JP6871679B2 - Gene expression cassette and its products - Google Patents
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Description
本発明は、組換えタンパク質を大量かつ安定的に産生しうる遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該遺伝子発現用カセットを用いた遺伝子の発現方法及びその産生物に関する。具体的には、プロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該プロモーター、エンハンサー等を用いて遺伝子の発現を上昇させる方法に関する。 The present invention relates to a gene expression cassette capable of stably producing a large amount of recombinant protein, and further relates to a gene expression method using the gene expression cassette and a product thereof. Specifically, the present invention relates to a cassette for gene expression containing a promoter, enhancer and the like, and further relates to a method for increasing gene expression using the promoter, enhancer and the like.
遺伝子発現効率を上昇させるために、CMVプロモーターやCAGプロモーターなど様々な遺伝子発現プロモーターが開発されている(特許文献1〜3)。本発明者らが開発したプロモーター、エンハンサーなどの組み合わせを最適化し、大半の哺乳細胞で遺伝子の発現を上昇させるシステムもその1つである(特許文献4、非特許文献1、2を参照)。
In order to increase the gene expression efficiency, various gene expression promoters such as CMV promoter and CAG promoter have been developed (
より高い効率で遺伝子を発現させることができるシステムの開発を試み、様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行うことにより、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子(以下、「目的遺伝子」ともいう。)及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー又は第2のプロモーターが連結した、遺伝子の発現用カセットを用いることで、遺伝子を高効率で発現させ得ることが本発明者らにより見いだされ、報告されている(特許文献4、非特許文献1、2を参照)。しかしこのベクターは、細胞の一過性発現に有効なベクターであり、現在、医薬品生産の現場で求められる目的タンパク質を安定かつ高産生する哺乳動物細胞を作製するためには、さらにベクターを改良する必要があった。
By trying to develop a system that can express genes with higher efficiency and comparing and examining promoter activity by combining promoters and enhancers of various genes, genes to be expressed downstream of promoters (hereinafter referred to as "genes") , Also referred to as "target gene") and a gene expression cassette in which an enhancer or a second promoter is linked downstream of a DNA construct containing a poly A addition sequence, so that the gene can be expressed with high efficiency. Has been found and reported by the present inventors (see
一般的に、遺伝子組換えの手法による目的タンパク質を安定かつ高産生させる細胞を取得するためには、宿主細胞内の染色体に目的遺伝子を組み込み、遺伝子増幅を利用し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を構築する。その方法として最も頻繁に用いられているのが、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損株CHO-DG44細胞を用いた方法である。具体的には、目的遺伝子及びDHFR遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を取得する(非特許文献3、4を参照)。しかしながら、係るDHFR欠損細胞を用いた方法は、DHFR阻害剤であるmethotrexate(MTX)の濃度を段階的に増加させながら培養する必要があり、高濃度のMTX耐性のクローンを選択することによりクローンの取得に時間がかかり、他の細胞への汎用性が低いなどの問題点がある。
In general, in order to obtain cells that stably and highly produce the target protein by the gene recombination method, the target gene is integrated into the chromosome in the host cell, gene amplification is used, and multiple copies of the target gene are integrated. Build cells. The most frequently used method is the method using dihydrofolate reductase (DHFR) deficient strain CHO-DG44 cells. Specifically, a vector containing a target gene and a DHFR gene is introduced into cells to obtain cells in which multiple copies of the target gene have been integrated (see Non-Patent
上述したごとく、遺伝子発現効率を上昇させるための技術は、様々なプロモーターの開発などにより、改良が進められている。しかし哺乳動物細胞におけるタンパク質の産生系は、大腸菌や酵母など他の宿主と比較して十分なタンパク質を得ることが難しい。バイオテクノロジーの分野では、これらの従来技術を用いても、細胞の種類や遺伝子の種類によって、遺伝子発現がほとんど起こらない、又は発現タンパク質量が極めて少ないといった問題が日常的に発生している。また、この問題は、遺伝子発現を診断や治療に用いる医療の発展において、大きな障壁となっている。 As described above, the technique for increasing the gene expression efficiency is being improved by the development of various promoters. However, it is difficult for the protein production system in mammalian cells to obtain sufficient protein as compared with other hosts such as Escherichia coli and yeast. In the field of biotechnology, even if these conventional techniques are used, problems such as almost no gene expression or extremely low amount of expressed protein occur on a daily basis depending on the type of cell and the type of gene. This problem also poses a major barrier to the development of medical treatments that use gene expression for diagnosis and treatment.
例えば、HRG(Histidine-rich glycoprotein)は、1972年にHeimburger et al (1972)によって同定された分子量約80 kDaの血漿タンパク質である。合計507個のアミノ酸より構成され、そのうちヒスチジンが66存在する高ヒスチジン含有タンパク質であり、主として肝臓で合成され、約100〜150μg/mLという非常に高いと考えられる濃度でヒト血漿中に存在する。しかしながら、HRGの臨床的意義を検討するために、遺伝子組換え技術によって充分量のHRGを産生する方法が望まれていた。 For example, HRG (Histidine-rich glycoprotein) is a plasma protein with a molecular weight of approximately 80 kDa identified by Heimburger et al (1972) in 1972. It is a high-histidine-containing protein composed of a total of 507 amino acids, of which 66 histidine is present. It is mainly synthesized in the liver and is present in human plasma at a very high concentration of about 100 to 150 μg / mL. However, in order to examine the clinical significance of HRG, a method for producing a sufficient amount of HRG by gene recombination technology has been desired.
また、PD-1(Programmed cell death 1)、EMMPRIN(extracellular matrix metalloproteinase inducer)、NPTNβ(neuroplastinβ)、EMB(embigin)、RAGE(receptor for advanced glycation end products)、MCAM(melanoma cell adhesion molecule)、ALCAM(activated leukocyte cell adhesion molecule)、ErbB2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)などのタンパク質は、免疫細胞を抑制したり腫瘍細胞に発現したりすることが知られており、これらのタンパク質は医療分野の研究開発や、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質の候補として重要と考えられる。これらのタンパク質について、遺伝子組換え技術によって充分量の各タンパク質を産生する方法が望まれている。 In addition, PD-1 (Programmed cell death 1), EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer), NPTNβ (neuroplastinβ), EMB (embigin), RAGE (receptor for advanced glycation end products), MCAM (melanoma cell adhesion molecule), ALCAM ( Proteins such as activated leukocyte cell adhesion molecule) and ErbB2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2) are known to suppress immune cells and be expressed in tumor cells, and these proteins are used in the medical field. It is considered to be an important candidate for proteins that can be used for research and development, pharmaceuticals, pharmaceuticals, diagnostic agents or reagents. For these proteins, a method for producing a sufficient amount of each protein by gene recombination technology is desired.
本発明は、目的タンパク質を安定かつ高産生するための遺伝子発現用カセットを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a cassette for gene expression for stable and high production of a target protein.
本願発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、プロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットに、さらにプロモーター(P)の上流とエンハンサー(P')の下流に、各々トランスポゾン配列(T)を含む遺伝子発現用カセットを用いることで目的タンパク質を安定かつ高産生できることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have created a gene expression cassette having a structure in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence is sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P'). Furthermore, they have found that the target protein can be stably and highly produced by using a gene expression cassette containing a transposon sequence (T) upstream of the promoter (P) and downstream of the enhancer (P'), respectively, and completed the present invention. ..
すなわち本発明は、以下よりなる。
1.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、プロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター(P)の上流及びエンハンサー(P')の下流にトランスポゾン配列(T)を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
2.さらに、プロモーター(P)の上流及び/又はエンハンサー(P')の下流に、複製開始配列(S)が配置されていることを特徴とする、前項1に記載の遺伝子発現用カセット。
3.プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')及びトランスポゾン配列(T)が含まれ、更に選択的に複製開始配列(S)を含む遺伝子発現用カセットが、以下の1)〜4)のいずれかに示す順序で含まれる、前項1又は2に記載の遺伝子発現用カセット:
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(T);
2)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T);
3)(T)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T);
4)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T)。
4.複製開始配列(S)の上流に核マトリックス結合配列(M)が配置されていることを特徴とする前項2又は3に記載の遺伝子発現用カセット。
5.トランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')、核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)及びトランスポゾン配列(T)を含む、遺伝子発現用カセット。
6.配列(S)が、ROIS及び/又はARSである前項2〜5のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
7.プロモーター(P)が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、前項1〜6のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
8.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流に連結したエンハンサー(P')が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか1種又は複数種を含む、前項1〜7のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
9.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)において、目的遺伝子が、HRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2及び抗体のいずれかから選択されるタンパク質の部分又は全体をコードする遺伝子を含む、前項1〜8のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
10.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
11.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
12.前項1〜9のいずれかに記載の発現用カセットを用いて目的遺伝子を発現させる方法。
13.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを用いて産生されたタンパク質。
That is, the present invention comprises the following.
1. 1. In a gene expression cassette in which the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence is sandwiched between the promoter (P) and the enhancer (P'), the DNA construct (P') is further upstream of the promoter (P) and the enhancer (P'). ), A cassette for gene expression, which comprises a transposon sequence (T).
2. The gene expression cassette according to
3. 3. For gene expression containing a promoter (P), a DNA construct (X) containing a gene of interest and a poly A addition sequence, an enhancer (P') and a transposon sequence (T), and selectively containing a replication initiation sequence (S). The gene expression cassette according to
1) (T), (P), (X), (P'), (T);
2) (T), (S), (P), (X), (P'), (T);
3) (T), (P), (X), (P'), (S), (T);
4) (T), (S), (P), (X), (P'), (S), (T).
4. The gene expression cassette according to
5. Transposon sequence (T), promoter (P), DNA construct (X) containing target gene and poly A addition sequence, enhancer (P'), nuclear matrix binding sequence (M), replication initiation sequence (S) and transposon sequence ( A cassette for gene expression containing T).
6. The gene expression cassette according to any one of
7. The gene expression according to any one of the
8. The enhancer (P') linked downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence contains any one or more selected from hTERT enhancer, CMV enhancer and SV40 enhancer. The cassette for gene expression according to any one of 7 to 7.
9. In the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence, the target gene is a protein selected from HRG, PD-1, EMMPRIN, NPTNβ, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, ErbB2 and antibody. The gene expression cassette according to any one of the
10. A plasmid for gene expression containing the cassette for gene expression according to any one of the
11. A gene expression vector containing the gene expression cassette according to any one of the
12. A method for expressing a target gene using the expression cassette according to any one of the
13. A protein produced using the gene expression cassette according to any one of the
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット(例えば、特許文献4に示すpCMViR-TSCベクター)をトランスポゾン配列(T)で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列(S)、核マトリックス結合配列(M) を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター(P)の上流にトランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流にエンハンサー(P')、さらにその下流に「核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)、トランスポゾン配列(T)を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の新規な遺伝子発現用ベクターは、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の遺伝子発現用ベクターと比較して数倍から数十倍の高産生を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T) to efficiently express a high number of copies of a gene on a chromosome. Allows you to insert a cassette. Furthermore, by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency. It will be possible. Specifically, the transposon sequence (T) is upstream of the promoter (P), the enhancer (P') is downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence downstream of the promoter (P), and the enhancer (P') thereof. By linking the "nuclear matrix binding sequence (M), replication initiation sequence (S), and transposon sequence (T) downstream, cells that stably and highly produce the target protein can be obtained. For the novel gene expression of the present invention. The vector further increases the transient expression level of the pCMViR-TSC vector, which achieved several to several tens of times higher production than the conventional vector for gene expression, despite the stable expression cell line after drug selection. Achieved an expression level that surpassed that of this.
本明細書において「遺伝子発現用カセット」とは、目的タンパク質を遺伝子組換え操作によって発現可能とするためのDNAのセットをいい、より具体的には、目的タンパク質をコードする遺伝子(目的遺伝子)を含み、さらに当該遺伝子を発現可能とするための各種DNA配列を含むDNAのセットをいう。本明細書において「目的タンパク質」とは、発現及び/又は産生させようとするタンパク質を意味する。 In the present specification, the "gene expression cassette" refers to a set of DNA for enabling expression of a target protein by a gene recombination operation, and more specifically, a gene (target gene) encoding the target protein. A set of DNA containing various DNA sequences for making the gene expressable. As used herein, the term "protein of interest" means a protein to be expressed and / or produced.
本明細書において「遺伝子発現用カセット」には、少なくとも「プロモーター(P)」、「目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)」及び「エンハンサー(P’)」の機能を有する各DNAを含み、さらに「トランスポゾン配列(T)」を含むことを特徴とする。さらに、「複製開始配列(S)」や「核マトリックス結合配列(M)」を含んでいてもよい。 In the present specification, the "gene expression cassette" has at least the functions of "promoter (P)", "DNA construct (X) containing target gene and poly A addition sequence", and "enhancer (P')". It is characterized by containing DNA and further containing a "transposon sequence (T)". Further, it may include a "replication initiation sequence (S)" and a "nuclear matrix binding sequence (M)".
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、少なくともプロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有し、さらにプロモーター(P」の上流、及びエンハンサー(P')の下流にトランスポゾン配列(T)を含むことを特徴とする。さらに、プロモーター(P)の上流、及び/又はエンハンサー(P')の下流に、核マトリックス結合配列(M)と複製開始配列(S)が配置されていてもよい。 The "gene expression cassette" of the present invention has a structure in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence is sandwiched between at least a promoter (P) and an enhancer (P'), and further, the promoter (P'). The transposon sequence (T) is contained upstream of the promoter (P') and downstream of the enhancer (P'). Further, nuclear matrix binding is performed upstream of the promoter (P) and / or downstream of the enhancer (P'). The sequence (M) and the replication start sequence (S) may be arranged.
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット(例えば、特許文献4に示すpCMViR-TSCベクター)をトランスポゾン配列(T)で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列(S)、核マトリックス結合配列(M)を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、或いは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター(P)の上流にトランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、その下流にエンハンサー(P')、さらにその下流に核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)、トランスポゾン配列(T)を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T) to efficiently express a high number of copies of a gene on a chromosome. Allows you to insert a cassette. Furthermore, by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency. It will be possible. Specifically, a transposon sequence (T) upstream of the promoter (P), a DNA construct (X) containing the target gene and polyA addition sequence downstream of the promoter (P), an enhancer (P') downstream thereof, and further. By linking the nuclear matrix binding sequence (M), replication initiation sequence (S), and transposon sequence (T) downstream thereof, cells that stably and highly produce the target protein can be obtained.
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、プロモーターを(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物を(X)、エンハンサーを(P')及びトランスポゾン配列を(T)、複製開始配列を(S)としたときに、少なくとも以下の1)〜4)のいずれかに示す順序で構成される。ここにおいて、トランスポゾン配列(T)には、トランスポゾンを特定する配列を2回以上連結したものが含まれていてもよい。
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(T);
2)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T);
3)(T)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T);
4)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T)。
The "cassette for gene expression" of the present invention has a promoter (P), a DNA construct containing a target gene and a poly A addition sequence (X), an enhancer (P') and a transposon sequence (T), and a replication initiation sequence. Is (S), it is composed of at least the order shown in any of 1) to 4) below. Here, the transposon sequence (T) may include a sequence in which a sequence specifying a transposon is linked twice or more.
1) (T), (P), (X), (P'), (T);
2) (T), (S), (P), (X), (P'), (T);
3) (T), (P), (X), (P'), (S), (T);
4) (T), (S), (P), (X), (P'), (S), (T).
本明細書において、「目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)」のうち、目的遺伝子は、目的タンパク質をコードする遺伝子(DNA)を含み、ホスト細胞と由来が異なる遺伝子であってもよいし、由来が同じ遺伝子であってもよい。また、発現遺伝子の検出や疾患の診断のためにレポーター遺伝子が含まれていてもよい。ポリA付加配列(ポリアデニル化配列、polyA)は自体公知の配列を適用することができ、その由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を遺伝子発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。 In the present specification, among the "DNA constructs (X) containing the target gene and the poly A addition sequence", the target gene is a gene containing a gene (DNA) encoding the target protein and having a different origin from the host cell. It may be a gene of the same origin. In addition, a reporter gene may be included for detecting an expressed gene or diagnosing a disease. As the polyA addition sequence (polyadenylation sequence, polyA), a sequence known per se can be applied, and the origin thereof is not limited, and the polyA addition sequence derived from the growth hormone gene, for example, the polyA addition derived from the bovine growth hormone gene. Examples thereof include a sequence, a poly A addition sequence derived from a human growth hormone gene, a poly A addition sequence derived from SV40 virus, and a poly A addition sequence derived from a β-globin gene of humans and rabbits. Transcription efficiency is increased by including the poly A addition sequence in the gene expression cassette.
本明細書において、目的遺伝子の種類は限定されず、遺伝子組換え技術により産生させようとする目的タンパク質をコードするDNAや、特定の疾患の治療に用いるために生体内で発現させようとする目的タンパク質をコードするDNAを用いることができる。本明細書に示す目的タンパク質として、医療分野の研究開発のためや、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質が挙げられる。係るタンパク質は自体公知のタンパク質又は今後見出されるタンパク質であってもよい。タンパク質は、全体であってもよいし、部分であってもよい。さらに、複合体からなるタンパク質であってもよい。タンパク質の例として、例えばHRG(ヒスチジンリッチ糖タンパク質)、PD-1(Programmed cell death 1)、EMMPRIN(extracellular matrix metalloproteinase inducer)、NPTNβ(neuroplastinβ)、EMB(embigin)、RAGE(receptor for advanced glycation end products)、MCAM(melanoma cell adhesion molecule)、ALCAM(activated leukocyte cell adhesion molecule)、ErbB2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)や抗体が挙げられる。さらに後述するように、目的タンパク質は、タンパク質と抗体のFc領域とを融合させたFc融合タンパク質(Fc fusion protein)等であってもよい。 In the present specification, the type of the target gene is not limited, and the DNA encoding the target protein to be produced by the gene recombination technique or the purpose to be expressed in vivo for use in the treatment of a specific disease. DNA encoding the protein can be used. Examples of the target protein shown in the present specification include proteins that can be used for research and development in the medical field and for pharmaceuticals, pharmaceuticals, diagnostic agents or reagents. The protein may be a protein known per se or a protein found in the future. The protein may be whole or partial. Furthermore, it may be a protein composed of a complex. Examples of proteins include HRG (histidine-rich glycoprotein), PD-1 (Programmed cell death 1), EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer), NPTNβ (neuroplastinβ), EMB (embigin), RAGE (receptor for advanced glycation end products). ), MCAM (melanoma cell adhesion molecule), ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule), ErbB2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2) and antibodies. Further, as will be described later, the target protein may be an Fc fusion protein or the like in which a protein and an Fc region of an antibody are fused.
例えばHRGをコードする全長cDNA、又はHRGの活性を有する部分をコードするcDNA、例えば、成熟HRGのアミノ酸配列(配列番号10)をコードする全長cDNA、又は部分をコードするcDNAを、発現ベクターにクローニングし、HRGを調製することができる。例えば、GenBank Accession No.NM000412で特定されるヌクレオチドの全体又は部分から、遺伝子組換え技術を用いて調製することもできる。本発明の有効成分としてのHRGは、成熟HRGの全体であっても良いし、成熟HRGのうちHRG活性を有する部分タンパク質又はペプチドであっても良い。さらに、糖鎖を含むものであってもよいし糖鎖がなくても良い。HRGは好中球活性化調節剤として機能し、好中球活性化に起因する疾患の治療薬の有効成分として、利用することができる。HRGは好中球活性化に起因する疾患及び/又は好中球活性化を伴う炎症性疾患の治療方法にも有効である。 For example, a full-length cDNA encoding HRG, or a cDNA encoding an active portion of HRG, for example, a full-length cDNA encoding the amino acid sequence of mature HRG (SEQ ID NO: 10), or a cDNA encoding a portion is cloned into an expression vector. And HRG can be prepared. For example, it can be prepared from all or parts of the nucleotide specified in GenBank Accession No. NM000412 using genetic recombination technology. The HRG as the active ingredient of the present invention may be the whole mature HRG, or a partial protein or peptide having HRG activity among the mature HRGs. Further, it may contain a sugar chain or may not have a sugar chain. HRG functions as a neutrophil activation regulator and can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for diseases caused by neutrophil activation. HRG is also effective in treating diseases caused by neutrophil activation and / or inflammatory diseases associated with neutrophil activation.
HRGと同様に、例えば成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号14)、成熟型EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号16)、成熟型NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号18)、成熟型EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号20)、成熟型RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号22)、成熟型MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号24)、成熟型ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号26)、成熟型ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号28)等をコードする全長cDNA、又は部分をコードするcDNAに基づいて、発現ベクターにクローニングし、各タンパク質を調製することができる。タンパク質にFcを融合させる場合の目的遺伝子の調製方法は、自体公知の方法、または今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。 Similar to HRG, for example, the amino acid sequence of the mature PD-1 extracellular domain (SEQ ID NO: 14), the amino acid sequence of the mature EMMPRIN extracellular domain (SEQ ID NO: 16), and the amino acid sequence of the mature NPTNβ extracellular domain (SEQ ID NO: 16). 18), Amino acid sequence of mature EMB extracellular domain (SEQ ID NO: 20), Amino acid sequence of mature RAGE extracellular domain (SEQ ID NO: 22), Amino acid sequence of mature MCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 24), Mature type Clone to an expression vector based on the full-length cDNA encoding the amino acid sequence of the ALCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 26), the amino acid sequence of the mature ErbB2 extracellular domain (SEQ ID NO: 28), or the portion encoding. Each protein can be prepared. As a method for preparing the target gene when Fc is fused to a protein, a method known per se or any method developed in the future can be applied.
PD-1は、免疫細胞側に存在し、免疫細胞の抑制に働く一回膜貫通型タンパク質で、Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci Transl Med. 2016 Mar 2;8(328):328rv4. doi: 10.1126/scitranslmed.aad7118.に開示されている。EMMPRIN, NPTN, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM等はがん細胞に存在し、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する接着分子(一回膜貫通型タンパク質)として知られている。EMMPRINは、Kanekura T, Chen X. CD147/basigin promotes progression of malignant melanoma and other cancers. J Dermatol Sci. 2010 Mar;57(3):149-54. doi: 10.1016/j.jdermsci.2009.12.008.に開示され、NPTNβは、Owczarek S, Berezin V. Neuroplastin: cell adhesion molecule and signaling receptor. Int J Biochem Cell Biol. 2012 Jan;44(1):1-5. doi: 10.1016/j.biocel.2011.10.006.に開示され、EMBは、Chao F, Zhang J, Zhang Y, Liu H, Yang C, Wang J, Guo Y, Wen X, Zhang K, Huang B, Liu D, Li Y. Embigin, regulated by HOXC8, plays a suppressive role in breast tumorigenesis. Oncotarget. 2015 Sep 15;6(27):23496-509.に開示され、RAGEは、Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, Herbst R, Coyle AJ. HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer. Annu Rev Immunol. 2010;28:367-88. doi: 10.1146/annurev.immunol.021908.132603.に開示され、MCAMは、Wang Z, Yan X. CD146, a multi-functional molecule beyond adhesion. Cancer Lett. 2013 Apr 28;330(2):150-62. doi: 10.1016/j.canlet.2012.11.049.に開示され、ALCAMは、Ofori-Acquah SF, King JA. Activated leukocyte cell adhesion molecule: a new paradox in cancer. Transl Res. 2008 Mar;151(3):122-8. doi: 10.1016/j.trsl.2007.09.006.に開示される。がん細胞に存在するErbB2は、がん遺伝子として知られており、この過剰発現は発がん、そしてその後のがん進展に大きく関わるといわれている。ErbB2は、Appert-Collin A, Hubert P, Cremel G, Bennasroune A. Role of ErbB Receptors in Cancer Cell Migration and Invasion. Front Pharmacol. 2015 Nov 24;6:283. doi: 10.3389/fphar.2015.00283.に開示される。
PD-1 is a single transmembrane protein that exists on the immune cell side and acts to suppress immune cells. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci Transl Med. 2016
例えば上述するタンパク質と抗体のFc領域とを融合させたFc融合タンパク質を作製する場合には、タンパク質のC'末端側をコードする部位にFcをコードするcDNAを結合させるのが好適である。 For example, in the case of producing an Fc fusion protein in which the above-mentioned protein and the Fc region of an antibody are fused, it is preferable to bind a cDNA encoding Fc to a site encoding the C'terminal side of the protein.
抗体は、重鎖(H鎖)及び軽鎖(L鎖)と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、H鎖はN末端側より可変領域(VH)、定常領域(CH)、L鎖はN末端側より可変領域(VL)、定常領域(CL)により、それぞれ構成される。CHはさらに、N末端側よりCH1、ヒンジ、CH2、CH3の各ドメインより構成される。また、CH2とCH3を併せてFc領域という。本発明の方法によって作製される抗体は、インタクト型抗体又は低分子抗体である抗体フラグメントであってもよい。抗体のクラスとしては、例えばイムノグロブリンG(IgG)、イムノグロブリンA(IgA)、イムノグロブリンE(IgE)、及びイムノグロブリンM(IgM)が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体は、IgGであることが好ましい。IgGのサブクラスとしては、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体のサブクラスは、用途目的に応じて適宜決定することができ、いずれのサブクラスの抗体であってもよい。抗体フラグメントとしては、Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、Fcフラグメント、ダイアボディーからなる群より選択されるその機能的抗体フラグメントが挙げられる。例えば、抗体のFc領域と必要なタンパク質を融合させたFc融合タンパク質(Fc fusion protein)であってもよい。 Antibodies are composed of polypeptides called heavy chains (H chains) and light chains (L chains). The H chain is composed of a variable region (VH) and a constant region (CH) from the N-terminal side, and the L chain is composed of a variable region (VL) and a constant region (CL) from the N-terminal side. CH is further composed of CH1, hinge, CH2, and CH3 domains from the N-terminal side. In addition, CH2 and CH3 are collectively called the Fc region. The antibody produced by the method of the present invention may be an intact antibody or an antibody fragment which is a small molecule antibody. Examples of antibody classes include immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), and immunoglobulin M (IgM). The antibody that can be produced by the method of the present invention is preferably IgG. Subclasses of IgG include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. The subclass of the antibody that can be produced by the method of the present invention can be appropriately determined according to the intended use, and may be any subclass of antibody. Examples of the antibody fragment include its functional antibody fragment selected from the group consisting of Fv, Fab, (Fab') 2, Fab', Fc fragment, and diabody. For example, it may be an Fc fusion protein in which the Fc region of an antibody and a necessary protein are fused.
トランスポゾン(Transposon:TP)とは、細胞内においてゲノム上の位置を転移(transposition)することのできる塩基配列である。動く遺伝子、転置因子(Transposable element)とも呼ばれる。DNA断片が直接転移するDNA型と、転写と逆転写の過程を経るRNA型がある。トランスポゾンは、例えばバクテリアや酵母などの微生物でも発見され、これら転置因子は一定の塩基配列をもったDNAで、バクテリアや酵母などの正常の染色体の構成成分として1細胞あたり複数個存在している。この因子は染色体に組込まれて存在するので挿入配列(insertion sequence:IS)とも呼ばれる。トランスポゾンは遺伝子導入のベクターや変異原として有用であり、遺伝学や分子生物学において様々な生物で応用されている。本明細書においても、トランスポゾンは遺伝子発現用カセットに組み込まれる。本明細書において、「トランスポゾン配列(T)」とは、上記トランスポゾンを特定する配列をいう。繰り返しになるが、トランスポゾン配列(T)には、トランスポゾンを特定する配列を2回以上連結したものが含まれていてもよい。 A transposon (TP) is a base sequence capable of transposing a position on the genome in a cell. It is also called a moving gene, a transposable element. There are DNA types to which DNA fragments are directly transferred and RNA types that undergo transcription and reverse transcription processes. Transposons are also found in microorganisms such as bacteria and yeast, and these transposable factors are DNA having a certain base sequence, and a plurality of transposons are present per cell as constituents of normal chromosomes such as bacteria and yeast. This factor is also called an insertion sequence (IS) because it is integrated into the chromosome. Transposons are useful as vectors and mutagens for gene transfer, and have been applied to various organisms in genetics and molecular biology. Also herein, transposons are incorporated into gene expression cassettes. As used herein, the term "transposon sequence (T)" refers to a sequence that identifies the transposon. To reiterate, the transposon sequence (T) may include a sequence in which a sequence specifying a transposon is concatenated twice or more.
DNAの複製反応は染色体上の決まった部位、複製開始点から始まり両方向に進行していく。真核生物の長大な染色体DNAを細胞周期の決まった時期に正確に複製するためには非常に多くの複製開始点が必要であり、それらの活性は時間的、空間的に制御されていると考えられている。さらにDNA複製を含めた染色体上で起こる様々な反応は互いに密接に関連し、染色体の恒常性が保持されている。複製開始が行われる領域には、複製開始配列があり、例えば複製開始配列(replication origin initiation sequence:ROIS)や自立複製配列(autonomously replicating sequence:ARS)が挙げられる。 The DNA replication reaction begins at a fixed site on the chromosome, the origin of replication, and progresses in both directions. It is said that a large number of replication origins are required to accurately replicate the long chromosomal DNA of eukaryotes at a fixed time in the cell cycle, and their activities are regulated temporally and spatially. It is considered. In addition, various reactions that occur on chromosomes, including DNA replication, are closely related to each other and maintain chromosomal homeostasis. The region where replication is initiated includes a replication origin sequence, such as a replication origin initiation sequence (ROIS) or an autonomous replication sequence (ARS).
核マトリックスとは、核内のクロマチンの保持だけでなく、遺伝子の転写や複製、DNA損傷修復、アポトーシスに代表される様々な核内イベントが機能するための重要な場を構成すると考えられる。複製開始配列と核マトリックス結合領域を含むプラスミドは、細胞内で効率よく遺伝子を増幅すると考えられる。本明細書において、「核マトリックス結合配列(M)」とは、上記核マトリックスに結合する配列として特定される配列をいう。本発明の遺伝子発現用カセットにおいて、複製開始配列(S)とともに核マトリックス結合配列(M)を含むのがより好適である。この場合、複製開始配列(S)よりも上流域において核マトリックス結合配列(M)が配置されているのが好適である。 The nuclear matrix is thought to constitute an important field for the functioning of various nuclear events such as gene transcription and replication, DNA damage repair, and apoptosis, as well as the retention of chromatin in the nucleus. A plasmid containing the replication origin sequence and the nuclear matrix binding region is considered to efficiently amplify the gene in the cell. In the present specification, the "nuclear matrix binding sequence (M)" refers to a sequence specified as a sequence that binds to the nuclear matrix. In the gene expression cassette of the present invention, it is more preferable to include the nuclear matrix binding sequence (M) together with the replication initiation sequence (S). In this case, it is preferable that the nuclear matrix binding sequence (M) is arranged in the upstream region from the replication origin sequence (S).
プロモーターとはDNAを鋳型に転写を開始するDNA上の特定の塩基配列であり、目的遺伝子の上流に配置される。本明細書の「プロモーター(P)」において使用可能なプロモーターは特許文献4に示す「第1のプロモーター」を参照し、「エンハンサー(P’)」は特許文献4に示す「エンハンサー」や「第2のプロモーター」の記載を参照することができる。具体的には、以下に説明する。
A promoter is a specific base sequence on DNA that initiates transcription using DNA as a template, and is located upstream of the target gene. The promoters that can be used in the "promoter (P)" of the present specification refer to the "first promoter" shown in
本明細書において、「プロモーター(P)」の配列は特に限定されず、自体公知のプロモーターを適用することができる。あらゆる細胞や組織で目的遺伝子の発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。特に本発明において適用可能なプロモーターとして、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターや増殖性細胞特異的プロモーターが好適である。具体的には、SV40プロモーター、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、EF1-alphaプロモーター、ユビキチンプロモーターなどが挙げられる。 さらに具体的には、例えば、CMV-iプロモーター(hCMV+イントロンプロモーター)等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーターやニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のCMV-iプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターも用いることもできる。CMV-iプロモーターは米国特許第5168062号明細書や米国特許第5385839号明細書の記載に基づいて合成することができる。また、用途に応じて、 癌・腫瘍特異的プロモーターとしてはhTERT(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素)、PSA(前立腺特異的抗原)、c-myc、GLUTプロモーターなどが、遺伝子発現を抑制することを目的としたショートヘアピン型RNA(shRNA)を発現させるプロモーターとしてはU6、H1プロモーターなどが、ES細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはOCT3/4、NANOGプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはNestinプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはHSP70、HSP90、p53プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはTNF-alphaプロモーターなどが連結されていてもよい。 In the present specification, the sequence of "promoter (P)" is not particularly limited, and a promoter known per se can be applied. Non-specific promoters capable of promoting the expression of the gene of interest in any cell or tissue can also be used, as well as specific or selective promoters such as tissue or organ-specific promoters, tumor-specific promoters, developmental or differentiation-specific promoters. In particular, as a promoter applicable in the present invention, a promoter that increases the number of copies of the infected plasmid and a proliferative cell-specific promoter are suitable. Specific examples thereof include the SV40 promoter, CMV promoter, β-actin promoter, CAG promoter, EF1-alpha promoter, and ubiquitin promoter. More specifically, for example, a CMV-i promoter (hCMV + intron promoter) or the like is used. The animal species from which the β-actin promoter is derived is not limited, and a mammalian β-actin promoter, for example, a human β-actin promoter or a chicken actin promoter is used. In addition, an artificial hybrid promoter such as the CMV-i promoter described above can also be used. The CMV-i promoter can be synthesized based on the description in US Pat. No. 5,168,062 and US Pat. No. 5385839. In addition, depending on the application, hTERT (human telomerase reverse transcriptase), PSA (prostate-specific antigen), c-myc, GLUT promoter, etc. as cancer / tumor-specific promoters aim to suppress gene expression. U6, H1 promoters, etc. as promoters that express the short hairpin type RNA (shRNA), OCT3 / 4, NANOG promoters, etc. as ES cell / cancer stem cell-specific promoters, Nestin promoter, etc. as nerve stem cell-specific promoters. However, HSP70, HSP90, p53 promoter and the like may be linked as the cell stress sensing promoter, albumin promoter and the like as the hepatocellular-specific promoter, and TNF-alpha promoter and the like as the radiosensitivity promoter.
本明細書において、「エンハンサー(P’)」とは、転写により生成するメッセンジャーRNA(mRNA)の量を結果的に増加させるものであればよく、特に限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられるエンハンサー(P’)に含まれるエンハンサーは1種類でもよいが、2つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。具体的には、その順番は限定されない。例えば、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase)エンハンサー等を用いることができる。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。エンハンサー(P’)は本明細書の目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流に配置され、遺伝子発現がより強力に発現可能となる。例えば、プロモーターと同様の機能を有し、プロモーターと同様の配列であってもよい。プロモーター(P)とエンハンサー(P’)は同じであっても異なっていてもよい。例えば、プロモーター(P)として特異的プロモーターを用いて、エンハンサー(P’)として、非特異的なプロモーターを用いることができる。具体的には、CMV-iプロモーターとCMVエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞(宿主細胞)において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、目的遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。 As used herein, the term "enhancer (P')" is not particularly limited as long as it results in an increase in the amount of messenger RNA (mRNA) produced by transcription. An enhancer is a base sequence having an effect of promoting the action of a promoter, and generally consists of about 100 bp. Enhancers can promote transcription regardless of sequence orientation. The enhancer (P') used in the present invention may contain one type of enhancer, two or more identical enhancers may be used, or a plurality of different enhancers may be used in combination. Specifically, the order is not limited. For example, a CMV enhancer, an SV40 enhancer, an hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, or the like can be used. As an example, hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer are connected in this order. The enhancer (P') is located downstream of the DNA construct (X) containing the gene of interest and the poly A addition sequence herein, allowing gene expression to be expressed more strongly. For example, it may have a function similar to that of a promoter and may have a sequence similar to that of a promoter. The promoter (P) and enhancer (P') may be the same or different. For example, a specific promoter can be used as the promoter (P), and a non-specific promoter can be used as the enhancer (P'). Specifically, by combining the CMV-i promoter and CMV enhancer, the target gene is potent regardless of the transfection reagent used when any gene is inserted into almost all cells (host cells). Protein expression is possible.
本発明において、エンハンサー(P’)に含まれるエンハンサーの他、エンハンサー配列をプロモーター(P)の上流に配置することもできる。プロモーター(P)の上流に1個以上のエンハンサー配列を挿入することにより、特定の細胞(例えば、特許文献4の実施例に示すHEK293細胞株やMCF7細胞株)において、特定の遺伝子、例えば、REIC/Dkk-3遺伝子やCD133遺伝子において、発現がさらに増強される。また、CMVエンハンサーをプロモーター(P)の上流に、例えば4個挿入することにより、特定の細胞(例えば、HepG2細胞株やHeLa細胞株)によっては、さらに発現の増強が期待される。 In the present invention, in addition to the enhancer contained in the enhancer (P'), the enhancer sequence can be arranged upstream of the promoter (P). By inserting one or more enhancer sequences upstream of the promoter (P), a specific gene, for example, REIC, can be used in a specific cell (for example, the HEK293 cell line or MCF7 cell line shown in Examples of Patent Document 4). Expression is further enhanced in the / Dkk-3 gene and CD133 gene. Further, by inserting, for example, four CMV enhancers upstream of the promoter (P), expression is expected to be further enhanced depending on specific cells (for example, HepG2 cell line or HeLa cell line).
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、遺伝子発現ベクターに組込み利用することができる。本発明には、本発明の遺伝子発現用カセットを含むベクターも包含される。 The "cassette for gene expression" of the present invention can be incorporated and used in a gene expression vector. The present invention also includes a vector containing the cassette for gene expression of the present invention.
本発明の遺伝子発現用カセットにおいて、目的遺伝子を挿入する部位は、マルチクローニング部位として存在してもよい。この場合、目的遺伝子をマルチクローニング部位(挿入部位)に制限酵素が認識する配列を利用して挿入することができる。このように目的遺伝子DNA自体が含まれておらず、該DNAを挿入する部分がマルチクローニング部位として含まれる遺伝子発現用カセットも本発明に包含される。 In the gene expression cassette of the present invention, the site into which the target gene is inserted may exist as a multicloning site. In this case, the target gene can be inserted into the multicloning site (insertion site) using a sequence recognized by the restriction enzyme. As described above, the present invention also includes a gene expression cassette that does not include the target gene DNA itself and includes a portion into which the DNA is inserted as a multicloning site.
さらに、特許文献4に示すように、RU5'が目的タンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。さらに、遺伝子発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、後にSV40遺伝子を挿入することにより、遺伝子発現が上昇する。上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、目的遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
Further, as shown in
本発明の遺伝子発現用カセットを挿入するベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス(Ad)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記遺伝子発現用カセットを導入したベクターを、感染、エレクトロポレーション等の公知の方法により細胞に導入することができる。遺伝子の導入方法は自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができ、例えば公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。 Examples of the vector into which the gene expression cassette of the present invention is inserted include viral vectors such as plasmid, adenovirus (Ad) vector, adeno-associated virus (AAV) vector, lentivirus vector, retrovirus vector, herpesvirus vector, and Sendaivirus vector. And non-viral vectors such as biodegradable polymers. The vector into which the above-mentioned gene expression cassette has been introduced can be introduced into cells by a known method such as infection or electroporation. As a method for introducing a gene, a method known per se or any method developed in the future can be applied, and for example, a known transfection reagent may be used for the gene transfer.
さらに、市販のベクターを改変し、本発明の発現用カセットが含まれるようにしてもよい。例えば、pShuttleベクター等の市販のベクターの遺伝子発現用カセットの下流領域にエンハンサーを組込んで用いることができる。 Further, a commercially available vector may be modified to include the expression cassette of the present invention. For example, an enhancer can be incorporated and used in the downstream region of a gene expression cassette of a commercially available vector such as a pShuttle vector.
本発明は、さらに、上記の目的遺伝子発現用カセットを含むウイルスベクターも含まれる。ウイルスベクターのうち例えばAdベクターやAAVベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とするが、本発明の遺伝子発現用カセットは、安定的持続的に遺伝子を発現させることができるので、遺伝子発現の用途に応じて用いるのが望ましい。該ウイルスベクターは、ベクターとして使用可能なウイルスゲノム上に、上記の目的遺伝子発現用カセットを挿入して作製することができる。 The present invention further includes a viral vector containing the above-mentioned cassette for expressing the target gene. Among viral vectors, for example, Ad vector and AAV vector enable specific diagnosis or treatment of diseases such as cancer, but the gene expression cassette of the present invention can express genes stably and continuously. , It is desirable to use it according to the purpose of gene expression. The viral vector can be prepared by inserting the above-mentioned cassette for expressing the target gene into a viral genome that can be used as a vector.
本発明の遺伝子発現用カセットを挿入したベクターを細胞に導入し、該細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞で目的遺伝子を発現させ、目的タンパク質を産生することができる。本発明の遺伝子発現用カセットを導入し目的タンパク質を産生させるためには、真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属細菌等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、HEK293細胞、CHO細胞、Hela細胞、COS細胞、BHK細胞、Vero細胞等の哺乳類細胞が用いられる。形質転換された前記の宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して目的とするタンパク質を産生させることができる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の公知の培養用培地を使用することができる。産生されたタンパク質は、分泌タンパク質の場合は培養液中から、非分泌タンパク質の場合は細胞抽出物中から公知の方法で精製することができる。目的タンパク質を産生させる場合、細胞に別々の目的遺伝子を含む複数のベクターを同時にトランスフェクトさせて産生してもよい。このようにすることにより、一度に複数のタンパク質を産生することができる。 By introducing a vector into which the gene expression cassette of the present invention is inserted into a cell and transfecting the cell, the target gene can be expressed in the cell and the target protein can be produced. A eukaryotic cell or prokaryotic cell line can be used to introduce the gene expression cassette of the present invention and produce the target protein. Examples of eukaryotic cells include established mammalian cell lines, insect cell lines, filamentous fungal cells, yeast cells and the like, and prokaryotic cells include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus spp. Bacterial cells can be mentioned. Preferably, mammalian cells such as HEK293 cells, CHO cells, Hela cells, COS cells, BHK cells and Vero cells are used. The transformed host cell can be cultured in vitro or in vivo to produce a protein of interest. The host cells are cultured according to a known method. For example, known culture media such as DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium. The produced protein can be purified by a known method from a culture solution in the case of a secretory protein and from a cell extract in the case of a non-secretory protein. When producing a target protein, cells may be simultaneously transfected with a plurality of vectors containing different target genes. By doing so, a plurality of proteins can be produced at one time.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
(実施例1)遺伝子発現用カセット
本実施例では、各種コンストラクトの遺伝子発現用カセットを構築した。具体的には、IDT社のプロモーターのないクローニング用プラスミドベクター(pIDT-SMART)に特許文献4に示す一過性発現において最も高効率にタンパク質を産生可能な遺伝子発現用カセットを挿入することにより、pCMViR-TSC発現ベクターを作製した(図1)。pCMViRとは、CMV-iプロモーターの下流にRU5'配列が挿入されていることを示す。
(Example 1) Gene expression cassette In this example, gene expression cassettes of various constructs were constructed. Specifically, by inserting a gene expression cassette capable of producing a protein with the highest efficiency in transient expression shown in
本発明の遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の上流及び下流にトランスポゾン配列(T)、複製開始配列(S)、核マトリックス結合配列(M)を図2に示すNo.1〜No.10の各組み合わせで構築した。 The gene expression cassette of the present invention shows a transposon sequence (T), a replication initiation sequence (S), and a nuclear matrix binding sequence (M) upstream and downstream of a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence. It was constructed with each combination of No. 1 to No. 10 shown in 2.
本実施例において、目的遺伝子は、GFP(Green fluorescent protein)、Puror(Puromycin耐性)及び2A (2A self-processing peptide - 短い自己プロセッシング性ペプチド)を含み、「GFP-2A-Puror」で示した。また、ポリA付加配列は「BGH polyA」、プロモーター(P)は「CMViRプロモーター」、エンハンサー(P')は、「hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーを連結したもの」を用いた。図2において、トランスポゾン配列(T)は「TP」、複製開始配列(S)は「ROIS」又は「ARS」、核マトリックス結合配列(M)は「MIS」で示した。トランスポゾン配列(T)には、例えばNo.2, 5, 9で示すように、「TP」で特定される配列が複数含まれていてもよい。 In this embodiment, the gene of interest, GFP (Green fluorescent protein), Puro r (Puromycin resistance) and 2A - include (2A self-processing peptide short self-processing peptide), indicated by "GFP-2A-Puro r" It was. The polyA addition sequence was "BGH polyA", the promoter (P) was "CMViR promoter", and the enhancer (P') was "hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer linked". In FIG. 2, the transposon sequence (T) is indicated by “TP”, the replication initiation sequence (S) is indicated by “ROIS” or “ARS”, and the nuclear matrix binding sequence (M) is indicated by “MIS”. The transposon sequence (T) may contain a plurality of sequences specified by "TP", for example, as shown in Nos. 2, 5 and 9.
上記において、プロモーター(P)の上流の5'側TP(5'TP)の塩基配列を配列番号1に示し、5'側TP領域の全配列を配列番号2に示した(図3参照)。そして、エンハンサー(P')の下流の3'側TP(3'TP)の塩基配列を配列番号3に示し、3'側TP領域の全配列を配列番号4に示した(図4参照)。また、複製開始配列(S)のうち、ROISの塩基配列を配列番号5に、ARSの塩基配列を配列番号6に示した。さらに、MISの塩基配列を配列番号7に示した。 In the above, the nucleotide sequence of the 5'side TP (5'TP) upstream of the promoter (P) is shown in SEQ ID NO: 1, and the entire sequence of the 5'side TP region is shown in SEQ ID NO: 2 (see FIG. 3). Then, the nucleotide sequence of the 3'side TP (3'TP) downstream of the enhancer (P') is shown in SEQ ID NO: 3, and the entire sequence of the 3'side TP region is shown in SEQ ID NO: 4 (see FIG. 4). Further, among the replication initiation sequences (S), the base sequence of ROIS is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence of ARS is shown in SEQ ID NO: 6. Furthermore, the nucleotide sequence of MIS is shown in SEQ ID NO: 7.
5'TP(配列番号1)
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
5'TP (SEQ ID NO: 1)
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
3'TP(配列番号3)
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
3'TP (SEQ ID NO: 3)
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGT GTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
ROIS(配列番号5)
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
ROIS (SEQ ID NO: 5)
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGA CTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
ARS(配列番号6)
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
ARS (SEQ ID NO: 6)
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
MIS(配列番号7)
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
MIS (SEQ ID NO: 7)
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
(実施例2)遺伝子発現用カセットの評価
実施例1で構築したNo.1〜10の各種遺伝子発現用カセット(図2)を含む発現ベクター(No.1〜10の各遺伝子発現ベクター)を作製した。図2に示すpCMViR-TSCを含むベクターをコントロールとした。No.1〜10の内、CHO細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図5(配列番号8)に示した。また、HEK293T細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図6(配列番号9)に示した。図2に示す各遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子であるGFP-2A-PuroをコードするcDNAの配列をEcoRI制限酵素サイトとXbaI制限酵素サイトを用いて正方向に挿入した。
(Example 2) Evaluation of gene expression cassette An expression vector (each gene expression vector of No. 1 to 10) containing various gene expression cassettes (Fig. 2) constructed in Example 1 was prepared. did. The vector containing pCMViR-TSC shown in FIG. 2 was used as a control. Of Nos. 1 to 10, the entire nucleotide sequence of the No. 4 gene expression vector, which is the most effective highly efficient expression plasmid vector in CHO cells, is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 8). In addition, the entire nucleotide sequence of the No. 1 gene expression vector, which is the most effective highly efficient expression plasmid vector in HEK293T cells, is shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 9). In each gene expression cassette shown in FIG. 2, the sequence of cDNA encoding GFP-2A-Puro, which is the target gene, was inserted in the positive direction using the EcoRI restriction enzyme site and the XbaI restriction enzyme site.
No.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを細胞に各々導入し、以下の手順に従い、GFP蛍光タンパク質の発現量を蛍光強度で評価した。
10% FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞((Chinese Hamster Ovary cells)及びHEK293T細胞(Human embryonic kidney cells)を6ウェルプレートで70%〜80%までコンフルエントに培養した。FuGENE(商標)-HD(遺伝子導入試薬)を用いて、No.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを、トランスポゼース発現ベクターとDNA量 1 : 1でコトランスフェクトした。トランスポゼース発現ベクターは、一過性発現用のベクターであるpCMViR-TSC ベクターにトランスポゼース遺伝子を搭載しており、このベクターをNo.1〜10の本発明のトランスポゾン配列 (TP) 搭載各遺伝子発現ベクターとコトランスフェクトすることにより、トランスポゾン配列の末端で遺伝子発現用カセットが切り出され、宿主ゲノム中のTTAA部位に効率よく目的遺伝子が挿入される。このような方法でトランスフェクトした細胞を24時間インキュベート後、細胞のGFP蛍光強度を蛍光プレートリーダー (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific) を用いて測定した。ベクターを導入していない細胞を(-)とした。
Each of No. 1 to 10 gene expression vectors and controls was introduced into cells, and the expression level of GFP fluorescent protein was evaluated by fluorescence intensity according to the following procedure.
6 CHO cells ((Chinese Hamster Ovary cells) and HEK293T cells (Human embryonic kidney cells)) cultured in GIBCO (R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) containing 10% FCS. Confluently cultured from 70% to 80% in a well plate. Using FuGENE ™ -HD (gene transfer reagent), each gene expression vector and control of No. 1 to 10 was subjected to transposase expression vector and
さらに同様にNo.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを導入したCHO細胞及びHEK293T細胞を、48時間培養後から、Puromycin(抗生物質)10μg/mLを添加して、3日に1回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。培養3週間経過後の各細胞の蛍光強度を蛍光プレートリーダーにより測定し、コントロール及びトランスフェクト後、24時間培養した細胞の蛍光強度と比較した。CHO細胞での蛍光強度を図7に示し、HEK293T細胞での蛍光強度を図8に示した。CHO細胞では、培養24時間目のGFP蛍光強度はコントロール及びNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)と殆ど差を認めなかったが、3週間経過後ではNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、明らかに高いGFP蛍光強度を示した。特に、No.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示した(図7)。一方HEK293T細胞では、培養24時間目のGFP発現量はコントロールは高い値を示し、一過性の発現を認めたが、No.1〜10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)よりやや高い値を示したのみであった。3週間経過後ではNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、高いGFP蛍光強度を示す傾向が認められ、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した(図8)。 Similarly, CHO cells and HEK293T cells into which the No. 1 to 10 gene expression vectors and controls have been introduced are cultured for 48 hours, and then Puromycin (antibiotic) 10 μg / mL is added to the medium once every 3 days. Drug selective culture was performed for 3 weeks while exchanging. The fluorescence intensity of each cell after 3 weeks of culturing was measured with a fluorescence plate reader, and compared with the fluorescence intensity of cells cultured for 24 hours after control and transfection. The fluorescence intensity in CHO cells is shown in FIG. 7, and the fluorescence intensity in HEK293T cells is shown in FIG. In CHO cells, the GFP fluorescence intensity at 24 hours of culture was almost the same as that of (-) in both the control and No. 1 to 10 gene expression vectors, but after 3 weeks, No. 1 to No. 1 to The cells into which each of the 10 gene expression vectors had been introduced showed a clearly higher GFP fluorescence intensity than the control. In particular, the No. 4 gene expression vector showed a high value (Fig. 7). On the other hand, in HEK293T cells, the GFP expression level at 24 hours of culture showed a high control value, and transient expression was observed, but all of the gene expression vectors No. 1 to 10 were slightly higher than (-). It only showed a high value. After 3 weeks, cells into which each of the No. 1 to 10 gene expression vectors had been introduced tended to show higher GFP fluorescence intensity than the control, and the No. 1 gene expression vector had a particularly high value. It is shown (Fig. 8).
次に、3週間薬剤選択培養を行った各細胞を蛍光強度測定後回収し、タンパク質定量を行った値を基に細胞の蛍光強度を補正し、その補正値に基づいてNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターの比較・検討を行った。その結果、CHO細胞では、特にNo.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示し(図9)、HEK293T細胞では、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した(図10)。 Next, each cell that had undergone drug selective culture for 3 weeks was collected after measuring the fluorescence intensity, and the fluorescence intensity of the cells was corrected based on the value obtained by protein quantification. Each gene expression vector was compared and examined. As a result, CHO cells showed particularly high values in the No. 4 gene expression vector (Fig. 9), and HEK293T cells showed particularly high values in the No. 1 gene expression vector (Fig. 10).
上記の結果、CHO細胞では、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の上流及び下流にMIS配列とともにROIS配列又はARS配列を含み、さらに上流及び下流にトランスポゾン配列(T)を含む、本発明の遺伝子発現用カセットによれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。またHEK293T細胞では、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の上流及び下流にトランスポゾン配列(T)を含む、本発明の遺伝子発現用カセットによれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。 As a result of the above, the CHO cell contains the ROIS sequence or the ARS sequence together with the MIS sequence upstream and downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence, and further contains the transposon sequence (T) upstream and downstream. According to the gene expression cassette of the present invention, it was confirmed that the target protein can be stably produced for a long period of time. Further, in HEK293T cells, according to the gene expression cassette of the present invention, which contains a transposon sequence (T) upstream and downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence, the target protein can be used for a long period of time. It was confirmed that it can be produced stably.
(実施例3)ヒト・ヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRG)の産生
本実施例では、遺伝子組換えヒトHRGは、以下のように作製した。実施例1に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、目的遺伝子として、配列番号10に示すヒトHRGのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC069574 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)を用い、No.4-HRG発現ベクターを作製した(図11参照) 。具体的には、10% FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞((Chinese Hamster Ovary cells)にFuGENE(商標)-HD(遺伝子導入試薬)を用いて、上記No.4-HRG発現ベクター、トランスポゼース発現ベクター、薬剤耐性遺伝子発現ベクターとして実施例1に示すNo.4遺伝子発現ベクターをDNA量 5 : 4:1でコトランスフェクトした。 遺伝子導入し、48時間培養後から、Puromycin(抗生物質)10μg/mLを添加して、3日に1回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。
(Example 3) Production of human histidine-rich glycoprotein (HRG) In this example, the recombinant human HRG was prepared as follows. Using the No. 4 gene expression cassette, which is the most effective high-efficiency gene expression cassette in the CHO cells shown in Example 1, DNA (GenBank Accession) encoding the coding region of human HRG shown in SEQ ID NO: 10 is used as the target gene. A DNA consisting of the base sequence specified in No. BC069574 (NCBI)) was used to prepare a No. 4-HRG expression vector (see FIG. 11). Specifically, FuGENE ™-in CHO cells ((Chinese Hamster Ovary cells)) cultured in GIBCO (R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) containing 10% FCS. Using HD (gene transfer reagent), the No. 4 gene expression vector shown in Example 1 as the above No. 4-HRG expression vector, transfection expression vector, and drug resistance gene expression vector was used in a DNA amount of 5: 4: 1. Transfected. After gene transfer and culturing for 48 hours, Puromycin (antibiotic) 10 μg / mL was added, and drug selective culture was performed for 3 weeks while exchanging the medium once every 3 days.
成熟HRGのアミノ酸配列(配列番号10)
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
Amino acid sequence of mature HRG (SEQ ID NO: 10)
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
組換えヒトHRGを含む培養上清を回収した。1×PBS(-) 30mLで予め洗浄したQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲル(Sepharose CL-6B支持体にNi-NTAを結合したゲル)を前記培養上清に加え、4℃で回転インキュベーションを2時間行ない、組換えヒトHRGをQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルに結合させた。QIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルを精製用カラムに移した後、洗浄液1(30mM Imidazoleを含むPBS(pH7.4)、洗浄液2(1M NaCl +10mM PB (pH7.4))、洗浄液3(1×PBS (pH7.4))で順次カラムを洗浄した。組換えヒトHRG は、500mM Imidazoleを含むPBS (pH7.4)で、4℃で溶出を行なった。精製品は、ウエスタンブロットとSDS-PAGE 後のタンパク染色でHRGを確認した。 Culture supernatants containing recombinant human HRG were collected. QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel (gel in which Ni-NTA is bound to Sepharose CL-6B support) pre-washed with 30 mL of 1 × PBS (-) is added to the culture supernatant and subjected to rotary incubation at 4 ° C. After 2 hours, recombinant human HRG was bound to QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel. After transferring the QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel to a purification column, cleaning solution 1 (PBS containing 30 mM Imidazole (pH 7.4), cleaning solution 2 (1M NaCl + 10 mM PB (pH 7.4))), cleaning solution 3 ( The columns were washed sequentially with 1 × PBS (pH 7.4)). Recombinant human HRG was eluted with PBS (pH 7.4) containing 500 mM Imidazole at 4 ° C. Refined products were Western blot and SDS. -HRG was confirmed by protein staining after PAGE.
上記本発明の遺伝子組換え手法により作製したHRG(以下、「遺伝子組換えHRG」)と国際公開WO2013/183494号公報の実施例1で作製したヒト血漿由来のHRG(以下、「血漿由来HRG」)について、各々好中球の正球化活性、CLP敗血症モデルマウスの生存率及び活性酸素分子種の産生抑制活性に及ぼす効果を確認した。 HRG prepared by the above-mentioned gene recombination method of the present invention (hereinafter, "genetical recombination HRG") and human plasma-derived HRG prepared in Example 1 of WO2013 / 183494A (hereinafter, "plasma-derived HRG") ), The effects on the neutrophil normalization activity, the survival rate of CLP sepsis model mice, and the production inhibitory activity of reactive oxygen species were confirmed, respectively.
(実験例3−1)好中球の形態
国際公開WO2013/183494号公報の図5に示すフローチャートに従いHRG:2μM、最終濃度1μM)50μlを好中球浮遊液(5×105 cell/mL)50μlに加えた系での好中球の形態をCalceinで細胞を蛍光標識して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、遺伝子組換えHRG及び血漿由来HRGのいずれも同じ効力で正球状形態を誘導することが観察された(図12)。
(Experimental Example 3-1) Morphology of neutrophils HRG: 2 μM,
(実験例3−2)CLP敗血症モデルマウスに及ぼすHRGの効果
本実験例では、盲腸結紮腹膜炎(cecal ligation and puncture: CLP)敗血症モデルで
カプランマイヤー法による生存率を調べた。マウスの腹腔内より盲腸を取り出して、盲腸根部を縫合糸により結紮し、18ゲージ注射針を用いて盲腸壁層に穿刺してCLP敗血症モデルを作製した。単開腹(sham)マウスをコントロールとした。術後5分、24時間及び48時間目に、遺伝子組換えHRG(HRG:400μg/マウス)を尾静脈内投与した(n=10)。HSA及びPBSをコントロールとした(n=10)。その結果、カプランマイヤー法で解析した結果、遺伝子組換えHRG投与グループは有意に高い累積生存率が確認された(図13)。
(Experimental Example 3-2) Effect of HRG on CLP sepsis model mice In this experimental example, the survival rate by the Kaplan-Meier method was investigated in a cecal ligation and puncture (CLP) sepsis model. The cecum was removed from the abdominal cavity of the mouse, the root of the cecum was ligated with a suture, and the cecum wall layer was punctured with an 18-gauge injection needle to prepare a CLP sepsis model. Single laparotomy (sham) mice were used as controls. Genetically modified HRG (HRG: 400 μg / mouse) was intravenously administered to the
(実験例3−3)活性酸素分子種の産生抑制活性
単離したヒト好中球を、イソルミノール(最終濃度 50mM)とHorse radish peroxidase type IV(最終濃度 4 U/mL)を添加してインキュベートし、細胞外放出活性酸素分子種レベルを反応開始15分後に化学発光で測定した。HRG非存在下のレベルを100%とし、0.01〜1.0μM濃度のHRG存在下での値を%表示で算出した(図14)。その結果、遺伝子組換えHRGはヒト血漿から精製したHRGと略等しい活性酸素分子種の産生抑制活性を示した。
(Experimental Example 3-3) Activity of suppressing production of reactive oxygen species neutrophils isolated human neutrophils are incubated by adding isolminol (
(実施例4)遺伝子組換えPD-1の産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるPD-1細胞外ドメインの産生について説明する。本実施例では、プロモーターの上流にTP配列、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー、さらにその下流にMIS配列、ROIS配列、TP配列を連結させた遺伝子発現ベクターを用いて、目的タンパク質を安定かつ高生産するCHO細胞を作製し、その細胞を用いて医薬品候補となるタンパク質を高効率に生産した。使用したコンストラクトの構造を図1(B)に示した。図2のNo.4のコンストラクトを用い、発現させようとする遺伝子をinserted geneとして挿入した。医薬品候補となるタンパク質は、すべて抗体の一部であるヒトIgGの Fc領域と融合させることにより、一般的に体内での安定性が低く薬効が得にくいと考えられているタンパク質製剤の安定性を向上させ、さらにヒトIgG2のFc領域を用いることで、補体活性が低く、副作用となる炎症反応が緩和される医薬品となると考えられる。ヒトIgG2 Fc領域の全塩基配列は図15に示し、リンカー及び制限酵素認識部位を含む塩基配列を、配列表の配列番号11に示した。ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号12に示した。
(Example 4) Production of transgenic PD-1 In this example, the production of PD-1 extracellular domain by gene recombination operation will be described. In this example, the TP sequence is linked upstream of the promoter, the enhancer is linked downstream of the DNA construct containing the gene and poly A addition sequence to be expressed downstream of the promoter, and the MIS sequence, ROIS sequence, and TP sequence are linked further downstream. Using the gene expression vector that was used, CHO cells that stably and highly produce the target protein were prepared, and the cells were used to produce the protein that is a drug candidate with high efficiency. The structure of the construct used is shown in FIG. 1 (B). Using the No. 4 construct in FIG. 2, the gene to be expressed was inserted as an inserted gene. By fusing all the proteins that are drug candidates with the Fc region of human IgG, which is a part of the antibody, the stability of protein preparations, which are generally considered to be low in the body and difficult to obtain drug efficacy, can be improved. By improving it and using the Fc region of human IgG 2 , it is considered that the drug will have low complement activity and alleviate the inflammatory reaction that is a side effect. The entire base sequence of the human IgG 2 Fc region is shown in FIG. 15, and the base sequence containing the linker and restriction enzyme recognition site is shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing. The amino acid sequence of the human IgG 2 Fc region is shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing.
ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列(配列番号12)
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Amino acid sequence of human IgG 2 Fc region (SEQ ID NO: 12)
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
遺伝子組換えPD-1の細胞外ドメインは、以下のように作製した。実施例1に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、目的遺伝子として、図16に示すPD-1細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC074740 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)に示す塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exPD-1-Fc)を作製した。図11に示すHRG搭載コンストラクトのHRGをPD-1-Fcに置き換えたNo.4-exPD-1-Fc発現ベクターを作製した。実施例3と同手法によりexPD-1-Fcをトランスフェクトした。 The extracellular domain of recombinant PD-1 was prepared as follows. Using the No. 4 gene expression cassette, which is the most effective high-efficiency gene expression cassette in the CHO cells shown in Example 1, the DNA encoding the coding region of the PD-1 extracellular domain shown in FIG. 16 was used as the target gene. The sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in FIG. 15 is fused to the base sequence shown in (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC074740 (NCBI)), and the polynucleotide (exPD-1- Fc) was prepared. A No. 4-ex PD-1-Fc expression vector was prepared by replacing the HRG of the HRG-loaded construct shown in FIG. 11 with PD-1-Fc. ExPD-1-Fc was transfected by the same method as in Example 3.
対数増殖期にあるFc融合タンパク質高産生CHO細胞を5×105細胞/mLの濃度に調製し、ハイパーフラスコ(Corning社)へ500mL幡種し、37℃、5 %CO2存在下でCD-CHO Medium(Life Technologies社)を用いて10日間培養し、培養上清を回収した。培養上清は、20mM sodium phosphate(pH7.0)で予め洗浄したProtein G Sepharose 4 Fast Flow (GEヘルスケア社)を充填したカラムへ添加し、Fc融合タンパク質を結合させた。非特異的に結合したタンパク質は、20mM sodium phosphate(pH7.0)を用いて洗浄した。Fc融合タンパク質は、0.1M Glycine-HCl(pH 2.7)で溶出を行い、溶出液は、1M Tris-HCl(pH 9.0)により中和された。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexPD-1-Fcという。成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号14に示した。
Fc fusion protein high-producing CHO cells in the logarithmic growth phase were prepared at a concentration of 5 × 10 5 cells / mL, 500 mL was seeded in a hyperflask (Corning), and CD- was used at 37 ° C in the presence of 5% CO 2. The cells were cultured in CHO Medium (Life Technologies) for 10 days, and the culture supernatant was collected. The culture supernatant was added to a column packed with
成熟型PD-1細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号14)
GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
Amino acid sequence of mature PD-1 extracellular domain (SEQ ID NO: 14)
GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
(実施例5)遺伝子組換えEMMPRINの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMMPRIN細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図17に示すEMMPRIN細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000172270 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exEMMPRIN-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMMPRIN細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEmmprin-Fcという。EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号16に示した。
(Example 5) Production of recombinant EMMPRIN In this example, the production of the extracellular domain of EMMPRIN by the gene recombination operation will be described. As a target gene, to the base sequence of DNA (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000172270 (Ensembl)) encoding the coding region of the EMMPRIN extracellular domain shown in FIG. 17, human IgG 2 shown in FIG. The sequence encoding the Fc region of EMMPRIN was fused to prepare a polynucleotide (exEMMPRIN-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4 to obtain the extracellular domain of EMMPRIN + human IgG 2 . An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exEmmprin-Fc. The amino acid sequence of the EMMPRIN extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 16 of the Sequence Listing.
成熟型EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号16)
ASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDQAIITLRVRSHL
Amino acid sequence of mature EMMPRIN extracellular domain (SEQ ID NO: 16)
ASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSK
(実施例6)遺伝子組換えNPTNβの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるNPTNβ細胞外ドメインの産生について説明する。
(Example 6) Production of recombinant NPTNβ In this example, the production of the extracellular domain of NPTNβ by the genetic recombination operation will be described.
本実施例では、目的遺伝子として、図18に示すNPTNβ細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000156642 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exNPTNβ-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、NPTNβ細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexENPTNβ-Fcという。NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号18に示した。 In this example, as the target gene, the base sequence of the DNA encoding the coding region of the NPTNβ extracellular domain shown in FIG. 18 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000156642 (Ensembl))) is transferred to FIG. The sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in the above was fused to prepare a polynucleotide (exNPTNβ-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4, and the NPTNβ extracellular domain was obtained. + An Fc fusion protein of human IgG 2 was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exENPTNβ-Fc. The amino acid sequence of the NPTNβ extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 18 of the Sequence Listing.
成熟型NPTNβ細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号18)
QNAGFVKSPMSETKLTGDAFELYCDVVGSPTPEIQWWYAEVNRAESFRQLWDGARKRRVTVNTAYGSNGVSVLRITRLTLEDSGTYECRASNDPKRNDLRQNPSITWIRAQATISVLQKPRIVTSEEVIIRDSPVLPVTLQCNLTSSSHTLTYSYWTKNGVELSATRKNASNMEYRINKPRAEDSGEYHCVYHFVSAPKANATIEVKAAPDITGHKRSENKNEGQDATMYCKSVGYPHPDWIWRKKENGMPMDIVNTSGRFFIINKENYTELNIVNLQITEDPGEYECNATNAIGSASVVTVLRVRSHL
Amino acid sequence of mature NPTNβ extracellular domain (SEQ ID NO: 18)
QNAGFVKSPMSETKLTGDAFELYCDVVGSPTPEIQWWYAEVNRAESFRQLWDGARKRRVTVNTAYGSNGVSVLRITRLTLEDSGTYECRASNDPKRNDLRQNPSITWIRAQATISVLQKPRIVTSEEVIIRDSPVLPVTLQCNLTSSSHTLTYSYWTKNGVELSATRKNASNMEYRINKPRAEDSGEYHCVYHFVSAPKANATIEVKAAPDITGHKRSENKNEGQDATMYCKSVGYPHPDWIWRKKENGMPMDIVNTSGRFFIINKENYTELNIVNLQITEDPGEYECNATNAIGSASVVTVLRVRSHL
(実施例7)遺伝子組換えEMBの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMB細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図19に示すEMB細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC059398 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exEMBβ-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMB細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEMB-Fcという。EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号20に示した。
(Example 7) Production of recombinant EMB In this example, the production of the extracellular domain of EMB by the genetic recombination operation will be described. As the target gene, to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the EMB extracellular domain shown in FIG. 19 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC059398 (NCBI)) Human IgG 2 shown in FIG. The sequence encoding the Fc region of EMB was fused to prepare a polynucleotide (exEMBβ-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4, and the EMB extracellular domain + human IgG 2 An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exEMB-Fc. The amino acid sequence of the EMB extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 20 of the sequence listing.
成熟型EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号20)
DGSAPDSPFTSPPLREEIMANNFSLESHNISLTEHSSMPVEKNITLERPSNVNLTCQFTTSGDLNAVNVTWKKDGEQLENNYLVSATGSTLYTQYRFTIINSKQMGSYSCFFREEKEQRGTFNFKVPELHGKNKPLISYVGDSTVLTCKCQNCFPLNWTWYSSNGSVKVPVGVQMNKYVINGTYANETKLKITQLLEEDGESYWCRALFQLGESEEHIELVVLSYLVP
Amino acid sequence of mature EMB extracellular domain (SEQ ID NO: 20)
DGSAPDSPFTSPPLREEIMANNFSLESHNISLTEHSSMPVEKNITLERPSNVNLTCQFTTSGDLNAVNVTWKKDGEQLENNYLVSATGSTLYTQYRFTIINSKQMGSYSCFFREEKEQRGTFNFKVPELHGKNKPLISYVGDSTVLTCKCQNCFPLNWT
(実施例8)遺伝子組換えRAGEの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるRAGE細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図20に示すRAGE細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000204305 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exRAGE-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、RAGE細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexRAGE-Fcという。RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号22に示した。
(Example 8) Production of recombinant RAGE In this example, the production of the extracellular domain of RAGE by the genetic recombination operation will be described. As a target gene, to the base sequence of DNA (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000204305 (Ensembl)) encoding the coding region of the RAGE extracellular domain shown in FIG. 20, human IgG 2 shown in FIG. The sequence encoding the Fc region of RAGE was fused to prepare a polynucleotide (exRAGE-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4, and the RAGE extracellular domain + human IgG 2 was obtained. An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exRAGE-Fc. The amino acid sequence of the RAGE extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 22 of the sequence listing.
成熟型RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号22)
QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLA
Amino acid sequence of mature RAGE extracellular domain (SEQ ID NO: 22)
QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLA
(実施例9)遺伝子組換えMCAMの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるMCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図21に示すMCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC056418 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exMCAM-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、MCAM細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexMCAM-Fcという。MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号24に示した。
(Example 9) Production of recombinant MCAM In this example, the production of the extracellular domain of MCAM by the genetic recombination operation will be described. As the target gene, to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the MCAM extracellular domain shown in FIG. 21 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC056418 (NCBI)) Human IgG 2 shown in FIG. The sequence encoding the Fc region of MCAM was fused to prepare a polynucleotide (exMCAM-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4 to obtain the extracellular domain of MCAM + human IgG 2 . An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exMCAM-Fc. The amino acid sequence of the MCAM extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 24 of the Sequence Listing.
成熟型MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号24)
VPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQGLDLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETGQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVNVAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRG
Amino acid sequence of mature MCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 24)
VPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQGLDLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETGQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVNVAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRG
(実施例10)遺伝子組換えALCAMの産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるALCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図22に示すALCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC137097 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exALCAM-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ALCAM細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexALCAM-Fcという。ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号26に示した。
(Example 10) Production of recombinant ALCAM In this example, the production of ALCAM extracellular domain by the genetic recombination operation will be described. As the target gene, to the base sequence of the DNA encoding the coding region of the ALCAM extracellular domain shown in FIG. 22 (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. BC137097 (NCBI)) Human IgG 2 shown in FIG. The sequence encoding the Fc region of ALCAM was fused to prepare a polynucleotide (exALCAM-Fc), and other than that, the gene recombination operation was performed by the same method as in Example 4 to obtain ALCAM extracellular domain + human IgG 2 . An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exALCAM-Fc. The amino acid sequence of the ALCAM extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 26 of the Sequence Listing.
成熟型ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号26)
WYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYINGRYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK
Amino acid sequence of mature ALCAM extracellular domain (SEQ ID NO: 26)
WYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYINGRYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK
(実施例11)遺伝子組換えErbB2の産生
本実施例では、遺伝子組換え操作によるErbB2細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図23に示すErbB2細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000141736 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exErbB2-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ErbB2細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexErbB2-Fcという。ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号28に示した。
(Example 11) Production of recombinant ErbB2 In this example, the production of the extracellular domain of ErbB2 by the gene recombination operation will be described. As the target gene, to the base sequence of the DNA (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. ENSG00000141736 (Ensembl)) encoding the coding region of the ErbB2 extracellular domain shown in FIG. 23, the human IgG 2 shown in FIG. the fusion of the sequence encoding the Fc region, to produce a polynucleotide (exErbB2-Fc), except for using, due same manner as in example 4 performed transgenic manipulation of ErbB2 extracellular domain + human IgG 2 An Fc fusion protein was prepared. The Fc fusion protein prepared in this example is called exErbB2-Fc. The amino acid sequence of the ErbB2 extracellular domain is shown in SEQ ID NO: 28 of the Sequence Listing.
成熟型ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号28)
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
Amino acid sequence of mature ErbB2 extracellular domain (SEQ ID NO: 28)
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
(実施例12)遺伝子組換えHRGの産生
本実施例では、目的遺伝子として、図24に示すHRGのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC069574 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(HRG-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、HRG+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をHRG-Fcという。HRGのアミノ酸配列は実施例3と同様に配列表の配列番号10に示した。
(Example 12) Production of recombinant HRG In this example, the target gene consists of the base sequence specified by the DNA (GenBank Accession No. BC069574 (NCBI)) encoding the coding region of HRG shown in FIG. 24. The nucleotide sequence of DNA) was fused with the sequence encoding the Fc region of human IgG 2 shown in FIG. 15, and a polynucleotide (HRG-Fc) was prepared and used. Other than that, the gene was recombined by the same method as in Example 4. The operation was carried out to prepare an Fc fusion protein of HRG + human IgG 2. The Fc fusion protein prepared in this example is called HRG-Fc. The amino acid sequence of HRG is shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing as in Example 3.
(実験例)タンパク質発現量
実施例4〜12の方法で作製した各精製Fc融合タンパク質をSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によってFc融合タンパク質の純度を確認した(図25)。さらにこの精製Fc融合タンパク質のタンパク質量をBradford法により定量し、500mL培養時の精製タンパク質量を算出し、表1に示した。
(Experimental Example) Protein Expression Amount Each purified Fc fusion protein prepared by the methods of Examples 4 to 12 was separated using SDS-PAGE, and the purity of the Fc fusion protein was confirmed by CBB staining (Fig. 25). Further, the protein amount of this purified Fc fusion protein was quantified by the Bradford method, and the purified protein amount at the time of 500 mL culture was calculated and shown in Table 1.
以上詳述したように、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、プロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター(P)の上流及びエンハンサー(P')の下流にトランスポゾン配列(T)を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセットによれば、従来遺伝子組換えによる作製が困難であったタンパク質も大量に産生させることができる。さらに、上記において、トランスポゾン配列(T)とともに、複製開始配列(S)の上流に核マトリックス結合配列(M)を組み合わせて適宜配置することで、より効果的に目的タンパク質を安定的かつ大量に産生することができる。 As described in detail above, in the gene expression cassette in which the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence has a structure sandwiched between the promoter (P) and the enhancer (P'), the promoter (P) is further added. According to the gene expression cassette, which is characterized by containing the transposon sequence (T) upstream of the enhancer (P') and downstream of the enhancer (P'), a large amount of protein which was conventionally difficult to produce by gene recombination can be produced. Can be done. Furthermore, in the above, by appropriately arranging the nuclear matrix binding sequence (M) upstream of the replication initiation sequence (S) together with the transposon sequence (T), the target protein can be produced in a stable and large amount more effectively. can do.
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット(例えば、特許文献4に示すpCMViR-TSCベクター)をトランスポゾン配列(T)で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに複製開始配列(S)、核マトリックス結合配列(M)を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、プロモーター(P)の上流にトランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)の下流に目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流にエンハンサー(P')、さらにその下流に核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)、トランスポゾン配列(T)を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の遺伝子発現用ベクターによれば、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の発現ベクターと比較して数倍から数十倍の高発現を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between transposon sequences (T) to efficiently express a high number of copies of a gene on a chromosome. Allows you to insert a cassette. Furthermore, by linking the replication initiation sequence (S) and the nuclear matrix binding sequence (M) upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be amplified with high efficiency. It will be possible. Specifically, the transposon sequence (T) is upstream of the promoter (P), the enhancer (P') is downstream of the DNA construct (X) containing the target gene and the poly A addition sequence downstream of the promoter (P), and the enhancer (P') thereof. By linking the nuclear matrix binding sequence (M), replication initiation sequence (S), and transposon sequence (T) downstream, cells that stably and highly produce the target protein can be obtained. According to the gene expression vector of the present invention, one of the pCMViR-TSC vectors that achieved several to several tens of times higher expression than the conventional expression vector, despite the stable expression cell line after drug selection. An expression level that further surpassed the transient expression level was achieved.
例えば、細胞の種類、遺伝子の種類、トランスフェクション試薬の種類を問わず、遺伝子発現させようとする目的タンパク質を超高発現により、安定かつ大量に産生することができる。バイオテクノロジーの分野での試薬としての適用のみならず、治療用のタンパク質医薬としての適用や臨床での遺伝子を用いた治療・検査・診断のために幅広い応用が可能である。 For example, regardless of the type of cell, the type of gene, or the type of transfection reagent, the target protein for which gene expression is to be expressed can be stably and mass-produced by ultra-high expression. It can be applied not only as a reagent in the field of biotechnology, but also as a therapeutic protein drug and for a wide range of clinical treatments, tests, and diagnoses using genes.
医療分野の研究開発のためや、医薬、医薬品、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質として、具体的にはHRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2や抗体が挙げられる。 Specific examples of proteins that can be used for research and development in the medical field and for pharmaceuticals, pharmaceuticals, diagnostic agents or reagents include HRG, PD-1, EMMPRIN, NPTNβ, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, ErbB2 and antibodies. Be done.
Claims (6)
前記(P)がCMVプロモーターであり、(P')がhTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか1種又は複数種を含み、
前記(P)、(M)及び(S)で特定される各塩基配列が、5'→3'の順で配置されており、
前記(P)、(X)、(P')、(T)、(M)及び(S)より選択されるいずれかが、以下の1)〜3)のいずれかに示す順序で連結して遺伝子発現用カセットに配置する工程を含む、遺伝子発現用カセットの作製方法:
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(M)、(S)、(T)
2)(T)、(M)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T)
3)(T)、(M)、(S)、(P)、(X)、(P')、(M)、(S)、(T)。 In a method for producing a gene expression cassette in which a DNA construct (X) containing a target gene and a poly A addition sequence is sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P'), the target gene is HRG, PD-1. , EMMPRIN, NPTNβ, EMB, RAGE, MCAM, ALCAM, ErbB2 and genes encoding parts or whole of proteins selected from antibodies, upstream of promoter (P) and downstream of enhancer (P'). A step of arranging the transposon sequence (T) and further arranging the nuclear matrix binding sequence (M) and the replication initiation sequence (S) upstream of the promoter (P) and / or downstream of the enhancer (P'). Characterized by including
The (P) is a CMV promoter, and (P') contains any one or more selected from hTERT enhancer, CMV enhancer and SV40 enhancer.
The base sequences specified in (P), (M) and (S) are arranged in the order of 5'→ 3'.
Any one selected from the above (P), (X), (P'), (T), (M) and (S) is concatenated in the order shown in any of the following 1) to 3). A method for producing a gene expression cassette, which comprises a step of placing the gene expression cassette:
1) (T), (P), (X), (P'), (M), (S), (T)
2) (T), (M), (S), (P), (X), (P'), (T)
3) (T), (M), (S), (P), (X), (P'), (M), (S), (T) .
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