JP6888175B2 - Klk5阻害ペプチド - Google Patents
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Description
(1)
配列番号61(図69)で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトKLK5の有するプロテアーゼ活性を阻害する、SPINK2変異体ペプチド、
(2)
ヒトKLK7又はヒトKLK14の有するプロテアーゼ活性を阻害する、(1)記載のペプチド、
(3)
該阻害がヒトKLK5及び任意でヒトKLK7又はKLK14選択的である、(1)記載のペプチド、
(4)
16番Xaa(X1)はAla、Asp、Gly、Gln、Leu、Ser又はThrである、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(5)
17番Xaa(X2)はArg、Glu、Asn、Gln又はSerである、(1)乃至(4)のいずれか一つに記載のペプチド、
(6)
18番Xaa(X3)はAsp、Gln、Ile、Thr、Trp又はTyrである、(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のペプチド、
(7)
19番Xaa(X4)はArg、Gly、Met、Gln又はThrである、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載のペプチド、
(8)
20番Xaa(X5)はAsp、Glu、Leu、Lys、Thr又はTyrである、(1)乃至(7)のいずれか一つに記載のペプチド、
(9)
21番Xaa(X6)はGlu、Gly、His、Leu、Ser、Gln又はTyrである、(1)乃至(8)のいずれか一つに記載のペプチド、
(10)
22番Xaa(X7)はAsp、Gly、Gln、Sey又はTyrである、(1)乃至(9)のいずれか一つに記載のペプチド、
(11)
24番Xaa(X8)はAla、Asp、Glu、Gly、Asn、Ser又はThrである、(1)乃至(10)のいずれか一つに記載のペプチド、
(12)
25番Xaa(X9)はArg又はLysである、(1)乃至(11)のいずれか一つに記載のペプチド、
(13)
26番Xaa(X10)はAsp、Glu、Gln、Ser又はValである、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載のペプチド、
(14)
27番Xaa(X11)はPhe又はTyrである、(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のペプチド、
(15)
28番Xaa(X12)はAsp又はGluである、(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のペプチド、
(16)
配列番号6、8、10、12、14、16、18及び20(図14、16、18、20、22、24、26及び28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63を含む、(1)乃至(15)記載のいずれか一つに記載のペプチド、
(17)
16番Xaa(X1)はGly、Met又はTyrである、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(18)
17番Xaa(X2)はGlu、Gln又はThrである、(1)乃至(3)及び(17)のいずれか一つに記載のペプチド、
(19)
18番Xaa(X3)はHis、Met又はTyrである、(1)乃至(3)、(17)及び(18)のいずれか一つに記載のペプチド、
(20)
19番Xaa(X4)はAla、Arg、Lys又はGlnである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチド、
(21)
20番Xaa(X5)はGly、Arg又はSerである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(20)のいずれか一つに記載のペプチド、
(22)
21番Xaa(X6)はArg、Lys、Gln又はSerである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(21)のいずれか一つに記載のペプチド、
(23)
22番Xaa(X7)はGlyである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(22)のいずれか一つに記載のペプチド、
(24)
24番Xaa(X8)はHis、Thr又はTyrである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(23)のいずれか一つに記載のペプチド、
(25)
25番Xaa(X9)はHis又はTyrである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(24)のいずれか一つに記載のペプチド、
(26)
26番Xaa(X10)はAsp、Glu又はHisである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(25)のいずれか一つに記載のペプチド、
(27)
27番Xaa(X11)はTyrである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(26)のいずれか一つに記載のペプチド、
(28)
28番Xaa(X12)はAsp又はGluである、(1)乃至(3)及び(17)乃至(27)のいずれか一つに記載のペプチド、
(29)
配列番号22、24、26及び28(図30、32、34及び36)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63を含む、(1)乃至(3)及び(17)乃至(28)記載のいずれか一つに記載のペプチド、
(30)
16番Xaa(X1)はGly、Ser又はTyrである、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(31)
17番Xaa(X2)はAsp又はGlnである、(1)乃至(3)及び(30)のいずれか一つに記載のペプチド、
(32)
18番Xaa(X3)はThr又はValである、(1)乃至(3)、(30)及び(31)のいずれか一つに記載のペプチド、
(33)
19番Xaa(X4)はThr又はValである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(32)のいずれか一つに記載のペプチド、
(34)
20番Xaa(X5)はGlu又はThrである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(33)のいずれか一つに記載のペプチド、
(35)
21番Xaa(X6)はHis又はThrである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(34)のいずれか一つに記載のペプチド、
(36)
22番Xaa(X7)はTyrである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(35)のいずれか一つに記載のペプチド、
(37)
24番Xaa(X8)はAsn又はSerである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(36)のいずれか一つに記載のペプチド、
(38)
25番Xaa(X9)はArgである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(37)のいずれか一つに記載のペプチド、
(39)
26番Xaa(X10)はAsp又はGluである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(38)のいずれか一つに記載のペプチド、
(40)
27番Xaa(X11)はTyrである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(39)のいずれか一つに記載のペプチド、
(41)
28番Xaa(X12)はAspである、(1)乃至(3)及び(30)乃至(40)のいずれか一つに記載のペプチド、
(42)
配列番号30及び32(図38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63を含む、(1)乃至(3)及び(30)乃至(41)記載のいずれか一つに記載のペプチド、
(43)
3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、(1)乃至(42)のいずれか一つに記載のペプチド、
(44)
(1)乃至(43)のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(45)
(44)記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(46)
(44)記載のポリヌクレオチド若しくは(45)記載のベクターを含むか又は(1)乃至(43)のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
(47)
下記工程(i)及び(ii)を含む、SPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)(46)記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程、
(48)
(1)乃至(43)のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
(49)
(47)又は(48)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド、
(50)
(1)乃至(43)及び(49)のいずれか一つに記載のペプチドに1つ又は2つ以上の任意の部分が結合してなるコンジュゲート、
(51)
1つの任意の部分が、SPINK2変異体ではない第2ペプチドを含む、(50)記載のコンジュゲート、
(52)
第2ペプチドが、SPINK2変異体のアミノ末端側に位置する、(51)記載のコンジュゲート、
(53)
第2ペプチドが、SPINK2変異体のカルボキシル末端側に位置する、(51)記載のコンジュゲート、
(54)
第2ペプチドが抗体又はその断片であり、且つ1つ又は2つ以上のFc領域を含む、(51)乃至(53)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
(55)
Fc領域がヒト免疫グロブリンのFc領域又はその断片である、(54)記載のコンジュゲート、
(56)
Fc領域がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及び/又は、IgEのFc領域又はその断片である、(54)又は(55)記載のコンジュゲート、
(57)
Fc領域がヒトIgG1のFc領域又はその断片である、(54)乃至(56)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
(58)
ヒトIgG1のFc領域が、配列番号87(図95)で示されるアミノ酸配列を含む、(57)記載のコンジュゲート、
(59)
Fc領域が野生型又は変異型である、(54)乃至(57)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
(60)
アミノ末端に1乃至数個のアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸が付加してなる、(51)乃至(59)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
(61)
下記(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含む、(50)乃至(60)のいずれか一つに記載のコンジュゲート:
(i)配列番号34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及び96(図42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68及び106)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(ii)上記(i)記載のアミノ酸配列と90%以上同一であり、且つKLK5の有するプロテアーゼ活性を阻害するコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列、
(62)
SPINK2変異体及び第2ペプチドが、リンカーを介して結合している、(51)乃至(61)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
(63)
リンカーが、SPINK2変異体及び第2ペプチドではない第3ペプチドである、(62)記載のコンジュゲート、
(64)
下記工程(i)及び(ii)を含む、(50)乃至(63)のいずれか一つに記載のコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
(65)
(50)乃至(63)のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
(66)
(64)又は(65)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート、
(67)
(1)乃至(43)及び(49)のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片、
(68)
(1)乃至(43)及び(49)のいずれか一つに記載のペプチド、(44)記載のポリヌクレオチド、(45)記載のベクター、(46)記載の細胞、(50)乃至(63)及び(66)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、(67)記載の抗体若しくはその結合断片を含む組成物、
(69)
(1)乃至(43)及び(49)のいずれか一つに記載のペプチド、(44)記載のポリヌクレオチド、(45)記載のベクター、(46)記載の細胞、並びに/又は、(50)乃至(63)及び(66)のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物、
(70)
KLK5関連疾患の治療又は予防のための、(69)記載の医薬組成物、
(71)
KLK5関連疾患がネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道である、(70)記載の医薬組成物、
(72)
他の医薬品と組み合わせて使用される、(69)乃至(71)記載のいずれか一つに記載の医薬組成物、
(73)
(1)乃至(43)及び(49)のいずれか一つに記載のペプチド、(44)記載のポリヌクレオチド、(45)記載のベクター、(46)記載の細胞、(50)乃至(63)及び(66)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、(67)記載の抗体又はその結合断片を含む、検査用又は診断用組成物、
(74)
(67)記載の抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、(47)、(48)、(64)及び(65)のいずれか一つに記載の方法、
(75)
下記工程(i)乃至(iii)を含む、KLK5阻害SPINK2変異体ペプチドの同定方法:
(i)被験SPINK2変異体ペプチド存在下及び非存在下で、KLK5プロテアーゼ及び基質を保温する工程;
(ii)被験SPINK2変異体ペプチド存在下及び非存在下におけるKLK5プロテアーゼ活性を測定する工程;及び、
(iii)該ペプチド存在下でのKLK5プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのKLK5プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程、
(76)
下記工程(i)乃至(iii)を含み、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及び32(図14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートが参照化合物として使用される、KLK5阻害化合物の同定方法:
(i)被験化合物存在下及び非存在下で、KLK5プロテアーゼ及び基質を保温する工程;
(ii)該化合物存在下及び非存在下におけるKLK5プロテアーゼ活性を測定する工程;及び、
(iii)該化合物存在下でのKLK5プロテアーゼ活性が、該化合物非存在下でのKLK5プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該化合物を陽性と判定する工程、
(77)
下記工程(i)乃至(iii)を含む、KLK5阻害化合物の同定方法:
(i)被験化合物のKLK5プロテアーゼ阻害活性を測定する工程;
(ii)配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及び32(図14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートである参照化合物のKLK5プロテアーゼ阻害活性を測定する工程;及び、
(iii)被験化合物のKLK5プロテアーゼ阻害活性が、参照化合物のKLK5プロテアーゼ阻害活性と同等又はより強い場合、該化合物を陽性と判定する工程、
(78)
下記工程(i)及び(ii)を含み、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及び32(図14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又該ペプチドを含むコンジュゲートが参照化合物として使用される、KLK5プロテアーゼ活性を測定する方法:
(i)KLK5プロテアーゼ、基質及び任意で他の成分を保温する工程;
(ii)工程(i)の後、基質量及び/又は生成物量を測定する工程、
(79)
KLK5阻害SPINK2変異体ペプチド又はSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートであって、表面プラズモン共鳴分析において、該ペプチド又はコンジュゲートを固定化し、KLK5を添加することにより測定されたKLK5に対する解離定数(KD)が1×10−9M以下である、該ペプチド又はコンジュゲート、
(80)
配列番号34(図42)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(81)
配列番号36(図44)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(82)
配列番号38(図46)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(83)
配列番号40(図48)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(84)
配列番号42(図50)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(85)
配列番号44(図52)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(86)
配列番号46(図54)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(87)
配列番号48(図56)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(88)
配列番号50(図58)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(89)
配列番号52(図60)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(90)
配列番号54(図62)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(91)
配列番号56(図64)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(92)
配列番号58(図66)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
(93)
配列番号60(図68)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
及び、
(94)
配列番号96(図106)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
等に関する。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのような鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
2−1.アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα−アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計20アミノ酸を意味する。それらの計20アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明のKLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、又は、KLK5/KLK14阻害ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
(1)疎水性アミノ酸グループ:Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性アミノ酸グループ:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性アミノ酸グループ:Asp、Glu
(4)塩基性アミノ酸グループ:His、Lys、Arg
(5)主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ:Gly、Pro
(6)芳香族アミノ酸グループ:Trp、Tyr、Phe
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
(1)非極性アミノ酸グループ:アラニン(以下、「Ala」又は単に「A」と記す)、バリン(以下、「Val」又は単に「V」と記す)、ロイシン(以下、「Leu」又は単に「L」と記す)、イソロイシン(以下、「Ile」又は単に「I」と記す)、プロリン(以下、「Pro」又は単に「P」と記す)、フェニルアラニン(「Phe」又は単に「F」と記す)、トリプトファン(以下、「Trp」又は単に「W」と記す)、メチオニン(以下、「Met」又は単に「M」と記す)
(2)非荷電極性アミノ酸グループ:グリシン(以下、「Gly」又は単に「G」と記す)、セリン(以下、「Ser」又は単に「S」と記す)、スレオニン(以下、「Thr」又は単に「T」と記す)、システイン(以下、「Cys」又は単に「C」と記す)、チロシン(以下、「Tyr」又は単に「Y」と記す)、アスパラギン(以下、「Asn」又は単に「N」と記す)、グルタミン(以下、「Gln」又は単に「Q」と記す)
(3)酸性アミノ酸グループ:アスパラギン酸(以下、「Asp」又は単に「D」と記す)、グルタミン酸(以下、「Glu」又は単に「E」と記す)
(4)塩基性アミノ酸グループ:リジン(以下、「Lys」又は単に「K」と記す)、アルギニン(以下、「Arg」又は単に「R」と記す)、ヒスチジン(以下、「His」又は単に「H」と記す)
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、N−ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、O−ホスホセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等を挙げることができ、ノルロイシン、Ac−アミノ酸、Boc−アミノ酸、Fmoc−アミノ酸、Trt−アミノ酸、Z−アミノ酸等のN末端保護アミノ酸、アミノ酸t−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のC末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のTic誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等を挙げることができるが、それらに限らず上記20の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
本発明のペプチドは、KLK5阻害活性、KLK5/KLK7阻害活性、又は、KLK5/KLK14阻害活性を有する。
16番Ser〜22番Glyのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
24番Pro〜28番Asnのうち1つ、2つ、3つ、4つ又は5つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
15番Cys、23番Cys、31番Cys、42番Cys、45番Cys及び63番Cysは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくCysであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のSPINK2変異体うち一部の好適なKLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、又は、KLK5/KLK14阻害ペプチドにおいては、天然型と同じ当該6箇所にCysが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、15番Cys−45番Cys、23番Cys−42番Cys、及び、31番Cys−63番Cysが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
16番Xaa(X1)はAla、Asp、Gly、Gln、Leu、Ser又はThr;
17番Xaa(X2)はArg、Glu、Asn、Gln又はSer;
18番Xaa(X3)はAsp、Gln、Ile、Thr、Trp又はTyr;
19番Xaa(X4)はArg、Gly、Met、Gln又はThr;
20番Xaa(X5)はAsp、Glu、Leu、Lys、Thr又はTyr;
21番Xaa(X6)はGlu、Gly、His、Leu、Ser、Gln又はTyr;
22番Xaa(X7)はAsp、Gly、Gln、Sey又はTyr;
24番Xaa(X8)はAla、Asp、Glu、Gly、Asn、Ser又はThr;
25番Xaa(X9)はArg又はLys;
26番Xaa(X10)はAsp、Glu、Gln、Ser又はVal;
27番Xaa(X11)はPhe又はTyr;及び
28番Xaa(X12)はAsp又はGlu
である。
16番Xaa(X1)はGly、Met又はTyr;
17番Xaa(X2)はGlu、Gln又はThr;
18番Xaa(X3)はHis、Met又はTyr;
19番Xaa(X4)はAla、Arg、Lys又はGln;
20番Xaa(X5)はGly、Arg又はSer;
21番Xaa(X6)はArg、Lys、Gln又はSer;
22番Xaa(X7)はGly;
24番Xaa(X8)はHis、Thr又はTyr;
25番Xaa(X9)はHis又はTyr;
26番Xaa(X10)はAsp、Glu又はHis;
27番Xaa(X11)はTyr;及び
28番Xaa(X12)はAsp又はGlu
である。
16番Xaa(X1)はGly、Ser又はTyr;
17番Xaa(X2)はAsp又はGln;
18番Xaa(X3)はThr又はVal;
19番Xaa(X4)はThr又はVal;
20番Xaa(X5)はGlu又はThr;
21番Xaa(X6)はHis又はThr;
22番Xaa(X7)はTyr;
24番Xaa(X8)はAsn又はSer;
25番Xaa(X9)はArg;
26番Xaa(X10)はAsp又はGlu;
27番Xaa(X11)はTyr;
28番Xaa(X12)はAsp
である。
(a1)配列番号6、8、10、12、14、16、18及び20(図14、16、18、20、22、24、26及び28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列;
(a2)(a1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(a3)(a1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(a4)(a1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
(b1)配列番号22、24、26及び28(図30、32、34及び36)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列;
(b2)(b1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(b3)(b1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(b4)(b1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
(c1)配列番号30及び32(図38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列;
(c2)(c1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c3)(c1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(c4)(c1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
(a1)配列番号34、36、38、40、42、44、46、48及び96(図42、44、46、48、50、52、54、56及び106)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(a2)(a1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(a3)(a1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(a4)(a1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
(b1)配列番号50、52、54及び56(図58、60、62及び64)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(b2)(b1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(b3)(b1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(b4)(b1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
(c1)配列番号58及び60(図66及び68)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(c2)(c1)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c3)(c1)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(c4)(c1)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
3.KLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、及び、KLK5/KLK14阻害ペプチドの同定
KLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、及び、KLK5/KLK14阻害ペプチドは、SPINK2のアミノ酸配列又は本発明のKLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、及び、KLK5/KLK14阻害ペプチドの有するアミノ酸配列(例えば、上記(a1)、(b1)又は(c1)に記載のアミノ酸配列)、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトSPINK2変異体ライブラリーより、KLK5阻害活性、KLK5/KLK7阻害活性、又は、KLK5/KLK14阻害活性を指標としてそれぞれ同定することができ、KLK5、KLK5/KLK7、又は、KLK5/KLK14に対する結合活性もそれぞれ指標として組み合わせてもよい。
本発明は、KLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、又は、KLK5/KLK14阻害ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(以下、それぞれ「KLK5阻害ペプチドをコードする核酸分子」、「KLK5/KLK7阻害ペプチドをコードする核酸分子」又は「KLK5/KLK14阻害ペプチドをコードする核酸分子」という)、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子若しくはベクターが導入された細胞(以下、「KLK5阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」、「KLK5/KLK7阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」又は「KLK5/KLK14阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」という)、KLK5阻害ペプチド、KLK5/KLK7阻害ペプチド、又は、KLK5/KLK14阻害ペプチドを産生する細胞(以下、それぞれ「KLK5阻害ペプチド産生細胞」、「KLK5/KLK7阻害ペプチド産生細胞」又は「KLK5/KLK14阻害ペプチド産生細胞」という)をも提供する。
(a1)配列番号6、8、10、12、14、16、18及び20(図14、16、18、20、22、24、26及び28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号1乃至189からなるヌクレオチド配列、又は、配列番号5、7、9、11、13、15、17及び19(図13、15、17、19、21、23、25及び27)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列;
(a2)(a1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(a3)(a1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(a4)(a1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(b1)配列番号22、24、26及び28(図30、32、34及び36)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号21、23、25及び27(図29、31、33及び35)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号1乃至189からなるヌクレオチド配列;
(b2)(b1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b3)(b1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(b4)(b1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(c1)配列番号30及び32(図38及び40)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1乃至63からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号29又は31(図37又は39)記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号1乃至189からなるヌクレオチド配列;
(c2)(c1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(c3)(c1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(c4)(c1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
(a1)配列番号34、36、38、40、42、44、46、48及び96(図42、44、46、48、50、52、54、56及び106)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号33、35、37、39、41、43、45、47及び95(図41、43、45、47、49、51、53、55及び105)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列;
(a2)(a1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(a3)(a1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(a4)(a1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(b1)配列番号50、52、54及び56(図58、60、62及び64)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号49、51、53及び55(図57、59、61及び63)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列;
(b2)(b1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b3)(b1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(b4)(b1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK7阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列:
(c1)配列番号58及び60(図66及び68)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号57又は59(図65又は67)記載のヌクレオチド配列;
(c2)(c1)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(c3)(c1)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(c4)(c1)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つKLK5/KLK14阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
本発明は又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)を提供する。
7.KLK5、KLK5及びKLK7、又は、KLK5及びKLK14の分離法
本発明のペプチド又はコンジュゲートは、好適には、KLK5、KLK5及び/若しくはKLK7、又は、KLK5及び/若しくはKLK14に特異的な結合活性を有する。したがって、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、KLK5、KLK5及び/若しくはKLK7、又は、KLK5及び/若しくはKLK14と他のKLKが混在した試料中から、KLK5、KLK5及び/若しくはKLK7、又は、KLK5及び/若しくはKLK14を特異的に分離することができる。ペプチド又はコンジュゲートからのKLK5、KLK5及び/若しくはKLK7、又は、KLK5及び/若しくはKLK14の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いpH、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、KLK5、KLK5及び/若しくはKLK7、又は、KLK5及び/若しくはKLK14のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
(1−1)KLK5阻害ペプチド発現ベクターの構築
各阻害ペプチドのヌクレオチド配列(配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31)とSPINK2のヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマー及びKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30サイクル)により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー1:5’−AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG−3’(配列番号62:図70)
プライマー2:5’−AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA−3’(配列番号63:図71)
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)によりDNAを調製した。調製したDNA断片及びpET 32a(Novagen)を制限酵素BamHI(NEB)及びXhoI(NEB)を用いて、37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)により精製した。LigaFast Rapid DNA Ligation System(Promega)を用いて、それぞれの精製断片を室温で10分間反応させることでligation反応を実施した。Ligation溶液は、大腸菌JM109(TOYOBO)に添加し、氷上で30分間静置した後、42℃で45秒の熱処理、さらに氷上で5分間静置し、0.1mg/mLアンピシリンを含む2YTプレートに播種後、37℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、0.1mg/mLアンピシリンを含むTerrific Broth培地(Invitrogen)に植菌し、37℃で一晩培養後、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを回収し(以下、「miniprep処理」という)、配列解析を実施することで、pET 32a_Kex2_KLK5阻害ペプチドを構築した。
(1−1)で構築したベクターで大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)を形質転換し、0.1mg/mLアンピシリンを含む2YT培地を用いて37℃で培養後、IPTG(最終濃度1mM)を添加し、16℃で一晩培養した。翌日、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により集菌後、BugBuster Master Mix(Novagen)を用いてlysateを調製し、TALON Metal Affinity Resin(Clontech)を用いてHis tag融合目的蛋白質を精製した。次に、Kex2(Saccharomyces cerevisiae:Accession CAA96143)を用いてthioredoxin tagと所望の蛋白質とを切断し、TALONを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex75 10/300 GL)又は逆相クロマトグラフィー(YMC−Pack ODS−AM)に供することで、KLK5阻害ペプチド14種を調製した。該誘導体の有するアミノ酸配列は、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34(図14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40)に記載されている。
(2−1)ヒトKLK5、ヒトKLK7及びヒトKLK14発現ベクターの構築
ヒトpro−KLK5、ヒトpro−KLK7及びヒトpro−KLK14のクローニングに用いたプライマー並びにPCR条件は次の通り。下記プライマー及びKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30サイクル)により断片Aを増幅した。
プライマー3:5’−GGCGATTATAAAGATGACGATGATAAACACCATCACCACCATC−3’(配列番号64:図72)
プライマー4:5’−GTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGTTTATCATCGTCAT−3’(配列番号65:図73)
次に、ヒトpro−KLK5(Uniprot:Q9Y337)、ヒトpro−KLK7(Uniprot:P49862)、ヒトpro−KLK14(Uniprot:Q9P0G3)をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ鋳型として、下記プライマー及びKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 60秒)×30サイクル)により断片を増幅した。
プライマー5:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCACAGCTAGACCCCCT−3’(配列番号66:図74)
プライマー6:5’−CGTCATCTTTATAATCGCCGCTGTTGGCCTGGATGGTTTCCTG−3’(配列番号67:図75)
プライマー7:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCAGATCTCTGCTGCTGCCC−3’(配列番号68:図76)
プライマー8:5’−CGTCATCTTTATAATCGCCCCGGTGTTTCTTCATGGTGTCGTT−3’(配列番号69:図77)
プライマー9:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTCCTCCTCCTCACCGCCCTC−3’(配列番号70:図78)
プライマー10:5’−CGTCATCTTTATAATCGCCCTTGTCGCGCATGGTCTCCTCGAT−3’(配列番号71:図79)
プライマー5(配列番号66:図74)又はプライマー7(配列番号68:図76)又はプライマー9(配列番号70:図78)
プライマー11:5’−AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGT−3’(配列番号72:図80)
プライマー12:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGGAGTGTGGCTGCTGAGCCTG−3’(配列番号73:図81)
プライマー13:5’−AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGCCGGTGGGTCTTCATGGTTTCCATG−3’(配列番号74:図82)
プライマー14:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTTCTGCTGCTGATCATCCTG−3’(配列番号75:図83)
プライマー15:5’−AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGGTTGCTCTGCATGGTCCGCTGAA−3’(配列番号76:図84)
(2−1)で構築した発現ベクターは、PEI MAX 40000(Polysciences)を用いてExpi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)にトランスフェクションし、培養3日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE healthcare)を用いて培養上清から所望のHis tag融合タンパク質を回収し、Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck Millipore)を用いてPBSにバッファー交換することで、KLK5、ヒトpro−KLK7、ヒトpro−KLK14、マウスpro−KLK7、マウスpro−KLK14をそれぞれ精製した。
KLK活性化バッファー(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,10mM CaCl2,0.05%(w/w)Brij−35,pH7.5)で調製した200μg/mLのpro−KLK7又は14に等量の20μg/mLのthermolysinを添加し、37℃で一定時間反応後、100mM EDTAを等量混合することで活性化ヒトKLK7、活性化ヒトKLK14、活性化マウスKLK7、活性化マウスKLK14を調製した。
(3−1)KLK5阻害ペプチドのヒト/マウスKLK5、ヒト/マウスKLK7及びヒト/マウスKLK14阻害活性評価
基質ペプチドを10mMになるようDMSOで溶解し、Assay buffer(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH8.0)で希釈して使用した。Assay bufferで希釈したヒト/マウスKLK5、ヒト/マウスKLK7、又はヒト/マウスKLK14と阻害ペプチドをそれぞれ25μLずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を50μL加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各阻害ペプチドは終濃度0.098〜1,000nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(登録商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト株式会社)を使用した。
基質ペプチドの分解を指標に、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。(3−1)に記載の方法と同様、Assay bufferで希釈したプロテアーゼとサンプル(終濃度1μM)をそれぞれ25μLずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を50μL加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナルを測定した。尚、プロテアーゼ活性評価にはAssay buffer(50mM Tris,150mM NaCl,pH8.0)を用い、反応及び測定にはプロテオセーブ(登録商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト株式会社)を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。
KLK5阻害ペプチドの結合親和性を測定するため、BIAcore T 200(GE healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。一本鎖DNAが固定化されたSensor Chip CAP(GE healthcare)に、ストレプトアビジンコンジュゲートの相補鎖DNAをハイブリダイゼーションでキャプチャーさせた。次に、EZ−Link NHS−PEG4−Biotin(Thermo Fisher Scientific)を用いてビオチン化したKLK5を流速10μL/minでキャプチャーさせることで、約10RUを固定化した。その後、HBS−EPで2倍段階希釈したKLK5阻害ペプチド(0.625〜10nM)をアナライトとして流速30μL/minで添加した。BIAcore T 200 Evaluation software(version 2.0)において、simple one−to−one Langmuir binding modelでSingle cycle kineticsを用いて解析し、kon及びkoffを算出した。尚、解離定数KDはkoff/konの比率として算出した。さらに、Biotin CAPture Kit(GE healthcare)付属のRegeneration bufferでSensor Chip CAPを再生し、ビオチン化KLK5を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のKLK5阻害ペプチドを測定した。
後述の(5−2)で調製したKLK5阻害ペプチドFc融合体の結合親和性を測定するため、BIAcore T 200(GE healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。
(4−1)KLK5/KLK5阻害ペプチド複合体の調製
(1−2)及び(2−2)に記載した方法に従って、配列番号で示されるアミノ酸配列を有するKLK5阻害ペプチドK51034、及びKLK5をそれぞれ調製した。50mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH8.0の条件下で両者を混合後、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex 200 10/300 GL)により複合体を単離精製した。
(4−1)で調製した複合体溶液を12mg/mLまで濃縮後、リザーバー溶液(0.2M Magnesium Chloride hexahydrate,20%PEG3350)と1対1で混合し、蒸気拡散法により結晶化した。得られた立方体状の単結晶を、20%のグリセロールを含むリザーバー溶液に浸漬した後、液体窒素にて凍結した。凍結結晶をクライオ気流下でX線照射し、回折イメージを得た(Hypixel 6000HE/MicroMax007)。CrysAlisProを使用した解析により、最大分解能1.7Åのスケーリングデータを取得した。KLK5単体(PDB ID:2PSX)、及びSPINK2単体(PDB ID:2JXD)を鋳型とした分子置換法により位相を決定し、構造精密化後、分解能1.8ÅでKLK5/該ペプチドK51034の複合体結晶を決定した。単位格子中にはKLK5とSPINK2が各1分子ずつ含まれていた。SPINK2分子については、配列情報と観測された電子密度に基づき、KLK5との相互作用部位を含む部分的な分子モデルを構築した。当該KLK5阻害ペプチドK51034はKLK5酵素活性中心を含む領域へ結合していることが認められた(図4)。
(5−1)KLK5阻害ペプチドFc融合体発現ベクターの構築
各阻害ペプチドのヌクレオチド配列(配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31)を鋳型として、下記プライマー及びKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30サイクル)により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー16:5’−AGATGGGTGTTGTCTGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC−3’(配列番号81:図89)
プライマー17:5’−GCAGGGGCCATTCCGGAT−3’(配列番号82:図90)
プライマー18:5’−AAAATCTAGAGCCGCCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCT−3’(配列番号83:図91)
プライマー19:5’−AGACAACACCCATCTAGGAGCGGCCACCAGCAGCAGAAAGAACC−3’(配列番号84:図92)
プライマー20:5’−ATCCGGAATGGCCCCTGCGAACCCAAGAGCTGCGAC−3’(配列番号85:図93)
プライマー21:5’−AAAAGTTTAAACTCATTTGCCGGGGCTCAG−3’(配列番号86:図94)
(5−1)で構築した発現ベクターは、PEI MAX 40000(Polysciences)を用いてExpi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)にトランスフェクションし、培養6日後に培養上清を回収した。MabSelect SuRe(GE healthcare)を用いて培養上清から所望のFc融合体を回収し、Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck Millipore)を用いてPBSにバッファー交換することで、KLK5阻害ペプチドFc融合体を調製した。KLK5阻害ペプチド内に糖鎖付加配列を有するクローンは、1残基置換により糖鎖付加配列を除去し、糖鎖除去体を示すIDとして「dN」を付加した。尚、糖鎖付加配列の改変はKLK5阻害活性や交差性など、何ら活性に影響は与えない。
KLK5阻害ペプチドK50055のヌクレオチド配列(配列番号7)を鋳型として、下記プライマー及びKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 20秒)×30サイクル)により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー17:5’−GCAGGGGCCATTCCGGAT−3’(配列番号82:図90)
(5−3)で構築した発現ベクターは、PEI MAX 40000(Polysciences)を用いてExpi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)にトランスフェクションし、培養6日後に培養上清を回収した。MabSelect SuRe(GE healthcare)を用いて培養上清から所望のFc融合体を回収し、Amicon Ultra NMWL 10,000(Merck Millipore)を用いてPBSにバッファー交換することで、KLK5阻害ペプチドFc融合体D1−K50055−Fcを調製した。
(6−1)KLK5阻害ペプチドFc融合体のヒト/マウスKLK5、ヒト/マウスKLK7及びヒト/マウスKLK14阻害活性評価
実施例3−1に記載の方法に準じて、KLK5阻害ペプチドFc融合体の、ヒト/マウスKLK5、ヒト/マウスKLK7及びヒト/マウスKLK14に対する阻害活性を評価した。各濃度における各阻害ペプチドFc融合体の基質ペプチド分解速度を算出し、阻害ペプチドFc融合体濃度0nMの分解速度を100%としてGraphPad Prism(version 5.0;GraphPad Software Inc.)を用いて50%阻害濃度(IC50)を算出した結果、いずれの阻害ペプチドFc融合体も低濃度でヒトKLK5酵素活性を阻害することが明らかとなった(表4、図5、図107)。一部の阻害ペプチドFc融合体はヒトKLK7又はヒトKLK14酵素活性を低濃度で阻害し、また、一部の阻害ペプチドFc融合体はこれらのプロテアーゼに対して弱く阻害活性を示した。阻害ペプチドFc融合体は、マウスKLK5、KLK7又はKLK14に対しても同様の活性を示した(表5)。尚、IC50値の算出には、独立した3回の実験の平均値を使用した。
(3−2)の結果と同様、一部の阻害ペプチドFc融合体はbovine trypsin、キモトリプシン、plasminに対して、阻害ペプチド終濃度1μMで弱く交差性を示した(IC50値は1μM未満)が、大半の阻害ペプチドはKLKs以外のいずれのプロテアーゼに対しても阻害活性を示さなかった(図6)。一部の阻害ペプチドFc融合体はKLK4又はKLK12に対して終濃度1μMで阻害活性を示した(IC50値は1μM未満)が、多くの阻害ペプチドFc融合体はKLK7又はKLK14を除くKLKsに対してもプロテアーゼ阻害活性を示さなかった。よって、阻害ペプチドと同様、阻害ペプチドFc融合体は高い特異性を有していることが明らかとなった。
KLK5阻害ペプチドFc融合体の、ヒトKLK5に対する阻害活性を評価し、阻害定数Kiを算出した。基質ペプチドBoc−Val−Pro−Arg−AMC(R&D Systems;ES011)を10mMになるようDMSOで溶解し、Assay buffer(50mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH8.0)で希釈して終濃度25〜200μMで使用した。Assay bufferで希釈したヒトKLK5とKLK5阻害ペプチドFc融合体をそれぞれ25μLずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を50μL加えて、Enspireで蛍光シグナル(excitation 380nm/emission 460nm)を測定した。ヒトKLK5は終濃度10nM、KLK5阻害ペプチドFc融合体は終濃度0.5〜25nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(登録商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト株式会社)を使用した。
タンパク基質としてヒトDesmoglein1及びヒトDesmocollin1を用い、KLK5阻害ペプチドFc融合体のKLK5阻害活性を評価した。Assay bufferで希釈したヒトKLK5と各KLK5阻害ペプチドFc融合体(D3−K50032dN−Fc,D3−K50055−Fc,D3−K51072−Fc,又はD3−K50016dN−Fc)を混合し、37℃で1時間反応させた。次に、Assay bufferで希釈したタンパク基質を加えて37℃で4時間反応させた後、還元剤を含むSDSサンプルバッファーを添加し、99℃で5分間処理することで酵素反応を停止した。その後、SDS−PAGE(還元条件)及びWestern blot解析により、タンパク基質の分解を評価した。各基質と酵素、各阻害ペプチドFc融合体、Western blot解析用抗体の組み合わせは以下の通り。
(7−1)ネザートン症候群モデルマウス
ネザートン症候群の原因遺伝子であるSPINK5に変異を有するCrusty2マウスは、ネザートン症候群のモデルマウスとして知られ、そのホモマウスCrusty2(+/+)は皮膚症状を呈する(Mutagenetix database)。
Crusty2(+/−)マウスとCrusty2(+/+)マウスを人工授精で掛け合わせ、得られた産仔(Crusty2(+/−)マウス又はCrusty2(+/+)マウス)を用いて、(5−4)で作製したKLK5阻害ペプチドFc融合体D1−K50055−Fcを評価した。生後0又は1日後から、PBS又は100mg/kgのD1−K50055−Fcを1日おきに4週間皮下投与した。初回投与時のみローディングドーズとして3倍量のD1−K50055−Fcを投与した。VAPO SCAN(AS−VT100RS,株式会社アサヒテクノラボ)を用いて、投与2及び4週時点で、マウスの背中又は臀部の皮膚におけるTEWLを測定した(図7)。尚、PBS投与群又はD1−K50055−Fc投与群に問わず、Crusty2(+/−)マウスの例数は9、Crusty2(+/+)マウスの例数は12であった。
配列番号2:ヒトKLK5のアミノ酸配列(図10)
配列番号3:ヒトKLK7のアミノ酸配列(図11)
配列番号4:ヒトKLK14のアミノ酸配列(図12)
配列番号5:KLK5阻害ペプチドK50032のヌクレオチド配列(図13)
配列番号6:KLK5阻害ペプチドK50032のアミノ酸配列(図14)
配列番号7:KLK5阻害ペプチドK50055のヌクレオチド配列(図15)
配列番号8:KLK5阻害ペプチドK50055のアミノ酸配列(図16)
配列番号9:KLK5阻害ペプチドK51072のヌクレオチド配列(図17)
配列番号10:KLK5阻害ペプチドK51072のアミノ酸配列(図18)
配列番号11:KLK5阻害ペプチドK50016のヌクレオチド配列(図19)
配列番号12:KLK5阻害ペプチドK50016のアミノ酸配列(図20)
配列番号13:KLK5阻害ペプチドK51034のヌクレオチド配列(図21)
配列番号14:KLK5阻害ペプチドK51034のアミノ酸配列(図22)
配列番号15:KLK5阻害ペプチドK50062のヌクレオチド配列(図23)
配列番号16:KLK5阻害ペプチドK50062のアミノ酸配列(図24)
配列番号17:KLK5阻害ペプチドK51090のヌクレオチド配列(図25)
配列番号18:KLK5阻害ペプチドK51090のアミノ酸配列(図26)
配列番号19:KLK5阻害ペプチドK50098のヌクレオチド配列(図27)
配列番号20:KLK5阻害ペプチドK50098のアミノ酸配列(図28)
配列番号21:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51028のヌクレオチド配列(図29)
配列番号22:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51028のアミノ酸配列(図30)
配列番号23:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51005のヌクレオチド配列(図31)
配列番号24:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51005のアミノ酸配列(図32)
配列番号25:KLK5/KLK7阻害ペプチドK50031のヌクレオチド配列(図33)
配列番号26:KLK5/KLK7阻害ペプチドK50031のアミノ酸配列(図34)
配列番号27:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51057のヌクレオチド配列(図35)
配列番号28:KLK5/KLK7阻害ペプチドK51057のアミノ酸配列(図36)
配列番号29:KLK5/KLK14阻害ペプチドK51069のヌクレオチド配列(図37)
配列番号30:KLK5/KLK14阻害ペプチドK51069のアミノ酸配列(図38)
配列番号31:KLK5/KLK14阻害ペプチドK50015のヌクレオチド配列(図39)
配列番号32:KLK5/KLK14阻害ペプチドK50015のアミノ酸配列(図40)
配列番号33:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50032dN−Fcのヌクレオチド配列(図41)
配列番号34:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50032dN−Fcのアミノ酸配列(図42)
配列番号35:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50055−Fcのヌクレオチド配列(図43)
配列番号36:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50055−Fcのアミノ酸配列(図44)
配列番号37:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51072−Fcのヌクレオチド配列(図45)
配列番号38:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51072−Fcのアミノ酸配列(図46)
配列番号39:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50016dN−Fcのヌクレオチド配列(図47)
配列番号40:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50016dN−Fcのアミノ酸配列(図48)
配列番号41:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51034−Fcのヌクレオチド配列(図49)
配列番号42:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51034−Fcのアミノ酸配列(図50)
配列番号43:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50062−Fcのヌクレオチド配列(図51)
配列番号44:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50062−Fcのアミノ酸配列(図52)
配列番号45:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51090−Fcのヌクレオチド配列(図53)
配列番号46:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K51090−Fcのアミノ酸配列(図54)
配列番号47:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50098dN−Fcのヌクレオチド配列(図55)
配列番号48:KLK5阻害ペプチドFc融合体D3−K50098dN−Fcのアミノ酸配列(図56)
配列番号49:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51028−Fcのヌクレオチド配列(図57)
配列番号50:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51028−Fcのアミノ酸配列(図58)
配列番号51:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51005−Fcのヌクレオチド配列(図59)
配列番号52:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51005−Fcのアミノ酸配列(図60)
配列番号53:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K50031−Fcのヌクレオチド配列(図61)
配列番号54:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K50031−Fcのアミノ酸配列(図62)
配列番号55:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51057−Fcのヌクレオチド配列(図63)
配列番号56:KLK5/KLK7阻害ペプチドFc融合体D3−K51057−Fcのアミノ酸配列(図64)
配列番号57:KLK5/KLK14阻害ペプチドFc融合体D3−K51069dN−Fcのヌクレオチド配列(図65)
配列番号58:KLK5/KLK14阻害ペプチドFc融合体D3−K51069dN−Fcのアミノ酸配列(図66)
配列番号59:KLK5/KLK14阻害ペプチドFc融合体D3−K50015−Fcのヌクレオチド配列(図67)
配列番号60:KLK5/KLK14阻害ペプチドFc融合体D3−K50015−Fcのアミノ酸配列(図68)
配列番号61:SPINK2変異体ペプチドの一般式(図69)
配列番号62:プライマー1のヌクレオチド配列(図70)
配列番号63:プライマー2のヌクレオチド配列(図71)
配列番号64:プライマー3のヌクレオチド配列(図72)
配列番号65:プライマー4のヌクレオチド配列(図73)
配列番号66:プライマー5のヌクレオチド配列(図74)
配列番号67:プライマー6のヌクレオチド配列(図75)
配列番号68:プライマー7のヌクレオチド配列(図76)
配列番号69:プライマー8のヌクレオチド配列(図77)
配列番号70:プライマー9のヌクレオチド配列(図78)
配列番号71:プライマー10のヌクレオチド配列(図79)
配列番号72:プライマー11のヌクレオチド配列(図80)
配列番号73:プライマー12のヌクレオチド配列(図81)
配列番号74:プライマー13のヌクレオチド配列(図82)
配列番号75:プライマー14のヌクレオチド配列(図83)
配列番号76:プライマー15のヌクレオチド配列(図84)
配列番号77:KLK7基質ペプチド(図85)中のアミノ酸配列
配列番号78:ウシα−キモトリプシン基質ペプチド(図86)中のアミノ酸配列
配列番号79:ニュートロフィル・エラスターゼ基質ペプチド(図87)中のアミノ酸配列
配列番号80:ヒトプロテインC基質ペプチド(図88)中のアミノ酸配列
配列番号81:プライマー16のヌクレオチド配列(図89)
配列番号82:プライマー17のヌクレオチド配列(図90)
配列番号83:プライマー18のヌクレオチド配列(図91)
配列番号84:プライマー19のヌクレオチド配列(図92)
配列番号85:プライマー20のヌクレオチド配列(図93)
配列番号86:プライマー21のヌクレオチド配列(図94)
配列番号87:ヒトIgG1のFcのアミノ酸配列(図95)
配列番号88:ヒトSPINK5のD8のアミノ酸配列(図96)
配列番号89:ヒトSPINK5のD9のアミノ酸配列(図97)
配列番号90:ヒトSPINK9のアミノ酸配列(図98)
配列番号91:マウスKLK5のアミノ酸配列(図99)
配列番号92:マウスKLK7のアミノ酸配列(図100)
配列番号93:マウスKLK14のアミノ酸配列(図101)
配列番号94:プライマー22のヌクレオチド配列(図104)
配列番号95:KLK5阻害ペプチドFc融合体D1−K50055−Fcのヌクレオチド配列(図105)
配列番号96:KLK5阻害ペプチドFc融合体D1−K50055−Fcのアミノ酸配列(図106)
Claims (57)
- 下記(i)又は(ii)記載のアミノ酸配列を含み、活性型ヒトKLK5の有するプロテアーゼ活性を選択的に阻害するSPINK2変異体ペプチド:
(i)配列番号6、8、10、12、14、16、18及び20(図14、16、18、20、22、24、26及び28)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号34、40及び48(図42、48及び56)のいずれか一つのアミノ酸番号4〜66からなるアミノ酸配列。 - 3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項1記載のペプチド。
- 請求項1又は2記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3記載のポリヌクレオチド若しくは請求項4記載のベクターを含むか又は請求項1又は2記載のペプチドを産生する細胞。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、活性型KLK5の有するプロテアーゼ活性を阻害するSPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)請求項5記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程。 - 請求項1又は2記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、活性型KLK5の有するプロテアーゼ活性を阻害するSPINK2変異体ペプチドの製造方法。
- 請求項6又は7記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド。
- 請求項1、2及び8のいずれか一つに記載の第1ペプチドに1つ又は2つ以上の任意の
部分が結合してなるコンジュゲート。 - 1つの任意の部分が、SPINK2変異体ではない第2ペプチドを含む、請求項9記載のコンジュゲート。
- 第2ペプチドが、第1ペプチドのアミノ末端側に位置する、請求項10記載のコンジュゲート。
- 第2ペプチドが、第1ペプチドのカルボキシル末端側に位置する、請求項10記載のコンジュゲート。
- 第2ペプチドが抗体又はその断片であり、且つ1つ又は2つ以上のFc領域を含む、請求項12記載のコンジュゲート。
- Fc領域がヒト免疫グロブリンのFc領域又はその断片である、請求項13記載のコンジュゲート。
- Fc領域がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及び/又は、IgEのFc領域又はその断片である、請求項13又は14記載のコンジュゲート。
- Fc領域がヒトIgG1のFc領域又はその断片である、請求項13乃至15のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
- ヒトIgG1のFc領域が、配列番号87(図95)で示されるアミノ酸配列を含む、請求項16記載のコンジュゲート。
- Fc領域が野生型又は変異型である、請求項13乃至15のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
- アミノ末端に1乃至数個のアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸が付加してなる、請求項9乃至18のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
- 配列番号34、36、38、40、42、44、46、48及び96(図42、44、46、48、50、52、54、56及び106)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項9、10、及び、12乃至19のいずれか一つに記載の、ヒトKLK5の有するプロテアーゼ活性を選択的に阻害するコンジュゲート。
- 第1ペプチド及び第2ペプチドが、リンカーを介して結合している、請求項9、10及び12乃至20のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
- リンカーが、第1ペプチド及び第2ペプチドではない第3ペプチドである、請求項21記載のコンジュゲート。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、請求項9、10及び12乃至22のいずれか一つに記載のコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートを回収する工程。 - 請求項9、10及び12乃至22のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
- 請求項23又は24記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート。
- 請求項1、2又は8記載のペプチド、請求項3記載のポリヌクレオチド、請求項4記載のベクター、請求項5記載の細胞、及び/又は、請求項9、10、12乃至22及び25のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物。
- 請求項1、2又は8記載のペプチド、請求項3記載のポリヌクレオチド、請求項4記載のベクター、請求項5記載の細胞、並びに/又は、請求項9、10、12乃至22及び25のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項27記載の医薬組成物。
- 他の医薬品と組み合わせて使用される、請求項27又は28記載の医薬組成物。
- 請求項1記載のペプチドに特異的に結合する抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、請求項6、7、23及び24のいずれか一つに記載の方法。
- 配列番号34(図42)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号36(図44)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号38(図46)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号40(図48)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号42(図50)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号44(図52)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号46(図54)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号48(図56)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 配列番号96(図106)で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート。
- 請求項31記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項40記載の医薬組成物。
- 請求項32記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項42記載の医薬組成物。
- 請求項33記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項44記載の医薬組成物。
- 請求項34記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項46記載の医薬組成物。
- 請求項35記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項48記載の医薬組成物。
- 請求項36記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項50記載の医薬組成物。
- 請求項37記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項52記載の医薬組成物。
- 請求項38記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項54記載の医薬組成物。
- 請求項39記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はBarrett食道の治療又は予防のための、請求項56記載の医薬組成物。
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