JP6956203B2 - 可変圧縮封止部を備えるマルチウェル板 - Google Patents

Description

本出願は、米国仮出願第62/504,128号（2017年05月10日出願）、第62/551,268号（2017年08月29日出願）、および第62/668,908号（2018年05月09日出願）の利益を請求するものであり、これらの出願が開示するところはこの参照により本出願に含まれる。

本開示に係る実施形態群は概して、生物学・生化学的な反応物質などのアッセイに有用な研究設備に関し、特にはマルチウェル（複ウェル）濾過装置に関係する。より具体的には本開示に係る実施形態群は、膜間差圧による試料濾過を行えるマルチウェル濾過装置に関し、この差圧はフィルターの片側に負圧もしくは陽圧を掛けるか、または遠心力によって生じる。

蛋白質、DNA、RNA、プラスミド、小分子などの種々の物質の濾過・精製や、研究室でのスクリーニングや創薬において、マルチウェル板は広汎に用いられている。その利点としては、必要な試料が少量でよいこと（特に高価な化合物を用いる場合や、何千種もの候補化合物をスクリーニングしなければならない場合）、そして同時に複数の試料を走らせられることが挙げられる。成長著しい創薬部門では、より大量の試料試験をコスト効率良く、すなわち液体扱いを自動化するロボットと、複数の試料をいちどきに処理できるマルチウェル板とを使って行っている。板を使う系の大半では、濾過板を捕集板の上に配置するようになっている。典型的な濾過板は、行列に並べたウェル群を有しており、例えば九十六個、三百八十四個、もしくは千五百三十六個のウェルを有する。各ウェルの底には開口部があり、一枚以上の多孔質フィルターもしくは膜によって選択的に覆われている。こうした膜は通常親水性であり、比較的弱い力で流体を通すようになっている。また膜は疎水性であってもよく、その場合は流出を起こさせるためには高めの圧力が要る。また捕集板は、濾過板のそれと同じ個数のウェルを有するのが普通であり、それらのウェルは濾過板のウェルと整列し、それぞれから流れ落ちてくる流体を捕集できるようになっている。捕集板のウェルの底は閉鎖されているのが普通である。

濾過板中の流体は、捕集板のウェルに行き着く前に、フィルターもしくは膜を通さなくてはならない。大半の濾過板には、フィルターもしくは膜の下に暗渠も設けられている。こうした暗渠には、流体を濾過板からその下の捕集板のウェルへと誘導できるような注ぎ口などが付いていてもよい。また暗渠には、暗渠内の流体を注ぎ口の方へと動かせるような何らかの傾斜面を設けてもよい。真空などの駆動力を流体的に系に接続することで、流体を濾過板と暗渠に通し、捕集板へと引き出すようにできる。また与圧を駆動力として使ってもかまわない。

一般に96ウェル形式の濾過板は、複数のアッセイを同時に行うために使われているが、そうしたアッセイの一部は濾過が完了するまで数時間も続くことがある。限外濾過膜（UF膜）を用いる濾過板を製造する者にとっては、その限外濾過膜の材料では従来の封止（シール）法を使うことになってしまい、製造方法も望ましくないし、また得られる製品の性能のばらつきも大きくなってしまうのが避けがたい障壁である。よく知られた封止法は古典的な熱封止、超音波溶接、封止ガスケットの使用である。

熱封止については試行錯誤の結果、市販に至った限外濾過膜板はいくつかあることはある。その組み立てでは、96枚の円板状膜（膜ディスク）を、96ウェル式ポリプロピレン板の持つ各ウェルの底に置く作業が要る。そして96本の加熱柱が生えた熱圧盤を打ち込んで、膜の下側を各ウェルの底の内面に熱融着させる。この工程での制御変数としては時間、温度、および掛ける力がある。しかしながら、必要な工程パラメータの組み合わせは、膜の種類によってそれぞれに固有のものになる。このため大抵は許容できない接合の出来になってしまうのである。

超音波溶接は、少数の市販板で使われてはいるものの、限外濾過膜には使われていない。底が開いているマルチウェル板と、そのマルチウェル板に合わせてその底から出てくる濾液を捕集し受液ウェルへと誘導するようになっている暗渠構造とが整列することになる。そのマルチウェル板と、ウェルの開口部をすべて覆うようになっている暗渠構造とのあいだに、単独の濾過材膜シートを挟む。そして超音波溶接機はこの三種の部品を圧縮し、超音波振動を掛ける。さてここでこの超音波システムは以下の二種の工程を行うわけである。第一に、マルチウェル板と暗渠構造によって、膜シートを96枚の円板状に切り取る。第二に、超音波エネルギーによってマルチウェル板と暗渠構造とを互いに融着させることで、円板状膜がマルチウェル板と暗渠構造のあいだに固定され、96個の個別のウェルが得られる。

ガスケット部品は、封止が難しいUF膜に対しては今のところもっともうまくいくのがわかっている。その基本構造は、支持グリッドを持つ基部と、その支持グリッド上に位置する円板状膜と、その膜上に位置するガスケット（フラットガスケットやOリング）と、そして基部に留められた試料捕集器とを有する。これらの部品を互いに留めるかまたは融着することで、ガスケットが所定の量だけ圧縮されて、膜表面に対して封止を行うようになっている。試料液をウェルに分配すると、駆動力が掛かって試料が膜を通り、基部のグリッドを抜けて捕集されることになる。

ガスケット封止の利点としては、構造・膜化学の面で、ガスケットは膜材料から独立しているということがある。しかしエラストマー的な封止部が持つ弾性により、膜厚さにはいくらかの融通は利くものの、膜の計測厚さだけは束縛因子となってしまっている。現在のところ、信頼性ある限外濾過膜を使ったマルチウェル板として商業的に成功できたものは存在していない。限外濾過膜を備えた単独の試料装置というのはいくつかあり、その数少ない例としてはマサチューセッツ州BedfordのMiiliporeSigmaが提供するMICROCON（登録商標）およびCENTRICON（登録商標）がある。

創薬研究市場の成長部門では、学術的にも製薬業界的にも、より高速なスループットを持ちコスト効率のよい試料試験法が求められている。と言うと普通は、自動化された液体操作ロボットと、一度に96種以上の試料を処理できるマルチウェル板とを使うことを意味するわけである。創薬において重要な特性であるfree versus bound drugs（遊離薬剤/結合薬剤評価）を研究する上で、UF板は優れた基盤である。例えば関心ある薬剤を試験するにあたって、血清などの血液製剤にその薬剤を混ぜて、UF膜で濾過することがある。すると血清その他の蛋白質は膜上に残るが、小分子である薬剤は濾過材を通過して捕集され、試験されることになる。濾液中にあった薬剤は遊離（free）形態であって、関心ある標的に対して機能させられると判断できる。

しかしながら、存在する蛋白質をマルチウェル式の各ウェル内に確実に保持し、小分子を限外濾過膜に通して収集できるような信頼性の高い限外濾過膜の封止法が求められていることは、解決すべき重大な問題である。

このため、マルチウェル板方式において、限外濾過膜を封止するための別法を提供できることが望ましいと考えられる。

また、膜の孔径、膜の材料、および／もしくは膜の化学的性質に左右されることなく、膜を封止できる方法を提供できることも望ましいと言える。

種々の膜厚に合わせて膜を封止するための方法を提供することもまた望ましい。

またマルチウェル板（十二個、二十四個、九十六個、三百八十四個のウェルを有する板など）に適切な膜を封止するための方法を提供することも望ましい。

生物学的・生化学的な反応物質などのアッセイのための濾過装置を提供する。当該濾過装置は、基板（各端に開口部を有する一個以上のウェルを持つ基板や板など）と、各ウェル内に位置して離散濾過領域を形成する多孔膜とを含む。或る実施形態に係る濾過装置には封止部（シール）が含まれ、多孔膜の表面およびウェル壁と与圧可能な関係にある。或る実施形態では封止部が、ウェル内の膜上に置かれる封止ガスケットである。或る実施形態においては各ウェルが、封止部を与圧する与圧部を有することで、その封止部が膜表面とウェル壁の双方に接するようになっている。或る実施形態では各ウェルが、封止部を与圧する与圧部を有することで、その封止部が膜表面と与圧部自体の下面の双方に接するようになり、稼動中に液体がウェル壁に沿う領域に近づけないようになっている。或る実施形態では与圧部が、ウェル内挿入体であって、ウェル内に配置されかつウェル内で封止部を与圧できるように構成される。或る実施形態ではウェル内挿入体が、ウェル板に設けられるウェルの支持表面に結合することで、装置内にウェル内挿入体を恒久的に固定できるようになっている。

或る実施形態では与圧部が（ウェル壁に締まりばめされるなどして）ウェル内に固定されるように構成してもよいし、あるいは、ウェル板に設けられるウェルの支持表面に結合することで恒久的に固定されるように構成してもよい。

或る実施形態に係る濾過装置は、一個以上のウェルを有する基板を含み、当該ウェルはウェル壁により劃定され、かつ第一の開口部およびその第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、第一の開口部と第二の開口部の間がウェル容積として定まる。また当該濾過装置はさらに、第二の開口部を覆うようにして一個以上のウェル内に設置される多孔質濾過材と、一個以上のウェル内にて多孔質濾過材の一部の上に位置する封止部と、一個以上のウェル内にて封止部を与圧できる位置に固定されることで多孔質濾過材および一個以上のウェルの壁に対して封止関係にある与圧部とを含む。

また、上述した濾過装置を組み立てるための方法も提供され、さらに濾過装置（単ウェル式もしくは複ウェル式の濾過装置など）において一種以上の膜を封止する方法も提供される。例えば或る実施形態では、濾過装置（単ウェル式もしくは複ウェル式の濾過装置など）において一種以上の膜を封止する方法が、円板状膜をダイ切断して得て、それを濾過装置の有するウェルの底に設置し、濾液排出口を覆うようにする工程を含んでよい。封止部を膜の上部に置き、与圧部がウェル内に挿入されるようにしてもよい。或る実施形態では、膜およびウェル壁に対して封止部が与圧されることで、与圧部の挿入が遂行されるようにしてもよい。或る実施形態では、ウェル内挿入体またはスリーブの表面を、基板の支持表面に結合その他の手法で固着させることで、挿入体またはスリーブをその位置に固定できる。すると封止部に力を掛けることで、封止部を外向きに押し出し、ウェル壁の内表面に対して封止できるようになる。

或る実施形態では与圧部とウェル壁の締まりばめによって、その位置を固定できる。他の実施形態では、与圧部の表面を、基板の支持表面に結合その他の手法で固着させることで、与圧部をその位置に固定できる。すると封止部に力を掛けることで、封止部を外向きに押し出し、ウェル壁の内径に対して封止できるようになる。

また、試料を濾過装置で濾過する方法も開示される。当該濾過装置は、一個以上のウェルを有する基板を含み、当該ウェルはウェル壁により劃定され、かつ第一の開口部およびその第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、第一の開口部と第二の開口部の間がウェル容積として定まる。また当該濾過装置はさらに、第二の開口部を覆うようにして一個以上のウェル内に設置される多孔質濾過材と、一個以上のウェル内にて多孔質濾過材の一部の上に位置する封止部と、一個以上のウェル内にて基板と結合するウェル内挿入体とを含む。当該ウェル内挿入体は、ウェル壁に接する壁を有する。そして当該方法は、試料をウェル内挿入体に導入する工程と、多孔質濾過材を介して試料を濾過する工程とを含む。真空や圧力などの駆動力を使って、濾過を促進してもよい。

或る実施形態では濾過装置が開示される。当該濾過装置は、複数のウェルを有する基板を含み、各ウェルは流体を通さないウェル壁により劃定され、かつ第一の開口部およびその第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、第一の開口部と第二の開口部の間がウェル容積として定まる。また当該濾過装置はさらに、第二の開口部を覆うようにして各ウェル内に設置される多孔質濾過材と、各ウェル内にて多孔質濾過材の一部の上に位置する封止部と、基板と結合する複数のウェル内挿入体とを含む。ここでウェル内挿入体の個数は、ウェルの個数に対応している。ウェル内挿入体の各々は、それぞれのウェル内に配置される領域を有し、その配置によって封止部が与圧され、多孔膜およびウェル壁に対して封止関係となる。或る実施形態では、複数個のウェル内挿入体のうちのいくつかが、配列（アレイ）をなすよう互いに結合していてもかまわない。

或る実施形態に係る、封止ガスケットおよび与圧部を有するウェルの断面図である。 或る実施形態に係る、図1のウェルの一部拡大図である。 或る実施形態に係る、与圧部の斜視図である。 或る実施形態に係る、別の与圧部の斜視図である。 或る実施形態に係る、なおも別の与圧部の斜視図である。 或る実施形態に係る、ウェル内に位置する一体化された与圧部および封止部の断面図である。 或る実施形態に係る、ウェル内に位置する別の一体化された与圧部および封止部の断面図である。 或る実施形態に係る、ウェル内に位置するなおも別の一体化された与圧部および封止部の断面図である。 或る実施形態に係る、ウェル内に位置するなおも別の一体化された与圧部および封止部の上方斜視図である。 図8Aの一体化された与圧部および封止部の下方斜視図である。 図8Aの一体化された与圧部および封止部の断面図である。 或る実施形態に係る、ウェル内に位置するなおも別の一体化された与圧部および封止部の上方斜視図である。 図9Aの一体化された与圧部および封止部を、ウェル内に配置した斜視図である。 図9Aの一体化された与圧部および封止部を、ウェル内に配置した断面図である。 或る実施形態に係る、封止ガスケットと与圧部を有するマルチウェル式装置の部分分解斜視図であって、当該与圧部はウェル内スリーブもしくは挿入体である。 或る実施形態に係る、マルチウェル式装置内に配置されるウェル内スリーブ（挿入体）の断面図である。 或る実施形態に係る、基板と熱融着されたウェル内挿入体の断面図である。 或る実施形態に係る、封止部を与圧しているウェル内スリーブ（挿入体）の断面図である。 或る実施形態に係る、スナップ機構を有するウェル内スリーブ（挿入体）の断面図であって、そのスナップ機構によってウェル基板に取りついている様子である。 或る実施形態に係る、別のスナップ機構を有するウェル内スリーブ（挿入体）の断面図であって、そのスナップ機構によってウェル基板に取りついている様子である。 或る実施形態に係る、接着剤によりウェル基板に接合するウェル内挿入体の断面図である。 或る実施形態に係る、さまざまな封止部の断面図である。 或る実施形態に係る、ウェル内スリーブ（挿入体）の2x2アレイを有するマルチウェル板の斜視図であって、対応するウェルへの挿入直前の様子を描いている。 或る実施形態に係る、ウェル内スリーブ（挿入体）の2x2アレイを有するマルチウェル板の斜視図であって、対応するウェルへの挿入後の様子を描いている。 或る実施形態に係る、ウェル内スリーブ（挿入体）の4x4アレイを有するマルチウェル板の斜視図であって、対応するウェルへの挿入後の様子を描いている。 或る実施形態に係る、ウェル内スリーブ（挿入体）の12x8アレイを有するマルチウェル板の斜視図であって、各ウェルに入れ込む直前の状態を描いている。 実施例1に係るシトクロムの検量線のグラフである。

付図を参照することで、本開示に係る部品、工程、および装置をより十全に理解できるであろう。これらの図面は単に本開示を説明しやすくするための模式的表現であって、装置またはその部品の相対サイズもしくは寸法を示そうとするものではないし、および／または実施形態例の範囲を定義もしくは限定しようとするものでもない。

以下の説明ではわかりやすさのために特定の用語を使っているが、それらの用語はあくまで図面を説明するために択んだ実施形態に係る一般構造を指すものに過ぎず、本開示の範囲を定義もしくは限定しようとするものではない。図面と以下の説明では、類似の参照番号は、類似の機能を持つ部品を指すと理解されたい。

単数形の「a」「an」「the」には、文脈上明らかに除外されていないかぎりは、複数の指示対象をも含む。

本明細書でそうしているように、種々の装置および部品については、その他の要素を「含む」と表現する場合がある。…を含む、…を有する、…であってよい（comprise(s)、include(s)、having、has、can、contain(s)）などの表現やそれらの活用形は、開かれた接続語として企図されたものであって、さらに要素が追加される可能性を排除しているわけではないことに留意されたい。

本明細書で使用する用語群には、相対的な用語が多く含まれていることに留意されたい。例えば「上側」upperおよび「下側」lowerという語は互いに位置に関して相対的な表現であって、上側の要素は下側の要素よりも高いところに位置していることを意味する。ただし、その構造体の向きや位置が特定のものに限られるわけではないことにも留意されたい。

「天」topおよび「底」bottomという語は、地表という絶対基準に対して相対的な語である。言い換えれば、天位置は常に底位置よりも地表に対して高いところにあるということである。

さて図1および図2には、或る実施形態に係るウェル 10 を示す。このウェル 10 は、マルチウェル濾過装置 100 の一部をなすものであってもよいし、あるいは単ウェル濾過装置が持つウェルであってもかまわない。ウェル 10 は流体不浸透性の壁 1 によって劃定される。この壁 1 は漏斗状に内向きに先細り（テーパー）になっているのが好ましく、注入口（開口部）から、排出口 5 を有する底面 8 へと均一に先細りになっているのが好ましい。或る実施形態では、ウェルの先細り傾斜は片面につき0.5度であり、締まりばめ領域（ウェルの底から1/4の領域）における直径の違いとしては0.004インチとなる。あるいは小さめの箇所が0.005インチかつ大きめの箇所が0.025インチになるような締まりばめを使ってもよい。装置の素材には、濾過対象試料にとって無害なものを使用でき、例えば蛋白質結合性が低いポリプロピレンを使用できる。

或る実施形態では、可撓性のガスケットやOリングなどである封止部 3 を、底面 8 に置かれた多孔膜 4 の天面（表）に対して与圧関係になるように配置できる。或る実施形態では、与圧部 2 をウェル 10 中に配置するにあたって、封止部 3 に与圧することで、封止部 3 が多孔膜 4 とウェル壁 1 の双方に触れるようにできる。或る実施形態では、与圧部 2 をウェル 10 内に締まりばめし、ウェル壁 1 に接触させることで、封止部 3 上に圧力を与え続けられる箇所にて与圧部 2 を効率的に保持できる。与圧部 2 と封止部 3 との位置関係が維持されるのは、封止部 3 に掛かる力が、与圧部 2 の位置をずらせるほどには強くないからである。このため与圧部 2 は、自身をウェル内に保持しつつ、封止部 3 に力を掛けて多孔膜 4 の表を封止させ、封止部 3 を半径方向に沿って外向きに押し拡げ、ウェル壁 1 の内径に対しても封止をする。こうすることで、液体試料が多孔膜 4 の周りから溢れ出て多孔膜 4 を通らずに排出口 5 から流れ出てしまわないようにできる。与圧部 2 には、流体を通すための一個以上の穴 9 がある（図では、中心に穴が一個あるのを示している）。要素 7 は、ウェル 10 内の液体試料を収められる領域を指している。

或る実施形態では与圧部 2 の直径を、与圧部 2 をウェル壁 1 内で保持する位置でのウェル壁 1 の内径よりも大きくできる。与圧部 2 は、ウェルの素材よりも硬い材料で作るのが好ましい。この硬度の違いによって、与圧部 2 をウェル壁 1 に締まりばめできるわけである。与圧部 2 に適切な材料としては、プラスチック、金属、ガラス、エポキシなどが挙げられ、ウェル壁 1 よりも硬い材料であればよい。ウェル壁がポリプロピレンの場合、与圧部に適切な材料の一例としてはポリカーボネートがある。

或る実施形態では与圧部 2 の断面が台形になるようにして、その天面もしくはその近傍での外径が、底面での外径よりも大きくなるように構成できる。こうすることで若干の進み角がつけられるので、押し込み力によって与圧部 2 がウェル内に滑り込みやすくなる。さらには後部鋭角端 6 もつけられるので、ウェル壁 1 に対して締まりばめでき、与圧部 2 がウェルから抜けてしまわないようにできる。このようにしてウェル壁 1 における位置を維持できるわけである。

或る実施形態では、与圧部 2 が封止部 3 に接触する表面が、箇所 11 で傾斜していてもよい。このように傾斜をつけることで、与圧されると封止部 3 がウェル壁への封止と膜 4 への封止をしやすくなる。傾斜として適切なのは5度以上であり、好ましくは30度以上である。

膜 4 の厚さ Dm は可変であって、これは膜 4 とウェル壁 1 に対する確実な封止を保ったまま、挿入深さを変更できるからである。なお厚さ Dm は、複数枚の膜層のそれを組み合わせたものであってもよい。膜の各層は同一ものであってもよいし、あるいは孔径、化学的性質、もしくは構造が異なるものであってもかまわない。

或る実施形態では与圧部 2 の持つ締まりばめのための要素が、連続した締まりばめ端である。これはすなわち、与圧部 2 がウェル壁 1 に締まりばめする領域の外径が、その領域の周縁全体にわたって一定であるという意味である。また他の実施形態では与圧部 2 の持つ締まりばめのための要素が、間欠的（非連続）な締まりばめ端である。これはすなわち、与圧部 2 がウェル壁 1 に締まりばめする領域の外径が、その領域の周縁全体にわたっては一定ではないという意味である。

濾過装置の組立方法の一例を以下に示す。膜 4 をダイ切断して円板状にし、ウェル 10 の底に置いてウェル排出口 5 を覆うようにする。ガスケットやOリングなどの封止部 3 を、ウェル 10 内の膜 4 の天面に置く。与圧部 2 をウェル 10 に挿入して、ウェル 10 内で与圧部 2 が封止部 3 に与圧する位置に置くことで、封止部 3 が膜 4 およびウェル壁 1 に対して与圧するようになる。

図3には、間欠的な締まりばめ端の実施形態を示し、ここでは与圧部 2 が複数個の放射状突起 12 を有している。図示しているとおり、放射状突起 12 は与圧部の本体から外に向かって放射状に伸びている。この実施形態では間隔を空けて並ぶ四個の放射状突起 12 を示しているが、当業者であれば突起の個数をそれよりも少なくしたり多くしたりできることは理解されたい。放射状突起 12 は互いに均等な間隔をとっていることが好ましい。或る実施形態では、放射状突起 12 の断面が三角形であって、その形状が概して楔形であり、与圧部 2 の天面から底面にかけて放射状かつ内向きに先細りになっていてよい。

図4には、間欠的な締まりばめ端を具えた与圧部 2 の別の実施形態を示しており、ここでは与圧部 2 が複数個の放射状突起 13 を有している。図示しているとおり、放射状突起 13 は与圧部の本体から外に向かって放射状に伸びている。この放射状突起 13 は概して平たく、半径方向の歯として機能する。この実施形態では間隔を空けて並ぶ八個の放射状突起 13 を示しているが、当業者であれば突起の個数をそれよりも少なくしたり多くしたりできることは理解されたい。放射状突起 13 は互いに均等な間隔をとっていることが好ましい。

図5は、間欠的な締まりばめ端を具えた与圧部 2 のさらに別の実施形態を示しており、ここでは与圧部 2 が複数個の放射状突起 14 を有している。図示しているとおり、放射状突起 14 は与圧部の本体から外に向かって放射状に伸びている。この放射状突起 14 は概して平たく、半径方向の歯として機能する。この実施形態では間隔を空けて並ぶ六個の放射状突起 14 を示しているが、当業者であれば突起の個数をそれよりも少なくしたり多くしたりできることは理解されたい。放射状突起 14 は互いに均等な間隔をとっていることが好ましい。この実施形態では、一個以上の放射状突起 14 が持つ放射状外端 14A が上方向に曲がっており、ウェル 10 内に正しく配置された際には封止部 3 と逆を向くようになっている。またこの曲がった放射状外端 14A がウェル壁 1 に食い込むことで、軸方向に力が掛かることになるため、封止ガスケット 3 が軸方向に動かないようにできる。

或る実施形態では、封止部と与圧部が一体化されていてもよい。例えば図6A、図6Bには、与圧部 2' および封止部 3' が被覆成形（オーバーモールド）されて一体型部品となっている実施形態を描いてある。或る実施形態では封止部 3' が熱可塑性エラストマーであって、与圧部に結合もしくは融着するものであってよい。その結合もしくは融着を強化するために、与圧部 2' に溝 30 を設けて、結合もしくは融着に使える表面積を増加させてもよい。或る実施形態（図6B）では、ウェル 10 の壁 1 との締まりばめを間欠的な締まりばめ端によって行うように、与圧部 2' が間隔を空けて並ぶ複数個の放射状突起（突出部もしくは歯） 13' を有している。放射状突起 13' は与圧部の本体から外に向かって放射状に伸びている。他の実施形態（図6A）では、一定の直径である締まりばめ端によって締まりばめを行える。

図7には、封止部と与圧部を一体化する別の実施形態を示した。LSR（液体シリコーンゴム）などの被覆成形用エラストマー材料を使って与圧部 2" としてもよいが、その場合は封止部 3" に対する接着力もしくは融着力は最低限になる。そこで封止部 3" を与圧部 2" 内に包み込むようにして成形してもよい。その際には、上方封止部材と下方封止部材とをつなぐ給湯貫通孔 65 を使って、エラストマーである与圧部 2" によって封止部 3" の材料を物理的に溜めるようにして成形できる。こうすることで、与圧環の天面と底面にそれぞれ溝を形成できる。この二つの溝は当該部品の貫通孔によってつながっているので、与圧部 2" を被覆成形する際に、底溝が充填されて封止面を形成し、また貫通孔から天溝へと給湯して天溝を充填することで、与圧部 2" が封止部 3" の上と中に包み込まれるように固定できる。このようにして二種の部品の掛け締めを効率的に行えるわけである（図8Bも参照されたい）。

また図8A、8B、および8Cにも、封止部と与圧部を一体化する実施形態を示した。この実施形態でも、封止部 3"' が与圧部 2"' 内に溜められるもしくは包含される（閉じ込まれる）ようになっている。与圧部には環側壁に一個以上の開口部 26 が設けられているので、ウェル壁と与圧部 2"' のあいだに液体を捕集して、そこから出た液体を膜で濾過できるようになっている。こうすることで、使用中に無駄になる液体容量を減らせるのである。

また図9A、9B、および9Cにも、封止部と与圧部が一体化した実施形態を示す。この実施形態では、金属の挿入体がエラストマー（液体射出シリコーンや熱可塑性エラストマーなど）の中に包含されている。この金属によって、ウェルへ挿入する際に剛性が得られつつ、しかもロープロファイルな形状のままにできる。示した実施形態では、間隔を空けて並ぶ放射状突起（突出部もしくは歯） 13" が、与圧部の本体から半径方向に外向きに伸びている。このように放射状突起 13" を設けることで、ウェルの内壁に対して締まりばめできる。なお放射状突起 13" は金属なので、その端を鋭利にしてウェル壁にしっかり固定できるようにしてもよい。

図10にはさらに別の実施形態を示す。この実施形態は、ウェル 10 が複数のウェルのうちの一個のウェル（十二個、二十四個、九十六個、もしくは三百八十四個などのウェルを持つマルチウェル式濾過装置 100 が有するうちの一個のウェルなど）である場合に関する。なお単ウェル式の装置も使用できることには留意されたい。マルチウェル式の濾過装置は、この種の装置に通常用いられるポリマー材料から製造できる。そうしたポリマー材料としては、ポリオレフィン（ポリプロピレンやポリエチレンなど）、ポリカーボーネート、アクリル樹脂、ポリスチレンなどが挙げられる。多孔質濾過材または膜 4 は、ウェル 10 内に（通常は排出口の近傍に）配置して、第二開口部 15 を覆える大きさとする。また多孔質濾過材または膜 4 は、フィルター支持部（環状支持部 16 および輻肋 16' など）の上で支持するのが典型的である。複数の多孔質濾過材または膜 4 を、各ウェル 10 内に用いてもよい。複数の膜を（積層するなどして）使う場合には、層内の膜の孔径が、層内の別の膜のそれと同一であってもよいし異なっていてもよい。またデプスフィルター（深層式フィルター）を使ってもかまわない。或る実施形態では、可撓性の封止部 3 （平たいガスケットやOリングなど）を、一個以上のウェル 10 内で多孔質濾過材 4 の一部分（多孔質濾過材 4 の周縁近傍など）の上に配置してもよい。このような封止部 3 をウェル 10 内に配置することで、多孔質濾過材 4 の天面（表面）との与圧関係ができる。

示した実施形態では与圧部 2 が、ウェル 10 内に配置できるウェル内スリーブまたは挿入体 200 を有し、その配置によって封止部 3 に与圧することで、多孔質濾過材 4 とウェル壁 1 の内表面との双方と、封止部 3 が接触することになる（与圧部 200 の接点とも同様に接触する）。或る実施形態ではウェル内挿入体の各々が長細いスリーブであって、それが挿入されることになる先のウェル 10 の内容積の構成に対応したものとなっている。例えばウェル 10 が概して円筒状の内容積を有している場合には、ウェル内挿入体 200 が、円筒状外壁 201 を有する長細い円筒状であってよく、その外径がウェルの内容積領域の内径よりも若干小さくなっていてよい。或る実施形態ではウェル内挿入体 200 の外径が、天面から底面にかけて半径方向内向きに先細りになっていてよく、その先細り傾向は均一であるのが好ましい。すなわちウェル内挿入体 200 の天部（上部）における外径が、そのウェル内挿入体 200 の底部（下部）における外径よりも大きいということである。或る実施形態では挿入体が概して円錐状であってもよい。

ウェル内挿入体 200 は、多孔質濾過材 4 の厚さまたは化学的性質には依存しない。

ウェル内挿入体 200 をウェル 10 内に固定してもよく、その際には例えば基板または板の支持表面（一個以上のウェル 10 が形成される箇所、例えば基板の天面）への結合をしてよい。そうすることでウェル内挿入体 200 と封止部 3 との位置関係が維持されることになる。つまりウェル内挿入体 200 の機能としては、ウェル 10 内に封止部 3 を保持すること、封止部 3 に力を掛けることで封止部 3 に多孔質濾過材 4 の表面上で封止させること、ならびに、封止部を半径方向に外向きに押し込むことで、ウェル壁 1 の内壁に対して液密に封止して、液体試料が多孔質濾過材 4 の周囲から流れ出さないように、かつ多孔質濾過材 4 を通らずに排出口から流れ出てしまわないようにすることがある。

装置が複数個のウェル 10 を有する実施形態においては、ウェル内挿入体 200 の個数がウェル 10 の個数に等しく、各ウェル 10 が対応するウェル内挿入体 200 を有するようにするのが好ましい。

或る実施形態では、ウェル内挿入体 200 の各々の構成が、それぞれ挿入されることになる対応するウェル 10 の構成に概して適合するようになっている。例えば断面が円形であるウェル 10 の場合は、ウェル内挿入体 200 のうちウェル 10 の内容積を占めることになる部分が、同様に断面が円形になっていてよい。ウェル内挿入体 200 のうちウェル 10 の内容積を占めることになる部分の外径は、ウェル壁 1 の輪郭と合致しているべきであって、ウェル 10 の対応領域の内径よりも若干小さくなっているべきである。そうすることで、ウェル内挿入体 200 をウェル 10 内に導入した際に動作位置にて固定され、ウェル内挿入体 200 の外壁がウェル壁 1 に対して接する（つっぱる）ようにできる。すなわちウェル内挿入体 200 の内容積が、濾過装置 100 の有するウェル 10 の流路となり、かつウェル内挿入体 200 の注入口がウェル 10 の注入口になる、というわけである。ウェル内挿入体 200 の高さを変更すれば、ウェルの有効容積を変更できる。つまりウェル内挿入体 200 の高さを大きくして、ウェル 10 の外に軸方向に飛び出すようにすることで、マルチウェル様式を変更しなくても（自動機械に適合する96ウェル式などのままであっても）、ウェルの容積を効率的に増加させられる。

本開示に係る実施形態の範囲に収まる単ウェル式もしくは複ウェル式の別の典型的形状としては、断面が方形のウェルのもの、および断面がハニカム状のものが含まれる。

或る実施形態では図18Bおよび図19からよく理解できるように、ウェル内挿入体 200 の各々を、対応するウェル 100 の中に組み入れた際に、ウェル内挿入体 200 の各々がウェル 10 から軸方向に飛び出すようになっている。つまりウェル内挿入体 200 の軸方向長さが、ウェル 10 の軸方向深さよりも大きいということである。或る実施形態ではウェル内挿入体 200 の長さが変更可能/調節可能であって、種々の所望の容積に合わせられるようになっていてもよい。

複数個のウェル 10 と複数個のウェル内挿入体 200 を有する装置を使う実施形態においては、ウェル内挿入体 200 の各々が個別独立のユニットであってもよいし、あるいは複数個のウェル内挿入体 200 が一体化した部品であってもかまわない。例えば四個のウェル内挿入体 200 を、一体化した2x2アレイ（図18Aおよび図18B参照）や1x4の直線状アレイとして形成または接合してもよい。あるいは、十六個のウェル内挿入体 200 を一体化した4x4アレイ（図19参照）として形成してもよい。図20には、96ウェル式マルチウェル濾過装置 100 において、単独の12x8アレイを使う実施形態を示した。挿入体のアレイを使用する或る実施形態では、マルチウェル濾過装置 100 の天面上に載せるための外周壁 203 を、アレイが具えていてもよい。こうした外周壁 203 は例えば、図11に示す当たり面 A であってよい。この図11の当たり面 A が濾過装置 100 の天面 B に接することで、（一個以上の）ウェル内挿入体が（一個以上の）ウェルへと深く入ってしまわないようになっている。またアレイは対称である必要は無く、例えば1x3、2x3、もしくは4x6のアレイを使ってもかまわない。同様に、全てのウェル内挿入体 200 を含んだ単独一体型ユニットを使ってもよく、例えば96ウェル式マルチウェル板に対して96個分の一体型を、または384ウェル式マルチウェル板に対して384個分の一体型を使ってもよい。

或る実施形態では、封止部 3 と接するウェル内挿入体 200 の表面もしくは自由端が、ウェル壁 1 に沿って角度がついている（傾斜している）ものであってもよい（図13参照）。つまり示した実施形態では、ウェル内挿入体 200 をウェル 10 内に配置するにあたって、ウェル壁 1 に接することになるウェル内挿入体 200 の領域 200A がウェル 10 に潜る深さが、半径方向の最奥部 200B よりも若干短くなっている。このようにつけた傾斜によって、封止部 3 が与圧された際に、封止部 3 が壁 1 および膜（多孔質濾過材） 4 の表面に対して封止を形成しやすくなっているわけである。

或る実施形態では図11からよく理解できるように、ウェル内挿入体 200 が結合部 7 または突起を有する。図11からよくわかるように、結合部 7 は軸方向に伸びる突起であってよい。この実施形態では、軸方向に伸びる突起（結合部） 7 の断面が三角形であって、自由端点 7A に向かって先細りになっている。ウェル 10 が設けられる基板の接合面 6 において、この先細り自由端 7A が接する箇所が、超音波溶接工程の起点となる。或る実施形態では図12の箇所 19 のように、結合部 7 を基板表面に固定するにあたって、熱接着、融着、または何らかの他の固定方法を用いてよい。そうすることでウェル内挿入体 200 をウェル 10 内の適切な位置に恒久的に固定できるため、その位置でウェル内挿入体 200 が与圧部 3 に十分な力を掛けることで、ウェル内壁 1 と膜もしくは多孔質濾過材 4 とのあいだで封止部 3 を与圧して、十分な封止を行い封止部 3 の周囲から流体が洩れ出さないようにできる。或る実施形態では、マルチウェル濾過装置 100 の表面上の結合点が、ウェル 10 同士のあいだの領域内にあってもよい。

或る実施形態ではウェル 10 が設けられる基板の材料と同じか類似する材料を使って、ウェル内挿入体 200 を構築してもよい。ここで重要なのは、その材料が超音波溶接に適するものであるべきことである。こうすることで、ウェル内挿入体 200 を基板に（超音波エネルギーの使用などによって）熱融着できる。

上述した実施形態のいずれにおいても封止部 3 は、断面が円状のOリング、ダイ切断した平たいシートガスケット材料、または図17に示したような断面を有するように専用に成形したエラストマー封止部であってよい。これらを切断するにあたっては種々の手段を使用でき、例えばダイ切断、水ジェット、レーザーなどを使用できる。あるいは別の手法として、ウェル内挿入体 200 もしくは用途に合った他のガスケットの上に、エラストマー封止部を被覆成形してそれを封止部 3 としてもかまわない。

図10の実施形態は以下のように組み立てられる。膜などの多孔質濾過材 4 をダイ切断して円板状にし、ウェル 10 の底に置いて、ウェル排出口もしくは第二開口部 15 を覆うようにする。ガスケットやOリングなどの封止部 3 を、ウェル 10 内で膜の天面（つまり濾過の上流側）に配置する。そしてウェル内挿入体 200 をウェル 10 に挿入し、ウェル内挿入体 200 がウェル 10 内で封止部 3 に接することで、多孔質濾過材 4 と、ウェル壁 1 と、封止部 3 に接するウェル内挿入体 200 の（一個以上の）表面とに対して封止部 3 が与圧をするような位置に設定する。そしてウェル内挿入体 200 を、ウェル 10 が設けられた基板（マルチウェル装置 100 の天面など）へと固定する。その際には、溶接、結合、接着その他の固定手法を使用できる。

またその他のウェル内挿入体 200 の基板への接合方法も可能であり、例えば図14に示す手法を使用できる。図14の実施形態は機械的結合手段であって、スナップ機構 80 を有する。このスナップ機構 80 は、濾過装置の接合上に在る対応繋合部（受け部） 90 と、単独のとりつき位置を取れるようになっている。スナップ機構 80 は軸方向に伸びる腕部 81 を有し、腕部 81 には切り欠き 82 が設けられている。さてウェル内挿入体 200 がウェル 10 内に軸方向に導入されていくと、濾過装置の開口部 101 を通ってスナップ機構 80 が入り込んでいくことになる。すると腕部 81 の可撓性によって、まず腕部 81 が繋合部 90 の自由端によって半径方向に（図14で矢印 83 で示すように右側へ）押されることになる。そしてスナップ機構 80 が繋合部 90 を通過すると、今度は腕部 81 が弾き戻ることになる。つまり半径方向に、図14の左側（矢印 83 の逆向き）へと弾き戻るわけである。すると繋合部 90 の下でロックが掛かり、ウェル内挿入体 200 が機能できる位置に固定されることになる。

図15にも同様の実施形態を示しているが、腕部 81 に複数の切り欠き（ノッチ） 82A, 82B, 82C が設けられているところが異なる。これらの切り欠きは、爪車（ラチェット）と似たように機能できる。なお図示しているのは三個の切り欠きではあるが、当業者であれば切り欠きの個数を特定に限定しなくてもよく、三個より多いか少ない切り欠きを使ってもよいと理解できる。複数個の切り欠きが存在することで、繋合部 90 とどの切り欠きが噛み合うかに依ってウェル内挿入体 200 をウェル 10 に入れる深さを変更できるため、膜 4 の厚さを可変に調節でき、与圧条件も調整できる。

図16には、ウェル 10 が設けられた基板にウェル内挿入体 200 を結合するにあたり、接着剤 95 を用いる場合を示した。適切な接着剤としては、市販のUV硬化性接着剤、熱硬化性接着剤、および二剤型接着剤が挙げられる。一例としてLOCTITE 3936、LOCTITE EA E-60 HP、およびE-30CLなどがある。図16の実施形態からわかるように、濾過装置の天面（マルチウェル濾過装置 100 の天面など）に窪み領域 101' を設けて、そこに接着剤 95 を載せ、ウェル内挿入体 200 を接合できるようにしてもよい。

全ての場合においてウェル内挿入体 200 を結合するために使われる（一種以上の）機構の個数と場所は、ウェル 10 全体にわたって一定の力が掛かり、装置が有する全てのウェル 10 に均等な封止与圧力が得られるようにする上で充分なものとすべきである。この目的を達成するために、同じ装置において複数種の結合機構を用いてもかまわない。

本開示に係る実施形態による濾過装置が適する用途は数多あり、例えば基礎試料調製、そしてその中でも真空、圧力、もしくは遠心力などの駆動力を伴う基礎試料調製が挙げられる。また薬剤のfree versus boundなアッセイも用途として挙げられる。こうしたアッセイでは、患者へ一度導入された薬剤の有効性を調査する。具体的には、結合を起こさずに所望の箇所で機能できる薬剤の量を確認している。例えば関心ある薬剤を、血清などの血液製剤中に混ぜ込んで、インキュベートしてから限外濾過膜を介して遠心する。するとその限外濾過膜には血液もしくは血清の物質が保持され、その一方で結合しなかった（non-bound）薬剤は膜を自由に通過して捕集されることになる。こうして収集した濾液を試験することで、結合したもの対遊離のもの（bound versus free）の比率を測定できる。

本開示に係る実施形態群は、限られた数の実施形態のみを含むものであるが、これらの特定の実施形態群は、その他により記載されまた請求される範囲を限定しようとするものではない。開示したところからの変更・変形例もまた存在する。以下の実施例は、本開示に係る実施形態群を具体的に描写するために提示するものであり、本開示に係る実施形態群がその実施例が示す具体的な詳細に限定されるわけではないことを理解されたい。

実施例1
本開示に係る実施形態に沿って、MilliporeSigmaから市販されているULTRACEL膜（分子量カットオフ:10K、厚さ:約0.010インチ）を使ってポリプロピレン製の96ウェル板を組み上げた。Oリングを封止部として使った。ウェル内挿入体の2x2配列を二十四個溶接して、対応する各ウェル内でOリングを圧縮でき、かつ各ウェル内で膜表面を封止できるような位置になるようにした。

試験方法は以下のように準備した。
96ウェル板
吸収度終点
全板
波長: 410
光路長補正: 977/900
1cmでの吸収: 0.18
読取速度: Normal（通常）、ディレイ: 100msec、測定/データポイント: 8

濾液中のシトクロムCの百分率を、検量線から算出した。

最初の板による結果からは、封止が機能しうることが分かった。この最初の板は手製のもので、溶接深さについては最低限の制御しかできていなかった。第一のグラフには、シトクロムCの検量線を示す。その下の(2)表には、保持された蛋白質の%を示した。各板にて一個を除く全てのウェルが、充分な保持性能を持っていたことがわかる。これはつまり、蛋白質のうちの90%超を保持できていたこと、すなわち封止の完全性が確かめられたことを意味する。

Claims (33)

1. 内壁を有するウェル壁により劃定され且つ第一の開口部および前記第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、且つ前記第一の開口部と前記第二の開口部の間がウェル容積として定まる一個以上のウェルを有する基板と、
   前記一個以上のウェルの中に、前記第二の開口部を覆うようにして配置される、多孔質濾過材と、
   前記一個以上のウェルの中の、前記多孔質濾過材の一部の上に配置される、封止部と、
   前記一個以上のウェルの中で、前記封止部に与圧することで、前記多孔質濾過材と共に、前記一個以上のウェルが有する前記ウェル壁の前記内壁に対して、封止関係になるように配置される、与圧部と
   を含む、濾過装置。
2. 前記基板が複数個のウェルを有する、請求項1に記載の濾過装置。
3. 前記与圧部と前記封止部が一体である、請求項1に記載の濾過装置。
4. 前記封止部がOリングである、請求項1に記載の濾過装置。
5. 前記与圧部が、一個以上の放射状突起を有することで、前記与圧部を前記一個以上のウェル内に締まりばめさせる、請求項1に記載の濾過装置。
6. 前記与圧部が、前記封止部の少なくとも一部を閉じ込む、請求項1に記載の濾過装置。
7. 前記封止部が、前記与圧部の少なくとも一部を閉じ込む、請求項1に記載の濾過装置。
8. 前記封止部が、前記与圧部の少なくとも一部を閉じ込む、請求項6に記載の濾過装置。
9. 前記多孔質濾過材が膜を含む、請求項1に記載の濾過装置。
10. 前記多孔質濾過材が、複数の膜を含む、請求項1に記載の濾過装置。
11. 前記複数の膜の各々が、前記複数の膜のうちのその他の膜とは異なる孔径を有する、請求項10に記載の濾過装置。
12. 前記与圧部がウェル内挿入体であって、前記ウェル内挿入体が、前記基板と結合し、且つ前記一個以上のウェルの中に配置され、
    前記ウェル内挿入体が、前記ウェル壁に接する壁を有する
    ことを特徴とする、請求項1に記載の濾過装置。
13. 前記ウェル内挿入体が、前記封止部を与圧する先細り自由端を有する、請求項12に記載の濾過装置。
14. 前記基板が複数個のウェルを有する、請求項12に記載の濾過装置。
15. 前記封止部がOリングである、請求項12に記載の濾過装置。
16. 前記多孔質濾過材が膜を含む、請求項12に記載の濾過装置。
17. 前記多孔質濾過材が複数の膜を含む、請求項12に記載の濾過装置。
18. 前記複数の膜のそれぞれが、前記複数の膜のうちのそれ以外の膜とは違う孔径を有する、請求項17に記載の濾過装置。
19. 前記ウェル内挿入体が、熱接着によって前記基板と結合する、請求項12に記載の濾過装置。
20. 前記ウェル内挿入体が、超音波溶接によって前記基板と結合する、請求項12に記載の濾過装置。
21. 前記ウェル内挿入体が、接着剤によって前記基板と結合する、請求項12に記載の濾過装置。
22. 前記ウェル内挿入体が、機械的結合手段によって前記基板と結合する、請求項12に記載の濾過装置。
23. 前記ウェル内挿入体の高さが、前記ウェルの前記第一の開口部よりも軸方向に高くなるのに充分な高さである、請求項12に記載の濾過装置。
24. 濾過装置であって、
    複数個のウェルを有する基板であって、ここで各ウェルは、内壁を有するウェル壁により劃定され且つ第一の開口部および前記第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、且つ前記第一の開口部と前記第二の開口部の間がウェル容積として定まる、基板と、
    各ウェルの中に、前記第二の開口部を覆うようにして配置される、一個以上の多孔質フィルターと、
    各ウェルの中の、前記多孔質濾過材の一部の上に配置される、封止部と、
    前記基板に結合する、複数個のウェル内挿入体と
    を含み、
    前記ウェル内挿入体の個数が、前記複数個のウェルの個数に対応し、
    各ウェル内挿入体が、対応するウェル内に配置される領域を有することによって、前記封止部を与圧し、前記多孔質フィルターと共に、前記ウェル壁の前記内壁に対して封止関係をなす
    ことを特徴とする、濾過装置。
25. 複数個の前記ウェル内挿入体のうちの少なくとも幾つかが、アレイをなすように互いに結合する、請求項24に記載の濾過装置。
26. 前記ウェル内挿入体が、熱接着によって前記基板と結合する、請求項24に記載の濾過装置。
27. 前記ウェル内挿入体が、超音波溶接によって前記基板と結合する、請求項24に記載の濾過装置。
28. 前記ウェル内挿入体が、接着剤によって前記基板と結合する、請求項24に記載の濾過装置。
29. 前記ウェル内挿入体が、機械的結合手段によって前記基板と結合する、請求項24に記載の濾過装置。
30. 各ウェル内に複数の多孔質フィルターが配置され、かつ、
    前記複数の多孔質フィルターのうちの少なくともひとつが、前記複数の多孔質フィルターのうちの別の少なくともひとつと異なる孔径を有する
    ことを特徴とする、請求項24に記載の濾過装置。
31. 濾過装置を用いて試料を濾過するための方法であって、
    前記濾過装置が、
    内壁を有するウェル壁により劃定され且つ第一の開口部および前記第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、且つ前記第一の開口部と前記第二の開口部の間がウェル容積として定まる一個以上のウェルを有する基板と、
    前記一個以上のウェルの中に、前記第二の開口部を覆うようにして配置される、多孔質濾過材と、
    前記一個以上のウェルの中の、前記多孔質濾過材の一部の上に配置される、封止部と、
    前記基板と結合し、かつ前記一個以上のウェルの中に配置される、ウェル内挿入体と
    を含み、
    前記ウェル内挿入体が、前記封止部を与圧することで、前記多孔質濾過材と共に、前記ウェル壁の前記内壁に対して封止関係をなし、且つ、前記ウェル壁に対して接する壁を有し、
    前記方法は、
    前記ウェル内挿入体の中に前記試料を導入するステップと、
    前記多孔質濾過材を介して前記試料を濾過するステップと
    を含む
    ことを特徴とする、方法。
32. さらに
    前記濾過装置に駆動力を掛けることで、前記多孔質濾過材を介して前記試料の濾過を行うステップ
    を含む、請求項31に記載の方法。
33. 濾過装置を作成するための方法であって、
    一個以上のウェルを有する基板を用意し、ここで前記一個以上のウェルは、内壁を有するウェル壁により劃定され且つ第一の開口部および前記第一の開口部から離れた第二の開口部を有し、且つ前記第一の開口部と前記第二の開口部の間がウェル容積として定まるステップと、
    前記一個以上のウェルの中に、前記第二の開口部を覆うようにして、多孔質濾過材を配置するステップと、
    前記一個以上のウェルの中の、前記多孔質濾過材の一部の上に、封止部を配置するステップと、
    前記一個以上のウェルの中にウェル内挿入体を導入することで、前記封止部を、前記多孔質濾過材および前記ウェル壁の前記内壁に向かって与圧するステップと
    を含む、方法。

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