JP6906005B2 - Methods for identifying bacteria or fungi, determining drug susceptibility tests, and testing equipment - Google Patents
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本発明は細菌または真菌の同定検査や薬剤感受性検査の判定を行う方法、および検査装置に関する。 The present invention is concerning a method for determining the identification of bacteria or fungi inspection and drug susceptibility testing, and the testing device.
近年、感染症患者に対する抗生物質の濫用により薬剤耐性菌の割合が増加し、それに伴い院内感染の発生件数も増加傾向にある。しかし、利益率の低下のため新規抗生物質の開発は減少傾向にあり、米FDAで認可された抗生物質の種類は年々減少している。そのため、感染症発生時にその起因菌の菌種同定検査及び薬剤感受性検査を実施し、抗生物質を適切に使用することによって、患者の早期回復、院内感染の拡大防止、さらに薬剤耐性菌の出現を抑制することは、極めて重要となっている。 In recent years, the proportion of drug-resistant bacteria has increased due to the abuse of antibiotics for infectious disease patients, and the number of nosocomial infections has been increasing accordingly. However, the development of new antibiotics is declining due to the decline in profitability, and the types of antibiotics approved by the US FDA are decreasing year by year. Therefore, when an infectious disease occurs, the bacterial species identification test and drug susceptibility test of the causative bacteria are carried out, and by using antibiotics appropriately, early recovery of patients, prevention of spread of nosocomial infections, and emergence of drug-resistant bacteria can be prevented. Suppression has become extremely important.
病院の細菌検査室で通常実施されている検査方法では、感染症起因菌を培養し、その増殖の有無から菌種の同定と薬剤感受性を判定する。まず、患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰などの検体を採取し、感染症起因菌を単独コロニーで得るための分離培養を１昼夜行う。単独コロニーから細菌懸濁液を調製し、同定培養や薬剤感受性検査のための培養を１昼夜行う。薬剤感受性検査の判定結果が得られ、適切な投薬が行われるには、患者からの検体採取後例えば３日目以降となる。増殖速度が遅く、長時間の培養が必要な感染症起因菌においては、さらに日数を要する。 In the test method usually performed in the bacterial laboratory of a hospital, the infectious disease-causing bacteria are cultivated, and the bacterial species are identified and the drug susceptibility is determined based on the presence or absence of their growth. First, samples such as blood, pharyngeal swab, and sputum are collected from the patient, and isolated culture is performed for one day and night to obtain the infectious disease-causing bacteria as a single colony. Bacterial suspensions are prepared from single colonies and cultured for identification culture and drug susceptibility testing day and night. In order to obtain the judgment result of the drug susceptibility test and to administer appropriate medication, for example, after the third day after collecting the sample from the patient. Infectious disease-causing bacteria, which have a slow growth rate and require long-term culture, require more days.
分離培養の自動化・省力化を図るための検査装置として、培養シャーレ中の細菌コロニーの画像を取得して微生物や細胞を計測する検査装置などが開発されている（特許文献１）。また、薬剤感受性検査の簡易化を目的とした装置も発売されている（非特許文献１）。これらの装置では培養によって細菌が増殖し、培養液の濁度が増加することで判定を行う。 As an inspection device for automating and labor-saving separation culture, an inspection device for acquiring images of bacterial colonies in a culture dish and measuring microorganisms and cells has been developed (Patent Document 1). In addition, an apparatus for simplifying drug susceptibility testing has also been put on the market (Non-Patent Document 1). In these devices, bacteria grow by culturing and the turbidity of the culture solution increases to make a judgment.
このような装置を用いない方法として、微量液体希釈法やKirby-Bauer法に基づくディスク法が挙げられる(非特許文献２)。 Examples of methods that do not use such an apparatus include a trace liquid dilution method and a disk method based on the Kirby-Bauer method (Non-Patent Document 2).
しかしながら、特許文献１や非特許文献１による装置では、判定可能な濁度になるまで細菌が増殖する必要があるため、例えば緑膿菌のような増殖の遅い菌の場合、単独コロニーが得られてから最短でも８時間以上の培養が必要となる。
However, in the apparatus according to
また、非特許文献２による方法でも単独コロニーが得られてから判定結果が出るまでに１８時間程度を要する。このため、判定結果取得の迅速化が求められている。 Further, even with the method according to Non-Patent Document 2, it takes about 18 hours from the time when a single colony is obtained until the judgment result is obtained. Therefore, there is a demand for speedy acquisition of determination results.
以上のように、従来の方法によると、細菌同定検査や薬剤感受性検査を行うには、分離培養後に得られる単独コロニーから細菌懸濁液を調製し、同定培養や薬剤感受性検査のための培養を１昼夜行う必要がある。培養を行った結果、細菌が増殖する条件では細菌が分裂し、培養液の濁度が増加する。このように従来法では、濁度が増加したかどうかで細菌の増殖を判定するため、判定に時間がかかりすぎるという課題がある。また、従来方法においては、細菌一つ一つの形状を判定に利用することはできない。 As described above, according to the conventional method, in order to perform a bacterial identification test or a drug susceptibility test, a bacterial suspension is prepared from a single colony obtained after isolation culture, and a culture for identification culture or drug susceptibility test is performed. It is necessary to do it one day and night. As a result of culturing, the bacterium divides under the condition that the bacterium grows, and the turbidity of the culture solution increases. As described above, in the conventional method, since the growth of bacteria is determined based on whether or not the turbidity has increased, there is a problem that the determination takes too much time. Further, in the conventional method, the shape of each bacterium cannot be used for determination.
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、細菌同定や薬剤感受性の判定を迅速化することを可能とする技術を提供するものである。 The present invention has been made in view of such a situation, and provides a technique capable of accelerating bacterial identification and determination of drug susceptibility.
上記課題を解決するために、本発明による検査装置は、細菌または真菌の同定検査や薬剤感受性検査を行う検査装置であって、複数のウェルを有し、各ウェルに抗菌剤と前記細菌または真菌とを含む培養液中の菌を予め設定した複数の時点において顕微鏡観察を行う顕微鏡観察光学系と、顕微鏡観察で得られる画像を表示画面上に表示するプロセッサと、を有している。そして、当該プロセッサは、画像に基づいて、細菌または真菌に対して抗菌剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の抗菌剤及び複数の種類の濃度について生成し、当該影響判定情報を時系列で表示するようにしている。 In order to solve the above-mentioned problems, the inspection apparatus according to the present invention is an inspection apparatus for performing a bacterial or fungal identification test or a drug susceptibility test, and has a plurality of wells, and each well has an antibacterial agent and the bacterial or fungal agent. It has a microscope observation optical system for observing bacteria in a culture solution containing and at a plurality of time points set in advance, and a processor for displaying an image obtained by the microscope observation on a display screen. Then, based on the image, the processor generates effect determination information indicating the effect of the antibacterial agent on bacteria or fungi for a plurality of types of antibacterial agents and a plurality of types of concentrations, and the effect determination information. Is displayed in chronological order.
本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本発明の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。 Further features relating to the present invention will become apparent from the description herein and the accompanying drawings. Moreover, the aspect of the present invention is achieved and realized by the combination of elements and various elements and the following detailed description and the aspect of the appended claims.
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本発明の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。 It should be understood that the description herein is merely a typical example and does not limit the scope of claims or application of the present invention in any way.
本発明によれば、細菌同定や薬剤感受性の判定を迅速化することができるようになる。 According to the present invention, bacterial identification and determination of drug susceptibility can be expedited.
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施形態と実装例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. In the attached drawings, functionally the same elements may be displayed with the same number. The accompanying drawings show specific embodiments and implementation examples based on the principles of the present invention, but these are for the purpose of understanding the present invention, and in order to interpret the present invention in a limited manner. Not used.
本実施形態では、当業者が本発明を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本発明の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。 In the present embodiment, the description is given in sufficient detail for those skilled in the art to carry out the present invention, but other implementations and embodiments are also possible, without departing from the scope and spirit of the technical idea of the present invention. It is necessary to understand that it is possible to change the structure and structure and replace various elements. Therefore, the following description should not be construed as limited to this.
（１）実施形態
＜細菌検査装置の構成＞
図１は、本発明の実施形態による細菌検査装置の概略構成を示す図である。細菌検査装置１は、カバー１１と、載置台１２と、顕微鏡観察光学系及び濁度測定光学系１３と、温調１６と、培養プレート１８を搬送するためのグリッパ１７と、グリッパ１７の移動及び位置決めを制御する駆動制御装置１９と、を有している。また、細菌検査装置１は、処理条件や生物学的試料に関する情報、抗菌剤の種類や濃度に関する情報、患者検体に関する情報、その他の各種情報を入力するためのコンピュータ２０を含む。なお、コンピュータ２０の構成については図示しないが、通常のコンピュータと同様、プロセッサ、メモリ、記憶装置、入力デバイス（キーボード、マウス、タッチパネル、マイク等）、出力デバイス（ディスプレイ、プリンタ、スピーカ等）、記憶装置、通信デバイス等により構成される。
(1) Embodiment <Structure of bacterial test apparatus>
FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a bacterial test apparatus according to an embodiment of the present invention. The
細菌検査装置１を用いて行う検査は、例えば、細菌または真菌の薬剤感受性検査である。ここで薬剤感受性検査とは、様々な抗菌薬を所定の濃度で含む培養液で培養し、どの条件で増殖したかによって細菌または真菌が薬剤耐性を持つかを検査すること、あるいは、細菌や真菌の最小発育阻止濃度ＭＩＣ（Minimum Inhibitory Concentration）を判定する検査を意味する。細菌検査装置１を用いて検査を行う細菌の対象は、特に制限されない。例えば、黄色ブドウ球菌、腸球菌、肺炎球菌、大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌などが挙げられる。
The test performed using the
また、細菌検査装置１を用いて検査を行う際には、臨床検体から分離培養によって得られた単独コロニーを用いて細菌懸濁液を調製することが多い。ただし、臨床検体にコンタミネーションの可能性が低く単独の細菌を含む場合には細菌懸濁液を調整せず、検体をそのままあるいは適宜希釈して使用しても良い。
In addition, when conducting a test using the
さらに、細菌検査装置１を用いて検査を行う際には、ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, P.A）で推奨されている方法に従って検体を採取、運搬し、分離培養を行うことが望ましい。抗菌薬の調製や培地の調製も同様であるが、これに限るものではない。また、培養温度や使用する培養液についても同様にＣＬＳＩで推奨されている方法に基づくことが望ましいが、これに限るものではない。
Further, when conducting a test using the
また、細菌検査装置１を用いて検査を行う際には、培養プレート（例えば、計９６個のウェルを有する培養プレートを用いる）１８に検体から調製した細菌懸濁液と培養液を混ぜ合わせて培養を行う。薬剤感受性検査を行うために各々のウェルの培養液にはそれぞれ異なる抗菌剤が特定の濃度で含まれるように設定されている。培養の手順は、次のようにする。まず培養プレート１８に細菌懸濁液を導入する。そして、各々のウェルに含まれる培養液と混ぜ合わせた状態で温調１６を３５℃程度に設定する。さらに、培養プレート１８の各々のウェルが設定した温度になるようにインキュベーションして培養を行う。また、細菌検査装置１では、インキュベーションしながら各々のウェルに含まれる細菌を顕微鏡観察光学系によりモニタすることができるようになっている。顕微鏡観察はインキュベーション開始から終了までの間、予め設定した時間で行い、細菌増殖の様子を連続的にモニタしても良い。また、適切な時間を設定してその設定時間にモニタを行い、インキュベーション開始時のモニタ結果と比較できるようにしても良い。なお、従来の細菌検査装置と同様に培養プレート１８をインキュベーションしながら各々のウェルの濁度を濁度測定光学系により計測して、顕微鏡観察光学系のモニタ結果と比較しても良い。
Further, when performing the test using the
＜光学系の構成＞
図２は、本発明の実施形態による細菌検査装置１で用いられる顕微鏡観察光学系及び濁度測定光学系の構成例を示す図である。図２において、培養プレート２１（培養プレート１８と同一物）は、光源２２からの光によって照射される。光源は白色光源でも、ある波長領域にスペクトルをもつＬＥＤなどの光源でも良く、フィルタ２３によって適切な波長領域に調節される。顕微鏡観察を行う際には波長は特に限定する必要はないが、濁度測定を行う際には波長は６００ｎｍ近傍の波長で培養プレート２１を照射するように不要な波長領域はフィルタ２３でカットされる。
<Composition of optical system>
FIG. 2 is a diagram showing a configuration example of a microscope observation optical system and a turbidity measurement optical system used in the
顕微鏡観察の場合、光源２２からの光は、ダイクロイックミラー２４と対物レンズ２５を経て培養プレート２１に照射される。培養プレート２１からの散乱光は、対物レンズ２５を通してＣＣＤ素子２７で測定され、顕微鏡観察画像が取得される。
In the case of microscopic observation, the light from the
濁度測定の場合、光源２２からの光は、ダイクロイックミラー２４によって濁度測定用の光は対物レンズ２５を通り培養プレート２１に照射される。照射された光は、培養プレート２１の上方に設置されたホトダイオード２６によって測定される。一方、ダイクロイックミラー２４を通過した光は、光源２２と反対側に設置されたホトダイオード２６によって測定される。定法に従い、２つのホトダイオード２６で測定された光量から濁度を算出することができる。
In the case of turbidity measurement, the light from the
＜ＭＩＣ判定処理の内容＞
図３は、本発明の実施形態による細菌検査装置１によって実行されるＭＩＣ判定処理を説明するためのフローチャートである。図３Ａは細菌検査装置１における処理概要を示し、図３Ｂはステップ１０７の詳細を説明するためのフローチャートである。なお、ステップ１０１〜ステップ１０４までの処理は「人」が行う。従って、実際に自動化された処理（コンピュータ（プロセッサ）による処理）はステップ１０５〜ステップ１１３である。
<Details of MIC judgment processing>
FIG. 3 is a flowchart for explaining the MIC determination process executed by the
（図３Ａ：処理概要）
（i）ステップ１０１〜ステップ１０４
利用者は、装置に導入する検体となる細菌懸濁液を調製し（ステップ１０１）、当該細菌懸濁液を培養プレートに導入（ステップ１０２）してから培養プレートを細菌検査装置に導入する（ステップ１０３）。そして、利用者は、細菌検査装置１のコンピュータ２０を用いて、検体情報や抗菌剤の情報等必要な情報を入力し、開始ボタン等を押下する等して検査開始を指示する（ステップ１０４）。検査開始の指示を受けると、細菌検査装置１は、装置内に導入した培養プレートを３５℃程度にインキュベートして培養を行う。
(Fig. 3A: Outline of processing)
(I) Steps 101-104
The user prepares a bacterial suspension as a sample to be introduced into the apparatus (step 101), introduces the bacterial suspension into the culture plate (step 102), and then introduces the culture plate into the culture test apparatus (step 101). Step 103). Then, the user inputs necessary information such as sample information and antibacterial agent information using the
（ii）ステップ１０５
コンピュータ２０のプロセッサは、顕微鏡光学系を駆動し、予め設定した時間に培養プレートのウェルを顕微鏡観察して画像を取得する。なお、画像取得は、予め決められた時間を離散的に行っても良いし、或いは連続的に観察して予め決められた時間における画像を処理用の画像として取得しても良い。
(Ii) Step 105
The processor of the
（iii）ステップ１０６
上記プロセッサは、取得した画像は必要な処理を実施する。例えば、当該画像処理としては、図８〜１１で示される生の画像データを、図４〜６で示されるように２値化処理したり、グレースケール画像データにする処理をしたりする。また、他の画像処理として、図４〜６の画像データを基に細菌の面積、細菌数、細菌の円形度、細菌のアスペクト比、細菌の周囲長等を算出する処理等が含まれる。
(Iii) Step 106
The processor performs necessary processing on the acquired image. For example, as the image processing, the raw image data shown in FIGS. 8 to 11 is binarized as shown in FIGS. 4 to 6 or is converted into grayscale image data. In addition, other image processing includes processing for calculating the area of bacteria, the number of bacteria, the circularity of bacteria, the aspect ratio of bacteria, the peripheral length of bacteria, and the like based on the image data of FIGS. 4 to 6.
（iv）ステップ１０７
上記プロセッサは、ステップ１０６で得られた画像データを用いてＭＩＣ判定を試みる。当該処理の詳細は図３Ｂで示される通りであり、後述する。
(Iv) Step 107
The processor attempts a MIC determination using the image data obtained in step 106. The details of the process are as shown in FIG. 3B, which will be described later.
（v）ステップ１０８〜ステップ１０９
上記プロセッサは、培養プレートの各ウェルの濁度測定を行い、濁度データからＭＩＣの判定を試みる。通常、濁度判定を行うには培養開始から１８時間以上の時間経過を必要とするため、３０分や１時間程度の経過時には濁度判定をすることはできない。従って、この程度の時間経過ではＭＩＣ判定不可である。
(V) Step 108 to Step 109
The processor measures the turbidity of each well of the culture plate and attempts to determine the MIC from the turbidity data. Normally, it takes 18 hours or more from the start of culturing to determine the turbidity, so that the turbidity cannot be determined after about 30 minutes or 1 hour. Therefore, the MIC cannot be determined after the passage of time of this degree.
（vi）ステップ１１０
上記プロセッサは、さらにデータベース中の画像情報や濁度（数値）の情報と、上記ステップで得られた画像情報や濁度の情報とを比較してＭＩＣの判定を試みる（図７参照）。
(Vi) Step 110
The processor further compares the image information and turbidity (numerical value) information in the database with the image information and turbidity information obtained in the above step to try to determine the MIC (see FIG. 7).
（vii）ステップ１１１
上記プロセッサは、この時点でのＭＩＣ等の判定結果を表示する。具体的には、ステップ１０７で得られた判定結果（Ｓ／Ｉ／Ｒ判定、ＭＩＣ判定、時系列グラフ、及び顕微鏡画像等）を表示する。
(Vii) Step 111
The processor displays the determination result of the MIC or the like at this time. Specifically, the determination result (S / I / R determination, MIC determination, time series graph, microscope image, etc.) obtained in step 107 is displayed.
（viii）ステップ１１２
上記プロセッサは、ＭＩＣの判定が最終的に確定できるまで細菌の増殖が進んでいるか（インキュベーションを継続するか）を判定する。細菌の増殖が進んでいないと判定された場合（ステップ１１２でＹｅｓの場合）は、上記プロセッサは、インキュベーションを継続し、画像取得からの工程を繰り返し行う。
(Viii) Step 112
The processor determines whether bacterial growth is progressing (continuation of incubation) until the MIC determination is finally finalized. If it is determined that the bacterial growth has not progressed (Yes in step 112), the processor continues the incubation and repeats the steps from image acquisition.
細菌の増殖が進んでいると判定された場合（ステップ１１２でＮｏの場合）、処理はステップ１１３に移行する。つまり、培養プレートに含まれる抗菌剤について、ＭＩＣが判定される、もしくはＭＩＣが判定可能な抗菌剤についての処理が完了し、残りの抗菌剤については判定が困難であると判断された場合には、処理はステップ１１３に移行する。 If it is determined that the bacteria are growing (No in step 112), the process proceeds to step 113. That is, when the MIC is determined for the antibacterial agent contained in the culture plate, or the treatment for the antibacterial agent for which the MIC can be determined is completed, and it is determined that the remaining antibacterial agents are difficult to determine. , The process proceeds to step 113.
（ix）ステップ１１３
上記プロセッサは、画像から判定したＭＩＣと、濁度から判定したＭＩＣと、データベースとの比較から判定したＭＩＣを考慮して最終的なＭＩＣを決定し、検査を完了させる。この工程は培養プレートごとに設定された条件に基づいて自動的に実行される。なお、細菌検査装置１には複数の培養プレートが同時に設置できるが、培養プレートごとに条件を変更してもよいし、同じ条件で実施してもよい。
(Ix) Step 113
The processor determines the final MIC in consideration of the MIC determined from the image, the MIC determined from the turbidity, and the MIC determined from the comparison with the database, and completes the inspection. This step is automatically performed based on the conditions set for each culture plate. Although a plurality of culture plates can be installed in the
（図３Ｂ：ステップ１０７の詳細）
（i）ステップ１０７１
上記プロセッサは、上述の必要な処理が施された顕微鏡画像から、該当する培養条件において細菌が増殖しているか、増殖が阻害されているかを判定する。増殖しているかどうかの判定は、同一容器の異なる時間の画像から得た情報と比較して行なわれる。より具体的には、図４〜６に示される処理後の画像から、例えば細菌の面積を算出し、図１２のようなグラフを作成して増殖か否かの判定を行なう。
(Fig. 3B: Details of step 107)
(I)
The processor determines from the microscopic images subjected to the above-mentioned necessary treatment whether the bacteria are growing or the growth is inhibited under the corresponding culture conditions. Determining whether or not it is proliferating is made by comparing it with information obtained from images of the same container at different times. More specifically, for example, the area of bacteria is calculated from the processed images shown in FIGS. 4 to 6, and a graph as shown in FIG. 12 is created to determine whether or not the bacteria have grown.
（ii）ステップ１０７２
上記プロセッサは、ある抗菌剤濃度の組合せでの培養条件で増殖しているかどうかの情報を組合せて、増殖阻害となる最小の抗菌剤濃度（ＭＩＣ、最小発育阻止濃度）を判定する。ここでは、培養プレート２１に設けられた全てのウェルについてＭＩＣ判定が行われる。例えば、培養プレート２１には９６個のウェルがあり、ウェルには濃度（例えば、0μg/mL, 0.5μg/mL, 1μg/mL, 2.0μg/mL, 4.0μg/mL, 8.0μg/mL, 16.0μg/mL, ・・・・・）が異なる各種抗菌剤が入っている。このため、増殖阻害となる抗菌剤の最小濃度（ＭＩＣ）が分かるようになっている。
(Ii) Step 1072
The processor combines information on whether or not the cells are growing under culture conditions with a certain combination of antibacterial agent concentrations to determine the minimum antibacterial agent concentration (MIC, minimum inhibitory concentration) that inhibits growth. Here, the MIC determination is performed for all the wells provided on the
（iii）ステップ１０７３
上記プロセッサは、さらに、参照データとして格納しているブレイクポイント（ＣＬＳＩ、米国臨床検査標準協会のブレイクポイントや、日本化学療法学会のブレイクポイント、ＥＵＣＡＳＴのブレイクポイントなど）と比較して、検査対象の細菌が該当する抗菌剤に対して感受性（Ｓ: sensitive）か、耐性（Ｒ: resistant）か、中間（Ｉ: intermediate）を判定する。例えば、ブレイクポイントが８（8μg/mLで菌が死滅する）であった場合、ＭＩＣ判定が１６（16μg/mLで菌が死滅）であったとしても臨床的には１６μｇ／ｍＬ投与することはなく、この場合菌耐性（Ｒ）と判定されることとなる。
(Iii) Step 1073
The above processor is further compared with the breakpoints stored as reference data (CLSI, the breakpoints of the American Clinical and Laboratory Standards Institute, the breakpoints of the Japan Society of Chemotherapy, the breakpoints of EUCAST, etc.). It is determined whether the bacterium is sensitive (S: sensitive), resistant (R: resistant), or intermediate (I: intermediate) to the corresponding antibacterial agent. For example, if the breakpoint is 8 (8 μg / mL kills the bacteria), clinically 16 μg / mL can be administered even if the MIC judgment is 16 (16 μg / mL kills the bacteria). In this case, it will be determined to be bacterial resistance (R).
＜顕微鏡観察画像の例＞
図４乃至６は、顕微鏡で取得した画像（生の画像）に対して所定の処理（例えば、２値化処理）を実行して得られた画像の例を示す図である。
<Example of microscopic observation image>
4 to 6 are diagrams showing an example of an image obtained by performing a predetermined process (for example, binarization process) on an image (raw image) acquired by a microscope.
顕微鏡観察し、生画像データに対して所定の処理を実行した結果、図４乃至６に示すような画像が得られたとする。得られたデータは、コンピュータ（制御用ＰＣ）２０に格納、及び保存され、細菌同定やＭＩＣの判定に利用される。ここで、図４は、例えば、アンピシリンを含まないミューラーヒントン培地での大腸菌（ＡＴＣＣ番号２５９２２）を培養した様子を顕微鏡観察して得られた画像を２値化して表示したものである。培養開始から（ａ）０分、（ｂ）１８０分の様子がそれぞれ示されている。同様に、図５は２μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む培養液中で大腸菌（ＡＴＣＣ番号２５９２２）を培養した様子を、図６は１６μｇ／ｍＬを含む培養液中で大腸菌（ＡＴＣＣ番号２５９２２）を培養した様子を、それぞれ顕微鏡観察し、所定処理（２値化処理）して得られた画像を示している。図４乃至６において黒い対象物が大腸菌を示している。 As a result of observing with a microscope and performing a predetermined process on the raw image data, it is assumed that an image as shown in FIGS. 4 to 6 is obtained. The obtained data is stored and stored in a computer (control PC) 20 and used for bacterial identification and MIC determination. Here, FIG. 4 shows, for example, a binarized image obtained by observing a state of culturing Escherichia coli (ATCC No. 25922) in a Mueller-Hinton medium containing no ampicillin under a microscope. The states of (a) 0 minutes and (b) 180 minutes from the start of culturing are shown, respectively. Similarly, FIG. 5 shows Escherichia coli (ATCC No. 25922) cultured in a culture medium containing 2 μg / mL ampicillin, and FIG. 6 shows Escherichia coli (ATCC No. 25922) cultured in a culture medium containing 16 μg / mL. The state is observed with a microscope, and an image obtained by a predetermined process (binarization process) is shown. In FIGS. 4 to 6, black objects indicate Escherichia coli.
例えば、図５（ｂ）では、アンピシリンを２μｇ／ｍＬを含む培養液中での大腸菌（ＡＴＣＣ番号２５９２２）がβラクタム系抗菌剤の作用により伸張化している様子が確認できる。 For example, in FIG. 5 (b), it can be confirmed that Escherichia coli (ATCC No. 25922) in a culture medium containing 2 μg / mL of ampicillin is elongated by the action of a β-lactam antibacterial agent.
＜データベースの画像との比較＞
図７は、取得した画像（例えば、図４乃至６の画像）とデータベースに蓄積されている画像とを比較する処理の概要を示す図である。薬剤感受性検査では、検査対象の細菌に対して、抗菌剤の種類と濃度を変更した条件で培養を行い、細菌が増殖可能かどうかを検査してＭＩＣを決定する。ここでは、データベースは、細菌の種類ごとに、特定の抗菌剤の種類と濃度で培養した場合の細菌の画像を格納している。細菌の種類が同じであっても株が違うと薬剤に対する感受性が異なるため、抗菌剤の種類と濃度の条件でデータベースに格納されている複数の画像から、取得した検査対象の画像と類似している画像と比較を行いＭＩＣの決定を行うことが可能となる。また、ある抗菌剤についても様々な濃度について、データベースの画像と検査対象の画像とで比較を行うため正確なＭＩＣの決定ができる。例えば、図５（ｂ）に示すように、細菌が伸張化している状態であれば抗菌剤の効果が現れているが細菌を死滅させるには至っていないということが判明するため、ＭＩＣはこの濃度よりも高くなることがわかる。
<Comparison with images in the database>
FIG. 7 is a diagram showing an outline of a process of comparing the acquired image (for example, the image of FIGS. 4 to 6) with the image stored in the database. In the drug susceptibility test, the bacteria to be tested are cultured under conditions in which the type and concentration of the antibacterial agent are changed, and whether or not the bacteria can grow is examined to determine the MIC. Here, the database stores images of bacteria when cultured at a specific type and concentration of antibacterial agent for each type of bacteria. Even if the type of bacteria is the same, different strains have different sensitivities to the drug, so it is similar to the image to be tested obtained from multiple images stored in the database under the conditions of the type and concentration of the antibacterial agent. It is possible to determine the MIC by comparing with the existing image. Further, for a certain antibacterial agent, an accurate MIC can be determined because the image of the database and the image to be inspected are compared for various concentrations. For example, as shown in FIG. 5 (b), when the bacteria are in a stretched state, the effect of the antibacterial agent appears, but it is found that the bacteria have not been killed. Therefore, the MIC has this concentration. It turns out that it will be higher than.
また、画像同士を比較するのではなく、画像中に存在する細菌数、画像中に存在する細菌の面積、細菌の円形度、アスペクト比、周囲長など画像から抽出した特徴量を比較して細菌の同定や薬剤感受性を判定してもよい。この場合、データベースに格納している画像から、細菌の平均面積や円形度、アスペクト比、周囲長などの特徴量を抽出しておき、検査で取得した画像からこれらの特徴量を抽出して、特徴量同士を比較することでＭＩＣ判定を行う。コンピュータ（制御用ＰＣ）２０が格納するデータ量が膨大な場合には、画像データベースや様々な細菌の特徴量のデータをサーバに格納して、ＭＩＣ判定の際にアクセスして比較を行う形態であっても良い。これら顕微鏡観察によって得られた情報を利用してＭＩＣを決定できる。このため、濁度測定の結果からだけでなく、画像からもＭＩＣを決定でき、より正確な決定が可能となる。 Also, instead of comparing the images, the number of bacteria present in the image, the area of the bacteria present in the image, the circularity of the bacteria, the aspect ratio, the peripheral length, and other features extracted from the image are compared to compare the bacteria. Identification and drug susceptibility may be determined. In this case, the features such as the average area, circularity, aspect ratio, and peripheral length of the bacteria are extracted from the images stored in the database, and these features are extracted from the images obtained by the inspection. The MIC is determined by comparing the feature quantities. When the amount of data stored in the computer (control PC) 20 is enormous, the image database and the data of the feature amounts of various bacteria are stored in the server and accessed at the time of MIC judgment for comparison. There may be. The MIC can be determined by using the information obtained by these microscopic observations. Therefore, the MIC can be determined not only from the result of the turbidity measurement but also from the image, and a more accurate determination becomes possible.
（２）実施例
＜実施例１＞
図８乃至１１は、腸球菌（Enteroccoas faecalis, ATCC29212）の顕微鏡観察画像（上記画像処理前の生画像データ）を示す図である。得られた画像データは制御用PCに格納、保存され、細菌同定やＭＩＣの判定に利用する。例えば図８はレボフロキサシンを含まないミューラーヒントン培地での腸球菌の様子を培養開始から（ａ）０分、（ｂ）９０分、（ｃ）１５０分、（ｄ）２１０分に撮影した画像である。同様に図９は０．５μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養液中、図１０は１．０μｇ／ｍＬを含む培養液中、図１１は２．０μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養液中での腸球菌の画像であり、図８〜図１１において白っぽく見える対象物が腸球菌である。
(2) Example <Example 1>
8 to 11 are diagrams showing microscopic observation images (raw image data before the above image processing) of Enteroccoas faecalis (ATCC29212). The obtained image data is stored and stored in a control PC, and is used for bacterial identification and MIC determination. For example, FIG. 8 is an image of enterococci in a Mueller-Hinton medium containing no levofloxacin, taken at (a) 0 minutes, (b) 90 minutes, (c) 150 minutes, and (d) 210 minutes from the start of culture. .. Similarly, FIG. 9 shows the intestine in a culture medium containing 0.5 μg / mL levofloxacin, FIG. 10 shows the intestine in a culture medium containing 1.0 μg / mL, and FIG. 11 shows the intestine in a culture medium containing 2.0 μg / mL levofloxacin. It is an image of a bacterium, and the object that looks whitish in FIGS. 8 to 11 is an enterococcus.
図８及び９では、培養開始から時間が経過するにつれて腸球菌が増殖して連鎖状に分裂していく様子が観察できる。また、図１０及び１１では、各々（ｃ）１５０分後まではある程度腸球菌は分裂しているが、それ以降はほとんど分裂していない様子が観察できる。図１２は、画像中に観察された細菌の面積の経時変化を表すグラフを示している。図１２のグラフ中「菱形（ダイヤモンド形）」でプロットする抗菌剤なしと、「四角形」でプロットするレボフロキサシン濃度０．５μｇ／ｍＬの条件での腸球菌は、時間経過に従って、細菌面積が増加している。一方、図１２のグラフ中「丸形」でプロットするレボフロキサシン濃度１．０μｇ／ｍＬの条件と、「三角形」でプロットするレボフロキサシン濃度２．０μｇ／ｍＬの条件での腸球菌は、１５０分後まではある程度細菌面積の増加が見られたが、それ以降では細菌の面積はほぼ一定となっている。このように、図１２のグラフから、それぞれの培養条件で腸球菌が増殖するかどうかを判定することができる。 In FIGS. 8 and 9, it can be observed that enterococci proliferate and divide in a chain as time passes from the start of culture. Further, in FIGS. 10 and 11, it can be observed that the enterococci are divided to some extent until (c) 150 minutes later, but are hardly divided after that. FIG. 12 shows a graph showing the time course of the area of bacteria observed in the image. In the graph of FIG. 12, the bacterial area of enterococci increased with the passage of time under the conditions of no antibacterial agent plotted in the “diamond shape” and the levofloxacin concentration of 0.5 μg / mL plotted in the “square”. ing. On the other hand, in the graph of FIG. 12, enterococci under the condition of levofloxacin concentration of 1.0 μg / mL plotted in “round shape” and the condition of levofloxacin concentration of 2.0 μg / mL plotted in “triangle” are up to 150 minutes later. Although the bacterial area increased to some extent, the bacterial area has been almost constant since then. In this way, from the graph of FIG. 12, it can be determined whether or not enterococci grow under each culture condition.
図１３は、図１２のグラフからの判定結果を纏めた表を示している。抗菌剤を含まない条件では、培養開始から１２０分後までは増殖するかどうかは判定が難しく、Ｗａｉｔｉｎｇと判定され、「Ｗ」と表示されている。その後、１５０分後からは細菌面積が増加しているため、Ｇｒｏｗｔｈと判定されて「Ｇ」と表示されている。０．５μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養条件では、培養開始から９０分後までは増殖するかどうかは判定が難しく、Ｗａｉｔｉｎｇと判定され「Ｗ」と表示されている。その後、１２０分後からは細菌面積が増加しているため、Ｇｒｏｗｔｈと判定されて「Ｇ」と表示されている。１．０μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養条件及び２．０μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養条件では、培養開始から１２０分後までは増殖するかどうかは判定が難しく、Ｗａｉｔｉｎｇと判定され、「Ｗ」と表示されている。その後、１５０分後からも細菌面積は増加していないが、比較対象である抗菌剤を含まない条件では細菌面積が増加しているため、Ｉｎｈｉｂｉｔと判定されて「Ｉ」と表示されている。図１３に示すような増殖判定結果は測定ごとに更新され、徐々に情報が増えるように表示することが出来る。例えば、９０分後には、６０分と９０分の測定結果からの判定結果を表示するだけであるが、１２０分経過後には、情報が追加されて０．５μｇ／ｍＬのレボフロキサシンを含む培養条件でＧ判定であることを表示する。さらに時間が経過して測定回数が増えるごとに表示される情報が追加されることになる。 FIG. 13 shows a table summarizing the determination results from the graph of FIG. Under the condition that the antibacterial agent is not contained, it is difficult to determine whether or not the cells grow until 120 minutes after the start of culturing, and it is determined to be Waiting and is displayed as "W". After that, since the bacterial area increased after 150 minutes, it was determined to be Growth and displayed as "G". Under the culture conditions containing 0.5 μg / mL levofloxacin, it is difficult to determine whether or not the cells grow until 90 minutes after the start of the culture, and it is determined to be Waiting and displayed as “W”. After that, since the bacterial area increased after 120 minutes, it was determined to be Growth and displayed as "G". Under the culture conditions containing 1.0 μg / mL levofloxacin and the culture conditions containing 2.0 μg / mL levofloxacin, it is difficult to determine whether or not the cells grow until 120 minutes after the start of the culture, and it is determined to be Waiting. Is displayed. After that, the bacterial area did not increase even after 150 minutes, but the bacterial area increased under the condition that the comparison target did not contain the antibacterial agent, so that it was determined to be Inhibit and displayed as "I". The growth determination result as shown in FIG. 13 is updated for each measurement, and can be displayed so that the information gradually increases. For example, after 90 minutes, only the judgment results from the measurement results of 60 minutes and 90 minutes are displayed, but after 120 minutes, information is added and under culture conditions containing 0.5 μg / mL levofloxacin. Display that it is a G judgment. Further, the information to be displayed will be added as the number of measurements increases with the passage of time.
各抗菌剤には、細菌の種類について、ＭＩＣによってＲ（Resistant）、Ｉ（Intermediate）、Ｓ（Sensitive）と判定するかどうかのブレイクポイントが定められている。図１４は、図１３に示す判定を、測定時間ごとに、また抗菌剤ごとに行い、ブレイクポイントと比較して各抗菌剤に対するＲ、Ｉ、Ｓを判定した結果を示している。図１４は、ある細菌に対して、どの抗菌剤が有効、どの抗菌剤が無効であるかを纏めたものである。図１４に示す表を同じ施設で分離された同じ種類の細菌のデータを複数の細菌についてまとめて、抗菌剤に対する感受性をＲ、Ｉ、Ｓで表して纏めたものがアンチバイオグラムである。つまり、アンチバイオグラムでは、ある特定の施設で、特定の種類の細菌が抗菌剤に対して、Ｒ、Ｉ、Ｓを示す確率（％）を記載している。図１４はこの元となる表である。本発明の実施形態に従って薬剤感受性検査を行なうと、測定時間ごとに感受性判定した結果（Ｒ、Ｉ、Ｓ）が得られる。従って、従来のアンチバイオグラムの元となるデータがより詳細に得られることになる。さらに、図１４は、それぞれの抗菌剤についての様々な濃度で感受性判定（Ｒ、Ｉ、Ｓ）したデータ、つまり図１３から構成されている。このため、それぞれの抗菌剤についての結果を参照できる。また、図１３は、測定時間ごとの観察結果に基づいて作成された図１２に示すグラフから判定されている。このため、さまざまな抗菌剤濃度での培養条件で細菌の面積の時系列データを参照できる。このように、アンチバイオグラムの元となるデータをより詳細に参照できるため、細菌の種類だけでなく抗菌剤に対する感受性の情報が迅速かつ詳細に得られるようになる。 For each antibacterial agent, a breakpoint is set as to whether or not the type of bacteria is determined to be R (Resistant), I (Intermediate), or S (Sensitive) by the MIC. FIG. 14 shows the results of determining R, I, and S for each antibacterial agent by performing the determination shown in FIG. 13 for each measurement time and for each antibacterial agent and comparing with a breakpoint. FIG. 14 summarizes which antibacterial agent is effective and which antibacterial agent is ineffective against a certain bacterium. The table shown in FIG. 14 summarizes the data of the same type of bacteria isolated in the same facility for a plurality of bacteria, and the susceptibility to the antibacterial agent is represented by R, I, and S in an antibiogram. That is, the antibiogram describes the probability (%) that a particular type of bacterium shows R, I, S for an antibacterial agent at a particular facility. FIG. 14 is a table on which this is based. When the drug susceptibility test is performed according to the embodiment of the present invention, the results (R, I, S) of susceptibility determination are obtained for each measurement time. Therefore, the data on which the conventional anti-biogram is based can be obtained in more detail. Further, FIG. 14 is composed of data obtained by susceptibility determination (R, I, S) at various concentrations for each antibacterial agent, that is, FIG. Therefore, the results for each antibacterial agent can be referred to. Further, FIG. 13 is determined from the graph shown in FIG. 12 created based on the observation results for each measurement time. Therefore, time series data of bacterial area can be referred to under culture conditions at various antibacterial agent concentrations. In this way, since the data on which the antibiogram is based can be referred to in more detail, not only the type of bacteria but also the susceptibility to the antibacterial agent can be obtained quickly and in detail.
図１４に示す表には抗菌剤レボフロキサシンの欄はグレーでハッチングされている。このように現在投与中の抗菌剤をハイライト表示（強調表示）しておき、投与中の抗菌剤の使用を継続すべきかどうかを判断しやすくすることも可能である。なお、強調表示としてはハイライト表示すること以外に、他の抗菌剤よりも大きく表示したり、太字で表示したり、点滅表示させたりしても良い。 In the table shown in FIG. 14, the column for the antibacterial agent levofloxacin is hatched in gray. In this way, it is possible to highlight (highlight) the antibacterial agent currently being administered so that it is easy to determine whether or not the use of the antibacterial agent currently being administered should be continued. In addition to highlighting, the highlighting may be larger than other antibacterial agents, bold, or blinking.
また、図１４の表の１６ｈｒｓの列は、従来法によるＭＩＣ判定によってＲ、Ｉ、Ｓ判定を行なった結果であるが、それより左の列は６０〜１８０分での測定結果をもとにＲ、Ｉ、Ｓ判定を行なった結果を示している。つまり、従来では、培養開始から一晩経過後にＲ、Ｉ、Ｓ判定が行なわれるが、本発明の実施形態によると、顕微鏡観察ごとにＲ、Ｉ、Ｓ判定結果を表示することができる。また、培養時間が経過するごとにそれまでの測定結果を踏まえて判定を行なうことができる。具体的には、測定回数が増えるに従って図１２のグラフの情報が追加されて表示され、図１３の判定結果が追加され、図１４の結果も追加されて表示される。
以上のように、本発明により薬剤感受性の判定結果を迅速に表示することが可能となる。
The 16hrs column in the table of FIG. 14 is the result of performing R, I, and S determination by the MIC determination by the conventional method, but the column on the left is based on the measurement result in 60 to 180 minutes. The results of the R, I, and S determinations are shown. That is, conventionally, the R, I, S determination is performed overnight after the start of the culture, but according to the embodiment of the present invention, the R, I, S determination result can be displayed for each microscopic observation. In addition, each time the culture time elapses, the determination can be made based on the measurement results up to that point. Specifically, as the number of measurements increases, the information of the graph of FIG. 12 is added and displayed, the determination result of FIG. 13 is added, and the result of FIG. 14 is also added and displayed.
As described above, the present invention makes it possible to quickly display the determination result of drug susceptibility.
＜実施例２＞
図１５は、異なる患者から分離された大腸菌の検査結果を示す図である。具体的には、図１５（ａ）は、アンピシリンを含む条件で患者Ａから分離された大腸菌を培養した場合の細菌の面積の経時変化を示している。また、図１５（ｂ）は、アンピシリンを含む条件で患者Ｂから分離された大腸菌を培養した場合の大腸菌の経時変化を示している。図１５（ａ）及び（ｂ）は、ともに細菌の面積は培養開始時の細菌の面積で規格化している。
<Example 2>
FIG. 15 is a diagram showing test results of Escherichia coli isolated from different patients. Specifically, FIG. 15A shows the change over time in the area of bacteria when Escherichia coli isolated from patient A was cultured under conditions containing ampicillin. In addition, FIG. 15 (b) shows the time course of Escherichia coli when the Escherichia coli isolated from patient B was cultured under the condition containing ampicillin. In both FIGS. 15A and 15B, the area of bacteria is standardized by the area of bacteria at the start of culture.
図１５（ａ）では抗菌剤なしに比較して、アンピシリン５１２μｇ／ｍＬでも若干面積が増加している。一方、図１５（ｂ）ではアンピリシン４μｇ／ｍＬで増加が止まる傾向にあり、アンピシリン濃度８μｇ／ｍＬ以上だと、アンピシリンの作用によって細菌が破壊されて面積が減少傾向にあることがわかる。
In FIG. 15 (a), the area is slightly increased even at 512 μg / mL of ampicillin as compared with the case without the antibacterial agent. On the other hand, in FIG. 15B, it can be seen that the increase tends to stop at
図１６は、患者Ａ及びＢのそれぞれから分離された大腸菌の増殖判定結果（ＭＩＣ判定結果）を示す図である。図１６（ａ）に示す患者Ａから分離された大腸菌については、いずれも増殖と判定された。一方、図１６（ｂ）に示す患者Ｂから分離された大腸菌ではアンピシリン濃度８μｇ／ｍＬ以上では培養開始から１８０分後以降では増殖阻害と判定された。この結果から、患者ＡとＢから分離された大腸菌は、株が異なることが判明した。従来では、薬剤感受性の判定結果は培養開始の翌日に得られるが、本発明によると、顕微鏡観察を行なうたびに細菌面積の変化を解析することで細菌の増殖判定を行うことができ、迅速に細菌の株の判定を行なうことが可能である。 FIG. 16 is a diagram showing a growth determination result (MIC determination result) of Escherichia coli isolated from each of patients A and B. All of the Escherichia coli isolated from patient A shown in FIG. 16A were determined to be proliferating. On the other hand, in the Escherichia coli isolated from patient B shown in FIG. 16B, it was determined that the ampicillin concentration was 8 μg / mL or higher and the growth was inhibited 180 minutes after the start of culture. From this result, it was found that the strains of Escherichia coli isolated from patients A and B were different. Conventionally, the determination result of drug susceptibility is obtained the day after the start of culturing, but according to the present invention, it is possible to determine the growth of bacteria by analyzing the change in the bacterial area each time the microscopic observation is performed, and the bacterial growth can be determined quickly. It is possible to determine the strain of bacteria.
また、図１７は、患者Ａ及びＢのそれぞれから分離された大腸菌の感受性判定を行なった結果（ブレイクポイントとの比較結果）を示す図である。図１７（ａ）に示す患者Ａから分離された大腸菌については、アンピシリン耐性と判定された。一方、図１７（ｂ）に示す患者Ｂから分離された大腸菌ではアンピシリン感受性と判定された。 In addition, FIG. 17 is a diagram showing the results of susceptibility determination of Escherichia coli isolated from each of patients A and B (comparison results with breakpoints). The Escherichia coli isolated from patient A shown in FIG. 17 (a) was determined to be ampicillin resistant. On the other hand, the Escherichia coli isolated from patient B shown in FIG. 17 (b) was determined to be ampicillin-sensitive.
＜実施例３＞
図１８は、異なる患者から分離された黄色ブドウ球菌の検査結果を示す図である。具体的には、図１８（ａ）及び（ｃ）は、患者Ａから分離された黄色ブドウ球菌をアンピシリンもしくはバンコマイシンを含む条件で培養した場合の細菌の面積の経時変化を示している。また、図１８（ｂ）及び（ｄ）は、患者Ｂから分離された黄色ブドウ球菌をアンピシリンもしくはバンコマイシンを含む条件で培養した場合の大腸菌の経時変化を示している。図１８（ａ）乃至（ｄ）は、いずれも細菌の面積は培養開始時の細菌の面積で規格化されている。
<Example 3>
FIG. 18 is a diagram showing test results of Staphylococcus aureus isolated from different patients. Specifically, FIGS. 18 (a) and 18 (c) show changes in the area of bacteria over time when Staphylococcus aureus isolated from patient A is cultured under conditions containing ampicillin or vancomycin. In addition, FIGS. 18 (b) and 18 (d) show the time course of Escherichia coli when Staphylococcus aureus isolated from patient B was cultured under conditions containing ampicillin or vancomycin. In each of FIGS. 18A to 18D, the area of bacteria is standardized by the area of bacteria at the start of culture.
図１８（ａ）では抗菌剤なしに比較して、アンピシリン０．１２５μｇ／ｍＬでも若干面積が増加しており、アンピシリン濃度０．２５μｇ／ｍＬ以上でアンピシリンの増殖が阻害された。一方、図１８（ｂ）ではアンピリシン濃度０．１２５μｇ／ｍＬでも増殖はほぼ阻害されていた。また、図１８（ｃ）では抗菌剤なしとバンコマイシン濃度０．２５μｇ／ｍＬでは増殖が確認されたが、図１８（ｄ）ではバンコマイシン濃度０．５μｇ／ｍＬまで増殖が認められた。つまり、患者Ａから分離された黄色ブドウ球菌と、患者Ｂから分離された黄色ブドウ球菌はアンピシリン、バンコマイシンに対してのＭＩＣが異なることが判明した。図１８に示したデータは培養開始から３００分以内に得られた画像から解析した結果であることから、従来法と比較して迅速に細菌の株を識別できることがわかる。 In FIG. 18 (a), the area was slightly increased even at 0.125 μg / mL of ampicillin as compared with no antibacterial agent, and the growth of ampicillin was inhibited at an ampicillin concentration of 0.25 μg / mL or more. On the other hand, in FIG. 18 (b), the growth was almost inhibited even at an ampyricin concentration of 0.125 μg / mL. Further, in FIG. 18 (c), growth was confirmed without an antibacterial agent and at a vancomycin concentration of 0.25 μg / mL, but in FIG. 18 (d), growth was observed up to a vancomycin concentration of 0.5 μg / mL. That is, it was found that Staphylococcus aureus isolated from patient A and Staphylococcus aureus isolated from patient B have different MICs for ampicillin and vancomycin. Since the data shown in FIG. 18 is the result of analysis from the images obtained within 300 minutes from the start of culturing, it can be seen that the bacterial strain can be identified more quickly than in the conventional method.
図１９は、患者Ａ及びＢそれぞれから分離された黄色ブドウ球菌についての増殖判定結果（ＭＩＣ判定結果）を示す図である。図１９（ａ）に示す患者Ａから分離された黄色ブドウ球菌については、アンピシリン０．１２５μｇ／ｍＬまでの濃度で増殖と判定され、アンピシリン０．２５μｇ／ｍＬ以上の濃度で増殖阻害と判定された。また、バンコマイシン０．２５μｇ／ｍＬまでの濃度で増殖と判定され、バンコマイシン０．５μｇ／ｍＬ以上の濃度で増殖阻害と判定された。一方、図１９（ｂ）に示す患者Ｂから分離された黄色ブドウ球菌については、アンピシリン０．１２５μｇ／ｍＬ以上の濃度で増殖阻害と判定され、バンコマイシン０．５μｇ／ｍＬまでの濃度で増殖と判定され、バンコマイシン１．０μｇ／ｍＬ以上の濃度で増殖阻害と判定された。この結果から、患者ＡとＢから分離された黄色ブドウ球菌は、異なる株であると推察できる。 FIG. 19 is a diagram showing a growth determination result (MIC determination result) for Staphylococcus aureus isolated from each of patients A and B. The Staphylococcus aureus isolated from patient A shown in FIG. 19 (a) was determined to grow at a concentration of up to 0.125 μg / mL of ampicillin, and was determined to inhibit growth at a concentration of 0.25 μg / mL or more of ampicillin. .. In addition, growth was determined at a concentration of up to 0.25 μg / mL of vancomycin, and growth inhibition was determined at a concentration of 0.5 μg / mL or more of vancomycin. On the other hand, Staphylococcus aureus isolated from patient B shown in FIG. 19B was determined to be growth-inhibiting at a concentration of ampicillin of 0.125 μg / mL or higher, and was determined to be growth at a concentration of vancomycin up to 0.5 μg / mL. It was determined to inhibit growth at a concentration of 1.0 μg / mL or higher of vancomycin. From this result, it can be inferred that the Staphylococcus aureus isolated from patients A and B are different strains.
図２０は、患者Ａ及びＢそれぞれから分離された黄色ブドウ球菌について感受性判定を行なった結果（ブレイクポイントとの比較結果）を示す図である。図２０（ａ）に示す患者Ａから分離された黄色ブドウ球菌については、アンピシリン耐性、バンコマイシン感受性と判定された。一方、図２０（ｂ）に示す患者Ｂから分離された黄色ブドウ球菌ではアンピシリン感受性、バンコマイシン中間と判定された。従来では、感受性の判定は培養開始の翌日に得られるが、本発明によると、顕微鏡観察を行なうたびに細菌面積の変化を解析することで細菌の増殖判定を行うことができ、各抗菌剤の濃度での細菌の増殖判定を利用して、迅速に細菌が薬剤に対して感受性か耐性かの判定を行なうことが可能である。 FIG. 20 is a diagram showing the results (comparison results with breakpoints) of susceptibility determination of Staphylococcus aureus isolated from each of patients A and B. The Staphylococcus aureus isolated from patient A shown in FIG. 20 (a) was determined to be ampicillin-resistant and vancomycin-sensitive. On the other hand, Staphylococcus aureus isolated from patient B shown in FIG. 20 (b) was judged to be ampicillin-sensitive and vancomycin intermediate. Conventionally, the determination of susceptibility is obtained the day after the start of culturing, but according to the present invention, it is possible to determine the growth of bacteria by analyzing the change in the bacterial area each time microscopic observation is performed, and it is possible to determine the growth of each antibacterial agent. It is possible to quickly determine whether a bacterium is sensitive or resistant to a drug by using the determination of bacterial growth at a concentration.
以上のように、本発明を利用することで例えば、院内感染ルートの特定を迅速化することが可能である。 As described above, by using the present invention, for example, it is possible to expedite the identification of nosocomial infection routes.
また、図２１に示すように、薬剤感受性結果が得られた時点で、検査室に設置したＰＣからネットワークを介して、医局に設置したＰＣに結果を送信することで、迅速な対応、例えば抗菌剤の変更、治療方法の変更などが可能となる。 Further, as shown in FIG. 21, when the drug susceptibility result is obtained, the result is transmitted from the PC installed in the laboratory to the PC installed in the medical office via the network, thereby promptly responding, for example, antibacterial. It is possible to change the drug and the treatment method.
＜実施例４＞
図２２は、緑膿菌のメロペネムに対する感受性を調べた結果を示す図（グラフ）である。当該グラフは顕微鏡観察によって測定した画像中の緑膿菌の円形度を求め、その経時変化を示したものである。１つの画像中に複数個の緑膿菌が観察されるが、個々の緑膿菌の円形度を求め、画像中の細菌の平均値を算出した値をプロットした。なお、円形度は、４π×（面積）／（周囲長）＾２で算出される値である。細菌が真円であれば、４π×πｒ＾２／（２πｒ）＾２＝１となり、細菌が真円から外れると周囲長が大きくなるため値が減少する。
<Example 4>
FIG. 22 is a diagram (graph) showing the results of examining the susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to meropenem. The graph shows the change over time by determining the circularity of Pseudomonas aeruginosa in an image measured by microscopic observation. Although a plurality of Pseudomonas aeruginosa are observed in one image, the circularity of each Pseudomonas aeruginosa was determined, and the average value of the bacteria in the image was calculated and plotted. The circularity is a value calculated by 4π × (area) / (perimeter) ^ 2. If the bacterium is a perfect circle, 4π × πr ^ 2 / (2πr) ^ 2 = 1, and if the bacterium deviates from the perfect circle, the perimeter increases and the value decreases.
当該グラフ中、「菱形（ダイヤモンド形）」でプロットする抗菌剤なしは、培養開始から緑膿菌の円形度はほとんど変化しなかった。しかし、グラフ中「三角形」でプロットするメロペネム濃度０．１２５μｇ／ｍＬと、×でプロットするメロペネム濃度０．２５μｇ／ｍＬでは培養開始から９０分経過後から円形度が減少し始め、抗菌剤の作用によって緑膿菌が伸張化した。グラフ中＊でプロットするメロペネム濃度０．５μｇ／ｍＬと、「丸形」でプロットするメロペネム濃度１．０μｇ／ｍＬと、＋でプロットするメロペネム濃度２．０μｇ／ｍＬでは、少し円形度が減少するものの、１２０分経過後からはあまり円形度は減少しなかった。この結果から、円形度が減少し続けるメロペネム濃度０．１２５μｇ／ｍＬと０．２５μｇ／ｍＬでは、抗菌剤の作用によって細菌が伸張化しているが、緑膿菌はまだ死滅していないことが判明した。また、円形度の減少が止まるメロペネム濃度０．５μｇ／ｍＬ以上では、緑膿菌が死滅することが判明した。細菌は死滅していない場合には細菌の形状が変化するが、より高い抗菌剤濃度では細菌が死滅するため円形度は変化しなくなる。つまり抗菌剤濃度に応じて円形度が一旦減少し、さらに高い抗菌剤濃度で円形度が減少しなくなるが、その濃度をＭＢＣと推定できる。本実施例は、細菌の面積の経時変化をプロットする代わりに、細菌の円形度の経時変化をプロットした例であるが、このように細菌数や細菌面積以外に細菌の増殖や発育の程度を表す指標となる特徴量の経時変化をプロットすることで、細菌のＭＩＣ（最小発育阻止濃度、Minimum Inhibitory Concentration）だけでなくＭＢＣ（最小殺菌濃度、Minimum Bactericidal concentration）を判定することが可能となる。 In the graph, the circularity of Pseudomonas aeruginosa hardly changed from the start of culture without the antibacterial agent plotted in "diamond shape". However, at the meropenem concentration of 0.125 μg / mL plotted as “triangle” in the graph and the meropenem concentration of 0.25 μg / mL plotted as ×, the circularity began to decrease 90 minutes after the start of culture, and the action of the antibacterial agent. Stretched Pseudomonas aeruginosa. At the meropenem concentration of 0.5 μg / mL plotted with * in the graph, the meropenem concentration of 1.0 μg / mL plotted with “round”, and the meropenem concentration of 2.0 μg / mL plotted with +, the circularity is slightly reduced. However, the circularity did not decrease much after 120 minutes. From this result, it was found that at the meropenem concentrations of 0.125 μg / mL and 0.25 μg / mL, the roundness continues to decrease, the bacteria are elongated by the action of the antibacterial agent, but Pseudomonas aeruginosa has not yet died. did. It was also found that Pseudomonas aeruginosa was killed at a meropenem concentration of 0.5 μg / mL or higher at which the decrease in circularity stopped. If the bacteria are not killed, the shape of the bacteria will change, but at higher antimicrobial concentrations the bacteria will die and the roundness will not change. That is, the circularity decreases once according to the antibacterial agent concentration, and the circularity does not decrease at a higher antibacterial agent concentration, but the concentration can be estimated as MBC. In this example, instead of plotting the time course of the bacterial area, the time course of the circularity of the bacteria is plotted. In this way, the degree of bacterial growth and growth is measured in addition to the number of bacteria and the bacterial area. By plotting the time course of the feature amount as an index to represent, it is possible to determine not only the MIC (minimum inhibitory concentration, Minimum Inhibitory Concentration) of the bacterium but also the MBC (minimum bactericidal concentration, minimum bactericidal concentration).
（３）まとめ
（i）本発明による薬剤感受性検査では、顕微鏡観察で得られる画像に基づいて、細菌または真菌に対して抗菌剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の抗菌剤及び複数の種類の濃度について生成し、当該影響判定情報を時系列で表示するようにしている。このようにすることにより、患者への治療法の選択を早めることができ、迅速に適切な投薬を行なうことが可能となる。つまり、本発明では、細菌同定培養や薬剤感受性検査のための培養液を顕微鏡観察することによって細菌が増殖したか否かを判定する。具体的には、細菌同定培養や薬剤感受性検査のための培養プレートの各々のウェルの顕微鏡観察を行うための光源と、ミラーと、対物レンズと、画像を取得するためのＣＣＤとを備え、培養プレートの各々のウェルの吸光度を測定するための光源と、ミラーと、ホトダイオードとを備え、各々のウェルを観察あるいは測定するために培養プレートの位置を変更するためのＸＹＺステージを備えた温度調節機能つきの検査装置を用いる。ここで、顕微鏡観察のための光源やミラーは、吸光度測定のための光源やミラーと同一であっても良いし、別々に設置しても良い。光源とミラーとの間に適切なバンドパスフィルタを設置することで濁度(波長６００ｎｍ付近の吸光度）を測定することができ、バンドパスフィルタを別のフィルタに切替えることで白色光での顕微鏡観察が可能となる。また、顕微鏡観察画像を取得するＣＣＤ、あるいは吸光度測定用のホトダイオードの前にミラーを設置し、それぞれの測定の際にミラーを切替えても良い。ＸＹＺステージ上に培養プレートを設置し、３５℃程度で温調しながら培養を行い、設定した時間にＸＹＺステージを動作させて、培養プレートの各々のウェルの様子を観察する。ＸＹＺステージの制御や、バンドパスフィルタの切替えや、ミラーの切替えや、温調の設定などは検査装置に設蔵した制御用ＰＣで条件を設定して制御を行う。また、培養プレート中のウェル観察を行うタイミングや吸光度測定を行うタイミングの設定や、結果の記録も制御用ＰＣで行う。この検査装置で培養を行いながら顕微鏡観察することによってウェル中の細菌の形状や数を測定する。測定結果をＰＣで解析し、ウェル中の細菌の形状や数や面積の経時変化をグラフ化し、判定することによって１回の測定ごとに各ウェルで細菌が増殖したかどうかを判定する。また、複数の測定結果から、該当するウェルの細菌が今後増殖するかどうかを予測する。判定が困難な場合は該当する時間での判定を保留する。それらの結果を画面上に表示することにより、測定時間ごとに、細菌が増殖するかどうかの判定を行なうことができる。ある抗菌剤について濃度の異なる培養条件での結果を比較することで検査対象の細菌のＭＩＣ（最小発育阻止濃度：minimum inhibitory concentration）を判定することが出来る。参照データとしてブレイクポイントのデータを保持しておき、ＭＩＣと比較することで、細菌の薬剤感受性（感受性（Ｓ: sensitive）か、耐性（Ｒ: resistant）か、中間（Ｉ: intermediate））を判定して表示することが可能になる。これにより、迅速な結果をユーザに提供することが可能となる。
(3) Summary (i) In the drug susceptibility test according to the present invention, a plurality of types of antibacterial agents are used to provide effect determination information indicating the effect of the antibacterial agent on bacteria or fungi based on images obtained by microscopic observation. And, it is generated for a plurality of types of concentrations, and the effect judgment information is displayed in chronological order. By doing so, it is possible to accelerate the selection of the treatment method for the patient, and it is possible to promptly and appropriately administer the medication. That is, in the present invention, it is determined whether or not the bacterium has grown by observing the culture solution for bacterium identification culture and drug susceptibility test under a microscope. Specifically, the culture is provided with a light source for microscopic observation of each well of the culture plate for bacterial identification culture and drug susceptibility test, a mirror, an objective lens, and a CCD for acquiring an image. Temperature control function with a light source for measuring the absorbance of each well of the plate, a mirror, a photodioden, and an XYZ stage for repositioning the culture plate to observe or measure each well. Use the attached inspection device. Here, the light source and the mirror for microscopic observation may be the same as the light source and the mirror for the absorbance measurement, or may be installed separately. Turbidity (absorbance near wavelength 600 nm) can be measured by installing an appropriate bandpass filter between the light source and the mirror, and by switching the bandpass filter to another filter, microscopic observation with white light Is possible. Further, a mirror may be installed in front of the CCD for acquiring the microscope observation image or the photodiode for measuring the absorbance, and the mirror may be switched at the time of each measurement. A culture plate is placed on the XYZ stage, the culture is performed while controlling the temperature at about 35 ° C., the XYZ stage is operated at a set time, and the state of each well of the culture plate is observed. The control of the XYZ stage, the switching of the bandpass filter, the switching of the mirror, the setting of the temperature control, etc. are controlled by setting the conditions on the control PC installed in the inspection device. In addition, the timing for observing the wells in the culture plate, the timing for measuring the absorbance, and the recording of the results are also performed on the control PC. The shape and number of bacteria in the wells are measured by observing under a microscope while culturing with this inspection device. The measurement result is analyzed by a PC, and the change over time in the shape, number, and area of the bacteria in the wells is graphed, and it is determined whether or not the bacteria have grown in each well for each measurement. In addition, from a plurality of measurement results, it is predicted whether or not the bacteria in the corresponding well will grow in the future. If the judgment is difficult, the judgment at the relevant time is suspended. By displaying these results on the screen, it is possible to determine whether or not the bacterium grows at each measurement time. By comparing the results of a certain antibacterial agent under different concentration culture conditions, the MIC (minimum inhibitory concentration) of the bacterium to be inspected can be determined. Bacterial drug susceptibility (sensitivity (S: sensitive), resistance (R: resistant), intermediate (I: intermediate)) is determined by holding breakpoint data as reference data and comparing it with MIC. It becomes possible to display. This makes it possible to provide users with quick results.
本発明によれば、上述のように、培養プレート中の各々のウェル中の細菌を顕微鏡観察し、なおかつ各々のウェルに入っている培養液の濁度を測定することが可能となる。従来の細菌検査装置は培養液の濁度を測定することで細菌の増殖をモニタしているが、細菌の増殖に伴って培養液の濁度が増加し始めるには培養開始から５〜６時間程度かかる。また、薬剤感受性検査では使用する培養液や細菌の量が定められており、吸光度測定によって検査時間を短縮することは容易ではない。一般的に、細菌が分裂して培養液の濁度が増加する濃度に達するまで時間は細菌の分裂速度によって決まり、その速度は通常の培養条件下では劇的に変化しないためである。 According to the present invention, as described above, it is possible to observe the bacteria in each well in the culture plate under a microscope and measure the turbidity of the culture solution in each well. Conventional bacterial testers monitor the growth of bacteria by measuring the turbidity of the culture solution, but it takes 5 to 6 hours from the start of culture for the turbidity of the culture solution to begin to increase as the bacteria grow. It takes about. In addition, the amount of culture solution and bacteria used in the drug susceptibility test is determined, and it is not easy to shorten the test time by measuring the absorbance. This is because, in general, the time it takes for the bacteria to divide and reach a concentration that increases the turbidity of the culture is determined by the rate of bacterial division, which rate does not change dramatically under normal culture conditions.
しかし、本発明では、２０倍程度の倍率の対物レンズを用いて顕微鏡観察することによって細菌の分裂の様子をモニタでき、細菌１つ１つが分裂しているかどうかを判定することができる。従って、誘導期(lag phase)から対数期(log phase)になると、細菌が分裂しているかどうかを判定できるようになる。一般的に３０分〜３時間以内に細菌の増殖曲線は誘導期から対数期になるため、濁度による判定よりも早く細菌が増殖するかどうかを判定可能となる。 However, in the present invention, the state of bacterial division can be monitored by observing with a microscope using an objective lens having a magnification of about 20 times, and it can be determined whether or not each bacterium is dividing. Therefore, from the induction phase (lag phase) to the log phase (log phase), it becomes possible to determine whether or not the bacterium is dividing. Generally, the growth curve of bacteria changes from the induction phase to the logarithmic phase within 30 minutes to 3 hours, so that it is possible to determine whether or not the bacteria grow faster than the determination based on turbidity.
さらに、その判定結果を画面上に表示させることで、耐性菌の情報を顕微鏡観察が終了するたびことに提供することが出来る。培養時間が経過するとともに顕微鏡観察の回数も増え、複数個の判定結果を提供し、判定結果の確度を徐々に向上させることが可能となる。ある抗菌剤について複数の濃度で細菌の増殖を判定することでＭＩＣを決定でき、参照データとして保持しているブレイクポイントと比較することで細菌の薬剤感受性を迅速に判定することが可能となる。その結果、患者への治療法の選択を早めることができ、迅速に適切な投薬を行なうことが可能となる。 Furthermore, by displaying the determination result on the screen, information on resistant bacteria can be provided each time the microscopic observation is completed. As the culturing time elapses, the number of microscopic observations increases, a plurality of determination results can be provided, and the accuracy of the determination results can be gradually improved. The MIC can be determined by determining the growth of bacteria at a plurality of concentrations for a certain antibacterial agent, and the drug susceptibility of the bacteria can be rapidly determined by comparing with the breakpoints held as reference data. As a result, it is possible to accelerate the selection of the treatment method for the patient, and it is possible to promptly administer the appropriate medication.
さらに、本発明では、薬剤感受性判定の結果を予め設定した時間ごとに表示するとともに、複数の細菌または真菌についての薬剤感受性判定の結果を並列表示するようにしている。このようにすることにより、細菌の株が同じか異なるかを判定することを補助したり、院内感染ルートの特定を補助することが可能となる。 Further, in the present invention, the result of the drug susceptibility determination is displayed at preset time intervals, and the result of the drug susceptibility determination for a plurality of bacteria or fungi is displayed in parallel. By doing so, it is possible to assist in determining whether the bacterial strains are the same or different, and to assist in identifying the nosocomial infection route.
（ii）本発明は、実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、プログラムコードを記録した記憶媒体をシステム或は装置に提供し、そのシステム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施形態の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。このようなプログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。 (Ii) The present invention can also be realized by a program code of software that realizes the functions of the embodiment. In this case, a storage medium in which the program code is recorded is provided to the system or device, and the computer (or CPU or MPU) of the system or device reads the program code stored in the storage medium. In this case, the program code itself read from the storage medium realizes the function of the above-described embodiment, and the program code itself and the storage medium storing the program code itself constitute the present invention. Examples of the storage medium for supplying such a program code include a flexible disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a hard disk, an optical disk, a magneto-optical disk, a CD-R, a magnetic tape, a non-volatile memory card, and a ROM. Etc. are used.
また、プログラムコードの指示に基づき、コンピュータ上で稼動しているＯＳ（オペレーティングシステム）などが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。さらに、記憶媒体から読み出されたプログラムコードが、コンピュータ上のメモリに書きこまれた後、そのプログラムコードの指示に基づき、コンピュータのＣＰＵなどが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。 Further, based on the instruction of the program code, the OS (operating system) or the like running on the computer performs a part or all of the actual processing, and the processing enables the functions of the above-described embodiment to be realized. You may. Further, after the program code read from the storage medium is written in the memory on the computer, the CPU of the computer or the like performs a part or all of the actual processing based on the instruction of the program code, and the processing is performed. May realize the function of the above-described embodiment.
さらに、実施の形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードを、ネットワークを介して配信することにより、それをシステム又は装置のハードディスクやメモリ等の記憶手段又はＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−Ｒ等の記憶媒体に格納し、使用時にそのシステム又は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が当該記憶手段や当該記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出して実行するようにしても良い。 Further, by distributing the program code of the software that realizes the functions of the embodiment via the network, it is distributed as a storage means such as a hard disk or a memory of a system or an apparatus or a storage medium such as a CD-RW or a CD-R. The computer (or CPU or MPU) of the system or device may read and execute the program code stored in the storage means or the storage medium at the time of use.
最後に、ここで述べたプロセス及び技術は本質的に如何なる特定の装置に関連することはなく、コンポーネントの如何なる相応しい組み合わせによってでも実装できることを理解する必要がある。更に、汎用目的の多様なタイプのデバイスがここで記述した教授に従って使用可能である。ここで述べた方法のステップを実行するのに、専用の装置を構築するようにしても良い。また、実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。本発明は、具体例に関連して記述したが、これらは、すべての観点に於いて限定の為ではなく説明の為である。本分野にスキルのある者には、本発明を実施するのに相応しいハードウェア、ソフトウェア、及びファームウエアの多数の組み合わせがあることが解るであろう。例えば、記述したソフトウェアは、アセンブラ、Ｃ／Ｃ＋＋、ｐｅｒｌ、Ｓｈｅｌｌ、ＰＨＰ、Ｊａｖａ（登録商標）等の広範囲のプログラム又はスクリプト言語で実装できる。 Finally, it should be understood that the processes and techniques described here are not essentially associated with any particular device and can be implemented with any suitable combination of components. In addition, various types of devices for general purpose can be used according to the teachings described herein. Dedicated equipment may be built to perform the steps of the method described here. In addition, various inventions can be formed by appropriately combining the plurality of components disclosed in the embodiments. For example, some components may be removed from all the components shown in the embodiments. In addition, components across different embodiments may be combined as appropriate. The present invention has been described in the context of specific examples, but these are for illustration, not limitation, in all respects. Those skilled in the art will find that there are numerous combinations of hardware, software, and firmware suitable for implementing the present invention. For example, the described software can be implemented in a wide range of programs or scripting languages such as assembler, C / C ++, perl, Shell, PHP, Java®.
さらに、上述の実施形態において、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。全ての構成が相互に接続されていても良い。 Further, in the above-described embodiment, the control lines and information lines are shown as necessary for explanation, and the product does not necessarily show all the control lines and information lines. All configurations may be interconnected.
１ 細菌検査装置
１１ カバー
１２ 載置台
１３ 顕微鏡観察光学系及び濁度測定光学系
１６ 温調
１７ グリッパ
１８、２１ 培養プレート
１９ 駆動制御装置
２０ ＰＣ（コンピュータ）
２２ 光源
２３ フィルタ
２４ ミラー（ダイクロイックミラー）
２５ 対物レンズ
２６ ホトダイオード
２７ ＣＣＤ素子
1
22
25
Claims (15)
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養ステップと、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することにより複数の画像を取得する第１ステップと、
前記取得した複数の画像に対して、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つの画像処理を行う第２ステップと、
前記画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌に対して薬剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の薬剤及び複数の種類の濃度について生成する第３ステップと、
前記影響判定情報を時系列で表示する第４ステップと、
を含むこと特徴とする方法。 It is a method for determining the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture step in which the bacterium or fungus is retained and cultured on a microplate having a plurality of wells,
The first step of acquiring a plurality of images by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time, and
For the plurality of acquired images, a binarization process, a grayscale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. The second step of performing at least one image processing of the process of calculating the aspect ratio of the bacterium or the fungus, or the process of calculating the peripheral length of the bacterium or the fungus.
Based on the result of the image processing, a third step of generating effect determination information indicating the effect of the drug on the bacterium or fungus for a plurality of types of drugs and a plurality of types of concentrations, and
The fourth step of displaying the influence judgment information in chronological order and
A method characterized by including.
前記第３ステップは、
前記顕微鏡観察によって得られた複数の画像を比較することによって所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、
対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定することにより最小発育阻止濃度を特定し、
前記対象の薬剤での前記最小発育阻止濃度を特定した後、当該最小発育阻止濃度とブレイクポイントとを比較して前記細菌または真菌の薬剤感受性判定を行うステップであり、
前記第４ステップは、前記薬剤感受性判定の結果を前記表示画面上に表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
The third step is
By comparing a plurality of images obtained by the microscopic observation, it is determined whether the bacterium or fungus grows or is inhibited under predetermined culture conditions.
For the target drug, the minimum inhibitory concentration was specified by determining whether the bacterium or fungus grows or inhibits growth under multiple concentration conditions.
This is a step of determining the drug susceptibility of the bacterium or fungus by comparing the minimum inhibitory concentration with the breakpoint after specifying the minimum inhibitory concentration of the target drug.
The fourth step is a method of displaying the result of the drug susceptibility determination on the display screen.
前記第３ステップは、対象の薬剤の複数の濃度条件のそれぞれにおいて前記細菌または真菌が増殖するか、増殖が阻害されるかどうかを予め設定した時間ごとに判定するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
The third step is a step of determining whether or not the bacterium or fungus grows or is inhibited at each of a plurality of concentration conditions of the target drug at preset time intervals. Method.
前記第３ステップは、対象の薬剤の複数の濃度条件のそれぞれにおいて前記細菌または真菌が増殖するかどうかを予め設定した時間で顕微鏡観察した結果に基づいて、前記細菌または真菌の面積を求め、前記細菌または真菌の面積の時系列変化をプロットしたグラフを生成するステップであり、
前記第４ステップは、前記グラフを前記表示画面上に表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
In the third step, the area of the bacterium or fungus is determined based on the result of microscopic observation of whether or not the bacterium or fungus grows under each of a plurality of concentration conditions of the target drug at a preset time. It is a step to generate a graph plotting the time-series changes in the area of a bacterium or fungus.
The fourth step is a method of displaying the graph on the display screen.
前記第４ステップは、対象の培養条件において前記顕微鏡観察で得られる画像を、時系列に並べて前記表示画面上に表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
The fourth step is a method of displaying images obtained by microscopic observation under a target culture condition in chronological order on the display screen.
前記第４ステップは、前記顕微鏡観察で得られる画像を、対象の薬剤の複数の濃度条件に応じて並べて表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
The fourth step is a method of displaying images obtained by microscopic observation side by side according to a plurality of concentration conditions of a target drug.
前記第４ステップは、前記薬剤感受性判定の結果を予め設定した時間ごとに前記表示画面上に表示するとともに、複数の細菌または真菌についての前記薬剤感受性判定の結果を並列表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 2,
The fourth step is a step of displaying the result of the drug susceptibility determination on the display screen at preset time intervals and displaying the result of the drug susceptibility determination for a plurality of bacteria or fungi in parallel. How to feature.
前記第４ステップは、異なる患者間の前記薬剤感受性判定の結果を、比較により前記細菌または真菌の株を識別できるように、予め設定した時間ごとに前記表示画面上に表示するステップであることを特徴とする方法。 In claim 2,
The fourth step is a step of displaying the result of the drug susceptibility determination between different patients on the display screen at preset time intervals so that the bacterial or fungal strain can be identified by comparison. How to feature.
前記第３ステップは、前記顕微鏡観察によって得られた画像と、細菌の種類、薬剤の種類や濃度で培養した画像を格納したデータベースに蓄積されている画像とを比較することによって、細菌同定や所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定するステップであることを特徴とする方法。 In claim 1,
In the third step, bacterial identification and predetermined determination are performed by comparing the image obtained by the microscopic observation with the image stored in the database storing the images cultured with the type of bacteria, the type and concentration of the drug. A step of determining whether the bacterium or fungus grows or inhibits growth under the culture conditions of the above, and determines whether the bacterium or fungus grows or inhibits growth under a plurality of concentration conditions for the target drug. A method characterized by being.
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養ステップと、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することで得られる複数の画像に対して所定の画像処理を行い、当該画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌に対して前記薬剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の薬剤及び複数の種類の濃度について生成し、当該影響判定情報を時系列で表示する第１ステップと、
前記顕微鏡観察によって得られた複数の画像と、細菌の種類、薬剤の種類や濃度で培養した画像を格納したデータベースに蓄積されている画像とを比較することによって、細菌同定や所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定する第２ステップと、を含み、
前記所定の画像処理は、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つを含むことを特徴とする方法。 It is a method for determining the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture step in which the bacterium or fungus is retained and cultured on a microplate having a plurality of wells,
Predetermined image processing is performed on a plurality of images obtained by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time, and based on the result of the image processing, the drug is applied to the bacterium or fungus. The first step of generating effect determination information indicating the effect of the effect for a plurality of types of drugs and a plurality of types of concentrations, and displaying the effect determination information in chronological order, and
By comparing the plurality of images obtained by the microscopic observation with the images stored in the database storing the images cultured with the type of bacteria, the type and concentration of the drug, the bacteria can be identified and the predetermined culture conditions can be obtained. A second step of determining whether the bacterium or fungus grows or inhibits growth, and determines whether the bacterium or fungus grows or inhibits growth under a plurality of concentration conditions for the drug of interest. only including,
The predetermined image processing includes a binarization process, a gray scale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. A method comprising at least one of a process of calculating the aspect ratio of a bacterium or a fungus or a process of calculating the perimeter of a bacterium or a fungus.
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養ステップと、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することで得られる複数の画像に対して所定の画像処理を行い、当該画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌の円形度、周囲長、及び個数のうち少なくとも１つの特徴量を算出し、当該細菌または真菌の特徴量を予め設定された時間ごとに前記表示画面上に表示する第１ステップを含み、
前記所定の画像処理は、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つを含むことを特徴とした方法。 It is a method for determining the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture step in which the bacterium or fungus is retained and cultured on a microplate having a plurality of wells,
Predetermined image processing is performed on a plurality of images obtained by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time, and based on the result of the image processing, the circularity and the peripheral length of the bacterium or fungus are obtained. and calculating at least one characteristic quantity of the number, look including a first step of displaying on the display screen for each predetermined time that the feature amount of the bacteria or fungi,
The predetermined image processing includes a binarization process, a gray scale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. A method comprising at least one of a process of calculating the aspect ratio of a bacterium or a fungus or a process of calculating the perimeter of a bacterium or a fungus.
前記顕微鏡観察によって得られた画像の前記特徴量と、細菌の種類、薬剤の種類や濃度で培養した画像を格納したデータベースに蓄積されている画像から抽出した特徴量とを比較することによって、細菌同定や所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定する第２ステップを含むことを特徴とする方法。 In claim 11, further
Bacteria by comparing the feature amount of the image obtained by the microscopic observation with the feature amount extracted from the image stored in the database storing the image cultured with the type of bacteria, the type and concentration of the drug. It is determined whether the bacterium or fungus grows or is inhibited by identification or predetermined culture conditions, and whether the bacterium or fungus grows or is inhibited by a plurality of concentration conditions for the target drug. A method comprising a second step of determination.
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養部と、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することにより複数の画像を取得する取得部と、
前記取得した複数の画像に対して、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つの画像処理を行う画像処理部と、 当該画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌に対して薬剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の薬剤及び複数の種類の濃度について生成し、当該影響判定情報を時系列で表示する表示部と、
を備える検査装置。 It is an inspection device that determines the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture section in which the bacterium or fungus is held and cultured on a microplate having a plurality of wells,
An acquisition unit that acquires a plurality of images by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time.
For the plurality of acquired images, a binarization process, a grayscale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. Based on the result of the image processing, the image processing unit that performs at least one image processing of the process of calculating the aspect ratio of the bacterium or the bacterium, or the process of calculating the peripheral length of the bacterium or the bacterium, and the bacterium. Alternatively, an effect determination information indicating the effect of the drug on the bacterium is generated for a plurality of types of drugs and a plurality of types of concentrations, and a display unit that displays the effect determination information in chronological order.
Inspection device equipped with.
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養部と、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することにより得られる複数の画像に対して所定の画像処理を行い、当該画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌に対して前記薬剤が与えた影響を示す影響判定情報を、複数の種類の薬剤及び複数の種類の濃度について生成する生成部と、
当該影響判定情報を時系列で表示する表示部と、
前記顕微鏡観察によって得られた複数の画像と、細菌の種類、薬剤の種類や濃度で培養した画像を格納したデータベースに蓄積されている画像とを比較することによって、細菌同定や所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定する判定部と、を備え、
前記所定の画像処理は、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つを含むことを特徴とする検査装置。 It is an inspection device that determines the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture section in which the bacterium or fungus is held and cultured on a microplate having a plurality of wells,
A plurality of images obtained by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time are subjected to predetermined image processing, and based on the result of the image processing, the drug is applied to the bacterium or fungus. A generator that generates impact determination information indicating the impact on multiple types of drugs and multiple types of concentrations, and
A display unit that displays the impact judgment information in chronological order,
By comparing the plurality of images obtained by the microscopic observation with the images stored in the database storing the images cultured with the type of bacteria, the type and concentration of the drug, the bacteria can be identified and the predetermined culture conditions can be obtained. A determination unit that determines whether the bacterium or fungus grows or is inhibited from growing, and determines whether the bacterium or fungus grows or is inhibited from growing under a plurality of concentration conditions for the target drug. Prepare ,
The predetermined image processing includes a binarization process, a gray scale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. processing for calculating the aspect ratio of bacteria or fungi, or inspection device you characterized in that it comprises at least one of a process for calculating the perimeter of bacteria or fungi.
複数のウェルを有するマイクロプレートに前記細菌または真菌を保持させて培養する培養部と、
前記細菌または真菌の培養状態を経時的に顕微鏡観察することにより得られる複数の画像に対して所定の画像処理を行い、当該画像処理の結果に基づいて、前記細菌または真菌の円形度、周囲長、及び個数のうち少なくとも１つの特徴量を算出する算出部と、
前記細菌または真菌の特徴量を予め設定された時間ごとに前記表示画面上に表示する表示部と、
前記顕微鏡観察によって得られた画像の前記特徴量と、細菌の種類、薬剤の種類や濃度で培養した画像を格納したデータベースに蓄積されている画像から抽出した特徴量とを比較することによって、細菌同定や所定の培養条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定し、対象の薬剤について、複数の濃度条件で前記細菌または真菌が増殖するか増殖が阻害されるかを判定する判定部と、を備え、
前記所定の画像処理は、二値化処理、グレースケール画像にする処理、細菌または真菌の面積を算出する処理、細菌または真菌の数を算出する処理、細菌または真菌の円形度を算出する処理、細菌または真菌のアスペクト比を算出する処理、あるいは、細菌または真菌の周囲長を算出する処理の少なくとも一つを含むことを特徴とする検査装置。 It is an inspection device that determines the identification test of bacteria or fungi and the drug susceptibility test.
A culture section in which the bacterium or fungus is held and cultured on a microplate having a plurality of wells,
Predetermined image processing is performed on a plurality of images obtained by observing the culture state of the bacterium or fungus with a microscope over time, and based on the result of the image processing, the circularity and peripheral length of the bacterium or fungus , And a calculation unit that calculates at least one feature amount out of the number,
A display unit that displays the feature amount of the bacterium or fungus on the display screen at preset time intervals, and a display unit.
Bacteria by comparing the feature amount of the image obtained by the microscopic observation with the feature amount extracted from the image stored in the database storing the image cultured with the type of bacteria, the type and concentration of the drug. It is determined whether the bacterium or fungus grows or is inhibited by identification or predetermined culture conditions, and whether the bacterium or fungus grows or is inhibited by a plurality of concentration conditions for the target drug. Equipped with a determination unit for determination
The predetermined image processing includes a binarization process, a gray scale image process, a process of calculating the area of bacteria or fungi, a process of calculating the number of bacteria or fungi, and a process of calculating the circularity of bacteria or fungi. processing for calculating the aspect ratio of bacteria or fungi, or inspection device you characterized in that it comprises at least one of a process for calculating the perimeter of bacteria or fungi.
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