JP6885598B2 - 未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法 - Google Patents

未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法 Download PDF

Info

Publication number
JP6885598B2
JP6885598B2 JP2017563896A JP2017563896A JP6885598B2 JP 6885598 B2 JP6885598 B2 JP 6885598B2 JP 2017563896 A JP2017563896 A JP 2017563896A JP 2017563896 A JP2017563896 A JP 2017563896A JP 6885598 B2 JP6885598 B2 JP 6885598B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
pou5f1
pluripotent stem
differentiation
transcription factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017563896A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2017131238A1 (ja
Inventor
実 洪
実 洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Publication of JPWO2017131238A1 publication Critical patent/JPWO2017131238A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6885598B2 publication Critical patent/JP6885598B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、多能性幹細胞の未分化性を低減させる方法であり、より詳しくは、多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化させる方法及び該分化させる方法に用いる分化誘導キットに関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2016-016785号優先権を請求する。
（多能性幹細胞の分化誘導について）
胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を分化誘導し、得られた細胞を用いる再生医療は国民の期待も大きく、早期の実現が待たれている治療法である。再生医療としては、iPS細胞由来の網膜色素上皮細胞移植治療が記憶に新しいが、細胞移植に適した成熟分化細胞を迅速かつ十分量作製する技術は、未だ発展途上であり開発の余地が大きい。
現在主流の多能性幹細胞から所望の細胞型への分化誘導法としては、各分化段階に適したサイトカイン・増殖因子を順次培地に添加し、胚様体や前駆細胞を経由させ分化させる方法である。この方法では、目的とする分化細胞を得るまでの培養期間が長いこと、分化誘導効率が高くないこと、異なる細胞系譜の細胞が混在することなどが問題となっている。
近年、組織特異的に発現する転写因子を単一又は複数組み合わせて、ES/iPS細胞に強制発現することにより細胞分化を方向づける試みが盛んに行われている。この転写因子を用いた分化誘導法は、ES/iPS細胞を直接目的の分化細胞へ誘導できるため、非常に有効な手段として期待されている。しかし、この手法をもってしても、細胞分化誘導効率が低いため、細胞の種類によっては、再生医療に必要な目的の分化細胞を十分量得るのが困難な状況である。
以上により、多能性幹細胞から目的の分化細胞をより迅速かつ均一、高効率に産生するための新たな分化誘導法の開発が求められていた。
（従来の多能性幹細胞の分化誘導の現状）
先行技術である非特許文献１〜４は、ES/iPS細胞の分化誘導を促進させるシステムであり、一例として、ES/iPS細胞を骨格筋に分化誘導することを開示している。
しかし、これらの分化誘導方法は、本発明の分化誘導方法とは明らかに異なる。
非特許文献５は、「マウスのES細胞を用いた研究で、転写因子であるOct3/4の発現を抑制すると、ES細胞から栄養外胚葉を誘導できること」を開示している。また、特許文献１は、「神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現量を制御することで、神経幹細胞から神経細胞およびグリア細胞などへの分化を調節できること」を開示している。
しかし、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に導入して、効率的に所望の細胞型に分化誘導する方法を開示又は示唆をしていない。
特開２００４−２３６６０７号公報
Nature medicine 13: 642-648. Cell stem cell 10: 610-619. Mol Ther. Nov;20(11):2153-67. PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540. Nat. Genet. 24 (4): 372-6.
従来の多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化する方法では、ヒトES/iPS細胞を用いた安定した高効率な分化誘導法は未確立であった。培養条件のコントロールや様々な細胞増殖因子・分化因子などを培養液に加えることによる段階的分化誘導法など多くの試みがなされてきたが、複雑な培養ステップの使用が大きな課題である。また、細胞分化のスピードが遅く、長期間の培養を必要とすること、さらに、分化効率が低いために必要な細胞数を十分量得ることが困難であることなども、大きな問題である。
本発明者らは、上記問題の一部は、多能性幹細胞が様々なメカニズムで細胞の未分化性を維持する性質を持っていることに起因していると推察した。そこで、多能性幹細胞の未分化性維持を低減させ、積極的に細胞型が分化方向に進む多能性幹細胞を作製し、短時間・高効率に所望の細胞型への分化誘導を行う方法を開発した。
さらに、多能性幹細胞の未分化性維持の低減だけでなく分化抵抗性を低減させることにより、より強力に短時間・高効率に所望の細胞型への分化誘導を行う方法を開発した。
以上により、本発明は完成した。
すなわち、本発明は以下からなる。
１．以下の（１）〜（８）のいずれか１を少なくとも含む多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させるための分化誘導キット、
（１）多能性幹細胞及びPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた多能性幹細胞、
（４）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び多能性幹細胞、
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている多能性幹細胞、
（６）POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞、
（７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞、及び
（８）多能性幹細胞並びにPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び脱メチル化酵素遺伝子。
２．前記POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子、及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である前項１に記載の分化誘導キット。
３．さらに、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を含む前項１又は２に記載の分化誘導キット。
４．前記転写因子の転写因子遺伝子は、センダイウイルスベクターに担持されている前項１〜３のいずれか１に記載の分化誘導キット。
５．以下の（１）〜（８）のいずれか１を少なくとも含む多能性幹細胞を骨格筋細胞へ分化させるための分化誘導キット、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞並びに転写因子であるMYOD1、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、転写因子であるMYOD1並びに多能性幹細胞、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた多能性幹細胞並びに転写因子であるMYOD1、
（４）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物、転写因子であるMYOD1並びに多能性幹細胞、
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている多能性幹細胞並びに転写因子であるMYOD1、
（６）POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞並びに転写因子であるMYOD1、
（７）転写因子であるMYOD1、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞、及び
（８）多能性幹細胞並びに転写因子であるMYOD1、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び脱メチル化酵素遺伝子。
６．以下の（１）〜（８）のいずれか１を少なくとも含む多能性幹細胞を神経細胞へ分化させるための分化誘導キット、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞並びに転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2並びに多能性幹細胞、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた多能性幹細胞並びに転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、
（４）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物、転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2並びに多能性幹細胞、
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている多能性幹細胞並びに転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、
（６）POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞並びに転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、
（７）転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞、及び
（８）多能性幹細胞並びに転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び脱メチル化酵素遺伝子。
７．以下の（１）〜（８）のいずれか１を少なくとも含む多能性幹細胞を肝細胞へ分化させるための分化誘導キット、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞並びに転写因子であるHNF1A、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、転写因子であるHNF1A並びに多能性幹細胞、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた多能性幹細胞並びに転写因子であるHNF1A、
（４）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物、転写因子であるHNF1A並びに多能性幹細胞、
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている多能性幹細胞並びに転写因子であるHNF1A、
（６）POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞並びに転写因子であるHNF1A、
（７）転写因子であるHNF1A、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞、及び
（８）多能性幹細胞並びに転写因子であるHNF1A、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び脱メチル化酵素遺伝子。
８．以下の（１）〜（６）のいずれか１に記載の前項３又は４に記載の分化誘導キット、
（１）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がMYOD1であり、かつ所望の細胞型が骨格筋細胞である、
（２）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がHNF1Aであり、かつ所望の細胞型が肝細胞である、
（３）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSOX9であり、かつ所望の細胞型が軟骨細胞である、
（４）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がRUNX2であり、かつ所望の細胞型が骨細胞である、
（５）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSPI1であり、かつ所望の細胞型が造血細胞である、及び
（６）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がASCL1であり、かつ所望の細胞型が神経細胞である。
９．以下の（１）〜（９）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させる方法、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（４）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞に添加する工程、
（５）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び所望の細胞型への分化に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程、
（７）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞に添加する工程、
（８）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
（９）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程。
１０．前記POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子、又はPOU5F1の抗体遺伝子である前項９に記載の分化方法。
１１．前記転写因子の転写因子遺伝子は、センダイウイルスベクターに担持されている前項９又は１０に記載の分化方法。
１２．以下の（１）〜（９）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を骨格筋細胞へ分化させる方法、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子であるMYOD1を多能性幹細胞に添加する工程、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子遺伝子であるMYOD1遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び転写因子であるMYOD1を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（４）転写因子であるMYOD1を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞に添加する工程、
（５）転写因子であるMYOD1を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び転写因子であるMYOD1を多能性幹細胞に添加する工程、
（７）転写因子であるMYOD1を、POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞に添加する工程、
（８）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素遺伝子及び転写因子であるMYOD1を多能性幹細胞に添加する工程、及び
（９）転写因子であるMYOD1を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程。
１３．以下の（１）〜（９）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を神経細胞へ分化させる方法、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を多能性幹細胞に添加する工程、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子遺伝子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（４）転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞に添加する工程、
（５）転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を多能性幹細胞に添加する工程、
（７）転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を、POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞に添加する工程、
（８）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素遺伝子及び転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を多能性幹細胞に添加する工程、及び
（９）転写因子であるNEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及び／又はNEUROD2を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程。
１４．以下の（１）〜（９）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる方法、
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子であるHNF1Aを多能性幹細胞に添加する工程、
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び転写因子遺伝子であるHNF1A遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び転写因子であるHNF1Aを担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
（４）転写因子であるHNF1Aを、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞に添加する工程、
（５）転写因子であるHNF1Aを、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び転写因子であるHNF1Aを多能性幹細胞に添加する工程、
（７）転写因子であるHNF1Aを、POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞に添加する工程、
（８）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素遺伝子及び転写因子であるHNF1Aを多能性幹細胞に添加する工程、及び
（９）転写因子であるHNF1Aを、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程。
１５．以下の（１）〜（６）のいずれか１に記載の前項９〜１１のいずれか１に記載の分化方法、
（１）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がMYOD1であり、かつ所望の細胞型が骨格筋細胞である、
（２）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がHNF1Aであり、かつ所望の細胞型が肝細胞である、
（３）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSOX9であり、かつ所望の細胞型が軟骨細胞である、
（４）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がRUNX2であり、かつ所望の細胞型が骨細胞である、
（５）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSPI1であり、かつ所望の細胞型が造血細胞である、及び
（６）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がASCL1であり、かつ所望の細胞型が神経細胞である。
本発明の多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化させる方法及び多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化させるための分化誘導キットは、少なくとも以下のいずれか１以上の効果を有する。
（１）多能性幹細胞から細胞分化に要する時間の短縮及び分化誘導効率の向上。
（２）多能性幹細胞への遺伝子導入に、遺伝子の修飾合成mRNAを使用するので、導入した遺伝子が多能性幹細胞のゲノムへ取り込まれることがなく、細胞分化誘導後に癌化などのリスクがない。
（３）修飾合成mRNAを用いた多能性幹細胞への遺伝子導入については、遺伝子mRNAの添加時期や回数を容易に変化させることができるので、各細胞型に特有の最適な条件を選択できる。
（４）多能性幹細胞の未分化性維持を低減させる方法及び分化抵抗性を低減させる方法を組み合わせることにより、相乗的な多能性幹細胞から細胞分化に要する時間の短縮及び分化誘導効率の向上。
本発明のPOU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞の分化誘導法の模式図。未分化性を司る遺伝子POU5F1をRNA干渉法で機能抑制した多能性幹細胞に対して、組織特異的な転写因子の修飾合成RNAを導入（添加）することにより、所望の細胞へと分化誘導を行うことができることを示す。 （a）本発明の多能性幹細胞の所望の細胞型への分化抵抗性を低減させる方法の模式図。(b)ヒトES又はiPS細胞からH3K27me3修飾が低減又は除去されることにより、転写因子（TF）が下流遺伝子のプロモーター部位に結合し、発生・分化関連遺伝子群の発現が亢進されて分化する。(c)脱メチル化酵素の修飾合成mRNAを導入後、転写因子（TF）の修飾合成mRNAを導入してヒトES細胞又はiPS細胞を分化誘導させる方法。(d)脱メチル化酵素及び転写因子（TF）の修飾合成mRNAを同時に導入してヒトES細胞又はiPS細胞を分化誘導させる方法。 標的遺伝子の修飾合成mRNAを使用した分化誘導法の略図。 標的遺伝子の修飾合成mRNAを使用した分化工程の略図。 標的遺伝子を多能性幹細胞のゲノムに導入する方法。 siRNAによるPOU5F1タンパク質の発現抑制。ヒトES細胞にPOU5F1に対するsiRNA(siPOU5F1)を導入し、POU5F1のタンパク質が減少していることを、特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって確認し（左図）、POU5F1及びNANOGのタンパク質が減少していることを、特異的抗体を用いた免疫染色法によって確認した（右図）。コントロールとして、どの遺伝子にも作用しないスクランブルsiRNA（siControl）を用いた。β-ACTINは「loading control」、DAPIは、「細胞核」を示す。 siPOU5F1による多能性幹細胞の形態変化。ヒトES細胞にsiPOU5F1を導入すると扁平な形へと変化したことを示す。 siPOU5F1と転写因子mRNAを共導入すると分化遺伝子が活性化されることを示す。siPOU5F1と組み合わせて、組織特異的な転写因子(MYOD1, HNF1A,RUNX2, SOX9, SPI1, ASCL1)の修飾合成RNA（synRNA）をヒトES細胞に導入すると各分化マーカー遺伝子（MYOG, AFP, COL1A1, COL2A1, CD45, NESTIN）の発現が上昇することをリアルタイムPCR法によって確認した。右側棒は、siPOU5F1を導入したときを示し、左側棒は、siControlを導入したときを示す。ネガティブコントロールのsynRNAとしてmCherryもしくはEmeraldを用いた。 siPOU5F1とMYOD1-synRNAによる骨格筋分化についてMyHC抗体を用いた免疫染色法により確認した。MYOD1単独（siControl + MYOD1)ではほとんど筋分化は起こらないが、siPOU5F1と組み合わせることにより、劇的に筋分化を誘導することを確認した。MyHCは「最終分化マーカー」、DAPIは「細胞核」を示す。 複数のES細胞株及びiPS細胞株でのsiPOU5F1とMYOD1-synRNAによる骨格筋分化についてMyHC抗体を用いた免疫染色法により確認した。ES細胞株であるH9株、4種類のiPS細胞株（201B7, 409B2, RIKEN-1A, tkDA3-4)においてもsiPOU5F1とMYOD1-synRNAを共発現させることによって、迅速かつ高効率に骨格筋分化を誘導できた。 siPOU5F1とHNF1A-synRNAによる肝細胞分化についてALBUMIN抗体及びAFP抗体を用いた免疫染色法により示す。DAPIは「細胞核」を示す。 脱メチル化酵素の強制的発現を組み合わせることにより、siPOU5F1による分化誘導がさらに促進されることがリアルタイムPCR法によって確認した。siPOU5F1と組織特異的な転写因子（MYOD1、HNF1A、SOX9、SPI1）によって活性化される分化マーカー遺伝子（MYOG、AFP、COL2A、CD45）の発現が脱メチル化酵素の強制的発現によって、さらに相乗的に増強されることを確認した。
本発明の多能性幹細胞の未分化性を低減させる方法（以後、「本発明の方法」と称する場合がある）は、多能性幹細胞の未分化性維持を低減させることができる方法、さらには多能性幹細胞の未分化性維持の低減だけでなく必要に応じて分化抵抗性を低減させることができる方法であれば特に限定されないが、以下で説明する。
（多能性幹細胞）
本発明の方法で使用する多能性幹細胞は、特に限定されないが、哺乳類由来が好ましく、特に好ましくはヒト由来である。例えば、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、又は、これらの任意の組み合わせであり、特に限定されず、組織や器官由来の組織幹細胞、皮膚の繊維芽細胞、さらには組織や器官に由来するあらゆる種類の細胞を含む。
（多能性幹細胞の未分化性維持を低減させる）
多能性幹細胞では、多能性幹細胞の未分化性維持には、転写因子であるPOU5F1（配列番号１、２：POU domain, class 5, transcription factor 1 isoform 1：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002692、別名：OCT3,OCT4,OTF3,OTF4, OTF-3,Oct-3,Oct-4, MGC22487）の発現が必須である。POU5F1は、生殖細胞や着床前初期胚といった多能性細胞で特異的に発現している。本発明の実施例では、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞に導入すれば、効率的に所望の細胞型に分化誘導できることを確認している（参照：図１）。すなわち、本発明の「多能性幹細胞の未分化性維持を低減させる」とは、多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させることを意味する。なお、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させることは、POU5F1の転写・翻訳のいずれかの段階の工程を阻害する及び／又は翻訳されたPOU5F1タンパク質活性を阻害することを含み、特に限定されない。
加えて、多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた状態は、該除去又は該低減させてない多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量（又はPOU5F1遺伝子の発現量）の程度と比較することにより、確認できる。例えば、多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた状態（程度）は、除去又は低減させてない多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量を１００とした場合と比較して、９５〜１、９０〜２、８５〜３、８０〜４、７５〜５、７０〜６、６５〜７、６０〜８、５０〜１０、４０〜１５、３０〜２０、約２５である。なお、多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量の程度は、市販の抗POU5F1抗体を使用することにより容易に測定することができ、また、POU5F1の遺伝子発現量を自体公知の方法により測定することもできる。
（多能性幹細胞の所望の細胞型への分化抵抗性を低減させる）
多能性幹細胞では、分化に関わる遺伝子群の各プロモーター領域に"Bivalentdomain"という特殊なクロマチン構造が形成されており、幹細胞性維持状態では容易に発生・分化に関わる遺伝子群が発現しないように待機状態にある。本発明者らは、「"Bivalent domain"からH3K27me3というヒストンメチル基修飾が取り除かれる又は低減させることにより、所望の細胞型への分化誘導に必要な分化遺伝子の発現が迅速かつ効率的に促進される」ことを確認している（参照：図２）。
すなわち、本発明の「多能性幹細胞の所望の細胞型への分化抵抗性を低減させる」とは、多能性幹細胞のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させることを意味する。
加えて、多能性幹細胞のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた状態は、該除去又は該低減させてない多能性幹細胞のH3K27me3修飾の程度と比較することにより、確認できる。例えば、多能性幹細胞のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた状態（程度）は、除去又は低減させてない多能性幹細胞のH3K27me3修飾の程度を１００とした場合と比較して、９５〜１、９０〜２、８５〜３、８０〜４、７５〜５、７０〜６、６５〜７、６０〜８、５０〜１０、４０〜２０、約３０である。なお、多能性幹細胞のH3K27me3修飾の程度は、市販の抗Histone H3K27me3抗体を使用することにより容易に測定することができるし、また、H3K27me3の遺伝子発現量を自体公知の方法により測定することもできる。
（本発明の多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化誘導する方法）
上記で述べたように、本発明の方法は、多能性幹細胞の未分化性維持を低減させる方法、さらには必要に応じて多能性幹細胞の所望の細胞型への分化抵抗性を低減させることができる方法であれば特に限定されないが、以下を例示することができる。
（標的遺伝子の修飾合成mRNAの使用）
本発明の方法では、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（POU5F1のsiRNA(small interfering RNA)を発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子、抗体遺伝子）、さらには、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子の遺伝子を多能性幹細胞に添加（導入）することを含む。
同様に、本発明の方法では、必要に応じてH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、さらには、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子の遺伝子を多能性幹細胞に添加（導入）することを含む。
なお、本明細書の「遺伝子」とは、二本鎖の核酸だけでなく、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各一本鎖、線状、環状を含み、さらに、特に言及しない限り、DNA、RNA 、mRNA、cDNA等を含む。
加えて、標的遺伝子とは、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、及び／又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子の両方を含む意味である。
本発明の方法の工程において、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）及び／又は所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加（導入）方法は、自体公知の方法を使用することができ、特に限定されない。好ましくは、宿主ゲノムへの遺伝子組込みのないフットプリントフリーな遺伝子強制発現法として、Warren, Rossiらが開発した合成mRNAを用いた遺伝子発現法（参照文献：Cell Stem Cell 7:618-630, 2010.）を使用し、転写因子合成mRNAを効率良くヒト多能性幹細胞に導入し分化誘導する方法（参照：図３）を使用する。
なお、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子の多能性幹細胞の添加時期は、特に限定されないが、好ましくは、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）を分化誘導に必要な転写因子の添加前に多能性幹細胞に添加することが好ましい。
さらに、各遺伝子（mRNA）の添加時期として、１２〜６４時間毎に１回以上、好ましくは、２〜５回、２〜４回、２〜３回、又は２回行うことを例示することができるが、特に限定されない。より具体的な方法は、以下に例示することができる。
（転写因子のアミノ酸配列をコードする修飾mRNAの合成）
文献「Warren et al., Cell Stem Cell, 2010 Nov5;7(5):618-30」に記載の方法を参照して、修飾mRNAを合成する。より詳しくは、mRNAは、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子のアミノ酸配列をコードするテンプレートDNAを修飾したdNTPsの混合物｛（dNTPs:3-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)GARCA cap analog, 5-methylcytidine triphosphate、及びpseudouridine triphosphate）｝を用いて、試験管内での転写により合成する。
（転写因子のアミノ酸配列をコードするセンダイウイルスベクターの作成）
哺乳類（特に、ヒト）の転写因子を発現するために、好ましくは、ヒト転写因子を発現可能なセンダイウイルスベクターを使用する。特に、Fタンパク質欠損等のセンダイウイルスベクターの変異体は、感染性が無く、操作が容易である（参照：Inoue et al., J Virol. 77: 23238-3246, 2003）。
（多能性幹細胞の所望の細胞型への高効率な分化誘導方法）
単一又は２以上の所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子のカクテルを調製する。転写因子の形態は、特に限定されず、合成mRNAs、転写因子（又は複数の転写因子）を組み込んだセンダイウイルスベクター、合成mRNAsを含むナノ粒子カプセルのいずれでも良い。
これらの単一又は２以上の転写因子のカクテルを細胞に導入する方法は、特に限定されず、リポフェクタミンによるトランスフェクション、ウイルス感染等を利用する。本発明の方法で利用することができる一例の分化誘導工程の略図を図４に示す。
（発現ベクターの使用）
本発明の方法の工程において、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）及び／又は所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を導入した自体公知の発現ベクターを使用することができる。本発明に用いる発現ベクターとしては、動物細胞発現プラスミドベクター、センダイウイルスベクター等を例示することができるが、特に限定されない。
上記合成mRNA及び発現ベクターを多能性幹細胞に導入する方法としては、特に制限されないが、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等を例示することができるが、特に好ましくは、リポフェクション法が挙げられる。
別方法として、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）は発現ベクターを使用し、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子は合成mRNAを使用することもできるし、その逆のパターンもできる。
（POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物）
本発明のPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物は、特に限定されないが、POU5F1のsiRNA、POU5F1のshRNA、POU5F1のアンチセンス鎖、POU5F1タンパク質に特異的に結合する抗体、阻害剤等である。
また、これらの化合物を単一で使用するだけではなく、複数の種類の化合物及び／又は低分子化合物を組み合わせることにより、効率的に「多能性幹細胞の未分化性を低減させる（多能性幹細胞のPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる）」ことができる。
（H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物）
本発明のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物は、特に限定されないが、脱メチル化酵素（特に、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を持つ脱メチル化酵素）、H3K27me3に特異的に結合する抗体、H3K27me3の修飾作用を持つポリコームタンパク質群（PcGタンパク質）の抗体、siRNA（特に、cationicsiRNA）、阻害剤等である。cationic siRNA は、transfectionのための試薬が不要である。
なお、低分子化合物としては、Valproic acid等のHistoneDeaceylase (HDAC)抑制剤を例示することができるが特に限定されない。
脱メチル化酵素としては、AOF (LSD1), AOF1 (LSD2), FBXL11 (JHDM1A),Fbxl10 (JHDM1B), FBXL19 (JHDM1C), KIAA1718 (JHDM1D), PHF2 (JHDM1E), PHF8(JHDM1F), JMJD1A (JHDM2A), JMJD1B (JHDM2B), JMJD1C (JHDM2C), JMJD2A (JHDM3A), JMJD2B(JHDM3B), JMJD2C (JHDM3C), JMJD2D (JHDM3D), RBP2 (JARID1A), PLU1 (JARID1B),SMCX (JARID1C), SMCY (JARID1D), Jumonji (JARID2), UTX (UTX), UTY (UTY), JMJD3(JMJD3), JMJD4 (JMJD4), JMJD5 (JMJD5), JMJD6 (JMJD6), JMJD7 (JMJD7), JMJD8(JMJD8)等を例示することができるが、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を持つ脱メチル化酵素として、JMJD3、UTX等が好ましい。
加えて、本発明の脱メチル化酵素は、以下も含む。
（１）上記いずれか１に記載の脱メチル化酵素の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体。
（２）上記いずれか１に記載の脱メチル化酵素と90％（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有し、かつ該脱メチル化酵素と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ酵素。
（３）上記いずれか１に記載の脱メチル化酵素において、１００〜１０個、５０〜３０個、４０〜２０個、１０〜５個、５〜１個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該脱メチル化酵素と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ酵素。
さらに、本発明の脱メチル化酵素の遺伝子は、以下を含む。
（１）上記いずれか１以上の酵素のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
（２）上記いずれか１以上の酵素のアミノ酸配列において、1〜20（又は、1〜15、1〜10、1〜7、1〜5、1〜3）個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ脱メチル化酵素と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（３）上記いずれか１以上の酵素のアミノ酸配列と90%（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有し、かつ脱メチル化酵素と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
変異を有する酵素は、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRと略称する）などを単独で又は適宜組合せて使用できる。
例えば成書に記載の方法（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ulmer, K.M.）、「サイエンス（Science）」、1983年、第219巻、p.666-671）を利用することもできる。ペプチドの場合、変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
（JMJD3）
JMJD3は、ヒストンのH3K27me3の脱メチル化酵素（マウスNP_001017426、ヒトNP_001073893）として知られており、完全長（NP_001073893、配列番号３）でも多能性幹細胞のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ。驚くべきことに、本発明者らは、JmjCドメイン｛配列番号４、触媒ドメイン：配列番号５（1376-1484番目のアミノ酸）｝を持つJMJD3cは、完全長JMJD3と比較して、より強くH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つことを確認している。
JMJD3の好ましい塩基配列は、配列番号３２に記載の塩基配列である。
加えて、本発明のJMJD3は、以下の態様も含む。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体。
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有し、かつ該JMJD3と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つアミノ酸配列。
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１００〜１０個、５０〜３０個、４０〜２０個、１０〜５個、５〜１個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該JMJD3と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つアミノ酸配列。
（４）配列番号４に記載のアミノ酸配列の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体。
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列と90％（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有し、かつJMJD3cと実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つアミノ酸配列。
（６）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１００〜１０個、５０〜３０個、４０〜２０個、１０〜５個、５〜１個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該JMJD3cと実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つアミノ酸配列。
（７）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、かつJMJD3cと実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つアミノ酸配列。
「配列相同性」とは、通常、アミノ酸配列の全体で70％以上、好ましくは80％、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上であることが適当である。
さらに、本発明のJMJD3遺伝子は、以下を含む。
（１）配列番号３〜５のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
（２）配列番号３〜５のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20（又は、1〜15、1〜10、1〜7、1〜5、1〜3）個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号３〜５に記載のアミノ酸配列と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（３）配列番号３〜５のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有し、かつ配列番号３〜５に記載のアミノ酸配列と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（４）配列番号６〜８、３２のいずれか１に記載の塩基配列からなる遺伝子。
（５）配列番号６〜８、３２のいずれか１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３〜５に記載のアミノ酸配列と実質的同質のH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（６）配列番号６〜８、３２のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50（又は、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、1〜5、1〜3）個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加している遺伝子。
（７）配列番号６〜８、３２のいずれか１に記載の塩基配列からなる遺伝子と90%（又は、92％、94％、96％、98％、99％）以上の相同性を有する遺伝子。
（所望の細胞型への高効率な分化誘導に必要な転写因子）
本発明の方法で使用する「所望の細胞型への高効率な分化誘導に必要な転写因子」の形態は、特に限定されないが、例えば、RNA, DNAなどの核酸、合成核酸、タンパク質等を例示することができるが特に限定されない。
また、本発明の方法において、所望の細胞型の例示として、骨格筋、肝臓（肝細胞）、神経細胞、軟骨細胞、骨細胞、造血細胞を例示することができる。
｛骨格筋（特に骨格筋に存在する細胞）の分化誘導に必要な転写因子｝
骨格筋の分化誘導方法は、以下の通りである。
MYOD1、NRF1、SALL4、ZIC1、KLF9、ZNF281、CTCF、HES1、HOXA2、TBX5、TP73、ERG、MAB21L3、PRDM1、NFIC、CTCFL、FOXP1、HEY1、PITX2、JUNB、KLF4、ESX1、TFAP2C、FOS、TFE3、FOSL1、GRHL2、TBX2、NFIB、IRF4から選択される単独、ないしは、２以上の転写因子を多能性幹細胞に導入する。特に、MYOD1を多能性幹細胞に導入することが好ましい。
｛肝臓（特に肝臓に存在する細胞である肝芽細胞）の分化誘導に必要な転写因子｝
肝臓（特に、肝臓、胎児肝臓）の分化誘導方法は、以下の通りである。
肝臓：HNF1A、TCF-1、SALL4、TGIF1、MAB21L3、ZIC1、EGFLAM、PITX2、HNF4A、NRF1、ZNF281、CTCFL、TP73、TFE3、DLX6、TCF4から選択される単独、ないしは、２以上の転写因子をヒト多能性幹細胞に導入する。
胎児肝臓：HNF1A、TCF-1、SIX5、HNF4A、SIN3A、ID1、HNF1Aから選択される単独、ないしは、２以上の転写因子をヒト多能性幹細胞に導入する。
特に、HNF1Aを多能性幹細胞に導入することが好ましい。
（神経細胞の分化誘導に必要な転写因子）
神経細胞の分化誘導方法は、以下の通りである。
NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、NEUROD1及びNEUROD2から選択される単独、ないしは、２以上、３以上、４以上、又は５の転写因子をヒト多能性幹細胞に導入する。
（標的遺伝子を多能性幹細胞のゲノムに導入する方法）
本発明の方法の工程において、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子）及び／又は所望の細胞型への高効率な分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞のゲノムに導入する方法は、自体公知の方法を使用することができ、特に限定されない。好ましくは、導入する遺伝子が積極的に多能性幹細胞（特に、ヒトES細胞ゲノム）に組み込まれるような仕組みとして、Woltjenらが開発したPiggyBacトランスポゼース認識配列（PB配列）に挟まれた発現カセット（参照文献：Nature 458:766-770, 2009.）を使用することができる。該発現カセットでは、薬剤選別カセットを導入することで、効率良く遺伝子組換え多能性幹細胞株を樹立できる系（参照：図５）である。
（標的タンパク質を多能性幹細胞に導入する方法）
本発明の方法の工程において、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物）（特に、タンパク質）及び／又は所望の細胞型への高効率な分化誘導に必要な転写因子（タンパク質）を多能性幹細胞のゲノムに導入する方法は、自体公知の方法を使用することができ、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、細胞膜透過ペプチドを付加した融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。
本発明の「細胞膜透過性ペプチド」は、細胞内に移行する性質、より詳しくは、細胞膜を透過する性質、さらに詳しくは、細胞膜又は核膜を透過して細胞質内又は核内に透過する性質を有するペプチドである。該ペプチドのアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、TAT（GRKKRRQRRRPQ：配列番号９）、r8｛rrrrrrrr (D体-R)：配列番号１０｝、MPG-8（βAFLGWLGAWGTMGWSPKKKRK：配列番号１１）を例示することができる。
なお、標的タンパク質とは、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物（又は、H3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物）（特に、タンパク質）及び／又は所望の細胞型への高効率な分化誘導に必要な転写因子（タンパク質）の両方を含む。
（遺伝子ノックアウト法）
上記以外の方法として、遺伝子ノックアウト法がある。遺伝子ノックアウト法により、「POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞」を作製することができる。「POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞」は、POU5F1遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって、POU5F1遺伝子の正常な発現が阻害されていること、その結果、POU5F1の発現が抑制され、POU5F1タンパク質が正常に発現していないことを意味する。
また、「POU5F1遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損している」における「全部」とは、POU5F1ゲノムDNAのタンパク質コーディング領域をいう。
また、「一部」とは、タンパク質コーディング領域の一部であって、POU5F1遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。
さらに、「改変」とは、単一又は複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は付加させることにより、ゲノムDNA中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
（多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化誘導するための分化誘導キット）
本発明の多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化誘導するための分化誘導キット（以後、「本発明のキット」と称する場合がある）は、以下のいずれか１以上の態様を含む。
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞
上記の本発明の方法により、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製可能である。
使用者は、該多能性幹細胞に、上述のように、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を導入することにより、容易に、所望の細胞型へ分化誘導することができる。
また、ドキシサイクリン等で誘導可能な遺伝子構築物がゲノムに挿入されていることで、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素等を一時的に強制発現することができる多能性幹細胞も対象である。
（２）本発明のキット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子
使用者は、キット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子を多能性幹細胞に添加することにより、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製可能である。
キット用抗POU5F1抗体遺伝子は、市販の抗体遺伝子等を例示することができるが、特に限定されない。
キット用脱メチル化酵素遺伝子は、脱メチル化酵素遺伝子（例えば、JMJD3c）のmRNA、DNA、タンパク質等を例示することができるが、特に限定されない。
（３）本発明のキット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を含む遺伝子
使用者は、キット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を含む遺伝子を多能性幹細胞に添加することにより、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製し、さらに所望の細胞型へ高効率に分化誘導させることができる。
なお、これらの遺伝子は、１つの遺伝子上に存在していても良いし、別の遺伝子上でも良い。別の遺伝子上であれば、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（又は、脱メチル化酵素遺伝子）と所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を同時又は別の時期に多能性幹細胞に添加することができる。
（４）本発明のキット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び／又は脱メチル化酵素
使用者は、キット用POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び／又は脱メチル化酵素を多能性幹細胞に添加することにより、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製可能である。
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物
使用者は、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに導入することにより、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並び／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製可能である。
なお、遺伝子構築物には、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子だけでなく、プロモーター配列、遺伝子発現向上配列、マーカー遺伝子、レポーター配列、薬剤耐性遺伝子等を必要に応じて含んでもよい。
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を担持した遺伝子構築物
使用者は、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに導入することにより、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びに／又はH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を容易に作製し、さらに所望の細胞型へ分化誘導させることができる。
なお、これらの遺伝子は、１つの遺伝子上に存在していても良いし、別の遺伝子上でも良い。別の遺伝子上であれば、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子と所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を同時又は別の時期に多能性幹細胞のゲノムで発現することができる。
なお、遺伝子構築物には、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び／又は脱メチル化酵素遺伝子並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子だけでなく、プロモーター配列、遺伝子発現向上配列、マーカー遺伝子、レポーター配列、薬剤耐性遺伝子等を必要に応じて含んでもよい。
（POU5F1以外の未分化性維持に関するタンパク質）
NANOG、SOX2、SOX3、KLF2、KLF4、KLF5、TBX3、ESRRB、SALL4、STAT3、ZIC3、LIN28及びTCF3は、未分化性維持に関するタンパク質として知られている。よって、NANOG、SOX2、SOX3、KLF2、KLF4、KLF5、TBX3、ESRRB、SALL4、STAT3、ZIC3、LIN28及びTCF3のタンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞は、所望の細胞型へ高効率に分化させることができると考えられる。
さらに、上記記載のいずれか１以上のタンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞（上記記載のいずれか１以上のタンパク質発現量を実質的に除去又は低減させた、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞）も本発明の対象とする。
加えて、上記記載のいずれか１以上のタンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子（さらには、脱メチル化酵素遺伝子等）並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程を含む多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させる方法も本発明の対象とする。
本開示の多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させる方法では、下記の（１）〜（９）のいずれか１に記載の工程を含む方法を例示することができるが、特に限定されない。
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程。
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程。
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程。
（４）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞に添加する工程。
（５）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程。
（６）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物及び所望の細胞型への分化に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程。
（７）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1遺伝子が破壊された多能性幹細胞に添加する工程。
（８）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、脱メチル化酵素遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を多能性幹細胞に添加する工程。
（９）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程。
本開示では、以下のいずれか１の所望の細胞型分化用多能性幹細胞も対象とする。
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（４）POU5F1遺伝子が破壊された、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
本開示では、以下のいずれか１の所望の細胞型分化用多能性幹細胞の使用も対象とする。
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（４）POU5F1遺伝子が破壊された、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
本開示では、以下のいずれか１の所望の細胞型分化用多能性幹細胞を、多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させるための分化誘導キットの製造としての使用も対象とする。
（１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を強制発現させた、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子を担持した遺伝子構築物がゲノムに挿入されている、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（４）POU5F1遺伝子が破壊された、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
（５）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する、所望の細胞型分化用多能性幹細胞。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、全ての本実施例は、慶應義塾大学医学部の倫理委員会によって承認されている。
（材料及び方法）
以下に記載の材料及び方法を使用して実施例２〜６を行った。詳細は、以下の通りである。
（ヒト多能性幹細胞培養及び分化誘導方法）
ヒトES細胞(hESC)株であるSEES-3及びH9は、それぞれ国立成育医療研究センター（National Research Institute for Child Health and Development）及びアメリカのCell Research Instituteから入手した。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)株は、理化学研究所又は京都大学iPS細胞研究所から入手した。hESC/iPSCは、iMatrix-511（ニッピ）コーティングプレート上にStemFit AK-03培地（味の素）を用いて、フィーダー細胞を使用せず培養した。ROCK(Rho-associatedcoiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤Y-27632は、継代時の細胞解離により誘導されるアポトーシスを抑えるために、細胞継代中に培地に添加した。
筋原性分化のために、hESC/iPSCは、iMatrix-511コーティングプレート上に、5% KSR、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸アミノ酸、2 mMグルタミン、0.1 mM βメルカプトエタノール、及びペニシリン/ストレプトマイシン（50 U/50 μg/ml）を添加したαMEM（Gibco）の培地中で培養した。
アルブミン分泌肝細胞分化のために、hESC/iPSCは、Matrigel（BD）コーティングプレート上に、上記培地中で培養後、1 mM NaB, 100ng/ml ActivinA, 50 ng/ml Wnt3a, 1x B27, 2 mM GlutaMAXを添加したRPMI1640培地で1日培養し、次に1%DMSO, 0.5 mM MTG, 1% NEAA, 1mM GlutaMAX, 20% KSRを添加したDMEM培地で5日培養し、最後に 20 ng/ml HGF, 20 ng/ml OncostatinM, HCM培地(Lonza)で7日培養した。
（siRNAの導入）
POU5F1に対するsiRNA（センス鎖GCCCGAAAGAGAAAGCGAATT：配列番号１２、アンチセンス鎖UUCGCUUUCUCUUUCGGGCCT：配列番号１３）は、文献「Proceeding of national academy of sciences 109, 4485-4490 (2012)」で使用されている同一のものをApplied Biosystemsから購入して使用した（製品番号：s10873）。ネガティブコントロールのsiRNAについてもApplied Biosystemsから購入して使用した。siRNA導入は、添付の説明書の指示に従って、LipofectamineMessenger Max（Invitrogen）を用いて行った。導入細胞の生存率を向上させるために、B18Rインターフェロン阻害剤（eBioscience）を、培養培地に添加した。培地は、各導入の2〜3時間後に交換した。
（修飾mRNA合成及び導入）
mRNAを合成するテンプレートの調製のために、赤色蛍光タンパク質mCherry、緑色蛍光タンパク質Emerald及び組織特異的な転写因子｛MYOD1（配列番号２６）, HNF1A（配列番号２７）, RUNX2（配列番号２８）, SOX9（配列番号２９）, SPI1（配列番号３０）及びASCL1（配列番号３１）｝ のタンパク質コーディング領域(Open Reading Frame, ORF)をmRNA安定性及び翻訳効率を増加させるマウスαグロビンの5' UTR及び3' UTRを含むpCRIIコンストラクトにサブクローニングした。
修飾mRNAは、文献「Cell stem cell 7,618-630 (2010)」の記載を基にして合成された。簡単に言及すると、T7プロモーターとポリA末端は、KAPA taq kit（Kapabiosystems）を用いてPCR反応で添加した。RNAは、ARCAcap analog（New England Biolabs）、ATP、GTP、5-Methyl-CTP（TriLink）、及びpseudo-UTP（TriLink）と共に、MEGAscript T7 kit（Ambion）を用いて、PCR産物から合成した。合成mRNAは、MEGAclear kit（Ambion）を用いて精製した。合成mRNA導入は、添付の説明書の指示に従って、Lipofectamine MessengerMax（Invitrogen）を用いて行った。導入細胞の生存率を向上させるために、B18Rインターフェロン阻害剤（eBioscience）を、培養培地に添加した。培地は、各導入の2〜3時間後に交換した。
（抗体）
以下の抗体を使用した。
POU5F1（Santa Cruz, sc-5279）
β-ACTIN（Cell Signaling, 4970S）
MyHC（R&D MAB4470）
ALBUMIN（Abcam ab10241）
AFP（R&D MAB1368）
（免疫染色）
細胞は、4%PFA中で10分間室温で固定し、そして、0.5% Triton-X含有PBS中で10分間透過処理した。細胞は、2%BSA含有PBS中で10分間ブロッキングし、そして、ブロッキング溶液中で１次抗体（1:500）と共に2〜3時間室温で若しくは一晩4℃で培養した。細胞は、PBS中で2回洗浄した後、ブロッキング溶液中でAlexa色素結合2次抗体（1:500；Invitrogen）と共に、1時間室温で培養した。核は、DAPI（Dako）で対比染色した。免疫蛍光は、倒立蛍光顕微鏡IX73（オリンパス）を用いて可視化した。画像は、オリンパスcellSensイメージングソフトウェアを用いて得た。
（免疫ブロット法）
細胞は、サンプルバッファー（50 mM Tris-HCl pH6.8、2% SDS、6% 2-メルカプトエタノール、500 mg/ml尿素）で溶解した。タンパク質は、4-15%ポリアクリルアミドゲル（Biorad）を用いたSDS-PAGEにより分離し、そして、ポリフッ化ビニリデンメンブレン（Biorad）に電気的に転写した。メンブレンは、1時間、0.1% Tween-20含有Tris-buffered saline（TBST）及び5%スキムミルク中でブロッキングした。メンブレンは、TBST中で洗浄し、その後2% BSA含有TBS中で、2〜3時間室温で若しくは一晩4℃で1次抗体（1:1000で希釈）と共に培養した。メンブレンは、洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合2次抗体（GE）と共に1時間室温で培養した。メンブレンは、TBST中で洗浄し、そして、免疫反応性は、ECL Prime Detection Kit（GE）を用いて可視化し、さらにLuminescent Image Analyzer（LAS-4000; Fujifilm）を用いて検出した。
（qRT-PCR）
全RNAは、TRIzol reagent（Invitrogen）で単離し、そして、cDNAは、ReverTra Ace kit（東洋紡）を用いて、ランダムヘキサマーを用いて生成した。リアルタイムPCRは、SYBR Green PCR system（タカラ）を用いて行った。RT-PCR用プライマー配列を、以下に示す。
MYOGプライマー（Forward）：gccagactatccccttcctc（配列番号１４）
MYOGプライマー（Reverse）：gaggccgcgttatgataaaa（配列番号１５）
AFPプライマー（Forward）：tgggacccgaactttcca（配列番号１６）
AFPプライマー（Reverse）：ggccacatccaggactagtttc（配列番号１７）
COL1A1プライマー（Forward）：cctggatgccatcaaagtct（配列番号１８）
COL1A1プライマー（Reverse）：tcttgtccttggggttcttg（配列番号１９）
COL2A1プライマー（Forward）：tttcccaggtcaagatggtc（配列番号２０）
COL2A1プライマー（Reverse）：cttcagcacctgtctcacca（配列番号２１）
CD45プライマー（Forward）：tcctggactcccaaaatctg（配列番号２２）
CD45プライマー（Reverse）：accttgaacccgaacatgag（配列番号２３）
NESTINプライマー（Forward）：tggttttccagagtcttcagtga（配列番号２４）
NESTINプライマー（Reverse）：gaaacagccatagagggcaaa（配列番号２５）
（POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞）
本実施例では、POU5F1タンパク質の発現量を強制的に低減させた多能性幹細胞が作製できるかを確認した。詳細は、以下の通りである。
（siRNA導入によるPOU5F1の発現抑制の確認）
ヒトES細胞のPOU5F1に対するsiRNA(siPOU5F1)の効果を免疫ブロット法及び免疫染色法によって確認した（図６）。siPOU5F1を導入後3日目の細胞を解析したところ、ネガティブコントロールsiRNA(POU5F1に対するスクランブルsiRNA配列：siControl)を導入した細胞に比べて、POU5F1タンパク質が顕著に減少していることを確認した（図６）。siPOU5F1導入により、多能性幹細胞の分子マーカーであるNANOGタンパク質が減少した。
よって、siPOU5F1導入による多能性の消失を確認した。
（siPOU5F1導入によるヒトES細胞の形態変化の確認）
ヒトES細胞は未分化性を維持しているときは、小さく丸い形をしている。siPOU5F1を導入すると細胞の形態が扁平な形に変化しており、POU5F1抑制によって分化方向に促進されていることを確認した（図７）。
本実施例により、POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞が作製できていること、さらには該細胞が分化方向に促進されていることを確認した。
（POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞の所望の細胞型への分化誘導確認）
本実施例では、POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞に所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を導入（添加）することにより、所望の細胞型への分化誘導が起るかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
siPOU5F1及び組織特異的な転写因子の修飾合成RNA（synRNA）をヒトES細胞に導入し、分化マーカー遺伝子MYOG（骨格筋）、AFP（肝細胞）、COL1A1（骨細胞）、COL2A1（軟骨）、CD45（造血細胞）及びNESTIN（神経）の発現をリアルタイムRT-PCR法によって調べた。
組織特異的な転写因子として、MYOD1（骨格筋）、HNF1A（肝臓）、RUNX2（骨細胞）、SOX9（軟骨）、SPI1（血液）及びASCL1（神経）を用いた。ネガティブコントロールとしてmCherry又はEmeraldのsynRNAを導入した。
siControl又はsiPOU5F1とsynRNAを同時に細胞へ導入（添加）し、1日後にさらに2回synRNAを導入した。その翌日（最初の導入の２日後）に細胞をサンプリングして解析を行った。培地は未分化性維持用の培地を用いた。その結果、siPOU5F1と転写因子を組み合わせて導入すると各組織の分化マーカーの発現が顕著に上昇していることを確認した（図８）。しかし、siControlや転写因子を単独で導入しても、分化マーカーの発現上昇はほとんど検出できなかった（図８）。
本実施例により、POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞に所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を導入（添加）することにより、所望の細胞型への分化誘導が効率的に起ることを確認した。
（POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞の所望の細胞型への分化確認）
本実施例では、所望の細胞型への分化誘導の例として、筋形成を制御するマスター転写因子であるMYOD1を用いた筋形成分化（骨格筋細胞分化）のモデル並びにHNF1A（hepatocyte nuclear factor-1-alpha）を用いた肝細胞分化のモデルを採用した。なお、hESCにおけるMYOD1単独の強制発現は、エピジェネティックな変化及び転写変化の不足により、筋形成までの分化に向かうことが困難であることが知られている（参照：Cell reports 3, 661-670 (2013)）。
（骨格筋細胞分化）
siControl又はsiPOU5F1とMYOD1のsynRNA（MYOD1-synRNA）を同時にヒトES細胞に導入して、1日後にさらに2回、MYOD1-synRNAを導入した。このとき該細胞を骨格筋分化培地で培養した。
最初の導入の２日後に行った最後のsynRNA導入後の翌々日に細胞を固定し、免疫染色を行った。siControlを導入したES細胞では、MYOD1-synRNAを導入しても形態変化は殆ど起こらず、骨格筋の最終分化マーカーであるMyosin Heavy Chain（MyHC）を発現している細胞はわずかであった（図９）。
しかしながら、siPOU5F1を導入したES細胞を用いると、最後のMYOD1-synRNA導入から2日後には、線維状の筋細胞が高頻度で出現し、殆どの細胞がMyHC陽性を示し、骨格筋細胞に分化したことを確認した（図９）。
加えて、別のES細胞株（H9 hES細胞）及び複数のiPS細胞株（201B7 iPS細胞、409B2iPS細胞、RIKEN-1A iPS細胞及びtkDA3-4iPS細胞）でも同様の効果を得ることができた（図１０）。
（肝細胞分化）
siControl又はsiPOU5F1とHNF1AのsynRNA（HNF1A-synRNA）を同時にヒトES細胞に導入して、1日後にさらに2回、HNF1A-synRNAを導入した。最初の導入の２日後に行った最後のsynRNA導入の翌日から肝細胞分化培地で培養して13日後に細胞を固定し、免疫染色を行った。siControlを導入したES細胞では、HNF1A-synRNAを導入しても肝細胞の分化マーカーであるAFPやALBUMIN（ALB）を発現している細胞はほとんど観察できなかった（図１１）。 しかしながら、siPOU5F1とHNF1A-synRNAを導入した細胞では、ALBUMIN及びAFPが発現している細胞が多くみられ、肝細胞へと分化していることが確認できた（図１１）。
本実施例により、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子をPOU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞に導入すれば、効率的に所望の細胞型に分化誘導できることを確認した。
（POU5F1タンパク質の発現量を低減させた及び脱メチル化酵素を強制的に発現させた多能性幹細胞の所望の細胞型への分化誘導確認）
本発明者らは、脱メチル化酵素を強制的に発現させた多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の分化抵抗性を消失させ、分化誘導を促進することを確認している。なお、POU5F1タンパク質の発現量を低減させる分子機構は、脱メチル化酵素を強制的に発現させる分子機構とは異なる。
そこで、POU5F1タンパク質の発現量の低減及び脱メチル化酵素の強制的な発現を組み合わせたPOU5F1タンパク質の発現量を低減させた及び脱メチル化酵素を強制的に発現させた多能性幹細胞に所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子を導入（添加）することにより、所望の細胞型への分化誘導が起るかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
所望の細胞型には、組織特異的な転写因子MYOD1、HNF1A、SOX9、SPI1のsynRNAを使って分化誘導を行った。
POU5F1タンパク質の発現量の低減又は脱メチル化酵素の強制的な発現のどちらかのみをsynRNAと組み合わせて分化させるよりも、POU5F1タンパク質の発現量の低減及び脱メチル化酵素の強制的な発現を組み合わせて分化させることによって、分化マーカー遺伝子MYOG（骨格筋）、AFP（肝細胞）、COL2A1（軟骨）、CD45（造血細胞）の発現が相乗的に上昇することを確認した（図１２）。
より詳しくは、POU5F1タンパク質の発現量の低減及び脱メチル化酵素の強制的な発現を組み合わせることにより、POU5F1タンパク質の発現量を低減した場合と比較して、MYOGの発現が約18.2倍、AFPの発現が約5.2倍、COL2A1の発現が約2.8倍、及びCD45の発現が約2.2倍上昇した。
さらに、POU5F1タンパク質の発現量の低減及び脱メチル化酵素の強制的な発現の組み合わせは、脱メチル化酵素の強制的な発現した場合と比較して、MYOGの発現が約4.3倍、AFPの発現が約54.0倍、COL2A1の発現が約2.8倍、及びCD45の発現が約4.5倍上昇した。
加えて、肝細胞分化誘導において、POU5F1タンパク質の発現量の低減は、脱メチル化酵素の強制的な発現と比較して、約10.4倍発現が高かった。これにより、肝細胞分化誘導に関しては、POU5F1タンパク質の発現量の低減は、脱メチル化酵素の強制的な発現と比較して、優れた効果を示した。
本実施例により、POU5F1タンパク質の発現量を低減させ及び脱メチル化酵素を強制的に発現させた多能性幹細胞は、POU5F1タンパク質の発現量を低減させた多能性幹細胞及び脱メチル化酵素を強制的に発現させた多能性幹細胞と比較して、相乗的な分化誘導効果（顕著な効果）を有することを確認した。
（本開示の多能性幹細胞を使用した所望細胞型への分化の例示）
本実施例では、実施例３の記載の実施例を基にして、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を使用して各所望細胞型への分化を確認した。
（骨格筋細胞への分化）
４日間の培養中において、siPOU5F1と MYOD１遺伝子（配列番号３３、配列番号３４）を同時にヒト多能性幹細胞に1回導入して、続いてMYOD１遺伝子を３回導入した。4日間の培養で、骨格筋細胞に分化していることを確認した。
（肝細胞への分化）
１２日間の培養中において、siPOU5F1とHNF1A遺伝子（配列番号３５、配列番号３６）を同時にヒト多能性幹細胞に1回導入して、続いてHNF1A遺伝子を２回導入した。１２日間の培養で、肝細胞に分化していることを確認した。
（神経細胞への分化）
５日間の培養中において、siPOU5F1を、ヒト多能性幹細胞に１回導入し、続いてNEUROG1遺伝子（配列番号３７、配列番号３８）、NEUROG2遺伝子（配列番号３９、配列番号４０）、NEUROG3遺伝子（配列番号４１、配列番号４２）、NEUROD1遺伝子（配列番号４３、配列番号４４）及びNEUROD2遺伝子（配列番号４５、配列番号４６）を３回導入する。この５日間の培養で、神経細胞へ分化させることができる。
（センダイウイルスベクターを使用して本開示の多能性幹細胞を使用した所望細胞型への分化の例示）
本実施例では、実施例３とは異なり、合成修飾mRNAではなくセンダイウイルスベクターを使用して、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた多能性幹細胞を使用して各所望細胞型への分化を確認する。
（骨格筋細胞への分化）
自体公知のセンダイウイルスベクター（33℃で働き、37℃で失活する）に、転写因子であるMYOD１遺伝子（配列番号３３、配列番号３４）をクローニングしたものを用いる。
ヒトES細胞又はiPS細胞の懸濁液にこのセンダイウイルスベクターを MOI (multiplicity of infection) 1〜100（25）で感染させる。その後、細胞を培養プレートに移し、33℃に保ったCO2 incubatorに3日間細胞を培養する。その後、37℃のCO2 incubatorに移し、培養を続けると、分化細胞である骨格筋細胞を観察できる。
（肝細胞への分化）
自体公知のセンダイウイルスベクターに、転写因子であるHNF1A遺伝子（配列番号３５、配列番号３６）をクローニングしたものを用いる。
ヒトES細胞又はiPS細胞の懸濁液にこのセンダイウイルスベクターを MOI 1〜100（25）で感染させる。その後、細胞を培養プレートに移し、33℃に保ったCO2 incubatorに3日間細胞を培養する。その後、37℃のCO2incubatorに移し、培養を続けると、分化細胞である肝細胞を観察できる。
（神経細胞への分化）
自体公知のセンダイウイルスベクターに、転写因子であるNEUROG3遺伝子（配列番号４１、配列番号４２）をクローニングしたものを用いる。
ヒトES細胞又はiPS細胞の懸濁液にこのセンダイウイルスベクターを MOI 1〜100（25）で感染させる。その後、細胞を培養プレートに移し、33℃に保ったCO2 incubatorに3日間細胞を培養する。その後、37℃のCO2incubatorに移し、培養を続けると、分化細胞である神経細胞（運動ニューロン）を観察できる。
（総論）
以上の実施例により、本発明の多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化させる方法及び多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化させるための分化誘導キットは、少なくとも以下のいずれか１の効果を有することを確認した。
（１）多能性幹細胞から細胞分化に要する時間の短縮及び分化誘導効率の向上。
（２）多能性幹細胞への遺伝子導入に、遺伝子の修飾合成mRNAを使用するので、導入した遺伝子が多能性幹細胞のゲノムへ取り込まれることがなく、細胞分化誘導後に癌化などのリスクがない。
（３）修飾合成mRNAを用いた多能性幹細胞へ遺伝子導入については、遺伝子mRNAの添加時期や回数を容易に変化させることができるので、各細胞型に特有の最適な条件を選択できる。
（４）多能性幹細胞の未分化性維持を低減させる方法及び分化抵抗性を低減させる方法を組わせることにより、相乗的な多能性幹細胞から細胞分化に要する時間の短縮及び分化誘導効率の向上。
本発明では、新規な多能性幹細胞を所望の細胞型へ高効率に分化する方法を提供できる。

Claims (17)

  1. 以下の（１）〜（８）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させる方法、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、
    （２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物、並びに所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （４）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素の発現量を実質的に増加させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （５）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （６）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を、POU5F1遺伝子が破壊され、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子が増加された多能性幹細胞に添加する工程、
    （７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
    （８）所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化方法。
  2. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項１に記載の分化方法。
  3. 前記転写因子遺伝子は、センダイウイルスベクターに担持されている請求項１又は２に記載の分化方法。
  4. 以下の（１）〜（６）のいずれか１に記載の請求項１〜３のいずれか１項に記載の分化方法、
    （１）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がMYOD1であり、かつ所望の細胞型が骨格筋細胞である、
    （２）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がHNF1Aであり、かつ所望の細胞型が肝細胞である、
    （３）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSOX9であり、かつ所望の細胞型が軟骨細胞である、
    （４）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がRUNX2であり、かつ所望の細胞型が骨細胞である、
    （５）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSPI1であり、かつ所望の細胞型が造血細胞である、及び
    （６）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がASCL1であり、かつ所望の細胞型が神経細胞である。
  5. 以下の（１）〜（８）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を骨格筋細胞へ分化させる方法、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、
    （２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物、並びに骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （４）骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素の発現量を実質的に増加させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （５）骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （６）骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を、POU5F1遺伝子が破壊され、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子が増加された多能性幹細胞に添加する工程、
    （７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
    （８）骨格筋細胞への分化誘導に必要な転写因子ＭＹＯＤ１遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化方法。
  6. 以下の（１）〜（８）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる方法、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、
    （２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物、並びに肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （４）肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素の発現量を実質的に増加させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （５）肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （６）肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を、POU5F1遺伝子が破壊され、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子が増加された多能性幹細胞に添加する工程、
    （７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
    （８）肝細胞への分化誘導に必要な転写因子HNF1A遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化方法。
  7. 以下の（１）〜（８）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を軟骨細胞へ分化させる方法、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、
    （２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物、並びに軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （４）軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素の発現量を実質的に増加させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （５）軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （６）軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を、POU5F1遺伝子が破壊され、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子が増加された多能性幹細胞に添加する工程、
    （７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
    （８）軟骨細胞への分化誘導に必要な転写因子SOX9遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化方法。
  8. 以下の（１）〜（８）のいずれか１に記載の工程を含む、多能性幹細胞を造血細胞へ分化させる方法、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、
    （２）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （３）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子を担持した遺伝子構築物、並びに造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を担持した遺伝子構築物を多能性幹細胞のゲノムに挿入する工程、
    （４）造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素の発現量を実質的に増加させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （５）造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物を強制発現させ、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素を強制発現させた多能性幹細胞に添加する工程、
    （６）造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を、POU5F1遺伝子が破壊され、かつH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子が増加された多能性幹細胞に添加する工程、
    （７）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子、H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子及び造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を多能性幹細胞に添加する工程、及び
    （８）造血細胞への分化誘導に必要な転写因子SPI1遺伝子を、POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞に添加する工程、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化方法。
  9. 以下の（１）又は（２）を含む多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化させるための分化誘導キット、
    （１）POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させた並びにH3K27me3修飾を実質的に除去又は低減させたヒストンを有する多能性幹細胞、又は
    （２）多能性幹細胞並びにPOU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子及びH3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素遺伝子、
    ここで、該POU5F1タンパク質の発現量を実質的に除去又は低減させる作用を持つ化合物の遺伝子は、POU5F1のsiRNAを発現する遺伝子、POU5F1のshRNAを発現する遺伝子、POU5F1のアンチセンス鎖を発現する遺伝子及び／又はPOU5F1の抗体遺伝子である、分化誘導キット。
  10. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項９に記載の分化誘導キット。
  11. さらに、所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子又は転写因子遺伝子を含む請求項９又は１０に記載の分化誘導キット。
  12. 前記転写因子遺伝子は、センダイウイルスベクターに担持されている請求項１１に記載の分化誘導キット。
  13. 以下の（１）〜（６）のいずれか１に記載の請求項９〜１２のいずれか１項に記載の分化誘導キット、
    （１）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がMYOD1であり、かつ所望の細胞型が骨格筋細胞である、
    （２）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がHNF1Aであり、かつ所望の細胞型が肝細胞である、
    （３）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSOX9であり、かつ所望の細胞型が軟骨細胞である、
    （４）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がRUNX2であり、かつ所望の細胞型が骨細胞である、
    （５）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がSPI1であり、かつ所望の細胞型が造血細胞である、及び
    （６）前記所望の細胞型への分化誘導に必要な転写因子がASCL1であり、かつ所望の細胞型が神経細胞である。
  14. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項５に記載の分化方法。
  15. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項６に記載の分化方法。
  16. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項７に記載の分化方法。
  17. 前記H3K27me3のメチル基を取り除く作用を有する脱メチル化酵素は、JMJD3である請求項８に記載の分化方法。
JP2017563896A 2016-01-31 2017-01-31 未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法 Active JP6885598B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016016785 2016-01-31
JP2016016785 2016-01-31
PCT/JP2017/003325 WO2017131238A1 (ja) 2016-01-31 2017-01-31 未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2017131238A1 JPWO2017131238A1 (ja) 2019-01-31
JP6885598B2 true JP6885598B2 (ja) 2021-06-16

Family

ID=59398337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017563896A Active JP6885598B2 (ja) 2016-01-31 2017-01-31 未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11396644B2 (ja)
EP (1) EP3421598B1 (ja)
JP (1) JP6885598B2 (ja)
WO (1) WO2017131238A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11396644B2 (en) 2016-01-31 2022-07-26 Keio University Method for promoting differentiation of pluripotent stem cells by reducing undifferentiated state thereof
US11136555B2 (en) 2017-03-01 2021-10-05 Elixirgen Scientific, Inc. Compositions and methods for differentiation of human pluripotent stem cells into desired cell types
JP6783954B2 (ja) * 2017-11-30 2020-11-11 アイ ピース，インコーポレイテッド 神経系細胞の作製方法
JP2023516484A (ja) 2020-03-11 2023-04-19 ビット バイオ リミテッド 肝細胞作製方法
WO2023245142A2 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 GC Therapeutics, Inc. Methods and compositions for stem cell differentiation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004236607A (ja) 2003-02-07 2004-08-26 Toyama Chem Co Ltd 神経幹細胞の分化調節方法
US9862929B2 (en) * 2011-11-18 2018-01-09 Kyoto University Method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to skeletal muscle cells
JP6420579B2 (ja) 2014-07-09 2018-11-07 株式会社イノアックコーポレーション スポイラ
US20180072988A1 (en) * 2015-04-10 2018-03-15 Agency For Science, Technology And Research Generation of functional cells from stem cells
US11396644B2 (en) 2016-01-31 2022-07-26 Keio University Method for promoting differentiation of pluripotent stem cells by reducing undifferentiated state thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3421598A4 (en) 2019-07-31
US20190048320A1 (en) 2019-02-14
JPWO2017131238A1 (ja) 2019-01-31
US20220364058A1 (en) 2022-11-17
EP3421598A1 (en) 2019-01-02
US12098389B2 (en) 2024-09-24
EP3421598B1 (en) 2021-07-14
US11396644B2 (en) 2022-07-26
WO2017131238A1 (ja) 2017-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6885598B2 (ja) 未分化性低減による多能性幹細胞の分化促進法
US12098392B2 (en) Compositions and methods for differentiation of human pluripotent stem cells into desired cell types
ES2726766T3 (es) Método para el desarrollo eficiente de células madre pluripotentes inducidas
EP2288692B1 (en) Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US8962331B2 (en) Method of making induced pluripotent stem cell from adipose stem cells using minicircle DNA vectors
JP2011519546A (ja) 核初期化方法
JP5987063B2 (ja) 分化多能性幹細胞の製造方法
WO2012036299A1 (en) Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US20210395692A1 (en) Method For Reducing Differentiation Resistance Of Pluripotent Stem Cells
Warren et al. Feeder‐free reprogramming of human fibroblasts with messenger RNA
WO2018052126A1 (ja) 巨核球細胞群における細胞の不均質性を識別する方法及び血小板の製造方法
Kwon Genome Engineering in Stem Cells for Skeletal Muscle Regeneration
Garza Manero The role of high mobility group of nucleosome binding proteins in stem cell biology and differentiation
DeJong Characterizing a Novel Mutation in MECP2 using an hiPSC Model of Rett Syndrome
Furtado Developing gene-edited models to study mis-splicing in Hypertrophic Cardiomyopathy
LINH Two histone variants TH2A and TH2B facilitate human iPS cell generation.
Goes Barbosa Buskin Improving our understanding of autosomal dominant Retinitis Pigmentosa using PRPF31 patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs)
Neumann H3K4 methyltransferases Mll1 and Mll2 have distinct roles and cooperate in neural differentiation and reprogramming
Voutila RNA-Mediated Transcriptional Activation Of Endogenous Pluripotency Gene Expression
Shen Uncovering new functions for histone variants: a role for H2A. Z in silencing retrotransposons
Weissmann The role of HDAC1 and HDAC2 in transcription and induced pluripotency
Autio Investigating the Regulation of Distinct Epigenetic States in Human Embryonic Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
AA64 Notification of invalidation of claim of internal priority (with term)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764

Effective date: 20181011

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181022

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200127

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200127

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210107

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210302

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210310

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210408

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210506

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6885598

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250