JP6964864B2 - Cataract induction methods, cataract model organisms, cataract preventive and therapeutic agent screening methods, and cataract inducers - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、白内障の誘導方法、白内障のモデル生物、白内障の予防剤ならびに治療剤のスクリーニング方法、および、白内障誘導剤に関する。 The present invention relates to a method for inducing cataract, a model organism for cataract, a method for screening a preventive agent and a therapeutic agent for cataract, and a cataract inducer.
白内障は、水晶体が混濁（例えば、白濁）することによって、視力が低下する疾患である。白内障の罹患者では、一般的に、水晶体の、核、皮質、または、後嚢下などに混濁が生じる。 Cataract is a disease in which the crystalline lens becomes cloudy (for example, cloudy), resulting in decreased visual acuity. In people with cataracts, opacity generally occurs in the lens, nucleus, cortex, or subcapsular region.
白内障の種類としては、加齢白内障、および、糖尿病白内障などが挙げられる。加齢白内障は、罹患者の数が最も多い白内障である。加齢白内障の場合、加齢に伴って罹患者の数が増加し、６０歳代の日本人の約６６〜８５％、７０歳代の日本人の約８４〜９７％が加齢白内障を患っているという報告がある。一方、糖尿病白内障の場合、発症が比較的早期であり、４０歳代でも発症し得ることが知られている。 Types of cataracts include age-related cataracts and diabetic cataracts. Age-related cataracts are the most affected cataracts. In the case of age-related cataracts, the number of affected people increases with age, and about 66-85% of Japanese in their 60s and about 84-97% of Japanese in their 70s suffer from age-related cataracts. There is a report that it is. On the other hand, in the case of diabetic cataract, it is known that the onset is relatively early and can occur even in the 40s.
白内障を治すには、現時点では外科手術しか手段がない。白内障の進行を予防するための点眼剤として、グルタチオン製剤およびピレノキシン製剤が認可されてはいるが（非特許文献１および２参照）、これらの製剤を点眼していても混濁が進行し、手術を受けるに至る場合が多いのが現状である。それ故に、確実な予防効果を有する製剤の開発が求められている。
At present, surgery is the only way to cure cataracts. Glutathione and pyrenoxin preparations have been approved as eye drops to prevent the progression of cataract (see
白内障の治療方法の開発、および、白内障の予防剤（または、治療剤）の開発を進めるにあたっては、白内障を誘導するための発症モデルが必要である。例えば、白内障の治療方法（または、治療剤）を開発する場合、まず、白内障の症状を示す水晶体を作製する必要がある。そして、当該水晶体に対して、新規な治療方法（または、新規な治療剤）を施し、これによって白内障の症状が緩和されれば、当該新規な治療方法（または、新規な治療剤）は、白内障の治療に有効であると考えることができる。一方、白内障の予防剤の開発を進める場合、水晶体と新規な予防剤とを接触させ、その後で、水晶体に対して白内障を誘導するための処置を施す。このとき、水晶体が白内障を発症しなければ、当該新規な予防剤は、白内障の予防に有効であると考えることができる。 In order to develop a treatment method for cataract and a preventive agent (or therapeutic agent) for cataract, an onset model for inducing cataract is required. For example, when developing a treatment method (or therapeutic agent) for cataract, it is first necessary to prepare a crystalline lens showing the symptoms of cataract. Then, if a new treatment method (or a new therapeutic agent) is applied to the crystalline lens and the symptoms of cataract are alleviated by this, the new treatment method (or a new therapeutic agent) is a cataract. It can be considered to be effective in the treatment of. On the other hand, when developing a preventive agent for cataract, the crystalline lens is brought into contact with a new preventive agent, and then a treatment for inducing cataract is applied to the crystalline lens. At this time, if the crystalline lens does not develop cataract, the novel preventive agent can be considered to be effective in preventing cataract.
上述したように、白内障に関連する分野において、白内障を誘導するための発症モデルは、極めて重要である。このような発症モデルとして、現在、ガラクトース添加培地を用いた、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて糖尿病白内障を誘導する発症モデルが用いられている（非特許文献３参照）。 As mentioned above, in the field related to cataract, the onset model for inducing cataract is extremely important. As such an onset model, an onset model that induces diabetic cataract in ex vivo using a galactose-added medium is currently used (see Non-Patent Document 3).
しかしながら、ガラクトース添加培地を用いた発症モデルは、糖尿病白内障を誘導するための発症モデルであって、糖尿病白内障以外の白内障を誘導するための発症モデルではない。現在、糖尿病白内障以外の白内障の治療方法および予防剤（または、治療剤）の開発に用いることができる発症モデルは存在せず、糖尿病白内障を誘導するメカニズムとは異なるメカニズムを介して白内障を誘導する発症モデルの開発が望まれている。 However, the onset model using the galactose-added medium is an onset model for inducing diabetic cataract, not an onset model for inducing cataract other than diabetic cataract. Currently, there is no onset model that can be used to develop therapeutic methods and preventive agents (or therapeutic agents) for cataracts other than diabetic cataract, and induces cataract through a mechanism different from the mechanism that induces diabetic cataract. Development of an onset model is desired.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、従来とは異なる糖尿病の発症モデルを開発するとともに、当該発症モデルを利用した技術を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to develop a diabetes onset model different from the conventional ones and to provide a technique using the onset model.
本発明者らは、ガラクトースなどの糖を用いることなく、ＤＮＡに損傷を与えることによって白内障を誘導することができることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、本発明は、ガラクトースなどの糖を用いていないことから、糖尿病白内障を誘導するメカニズムとは異なるメカニズムを用いた、白内障を誘導する技術であると考え得る。本発明の一実施形態は、以下の構成からなるものである。 The present inventors have found that cataract can be induced by damaging DNA without using sugar such as galactose, and have completed the present invention. Since the present invention does not use sugar such as galactose, it can be considered as a technique for inducing cataract using a mechanism different from the mechanism for inducing diabetic cataract. One embodiment of the present invention has the following configuration.
＜１＞採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有する、白内障の誘導方法。 <1> A method for inducing cataract, which comprises a damaging step of damaging the collected crystalline lens DNA or the crystalline lens DNA of a non-human organism.
＜２＞上記白内障は、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、または、糖尿病白内障である、＜１＞に記載の白内障の誘導方法。 <2> The method for inducing cataract according to <1>, wherein the cataract is age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopy cataract, radiation cataract, steroid cataract, or diabetic cataract.
＜３＞上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であり、上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激である、＜１＞または＜２＞に記載の白内障の誘導方法。 <3> The damage step is a step of damaging the DNA by applying a stimulus of a predetermined intensity to the collected crystalline lens or the crystalline lens of the non-human organism, and the stimulus is the step of applying the stimulus. The method for inducing cataract according to <1> or <2>, wherein the stimulation is so intense that only a part of the cross section of the crystalline lens is opaque.
＜４＞上記損傷工程は、以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）を包含する、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載の白内障の誘導方法：
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
<4> The method for inducing cataract according to any one of <1> to <3>, wherein the damage step includes the following (i) and / or (ii):
(I) Irradiating the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with ultraviolet rays or radiation.
(Ii) Contacting the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage.
＜５＞＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の方法によって得られる、白内障のモデル生物。 <5> A cataract model organism obtained by the method according to any one of <1> to <4>.
＜６＞採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、上記接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有する、白内障の予防剤のスクリーニング方法。 <6> A contact step of bringing the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism into contact with a test substance, and after the contact step, the DNA of the collected crystalline lens or the non-human organism A method for screening a preventive agent for cataract, which comprises a damage step of damaging the DNA of the crystalline lens of the lens.
＜７＞採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、上記損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有する、白内障の治療剤のスクリーニング方法。 <7> A damage step that damages the collected crystalline lens DNA or the non-human organism's crystalline lens DNA, and after the damage step, the collected crystalline lens or the non-human organism's crystalline lens A method for screening a therapeutic agent for cataract, which comprises a contact step of bringing a test substance into contact with the test substance.
＜８＞ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している、白内障誘導剤。 <8> A cataract inducer containing a substance that causes DNA damage as an active ingredient.
＜９＞上記ＤＮＡの損傷を引き起こす物質は、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断、ＤＮＡへの化合物の付加、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入を引き起こすものである、＜８＞に記載の白内障誘導剤。 <9> The substance that causes damage to DNA is one that causes alkylation of DNA, cleavage of DNA, addition of a compound to DNA, or insertion of a base analog into DNA, according to <8>. Cataract inducer.
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを用いて、白内障を誘導することができる。 According to one aspect of the present invention, cataracts can be induced by using an onset mechanism different from that caused by sugar.
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを標的とした、糖尿病用の新たな予防剤、および、治療剤をスクリーニングすることができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to screen new prophylactic agents and therapeutic agents for diabetes that target an onset mechanism different from that caused by sugar.
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを用いて白内障を誘導することができる、新たな白内障誘導剤を提供することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to provide a new cataract inducer capable of inducing cataract using an onset mechanism different from that of sugar.
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。 An embodiment of the present invention will be described below, but the present invention is not limited thereto. The present invention is not limited to the configurations described below, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the technical means disclosed in different embodiments and examples can be used. Embodiments and examples obtained in appropriate combinations are also included in the technical scope of the present invention. In addition, all of the documents described herein are incorporated herein by reference. In the present specification, when "AB" is described with respect to a numerical range, the description is intended to be "A or more and B or less".
〔１．用語の定義〕
［１−１．白内障］
本明細書において「白内障」とは、水晶体に混濁（例えば、白濁）を生じる疾患を意図する。白内障によって水晶体に生じる混濁には、例えば、皮質混濁；核混濁；後嚢下混濁；皮質スポーク状混濁；前嚢下混濁；線維ひだ、水隙、または、核周囲の徹照下点状混濁；水疱；点状混濁；冠上混濁などの類型がある。「白内障」の種類としては、加齢白内障、および、併発白内障（例えば、糖尿病白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、および、ステロイド白内障）などを挙げることができる。
[1. Definition of terms〕
[1-1. Cataract]
As used herein, the term "cataract" is intended to be a disease that causes opacity (eg, opacity) in the crystalline lens. Cataract-induced opacity in the lens includes, for example, cortical opacity; nuclear opacity; posterior subcapsular opacity; cortical spoke-like opacity; anterior subcapsular opacity; fibrous folds, water gaps, or perinuclear pointed opacity; There are types such as blisters; punctate opacity; crown opacity. Examples of the type of "cataract" include age-related cataract and comorbid cataract (for example, diabetic cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopic cataract, radiation cataract, and steroid cataract).
「糖尿病白内障」とは、血液中または血漿中のグルコース濃度が持続的に上昇している状態によって特徴づけられる疾患（例えば、高血糖症、または、糖尿病（例えば、一型糖尿病、または、二型糖尿病））の罹患者に発症している、水晶体の混濁を意図する。糖尿病白内障では、水晶体の皮質または後嚢下に混濁が生じることが多いことが大規模疫学調査で知られているが、混濁の生じる箇所はこれらに限定されない。
A "diabetic cataract" is a disease characterized by a sustained increase in glucose levels in the blood or plasma (eg, hyperglycemia, or diabetes (eg,
本発明の対象となる白内障は、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。 The cataracts that are the subject of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include age-related cataracts, congenital cataracts, traumatic cataracts, atopic cataracts, radiation cataracts, steroid cataracts, and diabetic cataracts.
［１−２．予防剤］
本明細書において「予防剤」とは、予防効果をもたらす薬剤を意図する。当該予防効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、または、発症のリスクを低減する。
（２）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、または、再発のリスクを低減する。
（３）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、または、兆候が生じるリスクを低減する。
[1-2. Preventive agent]
As used herein, the term "preventive agent" is intended to be an agent that has a preventive effect. The preventive effect is intended, but is not limited to, the effects exemplified below.
(1) Compared with the case where the preventive agent is not administered, when the preventive agent is administered, the onset of one or more symptoms related to the disease is prevented or the risk of developing the disease is reduced.
(2) Compared with the case where the preventive agent is not administered, when the preventive agent is administered, the recurrence of one or more symptoms related to the disease is prevented or the risk of recurrence is reduced.
(3) Preventing or reducing the risk of symptoms of one or more symptoms associated with the disease when the prophylactic agent is administered, as compared to the case where the prophylactic agent is not administered. do.
なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。 The one or more symptoms associated with the disease may be systemic or local.
［１−３．治療剤］
本明細書において「治療剤」とは、治療効果をもたらす薬剤を意図する。当該治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
（２）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または、重症度の進行を防止する。
（３）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または、重症度の進行速度を低減する。
[1-3. Therapeutic agent]
As used herein, the term "therapeutic agent" is intended to be an agent that provides a therapeutic effect. The therapeutic effect is intended, but is not limited to, the effects exemplified below.
(1) When the therapeutic agent is administered, the severity of one or more symptoms related to the disease is reduced as compared with the case where the therapeutic agent is not administered.
(2) When the therapeutic agent is administered, the severity of one or more symptoms related to the disease is increased or the progression of the severity is prevented as compared with the case where the therapeutic agent is not administered.
(3) Compared with the case where the therapeutic agent is not administered, when the therapeutic agent is administered, the rate of increase in the severity of one or more symptoms related to the disease or the rate of progression of the severity is reduced. ..
なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。 The one or more symptoms associated with the disease may be systemic or local.
〔１．白内障誘導剤〕
本実施の形態の白内障誘導剤は、ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡなど）の損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している。
[1. Cataract inducer]
The cataract inducer of the present embodiment contains a substance that causes damage to DNA (for example, chromosomal DNA) as an active ingredient.
上記物質によってＤＮＡに引き起こされる損傷は、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断（例えば、一本鎖ＤＮＡの切断、または、二本鎖ＤＮＡの切断）、ＤＮＡへの化合物の付加（例えば、ＤＮＡの欠失、ＤＮＡの挿入、または、塩基ミスマッチを引き起こすもの）、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入があり得る。 The damage caused to DNA by the above substances is not particularly limited, but is, for example, alkylation of DNA, cleavage of DNA (for example, cleavage of single-stranded DNA or cleavage of double-stranded DNA), and of a compound to DNA. There can be additions (eg, DNA deletions, DNA insertions, or those that cause a base mismatch), or insertions of base analogs into the DNA.
上記損傷がＤＮＡのアルキル化である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡをアルキル化してもよいし、間接的にＤＮＡをアルキル化（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質がＤＮＡをアルキル化）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ＭＭＳ（methyl methane sulfonate）、ＥＭＳ（ethyl methane sulfonate）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、メクロレタミン（Mechlorethamine）、ウラムスチン（Uramustine）、メルファラン（Melphalan）、クロラムブシル（Chlorambucil）、イホスファミド（Ifosfamide）、ベンダムスチン（Bendamustine）、カルムスチン（Carmustine）、ロムスチン（Lomustine）、ストレプトゾシン（Streptozocin）、ブスルファン（Busulfan）、ニトロソグアニジン（nitrosoguanidine）、ニトロソアミン、および、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレアを挙げることができる。 When the above damage is DNA alkylation, the substance causing the DNA damage may directly alkylate the DNA or indirectly alkylate the DNA (eg, induced by the substance causing the DNA damage). Other substances may alkylate the DNA). Specific examples of substances that cause DNA damage include MMS (methyl methane sulfonate), EMS (ethyl methane sulfonate), cyclophosphamide, Mechlorethamine, Uramustine, Melphalan, and others. Chlorambucil, Ifosfamide, Bendamustine, Carmustine, Lomustine, Streptozocin, Busulfan, Nitrosoguanidine, Nitrosoguanidine, Nnitrosoguanidine, N N-nitrosourea can be mentioned.
上記損傷がＤＮＡの切断である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡを切断してもよいし、間接的にＤＮＡを切断（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質（例えば、フリーラジカル）がＤＮＡを切断）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ブレオマイシン、および、ネオカルジノスタチンを挙げることができる。 When the above damage is a DNA break, the substance causing the DNA damage may directly cut the DNA or indirectly cut the DNA (for example, induced by a substance causing the DNA damage). Substances (eg, free radicals) may cleave DNA. Specific examples of substances that cause DNA damage include bleomycin and neocarzinostatin.
上記損傷がＤＮＡへの化合物の付加である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡに付加してもよいし、間接的にＤＮＡへ化合物を付加（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質がＤＮＡを架橋）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、シスプラチン（Cisplatin）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、カルボプラチン（Carboplatin）、ネダプラチン（Nedaplatin）、サトラプラチン（Satraplatin）、トリプラチン テトラニトレート（Triplatin tetranitrate）、ベンゾピレン、臭化エチジウム、クリセン、マイトマイシンＣ（Mitomycin C）、アンゲリシン（Angelicin）、ソラレン、および、トリオキシサレンを挙げることができる。 When the above damage is the addition of a compound to DNA, the substance causing the damage to the DNA may directly add to the DNA or indirectly add the compound to the DNA (for example, the substance causing the damage to the DNA). Other substances induced by the DNA may be cross-linked). Specific examples of substances that cause DNA damage include cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, nedaplatin, satraplatin, triplatin tetranitrate, benzopyrene, and odor. Examples thereof include ethidium compound, chrysene, mitomycin C, angelicin, solarene, and trioxysalen.
上記損傷がＤＮＡへの塩基類似体の挿入である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡに挿入されてもよいし、間接的にＤＮＡへ塩基類似体を挿入（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された塩基類似体がＤＮＡへ挿入）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ＢｒｄＵ、および、ＥｄＵを挙げることができる。 When the above damage is the insertion of a base analog into DNA, the substance causing the damage to the DNA may be directly inserted into the DNA or indirectly insert the base analog into the DNA (for example, of the DNA). A base analog induced by a damaging substance may be inserted into the DNA). Specific examples of substances that cause DNA damage include BrdU and EdU.
本実施の形態の白内障誘導剤によって誘導される白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。 The cataract induced by the cataract inducer of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopy cataract, radiation cataract, steroid cataract, and diabetic cataract. Can be done.
本実施の形態の白内障誘導剤は、液体状の剤型であってもよいし、固体状の剤型であってもよい。本実施の形態の白内障誘導剤が液体状の剤型である場合には、有効成分と、必要に応じて有効成分以外の成分とを、所望の溶媒に溶かすことによって、白内障誘導剤を作製することができる。上記溶媒は、水晶体に対して毒性が低いものであればよく、例えば、水、および、生理的食塩水であってもよい。本実施の形態の白内障誘導剤が固体状の剤型である場合には、有効成分と、必要に応じて有効成分以外の成分とを、混合することによって、白内障誘導剤を作製することができる。なお、本実施の形態の白内障誘導剤の製造方法は、特に限定されず、公知の方法に従えばよい。 The cataract inducer of the present embodiment may be in a liquid dosage form or a solid dosage form. When the cataract inducer of the present embodiment is in a liquid dosage form, the cataract inducer is prepared by dissolving the active ingredient and, if necessary, an ingredient other than the active ingredient in a desired solvent. be able to. The solvent may be any solvent having low toxicity to the crystalline lens, and may be, for example, water or physiological saline. When the cataract inducer of the present embodiment is in a solid dosage form, the cataract inducer can be prepared by mixing the active ingredient and, if necessary, an ingredient other than the active ingredient. .. The method for producing the cataract inducer of the present embodiment is not particularly limited, and a known method may be followed.
本実施の形態の白内障誘導剤は、有効成分以外の成分を含有していてもよい。 The cataract inducer of the present embodiment may contain an ingredient other than the active ingredient.
上記有効成分以外の成分としては、特に限定されないが、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。 The ingredients other than the above active ingredients are not particularly limited, but are buffering agents, pH adjusters, tonicity agents, preservatives, antioxidants, high molecular weight polymers, excipients, carriers, diluents, solvents, and the like. Examples thereof include diluents, stabilizers, fillers, binders, surfactants, stabilizers and the like.
上記緩衝剤の例としては、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、トロメタモール等が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等が挙げられる。 Examples of the above buffers are phosphate or phosphate, boric acid or borate, citric acid or citrate, acetic acid or acetate, carbonic acid or carbonate, tartrate or tartrate, ε-aminocaproic acid, tromethamole. And so on. Examples of the phosphate include sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the like. Examples of the borate include borax, sodium borate, potassium borate and the like. Examples of the citrate include sodium citrate, disodium citrate, trisodium citrate and the like. Examples of the acetate include sodium acetate, potassium acetate and the like. Examples of the carbonate include sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate and the like. Examples of the tartrate salt include sodium tartrate, potassium tartrate and the like.
ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。 Examples of the pH adjuster include hydrochloric acid, phosphoric acid, citric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like.
上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等）、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。 Examples of the isotonic agent are ionic isotonic agents (sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, etc.) and nonionic isotonic agents (glycerin, propylene glycol, sorbitol, mannitol, etc.). Can be mentioned.
上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられる。 Examples of the preservatives include benzalkonium chloride, benzalkonium bromide, benzethonium chloride, sorbic acid, potassium sorbate, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, chlorobutanol and the like.
上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。 Examples of the above-mentioned antioxidant include ascorbic acid, tocophenol, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, sodium erythorbate, propyl gallate, sodium sulfite and the like.
上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲン等が挙げられる。 Examples of the above high molecular weight polymer include methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose acetate succinate, and hydroxypropyl methyl cellulose phthalate. , Carboxymethyl ethyl cellulose, cellulose acetate phthalate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, atelocollagen and the like.
本実施の形態の白内障誘導剤は、所定の強度の刺激を水晶体に加えることができる濃度の有効成分を含有していることが好ましい。なお、「所定の強度の刺激」については、後述する〔２．白内障の誘導方法〕にて、詳細に説明する。当該構成であれば、重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導することができる。重度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは難しい。一方、中度〜軽度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは容易である。つまり、当該構成であれば、後述するスクリーニング方法において、スクリーニングの感度を向上させ、これによって、白内障の予防剤および治療剤を容易にスクリーニングすることができる。 The cataract inducer of the present embodiment preferably contains an active ingredient having a concentration capable of applying a stimulus of a predetermined intensity to the crystalline lens. The "stimulation of a predetermined intensity" will be described later [2. Cataract induction method] will be described in detail. With this configuration, it is possible to induce moderate to mild cataracts rather than severe cataracts. In the case of severely symptomatic cataracts, it is difficult to prevent or treat the cataract. On the other hand, in the case of cataract with moderate to mild symptoms, it is easy to prevent or treat the cataract. That is, with this configuration, in the screening method described later, the sensitivity of screening can be improved, whereby a preventive agent and a therapeutic agent for cataract can be easily screened.
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、白内障誘導剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。 The amount of the active ingredient contained in the cataract inducer of the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, 0.001% by weight to 100% by weight when the cataract inducer is 100% by weight. It may be 0.01% by weight to 100% by weight, 0.1% by weight to 100% by weight, 0.1% by weight to 95% by weight, and 0. It may be 1% by weight to 90% by weight, 0.1% by weight to 80% by weight, 0.1% by weight to 70% by weight, 0.1% by weight to 60% by weight. It may be% by weight, 0.1% by weight to 50% by weight, 0.1% by weight to 40% by weight, 0.1% by weight to 30% by weight. It may be 0.1% by weight to 20% by weight, or 0.1% by weight to 10% by weight.
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の量は、また、例えば、１ｍＬの白内障誘導剤あたり、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってもよい。 The amount of the active ingredient contained in the cataract inducer of the present embodiment may also be, for example, 1 ng / mL to 100 mg / mL per 1 mL of the cataract inducer, 1 ng / mL to 10 mg / mL. It may be 1 ng / mL to 1 mg / mL, 1 ng / mL to 500 μg / mL, or 1 ng / mL to 100 μg / mL.
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の濃度は、また、例えば、白内障誘導剤において、１ｎＭ〜１Ｍであってもよく、１ｎＭ〜１００ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜５０ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜１０ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜５ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜１ｍＭであってもよい。 The concentration of the active ingredient contained in the cataract inducer of the present embodiment may be, for example, 1 nM to 1 M, 1 nM to 100 mM, or 1 nM to 50 mM in the cataract inducer. It may be 1 nM to 10 mM, 1 nM to 5 mM, or 1 nM to 1 mM.
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。 The amount of the component other than the active ingredient contained in the therapeutic agent of the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, 0% by weight to 99.999% by weight when the therapeutic agent is 100% by weight. It may be 0% by weight to 99.99% by weight, 0% by weight to 99.9% by weight, 5% by weight to 99.9% by weight, and 10% by weight. It may be from% to 99.9% by weight, from 20% to 99.9% by weight, from 30% to 99.9% by weight, from 40% to 99.9% by weight. It may be 9% by weight, 50% by weight to 99.9% by weight, 60% by weight to 99.9% by weight, 70% by weight to 99.9% by weight. It may be 80% by weight to 99.9% by weight, or 90% by weight to 99.9% by weight.
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、また、例えば、１ｍＬの白内障誘導剤あたり、０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってもよい。 The amount of ingredients other than the active ingredient contained in the therapeutic agent of the present embodiment may also be, for example, 0 ng / mL to 100 mg / mL per 1 mL of the cataract inducer, and 0 ng / mL to 10 mg. It may be / mL, 0 ng / mL to 1 mg / mL, 0 ng / mL to 500 μg / mL, or 0 ng / mL to 100 μg / mL.
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分以外の成分の濃度は、また、例えば、白内障誘導剤において、０ｎＭ〜１Ｍであってもよく、０ｎＭ〜１００ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜１０ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜５ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜１ｍＭであってもよい。 The concentration of the component other than the active ingredient contained in the cataract inducer of the present embodiment may be 0 nM to 1 M, 0 nM to 100 mM, or 0 nM in the cataract inducer, for example. It may be 10 mM, 0 nM to 5 mM, or 0 nM to 1 mM.
〔２．白内障の誘導方法〕
本実施の形態の白内障の誘導方法は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有している。
[2. How to induce cataract]
The method for inducing cataract of the present embodiment includes a damage step of damaging the collected crystalline lens DNA or the crystalline lens DNA of a non-human organism.
本実施の形態の誘導方法によって誘導される白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。 The cataract induced by the induction method of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopy cataract, radiation cataract, steroid cataract, and diabetic cataract. can.
上記損傷は、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断（例えば、一本鎖ＤＮＡの切断、または、二本鎖ＤＮＡの切断）、ＤＮＡへの化合物の付加（例えば、ＤＮＡの欠失、ＤＮＡの挿入、または、塩基ミスマッチを引き起こすもの）、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入であり得る。 The above damage is not particularly limited, but is, for example, alkylation of DNA, cleavage of DNA (for example, cleavage of single-stranded DNA or cleavage of double-stranded DNA), addition of a compound to DNA (for example, of DNA). It can be a deletion, insertion of DNA, or something that causes a base mismatch), or insertion of a base analog into DNA.
上記水晶体は、生体から採取された水晶体であってもよいし、生体が非ヒト生物である場合には、生体内に保持されている水晶体であってもよい。上記生体としては、特に限定されず、例えば、ヒト、および、非ヒト生物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットなどの、ヒト以外の哺乳類）を挙げることができる。 The crystalline lens may be a crystalline lens collected from a living body, or may be a crystalline lens held in the living body when the living body is a non-human organism. The living body is not particularly limited, and is not limited to humans, for example, humans and non-human organisms (for example, monkeys, cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, and rats, other than humans. (Mammals) can be mentioned.
上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激（例えば、紫外線、放射線、または、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質など）を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であってもよい。この場合、できるだけ弱い強度の刺激を水晶体に加えることが好ましい。当該構成であれば、重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導することができる。重度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは難しい。一方、中度〜軽度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは容易である。つまり、当該構成であれば、後述するスクリーニング方法において、スクリーニングの感度を向上させ、これによって、白内障の予防剤および治療剤を容易にスクリーニングすることができる。 The damage step damages the DNA by applying a predetermined intensity of stimulation (for example, ultraviolet rays, radiation, or a substance that causes damage to the DNA) to the collected lens or the lens of the non-human organism. It may be a step of giving. In this case, it is preferable to apply a stimulus as weak as possible to the crystalline lens. With this configuration, it is possible to induce moderate to mild cataracts rather than severe cataracts. In the case of severely symptomatic cataracts, it is difficult to prevent or treat the cataract. On the other hand, in the case of cataract with moderate to mild symptoms, it is easy to prevent or treat the cataract. That is, with this configuration, in the screening method described later, the sensitivity of screening can be improved, whereby a preventive agent and a therapeutic agent for cataract can be easily screened.
上記刺激の強度は、損傷工程に先立って、予め決定することができる。刺激の強度の決定方法の一例について、以下に説明する。勿論、本発明は、以下の決定方法に限定されない。また、刺激の種類は、特に限定されない。 The intensity of the stimulus can be determined in advance prior to the injury step. An example of a method for determining the intensity of the stimulus will be described below. Of course, the present invention is not limited to the following determination method. The type of stimulus is not particularly limited.
上記刺激は、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に刺激を加えてから所定の時間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、１０日間など）が経過してから当該水晶体の断面を観察した場合に、断面の一部分のみ（換言すれば、断面の全体では無く、一部分のみ）が混濁する強度の刺激であることが好ましい。 The above stimulus is performed for a predetermined time after stimulating the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism (for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 7 days, 10 days, etc.). When the cross section of the crystalline lens is observed after the lapse of time, it is preferable that only a part of the cross section (in other words, not the whole cross section but only a part of the cross section) is turbid.
水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、「ａ／Ａ」の値は、特に限定されないが、「０＜ａ／Ａ＜１．０」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．９」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．８」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．７」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．６」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．５」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．４」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．３」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．２」、最も好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．１」である。なお、上述した「ａ／Ａ」の値の下限値は、「０」に限定されず、例えば、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、または、０．０９であってもよい。 When the total area of the cross section of the crystal body is "A" and the area of the turbid part in the cross section is "a", the value of "a / A" is not particularly limited, but "0 <a / A". <1.0 ", more preferably" 0 <a / A <0.9 ", more preferably" 0 <a / A <0.8 ", more preferably" 0 <a / A <0.7 " , More preferably "0 <a / A <0.6", more preferably "0 <a / A <0.5", more preferably "0 <a / A <0.4", more preferably " 0 <a / A <0.3 ", more preferably" 0 <a / A <0.2 ", and most preferably" 0 <a / A <0.1 ". The lower limit of the value of "a / A" described above is not limited to "0", and is, for example, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, or 0.09. May be good.
水晶体の断面の観察は、市販の顕微鏡を用いて行うことができる。このとき、断面の写真をとり、市販の画像解析ソフトを用いて解析することにより、混濁が生じている領域を特定することができる。例えば、水晶体の断面の写真をとり、当該断面を複数の領域に細分化し、各領域における白色度を複数の段階（例えば、３段階、５段階、７段階、または、１０段階など）に評価する。そして、白色度の高い段階（例えば、最も白色度が高い段階、最も白色度が高い段階および２番目に白色度が高い段階、など）に評価された領域を、混濁が生じている領域として特定することができる。 The cross section of the crystalline lens can be observed using a commercially available microscope. At this time, by taking a photograph of the cross section and analyzing it using commercially available image analysis software, it is possible to identify the region where turbidity occurs. For example, a photograph of a cross section of the crystalline lens is taken, the cross section is subdivided into a plurality of regions, and the whiteness in each region is evaluated in a plurality of stages (for example, 3 stages, 5 stages, 7 stages, or 10 stages). .. Then, the region evaluated in the stage of high whiteness (for example, the stage having the highest whiteness, the stage having the highest whiteness, the stage having the second highest whiteness, etc.) is specified as the region where turbidity occurs. can do.
上記損傷工程は、以下の（ｉ）または（ｉｉ）を包含することが可能である：
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線（例えば、α線、β線、γ線、または、Ｘ線）を照射すること、または、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
The damage step can include the following (i) or (ii):
(I) Irradiating the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with ultraviolet rays or radiation (for example, α-rays, β-rays, γ-rays, or X-rays) or
(Ii) Contacting the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage.
換言すれば、上記損傷工程では、上記の（ｉ）または（ｉｉ）によって、上述した所定の強度の刺激を水晶体に加え、これによって、ＤＮＡに損傷を与えてもよい。 In other words, in the above-mentioned damage step, the above-mentioned (i) or (ii) may apply the above-mentioned predetermined intensity stimulus to the crystalline lens, thereby damaging the DNA.
上記水晶体に対して照射される紫外線、または、放射線の線量は、特に限定されない。例えば、様々な生物種（例えば、酵母、および、ショウジョウバエ）において突然変異体を作製する時に用いる線量であり得る。 The ultraviolet rays or the dose of radiation applied to the crystalline lens are not particularly limited. For example, it can be the dose used when making mutants in various species (eg yeast and Drosophila).
上記水晶体に対して接触させるＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度は、特に限定されない。例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度を、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、または、１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬに調整した水溶液を準備し、当該水溶液と、水晶体とを接触させてもよい。また、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度を、１ｎＭ〜１Ｍ、１ｎＭ〜１００ｍＭ、１ｎＭ〜５０ｍＭ、１ｎＭ〜１０ｍＭ、１ｎＭ〜５ｍＭ、または、１ｎＭ〜１ｍＭに調整した水溶液を準備し、当該水溶液と水晶体とを接触させてもよい。 The concentration of the substance that causes damage to the DNA that comes into contact with the crystalline lens is not particularly limited. For example, the concentration of a substance that causes DNA damage is 1 ng / mL to 100 mg / mL, 1 ng / mL to 10 mg / mL, 1 ng / mL to 1 mg / mL, 1 ng / mL to 500 μg / mL, or 1 ng / mL to. An aqueous solution adjusted to 100 μg / mL may be prepared, and the aqueous solution may be brought into contact with the crystalline body. In addition, an aqueous solution prepared by adjusting the concentration of a substance that causes DNA damage to 1 nM to 1 M, 1 nM to 100 mM, 1 nM to 50 mM, 1 nM to 10 mM, 1 nM to 5 mM, or 1 nM to 1 mM was prepared, and the aqueous solution and the crystalline lens were used. May be brought into contact with each other.
ＤＮＡの損傷を引き起こす物質としては、〔１．白内障誘導剤〕の欄で既に説明した具体的な物質を用いることができる。 Substances that cause DNA damage include [1. The specific substances already explained in the column of cataract inducer] can be used.
本実施の形態の白内障の誘導方法は、損傷工程の後で、ＤＮＡに損傷を与えられた水晶体を培養する培養工程を有していてもよい。当該構成によれば、白内障を誘導するための時間を確保することができる。 The cataract induction method of the present embodiment may include a culture step of culturing a crystalline lens in which DNA is damaged after the damage step. According to this configuration, it is possible to secure time for inducing cataract.
培養工程の時間は、特に限定されず、水晶体に加える刺激の強度に応じて、適宜、設定すればよい。培養工程の時間は、例えば、１日間〜１０日間、１日間〜７日間、１日間〜４日間、１日間〜４日間、１日間〜３日間、または、１日間〜２日間であってもよい。重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導するという観点からは、１日間〜４日間が好ましく、３日間〜４日間が更に好ましく、４日間が最も好ましい。 The time of the culturing step is not particularly limited, and may be appropriately set according to the intensity of the stimulus applied to the crystalline lens. The time of the culturing step may be, for example, 1 day to 10 days, 1 day to 7 days, 1 day to 4 days, 1 day to 4 days, 1 day to 3 days, or 1 day to 2 days. .. From the viewpoint of inducing moderate to mild cataracts rather than severely symptomatic cataracts, 1 to 4 days is preferable, 3 to 4 days is more preferable, and 4 days is most preferable.
培養工程では、生体内に保持されている水晶体を生体内に保持された状態で維持してもよいし、生体から採取した水晶体を培地中で培養してもよい。当該培地としては、特に限定されないが、例えば、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いることができる。 In the culturing step, the crystalline lens held in the living body may be maintained in the state of being held in the living body, or the crystalline lens collected from the living body may be cultured in the medium. The medium is not particularly limited, but for example, M199 medium (manufactured by SIGMA) can be used.
〔３．白内障のモデル生物〕
本実施の形態の白内障のモデル生物は、上述した〔２．白内障の誘導方法〕に記載の方法によって得られるモデル生物である。例えば、当該モデル生物を用いれば、後述する〔４．白内障の予防剤または治療剤のスクリーニング方法〕を行うことができる。また、当該モデル生物を用いれば、白内障の発症メカニズムを解明することができる。
[3. Cataract model organism]
The cataract model organism of the present embodiment is described above [2. It is a model organism obtained by the method described in [Cataract induction method]. For example, if the model organism is used, it will be described later [4. Screening method for preventive or therapeutic agents for cataract] can be performed. In addition, the onset mechanism of cataract can be elucidated by using the model organism.
上記モデル生物は、生体そのものであってもよいし、生体から採取された組織（例えば、水晶体）であってもよい。上記生体としては、ヒト、および、非ヒト生物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットなどの、ヒト以外の哺乳類）を挙げることができる。 The model organism may be a living body itself or a tissue (for example, a crystalline lens) collected from the living body. Examples of the above-mentioned organisms include humans and non-human organisms (for example, non-human mammals such as monkeys, cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, and rats). can.
より具体的に、本実施の形態の白内障のモデル生物は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程によって得られるものであり得る。 More specifically, the cataract model organism of the present embodiment may be obtained by a damage step that damages the collected lens DNA or the non-human lens lens DNA.
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記白内障は、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、または、糖尿病白内障であり得る。 In the cataract model organism of the present embodiment, the cataract can be age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopy cataract, radiation cataract, steroid cataract, or diabetic cataract.
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であり、上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激であり得る。 In the cataract model organism of the present embodiment, the damage step is a step of damaging the DNA by applying a predetermined intensity stimulus to the collected crystalline lens or the crystalline lens of the non-human organism. The stimulus may be a stimulus of such an intensity that only a part of the cross section of the crystalline lens after the stimulus is applied becomes opaque.
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記損傷工程は、以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）を包含し得る：（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。 In the cataract model organism of this embodiment, the injury step may include the following (i) and / or (ii): (i) with respect to the harvested lens or the lens of a non-human organism. To irradiate with ultraviolet rays or radiation, and (ii) contact the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage.
本実施の形態の白内障のモデル生物では、水晶体のＤＮＡの様々な箇所に、様々な種類の損傷が与えられていると考えられる。出願時において、これらを特定することは、困難を極め、過大な経済的支出や時間を要する。 In the cataract model organism of the present embodiment, it is considered that various kinds of damages are given to various parts of the DNA of the crystalline lens. Identifying these at the time of filing is extremely difficult and requires excessive financial expenditure and time.
それ故に、本願には、出願時において、本実施の形態の白内障のモデル生物を構造または特性などにより直接特定することが不可能である、または、実際的でない事情が存在する。 Therefore, at the time of filing, there are circumstances in which it is impossible or impractical to directly identify the cataract model organism of the present embodiment by its structure or characteristics.
〔４．白内障の予防剤または治療剤のスクリーニング方法〕
本実施の形態の白内障の予防剤のスクリーニング方法は、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、当該接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有している。
[4. Screening method for cataract preventive or therapeutic agents]
The method for screening a cataract preventive agent according to the present embodiment is a contact step of bringing the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism into contact with a test substance, and after the contact step, the above-mentioned harvested lens is used. It has a damage step of damaging the DNA of the crystalline lens or the DNA of the crystalline lens of the non-human organism.
一方、本実施の形態の白内障の治療剤のスクリーニング方法は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、当該損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有している。 On the other hand, the method for screening a therapeutic agent for cataract of the present embodiment includes a damage step of damaging the collected lens DNA or the lens DNA of a non-human organism, and the above-mentioned collection after the damage step. It has a contact step of bringing the crystalline lens or the crystalline lens of the non-human organism into contact with the test substance.
上記白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。 The cataract is not particularly limited, and examples thereof include age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopy cataract, radiation cataract, steroid cataract, and diabetic cataract.
損傷工程については既に説明したので、その説明を省略する。以下では、接触工程について説明する。 Since the damage process has already been described, the description thereof will be omitted. The contact process will be described below.
上記接触工程では、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる。 In the above contact step, the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism is brought into contact with the test substance.
上記被検物質は、白内障の予防剤または治療剤に含まれる有効成分の候補となる物質であって、その具体的な構成は、限定されない。被検物質は、低分子化合物、または、高分子化合物であってもよい。また、被検物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、または、これらの複合体であってもよい。 The test substance is a substance that is a candidate for an active ingredient contained in a preventive agent or a therapeutic agent for cataract, and its specific composition is not limited. The test substance may be a small molecule compound or a high molecular compound. Further, the test substance may be a polypeptide, a polynucleotide, a sugar, or a complex thereof.
水晶体と被検物質との接触は、培地中で培養されている水晶体と被検物質とを接触させることによって行うことも可能であるし、生体内に保持されている水晶体と被検物質とを接触させることによって行うことも可能である。上記培地としては、特に限定されず、例えば、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いることができる。 The contact between the crystalline lens and the test substance can be performed by bringing the crystalline lens cultured in the medium into contact with the test substance, or the crystalline lens held in the living body and the test substance can be brought into contact with each other. It can also be done by contact. The medium is not particularly limited, and for example, M199 medium (manufactured by SIGMA) can be used.
本実施の形態の白内障の予防剤のスクリーニング方法は、損傷工程の後（例えば、損傷工程の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後、または、１０日後）で、水晶体の断面において混濁している領域を検出するための検出工程を有していてもよい。また、本実施の形態の白内障の治療剤のスクリーニング方法は、接触工程の後（例えば、接触工程の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後、または、１０日後）で、同様に、水晶体の断面において混濁している領域を検出するための検出工程を有していてもよい。 The method for screening a cataract preventive agent of the present embodiment is for the crystalline lens after the injury step (for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 7 days, or 10 days after the injury step). It may have a detection step for detecting a turbid region in the cross section of the above. In addition, the screening method for the therapeutic agent for cataract of the present embodiment is performed after the contact step (for example, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 7 days, or 10 days after the contact step). Similarly, it may have a detection step for detecting a turbid region in the cross section of the crystalline lens.
上記検出工程において、被検物質と接触した水晶体の断面において混濁している領域の面積が、被検物質と接触していない水晶体の断面において混濁している領域の面積よりも小さくなっていれば、当該被検物質を、白内障の予防剤または治療剤の有効成分として用いることができる。 In the above detection step, if the area of the opaque region in the cross section of the crystalline lens in contact with the test substance is smaller than the area of the turbid region in the cross section of the crystalline lens not in contact with the test substance. , The test substance can be used as an active ingredient of a preventive agent or a therapeutic agent for cataract.
より具体的に、上記検出工程において、被検物質と接触していない水晶体の断面において混濁している領域の面積を１００％とした場合、被検物質と接触した水晶体の断面において混濁している領域の面積が、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下であれば、当該被検物質を、白内障の予防剤または治療剤の有効成分として用いることができる。 More specifically, in the above detection step, when the area of the opaque region in the cross section of the crystalline lens not in contact with the test substance is 100%, the cross section of the crystalline lens in contact with the test substance is turbid. The area of the region is preferably 90% or less, more preferably 80% or less, more preferably 70% or less, more preferably 60% or less, more preferably 50% or less, more preferably 40% or less, more preferably 30. % Or less, more preferably 20% or less, most preferably 10% or less, the test substance can be used as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for cataract.
なお、混濁している領域は、市販の顕微鏡を用いて特定することができる。例えば、水晶体の断面の写真をとり、市販の画像解析ソフトを用いて解析することにより、混濁している領域を特定することができる。より具体的に、水晶体の断面の写真をとり、当該断面を複数の領域に細分化し、各領域における白色度を複数の段階（例えば、３段階、５段階、７段階、または、１０段階など）に評価する。そして、白色度の高い段階（例えば、最も白色度が高い段階、最も白色度が高い段階および２番目に白色度が高い段階、など）に評価された領域を、混濁が生じている領域として特定することができる。勿論、混濁している領域の特定は、当該方法以外の周知の方法によっても行うことができる。 The turbid region can be identified using a commercially available microscope. For example, a turbid region can be identified by taking a photograph of a cross section of the crystalline lens and analyzing it using commercially available image analysis software. More specifically, a photograph of a cross section of the crystalline lens is taken, the cross section is subdivided into a plurality of regions, and the whiteness in each region is divided into a plurality of stages (for example, 3 stages, 5 stages, 7 stages, or 10 stages). Evaluate to. Then, the region evaluated in the stage of high whiteness (for example, the stage having the highest whiteness, the stage having the highest whiteness, the stage having the second highest whiteness, etc.) is specified as the region where turbidity occurs. can do. Of course, the turbid region can be specified by a well-known method other than the method.
＜試験１＞
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、（ｉ）Ｍ１９９培地に、４ｍＭ、２ｍＭ、若しくは、１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、または、（ｉｉ）Ｍ１９９培地に、８００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、若しくは、２００μｇ／ｍＬのブレオマイシンを添加した培地、を用いて培養した。
<
Lenses were removed from the left and right eyeballs of a 6-week-old SD rat (manufactured by Sankyo Lab Service Co., Ltd.). The crystalline lens removed from the right eye was cultured in M199 medium (manufactured by SIGMA). On the other hand, the crystalline lens removed from the left eye is 800 μg / mL, 400 μg / in (i) M199 medium supplemented with 4 mM, 2 mM, or 1 mM MMS (methyl methanesulfonate), or (ii) M199 medium. Culturing was performed using mL or a medium supplemented with 200 μg / mL bleomycin.
各水晶体の培養にはインキュベーターを使用し、当該インキュベーター内の温度を３７℃に保った。培養開始から４日後に、培地から各水晶体を取り出し、ＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐａｓ社製）を用いて顕微鏡観察を行った。 An incubator was used for culturing each crystalline lens, and the temperature inside the incubator was maintained at 37 ° C. Four days after the start of the culture, each crystalline lens was taken out from the medium and observed under a microscope using SZX12 (manufactured by Olympas).
図１に、ＭＭＳの試験結果を示し、図２に、ブレオマイシン（ＢＭ：bleomycin）の試験結果を示す。図１および図２から明らかなように、ＭＭＳ、および、ブレオマイシンは、何れも、濃度依存的に、水晶体に混濁（具体的には、白濁）を発生させた。このことは、ＭＭＳ、および、ブレオマイシンが、何れも、白内障を誘導する能力を有していることを示している。 FIG. 1 shows the test results of MMS, and FIG. 2 shows the test results of bleomycin (BM: bleomycin). As is clear from FIGS. 1 and 2, both MMS and bleomycin caused opacity (specifically, cloudiness) in the crystalline lens in a concentration-dependent manner. This indicates that both MMS and bleomycin have the ability to induce cataracts.
また、本実施例は糖を用いずに白内障を誘導していることから、誘導された白内障は、糖尿病白内障のみならず、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、または、ステロイド白内障のモデルとして用いることが可能な白内障であると考えられる。 In addition, since this example induces cataract without using sugar, the induced cataract is not only diabetic cataract but also age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopic cataract, radiation cataract, or , It is considered to be a cataract that can be used as a model of steroid cataract.
また、水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、本実施例における「ａ／Ａ」の値は、何れのデータも「０＜ａ／Ａ＜１．０」を満たしていた。 Further, when the total area of the cross section of the crystalline lens is "A" and the area of the turbid part in the cross section is "a", the values of "a / A" in this embodiment are all "a / A". It satisfied 0 <a / A <1.0 ".
また、ＭＭＳは、ＤＮＡをアルキル化することによって、ＤＮＡに損傷を引き起こす物質であり、一方、ブレオマイシンは、フリーラジカルによってＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに損傷を引き起こす物質である。つまり、ＭＭＳと、ブレオマイシンとでは、ＤＮＡに引き起こされる損傷の種類が異なっている。そして、損傷の種類が異なっていても白内障を誘導化できるということは、本願発明では、ＤＮＡに損傷を引き起こす方法、および、ＤＮＡに損傷を引き起こす薬剤の種類が限定されないことを示している。 MMS is a substance that causes damage to DNA by alkylating DNA, while bleomycin is a substance that causes damage to DNA by cleaving DNA with free radicals. That is, MMS and bleomycin differ in the type of damage caused by DNA. The fact that cataracts can be induced even if the types of damage are different indicates that the present invention does not limit the method of causing damage to DNA and the types of agents that cause damage to DNA.
＜試験２＞
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地に、４００ｍＭ、４０ｍＭ、４ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または、０．１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、を用いて培養した。
<Test 2>
Lenses were removed from the left and right eyeballs of a 6-week-old SD rat (manufactured by Sankyo Lab Service Co., Ltd.). The crystalline lens removed from the right eye was cultured in M199 medium (manufactured by SIGMA). On the other hand, the crystalline lens removed from the left eye was cultured in M199 medium supplemented with 400 mM, 40 mM, 4 mM, 1 mM, 0.5 mM, or 0.1 mM MMS (methyl methanesulfonate).
各水晶体の培養にはインキュベーターを使用し、当該インキュベーター内の温度を３７℃に保った。培養開始から１日後、２日後、または、４日後に、培地から各水晶体を取り出し、ＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐａｓ社製）を用いて顕微鏡観察を行った。 An incubator was used for culturing each crystalline lens, and the temperature inside the incubator was maintained at 37 ° C. One day, two days, or four days after the start of the culture, each crystalline lens was taken out from the medium and observed under a microscope using SZX12 (manufactured by Olympas).
図３および図４に、ＭＭＳの試験結果を示す。図３および図４から明らかなように、ＭＭＳは、濃度依存的に、水晶体に混濁（具体的には、白濁）を発生させた。このことは、ＭＭＳが、白内障を誘導する能力を有していることを示している。 3 and 4 show the test results of MMS. As is clear from FIGS. 3 and 4, MMS caused opacity (specifically, cloudiness) in the crystalline lens in a concentration-dependent manner. This indicates that MMS has the ability to induce cataracts.
また、本実施例は糖を用いずに白内障を誘導していることから、誘導された白内障は、糖尿病白内障のみならず、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、または、ステロイド白内障のモデルとして用いることが可能な白内障であると考えられる。 In addition, since this example induces cataract without using sugar, the induced cataract is not only diabetic cataract but also age-related cataract, congenital cataract, traumatic cataract, atopic cataract, radiation cataract, or , It is considered to be a cataract that can be used as a model of steroid cataract.
また、水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、本実施例における「ａ／Ａ」の値は、ＭＭＳの濃度が低濃度の場合には、「０＜ａ／Ａ＜１．０」を満たしていた。当該試験結果から、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度は、４０ｍＭ未満が好ましく、０．１ｍＭ以上４０ｍＭ未満がより好ましく、０．５ｍＭ以上４ｍＭ以下がより好ましく、０．５ｍＭ以上１ｍＭ以下が最も好ましい、と考えられる。 Further, when the total area of the cross section of the crystalline lens is "A" and the area of the turbid part in the cross section is "a", the value of "a / A" in this example is that the concentration of MMS is low. In the case of the concentration, "0 <a / A <1.0" was satisfied. From the test results, the concentration of the substance that causes DNA damage is preferably less than 40 mM, more preferably 0.1 mM or more and less than 40 mM, more preferably 0.5 mM or more and 4 mM or less, and most preferably 0.5 mM or more and 1 mM or less. it is conceivable that.
本発明は、白内障の発症メカニズムの解明を目的とする分野、および、白内障の治療方法の開発を目的とする分野などに、広く利用することができる。 The present invention can be widely used in a field for elucidating the onset mechanism of cataract and a field for developing a treatment method for cataract.
Claims (12)
上記損傷工程は、以下の（ｉｉ）を包含する、白内障の誘導方法：
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。 DNA of the harvested lens, or have a damaged step damaging the DNA of the crystalline lens of the non-human organism,
The damage process encompasses the following (ii), the induction method of cataract:
(Ii) Contacting the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage .
上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激である、請求項１または２に記載の白内障の誘導方法。 The damage step is a step of damaging DNA by applying a predetermined intensity of stimulation to the collected crystalline lens or the crystalline lens of the non-human organism.
The method for inducing cataract according to claim 1 or 2, wherein the stimulus is a stimulus having an intensity such that only a part of the cross section of the crystalline lens is opaque after the stimulus is applied.
上記接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有し、
上記損傷工程は、以下の（ｉｉ）を包含する、白内障の予防剤のスクリーニング方法：
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。 A contact step in which the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism is brought into contact with the test substance,
After the contacting step, possess DNA of the harvested lens, or a damage process damage to DNA of the lens of the non-human organism, and
The damage process encompasses the following a (ii), the screening method of cataract preventive agent:
(Ii) Contacting the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage .
上記損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有し、
上記損傷工程は、以下の（ｉｉ）を包含する、白内障の治療剤のスクリーニング方法：
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。 A damage process that damages the collected crystalline lens DNA or the non-human organism's crystalline lens DNA,
After the injury process, possess the harvested lens, or the lens of the non-human organism, the contact step of contacting a test substance, and the,
The damage process encompasses the following a (ii), the screening method of cataract therapeutic agent:
(Ii) Contacting the collected crystalline lens or the crystalline lens of a non-human organism with a substance that causes DNA damage .
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