JP6932365B2 - A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and a method for predicting the prognosis of gastric cancer - Google Patents

A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and a method for predicting the prognosis of gastric cancer Download PDF

Info

Publication number
JP6932365B2
JP6932365B2 JP2016098055A JP2016098055A JP6932365B2 JP 6932365 B2 JP6932365 B2 JP 6932365B2 JP 2016098055 A JP2016098055 A JP 2016098055A JP 2016098055 A JP2016098055 A JP 2016098055A JP 6932365 B2 JP6932365 B2 JP 6932365B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gastric cancer
scirrhous
target molecule
cxcr2
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016098055A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2017206447A (en
Inventor
弘聖 平川
弘聖 平川
正和 八代
正和 八代
裕明 笠島
裕明 笠島
雅之 日野
雅之 日野
博久 中前
博久 中前
孝彦 中根
孝彦 中根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Public Corporation Osaka
Original Assignee
University Public Corporation Osaka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Public Corporation Osaka filed Critical University Public Corporation Osaka
Publication of JP2017206447A publication Critical patent/JP2017206447A/en
Priority to JP2021073627A priority Critical patent/JP7203447B2/en
Application granted granted Critical
Publication of JP6932365B2 publication Critical patent/JP6932365B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

本発明は、スキルス性胃癌の治療剤に関する。より具体的には、本発明は、骨髄間質細胞の胃癌細胞間質への誘導を抑制することによってスキルス性胃癌を治療する、スキルス性胃癌の治療剤に関する。更に、本発明は、胃癌患者の予後の予測方法に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for scirrhous gastric cancer. More specifically, the present invention relates to a therapeutic agent for scirrhous gastric cancer, which treats scirrhous gastric cancer by suppressing the induction of bone marrow stromal cells into gastric cancer cell stromal cells. Furthermore, the present invention relates to a method for predicting the prognosis of a gastric cancer patient.

近年の診断技術と術前術後管理の発達により胃癌の死亡率は減少しているものの、罹患者は多く、依然として癌による死因の中でも高い割合を占めている。胃癌の中でも、スキルス性胃癌が全体の約１０％を占めている。スキルス性胃癌は、腫瘍が隆起せずに胃粘膜の下に広がるため発見し難い、早期発見が難しく予後が悪い、進行が早く転移し易い、手術が困難等の特徴がある。スキルス性胃癌の多くでは腹膜播種が認められ、腹膜播種が認められると外科的治療を施せないという問題点がある。また、従来の胃癌治療薬では、スキルス性胃癌に対して治療効果が不十分であり、スキルス性胃癌の有効な治療方策が確立できていないのが現状である。このような背景の下、スキルス性胃癌に有効な治療薬の開発が急務となっている。 Although the mortality rate of gastric cancer has decreased due to recent developments in diagnostic techniques and preoperative and postoperative management, the number of affected patients is high, and it still accounts for a high proportion of cancer deaths. Among gastric cancers, scirrhous gastric cancer accounts for about 10% of the total. Scirrhous gastric cancer is characterized by being difficult to detect because the tumor does not rise and spreads under the gastric mucosa, difficult to detect early, poor prognosis, rapid progression and easy metastasis, and difficult surgery. Most scirrhous gastric cancers have peritoneal dissemination, and if peritoneal dissemination is observed, there is a problem that surgical treatment cannot be performed. In addition, conventional therapeutic agents for gastric cancer have insufficient therapeutic effects on scirrhous gastric cancer, and the current situation is that effective therapeutic measures for scirrhous gastric cancer have not been established. Against this background, there is an urgent need to develop effective therapeutic agents for scirrhous gastric cancer.

一方、本発明者等は、スキルス性胃癌において、胃癌細胞の周囲の間質細胞が、胃癌細胞の増殖や転移に影響を及ぼすことを明らかにしている（非特許文献１及び２参照）。更に、最近、この癌間質細胞は骨髄起源である可能性が報告され、骨髄間質細胞の胃癌細胞間質への誘導を抑制することが、スキルス性胃癌の治療に有効であることが示唆されている。
しかしながら、スキルス性胃癌における胃癌細胞が産生する骨髄細胞誘導シグナルについては解明できていないため、従来の技術では、骨髄間質細胞の胃癌細胞間質への誘導を抑制することによって、スキルス性胃癌を治療する方策が確立できていないのが現状である。 On the other hand, the present inventors have clarified that in scirrhous gastric cancer, the stromal cells surrounding the gastric cancer cells affect the proliferation and metastasis of the gastric cancer cells (see Non-Patent Documents 1 and 2). Furthermore, it has recently been reported that these cancer stromal cells may be of bone marrow origin, suggesting that suppressing the induction of bone marrow stromal cells into gastric cancer cell stromal cells is effective in treating scirrhous gastric cancer. Has been done.
However, since the bone marrow cell-inducing signal produced by gastric cancer cells in scirrhous gastric cancer has not been elucidated, conventional techniques have been used to suppress the induction of bone marrow stromal cells into gastric cancer cell stroma, thereby causing scirrhous gastric cancer. At present, no cure has been established.

また、予後が悪いことが知られているスキルス性胃癌を初めとして、胃癌患者の術後の予後を予測し、予後の悪化のリスクが高い術後の胃癌患者に対して、早期に適切な処置を施すことも重要になる。しかしながら、胃癌患者の予後を高精度で予測するためのマーカーについても十分に検討がなされていないのが現状である。 In addition, we predict the postoperative prognosis of gastric cancer patients, including scirrhous gastric cancer, which is known to have a poor prognosis, and take appropriate measures at an early stage for postoperative gastric cancer patients who are at high risk of worsening prognosis. It is also important to give. However, the current situation is that markers for predicting the prognosis of gastric cancer patients with high accuracy have not been sufficiently investigated.

Inoue T, Chung YS, Yashiro M, Nishimura S, Hasuma T, Otani S, Sowa M: Transforming growth factor-beta and hepatocyte growth factor produced by gastric fibroblasts stimulate the invasiveness of scirrhous gastric cancer cells. Jpn J Cancer Res, 88(2):152-159, 1997.Inoue T, Chung YS, Yashiro M, Nishimura S, Hasuma T, Otani S, Sowa M: Transforming growth factor-beta and hepatocyte growth factor produced by gastric fibroblasts stimulate the invasiveness of scirrhous gastric cancer cells. Jpn J Cancer Res, 88 ( 2): 152-159, 1997. Nakazawa K, Yashiro M, Hirakawa K: Keratinocyte growth factor produced by gastric fibroblasts specifically stimulates proliferation of cancer cells from scirrhous gastric carcinoma. Cancer Research 63: 8848-8852, 2003.Nakazawa K, Yashiro M, Hirakawa K: Keratinocyte growth factor produced by gastric fibroblasts specifically stimulates proliferation of cancer cells from scirrhous gastric carcinoma. Cancer Research 63: 8848-8852, 2003.

本発明の目的は、悪性度の強いスキルス性胃癌に対して優れた治療効果を示すスキルス性胃癌の治療剤を提供することである。また、本発明の他の目的は、胃癌患者の予後の予測方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for scirrhous gastric cancer, which exhibits an excellent therapeutic effect on highly malignant scirrhous gastric cancer. Another object of the present invention is to provide a method for predicting the prognosis of a gastric cancer patient.

本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2が、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナルに関与していることを突き止め、これらの分子の発現抑制及び／又は機能阻害によって、スキルス性胃癌を効果的に治療し得ることを見出した。また、本発明者は、胃癌組織の癌間質細胞において、骨髄由来マーカーであるCD271の発現量が多い胃癌患者は、スキルス性胃癌に多く予後が有意に悪いことを見出した。更に、本発明者は、胃癌組織の癌細胞におけるCXCL1の発現量、及び／又は胃癌組織の癌間質細胞におけるCXCR2の発現量が多い胃癌患者は、予後が悪いことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventor is involved in the signals that CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 induce bone marrow stromal cells into the stromal cancer of scirrhous gastric cancer. It was found that scirrhous gastric cancer can be effectively treated by suppressing the expression and / or function of these molecules. In addition, the present inventor has found that patients with gastric cancer having a high expression level of the bone marrow-derived marker CD271 in cancer stromal cells of gastric cancer tissue are more likely to have scirrhous gastric cancer and have a significantly worse prognosis. Furthermore, the present inventor has found that a gastric cancer patient having a high expression level of CXCL1 in cancer cells of gastric cancer tissue and / or an expression level of CXCR2 in cancer stromal cells of gastric cancer tissue has a poor prognosis. The present invention has been completed by further studies based on these findings.

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種の標的分子に対する発現抑制及び／又は機能阻害が可能な物質を有効成分とすることを特徴とする、スキルス性胃癌の治療剤。
項２． 前記標的分子に対する発現抑制が可能な物質が、前記標的分子に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、スキルス性胃癌の治療剤。
項３． 前記標的分子に対する機能阻害が可能な物質が、前記標的分子に対して機能阻害する低分子化合物、前記標的分子に対する抗体、及び当該抗体の断片よりなる群から選択される少なくとも１種である、項１に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項４． 前記標的分子の機能阻害が可能な物質がSB225002である、項１に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項５． 前記標的分子の機能阻害が可能な物質が前記標的分子に対する抗体又はその断片である、項１に記載のスキルス性胃癌の治療剤。
項６． 胃癌患者から採取された胃癌組織を用いて、癌間質細胞のCD271、癌細胞のCXCL1、及び癌間質細胞のCXCR2よりなる群から選択される少なくとも１種の発現量を検出することを特徴とする、胃癌患者の予後の予測方法。
項７． CD271を検出する試薬、CXCL1を検出する試薬、及びCXCR2を検出する試薬よりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、胃癌患者の予後検査薬。 That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
Item 1. A scirrhous property characterized by containing a substance capable of suppressing expression and / or inhibiting function of at least one target molecule selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 as an active ingredient. A therapeutic agent for gastric cancer.
Item 2. A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer, wherein the substance capable of suppressing the expression of the target molecule is at least one nucleic acid drug selected from the group consisting of siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, and antisense nucleic acid for the target molecule. ..
Item 3. The substance capable of inhibiting the function of the target molecule is at least one selected from the group consisting of a small molecule compound that inhibits the function of the target molecule, an antibody against the target molecule, and a fragment of the antibody. The therapeutic agent for scirrhous gastric cancer according to 1.
Item 4. Item 2. The therapeutic agent for scirrhous gastric cancer according to Item 1, wherein the substance capable of inhibiting the function of the target molecule is SB225002.
Item 5. Item 2. The therapeutic agent for scirrhous gastric cancer according to Item 1, wherein the substance capable of inhibiting the function of the target molecule is an antibody against the target molecule or a fragment thereof.
Item 6. Using gastric cancer tissue collected from a gastric cancer patient, it is characterized by detecting the expression level of at least one selected from the group consisting of CD271 of cancer stromal cells, CXCL1 of cancer cells, and CXCR2 of cancer stromal cells. A method for predicting the prognosis of gastric cancer patients.
Item 7. A prognosis test agent for gastric cancer patients, which comprises at least one selected from the group consisting of a reagent for detecting CD271, a reagent for detecting CXCL1, and a reagent for detecting CXCR2.

本発明によれば、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するのを効果的に抑制することができ、従来技術では、治療法が確立できていないスキルス性胃癌の効果的な治療が可能になり、スキルス性胃癌患者に福音をもたらすことができる。 According to the present invention, it is possible to effectively suppress the induction of bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer, and effective treatment of scirrhous gastric cancer for which a treatment method has not been established by the prior art. Can bring the gospel to patients with scirrhous gastric cancer.

また、本発明によれば、胃癌患者の外科的手術後に、予後が悪化し易いか否かを推測することができるので、予後の悪化のリスクが高い術後胃癌患者に対して、早期に適切な処置を施すことが可能になる。 Further, according to the present invention, since it is possible to estimate whether or not the prognosis is likely to deteriorate after the surgical operation of the gastric cancer patient, it is appropriate for the postoperative gastric cancer patient who has a high risk of deterioration of the prognosis at an early stage. It becomes possible to take various measures.

試験例１において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 1, the results of analysis of chemotaxis of bone marrow stromal cells by double chamber chemotaxis assay using a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer are shown. 試験例２において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 2, the results of analysis of chemotaxis of bone marrow stromal cells by double chamber chemotaxis assay using a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer are shown. 試験例３において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、骨髄間質細胞の走化性を創傷治癒アッセイにより分析した結果を示す。In Test Example 3, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by a wound healing assay using a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例３において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、骨髄間質細胞の走化性を創傷治癒アッセイにより分析した結果を示す。In Test Example 3, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by a wound healing assay using a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例４において、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3）の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った結果を示す。In Test Example 4, the results of analysis of cytokines contained in the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3) are shown. 試験例４において、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM12）の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った結果を示す。In Test Example 4, the results of analysis of cytokines contained in the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM12) are shown. 試験例４において、スキルス性胃癌由来の癌細胞（KATO-3）の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った結果を示す。In Test Example 4, the results of analysis of cytokines contained in the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (KATO-3) are shown. 試験例４において、スキルス性胃癌由来の癌細胞（NUGC3）の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った結果を示す。In Test Example 4, the results of analysis of cytokines contained in the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (NUGC3) are shown. 試験例５において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインを使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 5, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by double chamber chemotaxis assay using cytokines contained in the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例５において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインを使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 5, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by double chamber chemotaxis assay using cytokines contained in the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例６において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインを使用して、骨髄間質細胞の走化性を創傷治癒アッセイにより分析した結果を示す。In Test Example 6, the results of analyzing the chemotaxis of bone marrow stromal cells by a wound healing assay using cytokines contained in the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer are shown. 試験例７において、CCR6又はCXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞（siCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSC）のCXCR2及びCCR6の発現量を測定した結果を示す。In Test Example 7, the results of measuring the expression levels of CXCR2 and CCR6 in bone marrow stromal cells (siCXCR2 MSC and siCCR6 MSC) in which CCR6 or CXCR2 was knocked down are shown. 試験例８において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、CCR6又はCXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 8, the chemotaxis of bone marrow stromal cells in which CCR6 or CXCR2 was knocked down was analyzed by double chamber chemotaxis assay using a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例９において、抗CCL20抗体又は抗CXCL1抗体と、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清とを使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 9, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by double chamber chemotaxis assay using an anti-CCL20 antibody or an anti-CXCL1 antibody and a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. .. 試験例１０において、抗Dkk-1抗体又は抗lipocalin-2抗体と、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清とを使用して、骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 10, the chemotaxis of bone marrow stromal cells was analyzed by double chamber chemotaxis assay using anti-Dkk-1 antibody or anti-lipocalin-2 antibody and culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. The result is shown. 試験例１１において、スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対してCXCR2阻害剤を投与した後に、リンパ節転移の有無を解剖により観察した結果を示す。In Test Example 11, the results of anatomical observation of the presence or absence of lymph node metastasis after administration of a CXCR2 inhibitor to a scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model are shown. 試験例１１において、スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対してCXCR2阻害剤を投与した後に、同所移植後の生存率を測定した結果を示す。In Test Example 11, the results of measuring the survival rate after orthotopic transplantation after administration of a CXCR2 inhibitor to a scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model are shown. 試験例１１において、スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対してCXCR2阻害剤を投与し、同所移植から2週間後に胃癌組織の組織学的分析を行った結果を示す。In Test Example 11, a CXCR2 inhibitor was administered to a scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model, and a histological analysis of gastric cancer tissue was performed 2 weeks after the orthotopic transplantation. 試験例１１において、スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対してCXCR2阻害剤を投与し、同所移植から2週間後に胃癌組織の組織学的分析を行った結果を示す。In Test Example 11, a CXCR2 inhibitor was administered to a scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model, and a histological analysis of gastric cancer tissue was performed 2 weeks after the orthotopic transplantation. 試験例１１において、スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対してCXCR2阻害剤を投与し、同所移植から4週間後に、腫瘍面積、腫瘍体積、リンパ節転移個数、肝転移個数、胃重量、リンパ節転移重量、及び体重を測定した結果を示す。In Test Example 11, a CXCR2 inhibitor was administered to a scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model, and 4 weeks after the orthotopic transplantation, tumor area, tumor volume, number of lymph node metastases, number of liver metastases, stomach weight, lymph The node metastasis weight and the result of measuring the weight are shown. 試験例１２において、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を使用して、CXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞の走化性をdouble chamber chemotaxis assayにより分析した結果を示す。In Test Example 12, the chemotaxis of bone marrow stromal cells knocked down by CXCR2 was analyzed by double chamber chemotaxis assay using the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. 試験例１３において、胃癌患者をCD271陽性とCD271陰性に分類し、それぞれの術後生存年数を示した結果である。In Test Example 13, gastric cancer patients were classified into CD271 positive and CD271 negative, and the postoperative survival years of each were shown. 試験例１４において、胃癌患者をCXCL1陰性且つCXCR2陰性、CXCL1陰性且つCXCR2陽性、CXCL1陽性且つCXCR2陰性、及びCXCL1陽性且つCXCR2陽性の４つのグループに分類し、それぞれの術後生存年数を示した結果である。In Test Example 14, gastric cancer patients were classified into four groups: CXCL1 negative and CXCR2 negative, CXCL1 negative and CXCR2 positive, CXCL1 positive and CXCR2 negative, and CXCL1 positive and CXCR2 positive, and the results showing the postoperative survival years of each group. Is.

１．スキルス性胃癌の治療剤
本発明の治療剤は、スキルス性胃癌を治療するために使用される治療剤であって、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種の標的分子に対する発現抑制及び／又は機能阻害が可能な物質を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の治療剤について詳述する。 1. 1. Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer The therapeutic agent of the present invention is a therapeutic agent used for treating scirrhous gastric cancer and is selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 at least. The active ingredient is a substance capable of suppressing the expression and / or inhibiting the function of one target molecule. Hereinafter, the therapeutic agent of the present invention will be described in detail.

（有効成分）
本発明の治療剤では、有効成分として、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種の発現抑制及び／又は機能阻害が可能な物質を使用する。スキルス性胃癌における間質細胞が、当該胃癌細胞の増殖や転移を促進することが知られているが、本発明では、当該間質細胞の起源となる骨髄間質細胞がスキルス性胃癌の間質に誘導するのを抑制し、スキルス性胃癌を効果的に治療することを可能にする。 (Active ingredient)
In the therapeutic agent of the present invention, as an active ingredient, a substance capable of suppressing expression and / or function of at least one selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 is used. It is known that stromal cells in scirrhous gastric cancer promote the proliferation and metastasis of the gastric cancer cells, but in the present invention, the bone marrow stromal cells that are the origin of the stromal cells are the stroma of scirrhous gastric cancer. It suppresses the induction of gastric cancer and makes it possible to effectively treat scirrhous gastric cancer.

CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2は、胃癌細胞の増殖や転移を促進する骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナルに関与しており、本発明では、これらの発現を抑制、及び／又は機能を阻害することにより、スキルス性胃癌を効果的新治療することが可能になっている。以下、CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2を標的分子と表記することもある。 CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 are involved in signals that induce bone marrow stromal cells that promote the growth and metastasis of gastric cancer cells into the stroma of scirrhous gastric cancer, and in the present invention, these By suppressing the expression and / or inhibiting the function, it has become possible to effectively treat scirrhous gastric cancer. Hereinafter, CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 may be referred to as target molecules.

CXCL1は、CXCケモカインファミリーに属する公知のタンパク質である。CXCL1は、スキルス性胃癌細胞によって産生され、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナル分子として機能している。 CXCL1 is a known protein belonging to the CXC chemokine family. CXCL1 is produced by scirrhous gastric cancer cells and functions as a signal molecule that induces bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer.

CXCR2は、CXCL1の受容体として公知のタンパク質であり、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナル伝達の一役を担っている。 CXCR2 is a protein known as a receptor for CXCL1 and plays a role in signal transduction that induces bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer.

CCL20は、CCケモカインファミリーに属する公知のタンパク質である。CCL20は、スキルス性胃癌細胞によって産生され、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナル分子として機能している。 CCL20 is a known protein belonging to the CC chemokine family. CCL20 is produced by scirrhous gastric cancer cells and functions as a signal molecule that induces bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer.

CCR6は、CCL20の受容体として公知のタンパク質であり、骨髄間質細胞をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナル伝達の一役を担っている。 CCR6 is a protein known as a receptor for CCL20 and plays a role in signal transduction that induces bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer.

Lipocalin-2は、リポカリン・ファミリーに属するケモカイン誘導因子として公知のタンパク質である。Lipocalin-2は、スキルス性胃癌細胞によって産生され、骨髄間質細胞
をスキルス性胃癌の間質に誘導するシグナル分子として機能している。 Lipocalin-2 is a protein known as a chemokine inducing factor belonging to the lipocalin family. Lipocalin-2 is produced by scirrhous gastric cancer cells and functions as a signal molecule that induces bone marrow stromal cells into the stroma of scirrhous gastric cancer.

本発明において、標的分子（CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種）の発現抑制が可能な物質としては、薬学的に許容され、且つ標的分子をコードするDNA（CXCL1遺伝子、CXCR2遺伝子、CCL20遺伝子、CCR6遺伝子、及び／又はLipocalin-24遺伝子）から標的分子の発現を抑制できることを限度として特に制限されない。標的分子の発現を抑制する物質は、標的分子をコードしている遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいずれの段階で標的分子の発現に対する抑制作用を発揮するものであってもよい。標的分子の発現を抑制する物質として、具体的には、デコイ核酸等の標的分子をコードする遺伝子の転写を抑制する核酸分子；siRNA、shRNA、dsRNA等の標的分子のmRNAに対してRNA干渉作用を有するRNA分子又はその前駆体；miRNA、アンチセンス核酸（アンチセンスDNA、アンチセンスRNA）、リボザイム等の標的分子のmRNAの翻訳を抑制する核酸分子等の核酸医薬が挙げられる。これらの核酸医薬は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの核酸医薬の塩基配列は、標的分子をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。これらの核酸医薬の中でも、臨床応用への容易性等の観点から、好ましくは、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、アンチセンス核酸、更に好ましくはsiRNAが挙げられる。 In the present invention, as a substance capable of suppressing the expression of a target molecule (at least one selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2), a pharmaceutically acceptable target molecule is used. The expression of the target molecule is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the target molecule from the encoding DNA (CXCL1 gene, CXCR2 gene, CCL20 gene, CCR6 gene, and / or Lipocalin-24 gene). A substance that suppresses the expression of a target molecule exerts an inhibitory effect on the expression of the target molecule at any stage of transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, etc. of the gene encoding the target molecule. May be good. As a substance that suppresses the expression of the target molecule, specifically, a nucleic acid molecule that suppresses the transcription of a gene encoding the target molecule such as decoy nucleic acid; RNA interference action on the mRNA of the target molecule such as siRNA, shRNA and dsRNA. Nucleic acid drugs such as miRNA, antisense nucleic acid (antisense DNA, antisense RNA), and nucleic acid molecule that suppresses the translation of mRNA of a target molecule such as ribozyme. These nucleic acid drugs may be used alone or in combination of two or more. In addition, the base sequences of these nucleic acid drugs can be appropriately designed by a method known to those skilled in the art based on the base sequence information of the gene encoding the target molecule. Among these nucleic acid drugs, siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, antisense nucleic acid, and more preferably siRNA are preferable from the viewpoint of ease of clinical application.

また、前記核酸分子がRNA分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該RNA分子をコードしているDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。 When the nucleic acid molecule is an RNA molecule, it may be designed so that it can be produced in vivo. Specifically, the DNA encoding the RNA molecule may be inserted into an expression vector for mammalian cells. Examples of such expression vectors include viral vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, and Sendaivirus, animal cell expression plasmids, and the like.

また、標的分子（CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種）の機能阻害が可能な物質としては、薬学的に許容され、且つ当該標的の機能を抑制できるものであることを限度として特に制限されない。標的分子の機能を阻害する物質として、例えば、標的分子の機能を阻害する低分子化合物、標的分子に特異的に結合する抗体又はその断片、標的分子に特異的に結合するアプタマー等が挙げられる。これらの物質は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。 In addition, as a substance capable of inhibiting the function of a target molecule (at least one selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2), the substance is pharmaceutically acceptable and has the function of the target. There is no particular limitation as long as it can be suppressed. Examples of the substance that inhibits the function of the target molecule include a small molecule compound that inhibits the function of the target molecule, an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the target molecule, and an aptamer that specifically binds to the target molecule. These substances may be used alone or in combination of two or more.

標的分子の機能を阻害する低分子化合物としては、標的分子の機能を阻害し得る限り、公知の低分子化合物であっても、将来開発される低分子化合物であってもよい。当該低分子化合物として、具体的には、SB225002、SB265610、CHEMBL254773、CHEMBL403313、CHEMBL257829、AGN-PC-07PPDF、AGN-PC-07PPDD、Cpd19、CX4338、Sch527123等のCXCR2阻害剤（CXCR2の機能を阻害する化合物）が挙げられる。 The small molecule compound that inhibits the function of the target molecule may be a known small molecule compound or a small molecule compound that will be developed in the future as long as it can inhibit the function of the target molecule. Specific examples of the small molecule compound include CXCR2 inhibitors (inhibiting the function of CXCR2) such as SB225002, SB265610, CHEMBL254773, CHEMBL403313, CHEMBL257829, AGN-PC-07PPDF, AGN-PC-07PPDD, Cpd19, CX4338, and Sch527123. Compound).

また、標的分子に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。また、これらの抗体のアイソタイプについては、特に制限されず、IgG、IgM、IgA等のいずれであってもよいが、好ましくはIgGが挙げられる。 The antibody that specifically binds to the target molecule may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and a monoclonal antibody is preferable. The isotype of these antibodies is not particularly limited and may be any of IgG, IgM, IgA and the like, but IgG is preferable.

また、本発明の治療剤をヒトに投与する場合には、前記抗体は、ヒト体内での抗原性が低減されている抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ニワトリ−ヒトキメラ抗体等が好ましい。これらの中でも、完全ヒト抗体、ヒト化抗体が更に好ましい。 When the therapeutic agent of the present invention is administered to humans, the antibody is an antibody having reduced antigenicity in the human body, specifically, a fully human antibody, a humanized antibody, or a mouse-human chimeric antibody. , Chicken-human chimeric antibody and the like are preferable. Of these, fully human antibodies and humanized antibodies are even more preferred.

また、前記抗体の断片としては、標的分子を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであればよく、具体的には、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、scFv-Fc等が挙げられる。 Further, the antibody fragment may be any one having at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to a target molecule, and specifically, Fab, Fab', F (ab). ') 2 , scFv, scFv-Fc, etc.

前記抗体及びその断片は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。 The antibody and fragments thereof can be genetically engineered according to a conventional method.

（適用対象）
本発明の治療剤は、スキルス性胃癌の治療を目的としてスキルス性胃癌患者に適用される。また、本発明の治療剤は、スキルス性胃癌患者からスキルス性胃癌を摘出した後に、再発や転移を予防する目的で投与してもよく、スキルス性胃癌の切除後の患者における予後の改善剤又は癌の転移予防剤としても使用することもできる。 (Applicable target)
The therapeutic agent of the present invention is applied to patients with scirrhous gastric cancer for the purpose of treating scirrhous gastric cancer. Further, the therapeutic agent of the present invention may be administered for the purpose of preventing recurrence or metastasis after excision of scirrhous gastric cancer from a patient with scirrhous gastric cancer, and may be an agent for improving prognosis in patients after resection of scirrhous gastric cancer. It can also be used as a cancer metastasis preventive agent.

また、本発明の治療剤は、ヒトのみならず、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物に対して使用できるが、ヒト用の医薬品として好適に使用される。 Further, the therapeutic agent of the present invention can be used not only for humans but also for mammals such as cattle, pigs, dogs, cats, goats, rats, mice and rabbits, but is preferably used as a pharmaceutical product for humans. ..

（用量、用法）
本発明の治療剤の投与方法としては、本発明の治療剤を生体内でスキルス性胃癌にデリバリーできることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。 (Dose, usage)
The method for administering the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the therapeutic agent of the present invention can be delivered to scirrhous gastric cancer in vivo, and for example, intravascular (intravenous or intravenous) injection, continuous infusion, etc. Subcutaneous administration, topical administration, intramuscular administration and the like can be mentioned. Among these, intraarterial and intravenous administration is preferable.

本発明の治療剤の投与量は、使用する有効成分の種類、患者の症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて、標的分子の発現抑制及び／又は機能阻害が可能な範囲で適宜設定すればよい。 The dose of the therapeutic agent of the present invention is appropriately set according to the type of active ingredient used, the degree of symptom of the patient, the sex of the patient, the age, etc., within a range capable of suppressing the expression and / or function of the target molecule. do it.

本発明の治療剤は、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗腫瘍作用を有する他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。 The therapeutic agent of the present invention may be used alone or in combination with one or more other agents having antitumor activity and / or radiation therapy.

（製剤形態）
また、本発明の治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。 (Formation form)
In addition, the therapeutic agent of the present invention is formulated by adding a pharmaceutically acceptable carrier or additive according to the formulation form thereof. For example, in the case of a solid formulation, it can be formulated with an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant and the like. Further, in the case of a liquid preparation, it can be formulated using a physiological saline solution, a buffer solution or the like.

また、本発明の治療剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子がスキルス性胃癌細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。 In addition, when a nucleic acid molecule is used as an active ingredient in the therapeutic agent of the present invention, it may be formulated together with a nucleic acid introduction aid so that the nucleic acid molecule can be easily transferred into scirrhous gastric cancer cells. desirable. Specific examples of the nucleic acid introduction aid include lipofectamine, oligofectamine, RNAifect, liposome, polyamine, DEAE dextran, calcium phosphate, dendrimer and the like.

２．胃癌患者の予後の予測方法
後述する試験例１３に示すように、癌間質細胞におけるCD271の発現量が高い胃癌の患者は、スキルス性胃癌患者が多く、胃癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが明らかにされている。更に、後述する試験例１４に示すように、癌細胞におけるCXCL1の発現量、及び／又は癌間質細胞におけるCXCR2の発現量が高い胃癌の患者は、胃癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが明らかにされている。従って、本発明は、更に、胃癌患者から採取された胃癌組織を用いて、癌間質細胞のCD271、癌細胞のCXCL1、及び癌間質細胞のCXCR2よりなる群から選択される少なくとも１種の発現量を検出することを特徴とする、胃癌患者の予後の予測方法を提供する。 2. Method for Predicting Prognosis of Gastric Cancer Patients As shown in Test Example 13 described later, many gastric cancer patients with high expression level of CD271 in cancer stromal cells tend to have poor prognosis after excision of gastric cancer. It has been clarified that there is. Furthermore, as shown in Test Example 14 described later, patients with gastric cancer having a high expression level of CXCL1 in cancer cells and / or an expression level of CXCR2 in cancer stromal cells tend to have a worse prognosis after excision of gastric cancer. It has been revealed that there is. Therefore, the present invention further uses gastric cancer tissue collected from a gastric cancer patient to at least one selected from the group consisting of CD271 of cancer stromal cells, CXCL1 of cancer cells, and CXCR2 of cancer stromal cells. Provided is a method for predicting the prognosis of a gastric cancer patient, which comprises detecting the expression level.

当該予測方法においてCD271の発現量が高ければ、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと予測される。当該予後の予測方法は、とりわけ、スキルス性胃癌の骨髄間質細胞の癌間質誘導抑制治療の適応判定と術後の予後の予測方法として好適である。例えば、胃癌患者から摘出された胃癌組織における癌間質細胞のCD271が陽性の場合、陰性の場合に比較し、死亡リスクが1.8倍程度、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと推測される。 If the expression level of CD271 is high in the prediction method, the risk of postoperative recurrence or metastasis is high, and the prognosis is likely to deteriorate. The prognosis prediction method is particularly suitable as a method for determining the indication for cancer stromal induction suppression treatment of bone marrow stromal cells of scirrhous gastric cancer and for predicting the postoperative prognosis. For example, when CD271 of cancer stromal cells in gastric cancer tissue removed from a gastric cancer patient is positive, the risk of death is about 1.8 times higher than when it is negative, the risk of postoperative recurrence or metastasis is higher, and the prognosis is worse. It is presumed that it is easy to do.

また、当該予測方法において、CXCL1及び／又はCXCR2の発現量が高ければ、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと予測される。特に、CXCL1及びCXCR2の双方の発現量が高い場合には、予後が悪化する傾向が強いと予測される。例えば、胃癌患者から摘出された胃癌組織における癌細胞のCXCL1が陽性の場合、陰性の場合に比較し、死亡リスクが４．８倍程度高く、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと推測される。また、胃癌患者から摘出された胃癌組織における癌間質細胞のCXCR2が陽性の場合、陰性の場合に比較し、死亡リスクが３．８倍程度高く、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと推測される。更に、胃癌患者から摘出された胃癌組織における癌細胞のCXCL1が陽性且つ癌間質細胞のCXCR2が陽性の場合、双方が陰性の場合に比較し、死亡リスクが５０倍程度高く、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと推測される。 In addition, in the prediction method, if the expression level of CXCL1 and / or CXCR2 is high, the risk of postoperative recurrence or metastasis is high, and the prognosis is likely to deteriorate. In particular, when the expression levels of both CXCL1 and CXCR2 are high, it is predicted that the prognosis tends to deteriorate. For example, when CXCL1 of cancer cells in gastric cancer tissue removed from a gastric cancer patient is positive, the risk of death is about 4.8 times higher than that of negative case, the risk of postoperative recurrence or metastasis is high, and the prognosis is high. It is presumed that it tends to get worse. In addition, when CXCR2 of cancer stromal cells in gastric cancer tissue removed from gastric cancer patients is positive, the risk of death is about 3.8 times higher than that of negative cases, and the risk of postoperative recurrence or metastasis is high. It is presumed that the prognosis tends to deteriorate. Furthermore, when CXCL1 of cancer cells and CXCR2 of cancer stromal cells are positive in gastric cancer tissue removed from gastric cancer patients, the risk of death is about 50 times higher than when both are negative, and recurrence after surgery. It is presumed that the risk of metastasis is high and the prognosis is likely to deteriorate.

CD271、CXCL1及び／又はCXCR2の発現量の測定は、免疫染色法等の従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、胃癌患者から摘出された胃癌組織を用いて、抗CD271抗体、抗CXCL1抗体、及び／又は抗CXCR2抗体を用いて、これらの発現量を測定することができる。 The expression level of CD271, CXCL1 and / or CXCR2 can be measured according to a conventionally known method such as immunostaining. For example, the expression level of gastric cancer tissue removed from a gastric cancer patient can be measured using an anti-CD271 antibody, an anti-CXCL1 antibody, and / or an anti-CXCR2 antibody.

また、本発明は、前記予測方法を簡便に行うための検査薬として、CD271を検出する試薬、CXCL1を検出する試薬、及びCXCR2を検出する試薬よりなる群から選択される少なくとも１種を含む、胃癌患者の予後検査薬を提供する。当該予後検査薬に使用される前記各試薬としては、具体的には、前述する抗体等が挙げられる。 Further, the present invention includes at least one selected from the group consisting of a reagent for detecting CD271, a reagent for detecting CXCL1, and a reagent for detecting CXCR2 as a test agent for easily performing the prediction method. To provide a prognostic test drug for patients with gastric cancer. Specific examples of the reagents used in the prognosis test drug include the above-mentioned antibodies and the like.

以下、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下の記載、及び図中において、培養上清を「CM」と略記し、無血清を「SF」と略記し、スキルス性胃癌由来の癌細胞OCUM-2MD3を「D3」と略記することもある。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on Examples and the like, but the present invention is not limited thereto. In the following description and figures, the culture supernatant is abbreviated as "CM", serum-free is abbreviated as "SF", and scirrhous gastric cancer-derived cancer cell OCUM-2MD3 is abbreviated as "D3". There is also.

試験例１：スキルス性胃癌由来の癌細胞が骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）−１
6穴プレートに、8μｍ孔のメンブレンを有するチャンバーを挿入し、上部のチャンバーに5×103cells/wellの骨髄間質細胞（marrow stromal cell; MSC）を播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2M及びOCUM-2MD3）の培養上清を添加し、37℃で28時間インキュベートした。その後、8μｍ孔のメンブレンの上面を綿棒にて拭い、メンブレンに付着している細胞を固定した。メンブレンの下面に侵入しているMSCをDiff Quickを用いて染色し、細胞数を計測した。また、コントロールとして、前記培養上清に代えて培地（無血清DMEM）を使用し、前記と同条件で試験を行った。 Test Example 1: Effect of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay) -1
A chamber with an 8 μm pore membrane is inserted into a 6-well plate, 5 × 10 3 cells / well marrow stromal cells (MSCs) are seeded in the upper chamber, and scirrhous gastric cancer in the lower chamber. Culture supernatants of derived cancer cells (OCUM-2M and OCUM-2MD3) were added and incubated at 37 ° C. for 28 hours. Then, the upper surface of the membrane having 8 μm pores was wiped with a cotton swab to fix the cells attached to the membrane. The MSC invading the underside of the membrane was stained with Diff Quick, and the number of cells was counted. In addition, as a control, a medium (serum-free DMEM) was used instead of the culture supernatant, and the test was conducted under the same conditions as described above.

得られた結果を図１に示す。この結果から、MSCにはスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2M及びOCUM2MD3）の培養上清に対する走化性があることが示され、スキルス性胃癌由来の癌細胞にはMSCを誘導するシグナル分子を産生していることが示唆された。 The obtained results are shown in FIG. From this result, it was shown that MSC has chemotaxis to the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2M and OCUM2MD3), and MSC-inducing signal for scirrhous gastric cancer-derived cancer cells. It was suggested that it was producing a molecule.

試験例２：スキルス性胃癌由来の癌細胞が骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）−２
スキルス性胃癌由来の癌細胞（KATO-3、NUGC3、NUGC4、OCUM8、及びOCUM9）の培養上清を使用して、前記試験例１と同様の方法で、double chamber chemotaxis assayを行った。 Test Example 2: Effect of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay) -2
Using the culture supernatants of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer (KATO-3, NUGC3, NUGC4, OCUM8, and OCUM9), a double chamber chemotaxis assay was performed in the same manner as in Test Example 1 above.

得られた結果を図２に示す。この結果からも、試験例１の結果と同様に、MSCにはスキルス性胃癌由来の癌細胞（KATO-3、NUGC3、NUGC4、OCUM8、及びOCUM9）の培養上清に対する走化性があることが確認された。 The obtained results are shown in FIG. From this result as well, similar to the result of Test Example 1, MSC has chemotaxis to the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (KATO-3, NUGC3, NUGC4, OCUM8, and OCUM9). confirmed.

試験例３：スキルス性胃癌由来の癌細胞が骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（創傷治癒アッセイ）
96穴プレートに4×103cell/wellのMSCを播種し、終夜培養し、コンフルエントの細胞単層を形成した後に、細胞単層に対してピペットの先端を用いて線状剥離を行い、創傷（wound）を作成した。次いで、各穴に、癌細胞の培養上清を添加し、3時間毎に創傷内へ遊走した細胞をIncucyte ZOOMを用いて撮影し、創傷内の細胞密度を測定した。なお、癌細胞の培養上清としては、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2M及びOCUM-2MD3）、及び非スキルス性胃癌由来の癌細胞（MKN45及びMKN74）を用いて調製したものを使用した。また、コントロールとして、前記培養上清に代えて培地（無血清DMEM）を使用し、前記と同条件で試験を行った。 Test Example 3: Effect of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer on chemotaxis of bone marrow stromal cells (wound healing assay)
A 4 × 10 3 cell / well MSC was seeded on a 96-well plate, cultured overnight to form a confluent cell monolayer, and then linearly detached from the cell monolayer using the tip of a pipette to wound the wound. (Wound) was created. Next, the culture supernatant of cancer cells was added to each hole, and the cells that migrated into the wound were photographed using Incucyte ZOOM every 3 hours, and the cell density in the wound was measured. As the culture supernatant of cancer cells, those prepared using cancer cells derived from scirrhous gastric cancer (OCUM-2M and OCUM-2MD3) and cancer cells derived from non-skilled gastric cancer (MKN45 and MKN74) were used. bottom. In addition, as a control, a medium (serum-free DMEM) was used instead of the culture supernatant, and the test was conducted under the same conditions as described above.

得られた結果を図３及び４に示す。非キルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を添加した場合では、コントロールの場合と同程度の創傷部における細胞密度であった。これに対して、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清を添加した場合には、コントロールと比較して、創傷部における細胞密度が有意に上昇しており、MSCの走化性が認められた。 The obtained results are shown in FIGS. 3 and 4. When the culture supernatant of cancer cells derived from non-Kirs gastric cancer was added, the cell density in the wound was similar to that in the control case. On the other hand, when the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells was added, the cell density in the wound area was significantly increased as compared with the control, and MSC chemotaxis was observed. rice field.

試験例４：スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインの分析
Human XL cytokine array kitを使用して、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインの分析を行った。具体的には、各種サイトカインに対する抗体をプロットしているメンブレン上に、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3、OCUM12、KATO-3、及びNUGC3）の培養上清を添加し、４℃で終夜反応させた。その後、Detection antibody cocktail及びStreptoavidin-HRPをこの順でmembraneに添加し、更にChemi Reagent Mixを添加して、その1分後より撮影を行った。 Test Example 4: Analysis of cytokines contained in the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer
Using the Human XL cytokine array kit, cytokines contained in the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer were analyzed. Specifically, culture supernatants of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3, OCUM12, KATO-3, and NUGC3) were added onto a membrane on which antibodies against various cytokines were plotted, and at 4 ° C. I made it react all night. Then, Detection antibody cocktail and Streptoavidin-HRP were added to the membrane in this order, Chemi Reagent Mix was further added, and imaging was performed 1 minute later.

得られた結果を図５〜８に示す。これらの結果から、スキルス性胃癌由来の癌細胞は、CXCL1、Lipocalin-2、CXCL8、CXCL5、Dkk-1、CCL20、anglogenin、EMPRIN等のサイトカインを多く産生していることが明らかとなった。 The obtained results are shown in FIGS. 5 to 8. From these results, it was clarified that cancer cells derived from scirrhous gastric cancer produce a large amount of cytokines such as CXCL1, Lipocalin-2, CXCL8, CXCL5, Dkk-1, CCL20, anglogenin, and EMPRIN.

試験例５：スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインが骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）
前記試験例４においてスキルス性胃癌由来の癌細胞による産生が認められた各種サイトカイン（CXCL1、Lipocalin-2、CXCL8、CXCL5、Dkk-1、CCL20、anglogenin、EMPRIN）を使用して、double chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、各サイトカインを所定濃度（CXCL1; 200 ng/mL, CXCL5; 10 ng/mL, CXCL8; 2.5 ng/mL, Lipocalin-2; 10 ng/mL, Dkk-1; 100 ng/mL, Angiogenin; 10 ng/mL, EMMPRIN; 5 μg/mL, CCL20; 1 ng/mL）又はその１０倍濃度（CXCL8; 25 ng/mL, Lipocalin-2; 100 ng/mL, Dkk-1; 1 μg/mL, Angiogenin; 100 ng/mL）（図中、×10）で含む無血清DMEMを下部のチャンバーに添加した
こと以外は、前記試験例１と同様の方法で行った。また、比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2M及びOCUM2MD3）の培養上清を使用して、同様に試験を行った。なお、コントロールとしては、下部のチャンバーに培地（無血清DMEM）を使用して、前記と同条件で試験を行った。 Test Example 5: Effect of cytokines contained in culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay)
Double chamber chemotaxis assay using various cytokines (CXCL1, Lipocalin-2, CXCL8, CXCL5, Dkk-1, CCL20, anglogenin, EMPRIN) found to be produced by cancer cells derived from scirrhous gastric cancer in Test Example 4 Was done. In this study, each cytokine was concentrated at a predetermined concentration (CXCL1; 200 ng / mL, CXCL5; 10 ng / mL, CXCL8; 2.5 ng / mL, Lipocalin-2; 10 ng / mL, Dkk-1; 100 ng / mL, Angiogenin. 10 ng / mL, EMMPRIN; 5 μg / mL, CCL20; 1 ng / mL) or 10 times the concentration (CXCL8; 25 ng / mL, Lipocalin-2; 100 ng / mL, Dkk-1; 1 μg / mL , Angiogenin; 100 ng / mL) (× 10 in the figure) was added to the lower chamber, but the procedure was the same as in Test Example 1 above. In addition, for comparison, culture supernatants of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer (OCUM-2M and OCUM2MD3) were used in the same test. As a control, a medium (serum-free DMEM) was used in the lower chamber, and the test was conducted under the same conditions as described above.

得られた結果を図９及び１０に示す。これらの結果から、CXCL１、CXCL5、CCL20、Dkk-1、及びipocalin-2において、MSCの走化性が有意に認められた。 The obtained results are shown in FIGS. 9 and 10. From these results, the chemotaxis of MSCs was significantly observed in CXCL1, CXCL5, CCL20, Dkk-1, and ipocalin-2.

試験例６：スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清に含まれるサイトカインが骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（創傷治癒アッセイ）
前記試験例４においてスキルス性胃癌由来の癌細胞による産生が認められた各種サイトカイン（CXCL1、Lipocalin-2、CXCL8、CXCL5、Dkk-1、CCL20、anglogenin、EMPRIN）を使用して、創傷治癒アッセイを行った。本試験では、96穴プレートの各穴に各サイトカインを（CXCL1; 200 ng/mL, CXCL5; 10 ng/mL, CXCL8; 25 ng/mL, Lipocalin-2; 100 ng/mL, Dkk-1; 1 μg/mL, Angiogenin; 100 ng/mL, EMMPRIN; 5 μg/mL, CCL20; 1 ng/mL）含む無血清DMEMを添加したこと以外は、前記試験例３と同様の方法で行った。また、比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM12）の培養上清を使用して、前記試験例３と同様の条件で試験を行った。なお、コントロールとして、培地（無血清DMEM）を使用して、前記と同条件で試験を行った。 Test Example 6: Effect of cytokines contained in culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells on chemotaxis of bone marrow stromal cells (wound healing assay)
A wound healing assay was performed using various cytokines (CXCL1, Lipocalin-2, CXCL8, CXCL5, Dkk-1, CCL20, anglogenin, EMPRIN) that were found to be produced by cancer cells derived from scirrhous gastric cancer in Test Example 4. went. In this study, each cytokine was placed in each hole of the 96-well plate (CXCL1; 200 ng / mL, CXCL5; 10 ng / mL, CXCL8; 25 ng / mL, Lipocalin-2; 100 ng / mL, Dkk-1; 1 The procedure was the same as in Test Example 3 except that serum-free DMEM containing μg / mL, Angiogenin; 100 ng / mL, EMMPRIN; 5 μg / mL, CCL20; 1 ng / mL) was added. For comparison, a culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer (OCUM12) was used, and the test was conducted under the same conditions as in Test Example 3. As a control, a medium (serum-free DMEM) was used, and the test was conducted under the same conditions as described above.

得られた結果を図１１に示す。これらの結果では、CXCL1、CCL20及びanglogeninにおいて、MSCの走化性が有意に認められた。 The obtained results are shown in FIG. In these results, the chemotaxis of MSCs was significantly observed in CXCL1, CCL20 and anglogenin.

試験例７：CCR6又はCXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞の作成
CXCL1の受容体であるCXCR2、及びCCL20の受容体であるCCR6をノックダウンしたMSCを以下の方法に従って作製した。先ず、6穴プレートの各穴に2×105cell/wellのMSCを播種した。別途、150μlのOptimenと9μlのlipofectamin RNAiMAX reagentの混合液と、150μlのOptimenと9μlのsiRNA（siCCR6又はsiCXCR2）との混合液とを混合し、室温で5分間放置した後に、これを前記MSCを播種した各穴に添加し、37℃で48時間インキュベートした。斯して、CXCR2をノックダウンしたMSC（siCXCR2 MSC）及びCCR6をノックダウンしたMSC（siCCR6 MSC）を作製した。 Test Example 7: Preparation of bone marrow stromal cells in which CCR6 or CXCR2 is knocked down
MSCs in which CXCR2, which is a receptor for CXCL1, and CCR6, which is a receptor for CCL20, were knocked down were prepared according to the following method. First, 2 × 10 5 cell / well MSC was sown in each hole of the 6-well plate. Separately, a mixed solution of 150 μl Optimen and 9 μl lipofectamin RNAiMAX reagent and a mixed solution of 150 μl Optimen and 9 μl siRNA (siCCR6 or siCXCR2) were mixed, left at room temperature for 5 minutes, and then the MSC was used. It was added to each seeded hole and incubated at 37 ° C. for 48 hours. Thus, MSCs in which CXCR2 was knocked down (siCXCR2 MSC) and MSCs in which CCR6 was knocked down (siCCR6 MSC) were prepared.

また、siCXCR2 MSCにおけるCXCR2の発現量、及びsiCCR6 MSCにおけるCCR6の発現量を測定した結果を図１２に示す。図１２に示す通り、siCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSCでは、目的遺伝子（CXCR2及びCCR6）が十分にノックダウンされていることが確認された。 The results of measuring the expression level of CXCR2 in the siCXCR2 MSC and the expression level of CCR6 in the siCCR6 MSC are shown in FIG. As shown in FIG. 12, it was confirmed that the target genes (CXCR2 and CCR6) were sufficiently knocked down in the siCXCR2 MSC and siCCR6 MSC.

斯して作製されたsiCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSCを、後述する各試験に使用した。 The siCXCR2 MSCs and siCCR6 MSCs thus prepared were used in each of the tests described below.

試験例８：CCR6又はCXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）
前記試験例７で作成したsiCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSCを用いて、double chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、上部のチャンバーにsiCXCR2 MSC又はsiCCR6 MSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清を添加したこと以外は、前記試験例１と同様の方法で行った。比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清の代わりに培地（無血清DMEM）を使用して、同様に試験を行った。なお、コントロールとしては、CXCR2及びCCR6をノックダウンしていないMSC（negative MSC）を使用し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清又は培地（無血清DMEM）を使用して、同様に試験を行った。 Test Example 8: Effect of knockdown of CCR6 or CXCR2 on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay)
A double chamber chemotaxis assay was performed using the siCXCR2 MSC and siCCR6 MSC prepared in Test Example 7. In this test, except that siCXCR2 MSC or siCCR6 MSC was seeded in the upper chamber and the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3 and OCUM12) was added to the lower chamber. It was done in the same way as. For comparison, the same test was performed using medium (serum-free DMEM) instead of the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. As a control, MSCs (negative MSCs) in which CXCR2 and CCR6 are not knocked down are used, and culture supernatants or media (none) of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3 and OCUM12) are used in the lower chamber. The same test was performed using serum DMEM).

得られた結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、siCXCR2 MSC及びsiCCR6 MSCでは、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清の存在下での走化性が抑制されていた。即ち、本試験結果から、CXCR2又はCCR6の発現抑制又は機能阻害が、スキルス性胃癌によって誘発されるMSCの走化性を抑制できることが確認された。 The obtained results are shown in FIG. As is clear from FIG. 13, in the siCXCR2 MSC and siCCR6 MSC, the chemotaxis of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer was suppressed in the presence of the culture supernatant. That is, from the results of this study, it was confirmed that suppression of CXCR2 or CCR6 expression or functional inhibition can suppress the chemotaxis of MSCs induced by scirrhous gastric cancer.

試験例９：抗CCL20抗体及び抗CXCL1抗体が骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）
抗CCL20抗体及び抗CXCL1抗体を用いて、MSCに対するdouble chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、上部のチャンバーにMSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清と共に抗CCL20抗体を5μg/ml、抗CXCL1抗体を200ng/mL添加したこと以外は、前記試験例１と同様の方法で行った。比較のために、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清のみ又は培地（無血清DMEM）のみを添加して同様に試験を行った。 Test Example 9: Effect of anti-CCL20 antibody and anti-CXCL1 antibody on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay)
A double chamber chemotaxis assay for MSCs was performed using anti-CCL20 antibody and anti-CXCL1 antibody. In this test, MSC was seeded in the upper chamber, and 5 μg / ml of anti-CCL20 antibody and 200 ng / ml of anti-CXCL1 antibody were added to the lower chamber together with the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3 and OCUM12). The procedure was the same as in Test Example 1 except that mL was added. For comparison, the same test was performed by adding only the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3 and OCUM12) or only the medium (serum-free DMEM) to the lower chamber.

得られた結果を図１４に示す。この結果、抗CCL20抗体及び抗CXCL1抗体は、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清によって生じるMSCの走化性を有意に抑制できることが確認された。 The obtained results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that the anti-CCL20 antibody and the anti-CXCL1 antibody can significantly suppress the chemotaxis of MSCs caused by the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer.

試験例１０：抗Dkk-1抗体及び抗lipocalin-2抗体が骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）
抗Dkk-1抗体及び抗lipocalin-2抗体を用いて、MSCに対するdouble chamber chemotaxisassayを行った。本試験では、上部のチャンバーにMSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清と共に抗Dkk-1抗体を25μg/mL、抗lipocalin-2抗体を25μg/mL添加したこと以外は、前記試験例１と同様の方法で行った。比較のために、下部のチャンバーにDkk-1を100 ng/mL、lipocalin-2を25ng/mlを含む無血清DMEMを添加して同様に試験を行った。また、コントロールとして、下部のチャンバーに無血清DMEMを添加して同様に試験を行った。 Test Example 10: Effect of anti-Dkk-1 antibody and anti-lipocalin-2 antibody on chemotaxis of bone marrow stromal cells (double chamber chemotaxis assay)
A double chamber chemotaxis assay for MSCs was performed using anti-Dkk-1 antibody and anti-lipocalin-2 antibody. In this test, MSC was seeded in the upper chamber, and 25 μg / mL of anti-Dkk-1 antibody and anti-lipocalin-2 were added to the lower chamber together with the culture supernatant of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MD3 and OCUM12). The procedure was the same as in Test Example 1 except that 25 μg / mL of the antibody was added. For comparison, serum-free DMEM containing 100 ng / mL of Dkk-1 and 25 ng / ml of lipocalin-2 was added to the lower chamber and the same test was performed. In addition, as a control, serum-free DMEM was added to the lower chamber and the same test was conducted.

得られた結果を図１５に示す。この結果、抗Dkk-1抗体では、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清によって生じるMSCの走化性を抑制できなかったが、抗lipocalin-2抗体では、当該MSCの走化性を有意に抑制できていた。 The obtained results are shown in FIG. As a result, the anti-Dkk-1 antibody could not suppress the chemotaxis of MSC caused by the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer, but the anti-lipocalin-2 antibody significantly improved the chemotaxis of the MSC. I was able to suppress it.

試験例１１：スキルス性胃癌細胞同所移植モデルに対するCXCR2阻害剤の影響
ヌードマウス（BALB/c nu/nu、4週齢、雌）の胃壁に、スキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MLN）1×107cell/100μlを30ゲージ針を用いて同所移植した。移植翌日から、CXCR2阻害剤であるSB225002を１回の投与当たり1mg/kg又は3mg/kgとなるように、5回/週の頻度で腹腔内投与した。移植から4週間後に、胃腫瘍のサイズ、重量、リンパ節転移・肝転移の個数、及び体重を測定する。また、コントロールとして、SB225002の投与を行わないこと以外は、前記と同条件で試験を行った。また、本試験では、各群10匹のヌードマウスを使用して行った。 Test Example 11: Effect of CXCR2 inhibitor on scirrhous gastric cancer cell orthotopic transplantation model Cancer cells derived from scirrhous gastric cancer (OCUM-2MLN) on the stomach wall of nude mice (BALB / c nu / nu, 4 weeks old, female) 1 × 10 7 cells / 100 μl were orthotopically transplanted using a 30 gauge needle. From the day after transplantation, SB225002, a CXCR2 inhibitor, was intraperitoneally administered at a frequency of 5 times / week so as to be 1 mg / kg or 3 mg / kg per administration. Four weeks after transplantation, the size and weight of the gastric tumor, the number of lymph node metastases / liver metastases, and body weight are measured. In addition, as a control, the test was conducted under the same conditions as above, except that SB225002 was not administered. In this study, 10 nude mice in each group were used.

得られた結果を図１６〜２０に示す。同所移植から4週間後では、SB225002を投与した群では、コントロールに比して、腫瘍面積、腫瘍体積、リンパ節転移個数、胃重量、及びリンパ節転移重量が有意に低く、生存率も高かった（図１６、１７、及び２０）。また、同所移植から2週間後に同所移植した胃癌組織について組織学的分析をしたところ、コントロール群では、間質形成が誘導されていたが、SB225002を投与した群では間質の誘導が抑制されており、腫瘍の壊死も認められた（図１８及び１９）。この結果から、CXCR2の機能阻害が、スキルス性胃癌の治療に有効であることが示された。 The obtained results are shown in FIGS. 16 to 20. Four weeks after orthotopic transplantation, the SB225002-treated group had significantly lower tumor area, tumor volume, number of lymph node metastases, gastric weight, and lymph node metastasis weight and higher survival rates than controls. (FIGS. 16, 17, and 20). Histological analysis of gastric cancer tissue transplanted orthotopically 2 weeks after orthotopic transplantation showed that stromal formation was induced in the control group, but stromal induction was suppressed in the SB225002-administered group. And necrosis of the tumor was also observed (Figs. 18 and 19). From this result, it was shown that the functional inhibition of CXCR2 is effective for the treatment of scirrhous gastric cancer.

試験例１２：CXCR2をノックダウンした骨髄間質細胞の走化性に及ぼす影響（double chamber chemotaxis assay）
ピューロマイシン耐性遺伝子及びGFPを含むウイルスベクターに、CXCR2に対するsingle guide RNA(CXCR2 sgRNA)を組み込み、これをMSCに感染させた。感染開始から48時間後に、培地をピューロマイシン含有培地へ入れ替え、CXCR2欠損MSCの選択を行った。ピューロマイシン含有培地での培養を48時間行った後に、CXCR2がノックダウンしたMSCを回収した。得られたMSCにおいて、CXCR2がノックダウンしていることについては、RT-PCR及びウエスタンブロットによって確認した（図２０の左上図及び左下図）。また、CXCR2 sgRNAの代わりに、陰性コントロールsingle guide RNA（negative sgRNA）を導入したMSCについても作成した。 Test Example 12: Effect of CXCR2 on the chemotaxis of bone marrow stromal cells knocked down (double chamber chemotaxis assay)
A single guide RNA (CXCR2 sgRNA) for CXCR2 was incorporated into a viral vector containing a puromycin resistance gene and GFP, and this was infected with MSC. Forty-eight hours after the start of infection, the medium was replaced with a puromycin-containing medium, and CXCR2-deficient MSCs were selected. After culturing in puromycin-containing medium for 48 hours, MSC knocked down by CXCR2 was recovered. In the obtained MSC, knockdown of CXCR2 was confirmed by RT-PCR and Western blotting (upper left figure and lower left figure of FIG. 20). We also created an MSC into which a negative control single guide RNA (negative sgRNA) was introduced instead of CXCR2 sgRNA.

CXCR2がノックダウンしたMSCを用いて、double chamber chemotaxis assayを行った。本試験では、上部のチャンバーにCXCR2をノックダウンしたMSCを播種し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MLN、OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清を添加したこと以外は、前記試験例１と同様の方法で行った。比較のために、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清の代わりに培地（無血清DMEM）を使用して、同様に試験を行った。なお、コントロールとしては、negative sgRNAを導入したMSCを使用し、下部のチャンバーにスキルス性胃癌由来の癌細胞（OCUM-2MLN、OCUM-2MD3及びOCUM12）の培養上清又は培地（無血清DMEM）を使用して、同様に試験を行った。 A double chamber chemotaxis assay was performed using an MSC in which CXCR2 was knocked down. In this study, except that MSC knocked down CXCR2 was seeded in the upper chamber and culture supernatants of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MLN, OCUM-2MD3 and OCUM12) were added to the lower chamber. , The same method as in Test Example 1 was carried out. For comparison, the same test was performed using medium (serum-free DMEM) instead of the culture supernatant of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer. As a control, MSC into which negative sgRNA was introduced was used, and the culture supernatant or medium (serum-free DMEM) of scirrhous gastric cancer-derived cancer cells (OCUM-2MLN, OCUM-2MD3 and OCUM12) was placed in the lower chamber. It was used and tested in the same way.

得られた結果を図２１の右図に示す。図２１から明らかなように、CXCR2をノックダウンしたMSCでは、スキルス性胃癌由来の癌細胞の培養上清の存在下での走化性が抑制されていた。即ち、本試験結果からも、CXCR2の発現抑制又は機能阻害が、スキルス性胃癌によって誘発されるMSCの走化性を抑制できることが確認された。 The obtained results are shown in the right figure of FIG. As is clear from FIG. 21, in the MSC in which CXCR2 was knocked down, the chemotaxis of cancer cells derived from scirrhous gastric cancer was suppressed in the presence of the culture supernatant. That is, from the results of this study, it was confirmed that suppression of CXCR2 expression or function inhibition can suppress the chemotaxis of MSCs induced by scirrhous gastric cancer.

試験例１３：CD271による胃癌患者の予後の予測
外科的手術を受けた279名の胃癌患者（内、スキルス性胃癌患者は28名）において摘出された胃癌組織に対して、MSCのマーカーであるCD271の発現を測定し、癌間質細胞における陽性細胞の割合および染色強度を用いて染色スコアを0〜8で算出し4以上をCD271陽性、3以下をCD271陰性に分類した。なお、染色スコアは、陽性細胞の割合によるスコア（スコア0：0％、スコア1：<20％、スコア2：20〜49％、スコア3：50〜69％、スコア4：>69％）と染色強度によるスコア（スコア1：軽度、スコア2：中等度以上）の積によって算出した。また、CD271陽性とCD271陰性に分類した胃癌患者について、術後生存年数との関係を図２２に示す。この結果から、CD271陽性の胃癌患者では、CD271陰性の胃癌患者に比べて、術後の生存率が低く、予後が悪いことが明らかとなった。 Test Example 13: Prediction of prognosis of gastric cancer patients by CD271 CD271 which is a marker of MSC for gastric cancer tissue excised in 279 gastric cancer patients (including 28 patients with scirrhous gastric cancer) who underwent surgery. The staining score was calculated from 0 to 8 using the percentage of positive cells in cancer stromal cells and the staining intensity, and 4 or more were classified as CD271 positive, and 3 or less were classified as CD271 negative. The staining score is based on the percentage of positive cells (score 0: 0%, score 1: <20%, score 2: 20-49%, score 3: 50-69%, score 4:> 69%). It was calculated by the product of the scores based on the staining intensity (score 1: mild, score 2: moderate or higher). In addition, FIG. 22 shows the relationship between the postoperative survival years and the gastric cancer patients classified into CD271 positive and CD271 negative. From this result, it was clarified that patients with CD271 positive gastric cancer had a lower postoperative survival rate and a worse prognosis than patients with CD271 negative gastric cancer.

また、スキルス性胃癌患者の28名内、CD271陽性は26名、CD271陰性は2名であり（表１）、スキルス性胃癌患者はCD271陽性率が高いことも確認された。

Figure 0006932365
Of the 28 patients with scirrhous gastric cancer, 26 were CD271 positive and 2 were CD271 negative (Table 1), confirming that scirrhous gastric cancer patients had a high CD271 positive rate.
Figure 0006932365

試験例１４：CD271による胃癌患者の予後の予測
外科的手術を受けた300名の胃癌患者において摘出された胃癌組織に対して、抗CXCL1抗体、及び抗CXCR2抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。具体的には、Target Retrieval Solutionに浸したスライドグラスを105℃で10分間加熱し、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、それぞれの抗体を常温で1時間反応させた。次いで、癌細胞におけるCXCL1の発現、癌間質細胞におけるCXCR2の発現を染色比率・染色強度でスコア化し、CXCL1とCXCR2の発現について、陽性又は陰性に分類した。なお、染色スコアは0〜7で算出して、CXCL1については5以上を、CXCL1陽性、4以下をCXCL1陰性に分類し、またCXCR2に関しては、4以上をCXCR2陽性、3以下をCXCR2陰性に分類した。また、染色スコアは、陽性細胞の割合によるスコア（CXCL1：スコア0：0％、スコア1：<30％、スコア2：30〜69％、スコア3：70〜89％、スコア4：>89％、CXCR2：スコア0：0％、スコア1：<30％、スコア2：30〜49％、スコア3：50〜69％、スコア4：>69％）と染色強度によるスコア（スコア1：軽度、スコア2：中等度以上）の積によって算出した。そして、胃癌患者について、CXCL1陰性且つCXCR2陰性、CXCL1陰性且つCXCR2陽性、CXCL1陽性且つCXCR2陰性、及びCXCL1陽性且つCXCR2陽性の４つのグループに分類した。 Test Example 14: Prediction of prognosis of gastric cancer patients with CD271 Immunohistochemical staining of gastric cancer tissue resected in 300 gastric cancer patients who underwent surgery was performed using anti-CXCL1 antibody and anti-CXCR2 antibody. rice field. Specifically, slide glasses immersed in Target Retrieval Solution were heated at 105 ° C. for 10 minutes to block endogenous peroxidase, and then each antibody was reacted at room temperature for 1 hour. Next, the expression of CXCL1 in cancer cells and the expression of CXCR2 in cancer stromal cells were scored by staining ratio and staining intensity, and the expression of CXCL1 and CXCR2 was classified as positive or negative. The staining score is calculated from 0 to 7, and for CXCL1, 5 or more is classified as CXCL1 positive, 4 or less is classified as CXCL1 negative, and for CXCR2, 4 or more is classified as CXCR2 positive and 3 or less is classified as CXCR2 negative. bottom. The staining score is based on the percentage of positive cells (CXCL1: score 0: 0%, score 1: <30%, score 2: 30-69%, score 3: 70-89%, score 4:> 89%. , CXCR2: Score 0: 0%, Score 1: <30%, Score 2: 30-49%, Score 3: 50-69%, Score 4:> 69%) and score based on staining intensity (Score 1: Mild, Score 2: Calculated by the product of moderate or higher). Then, gastric cancer patients were classified into four groups: CXCL1 negative and CXCR2 negative, CXCL1 negative and CXCR2 positive, CXCL1 positive and CXCR2 negative, and CXCL1 positive and CXCR2 positive.

それぞれに分類した胃癌患者について、生存率との関係を図２３に示す。この結果から、CXCL1及びCXCR2の少なくとも一方が陽性の胃癌患者は、術後の生存率が低く、特にCXCL1及びCXCR2の双方が陽性の胃癌患者は、術後の生存率が格段に低くなっていることが明らかとなった。 The relationship between the survival rate and the gastric cancer patients classified into each is shown in FIG. From this result, the postoperative survival rate is low in gastric cancer patients who are positive for at least one of CXCL1 and CXCR2, and especially in the gastric cancer patients who are positive for both CXCL1 and CXCR2, the postoperative survival rate is significantly low. It became clear.

Claims (2)

CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種の標的分子に対する発現抑制及び／又は機能阻害が可能な物質を有効成分とするスキルス性胃癌の治療剤であり、
前記標的分子に対する発現抑制が可能な物質が、前記標的分子に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬であり、
前記標的分子に対する機能阻害が可能な物質が、SB225002、前記標的分子に対する抗体、及び前記標的分子を特異的に認識し結合するための相補性決定領域を有する抗体断片よりなる群から選択される少なくとも１種である、
スキルス性胃癌の治療剤。 A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer containing a substance capable of suppressing expression and / or function of at least one target molecule selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 as an active ingredient. ,
The substance capable of suppressing the expression of the target molecule is at least one nucleic acid drug selected from the group consisting of siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, and antisense nucleic acid for the target molecule.
A substance capable of inhibiting the function of the target molecule is selected from at least a group consisting of SB225002 , an antibody against the target molecule, and an antibody fragment having complementarity determining regions for specifically recognizing and binding to the target molecule. One kind,
A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer. CXCL1、CXCR2、CCL20、CCR6、及びLipocalin-2よりなる群から選択される少なくとも１種の標的分子に対する発現抑制及び／又は機能阻害が可能な物質を有効成分とする、スキルス性胃癌により誘発される骨髄間質細胞の走化性の抑制剤であり、
前記標的分子に対する発現抑制が可能な物質が、前記標的分子に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬であり、
前記標的分子に対する機能阻害が可能な物質が、SB225002、前記標的分子に対する抗体、及び前記標的分子を特異的に認識し結合するための相補性決定領域を有する抗体断片よりなる群から選択される少なくとも１種である、
前記抑制剤。
Induced by scirrhous gastric cancer containing a substance capable of suppressing expression and / or function of at least one target molecule selected from the group consisting of CXCL1, CXCR2, CCL20, CCR6, and Lipocalin-2 as an active ingredient. It is an inhibitor of chemotaxis of bone marrow stromal cells and
The substance capable of suppressing the expression of the target molecule is at least one nucleic acid drug selected from the group consisting of siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, and antisense nucleic acid for the target molecule.
A substance capable of inhibiting the function of the target molecule is selected from at least a group consisting of SB225002 , an antibody against the target molecule, and an antibody fragment having complementarity determining regions for specifically recognizing and binding to the target molecule. One kind,
The inhibitor.
JP2016098055A 2015-05-14 2016-05-16 A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and a method for predicting the prognosis of gastric cancer Active JP6932365B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021073627A JP7203447B2 (en) 2015-05-14 2021-04-23 Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and method for predicting prognosis of gastric cancer

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015099228 2015-05-14
JP2015099228 2015-05-14
JP2016097343 2016-05-13
JP2016097343 2016-05-13

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021073627A Division JP7203447B2 (en) 2015-05-14 2021-04-23 Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and method for predicting prognosis of gastric cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017206447A JP2017206447A (en) 2017-11-24
JP6932365B2 true JP6932365B2 (en) 2021-09-08

Family

ID=60416791

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016098055A Active JP6932365B2 (en) 2015-05-14 2016-05-16 A therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and a method for predicting the prognosis of gastric cancer
JP2021073627A Active JP7203447B2 (en) 2015-05-14 2021-04-23 Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and method for predicting prognosis of gastric cancer

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021073627A Active JP7203447B2 (en) 2015-05-14 2021-04-23 Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and method for predicting prognosis of gastric cancer

Country Status (1)

Country Link
JP (2) JP6932365B2 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023145844A1 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 株式会社カイオム・バイオサイエンス Anti-human cxcl1 antibody
CN114934116A (en) * 2022-01-28 2022-08-23 中国医学科学院北京协和医院 Early gastric cancer prognosis differential gene and recurrence prediction model

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1777523A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An in vitro method for the prognosis of progression of a cancer and of the outcome in a patient and means for performing said method
WO2009156994A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Ccl20-specific antibodies for cancer therapy
DK2585089T3 (en) * 2010-06-28 2016-12-12 Universitätsklinikum Freiburg CCL18 blockade of signaling through CCR6 as a therapeutic option in fibrotic diseases and cancer
US9939443B2 (en) * 2012-12-19 2018-04-10 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Compositions and methods for aptamer screening

Also Published As

Publication number Publication date
JP7203447B2 (en) 2023-01-13
JP2017206447A (en) 2017-11-24
JP2021113824A (en) 2021-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. TNF-α augments CXCL10/CXCR3 axis activity to induce Epithelial-Mesenchymal Transition in colon cancer cell
US20210139997A1 (en) Treatment of angiogenesis disorders
Li et al. PSCA promotes prostate cancer proliferation and cell‐cycle progression by up‐regulating c‐Myc
JP7203447B2 (en) Therapeutic agent for scirrhous gastric cancer and method for predicting prognosis of gastric cancer
Yang et al. FMNL1 down-regulation suppresses bone metastasis through reducing TGF-β1 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC)
Bhatia et al. Inhibition of EphB4–Ephrin-B2 signaling enhances response to Cetuximab–radiation therapy in head and neck cancers
JP2019502664A (en) Drugs for the treatment of diseases associated with unwanted cell proliferation
Sun et al. Upregulation of RICTOR gene transcription by the proinflammatory cytokines through NF-κB pathway contributes to the metastasis of renal cell carcinoma
WO2005084708A1 (en) Medicinal composition containing cxcr3 inhibitor
Sohn et al. Effect of CD133 overexpression on bone metastasis in prostate cancer cell line LNCaP
Zhang et al. Combined MEK inhibition and tumor-associated macrophages depletion suppresses tumor growth in a triple-negative breast cancer mouse model
Yoshimura et al. The chemokine monocyte chemoattractant protein-1/CCL2 is a promoter of breast cancer metastasis
JP2018158919A (en) Ckap4-molecular-targeted antitumor agent
CN110592222A (en) Application of TRIML1 as molecular marker of liver cancer
Xu et al. Oncostatin M/Oncostatin M Receptor Signal Induces Radiation-Induced Heart Fibrosis by Regulating SMAD4 in Fibroblast
WO2021075559A1 (en) Cell growth inhibitor or cell death inducer for cancer-associated fibroblasts
TWI730450B (en) Antibody, kit comprising the same, and uses thereof
JP6768979B2 (en) Suppression of cancer metastasis using HSP47 inhibitor
JP2021176852A (en) Biomarker composition for diagnosing radiation-resistant cancer or for predicting prognosis of radiation therapy containing pmvk as active ingredient
EP2831593B1 (en) S100a8/a9 as a diagnostic marker and a therapeutic target
JP7205864B2 (en) Therapeutic agents that control the tumor microenvironment
CN110777204B (en) Application of MAFG-AS1 knock-out reagent in preparation of medicines for treating bladder cancer
Kim et al. S6K1 deficiency in tumor stroma impairs lung metastasis of melanoma in mice
JP2021116243A (en) Agent for treating or preventing nash
JP2011093896A (en) Cancer therapeutic agent

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190515

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712

Effective date: 20190515

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20190515

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200623

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200821

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20210126

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210423

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20210423

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20210506

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20210511

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210803

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210811

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6932365

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150