JP6944709B2 - How to design mRNA - Google Patents
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Description
本発明は、mRNAの設計方法に関する。 The present invention relates to a method for designing mRNA.
多細胞生物の組織や器官は、多種類の細胞で構成されている。ヒトは、60兆(6x1013)個もの細胞から構成され、その種類は、成熟細胞だけでも約400種程度にも及ぶ。これらの細胞については、個々の細胞の機能を解析するだけでなくて、医療応用のための細胞調製において、細胞種を判別したり、同定したりする技術が重要になってきている。The tissues and organs of multicellular organisms are composed of many types of cells. Humans are composed of as many as 60 trillion (6x10 13 ) cells, and there are about 400 types of mature cells alone. For these cells, not only the function of individual cells but also the technique of discriminating and identifying the cell type is becoming important in the cell preparation for medical application.
細胞を同定するためには、特異的に発現した細胞表面のマーカー因子を、抗体で検出する手法が一般的に知られている。しかし、抗体で細胞内の情報を検出するためには、対象細胞を固定・膜透過させる必要があり、生細胞の分取には応用することができないという問題があった。また、細胞表面に必ずしも細胞の特定が可能なレセプターが存在するものではない。また、抗体による細胞のマーカー因子検出のような、一因子を、positive/negative(陰性または陽性)の2つに分類する手法は、細胞を定性的に分類する手法となり、精密な分類が難しいという問題がある。 In order to identify cells, a method of detecting a specifically expressed marker factor on the cell surface with an antibody is generally known. However, in order to detect intracellular information with an antibody, it is necessary to fix and permeate the target cells through the membrane, and there is a problem that it cannot be applied to the separation of living cells. In addition, there is not always a receptor on the cell surface that can identify the cell. In addition, a method of classifying one factor into two, positive / negative (negative or positive), such as detection of a marker factor of cells by an antibody, is a method of qualitatively classifying cells, and precise classification is difficult. There's a problem.
細胞をより精密に分類する方法、すなわち細胞を定量的に分類する方法としては、例えば、マイクロアレイや次世代シーケンシングなどを用いた多変量の測定に基づく細胞のプロファイリングが知られている。これらの方法では、タンパク質やRNAなどの細胞内分子について、多種類の分子を同時に定量測定し、また多変量解析などの統計解析を用いるなどして、定量的に細胞を分類することが可能である。しかし、測定をなされた細胞は破壊されてしまうため、細胞を生存させた状態では測定できないという問題がある。 As a method for classifying cells more precisely, that is, a method for quantitatively classifying cells, for example, cell profiling based on multivariate measurement using a microarray or next-generation sequencing is known. With these methods, it is possible to quantitatively classify cells for intracellular molecules such as proteins and RNA by simultaneously quantitatively measuring many types of molecules and using statistical analysis such as multivariate analysis. be. However, since the measured cells are destroyed, there is a problem that the measurement cannot be performed when the cells are alive.
そこで、所望の細胞に特異的に発現するマイクロRNA(以下、miRNAと指称する)を利用して、マーカーの遺伝子発現を抑制するという点に着目し、当該システムを利用した細胞分離方法が、提案されている(特許文献1)。 Therefore, focusing on the fact that microRNA (hereinafter referred to as miRNA) specifically expressed in a desired cell is used to suppress the gene expression of a marker, a cell separation method using the system has been proposed. (Patent Document 1).
特許文献1の方法では、着目する所望の細胞によっては、細胞を分類するための適切なmiRNAが選択できないこともあり、当該システムの改良が望まれている。
In the method of
本発明者らは、2以上のmiRNA応答配列とそれと機能的に連結したマーカー遺伝子配列を含むmRNAについて、1つのmRNAが複数のmiRNAを可算的に検出できること、各miRNAへの検出感度をmRNA上のmiRNA標的配列の位置で調節できることを発見した。すなわち、多因子の情報を先に要約してから、その結果合成されたパラメータを検出することで、同時に検出可能な、限られたシグナル数でも、多数の生細胞内因子の定量情報に由来し、そのエッセンスを抽出した合成パラメータを直接検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors can detect a plurality of miRNAs in a measurable manner with respect to an mRNA containing two or more miRNA response sequences and a marker gene sequence functionally linked to the response sequences, and the detection sensitivity to each miRNA is measured on the mRNA. It was discovered that it can be regulated by the position of the miRNA target sequence of. That is, by summarizing the multifactorial information first and then detecting the parameters synthesized as a result, it is derived from the quantitative information of a large number of living intracellular factors even with a limited number of signals that can be detected at the same time. , And found that the synthetic parameter from which the essence was extracted can be directly detected, and completed the present invention.
したがって、本発明の課題は以下の手段により解決することができる。
[1] 以下の工程を含む、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを設計する方法であって、当該miRNA応答配列を2以上含有するmRNAが、2以上のmiRNA応答配列とそれと機能的に連結したマーカー遺伝子配列を含むmRNAである、方法;
(1)1つのmiRNA応答配列を有するmRNAの翻訳抑制効果を2以上の対象細胞で測定する工程、
(2)前記工程(1)の測定結果に基づき、各対象細胞でのmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAの翻訳抑制効果を算出する工程、
(3)前記工程(2)で算出された値に基づき、前記2以上の対象細胞間における翻訳抑制効果の差が最大になる、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程。
[2] 前記工程(1)と工程(2)の間に、前記工程(1)の測定結果に基づき、前記工程(2)の算出に使用するmiRNA応答配列の種類を、多変量解析を用いて限定する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[3] 前記工程(2)の翻訳抑制効果が、前記2以上のmiRNA応答配列のそれぞれの翻訳抑制効果-log(ρ)を、miRNAの数だけ合算して得られるものであり、前記それぞれの翻訳抑制効果-log(ρ)が、下記式
(式中、ρは、miRNAによる翻訳抑制効果を表し、
d [nt]は、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離 を表し、
ξは、-0.576を表し、
ρ0 はそれぞれのmiRNAについて距離0 [nt] の時の仮想的な翻訳抑制効果を表す)
に基づいて算出される、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記工程(3)が、各対象細胞におけるマーカー遺伝子の翻訳量の分散を最大にする、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程を含む、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] [1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法でmRNAを設計する工程と、
前記設計されたmRNAを、遺伝子工学的手法により合成する工程と
を含む、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAの製造方法。
[6] [1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法で設計されたmRNAを用いて、マーカー遺伝子の翻訳量を指標として2以上の対象細胞を分離する方法。
[7] 前記mRNAが、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法で設計された、マーカー遺伝子配列及び5’UTRの配列がそれぞれ異なる4種のmRNAである、[6]に記載の方法。Therefore, the problem of the present invention can be solved by the following means.
[1] A method for designing an mRNA containing two or more miRNA response sequences, which comprises the following steps. An mRNA containing two or more miRNA response sequences is functionally linked to two or more miRNA response sequences. An mRNA containing the marker gene sequence that has been used;
(1) A step of measuring the translational inhibitory effect of mRNA having one miRNA response sequence in two or more target cells.
(2) A step of calculating the translation inhibitory effect of an mRNA containing two or more miRNA response sequences in each target cell based on the measurement result of the step (1).
(3) A step of selecting an mRNA containing two or more miRNA response sequences that maximizes the difference in translation inhibitory effect between the two or more target cells based on the value calculated in the step (2).
[2] Between the steps (1) and (2), based on the measurement result of the step (1), the type of miRNA response sequence used for the calculation of the step (2) is determined by multivariate analysis. The method according to [1], further comprising a step of limiting the above.
[3] The translation-suppressing effect of the step (2) is obtained by adding up the translation-suppressing effects-log (ρ) of each of the two or more miRNA response sequences by the number of miRNAs, and each of the above. Translation suppression effect-log (ρ) is expressed by the following formula
(In the formula, ρ represents the translational inhibitory effect of miRNA.
d [nt] represents the distance from the start codon to the miRNA target sequence
ξ represents -0.576,
ρ 0 represents the virtual translational repression effect for each miRNA at a distance of 0 [nt])
The method according to [1] or [2], which is calculated based on.
[4] The steps (3) of [1] to [3] include the step of selecting an mRNA containing two or more miRNA response sequences that maximizes the dispersion of the translation amount of the marker gene in each target cell. The method according to any one item.
[5] The step of designing mRNA by the method according to any one of [1] to [4], and
A method for producing an mRNA containing two or more miRNA response sequences, which comprises a step of synthesizing the designed mRNA by a genetic engineering method.
[6] A method for separating two or more target cells using the mRNA designed by the method according to any one of [1] to [4], using the translation amount of the marker gene as an index.
[7] The mRNAs are four types of mRNAs having different marker gene sequences and 5'UTR sequences, which are designed by the method according to any one of [1] to [4] [6]. The method described in.
本発明によれば、所望の細胞をより高精度で分離することが可能な、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを設計する方法が提供される。当該mRNAは、1分子で多数のmiRNAに応答し、かつ個々のmiRNAへの応答の程度(検出感度)を任意に調節可能なプローブとして機能する。すなわち、本発明により、細胞内の多因子情報を線形モデルで抽出することに成功した。従来技術では、非侵襲的に(細胞を殺さずに)同時に検出可能なシグナルの数は限られており、1対1に対応した検出プローブでは対応できなかったが、本発明の設計方法により、同時に検出可能な、限られたシグナル数でも、多数の生細胞内因子の定量情報に由来し、そのエッセンスを抽出した合成パラメータを直接検出することができるようになった。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there is provided a method for designing an mRNA containing two or more miRNA response sequences capable of separating desired cells with higher accuracy. The mRNA responds to a large number of miRNAs in one molecule, and functions as a probe in which the degree of response to each miRNA (detection sensitivity) can be arbitrarily adjusted. That is, according to the present invention, we have succeeded in extracting intracellular multifactorial information with a linear model. In the prior art, the number of signals that can be detected simultaneously non-invasively (without killing cells) is limited and cannot be handled by a one-to-one detection probe. Even with a limited number of signals that can be detected at the same time, it has become possible to directly detect synthetic parameters derived from the quantitative information of a large number of living intracellular factors and extracting their essences.
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments. The following embodiments do not limit the present invention.
本発明は、第1実施形態によれば、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを設計する方法であって、当該miRNA応答配列を2以上含有するmRNAが、2以上のmiRNA応答配列とそれと機能的に連結したマーカー遺伝子配列を含むmRNAである、方法に関する。本実施形態による方法は、以下の工程を含む。
(1)1つのmiRNA応答配列を有するmRNAの抑制効果を2以上の対象細胞で測定する工程、
(2)前記工程(1)の測定結果から、各細胞でのmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAの翻訳抑制効果を算出する工程、
(3)前記工程(2)で算出された値より、2以上の対象細胞間における翻訳抑制効果の差が最大になるmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程。According to the first embodiment, the present invention is a method for designing an mRNA containing two or more miRNA response sequences, wherein the mRNA containing two or more miRNA response sequences is two or more miRNA response sequences and their functions. It relates to a method that is an mRNA containing a marker gene sequence that is specifically linked. The method according to this embodiment includes the following steps.
(1) A step of measuring the inhibitory effect of mRNA having one miRNA response sequence on two or more target cells.
(2) A step of calculating the translational inhibitory effect of mRNA containing two or more miRNA response sequences in each cell from the measurement result of the step (1).
(3) A step of selecting an mRNA containing 2 or more miRNA response sequences that maximizes the difference in translation inhibitory effect between 2 or more target cells from the values calculated in the above step (2).
本発明は、2以上のmiRNAの応答配列(以下、miRNA応答配列、あるいはmiRNA標的配列ともいう)とこれに機能的に連結したマーカー遺伝子を含むメッセンジャーRNA(mRNA)が、各miRNA応答配列個別の翻訳抑制効果の積算値に翻訳抑制効果を備え、かつ、各miRNA応答配列個別の翻訳抑制効果は、各miRNA応答配列の開始コドンからの距離に反比例するという発見に基づく。 In the present invention, a messenger RNA (mRNA) containing a response sequence of two or more miRNAs (hereinafter, also referred to as a miRNA response sequence or a miRNA target sequence) and a marker gene functionally linked thereto is an individual miRNA response sequence. It is based on the discovery that the integrated value of the translational repression effect has a translational repression effect, and the translational repression effect of each miRNA response sequence is inversely proportional to the distance from the start codon of each miRNA response sequence.
本発明において、2以上のmiRNAの応答配列とマーカー遺伝子が機能的に連結するとは、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム(ただし、開始コドンを含む。)の5’UTR内に、2以上のmiRNA応答配列を備えることを意味する。このようなmRNAは、細胞内での対応するmiRNAの発現を指標として、細胞種を分離することができる。さらに詳細には、細胞内に対応するmiRNAが発現していると、その発現量に応じて、マーカー遺伝子の翻訳が抑制される。ここでいう、「miRNAの発現」とは、成熟miRNAが、所定の複数の蛋白質と相互作用して、RNA-induced silencing complex(RISC)を形成した状態にあるmiRNAが存在していることをいうものとする。「成熟miRNA」は、一本鎖RNA(20〜25塩基)であり、核外でDicerによる切断によってpre-miRNAから生じ、「pre-miRNA」は、Droshaと呼ばれる核内酵素による部分切断によって、DNAから転写された一本鎖RNAであるpri-mRNAから生じる。本発明におけるmiRNAとは、少なくとも10,000種類以上のmiRNAから選択することができる。詳細には、データベースの情報(例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/)に登録されたmiRNA、及び/または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより選択することができ、市販のライブラリのmiRNAより選択することもできる。すなわち、本発明においては、指標となるmiRNAは特定のmiRNAに限定されるものではない。 In the present invention, the functional linkage between the response sequence of two or more miRNAs and the marker gene means that the two or more miRNAs are within the 5'UTR of the open reading frame (but including the start codon) encoding the marker gene. It means to have a response sequence. Such mRNA can be separated into cell types using the expression of the corresponding miRNA in the cell as an index. More specifically, when the corresponding miRNA is expressed in the cell, the translation of the marker gene is suppressed according to the expression level. The term "miRNA expression" as used herein means that there is a miRNA in a state in which mature miRNA interacts with a plurality of predetermined proteins to form an RNA-induced silencing complex (RISC). Shall be. "Mature miRNAs" are single-stranded RNAs (20-25 bases) that result from pre-miRNAs by cleavage by Dicer outside the nucleus, and "pre-miRNAs" by partial cleavage by a nuclear enzyme called Drosha. It arises from pri-mRNA, a single-stranded RNA transcribed from DNA. The miRNA in the present invention can be selected from at least 10,000 types of miRNA. For details, miRNA registered in database information (for example, http://www.mirbase.org/ or http://www.microrna.org/) and / or literature information described in the database. It can be selected from the miRNAs described in, and can also be selected from the miRNAs of commercially available libraries. That is, in the present invention, the index miRNA is not limited to a specific miRNA.
本実施形態による設計方法に用いる、上記のようなmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAを本明細書中で、miRNA応答性mRNA、n-slot mRNA(nは2以上の整数)、あるいはレポーターmRNAとも指称する。このようなmiRNA応答性mRNAの基本的な構造について説明する。 In the present specification, mRNA containing two or more miRNA-responsive sequences as described above used in the design method according to the present embodiment is referred to as miRNA-responsive mRNA, n-slot mRNA (n is an integer of 2 or more), or reporter mRNA. Also referred to as. The basic structure of such miRNA-responsive mRNA will be described.
本実施形態において設計するmRNAの模式的な構造を、図2aの上図に例示する。図2aに示すmRNAは、5’末端から、5’から3’の向きに、Cap構造(7メチルグアノシン5’リン酸)、miRNAの応答配列を挿入可能な5つのスロット、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、並びに、ポリAテイルを備える。 The schematic structure of the mRNA designed in this embodiment is illustrated in the upper figure of FIG. 2a. The mRNA shown in FIG. 2a encodes a Cap structure (7-methylguanosine 5'phosphate), five slots into which the miRNA response sequence can be inserted, and a marker gene in the direction from the 5'end to the 5'to 3'. It has an open reading frame and a poly A tail.
ここで、「スロット」とは、miRNA標的配列を挿入可能な部分を概念的に示すものであって、各スロットは、miRNA標的配列、またはmiRNAの標的ではない配列(空スロットともいう)から構成される。ただし、5つのスロットのうち、2以上には、同一もしくは異なるmiRNA標的配列が挿入される。各スロットに挿入されるmiRNA標的配列、またはmiRNAの標的ではない配列の塩基数は、同一であってもよく異なっていてもよいが、概ね20〜25塩基である。スロット間には、任意の数の塩基が存在してもよく、存在しなくてもよい。また、3以上のスロットを含むmRNAにおいては、各スロット間の塩基数及び配列が同じであっても異なっていてもよい。 Here, the "slot" conceptually indicates a portion into which a miRNA target sequence can be inserted, and each slot is composed of a miRNA target sequence or a sequence that is not a target of miRNA (also referred to as an empty slot). Will be done. However, the same or different miRNA target sequences are inserted in two or more of the five slots. The number of bases of the miRNA target sequence or the non-target sequence of miRNA inserted into each slot may be the same or different, but is approximately 20 to 25 bases. Any number of bases may or may not be present between the slots. Further, in the mRNA containing 3 or more slots, the number of bases and the sequence between the slots may be the same or different.
miRNA標的配列は、指標となるmiRNAに特異的に結合可能な配列をいう。miRNA標的配列は、例えば、指標となるmiRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNA標的配列は、miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致(ミスマッチ)を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、40〜50% 程度の不一致があっても良いとされている。このような不一致は、特に限定されないが、1塩基、2塩基、3塩基、4塩基、5塩基、6塩基、7塩基、8塩基、9塩基、若しくは10塩基又は全認識配列の1%、5%、10%、20%、30%、若しくは40%の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えている mRNA 上の miRNA 標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわち miRNA の 3’ 側 16 塩基程度に対応する、標的配列内の 5’ 側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、1塩基、2塩基、若しくは3塩基の不一致を含んでもよい。また、開始コドンとなりうるAUG配列が含まれることのないように、miRNA標的配列を選択することが好ましい。 A miRNA target sequence is a sequence that can specifically bind to an index miRNA. The miRNA target sequence is preferably, for example, a sequence that is completely complementary to the index miRNA. Alternatively, the miRNA target sequence may have a mismatch with a perfectly complementary sequence as long as it can be recognized in the miRNA. The discrepancy from the sequence completely complementary to the miRNA may be any discrepancy that can be normally recognized by the miRNA in the desired cell, and the original intracellular function in vivo is about 40 to 50% of the discrepancy. It is said that there may be. Such discrepancies are not particularly limited, but are 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases, or 1% of the entire recognition sequence, 5 %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancies are exemplified. Also, in particular, like the miRNA target sequence on mRNA provided by cells, in particular, on the part other than the seed region, that is, on the 5'side of the target sequence, which corresponds to about 16 bases on the 3'side of miRNA. The region may contain a large number of discrepancies, and the portion of the seed region may contain no discrepancies or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases of discrepancies. In addition, it is preferable to select the miRNA target sequence so that the AUG sequence that can be the start codon is not included.
スロットに挿入され得るmiRNAの標的ではない配列(以下、非標的配列ともいう)は、特に限定されるものではないが、miRNA標的配列との類似性が低く、かつ、AUGを配列として含まないものであることが好ましい。類似性が低いとは、例えば、60%以上、70%以上、あるいは80%以上が不一致の配列であってもよいが、これらには限定されない。同一のmiRNA応答性mRNA上に、2以上の空スロットが存在する場合には、それぞれの空スロット挿入される非標的配列は、同一でも異なっていてもよい。また、特定の対象細胞の分離を指標に設計された複数種のmiRNA応答性mRNAのセットにおいて、異なるmiRNA応答性mRNAの空スロット挿入される非標的配列も、同一でも異なっていてもよい。 The non-target sequence of miRNA that can be inserted into the slot (hereinafter, also referred to as non-target sequence) is not particularly limited, but has low similarity to the miRNA target sequence and does not contain AUG as a sequence. Is preferable. Low similarity may be, for example, 60% or more, 70% or more, or 80% or more mismatched sequences, but is not limited thereto. When two or more empty slots are present on the same miRNA-responsive mRNA, the non-target sequences inserted in each empty slot may be the same or different. In addition, the non-target sequences to be inserted into empty slots of different miRNA-responsive mRNAs in a set of multiple miRNA-responsive mRNAs designed with the isolation of a specific target cell as an index may be the same or different.
miRNA応答性mRNAにおいて、Cap構造と最も5’側に位置するスロット(図2においては、slot-1)と間の塩基数及び塩基の種類は、開始コドンとなるAUGを含まず、かつステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、Cap構造とmiRNA標的配列と間の塩基数には、特に限定はなく、目的及び用途に合わせた塩基数となるように設計することができるが、例えば、1000塩基以下、好ましくは500塩基以下、さらに好ましくは250塩基以下の範囲で設計することができる。また、最も開始コドンに近接するスロット(図2においてはslot-5)と開始コドンと間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。したがって、最も開始コドンに近接するスロットと開始コドンと間の塩基数にも特に上限はなく、例えば、1000塩基以下、好ましくは500塩基以下、さらに好ましくは250塩基以下の範囲で、例えば、2〜20塩基、好ましくは3〜20塩基となるように設計することができる。 In miRNA-responsive mRNA, the number of bases and the type of base between the Cap structure and the slot located closest to the 5'side (slot-1 in FIG. 2) do not include AUG, which is the start codon, and the stem structure. It may be arbitrary as long as it does not form a three-dimensional structure. For example, the number of bases between the Cap structure and the miRNA target sequence is not particularly limited and can be designed to be the number of bases according to the purpose and application. For example, 1000 bases or less, preferably 500 bases or less. Below, more preferably, it can be designed in the range of 250 bases or less. Further, the number of bases and the type of bases between the slot closest to the start codon (slot-5 in FIG. 2) and the start codon may be arbitrary as long as they do not form a stem structure or a three-dimensional structure. Therefore, there is no particular upper limit to the number of bases between the slot closest to the start codon and the start codon, for example, in the range of 1000 bases or less, preferably 500 bases or less, more preferably 250 bases or less, for example, 2 to 2. It can be designed to have 20 bases, preferably 3 to 20 bases.
マーカー遺伝子は、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、細胞種の判別を可能にする任意の蛋白質をコードする遺伝子である。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうる蛋白質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発光又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができる蛋白質であってよい。蛍光蛋白質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光蛋白質;mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光蛋白質;TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光蛋白質;TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光蛋白質;KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光蛋白質;TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光蛋白質;TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed(例えば、hdKeimaRed)、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光蛋白質が挙げられるが、これらには限定されない。 A marker gene is a gene that is translated intracellularly, functions as a marker, and encodes an arbitrary protein that enables discrimination of a cell type. Examples of proteins that can be translated intracellularly and function as markers include proteins that can be visualized and quantified by fluorescence, luminescence, coloration, or by assisting fluorescence, luminescence, or coloration. May be. Fluorescent proteins include blue fluorescent proteins such as Sirius and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (eg hmAG1), ZsGreen, EmGFP, Green fluorescent proteins such as EGFP, GFP2, HyPer, etc .; Yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana; Orange fluorescent proteins such as KusabiraOrange (eg, hmKO2), mOrange. Red fluorescent proteins such as TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry; TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCherry, HcRed, KeimaRed (eg hdKeimaRed), mrasberry, mPlum, etc. Examples include, but are not limited to, infrared fluorescent proteins.
発光蛋白質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質をマーカー遺伝子として使用する場合、所望の細胞の判別において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。 Examples of the luminescent protein include, but are not limited to, aequorin. In addition, examples of proteins that assist fluorescence, luminescence, or color development include, but are not limited to, enzymes that decompose fluorescence, luminescence, or color development precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and β-lactamase. Here, in the present invention, when a protein that assists fluorescence, luminescence, or coloration is used as a marker gene, in determining a desired cell, the corresponding precursor is brought into contact with the cell, or the corresponding precursor is intracellularly used. Can be done by introducing.
また、細胞内でマーカーとして機能しうる蛋白質の別の例としては、細胞の機能に直接影響を与える蛋白質類が挙げられる。細胞増殖蛋白質、細胞死滅蛋白質、細胞シグナル因子、薬剤耐性遺伝子、転写制御因子、翻訳制御因子、分化制御因子、リプログラミング誘導因子、RNA結合タンパク質因子、クロマチン制御因子、膜タンパク質を例示することができるが、これらには限定されない。例えば、細胞増殖蛋白質は、それを発現した細胞のみを増殖させ、増殖した細胞を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅蛋白質は、それを発現した細胞の細胞死を引き起こすことで、特定のmiRNAを含有、もしくは含有しない細胞自体を死滅させ、細胞の生死を示すマーカーとして機能する。細胞シグナル因子は、それを発現した細胞が、特定の生物学的信号を発し、この信号を特定することでマーカーとして機能する。 Another example of a protein that can function as a marker in a cell is a protein that directly affects the function of the cell. Examples thereof include cell proliferation proteins, cell killing proteins, cell signaling factors, drug resistance genes, transcriptional regulators, translational regulators, differentiation regulators, reprogramming inducers, RNA binding protein factors, chromatin regulators, and membrane proteins. However, it is not limited to these. For example, a cell proliferation protein functions as a marker by proliferating only cells expressing it and identifying the proliferated cells. The cell-killing protein causes cell death of the cell expressing it, thereby killing the cell itself containing or not containing a specific miRNA, and functions as a marker indicating the life or death of the cell. A cell signaling factor functions as a marker when a cell expressing it emits a specific biological signal and identifies this signal.
本発明において、マーカー遺伝子は、局在化シグナルをコードする遺伝子を備えていてもよい。局在化シグナルとしては、核局在化シグナル、細胞膜局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、タンパク質分泌シグナル等を挙げることができ、具体的には、古典的核移行配列(NLS)、M9配列、ミトコンドリア標的配列(MTS)、小胞体移行配列を挙げることができるが、これらには限定されない。このような局在化シグナルは、後述するイメージングサイトメトリー等で、本発明の方法における判別工程を、画像上で行うときに特に有利である。 In the present invention, the marker gene may include a gene encoding a localization signal. Examples of the localization signal include a nuclear localization signal, a cell membrane localization signal, a mitochondrial localization signal, a protein secretion signal, and the like, and specifically, a classical nuclear localization sequence (NLS), M9. Sequences, mitochondrial target sequences (MTS), endoplasmic reticulum translocation sequences, but are not limited to these. Such a localized signal is particularly advantageous when the discrimination step in the method of the present invention is performed on an image by imaging cytometry or the like described later.
miRNA応答性mRNAは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、5−メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。 The miRNA-responsive mRNA preferably contains a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of normal uridine or cytidine. This is to reduce cytotoxicity. The positions of the modified bases can be independently all or part of both uridine and cytidine, and if they are a part, they can be random positions at any ratio.
図示する概念図においては、スロットの総数が5であるが、スロットの総数は2以上であればよく、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、あるいはそれ以上であってもよい。本実施形態においては、説明の簡略化のために、スロットの総数が5のmiRNA応答性mRNAを例示して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 In the illustrated conceptual diagram, the total number of slots is 5, but the total number of slots may be 2 or more, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more. It may be. In the present embodiment, for simplification of description, miRNA-responsive mRNA having a total number of slots of 5 will be illustrated and described, but the present invention is not limited thereto.
図2a上図に示す基本的構造を備えるmRNAは、以下の特性(a)、(b)を備える。
(a)miRNA応答配列を2以上含有するmRNAによる翻訳抑制効果は、各スロットのmiRNA標的配列単独による翻訳抑制効果の積算値となる。
(b)各スロットのmiRNA標的配列単独による翻訳抑制効果は、miRNAの種類に関わらず一般に、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離の 定数乗、具体的には-0.576 乗に比例する。
(A) The translational repression effect of an mRNA containing two or more miRNA response sequences is an integrated value of the translational repression effect of the miRNA target sequence alone in each slot.
(B) The translational repression effect of the miRNA target sequence alone in each slot is generally proportional to the constant power of the distance from the start codon to the miRNA target sequence, specifically to the -0.576 power, regardless of the type of miRNA.
(a)の式において、各スロットに挿入されるmiRNA応答配列を、slot-1から順に、それぞれ、miRNA(1)、miRNA(2)、miRNA(3)、miRNA(4)、miRNA(5)とした場合について考える。slot-1に挿入されたmiRNA(1)単独による翻訳抑制効果(ρslot-1)は、miRNA(1)を含めた全ての応答配列に対する阻害剤を添加した系での実測の翻訳抑制効果を1とした場合の、miRNA(1)以外の全ての応答配列に対する阻害剤を添加した系での実測の翻訳抑制効果で表される。slot-2に挿入したmiRNA(2)についての翻訳抑制効果(ρslot-2)、slot-3に挿入したmiRNA(3)についての翻訳抑制効果(ρslot-3)についても同様にして得ることができ、それらの積算値が、複数のスロットを備えるmRNAの予測翻訳抑制効果となる。なお、上記数式のように、ρの対数で考える場合には、合算値が予測翻訳抑制効果の対数となる。In the formula (a), the miRNA response sequences inserted into each slot are arranged in order from slot-1, miRNA (1), miRNA (2), miRNA (3), miRNA (4), miRNA (5), respectively. Consider the case. The translational repression effect (ρ slot-1 ) of miRNA (1) alone inserted in slot-1 shows the actual translational repression effect in a system in which an inhibitor was added to all response sequences including miRNA (1). When it is set to 1, it is represented by the actual translational repression effect in a system in which an inhibitor is added to all response sequences other than miRNA (1). The translation-suppressing effect (ρ slot-2 ) on the miRNA (2) inserted in slot-2 and the translation-suppressing effect (ρ slot-3) on the miRNA (3) inserted in slot-3 can be obtained in the same manner. And the integrated value of them becomes the predictive translation inhibitory effect of mRNA having a plurality of slots. When considering the logarithm of ρ as in the above formula, the total value is the logarithm of the predictive translation suppression effect.
(b)の式において、各スロットの開始コドン(AUG)からの距離dとは、開始コドンAUGのAから5’側に、各スロットを構成するmiRNA応答配列の3’末端の塩基までの塩基数(nt)をいうものとする。また、ρ0は、距離dが0の場合の仮想的な翻訳抑制効果の値をいうものとする。(a)及び(b)式の導出及び実験によるサポートは、実施例に示す。In the formula (b), the distance d from the start codon (AUG) of each slot is the base 5'from A of the start codon AUG to the base at the 3'end of the miRNA response sequence constituting each slot. It shall refer to a number (nt). Further, ρ 0 is a value of a virtual translation suppression effect when the distance d is 0. Derivation of equations (a) and (b) and experimental support are shown in the examples.
本実施形態に係る設計方法は、上記特性を備えるmiRNA応答性mRNAの基本構造に対して、各スロットに挿入するmiRNA応答配列の種類及び数(ただし、2以上)を選択する方法に関する。上記工程(1)に先立って、任意選択的な前工程として、スロットに挿入しうる候補miRNA標的配列をスクリーニングする工程を実施することができる。候補となり得るmiRNA応答配列は、上述の通り、あらゆるmiRNAに対する応答配列であってよい。したがって、本出願時において特定されているmiRNAには限定されず、今後、その存在及び機能が特定されるあらゆるmiRNAを含むものとする。この中から、複数の候補miRNA標的配列間で、類似の配列がなく、また、開始コドンに相当しうるAUGを含まないmiRNA応答配列とすることが好ましい。ここで、類似の配列とは、例えば、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上の配列相同性を有する配列をいうものとする。候補miRNA標的配列をスクリーニングする工程は、一例としては、後述する分離方法を用いて分離する細胞種の特性に応じて指標となるmiRNAを適宜選択することができる。また、特には、分離すべき複数の細胞中で、ある細胞では高発現(高活性)であり、別の細胞では低発現(低活性)であるような、miRNAの組み合わせを選択することができる。分離の精度をより高くするためである。 The design method according to the present embodiment relates to a method of selecting the type and number (however, 2 or more) of miRNA-responsive sequences to be inserted into each slot with respect to the basic structure of miRNA-responsive mRNA having the above characteristics. Prior to the above step (1), as an optional pre-step, a step of screening a candidate miRNA target sequence that can be inserted into the slot can be carried out. Candidate miRNA response sequences can be response sequences to any miRNA, as described above. Therefore, it is not limited to the miRNAs specified at the time of this application, and includes any miRNAs whose existence and function are specified in the future. Among these, it is preferable to use a miRNA response sequence that does not have a similar sequence among a plurality of candidate miRNA target sequences and does not contain AUG that can correspond to the start codon. Here, the similar sequence means, for example, a sequence having sequence homology of about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, and about 95% or more. In the step of screening the candidate miRNA target sequence, as an example, miRNA as an index can be appropriately selected according to the characteristics of the cell type to be separated by using the separation method described later. In particular, it is possible to select a combination of miRNAs that is highly expressed (highly active) in one cell and lowly expressed (lowly active) in another among a plurality of cells to be separated. .. This is to improve the accuracy of separation.
工程(1)は、1つのmiRNA応答配列を有するmRNAの抑制効果を、2以上の対象細胞で測定する工程である。工程(1)で用いる1つのmiRNA応答配列を有するmRNAを、1-slot mRNAとも指称する。この工程では、任意選択的に前工程で選択した、複数種類の候補miRNA標的配列にそれぞれ対応する、1-slot mRNAを合成する。何種類の1-slot mRNAの翻訳抑制効果を測定するかは、当業者が目的と用途に応じて適宜決定することができ、理論上の上限及び下限は存在しない。例えば、20種以上、50種以上、70種以上、100種以上の1-slot mRNAの翻訳抑制効果を測定することができる。 Step (1) is a step of measuring the inhibitory effect of mRNA having one miRNA response sequence on two or more target cells. An mRNA having one miRNA response sequence used in step (1) is also referred to as 1-slot mRNA. In this step, 1-slot mRNA corresponding to each of a plurality of candidate miRNA target sequences arbitrarily selected in the previous step is synthesized. The number of types of 1-slot mRNA to be measured can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose and application, and there is no theoretical upper limit and lower limit. For example, the translational inhibitory effect of 20 or more, 50 or more, 70 or more, and 100 or more 1-slot mRNAs can be measured.
各1-slot mRNAは、5’末端から、5’から3’の向きに、Cap構造(7メチルグアノシン5’リン酸)、1つのmiRNAの応答配列、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、並びに、ポリAテイルを備える。すなわち、図2aに示すmiRNA応答性mRNAのスロットを1つだけにしたものといえ、1-slot mRNAの翻訳抑制効果を測定可能であれば、5'UTRにおける、スロットの5’側や3’側の塩基数や塩基の種類は、任意であってよい。1-slot mRNAは、実験的に上記(b)式における、ρ0を導出するために用いられるためである。Each 1-slot mRNA has a Cap structure (7-methylguanosine 5'phosphate), one miRNA response sequence, an open reading frame encoding a marker gene, and an open reading frame from the 5'end to the 5'to 3'direction. , Equipped with poly A tail. That is, it can be said that the miRNA-responsive mRNA shown in FIG. 2a has only one slot, and if the translational inhibitory effect of 1-slot mRNA can be measured, the 5'side of the slot or 3'in 5'UTR. The number of bases and the type of bases on the side may be arbitrary. This is because 1-slot mRNA is experimentally used to derive ρ 0 in the above equation (b).
対象細胞とは、本実施形態において、miRNA応答性mRNAを設計するための指標となる細胞であって、2種以上、例えば、3種、4種、5種、6種、7種、または8種以上であってもよく、理論上、対象細胞の種類は限定されるものではない。 The target cell is a cell that serves as an index for designing miRNA-responsive mRNA in the present embodiment, and is 2 or more types, for example, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, or 8 types. It may be more than one species, and in theory, the type of target cell is not limited.
対象細胞は、後述する細胞の分離方法において、想定される使用状況において分離対象とする複数の細胞種をいうことができるが、これらには限定されない。分離の対象とする細胞の一例としては、同一の多能性幹細胞から分化した細胞であって、分化の程度が異なる複数種の細胞であってもよい。あるいは、別の例としては、生物個体、臓器、および組織から分取された細胞、あるいはその培養細胞であって、複数種類の細胞が含まれる細胞群、あるいは所望ではない細胞の混入が疑われる細胞群に含まれる細胞が挙げられる。しかしながら、対象細胞は、その細胞内の特徴(miRNA活性)を反映してmiRNA応答性mRNAを設計する指標になるものであればよく、使用状況において実際に分離する細胞と同一種の細胞には限定されない。また、いずれの場合であっても、異なる細胞の種類をおおまかに分類したいのか、類似した細胞の種類の中で細かく分類したいのかなど、分離の目的等によってどのような指標が有効になるのかは異なり、当業者が適宜決定することができる。 The target cell can refer to a plurality of cell types to be separated under the assumed usage conditions in the cell separation method described later, but is not limited thereto. As an example of the cell to be separated, a cell differentiated from the same pluripotent stem cell and a plurality of types of cells having different degrees of differentiation may be used. Alternatively, as another example, cells separated from individual organisms, organs, and tissues, or cultured cells thereof, which include multiple types of cells, or undesired contamination of cells is suspected. Examples include cells included in a cell group. However, the target cell may be an index for designing miRNA-responsive mRNA that reflects its intracellular characteristics (miRNA activity), and is suitable for cells of the same type as the cell that actually separates under usage conditions. Not limited. In any case, what kind of index is effective depending on the purpose of separation, such as whether you want to roughly classify different cell types or finely classify among similar cell types. Differently, those skilled in the art can make appropriate decisions.
分離対象とする細胞は、多細胞生物種から採取した細胞群に含まれる細胞であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞群に含まれる細胞であってもよい。当該細胞は、特には、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等)採取した細胞、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞であってよい。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。また、好ましい細胞は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞群であり、所望しない細胞を含む可能性があり、及び/または不均質な可能性がある細胞群である。例えば、前記体細胞から調製したiPS細胞を含んでなる細胞群であり、あるいはES 細胞やiPS細胞などによって例示される多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群である。本実施形態において、判別対象の細胞群は、生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明は、細胞を本発明の方法に供し、分離方法の終了後においても、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる点で有利である。 The cells to be isolated may be cells included in a cell group collected from a multicellular organism species, or may be cells included in a cell group obtained by culturing isolated cells. The cells are particularly cells collected from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.), cells isolated from mammals, or cells obtained by culturing a mammalian cell line. It may be there. Examples of somatic cells include keratinizing epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells on the surface of the tongue), exocrine gland epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, mammary cells). , Adrenal medulla cells), cells for metabolism and storage (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain canal (eg, blood vessels) Endophilic cells), cell with ciliary capacity (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts), contractile cells (eg, smooth muscle cells), blood and immune system Cells (eg, T lymphocytes), sensory cells (eg, rod cells), autonomic nervous system neurons (eg, cholinergic neurons), sensory and peripheral neuronal support cells (eg, companion cells), central nervous system Nerve cells and glial cells (eg, stellate glial cells), pigment cells (eg, retinal pigment epithelial cells), and their precursor cells (tissue precursor cells). There are no particular restrictions on the degree of cell differentiation or the age of the animal from which the cells are collected. It can be used as the origin of somatic cells in the invention. Examples of undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells. In the present invention, the individual mammal from which the somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably human. Also preferred cells are cell groups that have been artificially manipulated after harvesting early somatic cells, which may contain unwanted cells and / or may be heterogeneous. For example, a cell group containing iPS cells prepared from the somatic cells, or a cell group obtained after differentiating pluripotent stem cells exemplified by ES cells, iPS cells, etc., which are desired cells. It is a group of cells that can include differentiated cells other than the above. In the present embodiment, the cell group to be discriminated is preferably in a viable state. In the present invention, a cell in a viable state means a cell in a state in which the metabolic ability is maintained. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for subsequent applications in which cells are subjected to the method of the present invention, and even after the completion of the separation method, the cells remain alive, particularly maintaining the ability to divide, without losing their innate properties. It is advantageous in that.
対象細胞における翻訳抑制効果の測定は、1-slot mRNAを細胞に導入する工程と、マーカー遺伝子の翻訳量に基づいて、1-slot mRNAの翻訳抑制効果を得る工程とにより実施することができる。 The measurement of the translational inhibitory effect in the target cell can be carried out by a step of introducing 1-slot mRNA into the cell and a step of obtaining the translational inhibitory effect of 1-slot mRNA based on the translation amount of the marker gene.
本発明において、1-slot mRNAを細胞に導入する工程(以下、導入工程と指称する)は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、1種以上の1-slot mRNAを直接、細胞群に含まれる細胞に導入する。場合により50以上、100以上、200以上の異なるmiRNA応答配列について、1-slot mRNAの抑制効果を測定する場合には、miRNA応答配列及びマーカー遺伝子が異なる2種、3種あるいは4種以上のmiRNA応答性mRNAと、コントロールmRNAを、対象細胞に共導入することができる。コントロールmRNAとは、miRNA標的部位を有さず、1-slot mRNAがコードするマーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子をコードするmRNAをいう。共導入した2以上のmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定である。また、この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。 In the present invention, the step of introducing 1-slot mRNA into cells (hereinafter referred to as the introduction step) includes a lipofection method, a liposome method, an electroporation method, a calcium phosphate co-precipitation method, a DEAE dextran method, a microinjection method, and a gene. One or more types of 1-slot mRNA is directly introduced into cells contained in a cell group by using a gun method or the like. In some cases, when measuring the inhibitory effect of 1-slot mRNA for 50 or more, 100 or more, and 200 or more different miRNA response sequences, two, three, or four or more miRNAs having different miRNA response sequences and marker genes are used. Responsive mRNA and control mRNA can be co-introduced into target cells. A control mRNA is an mRNA that does not have a miRNA target site and encodes a marker gene different from the marker gene encoded by 1-slot mRNA. The activity ratio of the marker proteins expressed from two or more co-introduced mRNAs is constant within the cell population. Further, the amount to be introduced at this time varies depending on the cell group to be introduced, the mRNA to be introduced, the method of introduction and the type of the reagent to be introduced, and those skilled in the art can appropriately select these in order to obtain a desired translation amount. The amount of control mRNA introduced can also be appropriately selected by those skilled in the art in order to obtain the desired translation amount.
miRNA応答性mRNAが細胞に導入されると、細胞内では、細胞に所定のmiRNAがRISCとして存在する場合、miRNA応答性mRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳量が制御、例えば翻訳量が抑制される。そして、翻訳量の制御は、miRNA活性に応じて定量的になされる。一方、細胞に所定のmiRNAが存在しない場合、もしくは所定のmiRNAがRISCとして存在しない場合、miRNA応答性mRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳量が抑制されることはない。したがって、所定のmiRNAがRISCとして存在する細胞と、存在しない細胞との間で、マーカー遺伝子の翻訳量が異なる。なお、本明細書において、所定のmiRNAがRISCとして存在する場合を、「miRNA活性が存在する場合」とも指称する。一方、コントロールmRNAは、miRNA活性に関係なくマーカー蛋白質を発現する。導入されても、miRNA標的配列が存在しないため、miRNA発現量に応じて翻訳制御されることがないためである。 When a miRNA-responsive mRNA is introduced into a cell, the translation amount of the marker gene encoded by the miRNA-responsive mRNA is controlled, for example, the translation amount is suppressed when the predetermined miRNA is present as RISC in the cell. .. The amount of translation is controlled quantitatively according to the miRNA activity. On the other hand, when the predetermined miRNA does not exist in the cell, or when the predetermined miRNA does not exist as RISC, the translation amount of the marker gene encoded by the miRNA-responsive mRNA is not suppressed. Therefore, the amount of translation of the marker gene differs between cells in which a predetermined miRNA exists as RISC and cells in which it does not exist. In addition, in this specification, the case where a predetermined miRNA is present as RISC is also referred to as "the case where miRNA activity is present". On the other hand, control mRNA expresses a marker protein regardless of miRNA activity. This is because even if it is introduced, translation control is not performed according to the miRNA expression level because the miRNA target sequence does not exist.
本実施形態においては2以上の対象細胞の全てにおいて、1-slot mRNAの翻訳抑制効果を測定する。 In this embodiment, the translational inhibitory effect of 1-slot mRNA is measured in all of two or more target cells.
マーカー遺伝子の翻訳量は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより得ることができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定
されない。このような検出装置は、マーカー蛋白質及び判別の態様により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカー蛋白質の定量が可能であり、マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能であり、マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能である。マーカー蛋白質が蛍光蛋白質の場合は、フローサイトメトリーを用いて、個々の細胞において翻訳されたマーカー蛋白質である、蛍光蛋白質、発光酵素が発する光の強度を定量的に得ることができるため好ましい。The amount of translation of the marker gene can be obtained by detecting the signal from the marker protein using a predetermined detection device. Examples of the detection device include, but are not limited to, a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, a light emitting microscope, a CCD camera, and the like. As such a detection device, one suitable for those skilled in the art can be used depending on the marker protein and the mode of discrimination. For example, when the marker protein is a fluorescent protein or a luminescent protein, the marker protein can be quantified using a detection device such as a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescent microscope, or a CCD camera, and the marker protein is fluorescent. In the case of a protein that assists luminescence or color development, a method for quantifying the marker protein using a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer is possible. A cell surface protein-specific detection reagent such as an antibody and a method for quantifying a marker protein using the above-mentioned detection device are possible. When the marker protein is a fluorescent protein, it is preferable because flow cytometry can be used to quantitatively obtain the intensity of light emitted by the fluorescent protein and the luciferase, which are the marker proteins translated in individual cells.
なお、1-slot mRNAの翻訳抑制効果の測定方法は、上記した特定の方法のみには限定されず、他の任意の方法で実施することができる。例えば、マイクロアレイを使用する方法や、次世代シーケンシングによる方法を用いて、miRNAと相互作用しているmRNAを定量することによる、1-slot mRNAの翻訳抑制効果の測定が可能であり、これらの方法を用いて測定した場合も本発明を構成するものとする。
工程(1)は、前述の式(b)の原理、すなわち、各スロットのmiRNA標的配列単独による翻訳抑制効果は、miRNAの種類に関わらず一般に、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離の 定数乗、具体的には-0.576 乗に比例する、という発見に基づき、1-slot mRNAの翻訳感度を調節する方法に関する発明ということもできる。すなわち、1つのmiRNA応答配列を有するmRNAにおいて、miRNA応答配列の開始コドンからの距離を変化させることにより、同じmiRNA応答配列を持つmRNAであっても、翻訳抑制効率を変化させる、すなわちチューニングすることができる。このようなmRNAを用いることにより、多様な細胞の分離が可能になるといえる。The method for measuring the translational inhibitory effect of 1-slot mRNA is not limited to the above-mentioned specific method, and can be carried out by any other method. For example, it is possible to measure the translational inhibitory effect of 1-slot mRNA by quantifying mRNA interacting with miRNA using a method using a microarray or a method using next-generation sequencing. The present invention shall also be constructed when measured using the method.
In step (1), the principle of the above formula (b), that is, the translational repression effect of the miRNA target sequence alone in each slot is generally the constant power of the distance from the start codon to the miRNA target sequence regardless of the type of miRNA. Based on the discovery that it is specifically proportional to the power of -0.576, it can be said that the invention relates to a method for adjusting the translation sensitivity of 1-slot mRNA. That is, in an mRNA having one miRNA response sequence, by changing the distance from the start codon of the miRNA response sequence, even if the mRNA has the same miRNA response sequence, the translational repression efficiency is changed, that is, tuned. Can be done. It can be said that the use of such mRNA enables the separation of various cells.
工程(2)は、前記工程(1)の測定結果に基づき、各対象細胞でのmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAの翻訳抑制効果を算出する工程である。この工程では、前述の特性(a)、(b)に基づき、各細胞でのmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAの翻訳抑制効果を、計算により得る。より具体的には、前記工程(1)の測定値から得られる、dが0の際の仮想的な翻訳抑制率を、d-0.576乗したもの(dは、マーカー遺伝子の開始コドンからのmiRNA応答配列の距離)を、miRNA応答配列の数だけ積算することによって算出する。The step (2) is a step of calculating the translation-suppressing effect of mRNA containing two or more miRNA response sequences in each target cell based on the measurement result of the step (1). In this step, based on the above-mentioned properties (a) and (b), the translational inhibitory effect of mRNA containing two or more miRNA response sequences in each cell is obtained by calculation. More specifically, the virtual translational repression rate when d is 0, obtained from the measured value in step (1), multiplied by d -0.576 (d is miRNA from the start codon of the marker gene). The distance of the response sequence) is calculated by integrating the number of miRNA response sequences.
前記工程(1)の測定結果から、それぞれの1-slot mRNAについて、AUGからの距離d(nt)における翻訳抑制効果ρ(d)の実測値を得ることができる。そして、式(b)に基づき、ρ(d)の実測値、並びに位置dにおけるtuning factor k値から、特定のmiRNAの仮想の翻訳抑制効果であるρ(0)を得ることができる。なお、dは、工程(1)で設計したそれぞれの1-slot mRNAの間で、同一であってもよく、異なっていても、同じようにρ(0)の値を導出することが可能である。本発明においては、式(a)及び(b)の示す原理に基づいて所望の翻訳抑制効果を測定することができればよく、例えば工程(1)の試験条件(1-slot mRNAの設計条件等)によっては、ρ(0)の値を直接的に算出する必要が無い場合もある。From the measurement result of the step (1), it is possible to obtain an actually measured value of the translation inhibitory effect ρ (d) at a distance d (nt) from AUG for each 1-slot mRNA. Then, based on the equation (b), ρ (0) , which is a virtual translation suppression effect of a specific miRNA, can be obtained from the measured value of ρ (d) and the tuning factor k value at the position d. It should be noted that d can be the same or different between the 1-slot mRNAs designed in step (1), and the value of ρ (0) can be derived in the same manner. be. In the present invention, it suffices if the desired translation-suppressing effect can be measured based on the principles represented by the formulas (a) and (b). Depending on the case, it may not be necessary to directly calculate the value of ρ (0).
そうすると、AUGから異なる距離dにある、あるmiRNA応答配列の単独で翻訳抑制効果は、ρ(0)^d-0.576で表される。そして、式(a)に基づいて、miRNA応答配列の数だけこの値を積算することで、mRNAの翻訳抑制効果予測値(計算値)が得られる。なお、式(a)において、空スロットの翻訳抑制効果は1である(翻訳抑制しない)。この方法によれば、5のスロットを備えるmiRNA応答性mRNAの翻訳抑制効果を、例えば選択したすべてのmiRNA応答配列について、網羅的に計算することができる。Then, the translational inhibitory effect of a single miRNA response sequence at a different distance d from AUG is represented by ρ (0) ^ d -0.576. Then, by integrating this value by the number of miRNA response sequences based on the formula (a), a predicted translational inhibitory effect value (calculated value) of mRNA can be obtained. In the formula (a), the translation suppression effect of the empty slot is 1 (translation suppression is not performed). According to this method, the translational inhibitory effect of a miRNA-responsive mRNA having 5 slots can be comprehensively calculated, for example, for all selected miRNA-responsive sequences.
ただし、miRNA応答配列には20塩基程度の長さがあるため、miRNA標的配列が重なるような位置にスロットを設計することはできない。また、式(a)、(b)による計算上は、1以下のmiRNA標的配列を含むmRNAを原理的には排除しない。 However, since the miRNA response sequence has a length of about 20 bases, it is not possible to design a slot at a position where the miRNA target sequences overlap. Further, in the calculation by the formulas (a) and (b), in principle, mRNA containing 1 or less miRNA target sequence is not excluded.
上記の工程(1)の後であって、(2)の前には、前記工程(1)の測定結果に基づき、前記工程(2)の算出に使用するmiRNA応答配列の種類を、多変量解析、例えば、主成分分析やクラスター分析を用いて限定する工程をさらに含んでもよい。この工程を本明細書で、「限定工程」とも指称する。前記工程(1)では、例えば測定する1-slot mRNAを、100種以上、200種以上とする場合があり、工程(1)で探索した全てのmiRNAについて、あらゆる組み合わせのmRNAを設計して探索すると、その組み合わせが膨大になることある。したがって、工程(1)で得られた細胞ごとのmiRNA活性のプロファイルを、主成分分析およびクラスター分析などの多変量解析を実施し、細胞の分離に有効なmiRNAを限定することができる。主成分分析においては、寄与率の高い主成分に対して、それぞれ主成分負荷量の絶対値が高いmiRNAを、細胞の分離に有用なmiRNAとして選択できる。またクラスター分析においては、同一クラスターに分類されるmiRNA群から代表的なmiRNAを選択することによって、細胞分離への有用性が低いと期待されるその他のmiRNAを排除することができる。本発明の実施例では、270種のmiRNA応答配列から、この段階で26miRNA応答配列にまで絞ってから、工程(2)を実施している。これらの多変量解析によって、工程(2)において算出するmRNAの構成を1、あるいはそれ以上の数に限定することができる。 After the above step (1) and before (2), based on the measurement result of the above step (1), the type of miRNA response sequence used for the calculation of the above step (2) is multivariate. Further may include limiting steps using analysis, eg, principal component analysis or cluster analysis. This process is also referred to herein as a "limited process." In the step (1), for example, the 1-slot mRNA to be measured may be 100 or more or 200 or more, and all combinations of mRNAs searched in the step (1) are designed and searched. Then, the combination may become enormous. Therefore, it is possible to limit the miRNAs effective for cell separation by performing multivariate analysis such as principal component analysis and cluster analysis on the profile of miRNA activity for each cell obtained in step (1). In principal component analysis, miRNAs having a high absolute value of principal component loading can be selected as useful miRNAs for cell separation with respect to principal components having a high contribution rate. In cluster analysis, by selecting representative miRNAs from the miRNA group classified into the same cluster, other miRNAs that are expected to be less useful for cell separation can be excluded. In the examples of the present invention, step (2) is carried out after narrowing down from 270 kinds of miRNA response sequences to 26 miRNA response sequences at this stage. By these multivariate analysis, the composition of mRNA calculated in the step (2) can be limited to one or more.
また、この段階で、miRNA応答配列の種類のみならず、スロットの数や位置などを、ある程度固定したmRNAの構成を設計することができる。図2a及び後述する実施例では、5-slotのmRNA、slot間距離2nt、最も開始コドンに近いslotと開始コドンの距離2nt、という構成に固定して工程(2)を実施している。このようなslotの位置及び数構成は、当業者が適宜決定することができる。そして、このような設計において、細胞の分離のために2種以上のmiRNA応答性mRNAを設計しようとするとき、2種以上のmiRNA応答性mRNAのセットでは、スロットの位置や数が互いに同じであっても異なっていてもよく、miRNA応答性mRNAの5'UTRの全長も、互いに同じであっても異なっていてもよい。いずれもこの段階で適宜設計することができる。
Further, at this stage, it is possible to design an mRNA configuration in which not only the type of miRNA response sequence but also the number and position of slots are fixed to some extent. In FIG. 2a and the examples described later, the step (2) is carried out with the configuration fixed to 5-slot mRNA, the distance between
この限定工程は、工程(2)で網羅的な計算をすることが可能な場合は、原理的には必須ではなく、任意選択的に行ってよい工程である。 This limited step is not essential in principle when it is possible to perform a comprehensive calculation in step (2), and it may be performed arbitrarily.
工程(3)は、前記工程(2)で算出された値より、2以上の対象細胞間における翻訳抑制効果の差が最大になるmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程である。この工程では、翻訳抑制効果の差が最大になるように、各スロットに挿入されるmiRNA応答配列及び非miRNA応答配列を選択する。 The step (3) is a step of selecting an mRNA containing two or more miRNA response sequences that maximize the difference in translation inhibitory effect between two or more target cells from the values calculated in the above step (2). In this step, the miRNA-responsive and non-miRNA-responsive sequences to be inserted into each slot are selected so that the difference in translational inhibitory effect is maximized.
工程(2)において、それぞれAUGから任意の塩基数離れた場所にある、任意の数のスロットをもつmRNAを設計することができ、設計されたmRNAを目的の細胞に導入したときの、各細胞における発現量は計算して得ることができる。すなわち、任意に設計したmRNAを細胞に導入した結果は推測することができる。工程(2)において多種類のmRNAを設計し、細胞に導入したときの各細胞における推測値を計算すれば、そのなかから、任意の条件を設定して目的に応じた効果を持つmRNAを得ることができる。例えば、対象とする複数種類の細胞に導入した場合に細胞を分離する能力の高いmRNAを得たい場合、設計したmRNAごとの各細胞における発現量の分散を指標として、最も分散が大きいmRNAを、細胞分離能が最も高いと期待されるmRNAとして選択することができる。2種類以上の設計mRNAを同時に細胞に導入した場合であっても、それぞれのmRNAの各細胞における発現量が計算で得られるため、任意の条件を設定して目的に応じた効果を持つmRNAの組み合わせを得ることができる。例えば、4種類のmRNAを細胞に導入して、2種類のmRNAずつの発現量の比率を指標にして細胞を分類しようとする場合、4種類のmRNAごとの各細胞における発現量が工程(2)で得られているため、それらの比率を計算し、4種類のmRNAひとセットごとに各細胞における2つの蛍光比率をパラメータとして得ることができる。任意のmRNAを4種類選んだ任意のmRNAセットについて、得られた2パラメータのばらつき、任意の2つの細胞間の差、あるいはその差の積算値が最大となるmRNAセットを計算結果から探索することができる。 In step (2), it is possible to design mRNA having an arbitrary number of slots, which is located at an arbitrary number of bases away from AUG, and each cell when the designed mRNA is introduced into a target cell. The expression level in can be obtained by calculation. That is, the result of introducing an arbitrarily designed mRNA into cells can be inferred. If many types of mRNA are designed in step (2) and the estimated value in each cell when introduced into the cell is calculated, an mRNA having an effect according to the purpose can be obtained by setting arbitrary conditions. be able to. For example, when it is desired to obtain an mRNA having a high ability to separate cells when introduced into a plurality of target cells, the mRNA having the largest dispersion is selected by using the dispersion of the expression level in each cell for each designed mRNA as an index. It can be selected as the mRNA expected to have the highest cell separation ability. Even when two or more types of design mRNA are introduced into cells at the same time, the expression level of each mRNA in each cell can be calculated. You can get a combination. For example, when introducing four types of mRNA into cells and classifying the cells using the ratio of the expression levels of each of the two types of mRNA as an index, the expression level of each of the four types of mRNA in each cell is the step (2). ), The ratios thereof can be calculated, and two fluorescence ratios in each cell can be obtained as parameters for each set of four types of mRNA. For any mRNA set in which 4 types of arbitrary mRNA are selected, search the calculation result for the mRNA set that maximizes the variation of the obtained 2 parameters, the difference between any 2 cells, or the integrated value of the difference. Can be done.
工程(3)において探索の対象となるmRNAの数は、限定工程でどの程度まで、スロットに挿入するmiRNA候補数や、スロット数を絞るかにより異なる。例えば、限定工程で、計算により単一のmRNA、あるいは4種類のmRNAひとセットにまで絞った場合には、実質的に工程(3)は、工程(2)で翻訳抑制効果を計算した単一のmRNA、あるいは4種類のmRNAひとセットを、そのまま選択するだけとなる場合もある。 The number of mRNAs to be searched for in the step (3) differs depending on the number of miRNA candidates to be inserted into the slots and the number of slots to be narrowed down in the limited step. For example, in a limited step, when the calculation is narrowed down to a single mRNA or a set of four types of mRNA, the step (3) is substantially the single for which the translational repression effect is calculated in the step (2). In some cases, it is only necessary to select one set of mRNAs or four types of mRNAs as they are.
また、工程(3)においては、分散、複数パラメータのばらつき、任意の2つの細胞間の差、あるいはその差の積算値の計算結果のみに基づいて、最終的な単一のmRNA、あるいは2〜4種類のmRNAひとセットを選択することもできるし、さらに実験的手法で翻訳抑制効果を測定し、分散、複数パラメータのばらつき、任意の2つの細胞間の差、あるいはその差の積算値の計算結果と合せて、最終的な単一のmRNA、あるいは2〜4種類のmRNAひとセットを選択することもできる。すなわち、工程(2)で翻訳抑制効果を計算した全てのmRNAについて、あるいは工程(2)で翻訳抑制効果を計算したmRNAのうち、工程(3)で分散、複数パラメータのばらつき、任意の2つの細胞間の差、あるいはその差の積算値の計算結果からある程度絞り込んだmRNAについて、実際に遺伝子工学的手法により、これらのmRNAを調製し、対象細胞に導入して分離方法を試験する。その結果、実際に対象細胞の分散、複数パラメータのばらつき、任意の2つの細胞間の差、あるいはその差の積算値が最大となるmRNAを選択して、本発明の設計を完了することもできる。 Further, in the step (3), the final single mRNA, or 2 to 2 to, is based only on the dispersion, the variation of a plurality of parameters, the difference between any two cells, or the calculation result of the integrated value of the difference. One set of four types of mRNA can be selected, and the translational repressive effect is measured by an experimental method, and the variance, the variation of multiple parameters, the difference between any two cells, or the integrated value of the difference is calculated. Depending on the results, the final single mRNA or a set of 2-4 mRNAs can be selected. That is, for all the mRNAs for which the translational repression effect was calculated in step (2), or among the mRNAs for which the translational repression effect was calculated in step (2), dispersion in step (3), variation in multiple parameters, and any two. For mRNAs that have been narrowed down to some extent from the difference between cells or the calculation result of the integrated value of the difference, these mRNAs are actually prepared by a genetic engineering method and introduced into target cells to test the separation method. As a result, the design of the present invention can be completed by actually selecting the mRNA that maximizes the dispersion of the target cells, the variation of a plurality of parameters, the difference between any two cells, or the integrated value of the difference. ..
次に、工程(1)〜(3)を例に基づき説明する。
工程(1)
1-slot mRNAを用いて、各細胞におけるmiRNA活性を具体的に測定する。ここではmiRNA応答mRNAの発現量として考えるため、発現量が小さいものほど活性は高くなる。また、以後の計算のため対数で考える。そのため、全く活性がない場合が0、発現量を1/10まで抑制する場合が-1、1/100まで抑制する場合が-2と負の数字が小さいほど抑制力が高い。細胞 A, B, C, D を対象に解析して、以下のような結果を得たとする。Next, steps (1) to (3) will be described based on an example.
Process (1)
The miRNA activity in each cell is specifically measured using 1-slot mRNA. Here, since it is considered as the expression level of miRNA-responsive mRNA, the lower the expression level, the higher the activity. Also, consider it logarithmically for subsequent calculations. Therefore, the smaller the negative number, the higher the inhibitory power, 0 when there is no activity at all, -1 when suppressing the expression level to 1/10, and -2 when suppressing up to 1/100. Assume that cells A, B, C, and D are analyzed and the following results are obtained.
工程(2)
上記工程で、それぞれの細胞ごとにmiRNAの活性がわかれば、複数のmiRNA標的配列を含むあるmRNAを作って細胞に導入した時に、各細胞における発現量を予想することができる。このとき、予想値は k x 上記対数の和で与えられる。kの値はスロットのAUGからの距離 (d[nt]) で決まり、k=d-0.576で求まる。ただし、以下の例では簡単のため直接 k を与える(そういうdのところにスロットがあるmRNAだとする)。 Process (2)
If the activity of miRNA is known for each cell in the above step, the expression level in each cell can be predicted when a certain mRNA containing a plurality of miRNA target sequences is prepared and introduced into the cell. At this time, the expected value is given by the sum of the above logarithms of kx. The value of k is determined by the distance (d [nt]) of the slot from the AUG, and is calculated by k = d -0.576 . However, in the following example, for simplicity, we give k directly (assuming that the mRNA has a slot at such d).
a = 0.1 x 0 + 0.4 x -1 = -0.4 (このmRNAの発現量は 10-0.4= 0.398 と計算される。)
b = 0.1 x -0.5 + 0.4 x -0.1 = -0.09
c = 0.1 x -1 + 0.4 x -0.8 = -0.42
d = 0.1 x -2 + 0.4 x -0.2 = -0.28
a = 0.1 x 0 + 0.4 x -1 = -0.4 (The expression level of this mRNA is calculated to be 10 -0.4 = 0.398.)
b = 0.1 x -0.5 + 0.4 x -0.1 = -0.09
c = 0.1 x -1 + 0.4 x -0.8 = -0.42
d = 0.1 x -2 + 0.4 x -0.2 = -0.28
例えば、miRNA 100 個を解析対象としていて、あらかじめAUGからの距離が固定されている5つのスロットを含むmRNA(たとえば5つのスロットの距離を105 nt, 80 nt ,65 nt , 40 nt, 15ntとする)は、各スロットにはmiRNA標的配列100種類または空配列の101種類が入ることができる。作成可能な5-slot mRNAは 101 x 101 x 101 x 101 x 101 = 10,510,100,501 種類の mRNA(ただし、このうち1種類は全て空)を作ることができ、そのmRNAを各細胞に導入した場合の発現量が計算できる。このmRNAとはスロットの距離が違う値に固定されたmRNAも同様の計算で10,510,100,501種類設計できる。たとえば5つのスロットの距離が106 nt, 80 nt ,65 nt , 40 nt, 15ntのものも10,510,100,501 種類できるし、104 nt, 80 nt ,65 nt , 40 nt, 15nt のものも、106 nt, 83 nt ,62 nt , 41 nt, 13nt のものも10,510,100,501 種類できる。スロット数を5以外にした場合も同様で、それぞれAUGから任意の塩基数離れた場所にある、任意の数のスロットをもつmRNAを設計でき、そのmRNAをこれらの細胞に導入した場合の、各細胞における発現量を計算によって得ることができる。 For example, 100 miRNAs are analyzed, and mRNA containing 5 slots whose distance from AUG is fixed in advance (for example, the distances of 5 slots are 105 nt, 80 nt, 65 nt, 40 nt, 15 nt). ) Can accommodate 100 miRNA target sequences or 101 empty sequences in each slot. The 5-slot mRNA that can be produced can produce 101 x 101 x 101 x 101 x 101 = 10,510,100,501 types of mRNA (however, all of them are empty), and the expression when the mRNA is introduced into each cell. The amount can be calculated. 10,510,100,501 types of mRNA that is fixed to a value with a different slot distance from this mRNA can be designed by the same calculation. For example, there are 10,510,100,501 types of 5 slots with distances of 106 nt, 80 nt, 65 nt, 40 nt, 15 nt, and 104 nt, 80 nt, 65 nt, 40 nt, 15 nt, 106 nt, 83 nt. , 62 nt, 41 nt, 13 nt can also be 10,510,100,501 types. The same applies when the number of slots is set to other than 5, and when an mRNA having an arbitrary number of slots, which is located at an arbitrary number of bases away from the AUG, can be designed, and the mRNA is introduced into these cells, each The expression level in cells can be obtained by calculation.
工程(3)
あるmRNAを使用した時の細胞の分離具合を、そのmRNAを使用した時のそのmRNAの発現量の対数の分散を指標として計算する。
スロットの構成が、5’側から順に「空/miR-1/空/miR-2/空」のmRNAの場合、発現量の対数値は (A, B, C, D) = (-0.4, -0.09, -0.42, -0.28) なので、このmRNA(を用いた場合の対象細胞)の標本分散は 0.0172と計算できる。例えば、「空/miR-1/空/miR-2/空」と「miR-3/ miR-4/miR-4/空/miR-3」のmRNAを使った場合、「miR-3/ miR-4/miR-4/空/miR-3」の発現量は以下のとおり。
e = (0.05+0.8) x -2 + (0.1+0.2) x -0.5 = -1.85
f = (0.05+0.8) x -2 + (0.1+0.2) x -0 = -1.7
g = (0.05+0.8) x -0.4 + (0.1+0.2) x -2 = -0.94
h = (0.05+0.8) x -1.2 + (0.1+0.2) x -0.1 = -1.05
このmRNAの標本分散は 0.156と計算できる。また、これら2つの値で細胞を分類しようとする場合、{A, B, C, D} = {(-0.4, -1.85), (-0.09,-1.7), (-0.42,-0.94), (-0.28,-1.05)} となる。そこで2変数の相関係数を計算すると -0.320 となる。例えば、標本分散および相関係数を2パラメータのばらつきの指標として用いることができる。 Process (3)
The degree of cell separation when a certain mRNA is used is calculated using the logarithmic variance of the expression level of the mRNA when the mRNA is used as an index.
When the slot configuration is "empty / miR-1 / empty / miR-2 / empty" mRNA in order from the 5'side, the logarithmic expression level is (A, B, C, D) = (-0.4, Since -0.09, -0.42, -0.28), the sample variance of this mRNA (target cell when used) can be calculated as 0.0172. For example, when using the mRNAs of "sky / miR-1 / sky / miR-2 / sky" and "miR-3 / miR-4 / miR-4 / sky / miR-3", "miR-3 / miR" The expression levels of "-4 / miR-4 / sky / miR-3" are as follows.
e = (0.05 + 0.8) x -2 + (0.1 + 0.2) x -0.5 = -1.85
f = (0.05 + 0.8) x -2 + (0.1 + 0.2) x -0 = -1.7
g = (0.05 + 0.8) x -0.4 + (0.1 + 0.2) x -2 = -0.94
h = (0.05 + 0.8) x -1.2 + (0.1 + 0.2) x -0.1 = -1.05
The sample variance of this mRNA can be calculated to be 0.156. Also, when trying to classify cells by these two values, {A, B, C, D} = {(-0.4, -1.85), (-0.09, -1.7), (-0.42, -0.94), (-0.28, -1.05)}. Therefore, the correlation coefficient of the two variables is calculated to be -0.320. For example, the sample variance and correlation coefficient can be used as indicators of two-parameter variability.
miRNA応答性mRNAは、上記工程(1)〜(3)に従って設計され、その配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro転写合成法により、得ることができる。 The miRNA-responsive mRNA is designed according to the above steps (1) to (3), and once its sequence is determined, it can be synthesized by a person skilled in the art by any method known genetically engineered. In particular, it can be obtained by an in vitro transcriptional synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
したがって、本発明は、上記工程(1)〜(3)を含む設計の工程と、合成工程とを含む、mRNAの製造方法とも捉えることができる。製造したmRNAは、第2実施形態において詳述する分離方法において、好適に用いることができる。 Therefore, the present invention can be regarded as a method for producing mRNA, which includes a design step including the above steps (1) to (3) and a synthesis step. The produced mRNA can be suitably used in the separation method described in detail in the second embodiment.
本発明は、第2実施形態によれば、2以上の対象細胞を分離する方法に関する。当該方法は、第1実施形態の方法で設計され、合成されたmiRNA応答性mRNAを用いて、マーカー遺伝子の翻訳量を指標として2以上の対象細胞を分離する。miRNA応答性mRNAで測定するのは、第1実施形態の方法において用いた対象細胞内の特徴を反映したなにかしらの指標といえるので、設計したmRNAあるいはmRNAのセットをどのような細胞、細胞の混合物に導入することもできる。ただし、mRNAを設計したときに根拠となった対象細胞の組み合わせをなるべくよく分類しようとするような指標となっている。 The present invention relates to a method of separating two or more target cells according to a second embodiment. This method uses the synthesized miRNA-responsive mRNA designed by the method of the first embodiment to separate two or more target cells using the translation amount of the marker gene as an index. Since measuring with miRNA-responsive mRNA can be said to be some index that reflects the characteristics in the target cell used in the method of the first embodiment, what kind of cell or cell is the designed mRNA or mRNA set. It can also be introduced into a mixture of. However, it is an index that tries to classify the combination of target cells that was the basis for designing mRNA as well as possible.
本実施形態による分離方法では、第1実施形態により設計され、合成されたmRNAを用いる。したがって、第1実施形態により設計され、合成された1種類のmiRNA応答性mRNAを用いることもでき、2種類、3種類、4種類以上のmiRNA応答性mRNAを用いることもできる。2種類以上のmiRNA応答性mRNAを用いる場合には、第1実施形態により、細胞の分離を最大にするように設計された5’UTRの配列及びマーカー遺伝子がそれぞれ異なる2種類以上のmiRNA応答性mRNAのセットを用いる。特には、5’UTRの配列及びマーカー遺伝子がそれぞれ異なる4種類のmiRNA応答性mRNAから構成されるセットを用いることがより好ましい。 The separation method according to the present embodiment uses the mRNA designed and synthesized according to the first embodiment. Therefore, one type of miRNA-responsive mRNA designed and synthesized according to the first embodiment can be used, or two, three, or four or more types of miRNA-responsive mRNA can be used. When two or more types of miRNA-responsive mRNAs are used, two or more types of miRNA-responsive mRNAs having different 5'UTR sequences and marker genes designed to maximize cell separation according to the first embodiment are used. Use a set of mRNA. In particular, it is more preferable to use a set composed of four types of miRNA-responsive mRNAs having different 5'UTR sequences and marker genes.
具体的な方法としては、4種類のmiRNA応答性mRNAを、対象細胞を含む細胞群に共導入し、マーカー遺伝子の翻訳量を指標として対象細胞を分離することができ、詳細な実験手順及び測定法は、第1実施形態の工程(1)と概ね同様である。したがって、測定は種々の方法で可能であるが、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合であって、フローサイトメトリーで測定する場合を例として説明する。4種類のmiRNA応答性mRNAから測定される蛍光強度をそれぞれ、FL1、FL2、FL3、FL4とした場合に、FL1/FL2、FL3/FL4の蛍光強度比をそれぞれX軸、Y軸とした場合のドットプロットで、細胞を分離することができる。あるいは、6種類のmiRNA応答性mRNAから測定される蛍光強度を、同様にして、2種類ずつの蛍光強度比とし、それぞれX軸、Y軸、Z軸とした場合のドットプロットで、細胞を分離することもでき、理論上の上限はない。 As a specific method, four types of miRNA-responsive mRNA can be co-introduced into a cell group including the target cell, and the target cell can be separated using the translation amount of the marker gene as an index. Detailed experimental procedure and measurement can be performed. The method is substantially the same as the step (1) of the first embodiment. Therefore, the measurement can be performed by various methods, but the case where the marker gene is a fluorescent protein gene and the measurement is performed by flow cytometry will be described as an example. When the fluorescence intensities measured from the four types of miRNA-responsive mRNAs are FL1, FL2, FL3, and FL4, respectively, and the fluorescence intensity ratios of FL1 / FL2 and FL3 / FL4 are the X-axis and Y-axis, respectively. Cells can be isolated on a dot plot. Alternatively, the fluorescence intensity measured from the 6 types of miRNA-responsive mRNA is similarly set to the fluorescence intensity ratio of 2 types each, and the cells are separated by a dot plot when the X-axis, Y-axis, and Z-axis are used, respectively. There is no theoretical upper limit.
このような分離はまた、イメージアナライザーを用いたイメージングサイトメトリーでも実施することができる。イメージアナライザーは、細胞内のマーカー遺伝子の翻訳量の経時変化の情報を得ることができ、また、画像化、視覚化の点で優れており、単位時間あたりの解析量を向上できるほか、細胞の形態情報や位置情報を包含した解析、培養容器に接着した状態の細胞や、平面的あるいは立体的に組織化された細胞群を対象にした細胞の同定といった応用が可能となる点で有利である。 Such separation can also be performed by imaging cytometry using an image analyzer. The image analyzer can obtain information on the change over time in the translation amount of marker genes in cells, and is excellent in terms of imaging and visualization, and can improve the amount of analysis per unit time. It is advantageous in that it can be applied to analysis including morphological information and position information, and identification of cells in a state of being adhered to a culture vessel, or cells for a group of cells organized in a planar or three-dimensional manner. ..
以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following examples do not limit the present invention.
mRNAの配列
本実施例で使用した5-slot mRNAの5’ UTR 配列は、表3の配列番号2〜115に、1-slot mRNA の5’ UTR 配列は、表5の配列番号122〜391に示す。 Sequence of mRNA The 5'UTR sequence of 5-slot mRNA used in this example is shown in SEQ ID NOs: 2-115 in Table 3, and the 5'UTR sequence of 1-slot mRNA is shown in SEQ ID NOs: 122-391 in Table 5. show.
蛍光蛋白質コード領域及び3’UTR断片の構築
蛍光蛋白質 hmAG1, hmKO2, hdKRed および tagBFP の蛋白質コード領域は、プラスミドDNA: pFucci-S/G2/M Green (Amargaam)、pFucci-G1 Orange (Amargaam)、pAM-tagBFP (参考文献 [Miki, K., et al, Cell Stem Cell, 2015])、およびpNP-hdKeima-Red (Amargaam)からそれぞれ表6に示す適当なプライマーセット(Fwd/Rev hmAG1 (配列番号392/393)、Fwd/Rev hmKO2 (配列番号394/395)、Fwd/Rev tagBFP (配列番号396/397)、Fwd/Rev hdKeimaRed (配列番号398/399))を用いて PCR 増幅した。PCR産物中のプラスミドDNAを制限酵素Dpn I (Toyobo)を用いて、37 °Cで30分消化し、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製した。3’UTR配列はオリゴヌクレオチドtemp3UTR(配列番号 405)を鋳型にしてFwd3UTR(配列番号 403)及びRev3UTR(配列番号 404)をプライマーに用いてPCR増幅した。コントロールmRNAの5’UTR配列は、オリゴヌクレオチドtemp5UTR(配列番号 402)を鋳型にしてT7Fwd5UTR(配列番号 400)及びRev5UTR(配列番号 401)をプライマーに用いてPCR増幅した。これらのPCR産物は、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製した。 Construction of Fluorescent Protein Code Region and 3'UTR Fragment The protein coding regions of the fluorescent proteins hmAG1, hmKO2, hdKRed and tagBFP are plasmid DNA: pFucci-S / G2 / M Green (Amargaam), pFucci-G1 Orange (Amargaam), pAM. -TagBFP (references [Miki, K., et al, Cell Stem Cell, 2015]), and pNP-hdKeima-Red (Amargaam), respectively, from the appropriate primer sets shown in Table 6 (Fwd / Rev hmAG1 (SEQ ID NO: 392)). PCR amplification was performed using / 393), Fwd / Rev hmKO2 (SEQ ID NO: 394/395), Fwd / Rev tagBFP (SEQ ID NO: 396/397), Fwd / Rev hdKeimaRed (SEQ ID NO: 398/399). The plasmid DNA in the PCR product was digested with the restriction enzyme Dpn I (Toyobo) at 37 ° C for 30 minutes and purified using the MinElute PCR purification kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. The 3'UTR sequence was PCR amplified using the oligonucleotide temp3UTR (SEQ ID NO: 405) as a template and Fwd3UTR (SEQ ID NO: 403) and Rev3UTR (SEQ ID NO: 404) as primers. The 5'UTR sequence of the control mRNA was PCR amplified using the oligonucleotide temp5UTR (SEQ ID NO: 402) as a template and T7Fwd5UTR (SEQ ID NO: 400) and Rev5UTR (SEQ ID NO: 401) as primers. These PCR products were purified using the MinElute PCR purification kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
mRNA合成鋳型DNAの構築
mRNA合成鋳型を生成するために、マーカー蛋白質コード領域のPCR増幅断片(最終濃度 0.2 ng/μL)、3’UTRのPCR増幅断片(最終濃度 10 nM) および 5’ UTR配列を含むオリゴヌクレオチド(最終濃度 10 nM)を混合し、表7に示したT7Fwd及びRev120Aのプライマーセットを用いてPCR増幅して、連結した。1-slot mRNAの合成鋳型には1本の、5-slot mRNAの合成鋳型には2本のオリゴヌクレオチドを用いた。ただしコントロールmRNAを作成する場合には、5’UTR配列はオリゴヌクレオチドの代わりに、精製したPCR断片を最終濃度10 nM で用いた。PCR産物は、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製した。最終的に合成される5-slot mRNAの5’UTR配列は表3に、1-slot mRNAの5’UTR配列は表5に、蛍光タンパク質のORF配列(配列番号117,118,119,120、及び3' UTR配列(配列番号121、すべてのmRNAに共通)は表4に示した。5-slot コントロールmRNAの5’UTR配列(配列番号1)は表3に、1-slotコントロールmRNAの5’UTR配列(配列番号116)は表4に示した。 Construction of mRNA synthesis template DNA
To generate an mRNA synthesis template, an oligonucleotide containing a PCR amplified fragment of the marker protein coding region (final concentration 0.2 ng / μL), a 3'UTR PCR amplified fragment (
mRNAの合成及び精製
miRNA応答性mRNAは、修正されたプロトコル(下記の参考文献[Miki, K., et al, Cell Stem Cell, 2015]を参照)において、MegaScript T7 kit (Ambion)を用いて調製した。この反応にいて、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン-5’-三リン酸及び5-メチルシチジン-5’-三リン酸(TriLink BioTechnologies)をそれぞれ用いた。IVT(mRNA合成)反応の前に、グアノシン-5’-三リン酸は、Anti Reverse Cap Analog (New England Biolabs)で5倍希釈した。反応混合液を37度で4時間インキュベートして、TURBO DNase (Ambion)を添加した後、37度でさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic Phosphatase (New England Biolabs)を用いて、37度で30分インキュベートした。その後、RNeasy MiniElute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。 Synthesis and purification of mRNA
miRNA-responsive mRNAs were prepared using the MegaScript T7 kit (Ambion) in a modified protocol (see Resources [Miki, K., et al, Cell Stem Cell, 2015] below). In this reaction, pseudouridine-5'-triphosphate and 5-methylcytidine-5'-triphosphate (TriLink Bio Technologies) were used in place of uridine triphosphate and cytidine triphosphate, respectively. Prior to the IVT (mRNA synthesis) reaction, guanosine-5'-triphosphate was diluted 5-fold with Anti Reverse Cap Analog (New England Biolabs). The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours, TURBO DNase (Ambion) was added, and then incubated at 37 ° C. for an additional 30 minutes. The obtained mRNA was purified by FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes using Antarctic Phosphatase (New England Biolabs). It was then further purified with the RNeasy MiniElute Cleanup Kit (QIAGEN).
mRNAトランスフェクション
表8に記載の条件に従って、StemFect (Stemgent)を用いて、製造者の指示に従って 24-well フォーマットの培養プレートにて、リバーストランスフェクションを行った。ただし、ヒトiPS細胞の経時変化を追跡する場合には、フォワードトランスフェクションを行った。 mRNA Transfection According to the conditions shown in Table 8, reverse transfection was performed using StemFect (Stemgent) on a 24-well format culture plate according to the manufacturer's instructions. However, when tracking changes over time in human iPS cells, forward transfection was performed.
フローサイトメトリー
トランスフェクションの24時間後に細胞を培養皿から分離し、メッシュを通して、FACSAria II (BD Biosciences) 用いたフローサイトメトリーにより分析した。hmAG1、hmKO2、tagBFP及びhdKRedは、青色レーザー(488 nm)とFITCフィルター(530/30 nm)、緑色レーザー(561 nm)とPE フィルター(585/42 nm)、紫色レーザー(405 nm)とPacific Blue フィルター(450nm/40 nm)、及び紫色レーザー(405 nm)とQdot 605 フィルター(610/20 nm)によりそれぞれ検出した。死細胞及びデブリは、前方及び側方光散乱の値に基づいて除外した。 Flow Cytometry Cells were isolated from
フローサイトメトリーで検出した蛍光値の補正解析
hmAG1、hmKO2、tagBFP及びhdKRedの4種類の蛍光蛋白質を同時に検出した場合には、同時に、hmAG1、hmKO2、tagBFPまたはhdKRedのmRNAのみをトランスフェクションした細胞を解析して、実際とは異なる蛍光蛋白質として検出される蛍光値を補正した(参考文献:[Endo, K. and Saito, H. Methods in Molecular Biology, 2014])。 Correction analysis of fluorescence values detected by flow cytometry
When four types of fluorescent proteins, hmAG1, hmKO2, tagBFP and hdKRed, are detected at the same time, cells transfected with only mRNA of hmAG1, hmKO2, tagBFP or hdKRed are analyzed at the same time to obtain different fluorescent proteins from the actual ones. The detected fluorescence values were corrected (references: [Endo, K. and Saito, H. Methods in Molecular Biology, 2014]).
Relative expressionの算出
フローサイトメトリーの解析により、レポーター mRNA から発現するhmAG1の蛍光強度を、共導入したコントロールmRNAから発現する tagBFP の蛍光強度で割り、その解析した細胞集団における相乗平均値をレポーターmRNAの蛍光比率 (Fluorescence ratio) とした。各mRNA配列について、レポーターmRNAが応答するmiRNAの阻害剤存在下における蛍光比率を基準として、miR-1 の阻害剤存在下(目的のmiRNA活性状態)の蛍光比率の相対値を “Relative expression” として定義した。2種類のmiRNA応答配列を含む mRNA の場合は、一方のmiRNA阻害剤存在下で、それぞれ “Relative expression” 値を測定し、測定した2値を積算したものを “Estimated expression” とした。3種類のmiRNA応答配列を含む mRNA の場合は、3種類中2種類のmiRNA阻害剤存在下で、それぞれ “Relative expression” 値を測定し、測定した3値を積算したものを “Estimated expression” とした。 Calculation of Relative expression By analysis of flow cytometry, the fluorescence intensity of hmAG1 expressed from the reporter mRNA is divided by the fluorescence intensity of tagBFP expressed from the co-introduced control mRNA, and the synergistic average value in the analyzed cell population is the synergistic average value of the reporter mRNA. It was defined as the fluorescence ratio. For each mRNA sequence, the relative value of the fluorescence ratio in the presence of the miR-1 inhibitor (target miRNA active state) is used as the “Relative expression” based on the fluorescence ratio of the miRNA that the reporter mRNA responds to in the presence of the inhibitor. Defined. In the case of mRNA containing two types of miRNA response sequences, the “Relative expression” value was measured in the presence of one miRNA inhibitor, and the sum of the measured two values was defined as the “Estimated expression”. In the case of mRNA containing 3 types of miRNA response sequences, the “Relative expression” value is measured in the presence of 2 types of miRNA inhibitors out of 3 types, and the total of the measured 3 values is called “Estimated expression”. bottom.
結果
1分子で多数のmiRNAに応答し、かつ個々のmiRNAへの応答の程度(検出感度)を任意に調節プローブ (= mRNA) の設計方法を開発し、細胞内の多因子情報を線形モデルで抽出することに成功した。RNA Synthetic Device はmRNAと転写後・翻訳段階の制御を基本としているため、mRNAに作用するmiRNA が細胞内部のマーカー分子として用いられている。マイクロアレイや次世代シーケンシングなどの high-throuput analysisの場合は、まず、(1) miRNA を網羅的に定量検出し、その後で、(2) 多変量解析などにより膨大な数の変数から取り扱いが容易な数の合成変数を抽出し、それに基づいて細胞の状態を区別している (図1a左図)。一方で、非侵襲的に(細胞を殺さずに)同時に検出可能なシグナルの数は限られており、1対1に対応した検出プローブでは対応できない。そこで、生細胞内の多因子の情報を検出するために、多因子の情報を先に要約してから、その結果合成されたパラメータを検出する戦略をとる (図1a右図)。すると、同時に検出可能な、限られたシグナル数でも、多数の生細胞内因子の定量情報に由来し、そのエッセンスを抽出した合成パラメータを直接検出できる。我々は、1つのmRNAが複数のmiRNAを可算的に検出できること、各miRNAへの検出感度をmRNA上のmiRNA標的配列の位置で調節できることを発見した。 result
One molecule responds to a large number of miRNAs, and the degree of response to individual miRNAs (detection sensitivity) is arbitrarily adjusted. We have developed a probe (= mRNA) design method and extracted intracellular multifactorial information using a linear model. I succeeded in doing it. Since RNA Synthetic Device is based on the control of mRNA and post-transcriptional / translational stages, miRNA that acts on mRNA is used as a marker molecule inside the cell. In the case of high-throuput analysis such as microarray and next-generation sequencing, it is easy to handle from a huge number of variables by (1) comprehensive quantitative detection of miRNA and then (2) multivariate analysis. A large number of synthetic variables are extracted, and the cell states are distinguished based on them (Fig. 1a, left figure). On the other hand, the number of signals that can be detected simultaneously non-invasively (without killing cells) is limited, and a one-to-one correspondence detection probe cannot handle it. Therefore, in order to detect multifactorial information in living cells, a strategy is taken to first summarize the multifactorial information and then detect the parameters synthesized as a result (Fig. 1a, right figure). Then, even with a limited number of signals that can be detected at the same time, it is possible to directly detect synthetic parameters derived from the quantitative information of a large number of living intracellular factors and extracting the essence of the factors. We have found that one mRNA can countably detect multiple miRNAs, and that the detection sensitivity to each miRNA can be regulated by the position of the miRNA target sequence on the mRNA.
複数のmiRNA応答は積算される
複数種類のmiRNAに応答するmRNAを作成するため、これまでは1カ所のみmiRNA標的配列を含んでいたmRNA (1-slot mRNA, 図6a, Miki, K. et al, Cell Stem Cell, 2015, 国際公開WO2015/105172) を拡張し、5’ UTR に連続に5カ所のmiRNA標的配列挿入部位 (スロット) を設計した (5-slot mRNA, 図2a)。細胞内因子の例としては、HeLa 細胞内で弱い活性を示すmiRNAの例として miR-34a-5p、強い活性の例として miR-17-5p と miR-92a-3p、さらに非常に強い活性の例として miR-21-5p の4種類を選んだ。5カ所のスロットに2 または3 種類の異なるmiRNA標的配列が挿入され、マーカー蛋白質としてhmAG1をコードするmRNAをランダムに12種類設計し、mRNAを合成した (図2a, 表3)。合成した 5-slot mRNAを、それぞれ、mRNA導入のコントロールとして蛍光蛋白質 tagBFPをコードした mRNAおよび 5-slot mRNAが応答するmiRNAに対する阻害剤 (miRVana miRNA inhibitor, Invitrogen) とともにHeLa細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後に、フローサイトメーターを用いてマーカータンパク質の蛍光強度を定量し、Relative expression 値を解析した。 Multiple miRNA responses are integrated to create mRNAs that respond to multiple types of miRNAs, so mRNAs that previously contained only one miRNA target sequence (1-slot mRNA, Figure 6a, Miki, K. et al) , Cell Stem Cell, 2015, WO 2015/105172) was expanded to design five consecutive miRNA target sequence insertion sites (slots) in the 5'UTR (5-slot mRNA, Figure 2a). Examples of intracellular factors include miR-34a-5p as an example of miRNA showing weak activity in HeLa cells, miR-17-5p and miR-92a-3p as examples of strong activity, and an example of very strong activity. I chose 4 types of miR-21-5p as. Two or three different miRNA target sequences were inserted into five slots, and 12 types of mRNA encoding hmAG1 were randomly designed as marker proteins, and mRNA was synthesized (Fig. 2a, Table 3). The synthesized 5-slot mRNA was transfected into HeLa cells with an mRNA encoding the fluorescent protein tagBFP and an inhibitor of the 5-slot mRNA-responsive miRNA (miRVana miRNA inhibitor, Invitrogen), respectively, as controls for mRNA introduction. Twenty-four hours after transfection, the fluorescence intensity of the marker protein was quantified using a flow cytometer, and the Relative expression value was analyzed.
例えば、miR-17-5p の標的配列を slot-2 に、miR-92a-3p の標的配列を slot-4 に持つmRNAの場合 (図2b)、両方のmiRNAに対する阻害剤を導入した時の 5-slot mRNA の発現量は、どちらのmiRNAの活性にも影響されていない場合の発現量を示すと考えられ、これを5-slot mRNAごとの発現量の基準値 (=1) とした。どちらか一方のmiRNA阻害剤 (miR-17-5p または miR-92a-3p) を導入した時の発現量は、それぞれ、もう一方のmiRNA活性 (miR-92a-3p または miR-17-5p) のみを反映していると考えられる。また、miRNA阻害剤の非存在下 (実際には、mock として用いたmiRNA-1 に対する inhibitor の存在下) の発現量は、両方のmiRNAの活性を反映していると考えられる。この両方のmiRNA活性を反映した Relative expression値は、個々のmiRNA活性への応答した Relative expression値の積算値(これを予測発現量, estimated expressionとする)に近い値を示した。 For example, in the case of an mRNA having the target sequence of miR-17-5p in slot-2 and the target sequence of miR-92a-3p in slot-4 (Fig. 2b), 5 when an inhibitor for both miRNAs was introduced. The expression level of -slot mRNA is considered to indicate the expression level when neither miRNA activity is affected, and this was used as the reference value (= 1) of the expression level for each 5-slot mRNA. When one of the miRNA inhibitors (miR-17-5p or miR-92a-3p) is introduced, the expression level is only the other miRNA activity (miR-92a-3p or miR-17-5p), respectively. It is thought that it reflects. In addition, the expression level in the absence of the miRNA inhibitor (actually, in the presence of an inhibitor against miRNA-1 used as a mock) is considered to reflect the activity of both miRNAs. The Relative expression values reflecting both of these miRNA activities showed values close to the integrated value of the Relative expression values in response to the individual miRNA activities (this is referred to as the predicted expression level, estimated expression).
そこで、ランダムに作成した12種類の 5-slot mRNA それぞれについて、miRNA阻害剤非存在下の Relative expression 値 (observed relative expression) と、応答する複数のmiRNAのうち1種類のみのmiRNA活性に応答したRelative expression値の積算値(estimated expression)を比較すると、非常に高い相関を示した (図2c)。このことは複数のmiRNA標的配列を持つ合成mRNAを用いることによって、複数のmiRNA活性を積算的に検出できることを示す。 Therefore, for each of the 12 randomly prepared 5-slot mRNAs, the Relative expression value (observed relative expression) in the absence of the miRNA inhibitor and the Relative that responded to the miRNA activity of only one of the multiple miRNAs that responded. Comparing the estimated expressions of the expression values, they showed a very high correlation (Fig. 2c). This indicates that multiple miRNA activities can be detected cumulatively by using synthetic mRNAs having multiple miRNA target sequences.
miR34a-5p, miR-92a-3p, miR17-5p または miR-21-5p に応答する1-slot mRNAを合成し、mRNA導入のコントロールとなる tagBFP mRNA および 4種類のmiRNA阻害剤とともにHeLa 細胞に導入して Relative expression を求めたところ、mRNAが応答するmiRNA 以外のmiRNA阻害剤を導入しても Relative expression の値は影響を受けなかった。よって今回の実験条件においては、これらのmiRNA阻害剤は目的としない他の3種類のmiRNA活性を阻害しないことが確認された (図5a)。一方、複数のmiRNA阻害剤を挿入する場合には、細胞に導入するmiRNA阻害剤の総量が変動してしまう。ネガティブコントロールとして使用したmiR-1 に対するmiRNA阻害剤の量を増加させても、測定されるRelative expression の値は影響を受けなかったことから、今回の実験条件においては、miRNA inhibitor の導入総量の影響は無視できることが確認された。 Synthesize 1-slot mRNA in response to miR34a-5p, miR-92a-3p, miR17-5p or miR-21-5p and introduce into HeLa cells with tagBFP mRNA and 4 miRNA inhibitors that control mRNA introduction Then, when the Relative expression was obtained, the value of the Relative expression was not affected by the introduction of a miRNA inhibitor other than the miRNA that the mRNA responds to. Therefore, under the conditions of this experiment, it was confirmed that these miRNA inhibitors do not inhibit the activity of three other types of miRNA that are not intended (Fig. 5a). On the other hand, when a plurality of miRNA inhibitors are inserted, the total amount of miRNA inhibitors introduced into cells varies. Increasing the amount of miRNA inhibitor for miR-1 used as a negative control did not affect the measured Relative expression value, so under the experimental conditions this time, the effect of the total amount of miRNA inhibitor introduced Was confirmed to be negligible.
スロットの位置により応答感度を調節できる
5カ所のスロットのうち、1、2または3カ所が同一のmiRNA標的配列で占められている一連の 5-slot mRNAを、miR34a-5p, miR-92a-3p, miR17-5p または miR-21-5p の4種類のmiRNAについて、それぞれ設計し、mRNAを合成した (Fig 2d, 表3)。合成した5-slot mRNAを、それぞれ、mRNA導入のコントロールとして蛍光蛋白質 tagBFPをコードした mRNAおよび 5-slot mRNAが応答するmiRNAに対する阻害剤とともにHeLa細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後に、フローサイトメーターを用いてマーカータンパク質の蛍光強度を定量し、Relative expression 値を解析した。ただし、miR-21-5p の解析においては、マーカー遺伝子の発現が強く抑制され、細胞の自家蛍光の影響が高くなるため、tagBFPの蛍光値が 10,000 以下の細胞を除去してmRNA導入量の高い細胞群で評価した。 A series of 5-slot mRNAs in which one, two or three of the five slots whose response sensitivity can be adjusted by the slot position are occupied by the same miRNA target sequence are miR34a-5p, miR-92a-3p. , miR17-5p or miR-21-5p, respectively, were designed and mRNAs were synthesized (Fig. 2d, Table 3). The synthesized 5-slot mRNA was transfected into HeLa cells with an inhibitor of the fluorescence protein tagBFP-encoding mRNA and the 5-slot mRNA-responsive miRNA as controls for mRNA introduction, respectively. Twenty-four hours after transfection, the fluorescence intensity of the marker protein was quantified using a flow cytometer, and the Relative expression value was analyzed. However, in the analysis of miR-21-5p, the expression of the marker gene is strongly suppressed and the effect of cell autofluorescence is high. Therefore, cells with a tagBFP fluorescence value of 10,000 or less are removed and the amount of mRNA introduced is high. Evaluated by cell population.
このとき、各 5-slot mRNAの発現量 (Relative expression) は、各スロットにおけるmiRNA応答性 (ρ) の積算値だと考えられる (Fig. 2d, bottom)。そこで、実験的に測定した Relative expression 値 (observed relative expression) のデータセットから、最小二乗法に基づいたフィッティングにより、各スロットにおけるmiRNA応答性 (ρ) を4種類のmiRNAそれぞれについて算出した。この解析で求められた各スロットにおけるmiRNA応答性の積算値を、5-slot mRNA それぞれの予測発現量 (estimated expression) とした。 At this time, the expression level (Relative expression) of each 5-slot mRNA is considered to be the integrated value of miRNA responsiveness (ρ) in each slot (Fig. 2d, bottom). Therefore, from the experimentally measured Relative expression value (observed relative expression) data set, the miRNA responsiveness (ρ) in each slot was calculated for each of the four types of miRNA by fitting based on the least squares method. The integrated value of miRNA responsiveness in each slot obtained in this analysis was used as the estimated expression of each 5-slot mRNA.
4種類全てのmiRNAについて、予測発現量は、実験的に測定されたRelative expression 値 (observed relative expression) とよく一致した (Fig. 2e)。このことは、5-slot mRNAの挙動が各スロットにおけるmiRNA応答性 (Local relative expression, ρ) で説明できていることを示唆する。4種類のmiRNAのうちいずれにおいても、スロット番号の小さい5’側のslot ほど応答感度が低く、3’側のslot ほど応答感度が高かった (図2fおよび図6)。 For all four miRNAs, the predicted expression levels were in good agreement with the experimentally measured Relative expression values (observed relative expression) (Fig. 2e). This suggests that the behavior of 5-slot mRNA can be explained by the miRNA responsiveness (Local relative expression, ρ) in each slot. Among the four types of miRNAs, the slot on the 5'side with the smaller slot number had a lower response sensitivity, and the slot on the 3'side had a higher response sensitivity (Fig. 2f and Fig. 6).
一方、miR34a-5p, miR-92a-3p, miR17-5p または miR-21-5p に応答する1-slot mRNA についても Relative expression 値を解析すると、どのmiRNAにおいても 1-slot mRNA はslot-5 に近い値を示した(図6b)。1-slot mRNA のmiRNA標的配列は、mRNAの5’末端から~20 nt, AUG から23 nt に位置している (図6a) ことから、この結果は、miRNA標的配列が、5’末端ではなく開始コドンにより近いほど、mRNAの応答感度が高くなること、開始コドンからの距離に依存して応答感度が低くなることを示唆する。 On the other hand, when the Relative expression value was analyzed for 1-slot mRNA responding to miR34a-5p, miR-92a-3p, miR17-5p or miR-21-5p, 1-slot mRNA became slot-5 in all miRNAs. It showed close values (Fig. 6b). The miRNA target sequence of 1-slot mRNA is located ~ 20 nt from the 5'end of the mRNA and 23 nt from the AUG (Fig. 6a), so this result shows that the miRNA target sequence is not the 5'end. It is suggested that the closer to the start codon, the higher the response sensitivity of the mRNA, and the lower the response sensitivity depends on the distance from the start codon.
解析した4種類のmiRNAに固有のパラメータではなく、これらのmiRNAに共通するパラメータとして、miRNA標的配列の位置とmiRNA応答性の関係を求めるため、活性の異なる 4種類のmiRNAの解析で得られた各スロットの応答感度を、下記の指数関数モデルに同時にフィッティングした (図2f)。フィッティングは対数値に対して最小二乗法を用いて実施した。 It was obtained by analysis of 4 types of miRNAs with different activities in order to determine the relationship between the position of the miRNA target sequence and miRNA responsiveness as a parameter common to these miRNAs, not as a parameter unique to the 4 types of miRNAs analyzed. The response sensitivity of each slot was simultaneously fitted to the exponential function model below (Fig. 2f). The fitting was performed using the method of least squares for logarithmic values.
このとき、d は開始コドンからの距離 ([nt]) を、ρ0 はそれぞれのmiRNAについて距離 0 [nt] の時の仮想的な応答感度を示す。ξ はmiRNAの種類に関わらず共通する変数を示す。(つまりρ(d) = {ρ0}k(d)= ρ0^dξ となる。)
At this time, d indicates the distance from the start codon ([nt]), and ρ 0 indicates the virtual response sensitivity of each miRNA at a distance of 0 [nt]. ξ indicates a variable that is common regardless of the type of miRNA. (That is, ρ (d) = {ρ 0 } k (d) = ρ 0 ^ d ξ .)
フィッティング解析の結果、miRNAによる翻訳抑制効果 (local repression, -log(ρ)) は、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離 (d [nt]) と miRNAの種類に関わらない変数ξを用いてよく説明できた。今回の解析では、共通変数ξの値として -0.576 を得た。すなわち、5’UTR にmiRNA標的配列を含むmRNAを設計する場合、miRNAによる翻訳抑制効果は、miRNAの種類に関わらず一般に、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離の -0.576 乗に比例すると考えられる。 As a result of fitting analysis, the translational repression effect (local repression, -log (ρ)) by miRNA may be obtained by using the distance (d [nt]) from the start codon to the miRNA target sequence and the variable ξ regardless of the type of miRNA. I was able to explain. In this analysis, we obtained -0.576 as the value of the common variable ξ. That is, when designing an mRNA containing a miRNA target sequence in the 5'UTR, the translational repression effect of the miRNA is generally considered to be proportional to the -0.576 power of the distance from the start codon to the miRNA target sequence, regardless of the type of miRNA. ..
多種類の細胞の分類
このモデルを実証するため、複数種類のヒト正常細胞を生きたまま、miRNA活性プロファイルに従って分類、分離することを試みた(図3)。 Classification of many types of cells
To demonstrate this model, we attempted to classify and isolate multiple types of normal human cells alive according to their miRNA activity profile (Fig. 3).
まず細胞種ごとのmiRNA 活性を探索的に定量した。5’ UTR で標的配列が AUG になるのを防ぐため、CAUを含まないmiRNA を 270 抽出した(図3a、表4)。このとき、過去の文献から様々な細胞で比較的発現量の高いものを選別し(参考文献 [Neveu, P., et al, Cell Stem Cell, 2010])、かつ配列に類似性の高いmiRNAは除いた。選別した270のmiRNA のうち90はhmAG1を、別の90はtagBFPを、残る90はhdKRedをマーカーの蛍光蛋白質としてコードする1-slot mRNA を合成した。作成したmRNAの5’UTR配列を表5 に示す。異なるmiRNA標的配列が挿入されたhmAG1、tagBFP、およびhdKRedをコードする1-slot mRNAを各1種類と、mRNA導入のコントロールとして用いたhmKO2 mRNAの計4種類のmRNAを混合し、解析対象の細胞にトランスフェクションした。すなわち、計90種類の組み合わせで 1-slot mRNAをトランスフェクションした。また、解析上のコントロールとして、mRNAを含まない水、miRNAに応答しないコントロールのhmAG1、tagBFP、hdKRedおよびhmKO2の4種類のmRNAの混合、またはこれら4種類のmRNAのうちそれぞれ1種類のみ、の6種類のトランスフェクションを行った。すなわち、各細胞について96種類のトランスフェクションを実施して1セットの探索解析とした。解析対象の細胞としては、HeLa 細胞のほか、ヒト正常皮膚線維芽細胞(NHDF)、ヒト正常肺線維芽細胞(NHLF)、ヒト正常表皮ケラチノサイト(NHEK)、人腎臓上皮細胞(HRE)の初代培養細胞4種類、マウス線維芽細胞 (MEF) 、ヒト上皮線維芽細胞由来のiPS細胞(hiPSC)、およびhiPSCをbFGF非存在下で部分的に分化させた細胞 (hiPSC 14d) を用いた。 First, the miRNA activity of each cell type was quantified exploratively. To prevent the target sequence from becoming AUG in the 5'UTR, 270 CAU-free miRNAs were extracted (Fig. 3a, Table 4). At this time, miRNAs with relatively high expression levels in various cells were selected from past literature (references [Neveu, P., et al, Cell Stem Cell, 2010]), and miRNAs with high sequence similarity were selected. Excluded. Of the 270 miRNAs selected, 90 synthesized hmAG1, another 90 synthesized tagBFP, and the remaining 90 synthesized 1-slot mRNA encoding hdKRed as a marker fluorescent protein. The 5'UTR sequence of the prepared mRNA is shown in Table 5. A total of 4 types of mRNA, 1 type each of 1-slot mRNA encoding hmAG1, tagBFP, and hdKRed into which different miRNA target sequences were inserted and hmKO2 mRNA used as a control for mRNA introduction, were mixed and analyzed. Transfected into. That is, 1-slot mRNA was transfected with a total of 90 combinations. In addition, as analytical controls, water containing no mRNA, a mixture of four types of mRNAs, hmAG1, tagBFP, hdKRed, and hmKO2, which are controls that do not respond to miRNAs, or only one type of each of these four types of mRNAs, 6 Kind of transfection was performed. That is, 96 types of transfection were performed on each cell to obtain one set of search analysis. In addition to HeLa cells, the cells to be analyzed include primary cultures of human normal skin fibroblasts (NHDF), human normal lung fibroblasts (NHLF), human normal epidermal keratinocytes (NHEK), and human kidney epithelial cells (HRE). Four types of cells, mouse fibroblasts (MEF), human epithelial fibroblast-derived iPS cells (hiPSC), and cells in which hiPSC was partially differentiated in the absence of bFGF (hiPSC 14d) were used.
フローサイトメトリー後、補正された蛍光強度を用いて、解析した細胞ごとにhmAG1、tagBFPおよびhdKRedの蛍光強度をhmKO2の蛍光強度で割り、蛍光比率を求め、解析した細胞における相乗平均をもとめて各1-slot mRNAの蛍光比率 (Fluorescence ratio) とした。探索解析を同じ細胞に対して2度実施し、得られた蛍光比率の比較を図3bに示す。これらの解析結果は高い相関を示したことから、この解析系は安定していることが示唆される。 After flow cytometry, using the corrected fluorescence intensity, divide the fluorescence intensity of hmAG1, tagBFP and hdKRed by the fluorescence intensity of hmKO2 for each analyzed cell to obtain the fluorescence ratio, and obtain the synergistic average in the analyzed cells. The fluorescence ratio of 1-slot mRNA was used. The search analysis was performed twice on the same cells, and a comparison of the obtained fluorescence ratios is shown in FIG. 3b. The results of these analyzes showed a high correlation, suggesting that this analysis system is stable.
一般に、定量検出されるmiRNAのうち約1/3程度しか翻訳抑制活性を持たないことが知られている(参考文献[Mullokandov, G. et al, Nature Methods, 2013])。本解析で用いた270のmiRNAについても約2/3程度はmiRNA活性に左右されないと考えられるため、1-slot mRNAの蛍光比率は全体として対角線上に分布すると考えられる。しかし、細胞間の探索解析結果を比較すると、HeLa細胞とNHLFの比較では、観察された蛍光比率は対角線からずれてプロットされている(図7a)。これは細胞ごとに、蛍光蛋白質の合成効率や安定性などに違いがあるため、結果として発現量の分布にバイアスがかかっていると考えられる。そこで細胞間の蛍光蛋白質発現量を、HeLa細胞を基準に用いて標準化した。具体的には、各細胞の蛍光比率とHeLa細胞の蛍光比率の散布図を作成し、蛍光蛋白質ごとに直線回帰を行って、傾きが1となるようそれぞれに線形補正を実施
した (図7b)。これにより細胞間にあるバイアスは補正され、散布図を作成すると各1-slot mRNAは対角線上に分布したが、hmAG1、tagBFPおよびhdKRedの蛍光比率の分布は一致していない。これはマーカーとして用いた蛍光蛋白質の違いによるバイアスがあることを示す。そこでさらに、各蛍光比率の分布を平均0.5、標準偏差0.15に標準化した (図7c)。標準化した蛍光比率についてNHDFとhiPSCの比較を図3cに示す。これらの細胞間には大きなmiRNA活性の差があると期待されるが、実際に、miRNA活性を示す図中の各点は対角線に対して直行する方向に広がって分布しており、かつこの分布は用いた蛍光蛋白質によらず均等に分布している。この補正値を細胞ごとのmiRNA活性プロファイルとし、線形モデルの例として主成分分析により解析した。主成分分析には統計パッケージRのprcomp関数を用いた。第一主成分を横軸、第二主成分を縦軸にとると、8 種類の細胞条件は分類された(図3d)。このことは1-slot mRNA を用いた探索解析によって得られたmiRNA活性プロファイルに従って、これらの細胞を統計解析上は分類できることを示している。In general, it is known that only about one-third of miRNAs detected quantitatively have translation-suppressing activity (references [Mullokandov, G. et al, Nature Methods, 2013]). About two-thirds of the 270 miRNAs used in this analysis are also considered to be independent of miRNA activity, so the fluorescence ratio of 1-slot mRNA is considered to be distributed diagonally as a whole. However, when comparing the results of the search analysis between cells, in the comparison between HeLa cells and NHLF, the observed fluorescence ratios are plotted off the diagonal line (Fig. 7a). This is because there are differences in the synthesis efficiency and stability of fluorescent proteins among cells, and as a result, the distribution of expression levels is considered to be biased. Therefore, the expression level of fluorescent protein between cells was standardized using HeLa cells as a reference. Specifically, a scatter plot of the fluorescence ratio of each cell and the fluorescence ratio of HeLa cells was created, linear regression was performed for each fluorescent protein, and linear correction was performed for each so that the slope was 1 (Fig. 7b). .. This corrected the bias between the cells, and when a scatter plot was made, each 1-slot mRNA was distributed diagonally, but the distribution of fluorescence ratios of hmAG1, tagBFP and hdKRed did not match. This indicates that there is a bias due to the difference in the fluorescent protein used as a marker. Therefore, the distribution of each fluorescence ratio was further standardized to an average of 0.5 and a standard deviation of 0.15 (Fig. 7c). A comparison of NHDF and hiPSC for standardized fluorescence ratios is shown in FIG. 3c. It is expected that there will be a large difference in miRNA activity between these cells, but in fact, each point in the figure showing miRNA activity is distributed in a direction perpendicular to the diagonal line, and this distribution Is evenly distributed regardless of the fluorescent protein used. This corrected value was used as the miRNA activity profile for each cell, and was analyzed by principal component analysis as an example of a linear model. The prcomp function of statistical package R was used for principal component analysis. When the first principal component was taken on the horizontal axis and the second principal component was taken on the vertical axis, eight types of cell conditions were classified (Fig. 3d). This indicates that these cells can be classified statistically according to the miRNA activity profile obtained by exploratory analysis using 1-slot mRNA.
主成分分析で得られた成分は270のmiRNA活性の線形結合として表現される。一方、細胞内の複数のmiRNA活性は、複数の標的配列を持つ1つのmRNAにより、定量的に積算して測定でき、かつmiRNA活性の検出感度は標的配列と開始コドン間の距離によって調節できた。従ってマーカータンパク質の発現量の対数をとると、複数のmiRNA活性を線形モデルで集約されることになる (図1b)。ただし、miRNA活性にかかる係数 (k = d-0.576) は常に正になる。そこで、異なる蛍光タンパク質を発現する2 種類のmiRNA応答mRNAを用いて、2種類の蛍光値の比をとることによって、各miRNAに対して正負任意の重み付けを実現できる (図1b)。すなわち、細胞内の多種類のmiRNA活性プロファイルは、2種類のmiRNA応答mRNAを設計することによって、多変量を1つの蛍光値の比として集約できることになる。そこで、主成分分析と同様に、対象細胞で測定される値の分散が最大化されるようなmRNAを用いれば、対象の細胞を生きたまま分類することができると考えられる。The components obtained by principal component analysis are represented as linear combinations of 270 miRNA activities. On the other hand, the intracellular miRNA activity could be quantitatively integrated and measured by one mRNA having multiple target sequences, and the detection sensitivity of miRNA activity could be adjusted by the distance between the target sequence and the start codon. .. Therefore, when the logarithm of the expression level of the marker protein is taken, multiple miRNA activities are aggregated by a linear model (Fig. 1b). However, the coefficient for miRNA activity (k = d -0.576 ) is always positive. Therefore, by using two types of miRNA-responsive mRNAs expressing different fluorescent proteins and taking the ratio of the two types of fluorescence values, it is possible to realize arbitrary positive and negative weighting for each miRNA (Fig. 1b). That is, the intracellular multivariate miRNA activity profiles can be aggregated as a ratio of one fluorescence value by designing two types of miRNA-responsive mRNAs. Therefore, as in the case of principal component analysis, it is considered that the target cells can be classified alive by using mRNA that maximizes the dispersion of the values measured in the target cells.
ここでは簡単のため4種類の5-slot mRNAを用いることとした。異なる細胞の種類を分類するため、270のmiRNA活性プロファイルから、細胞の分離能の高いと考えられるmiRNAを選別した。スクリーニング解析で得たmiRNA活性プロファイルに対して主成分分析とクラスター分析(ウォード法)を行い 270 のmiRNAを49クラスターに分離し、各クラスターで第一成分または第二成分への寄与が最も高いmiRNAを選んだ。クラスター分析には統計パッケージRのdist関数及びhclust関数を用いた。選ばれた49 miRNAのみで再び主成分分析を行い、第一成分または第二成分への寄与が高い26のmiRNAを選別した。26 miRNAの標的配列を含む 5-slot mRNAの8種類の細胞における発現量の予測値を計算し、いずれかの細胞で発現量が極めて小さくなるmRNA(Estimated expression < 0.05) を除外した。残りのmRNAについて8細胞における予測発現量の分散を計算し、分散が最大化するmRNAを5-slot mRNA #1 (hmAG1) とした。次に、5-slot mRNA #1と予測発現量の比率を計算し、その値が8細胞の分散を最大化するmRNAを5-slot mRNA #2 (hmKO2) とした。さらに、5-slot mRNA #1 と 5-slot mRNA #2 の比率と、新たなmRNAの予測発現量の相関係数が 0.3 以下となり、かつこれらの2次元のデータにおいて8細胞の分散を最大化するmRNAを求め、5-slot mRNA #3 (tagBFP) とした。最後に 5-slot mRNA #1 と #2 の比率、5-slot mRNA #3 と #4 の比率の2次元データにおいて8細胞の分散を最大化する5-slot mRNA #4 (hdKRed) を求めた。一連の計算上の探索により得られた1 セットの 5-slot mRNA を図3eに示す。また、このmRNAセットをトランスフェクションした場合の、8細胞の分布の推測結果を図3fに示す。
Here, for the sake of simplicity, we decided to use four types of 5-slot mRNA. In order to classify different cell types, miRNAs considered to have high cell segregation ability were selected from 270 miRNA activity profiles. Principal component analysis and cluster analysis (ward method) were performed on the miRNA activity profile obtained by screening analysis to separate 270 miRNAs into 49 clusters, and each cluster contributed the most to the first or second component. I chose. The dist function and hclust function of statistical package R were used for cluster analysis. Principal component analysis was performed again with only the selected 49 miRNAs, and 26 miRNAs with a high contribution to the first or second component were selected. Predicted values of expression of 5-slot mRNA containing the target sequence of 26 miRNA in 8 types of cells were calculated, and mRNA (Estimated expression <0.05) whose expression level was extremely low in any of the cells was excluded. The variance of the predicted expression level in 8 cells was calculated for the remaining mRNA, and the mRNA that maximized the variance was designated as 5-slot mRNA # 1 (hmAG1). Next, the ratio of 5-
設計された4 本の5-slot mRNAを混合し、HeLa細胞、NHEK、NHDF、hiPSC及びhiPSC 14dにトランスフェクションし、24時間後にフローサイトメトリーを行った。蛍光補正後、解析された細胞ごとにhmAG1/hmKO2及びtagBFP/hdKRedの2つの蛍光比率を求め、細胞の分布を密度プロットで示した(図3g)。これらの5種類の細胞は、同一の5-slot mRNAセットを用いてそれぞれ異なる場所に分布した。この結果から、6 種類のmiRNA活性から線形モデルで抽出した 2 つのパラメータを、4 本の 5-slot mRNAを用いて直接測定し、これに基づいて5種類の細胞を生きたまま分離することが可能となった。また、miRNAに応答しないmRNAのセットや、1-slot のmiRNA-responsive mRNA のセットでも同様の実験を実施したが、これらの細胞種は分離できなかった (図8) 。 The four designed 5-slot mRNAs were mixed and transfected into HeLa cells, NHEK, NHDF, hiPSC and hiPSC 14d, and flow cytometry was performed 24 hours later. After fluorescence correction, the two fluorescence ratios of hmAG1 / hmKO2 and tagBFP / hdKRed were obtained for each analyzed cell, and the cell distribution was shown in a density plot (Fig. 3g). These five types of cells were distributed in different locations using the same 5-slot mRNA set. From this result, two parameters extracted from 6 types of miRNA activity by a linear model can be directly measured using 4 5-slot mRNAs, and based on this, 5 types of cells can be separated alive. It has become possible. Similar experiments were also performed on sets of mRNAs that did not respond to miRNAs and sets of 1-slot miRNA-responsive mRNAs, but these cell types could not be isolated (Fig. 8).
同一細胞(種)の時間変化の追跡
さらに、ヒトiPS細胞が分化能を失う過程を経時的に追跡して、工程(1)で探索する細胞の違いにより、得られるmRNAセットの分離能の違いを検証した(図4)。まず、270のmiRNA活性を探索的に定量した結果(図3c)から hiPSC とbFGF非存在下で部分的に分化させた hiPSC (iPSC 14d) の間で差の大きかった 54 のmiRNAを選択した(図4a)。これらのmiRNAを対象として、hiPSCがbFGF非存在下で部分的に分化する過程におけるmiRNA活性の経時変化を追跡するため、二次的な探索解析を実施した (図4b)。hiPSCをbFGF非存在下で培養し、培養開始当日(day 0) および1(day 1)、3(day 3)、6(day 6)、9(day9 )、または14日後(day 14)に、異なるmiRNA標的配列が挿入されたhmAG1、tagBFP、およびhdKRedをコードする1-slot mRNAを各1種類と、mRNA導入のコントロールとして用いたhmKO2 mRNAの計4種類のmRNAを混合し、トランスフェクションした。このとき一次的な探索解析(図3a)で用いた6種類のコントロールと同一のトランスフェクションを実施した。すなわち、各培養条件において24種類のトランスフェクションを実施した(図4a)。
各培養条件の細胞はトランスフェクションから24時間にフローサイトメトリーで解析した。一時的な探索解析の結果(図7a)と異なり、これらの培養条件間では、蛍光比率に大きなバイアスは見られなかった(図4c)ことから、蛍光比率の値をそのまま以後の解析に用いた。miRNA活性のプロファイルを主成分分析し、第一主成分を横軸、第二主成分を縦軸にとって、これらの培養条件にある細胞を分類した(図4d)。
測定された蛍光比率に対して主成分分析とクラスター分析(ウォード法)を行い54のmiRNAを23クラスターに分離し、各クラスターで第一成分または第二成分への寄与が最も高いmiRNAを選んだ。クラスター分析にはこれまでと同様に統計パッケージRのdist関数及びhclust関数を用いた。選ばれた23 miRNAのみで再び主成分分析を行い、第一成分または第二成分への寄与が高い11のmiRNAを選別した。これらの11 miRNAを用いて、一次的な探索解析(図3e, f)と同様の計算を実施して得られた5-slot mRNAのセットを図4eに、このmRNAセットをトランスフェクションした場合の、各培養条件の細胞の分布の推測結果を図4fに示す。また、実際にこの4 本の5-slot mRNAs を各培養条件の細胞にトランスフェクションし、フローサイトメトリーを実施した結果を図4gに示す。電子ティープロット上で細胞集団は時間変化にしたがって移動しており、8 種類のmiRNA活性から線形モデルで抽出した 2 つのパラメータを用いて、ヒトiPS細胞内部情報の経時的な変化を生きたまま追跡することができた。多種類の細胞を分類したプローブセット (図3e) と比べて、hiPSCの変化をより広い範囲に分離することができた (図9)。このことは細胞を分類している2つの合成パラメータを、mRNAのデザインにより任意に変更できることを示している。 Tracking the time change of the same cell (species) Furthermore, by tracking the process of human iPS cells losing their differentiation potential over time, the difference in the segregation ability of the obtained mRNA set due to the difference in cells searched in step (1) Was verified (Fig. 4). First, 54 miRNAs with a large difference between hiPSC and partially differentiated hiPSC (iPSC 14d) in the absence of bFGF were selected from the results of exploratory quantification of 270 miRNA activities (Fig. 3c) (Fig. 3c). FIG. 4a). For these miRNAs, a secondary exploratory analysis was performed to track changes in miRNA activity over time in the process of partial differentiation of hiPSCs in the absence of bFGF (Fig. 4b). HiPSC was cultured in the absence of bFGF and on the day of culture initiation (day 0) and 1 (day 1), 3 (day 3), 6 (day 6), 9 (day 9), or 14 days later (day 14). One type each of 1-slot mRNA encoding hmAG1, tagBFP, and hdKRed into which different miRNA target sequences were inserted and a total of four types of mRNA, hmKO2 mRNA used as a control for mRNA introduction, were mixed and transfected. At this time, the same transfection as the 6 types of controls used in the primary search analysis (Fig. 3a) was performed. That is, 24 types of transfection were performed under each culture condition (Fig. 4a).
Cells in each culture condition were analyzed by
Principal component analysis and cluster analysis (Ward's method) were performed on the measured fluorescence ratio to separate 54 miRNAs into 23 clusters, and the miRNA with the highest contribution to the first or second component was selected in each cluster. .. For the cluster analysis, the dist function and hclust function of the statistical package R were used as before. Principal component analysis was performed again with only the selected 23 miRNAs, and 11 miRNAs with a high contribution to the first or second component were selected. Using these 11 miRNAs, the set of 5-slot mRNA obtained by performing the same calculation as in the primary search analysis (Fig. 3e, f) is shown in Fig. 4e, when this mRNA set is transfected. , The estimation result of the cell distribution under each culture condition is shown in FIG. 4f. In addition, Fig. 4g shows the results of actually transfecting these four 5-slot mRNAs into cells under each culture condition and performing flow cytometry. Cell populations move over time on electronic tee plots, and lively track changes in human iPS cell internal information over time using two parameters extracted from eight miRNA activities using a linear model. We were able to. Compared with the probe set in which many types of cells were classified (Fig. 3e), changes in hiPSC could be isolated in a wider range (Fig. 9). This indicates that the two synthetic parameters that classify cells can be arbitrarily modified by the design of the mRNA.
(参考文献)
MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stemcell states.
Neveu P., Kye MJ., Qi S., Buchholz DE., Clegg DO., Sahin M., Park IH., Kim KS.,
Daley GQ., Kornblum HI., Shraiman BI., Kosik KS.
Cell Stem Cell, 7(6):671-81, 2010
Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches.
Miki K., Endo K., Takahashi S., Funakoshi S., Takei I., Katayama S., Toyoda T., Kotaka M., Takaki T., Umeda M., Okubo C., Nishikawa M., Oishi A., Narita M., Miyashita I., Asano K., Hayashi K., Osafune K., Yamanaka S., Saito H., Yoshida Y.
Cell Stem Cell, 16(6):699-711, 2015
Engineering protein-responsive mRNA switch in Mammalian cells.
Endo K., Saito H.
Methods Mol Biol, 1111:183-96, 2014
High-throughput assessment of microRNA activity and function using microRNA sensor and decoy libraries.
Mullokandov G., Baccarini A., Ruzo A., Jayaprakash AD., Tung N., Israelow B., Evans MJ., Sachidanandam R., Brown BD.
Nat Methods, 9(8):840-6, 2012(Reference)
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Claims (7)
(1)1つのmiRNA応答配列を有するmRNAの翻訳抑制効果を2以上の対象細胞で測定する工程、
(2)前記工程(1)の測定結果に基づき、各対象細胞でのmiRNA応答配列を2以上含有するmRNAの翻訳抑制効果を算出する工程、
(3)前記工程(2)で算出された値に基づき、前記2以上の対象細胞間における翻訳抑制効果の差が最大になる、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程。A method for designing an mRNA containing two or more miRNA response sequences, which comprises the following steps, in which an mRNA containing two or more miRNA response sequences is a marker gene functionally linked to two or more miRNA response sequences. A method that is an mRNA containing a sequence;
(1) A step of measuring the translational inhibitory effect of mRNA having one miRNA response sequence in two or more target cells.
(2) A step of calculating the translational inhibitory effect of mRNA containing two or more miRNA response sequences in each target cell based on the measurement result of the step (1).
(3) A step of selecting an mRNA containing two or more miRNA response sequences that maximizes the difference in translation inhibitory effect between the two or more target cells based on the value calculated in the step (2).
(式中、ρは、miRNAによる翻訳抑制効果を表し、
d [nt]は、開始コドンからmiRNA標的配列までの距離 を表し、
ξは、-0.576を表し、
ρ0 はそれぞれのmiRNAについて距離0 [nt] の時の仮想的な翻訳抑制効果を表す)に基づいて算出される、請求項1または2に記載の方法。The translation-suppressing effect of the step (2) is obtained by adding up the translation-suppressing effects-log (ρ) of each of the two or more miRNA response sequences by the number of miRNAs, and each of the translation-suppressing effects. -log (ρ) is the following formula
(In the formula, ρ represents the translational inhibitory effect of miRNA.
d [nt] represents the distance from the start codon to the miRNA target sequence
ξ represents -0.576,
The method according to claim 1 or 2, wherein ρ 0 represents a virtual translational inhibitory effect for each miRNA at a distance of 0 [nt]).
miRNA応答配列を2以上含有するmRNAを選択する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。The step (3) maximizes the dispersion of the translation amount of the marker gene in each target cell.
The method according to any one of claims 1 to 3, which comprises a step of selecting an mRNA containing two or more miRNA response sequences.
前記設計されたmRNAを、遺伝子工学的手法により合成する工程と
を含む、miRNA応答配列を2以上含有するmRNAの製造方法。The step of designing mRNA by the method according to any one of claims 1 to 4,
A method for producing an mRNA containing two or more miRNA response sequences, which comprises a step of synthesizing the designed mRNA by a genetic engineering method.
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