JP6888974B2

JP6888974B2 - Compounds with CYP2A13 inhibitory activity and CYP2A13 inhibitors

Info

Publication number: JP6888974B2
Application number: JP2017028927A
Authority: JP
Inventors: 宮澤　三雄; 三雄宮澤
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2036-01-27
Also published as: JP2017132771A

Description

本発明は、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤に関する。 The present invention relates to compounds having CYP2A13 inhibitory activity and CYP2A13 inhibitors.

シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は主に肝臓に含まれる酵素であり、ヒトの薬物代謝反応の約８割に関与するといわれている。ＣＹＰは脂溶性基質を酸化することで水溶性を高め、体外へ排出しやすくする役割を果たしている。 Cytochrome P450 (CYP) is an enzyme mainly contained in the liver and is said to be involved in about 80% of human drug metabolism reactions. CYP plays a role of increasing water solubility by oxidizing a fat-soluble substrate and facilitating excretion from the body.

ＣＹＰ２Ａ１３は、３種存在するＣＹＰ２Ａファミリーの１つであり、鼻の粘膜、気道、及び肺等の呼吸器官に発現するアイソザイムである。ＣＹＰ２Ａ１３は、タバコの主成分であるニコチンを代謝する酵素であり、ニコチンを中間体であるイミニウムイオンへと代謝する。このイミニウムイオンはさらにアルデヒドオキシダーゼにより、最終生成物であるコチニンへ代謝される。また、ＣＹＰ２Ａ１３は、たばこに含有されている前駆体変異原物質である４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）を代謝し、活性化することが知られている。 CYP2A13 is one of the three CYP2A families, and is an isozyme expressed in the mucous membrane of the nose, the respiratory tract, and the respiratory organs such as the lungs. CYP2A13 is an enzyme that metabolizes nicotine, which is the main component of tobacco, and metabolizes nicotine to iminium ion, which is an intermediate. This iminium ion is further metabolized by aldehyde oxidase to the final product, cotinine. It is also known that CYP2A13 metabolizes and activates 4- (methylnitrosoamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone (NNK), which is a precursor mutagen contained in tobacco. Has been done.

喫煙者においてニコチンの代謝による消失は、集中力の欠如や不安、不眠などの離脱症状をもたらし、これらの症状を解消するため喫煙を繰り返し、ニコチン濃度を維持しようする。このように喫煙を繰り返すことにより、ＮＮＫが代謝され、結果的に発癌リスクが高まることとなる。 Loss of nicotine by metabolism in smokers results in withdrawal symptoms such as lack of concentration, anxiety, and insomnia, and repeated smoking is attempted to maintain nicotine levels in order to eliminate these symptoms. By repeating smoking in this way, NNK is metabolized, and as a result, the risk of carcinogenesis increases.

これまでに、本出願人は単環性モノテルペン化合物である（＋）−ネオメントール、双環性モノテルペン化合物である（−）−ミルテナール等がＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有し、ＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として使用できることを報告している（下記特許文献１参照）。 So far, Applicants have used the monocyclic monoterpene compound (+)-neomenthol, the bicyclic monoterpene compound (-)-miltenal, etc. as CYP2A13 inhibitors because they have CYP2A13 inhibitory activity. It is reported that it can be done (see Patent Document 1 below).

一方、モノテルペン以外にもＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤の開発が要望されている。 On the other hand, in addition to monoterpenes, there is a demand for the development of compounds having CYP2A13 inhibitory activity and CYP2A13 inhibitors.

特許第５７３０３５５号公報Japanese Patent No. 5730355

本発明は、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a compound having a CYP2A13 inhibitory activity and a CYP2A13 inhibitor.

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねてきた。その研究過程において、林檎、バラ、コーヒー、ワイン等の主要な香気成分であるβ−ダマセノンに着目し、β−ダマセノンの生物変換（biotransformation）により生成する化合物が、ＣＹＰ２Ａ１３
阻害活性を有していることを見出した。
本発明者らは、さらに研究を進め、ある種の特定ヨノン系化合物及びセスキテルペン化合物についても優れたＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有していることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。 The present inventors have carried out diligent research to achieve the above object. In the research process, we focused on β-damascenone, which is a major aroma component of apples, roses, coffee, wine, etc., and the compound produced by biotransformation of β-damascenone is CYP2A13.
It was found that it has an inhibitory activity.
The present inventors further studied and found that certain specific ionone compounds and sesquiterpene compounds also have excellent CYP2A13 inhibitory activity. The present invention has been completed based on such findings.

即ち、本発明は、以下のＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を包含する。 That is, the present invention includes the following compounds having CYP2A13 inhibitory activity and CYP2A13 inhibitors.

項１．下記式（１）又は（２）で表される化合物。 Item 1. A compound represented by the following formula (1) or (2).

項２．項１に記載の化合物、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル、酢酸ミルテニル、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。 Item 2. Item 2. The compound according to Item 1, α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damacenone, γ-ionone, α-damacenone, γ-damacenone, α-iron, β-iron, γ-iron, (+). -Aromadendren, (-)-Aroalomadendren, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongifolane-7α-ol, (-)-Isolongifolene-9-on, (+) -Cycloisolongifol-5-ol, (-)-episedrol, (+)-sedrill acetate, nutcaton, (-)-globulol, (-)-cariophyllene oxide, valencene, bornyl acetate, isobornyl acetate, myltenyl acetate , CYP2A13 inhibitor containing at least one selected from the group consisting of citral, β-cyclocitral, perillaaldehyde and safranal.

項３．項１に記載の化合物、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイド、酢酸ボルニル、β−シクロシトラール及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有する上記項２に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。 Item 3. Item 2. The compound according to Item 1, α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damascenone, (-)-aroaromadendrene, (-)-isolongifolene, (-)-isolongifolene-9 The CYP2A13 inhibitor according to Item 2 above, which contains at least one selected from the group consisting of -one, (-)-caryophyllene oxide, bornyl acetate, β-cyclocitral and safranal.

項４．項２又は３に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を含有する喫煙回数低減剤。 Item 4. Item 2. A smoking frequency reducing agent containing the CYP2A13 inhibitor according to Item 2.

項５．項２又は３に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニコチンとを含む製剤。 Item 5. A preparation containing the CYP2A13 inhibitor according to Item 2 or 3 and nicotine.

項６．項１に記載の化合物の製造方法であって、β−ダマセノンを黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する製造方法。 Item 6. Item 2. The method for producing a compound according to Item 1, wherein β-damascenone is bioconverted by a black Aspergillus fungus.

本発明の式（１）及び式（２）で表される化合物は新規化合物であり、高いＣＹＰ２Ａ
１３阻害活性を有している。そのため、式（１）、式（２）で表される化合物等を含むＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を用いることによって、ニコチン代謝を遅らせ、体内のニコチン濃度を長期間維持することができるため、結果的に喫煙量を減らすことができる。 The compounds represented by the formulas (1) and (2) of the present invention are novel compounds and have a high CYP2A.
13 Has inhibitory activity. Therefore, by using a CYP2A13 inhibitor containing a compound represented by the formulas (1) and (2), nicotine metabolism can be delayed and the nicotine concentration in the body can be maintained for a long period of time, resulting in smoking. The amount can be reduced.

実施例で培養したアスペルギルス・ニガーによるβ−ダマセノンの生物変換の経時的変化を示す図である。It is a figure which shows the time-dependent change of the biological conversion of β-damascenone by Aspergillus niger cultured in Example. 実施例で得られた化合物１の^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲのスペクトルデータを示す図である。It is a figure which shows the spectrum data ^{of 1 1} H NMR and ¹³ C NMR of compound 1 obtained in an Example. 実施例で得られた化合物２の^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲのスペクトルデータを示す図である。It is a figure which shows the spectrum data ^{of 1 1} H NMR and ¹³ C NMR of compound 2 obtained in an Example. ２−ヒドロキシ−β−ダマセノン、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン及びβ−ダマセノンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of 2-hydroxy-β-damascenone, 3,4-dihydroxy-β-damascenone, α-ionol, β-ionol, β-damascenone and β-damascenone. γ−イオノン、α−ダマセノン及びγ−ダマセノンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of γ-ionone, α-damascenone and γ-damascenone. α−イロン、β−イロン及びγ−イロンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of α-yron, β-yron and γ-yron. （＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン及び（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オールのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。(+)-Aromadendren, (-)-Aromadendren, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongiforan-7α-ol, (-)-Isolongifolene-9-one and It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of (+)-cycloisolongifol-5-ol. （−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of (-)-epicedrol, (+)-cedrol acetate, nootkatone, (-)-globulol, (-)-caryophyllene oxide and valencene. 酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of bornyl acetate, isobornyl acetate and myrtenyl acetate. シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。It is a graph which shows the CYP2A13 inhibitory activity of citral, β-cyclocitral, perillaldehyde and safranal.

以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明は、下記式（１）又は（２）で表される化合物である。 The present invention is a compound represented by the following formula (1) or (2).

上記式（１）で表される化合物は、２−ヒドロキシ−β−ダマセノン（以下、「化合物１」ともいう）であり、上記式（２）で表される化合物は、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンである（以下、「化合物２」ともいう）。 The compound represented by the above formula (1) is 2-hydroxy-β-damascenone (hereinafter, also referred to as “Compound 1”), and the compound represented by the above formula (2) is 3,4-dihydroxy-. It is β-damascenone (hereinafter, also referred to as “Compound 2”).

化合物１及び化合物２は、次に示すようにβ−ダマセノンを生物変換（biotransformation）することにより代謝産物として製造される。 Compound 1 and Compound 2 are produced as metabolites by biotransforming β-damascenone as shown below.

β−ダマセノンの生物変換には、黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、具体的にはアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ４４１４が用いられる。アスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ４４１４は（独）製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＩＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ）から購入可能である。 For the biological conversion of β-damascenone, black Aspergillus niger, specifically Aspergillus niger NBRC4414, is used. Aspergillus niger NBRC4414 can be purchased from the NITE Biological Resource Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation.

生物変換の具体的な方法としては、アスペルギルス・ニガーの培養培地に、基質であるβ−ダマセノンを添加して、培養することにより行うことができる。培養に用いられる培地としては、アスペルギルス・ニガーが利用し得る栄養源を含むものであれば液状でも固状でもよい。この培地には、アスペルギルス・ニガーを培養するために必要な物質、例えば、アスペルギルス・ニガーが同化し得る炭素源、消化し得る窒素源及び無機物等が適宜配合される。培地のｐＨ及び温度条件は、アスペルギルス・ニガーの育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができる。例えば、温度２８℃程度で２〜７日間培養することが好ましい。 As a specific method of biological conversion, it can be carried out by adding β-damascenone as a substrate to the culture medium of Aspergillus niger and culturing it. The medium used for culturing may be liquid or solid as long as it contains a nutrient source that can be used by Aspergillus niger. The medium is appropriately blended with substances necessary for culturing Aspergillus niger, such as a carbon source that can be assimilated by Aspergillus niger, a nitrogen source that can be digested, and an inorganic substance. The pH and temperature conditions of the medium can be used under any conditions as long as they are in a range suitable for growing Aspergillus niger. For example, it is preferable to incubate at a temperature of about 28 ° C. for 2 to 7 days.

生物変換の後、代謝産物を分離又は抽出し、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー又はシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することにより、化合物１及び化合物２を得ることができる。 After bioconversion, metabolites are separated or extracted and, if necessary, suitable separation such as alumina column chromatography or silica gel chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, high speed liquid chromatography and the like. Compound 1 and compound 2 can be obtained by purifying one or a combination of two or more purification means.

化合物１及び化合物２は、以下の実施例で示すように、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有している。化合物１及び化合物２はそのままＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として用いることが可能
である。 Compound 1 and Compound 2 have CYP2A13 inhibitory activity, as shown in the following examples. Compound 1 and Compound 2 can be used as they are as CYP2A13 inhibitors.

また、以下の実施例で示すように、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル、酢酸ミルテニル、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールはＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有している。 In addition, as shown in the following examples, α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damascenone, γ-damascenone, α-damascenone, γ-damascenone, α-iron, β-iron, γ-iron , (+)-Aromadendrene, (-)-Aroaromadendrene, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongifolane-7α-ol, (-)-Isolongifolene-9-on , (+)-Cycloisolongifol-5-ol, (-)-episedrol, (+)-sedrill acetate, nutcaton, (-)-globulol, (-)-cariophyllene oxide, valencene, bornyl acetate, acetic acid Isobornyl, myrtenyl acetate, citral, β-cyclocitral, perillaaldehyde and safranal have CYP2A13 inhibitory activity.

α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン及びγ−イロンは、ヨノン系化合物である。 α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damascenone, γ-ionone, α-damascenone, γ-damascenone, α-iron, β-iron and γ-iron are yonon compounds.

上記したヨノン系化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノンが好ましい。 Among the above-mentioned yonon compounds, α-ionol, β-ionol, β-damascenone, and β-damascenone are preferable from the viewpoint of CYP2A13 inhibitory activity.

（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンはセスキテルペン化合物である。 (+)-Aromadendren, (-)-Aromadendren, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongifolane-7α-ol, (-)-Isolongifolene-9-on, (+)-Cycloisolongifol-5-ol, (-)-epicedrol, (+)-cedrol acetate, nootkatone, (-)-globulol, (-)-caryophyllene oxide and valencene are sesquiterpene compounds. ..

上記したセスキテルペン化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイドが好ましい。 Among the above-mentioned sesquiterpene compounds, from the viewpoint of CYP2A13 inhibitory activity, (-)-aroaromadendrene, (-)-isolongifolene, (-)-isolongifolene-9-one, (-)-caryophyllene Oxide is preferred.

酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルは、環状モノテルペンアセテート化合物である。 Bornyl acetate, isobornyl acetate and myrtenyl acetate are cyclic monoterpene acetate compounds.

上記した環状モノテルペンアセテート化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、酢酸ボルニルが好ましい。 Among the above-mentioned cyclic monoterpene acetate compounds, bornyl acetate is preferable from the viewpoint of CYP2A13 inhibitory activity.

シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールは、モノテルペンアルデヒド化合物である。 Citral, β-cyclocitral, perillaldehyde and safranal are monoterpene aldehyde compounds.

上記したモノテルペンアルデヒド化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、β−シクロシトラール及びサフラナールが好ましい。 Among the above-mentioned monoterpene aldehyde compounds, β-cyclocitral and safranal are preferable from the viewpoint of CYP2A13 inhibitory activity.

上記したヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物は、種々の植物の精油成分として知られていることから、安全かつ入手が容易である。本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、上記したヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物を含む精油をも包含する。例えば、γ−イオノン、（＋）−アロマデンドレン、バレンセン、ヌートカトン、酢酸ボルニル、等は、それぞれタマリンド、ユーカリ、オレンジ、グレープフルーツ、ヒノキ、レモングラス等の植物から単離することができる。 Since the above-mentioned yonon-based compound, sesquiterpene compound, cyclic monoterpene acetate compound, or monoterpene aldehyde compound is known as an essential oil component of various plants, it is safe and easily available. The CYP2A13 inhibitor of the present invention also includes essential oils containing the above-mentioned yonon-based compound, sesquiterpene compound, cyclic monoterpene acetate compound or monoterpene aldehyde compound. For example, γ-ionone, (+)-aromadendrene, valencene, nootkatone, bornyl acetate, etc. can be isolated from plants such as tamarind, eucalyptus, orange, grapefruit, cypress, and lemongrass, respectively.

上記のヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物を含む植物からの精油は、公知の方法を用いて抽出することができる。その抽出方法は、該当する植物を、そのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供するのが好ましい。 Essential oils from plants containing the above-mentioned yonon compounds, sesquiterpene compounds, cyclic monoterpene acetate compounds or monoterpene aldehyde compounds can be extracted using known methods. In the extraction method, the corresponding plant can be used for extraction as it is, but it is preferable that the plant is crushed into smaller pieces and then used for extraction.

抽出溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；水等を用いることができる。これらの抽出溶媒は、一種単独又は二種以上を混合して用いることができる。特に、メタノール、エタノール等のアルコール類、及び酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることが、取り扱いが容易であり、しかも優れた活性を有する抽出物を得ることができる点で好ましい。 The extraction solvent is not particularly limited, and for example, alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; glycols such as 1,3-butylene glycol, glycerin and propylene glycol; esters such as ethyl acetate and butyl acetate. Hydroxane, cyclohexane, petroleum ether and other hydrocarbons; water and the like can be used. These extraction solvents can be used alone or in admixture of two or more. In particular, it is easy to handle and obtain an extract having excellent activity by using at least one selected from the group consisting of alcohols such as methanol and ethanol and esters such as ethyl acetate and butyl acetate. It is preferable in that it can be used.

上記した方法によって抽出物を得た後、必要に応じ、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのままＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として用いることが可能であるが、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性をさらに高めるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。 After obtaining the extract by the above method, if necessary, the extract can be obtained by solid-liquid separation from the residue by a conventional method such as filtration or centrifugation. In the present invention, the obtained extract can be used as it is as a CYP2A13 inhibitor, but in order to further enhance the CYP2A13 inhibitory activity, it can be appropriately concentrated or the solvent is distilled off and used as an extract or powder. it can.

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ１３の発現あるいは酵素活性を抑制することで、ニコチンを代謝させず、あるいは代謝速度を低下させることで体内に長く留まらせることができ、結果的に喫煙者の喫煙回数を減らす働きを有する。そのため、喫煙回数低減剤として有用である。 The CYP2A13 inhibitor of the present invention can suppress the expression or enzyme activity of CYP2A13 to prevent nicotine from being metabolized or to reduce the metabolic rate so that it can stay in the body for a long time, resulting in smoking by smokers. It has the function of reducing the number of times. Therefore, it is useful as a smoking frequency reducing agent.

また、本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を用いて喫煙者の喫煙回数を低減させることにより、結果的に４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）の吸入量を低減させることができる。さらに、ＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ１３の発現あるいは酵素活性を抑制することで、体内でＮＮＫの代謝及び活性化を抑制する働きを有する。そのため、発癌リスクを低減できる禁煙補助剤としても有効である。 In addition, by reducing the number of times smokers smoke using the CYP2A13 inhibitor of the present invention, the amount of 4- (methylnitrosoamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone (NNK) inhaled as a result. Can be reduced. Furthermore, the CYP2A13 inhibitor has a function of suppressing the metabolism and activation of NNK in the body by suppressing the expression or enzyme activity of CYP2A13. Therefore, it is also effective as a smoking cessation aid that can reduce the risk of carcinogenesis.

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、従来慣用されている方法により、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。製剤化には通常用いられている賦形剤、結合剤、潤沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。 The CYP2A13 inhibitor of the present invention is a tablet, a powder, a fine granule, a granule, a coated tablet, a capsule, a syrup, an elixir, a troche, an inhalant, a suppository, or an injection by a conventionally used method. , Ointments, eye ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, paps, lotions and the like. Excipients, binders, abundant agents, colorants, flavoring and odorants commonly used for formulation, and optionally stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives , Antioxidants and the like can be used, and the components and blending amounts generally used as raw materials for pharmaceutical preparations are appropriately selected and formulated by a conventional method.

本発明の製剤を投与する場合、その投与形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、例えば、経口、経皮、経肺、吸入、局所、直腸等のいずれでもよい。好適には、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等の形態が例示される。特に、経皮スキンパッチの形態、ネブライザー等によるエアロゾール投与、ディフューザーによる空間への噴霧等で用いることが好適である。 When the preparation of the present invention is administered, the administration form is not particularly limited, and any commonly used method may be used, for example, oral, transdermal, transpulmonary, inhalation, topical, rectal and the like. Preferred forms include chewing gum, nasal sprays, mouth sprays, mouthwashes, transdermal patches and the like. In particular, it is preferably used in the form of a transdermal skin patch, administration of aerosol with a nebulizer or the like, spraying into a space with a diffuser, or the like.

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ニコチンとともに用いて、ニコチンを代謝させず、あるいは代謝速度を低減させることによりニコチンを体内に長く留まらせ、喫煙者の喫煙衝動をより低減することができる。例えば、公知のニコチン製剤（例えば、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等）とともに上記したＣＹＰ２Ａ１３阻害剤の製剤を併用することができる。また、製剤中にＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニ
コチンを含有していてもよい。 The CYP2A13 inhibitor of the present invention can be used together with nicotine to keep nicotine in the body for a long time by not metabolizing nicotine or reducing the rate of metabolism, and the smoking urge of smokers can be further reduced. For example, the above-mentioned CYP2A13 inhibitor preparation can be used in combination with a known nicotine preparation (for example, chewing gum, nasal spray, mouth spray, mouthwash, transdermal patch, etc.). In addition, the CYP2A13 inhibitor and nicotine may be contained in the formulation.

喫煙者の喫煙回数を低減させるため、フィルター付タバコのフィルターに本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を含有させることもできる。また、喫煙ルームなどにおいて、ディフューザーを用いて空間に噴霧することも可能である。 In order to reduce the number of times smokers smoke, the filter of the cigarette with a filter can also contain the CYP2A13 inhibitor of the present invention. It is also possible to spray the space with a diffuser in a smoking room or the like.

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples and the like.

実施例１
黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（アスペルギルス・ニガー）の培養
１Ｌ三角フラスコに蒸留水５００ｍｌ中に、ショ糖（７．５ｇ）、グルコース（７．５ｇ）、ポリペプトン（２．５ｇ）、塩化カリウム（２５０ｍｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（２５０ｍｇ）、リン酸二水素カリウム（０．５ｇ）及び硫酸鉄(ＩＩ)七水和物（５ｍｇ）を含むオートクレーブした培養液を調製した。さらに、４℃で寒天培地上で保持した黒色｛こくしょく｝アスペルギルスＮＢＲＣ４４１４(（独）製品評価技術基盤機構
バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から購
入)の胞子を添加し、３日間培養した。 Example 1
Culture of black {Kokushoku} Aspergillus niger (Aspergillus niger) in 500 ml of distilled water in a 1 L triangular flask, sucrose (7.5 g), glucose (7.5 g), polypeptone (2.5 g), potassium chloride (250 mg) ), Magnesium sulfate heptahydrate (250 mg), potassium dihydrogen phosphate (0.5 g) and iron (II) sulfate heptahydrate (5 mg) were prepared in an autoclaved culture solution. Furthermore, spores of black {Kokushoku} Aspergillus NBRC 4414 (purchased from NITE Biological Resource Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation) kept at 4 ° C on an agar medium were added. It was cultured for 3 days.

β−ダマセノンの代謝化合物の製造
前記培養した培地に、基質であるβ−ダマセノン（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社から入手）を添加（基質濃度は０．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）した。β−ダマセノンを添加した培地を２８℃で７日間振盪培養し、培地及び菌糸体を濾過することにより分離した。分離した菌糸体は、ｐＨ４まで酸性にし、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって乾燥し、減圧することによって酢酸エチルを除去した。 Production of Metabolic Compound of β-Damasenone To the cultured medium, β-Damasenone (obtained from Filmenich), which is a substrate, was added (a substrate concentration of 0.5 to 50 mg / mL). The medium supplemented with β-damascenone was cultured with shaking at 28 ° C. for 7 days, and the medium and mycelium were separated by filtration. The separated mycelium was acidified to pH 4 and extracted with ethyl acetate. The obtained extract _{was dried over anhydrous Na 2} SO ₄ and the pressure was reduced to remove ethyl acetate.

ここで、β−ダマセノンの代謝産物の存在を確認するために、１日１回薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。 Here, thin layer chromatography (TLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were performed once a day to confirm the presence of β-damasenone metabolites.

ＴＬＣ分析は、シリカゲル６０ＧＦ２５４を塗布したＴＬＣプレート(メルク社製、層
厚０．２５ｍｍ)を用いて行った。 The TLC analysis was performed using a TLC plate (manufactured by Merck & Co., Ltd., layer thickness 0.25 mm) coated with silica gel 60GF254.

ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）は、スプリット注入器、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ−５８９０Ａ、ヒューレット−パッカード社製）を、質量分析計（５９７２Ａ、ヒューレット−パッカード社製）に直結した装置で行った。昇温プログラムはＧＣと同一にした。キャリヤーガスとしてヘリウムを１．０ｍＬ／分の流量で用いた。イオン源部の温度は２８０℃であり、電子エネルギーは７０ｅＶであった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。 Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) uses a gas chromatograph (HP-5890A, manufactured by Hewlett-Packard) equipped with a split injector and a capillary column (HP-5MS, length 30 m, inner diameter 0.25 mm). This was performed with a device directly connected to an analyzer (5792A, manufactured by Hewlett-Packard). The heating program was the same as GC. Helium was used as the carrier gas at a flow rate of 1.0 mL / min. The temperature of the ion source was 280 ° C., and the electron energy was 70 eV. As the ionization method, the electron impact method (EI) was used.

また、β−ダマセノンの代謝産物の存在を確認するために、酢酸エチルで抽出した抽出物をＧＣ−ＭＳで分析した結果、２つの代謝物（化合物１及び化合物２）のピークを確認することができた。 In addition, as a result of analyzing the extract extracted with ethyl acetate by GC-MS in order to confirm the presence of the metabolite of β-damasenone, it is possible to confirm the peaks of the two metabolites (Compound 1 and Compound 2). did it.

図１に、培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒによるβ−ダマセノンの生物変換の経時的変化を示す。図１におけるプロット（●）はβ−ダマセノンを表し、プロット（▲）は化合物１を表し、プロット（■）は化合物２を表す。β−ダマセノンを７日間生物変換することにより、化合物１を約４０％の収率で得ることができ、化合物２を約６０％の収率で得ることができた。 FIG. 1 shows the time course of the biological conversion of β-damascenone by cultured Aspergillus niger. The plot (●) in FIG. 1 represents β-damascenone, the plot (▲) represents compound 1, and the plot (■) represents compound 2. By bioconverting β-damascenone for 7 days, compound 1 could be obtained in a yield of about 40% and compound 2 could be obtained in a yield of about 60%.

化合物１及び化合物２の構造決定
化合物１及び化合物２の構造を決定する目的で、ＨＲＥＩＭＳ、ＩＲ、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。 Structure determination of ^{compound 1 and compound 2 HREIMS, IR, 1} H-NMR and ¹³ C-NMR were measured for the purpose of determining the structure of compound 1 and compound 2.

ＨＲＥＩＭＳの測定には、日本電子株式会社製ＪＥＯＬｔｈｅＴａｎｄｅｍＭＳ
ｓｔａｔｉｏｎＪＭＳ−７００を使用した。 For the measurement of HREIMS, JEOL the Tandem MS manufactured by JEOL Ltd.
station JMS-700 was used.

ＩＲ（赤外線吸収）スペルトルの測定には、日本分光株式会社製のＪＡＳＣＯＦＴ／ＩＲ−４７０ｐｌｕｓフーリエ変換赤外分光光度計を使用した。 A JASCO FT / IR-470 plus Fourier transform infrared spectrophotometer manufactured by JASCO Corporation was used for the measurement of IR (infrared absorption) spertor.

核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ）は、日本電子株式会社製ＪＥＯＬＥＣＡ−８００（８００ＭＨｚ）分光計を用い、ＣＤＣｌ_３中で測定し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準物質として使用して測定した。 Nuclear magnetic resonance spectra ( ¹ H-NMR and ¹³ _{C-NMR) were measured in CDCl 3} using a JEOL ECA-800 (800 MHz) spectrometer manufactured by JEOL Ltd., and tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard. Measured using as a substance.

化合物１の物性は下記の通りである。
ＨＲＥＩＭＳ：ｍ／ｚ（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，％）２０６．１３０７（Ｍ^＋，８），１９１（４），１７３（１５），１３７（１８），９１（１９），７７（１４），６９（１００），４１（６３），４３（３６）；
ＩＲ（ν_ｍａｘ，ｆｉｌｍ，ｃｍ^−１）：３３７７，２９５４，２９２１，２８５７，１６３８，１４３９，１０６７，１０２０，９６０
化合物１の^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータを図２に示す。 The physical characteristics of compound 1 are as follows.
HREIMS: m / z (reactive intensity,%) 206.1307 (M ⁺ , 8), 191 (4), 173 (15), 137 (18), 91 (19), 77 (14), 69 (100) , 41 (63), 43 (36);
IR (ν _max , film, cm ^-1 ): 3377, 2954, 2921, 2857, 1638, 1439, 1067, 1020, 960
¹ H NMR and ¹³ C NMR spectral data of Compound 1 are shown in FIG.

ＨＲＥＩＭＳでは、ｍ／ｚ２０６．１３０７に分子イオンピークが確認され、化合物１の分子量が２０６．１３０７であり、組成式がＣ_１３Ｈ_１８Ｏ_２であることが示唆された。ＩＲスペクトルデータより、水酸基（３３７７ｃｍ^−１，１０６７ｃｍ^−１）、カルボニル基（１６３８ｃｍ^−１）及び二重結合（１０２０ｃｍ^−１，９６０ｃｍ^−１）の存在が示唆された。 In HREIMS, a molecular ion peak was confirmed at m / z 206.1307, suggesting that the molecular weight of Compound 1 was 206.1307 and the composition formula was C ₁₃ H ₁₈ O ₂ . IR spectrum data suggested the presence of hydroxyl groups (3377 cm ^-1 , 1067 cm ^-1 ), carbonyl groups (1638 cm ^-1 ) and double bonds (1020 cm ^-1 , 960 cm ^-1).

さらに、部分構造を決定するため、２次元ＮＭＲとして、ＨＭＢＣ（hetero-nuclear multiple-bond connectivity）を測定した。水酸基の位置について、ＨＭＢＣより、１１
位のメチル基由来のプロトンからＣ−２位への相関が観測され、同様に、４位のメチンプロトンからＣ−２位への相関が観測された。このことから、水酸基の位置を２位と特定した。 Furthermore, in order to determine the partial structure, HMBC (hetero-nuclear multiple-bond connectivity) was measured as a two-dimensional NMR. Regarding the position of the hydroxyl group, from HMBC, 11
A correlation was observed from the methyl group-derived proton to the C-2 position, and similarly, a correlation from the methine proton at the 4-position to the C-2 position was observed. From this, the position of the hydroxyl group was specified as the 2nd position.

以上より、化合物１の構造は、下記式（１）で表されることが判明し、２−ヒドロキシ−β−ダマセノンであると決定した。 From the above, it was found that the structure of compound 1 was represented by the following formula (1), and it was determined to be 2-hydroxy-β-damascenone.

化合物１は、新規化合物である。 Compound 1 is a novel compound.

化合物２の物性は下記の通りである。
ＨＲＥＩＭＳ：ｍ／ｚ（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，％）２２４．１４１３（Ｍ^＋，４），２０９（９），１５５（２１），１３７（３７），１２３（１２），１０９（２６），８１（１６），６９（１００），４３（３４），４１（４２）；
ＩＲ（ν_ｍａｘ，ｆｉｌｍ，ｃｍ^−１）：３４３５，３０５０，２９６６，１６４１，１４４１，１２９０，１０５０，９７５
化合物２の^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータを図３に示す。 The physical characteristics of compound 2 are as follows.
HREIMS: m / z (reactive intensity,%) 224.1413 (M ⁺ , 4), 209 (9), 155 (21), 137 (37), 123 (12), 109 (26), 81 (16) , 69 (100), 43 (34), 41 (42);
IR (ν _max , film, cm ^-1 ): 3435, 3050, 2966, 1641, 1441, 1290, 1050, 975
¹ H NMR and ¹³ C NMR spectral data of Compound 2 are shown in FIG.

ＨＲＥＩＭＳでは、ｍ／ｚ２２４．１４１３に分子イオンピークが確認され、化合物２の分子量が２２４．１４１３であり、組成式がＣ_１３Ｈ_２０Ｏ_３であることが示唆された。ＩＲスペクトルデータより、水酸基（３４３５ｃｍ^−１，１０５０ｃｍ^−１）、カルボニル基（１６４１ｃｍ^−１）及び二重結合（３０５０ｃｍ^−１，９７５ｃｍ^−１）の存在が示唆された。 In HREIMS, a molecular ion peak was confirmed at m / z 224.1413, suggesting that the molecular weight of Compound 2 was 224.1413 and the composition formula was C ₁₃ H ₂₀ O ₃ . IR spectrum data suggested the presence of hydroxyl groups (3435 cm ^-1 , 1050 cm ^-1 ), carbonyl groups (1641 cm ^-1 ) and double bonds (3050 cm ^-1 , 975 cm ^-1).

また、^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータより、β−ダマセノンのＮＭＲデータと比較すると、３位及び４位由来のメチンプロトン及びカーボンが消失し、オキシメチン由来のプロトン、カーボンシグナルが観測された。さらに、２次元ＮＭＲとして、ＨＭＢＣを測定することにより、水酸基の位置を３位及び４位に特定した。 Further, from the ¹ H NMR and ¹³ C NMR spectral data, when compared with the NMR data of β-damasenone, the methine protons and carbons derived from the 3rd and 4th positions disappeared, and the protons and carbon signals derived from oxymethine were observed. Further, by measuring HMBC as a two-dimensional NMR, the positions of the hydroxyl groups were specified at the 3rd and 4th positions.

以上より、化合物２の構造は、下記式（２）で表されることが判明し、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンであると決定した。 From the above, it was found that the structure of compound 2 was represented by the following formula (2), and it was determined to be 3,4-dihydroxy-β-damascone.

化合物２は、新規化合物である。 Compound 2 is a novel compound.

試験例１（ＨＰＬＣを用いたニコチン代謝分析法）
新規化合物である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン及び３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン；ヨノン系化合物である、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン及びγ−イロン；セスキテルペン化合物である、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセン；環状モノテルペンアセテート化合物である、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニル；モノテルペンアルデヒド化合物である、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラ
アルデヒド及びサフラナールを用いて、以下のニコチン代謝分析を行った。また、ニコチン代謝分析のポジティブコントロールとして、クマリンを使用した。 Test Example 1 (Nicotine Metabolism Analysis Method Using HPLC)
New compounds 2-hydroxy-β-damascenone and 3,4-dihydroxy-β-damascenone; yonone compounds α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damascenone, γ-ionone, α- Damascenone, γ-damascenone, α-iron, β-iron and γ-iron; sesquiterpene compounds, (+)-aromadendrene, (-)-aroaromadendrene, (-)-isolongifoll, ( -)-Isolongiphoran-7α-ol, (-)-isolongifolene-9-one, (+)-cycloisolongifol-5-ol, (-)-episedrol, (+)-sedrill Acetate, nutcatone, (-)-globrol, (-)-cariophyllene oxide and damascenone; cyclic monoterpene acetate compounds, bornyl acetate, isobornyl acetate and myrtenyl acetate; monoterpene aldehyde compounds, citral, β-cyclocitral, The following nicotine metabolism analysis was performed using perillaaldehyde and safranal. In addition, coumarin was used as a positive control for nicotine metabolism analysis.

５μＬのバキュロウイルス組換えＣＹＰ２Ａ１３（２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＢＤ社製）、１５μＬのプールドヒト肝サイトゾール（０．３ｍｇ／ｍＬ、ＢＤ社製）、５２．５μＬのＮＡＤＰＨ生成系（０．５ｍＭＮＡＤＰ^＋、５ｍＭＧ−６−Ｐ、０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬＧ−６−ＰＤＨ）、１０μＬのニコチン（５０μＭ）、および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を混合し、全量を２５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間反応させた。 5 μL baculovirus recombinant CYP2A13 (20 nmol / mL, manufactured by BD), 15 μL pooled human liver cytosole (0.3 mg / mL, manufactured by BD), 52.5 μL NADPH production system (0.5 mM NADP ⁺ , 5 mM) G-6-P, 0.5units / mL G-6-PDH), 10 μL of nicotin (50 μM), and 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) were mixed to bring the total volume to 250 μL. The mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes.

阻害剤である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン及びβ−ダマセノンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。 Inhibitors 2-hydroxy-β-damascenone, 3,4-dihydroxy-β-damascenone, α-ionol, β-ionol, β-damascenone and β-damascenone are dissolved in DMSO and the total amount is 250 μL. It was adjusted to 10, 5, and 2.5 μM.

阻害剤であるγ−イオノン、α−ダマセノン及びγ−ダマセノンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、５０、２５、１２．５μＭになるように調製した。 The inhibitors γ-ionone, α-damascenone and γ-damascenone were dissolved in DMSO and adjusted to 50, 25, 12.5 μM in a reaction system having a total volume of 250 μL.

阻害剤であるα−イロン、β−イロン及びγ−イロンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１００、５０、２５μＭになるように調製した。 Inhibitors α-ylon, β-yron and γ-yron were dissolved in DMSO and adjusted to 100, 50 and 25 μM in a reaction system having a total volume of 250 μL.

阻害剤である（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。 Inhibitors (+)-Aromadendrene, (-)-Aromadendren, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongifolane-7α-ol, (-)-Isolongifolene- For 9-on, (+)-cycloisolongifol-5-ol, (-)-epicedrol, (+)-cedrol acetate, nootkatone, (-)-globulol, (-)-caryophyllene oxide and valencene , DMSO was dissolved in DMSO, and the total volume was adjusted to 10, 5, 2.5 μM in a reaction system of 250 μL.

阻害剤である酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。 Inhibitors Bornyl acetate, Isobornyl acetate and Miltenyl acetate were dissolved in DMSO and prepared to a total volume of 250 μL in a reaction system of 10, 5, 2.5 μM.

阻害剤であるシトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。 The inhibitors citral, β-cyclocitral, perillaldehyde and safranal were dissolved in DMSO and prepared to a total volume of 250 μL in a reaction system of 10, 5, 2.5 μM.

ポジティブコントロールであるクマリンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。 Coumarin, which is a positive control, was dissolved in DMSO and adjusted to 10, 5, 2.5 μM in a reaction system having a total volume of 250 μL.

反応後、内部標準物質として２５μＬのトランス−４’−カルボキシコチニンメチルエステル（２５μＭ）および反応停止剤としてアセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液を２５０μＬ加えた。反応停止後、４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清をとり、上清を活性化させたＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）にてクリーンナップし、ＨＰＬＣによりコチニンの生成量を定量した。ＨＰＬＣ分析条件及び内部標準物質の調整法は以下の通りである。コチニン生成量の結果を図４〜１０に、本実施例で用いた上記化合物のＩＣ_５０値を表１及び表２に示す。 After the reaction, 25 μL of trans-4'-carboxycotinine methyl ester (25 μM) as an internal standard and 250 μL of an acetonitrile / methanol (1: 1, v / v) mixture as a reaction terminator were added. After stopping the reaction, the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 3000 rpm for 20 minutes, the supernatant was taken, cleaned up with Sep-Pak C18 (manufactured by Waters) in which the supernatant was activated, and the amount of cotinine produced was quantified by HPLC. did. The HPLC analysis conditions and the method for adjusting the internal standard substance are as follows. Figure 4-10 Results of cotinine production amount, IC ₅₀ values of the compounds used in this example are shown in Table 1 and Table 2.

ＨＰＬＣ分析条件
ＳｃｈｅｒｚｏＳＭ−Ｃ１８（３．０×１５０ｍｍ、ｉｍｔａｋｔ社製）を用い、移
動相を１５％アセトニトリル／５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、フローレート（Ｆｌｏｗｒａｔｅ）を０．４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を３７℃とした。検出には、２６０ｎｍのＵＶ波長を用いた。コチニンの生成量はコチニンの絶対検量線を作成し、それより算出した。阻害の評価はそれぞれの５０％阻害濃度であるＩＣ_５０値を求めることにより行った。 HPLC analysis conditions Using Scherzo SM-C18 (3.0 × 150 mm, manufactured by imtakat), the mobile phase was 15% acetonitrile / 50 mM ammonium acetate buffer, the flow rate was 0.4 mL / min, and the column temperature was adjusted. The temperature was 37 ° C. A UV wavelength of 260 nm was used for detection. The amount of cotinine produced was calculated by preparing an absolute calibration curve for cotinine. Evaluation of inhibition was performed by determining an IC ₅₀ value of 50% inhibitory concentration of each.

内部標準物質の調製法
トランス−４’−カルボキシコチニン（ｔｒａｎｓ−４’−ｃａｒｂｏｘｙｃｏｔｉｎｉｎｅ）(東京化成工業株式会社)３０ｍｇをセトン２０ｍＬに溶解し、ジアゾメタンを２ｍＬ加え室温で２０分間、反応させた。反応後、溶媒を留去し、メチルエステル体であるトランス−４’−カルボキシコチニンメチルエステル（ｔｒａｎｓ−４’−ｃａｒｂｏｘｙｃｏｔｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）３９ｍｇを得た。 Preparation method of internal standard substance Trans-4'-carboxycotinine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 30 mg was dissolved in 20 mL of seton, 2 mL of diazomethane was added, and the mixture was reacted at room temperature for 20 minutes. After the reaction, the solvent was distilled off to obtain 39 mg of trans-4'-carboxycotinine methyl ester, which is a methyl ester.

図４〜１０及び表１〜２より、本実施例で用いた全ての化合物について、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有することが確認できた。ポジティブコントロールとして使用したクマリンについては、ＩＣ_５０値は３．８μＭであった。 From FIGS. 4 to 10 and Tables 1 and 2, it was confirmed that all the compounds used in this example had CYP2A13 inhibitory activity. The coumarin was used as a positive control, _{IC 50} value was 3.8MyuM.

ＣＹＰ２Ａ１３の阻害効果では、新規化合物である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン及び３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンが、ポジティブコントロールとして使用したクマリンと同程度の阻害活性を示すことがわかった。 Regarding the inhibitory effect of CYP2A13, it was found that the novel compounds 2-hydroxy-β-damascenone and 3,4-dihydroxy-β-damascenone exhibited the same inhibitory activity as coumarin used as a positive control.

製造例（製剤例）
試験例１で分析を行った２−ヒドロキシ−β−ダマセノンを用いて、下記製造例１〜５の製剤を調製できる。 Production example (formulation example)
Using the 2-hydroxy-β-damascenone analyzed in Test Example 1, the following preparations of Production Examples 1 to 5 can be prepared.

製造例１（パッチ製剤付着性ゲル） Production Example 1 (patch preparation adhesive gel)

製造例２（パッチ製剤付着性ゲル） Production Example 2 (patch preparation adhesive gel)

製造例３（スプレー製剤） Production Example 3 (spray formulation)

製造例４（スプレー製剤） Production Example 4 (spray formulation)

製造例５（チューインガム製剤）
下記の組成物Ａを調製する。 Production Example 5 (chewing gum preparation)
The following composition A is prepared.

上記の組成物Ａを、下記のガムベース及び香料と混合してチューインガムを製造する。 The above composition A is mixed with the following gum base and flavor to produce chewing gum.

Claims

α-ionol, β-ionol, β-damascenone, β-damascenone, γ-ionone, α-damascenone, γ-damascenone, α-iron, β-iron, γ-iron, (+)-aromadendrene, (- )-Aroaromadendrene, (-)-Isolongifoll, (-)-Isolongiphoran-7α-ol, (-)-Isolongifolene-9-one, (+)-Cycloisolongifol-5 -Ol, (-)-Epicedrol, (+)-Cedrillacetate, Nootkatone, (-)-Globrol, (-)-Valencene, Bornyl acetate, Isobornyl acetate, Myrtenyl acetate, Citral, β-Cyclocitral , A CYP2A13 inhibitor containing at least one selected from the group consisting of perillaaldehyde and safranal.

α-Ionol, β-Ionol, β-Damascone, β-damascenone, (-)-Aroaromadendrene, (-)-Isolongifolene, (-)-Isolongifolene-9-on, (-)- The CYP2A13 inhibitor according to claim 1, which contains at least one selected from the group consisting of caryophyllene oxide, bornyl acetate, β-cyclocitral and safranal.

A smoking frequency reducing agent containing the CYP2A13 inhibitor according to claim 1 or 2.

α-ionol, β-ionol, β-damascenone, γ-ionone, α-damacenone, γ-damacenone, α-iron, β-iron, γ-iron, (+)-aromadendrene, (-)-aroromaden Drain, (-)-isolongifoll, (-)-isolongiforan-7α-ol, (-)-isolongiforen-9-one, (+)-cycloisolongifol-5-ol, ( -) - Epise Dror, (+) - cedryl acetate, nootkatone, (-) - Guroburoru, (-) - caryophyllene oxide, valencene, acetic acid Miruteniru, beta-cyclo citral, selected from the group consisting of perilla aldehyde and Safranal A preparation containing a CYP2A13 inhibitor containing at least one and nicotine.

α-Ionol, β-Ionol, β-Damascone, (-)-Aroaromadendrene, (-)-Isolongifoll, (-)-Isolongifolene-9-one, (-)-Caryophyllen oxide , β -A preparation containing a CYP2A13 inhibitor containing at least one selected from the group consisting of cyclocitral and safranal and nicotine.