JP2017070224A - Cassette for gene expression and product thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換えタンパク質を大量かつ安定的に産生しうる遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該遺伝子発現用カセットを用いた遺伝子の発現方法及びその産生物に関する。具体的には、プロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現用カセットに関し、さらには当該プロモーター、エンハンサー等を用いて遺伝子の発現を上昇させる方法に関する。 The present invention relates to a gene expression cassette capable of stably producing a large amount of recombinant protein, and further relates to a gene expression method using the gene expression cassette and a product thereof. Specifically, the present invention relates to a gene expression cassette containing a promoter, an enhancer and the like, and further relates to a method for increasing gene expression using the promoter, enhancer and the like.
遺伝子発現効率を上昇させるために、CMVプロモーターやCAGプロモーターなど様々な遺伝子発現プロモーターが開発されている（特許文献１〜３）。本発明者らが開発したプロモーター、エンハンサーなどの組み合わせを最適化し、大半の哺乳細胞で遺伝子の発現を上昇させるシステムもその１つである（特許文献４、非特許文献１、２を参照）。 In order to increase the gene expression efficiency, various gene expression promoters such as CMV promoter and CAG promoter have been developed (Patent Documents 1 to 3). One of them is a system that optimizes the combination of promoters and enhancers developed by the present inventors and increases gene expression in most mammalian cells (see Patent Document 4, Non-Patent Documents 1 and 2).
より高い効率で遺伝子を発現させることができるシステムの開発を試み、様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行うことにより、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結した、遺伝子の発現用カセットを用いることで、遺伝子を高効率で発現させ得ることが本発明者らにより見いだされ、報告されている（特許文献４、非特許文献１、２を参照）。しかしこのベクターは、細胞の一過性発現に有効なベクターであり、現在、医薬品生産の現場で求められる目的タンパク質を安定かつ高産生する哺乳動物細胞を作製するためには、さらにベクターを改良する必要があった。 By trying to develop a system that can express genes with higher efficiency, and comparing and examining promoter activities by combining promoters and enhancers of various genes, The present inventors have found and reported that a gene can be expressed with high efficiency by using a gene expression cassette in which an enhancer or a second promoter is linked downstream of a DNA construct containing an A added sequence. (See Patent Document 4, Non-Patent Documents 1 and 2). However, this vector is an effective vector for transient expression of cells, and the vector is further improved in order to produce mammalian cells that stably and highly produce the target protein currently required in the field of pharmaceutical production. There was a need.
一般的に、遺伝子組換えの手法による目的タンパク質を安定かつ高産生させる細胞を取得するためには、宿主細胞内の染色体に目的遺伝子を組み込み、遺伝子増幅を利用し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を構築する。その方法として最も頻繁に用いられているのが、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）欠損株CHO-DG44細胞を用いた方法である。具体的には、目的遺伝子及びDHFR遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、目的遺伝子が多コピー組み込まれた細胞を取得する（非特許文献３、４を参照）。しかしながら、係るDHFR欠損細胞を用いた方法は、DHFR阻害剤であるmethotrexate（MTX）の濃度を段階的に増加させながら培養し、高濃度のMTX耐性のクローンを選択することにより、MTXの濃度を段階的に増加させながら培養を行う必要があるため、クローンの取得に時間がかかり、他の細胞への汎用性が低いなどの問題点がある。 Generally, in order to obtain cells that stably and highly produce the target protein by genetic recombination techniques, the target gene is integrated into the chromosome in the host cell, and gene amplification is used to incorporate multiple copies of the target gene. Build up cells. The most frequently used method is a method using CHO-DG44 cells lacking dihydrofolate reductase (DHFR). Specifically, a vector containing the target gene and the DHFR gene is introduced into the cell to obtain a cell into which the target gene is incorporated in multiple copies (see Non-Patent Documents 3 and 4). However, the method using such DHFR-deficient cells increases the concentration of MTX by culturing while gradually increasing the concentration of the DHFR inhibitor methotrexate (MTX), and selecting a high concentration MTX resistant clone. Since it is necessary to carry out the culture while increasing it stepwise, it takes time to obtain clones and there are problems such as low versatility for other cells.
上述したごとく、遺伝子発現効率を上昇させるための技術は、様々なプロモーターの開発などにより、改良が進められている。しかし哺乳動物細胞におけるタンパク質の産生系は、大腸菌や酵母など他の宿主と比較して十分なタンパク質を得ることが難しい。バイオテクノロジーの分野では、これらの従来技術を用いても、細胞の種類や遺伝子の種類によって、遺伝子発現がほとんど起こらない、又は発現タンパク質量が極めて少ないといった問題が日常的に発生している。また、この問題は、遺伝子発現を診断や治療に用いる医療の発展において、大きな障壁となっている。 As described above, techniques for increasing gene expression efficiency are being improved by the development of various promoters. However, protein production systems in mammalian cells are difficult to obtain sufficient proteins compared to other hosts such as E. coli and yeast. In the field of biotechnology, even if these conventional techniques are used, problems such as almost no gene expression or a very small amount of expressed protein occur on a daily basis, depending on the cell type and gene type. This problem is also a major barrier in the development of medicine that uses gene expression for diagnosis and treatment.
例えば、HRG（Histidine-rich glycoprotein）は、1972年にHeimburger et al (1972)によって同定された分子量約80 kDaの血漿タンパク質である。合計507個のアミノ酸より構成され、そのうちヒスチジンが66存在する高ヒスチジン含有タンパク質であり、主として肝臓で合成され、約100〜150μg/mLという非常に高いと考えられる濃度でヒト血漿中に存在する。しかしながら、HRGの臨床的意義を検討するために、遺伝子組み換え技術によって充分量のHRGを産生する方法が望まれていた。 For example, Histidine-rich glycoprotein (HRG) is a plasma protein having a molecular weight of about 80 kDa, identified by Heimburger et al (1972) in 1972. It is a high histidine-containing protein composed of a total of 507 amino acids, of which 66 histidines are present, is synthesized primarily in the liver and is present in human plasma at concentrations considered to be very high, about 100-150 μg / mL. However, in order to examine the clinical significance of HRG, a method for producing a sufficient amount of HRG by genetic recombination technology has been desired.
本発明は、目的タンパク質を安定かつ高産生するための遺伝子発現用カセットを提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a gene expression cassette for stably and highly producing a target protein.
本願発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットに、さらにプロモーター（Ｐ）の上流とエンハンサー（Ｐ'）の下流に、各々トランスポゾン配列（Ｔ）を含む遺伝子発現用カセットを用いることで目的タンパク質を安定かつ高産生できることを見出し、本発明を完成した。。 As a result of intensive studies, the inventors of the present application have a gene having a structure in which a gene to be expressed and a DNA construct (X) containing a poly A addition sequence are sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P ′). It has been found that the target protein can be stably and highly produced by using a gene expression cassette containing a transposon sequence (T) upstream of the promoter (P) and downstream of the enhancer (P ′) in the expression cassette. Completed the invention. .
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
２．さらに、プロモーター（Ｐ）の上流及び／又はエンハンサー（Ｐ'）の下流に、複製開始配列（Ｓ）が配置されていることを特徴とする、前項１に記載の遺伝子発現用カセット。
３．プロモーター（Ｐ）、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）及びトランスポゾン配列（Ｔ）が含まれ、更に選択的に複製開始配列（Ｓ）を含む遺伝子発現用カセットが、以下の１）〜４）のいずれかに示す順序で含まれる、前項１又は２に記載の遺伝子発現用カセット：
１）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。
４．複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）が配置されていることを特徴とする前項２又は３に記載の遺伝子発現用カセット。
５．トランスポゾン配列（Ｔ）、プロモーター（Ｐ）、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）、エンハンサー（Ｐ'）、核マトリックス結合配列（Ｍ）、複製開始配列（Ｓ）及びトランスポゾン配列（Ｔ）を含む、遺伝子発現用カセット。
６．複製開始配列（Ｓ）が、ROIS及び／又はARSである前項２〜５のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
７．プロモーター（Ｐ）が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、前項１〜６のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
８．発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）の下流に連結したエンハンサー（Ｐ'）が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか１種又は複数種を含む、前項１〜７のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
９．発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）において、発現させようとする遺伝子が、疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質をコードするDNAである、１〜８のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
１０．疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質が、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）である、前項９に記載の遺伝子発現用カセット。
１１．疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質が、抗体である、前項９に記載の遺伝子発現用カセット。
１２．前項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
１３．前項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
１４．前項１〜１１のいずれかに記載の発現用カセットを用いて発現させようとする遺伝子を発現させる方法。
１５．前項１０に記載の発現用カセットを用いて産生されたヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）。
That is, this invention consists of the following.
1. In a gene expression cassette having a structure in which a gene to be expressed and a DNA construct (X) containing a poly A addition sequence are sandwiched between a promoter (P) and an enhancer (P ′), and further upstream of the promoter (P) A gene expression cassette comprising a transposon sequence (T) downstream of an enhancer (P ′).
2. 2. The gene expression cassette according to item 1, wherein the replication initiation sequence (S) is arranged upstream of the promoter (P) and / or downstream of the enhancer (P ′).
3. A promoter (P), a DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence, an enhancer (P ′) and a transposon sequence (T) are included. The gene expression cassette according to item 1 or 2, wherein the gene expression cassette is contained in the order shown in any of 1) to 4) below:
1) (T), (P), (X), (P ′), (T);
2) (T), (S), (P), (X), (P ′), (T);
3) (T), (P), (X), (P ′), (S), (T);
4) (T), (S), (P), (X), (P ′), (S), (T).
4). 4. The gene expression cassette according to item 2 or 3, wherein a nuclear matrix binding sequence (M) is arranged upstream of the replication initiation sequence (S).
5. DNA construct (X) including transposon sequence (T), promoter (P), gene to be expressed and poly A addition sequence, enhancer (P ′), nuclear matrix binding sequence (M), replication initiation sequence (S) And a cassette for gene expression comprising a transposon sequence (T).
6). 6. The gene expression cassette according to any one of 2 to 5 above, wherein the replication initiation sequence (S) is ROIS and / or ARS.
7). The gene expression according to any one of items 1 to 6, wherein the promoter (P) is a promoter selected from the group consisting of a CMV promoter, a CMV-i promoter, an SV40 promoter, an hTERT promoter, a β actin promoter, and a CAG promoter. cassette.
8). The enhancer (P ′) linked downstream of the gene to be expressed and the DNA construct (X) containing the poly A addition sequence is selected from one or more selected from the hTERT enhancer, CMV enhancer and SV40 enhancer 8. The gene expression cassette according to any one of 1 to 7 above.
9. In a DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence, the gene to be expressed is a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease, or a protein that can be used for a medicine, a diagnostic agent, or a reagent The gene expression cassette according to any one of 1 to 8, which is a DNA to be encoded.
10. 10. The gene expression cassette according to item 9 above, wherein the therapeutic gene that can be used for treatment of a disease or the protein that can be used for a medicine, a diagnostic agent, or a reagent is histidine-rich glycoprotein (HRG).
11. 10. The gene expression cassette according to item 9, wherein the therapeutic gene that can be used for treatment of a disease or the protein that can be used for a drug, a diagnostic agent, or a reagent is an antibody.
12 A gene expression plasmid comprising the gene expression cassette according to any one of 1 to 11 above.
13. 12. A gene expression vector comprising the gene expression cassette according to any one of 1 to 11 above.
14 A method for expressing a gene to be expressed using the expression cassette according to any one of 1 to 11 above.
15. A histidine-rich glycoprotein (HRG) produced using the expression cassette according to item 10 above.
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）を「トランスポゾン配列（Ｔ）」で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに「複製開始配列（Ｓ）」、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」 を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、「プロモーター（Ｐ）」の上流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」、「プロモーター（Ｐ）」の下流に「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の下流に「エンハンサー（Ｐ'）」、さらにその下流に「核マトリックス結合配列（Ｍ）」、「複製開始配列（Ｓ）」、「トランスポゾン配列（Ｔ）」を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の新規な遺伝子発現用ベクターは、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の遺伝子発現用ベクターと比較して数倍から数十倍の高産生を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between “transposon sequences (T)”, whereby a high copy number can be efficiently copied to a chromosome. Allows insertion of a gene expression cassette. Furthermore, by connecting the “replication initiation sequence (S)” and “nuclear matrix binding sequence (M)” upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be increased with high efficiency. It can be amplified. Specifically, a DNA construct (X) comprising a “transposon sequence (T)” upstream of the “promoter (P)” and a gene to be expressed and a poly A addition sequence downstream of the “promoter (P)” To the target protein by linking “enhancer (P ′)” downstream of “nuclear matrix binding sequence (M)”, “replication initiation sequence (S)” and “transposon sequence (T)”. Can be obtained stably and highly producing cells. The novel gene expression vector of the present invention is a pCMViR-TSC vector that achieves several to several tens of times higher production than conventional gene expression vectors, despite the stable expression cell line after drug selection. The expression level further surpassing the transient expression level was achieved.
本明細書において「遺伝子発現用カセット」とは、発現させようとするタンパク質を遺伝子組換え操作によって発現可能とするためのDNAのセットをいい、より具体的には、目的タンパク質をコードする遺伝子（発現させようとする遺伝子）を含み、さらに当該遺伝子を発現可能とするための各種DNA配列を含むDNAのセットをいう。 In the present specification, the “gene expression cassette” refers to a set of DNAs that allow a protein to be expressed to be expressed by gene recombination. More specifically, a gene encoding a target protein ( A set of DNAs including various DNA sequences for allowing the gene to be expressed.
本明細書において「遺伝子発現用カセット」には、少なくとも「プロモーター（Ｐ）」、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」及び「エンハンサー（Ｐ’）」の機能を有する各DNAを含み、さらに「トランスポゾン配列（Ｔ）」を含むことを特徴とする。さらに、「複製開始配列（Ｓ）」や「核マトリックス結合配列（Ｍ）」を含んでいてもよい。 In the present specification, the “gene expression cassette” includes at least “promoter (P)”, “DNA construct containing gene to be expressed and poly A addition sequence (X)” and “enhancer (P ′)”. Each DNA has a function, and further includes a “transposon sequence (T)”. Furthermore, “replication initiation sequence (S)” and “nuclear matrix binding sequence (M)” may be included.
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」が、少なくとも「プロモーター（Ｐ）」と「エンハンサー（Ｐ'）」で挟まれる構造を有し、さらに「プロモーター（Ｐ）」の上流、及び「エンハンサー（Ｐ'）」の下流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」を含むことを特徴とする。さらに、「プロモーター（Ｐ）」の上流、及び／又は「エンハンサー（Ｐ'）」の下流に、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」と「複製開始配列（Ｓ）」が配置されていてもよい。 In the “gene expression cassette” of the present invention, “a DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence” is sandwiched between at least a “promoter (P)” and an “enhancer (P ′)”. And further comprising a “transposon sequence (T)” upstream of the “promoter (P)” and downstream of the “enhancer (P ′)”. Further, “nuclear matrix binding sequence (M)” and “replication initiation sequence (S)” may be arranged upstream of “promoter (P)” and / or downstream of “enhancer (P ′)”. .
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）を「トランスポゾン配列（Ｔ）」で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに「複製開始配列（Ｓ）」、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」 を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、或いは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、「プロモーター（Ｐ）」の上流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」、「プロモーター（Ｐ）」の下流に「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」、その下流に「エンハンサー（Ｐ'）」、さらにその下流に「核マトリックス結合配列（Ｍ）」、「複製開始配列（Ｓ）」、「トランスポゾン配列（Ｔ）」を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between “transposon sequences (T)”, whereby a high copy number can be efficiently copied to a chromosome. Allows insertion of a gene expression cassette. Furthermore, by connecting the “replication initiation sequence (S)” and “nuclear matrix binding sequence (M)” upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be increased with high efficiency. It can be amplified. Specifically, a DNA construct (X) comprising a “transposon sequence (T)” upstream of the “promoter (P)” and a gene to be expressed and a poly A addition sequence downstream of the “promoter (P)” ”,“ Enhancer (P ′) ”downstream thereof, and“ nuclear matrix binding sequence (M) ”,“ replication initiation sequence (S) ”,“ transposon sequence (T) ”downstream thereof, Cells that stably and highly produce proteins are obtained.
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、プロモーターを（Ｐ）、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物を（Ｘ）、エンハンサーを（Ｐ'）及びトランスポゾン配列を（Ｔ）、複製開始配列を（Ｓ）としたときに、少なくとも以下の１）〜４）のいずれかに示す順序で構成される。ここにおいて、「トランスポゾン配列（Ｔ）」には、トランスポゾンを特定する配列を２回以上連結したものが含まれていてもよい。
１）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。
The “gene expression cassette” of the present invention comprises a promoter (P), a DNA construct containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence (X), an enhancer (P ′) and a transposon sequence (T). When the replication start sequence is (S), at least one of the following orders 1) to 4) is configured. Here, the “transposon sequence (T)” may include a sequence in which a transposon-identifying sequence is linked two or more times.
1) (T), (P), (X), (P ′), (T);
2) (T), (S), (P), (X), (P ′), (T);
3) (T), (P), (X), (P ′), (S), (T);
4) (T), (S), (P), (X), (P ′), (S), (T).
本明細書において、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」のうち、「発現させようとする遺伝子」は、人工的に挿入した外来タンパク質をコードする遺伝子（DNA）を含み、ホスト細胞と由来が異なる遺伝子であってもよいし、由来が同じ遺伝子であってもよい。また、発現遺伝子の検出や疾患の診断のためにレポーター遺伝子が含まれていてもよい。なお、発現させようとする遺伝子を標的遺伝子や目的遺伝子と呼び、産生させようとするタンパク質を標的タンパク質や目的タンパク質と呼ぶ場合もある。また、遺伝子発現用カセットの構築の観点からは、これらの遺伝子を本発明の遺伝子発現用カセットの標的遺伝子の領域に挿入するので、挿入遺伝子ともいい、また外来遺伝子ということもある。「ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）」は自体公知の配列を適用することができ、その由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を遺伝子発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。 In the present specification, among “a DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A additional sequence”, “a gene to be expressed” is a gene encoding a foreign protein artificially inserted ( A gene having a different origin from that of the host cell, or a gene having the same origin. In addition, a reporter gene may be included for detection of an expressed gene or diagnosis of a disease. A gene to be expressed may be called a target gene or a target gene, and a protein to be produced may be called a target protein or a target protein. From the viewpoint of constructing a gene expression cassette, since these genes are inserted into the target gene region of the gene expression cassette of the present invention, they are also referred to as inserted genes and sometimes referred to as foreign genes. The “poly A addition sequence (polyadenylation sequence, polyA)” can be a sequence known per se, and its origin is not limited, and a poly A addition sequence derived from a growth hormone gene, such as a poly sequence derived from a bovine growth hormone gene. Examples include A addition sequences, poly A addition sequences derived from human growth hormone genes, poly A addition sequences derived from SV40 virus, poly A addition sequences derived from human and rabbit β-globin genes, and the like. Inclusion of the poly A addition sequence in the gene expression cassette increases transcription efficiency.
本明細書において、「発現させようとする遺伝子」の種類は限定されず、組換え体を製造しようとするあらゆるタンパク質をコードするDNAや特定の疾患の治療に用いるために生体内で発現させようとするタンパク質をコードするDNAを用いることができる。「発現させようとする遺伝子」として、疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質をコードするDNAが挙げられる。疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質として、具体的には「ヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）」や「抗体」が挙げられる。 In the present specification, the type of “gene to be expressed” is not limited, and it may be expressed in vivo for use in the treatment of DNA encoding any protein for which a recombinant is to be produced or a specific disease. DNA encoding the protein can be used. Examples of the “gene to be expressed” include a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease, or a DNA that encodes a protein that can be used for a medicine, a diagnostic agent, or a reagent. Specific examples of therapeutic genes that can be used for treatment of diseases, or proteins that can be used for drugs, diagnostic agents, or reagents include “histidine-rich glycoprotein (HRG)” and “antibodies”.
HRGをコードする全長cDNA、又はHRGの活性を有する部分をコードするcDNA、例えば、成熟HRGのアミノ酸配列（配列番号１０）をコードする全長cDNA、又は部分をコードするcDNAを、発現ベクターにクローニングし、調製することもできる。例えば、GenBank Accession No.NM000412で特定されるヌクレオチドの全体又は部分から、遺伝子組換え技術を用いて調製することもできる。本発明の有効成分としてのHRGは、成熟HRGの全体であっても良いし、成熟HRGのうちHRG活性を有する部分タンパク質又はペプチドであっても良い。さらに、糖鎖を含むものであってもよいし糖鎖がなくても良い。HRGは好中球活性化調節剤として機能し、好中球活性化に起因する疾患の治療薬の有効成分として、利用することができる。HRGは好中球活性化に起因する疾患及び／又は好中球活性化を伴う炎症性疾患の治療方法にも有効である。 A full-length cDNA encoding HRG, or a cDNA encoding a portion having HRG activity, for example, a full-length cDNA encoding the amino acid sequence of mature HRG (SEQ ID NO: 10), or a cDNA encoding the portion, is cloned into an expression vector. Can also be prepared. For example, it can also be prepared from the whole or part of the nucleotide specified by GenBank Accession No. NM000412 using a gene recombination technique. The HRG as the active ingredient of the present invention may be the entire mature HRG, or a partial protein or peptide having HRG activity in the mature HRG. Furthermore, it may contain a sugar chain or may not have a sugar chain. HRG functions as a neutrophil activation regulator and can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for diseases caused by neutrophil activation. HRG is also effective for treating diseases caused by neutrophil activation and / or inflammatory diseases accompanied by neutrophil activation.
抗体は、重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、H鎖はN末端側より可変領域（VH）、定常領域（CH）、L鎖はN末端側より可変領域（VL）、定常領域（CL）により、それぞれ構成される。CHはさらに、N末端側よりCH1、ヒンジ、CH2、CH3の各ドメインより構成される。また、CH2とCH3を併せてFc領域という。本発明の方法によって作製される抗体は、インタクト型抗体又は低分子抗体である抗体フラグメントであってもよい。抗体のクラスとしては、例えばイムノグロブリンG（IgG）、イムノグロブリンA（IgA）、イムノグロブリンE（IgE）、及びイムノグロブリンM（IgM）が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体は、IgGであることが好ましい。IgGのサブクラスとしては、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4が挙げられる。本発明の方法によって産生されうる抗体のサブクラスは、用途目的に応じて適宜決定することができ、いずれのサブクラスの抗体であってもよい。抗体フラグメントとしては、Fv、Fab、(Fab')2、Fab'、Fcフラグメント、ダイアボディーからなる群より選択されるその機能的抗体フラグメントが挙げられる。例えば、抗体のFc領域と必要なタンパク質を融合させたFc融合タンパク質（Fc fusion protein）であってもよい。 Antibodies are composed of polypeptides called heavy chains (H chains) and light chains (L chains). The H chain is composed of a variable region (VH) and a constant region (CH) from the N-terminal side, and the L chain is composed of a variable region (VL) and a constant region (CL) from the N-terminal side. CH is further composed of CH1, hinge, CH2, and CH3 domains from the N-terminal side. Further, CH2 and CH3 are collectively referred to as an Fc region. The antibody produced by the method of the present invention may be an antibody fragment that is an intact antibody or a small molecule antibody. Examples of the antibody class include immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), and immunoglobulin M (IgM). The antibody that can be produced by the method of the present invention is preferably IgG. IgG subclasses include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. The subclass of the antibody that can be produced by the method of the present invention can be appropriately determined according to the purpose of use, and may be any subclass of antibody. Antibody fragments include functional antibody fragments selected from the group consisting of Fv, Fab, (Fab ′) 2 , Fab ′, Fc fragment, and diabody. For example, it may be an Fc fusion protein obtained by fusing an antibody Fc region with a necessary protein.
トランスポゾン（Transposon：TP）とは、細胞内においてゲノム上の位置を転移（transposition）することのできる塩基配列である。動く遺伝子、転置因子（Transposable element）とも呼ばれる。DNA断片が直接転移するDNA型と、転写と逆転写の過程を経るRNA型がある。トランスポゾンは、例えばバクテリアや酵母などの微生物でも発見され、これら転置因子は一定の塩基配列をもったDNAで、バクテリアや酵母などの正常の染色体の構成成分として１細胞あたり複数個存在している。この因子は染色体に組込まれて存在するので挿入配列（insertion sequence：IS）とも呼ばれる。トランスポゾンは遺伝子導入のベクターや変異原として有用であり、遺伝学や分子生物学において様々な生物で応用されている。本明細書においても、トランスポゾンは遺伝子発現用カセットに組み込まれる。本明細書において、「トランスポゾン配列（Ｔ）」とは、上記トランスポゾンを特定する配列をいう。繰り返しになるが、「トランスポゾン配列（Ｔ）」には、トランスポゾンを特定する配列を２回以上連結したものが含まれていてもよい。 The transposon (Transposon: TP) is a base sequence capable of transpositioning the position on the genome in a cell. It is also called a transposable element. There are two types: a DNA type in which DNA fragments are transferred directly, and an RNA type that undergoes a process of transcription and reverse transcription. Transposons are also found in microorganisms such as bacteria and yeasts, and these transposable elements are DNAs having a certain base sequence, and a plurality of transposons exist per cell as components of normal chromosomes such as bacteria and yeasts. This factor is also called an insertion sequence (IS) because it exists in the chromosome. Transposons are useful as gene transfer vectors and mutagens, and are applied to various organisms in genetics and molecular biology. Also in this specification, the transposon is incorporated into a gene expression cassette. In the present specification, the “transposon sequence (T)” refers to a sequence that identifies the transposon. Again, the “transposon sequence (T)” may include a sequence in which a transposon-identifying sequence is linked two or more times.
DNAの複製反応は染色体上の決まった部位、複製開始点から始まり両方向に進行していく。真核生物の長大な染色体DNAを細胞周期の決まった時期に正確に複製するためには非常に多くの複製開始点が必要であり、それらの活性は時間的、空間的に制御されていると考えられている。さらにDNA複製を含めた染色体上で起こる様々な反応は互いに密接に関連し、染色体の恒常性が保持されている。複製開始が行われる領域には、「複製開始配列」があり、例えば「複製開始配列（replication origin initiation sequence：ROIS)」や「自立複製配列（autonomously replicating sequence：ARS）」が挙げられる。 The DNA replication reaction begins in a fixed position on the chromosome, the replication origin, and proceeds in both directions. In order to accurately replicate the long chromosomal DNA of eukaryotes at a certain time in the cell cycle, a large number of replication origins are required, and their activities are controlled temporally and spatially. It is considered. Furthermore, various reactions that occur on chromosomes, including DNA replication, are closely related to each other, and chromosome homeostasis is maintained. The region where the replication start is performed includes “replication initiation sequence”, and examples thereof include “replication origin initiation sequence (ROIS)” and “autonomously replicating sequence (ARS)”.
核マトリックスとは、核内のクロマチンの保持だけでなく、遺伝子の転写や複製、DNA損傷修復、アポトーシスに代表される様々な核内イベントが機能するための重要な場を構成すると考えられる。複製開始配列と核マトリックス結合領域を含むプラスミドは、細胞内で効率よく遺伝子を増幅すると考えられる。本明細書において、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」とは、上記核マトリックスに結合する配列として特定される配列をいう。本発明の「遺伝子発現用カセット」において、「複製開始配列（Ｓ）」とともに「核マトリックス結合配列（Ｍ）」を含むのがより好適である。この場合、「複製開始配列（Ｓ）」よりも上流域において「核マトリックス結合配列（Ｍ）」が配置されているのが好適である。 The nuclear matrix is considered to constitute not only the retention of chromatin in the nucleus, but also an important field for the function of various nuclear events represented by gene transcription and replication, DNA damage repair, and apoptosis. A plasmid containing a replication initiation sequence and a nuclear matrix binding region is considered to efficiently amplify a gene in a cell. In the present specification, the “nuclear matrix binding sequence (M)” refers to a sequence specified as a sequence that binds to the nuclear matrix. In the “gene expression cassette” of the present invention, it is more preferable to include a “nuclear matrix binding sequence (M)” together with a “replication initiation sequence (S)”. In this case, it is preferable that the “nuclear matrix binding sequence (M)” is arranged in the upstream region from the “replication initiation sequence (S)”.
本明細書において、「プロモーター」とはDNAを鋳型に転写を開始するDNA上の特定の塩基配列であり、発現させようとする遺伝子の上流に配置される。本明細書において使用可能な「プロモーター（Ｐ）」は特許文献４に示す「第１のプロモーター」を参照し、「エンハンサー（Ｐ’）」は特許文献４に示す「エンハンサー」や「第２のプロモーター」の記載を参照することができる。具体的には、以下に説明する。 In this specification, a “promoter” is a specific base sequence on DNA that initiates transcription using DNA as a template, and is placed upstream of the gene to be expressed. “Promoter (P)” usable in the present specification refers to “first promoter” shown in Patent Document 4, and “enhancer (P ′)” means “enhancer” and “second promoter” shown in Patent Document 4. Reference can be made to the description of "promoter". Specifically, this will be described below.
本明細書において、「プロモーター（Ｐ）」の配列は特に限定されず、自体公知のプロモーターを適用することができる。あらゆる細胞や組織で外来遺伝子の発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。特に本発明において適用可能なプロモーターとして、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターや増殖性細胞特異的プロモーターが好適である。具体的には、SV40プロモーター、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、EF1-alphaプロモーター、ユビキチンプロモーターなどが挙げられる。 さらに具体的には、例えば、CMV-iプロモーター（hCMV＋イントロンプロモーター）等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーターやニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のCMV-iプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターも用いることもできる。CMV-iプロモーターは米国特許第5168062号明細書や米国特許第5385839号明細書の記載に基づいて合成することができる。また、用途に応じて、 癌・腫瘍特異的プロモーターとしてはhTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、PSA（前立腺特異的抗原）、c-myc、GLUTプロモーターなどが、遺伝子発現を抑制することを目的としたショートヘアピン型RNA(shRNA)を発現させるプロモーターとしてはU6、H1プロモーターなどが、ES細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはOCT3/4、NANOGプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはNestinプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはHSP70、HSP90、p53プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはTNF-alphaプロモーターなどが連結されていてもよい。 In this specification, the sequence of “promoter (P)” is not particularly limited, and a promoter known per se can be applied. A non-specific promoter capable of promoting the expression of a foreign gene in any cell or tissue, and a specific or selective promoter such as a tissue or organ-specific promoter, a tumor-specific promoter, a developmental or differentiation-specific promoter can be used. In particular, a promoter applicable in the present invention is preferably a promoter that increases the copy number of an infectious plasmid or a proliferative cell-specific promoter. Specific examples include SV40 promoter, CMV promoter, β-actin promoter, CAG promoter, EF1-alpha promoter, ubiquitin promoter, and the like. More specifically, for example, CMV-i promoter (hCMV + intron promoter) or the like is used. The animal species from which the β-actin promoter is derived is not limited, and a mammalian β-actin promoter such as a human β-actin promoter or a chicken triactin promoter is used. Artificial hybrid promoters such as the above CMV-i promoter can also be used. The CMV-i promoter can be synthesized based on the descriptions in US Pat. No. 5,168,062 and US Pat. No. 5,858,839. Also, depending on the application, hTERT (human telomerase reverse transcriptase), PSA (prostate specific antigen), c-myc, GLUT promoter, etc. are intended to suppress gene expression depending on the application. U6, H1 promoter, etc. are used to express the short hairpin RNA (shRNA), ESCT / cancer stem cell-specific promoter is OCT3 / 4, NANOG promoter, etc., and neural stem cell-specific promoter is Nestin promoter, etc. However, HSP70, HSP90, and p53 promoters may be linked as cell stress sensing promoters, albumin promoters may be linked as hepatocyte-specific promoters, and TNF-alpha promoters may be linked as radiation sensitive promoters.
本明細書において、「エンハンサー（Ｐ’）」とは、転写により生成するメッセンジャーRNA（mRNA）の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられる「エンハンサー（Ｐ’）」に含まれるエンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。具体的には、その順番は限定されない。例えば、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー等を用いることができる。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。「エンハンサー（Ｐ’）」は本明細書の「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の下流に配置され、遺伝子発現がより強力に発現可能となる。例えば、プロモーターと同様の機能を有し、プロモーターと同様の配列であってもよい。「プロモーター（Ｐ）」と「エンハンサー（Ｐ’）」は同じであっても異なっていてもよい。例えば、「プロモーター（Ｐ）」として特異的プロモーターを用いて、「エンハンサー（Ｐ’）」として、非特異的なプロモーターを用いることができる。具体的には、CMV-iプロモーターとCMVエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞（宿主細胞）において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、発現させようとする遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。 In the present specification, the “enhancer (P ′)” is not limited as long as it results in an increase in the amount of messenger RNA (mRNA) produced by transcription. An enhancer is a base sequence that has the effect of promoting the action of a promoter, and generally there are many sequences consisting of around 100 bp. Enhancers can promote transcription regardless of sequence orientation. One type of enhancer may be included in the “enhancer (P ′)” used in the present invention, but two or more identical enhancers may be used, or a plurality of different enhancers may be used in combination. Specifically, the order is not limited. For example, CMV enhancer, SV40 enhancer, hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, etc. can be used. An example is a hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer linked in this order. The “enhancer (P ′)” is arranged downstream of the “DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence” in the present specification, so that gene expression can be expressed more strongly. For example, the sequence may have the same function as the promoter and the same sequence as the promoter. “Promoter (P)” and “enhancer (P ′)” may be the same or different. For example, a specific promoter can be used as “promoter (P)”, and a non-specific promoter can be used as “enhancer (P ′)”. Specifically, the combination of the CMV-i promoter and the CMV enhancer tries to cause expression in any transfection reagent when any gene is inserted in almost all cells (host cells). Strong protein expression of the gene becomes possible.
本発明において、「エンハンサー（Ｐ’）」に含まれるエンハンサーの他、エンハンサー配列を「プロモーター（Ｐ）」の上流に配置することもできる。「プロモーター（Ｐ）」の上流に１個以上のエンハンサー配列を挿入することにより、特定の細胞（例えば、特許文献４の実施例に示すHEK293細胞株やMCF7細胞株）において、特定の遺伝子、例えば、REIC／Dkk-3遺伝子やCD133遺伝子において、発現がさらに増強される。また、CMVエンハンサーを「プロモーター（Ｐ）」の上流に、例えば４個挿入することにより、特定の細胞（例えば、HepG2細胞株やHeLa細胞株）によっては、さらに発現の増強が期待される。 In the present invention, in addition to the enhancer included in the “enhancer (P ′)”, an enhancer sequence can be arranged upstream of the “promoter (P)”. By inserting one or more enhancer sequences upstream of the “promoter (P)”, in a specific cell (for example, HEK293 cell line and MCF7 cell line shown in Examples of Patent Document 4), for example, a specific gene, In the REIC / Dkk-3 gene and CD133 gene, the expression is further enhanced. Further, by inserting, for example, four CMV enhancers upstream of the “promoter (P)”, further enhancement of expression is expected depending on specific cells (for example, HepG2 cell line and HeLa cell line).
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、遺伝子発現ベクターに組込み利用することができる。本発明は、本発明の「遺伝子発現用カセット」を含むベクターも含む。 The “gene expression cassette” of the present invention can be incorporated into a gene expression vector. The present invention also includes a vector comprising the “gene expression cassette” of the present invention.
発現させようとする遺伝子は、本発明の遺伝子発現用カセットにおいて、発現させようとする遺伝子を挿入する部位は、マルチクローニングサイトとして存在してもよい。この場合、発現させようとする遺伝子をマルチクローニング部位（挿入部位）に制限酵素が認識する配列を利用して挿入することができる。このように発現させようとする遺伝子DNA自体が含まれておらず、該DNAを挿入する部分がマルチクローニング部位として含まれる遺伝子発現用カセットも本発明に含まれる。 In the gene expression cassette of the present invention, the site to be expressed may be present as a multiple cloning site in the gene expression cassette of the present invention. In this case, the gene to be expressed can be inserted into the multicloning site (insertion site) using a sequence recognized by a restriction enzyme. The present invention also includes a gene expression cassette that does not include the gene DNA itself to be expressed as described above, and includes a portion into which the DNA is inserted as a multicloning site.
さらに、特許文献４に示すように、RU5'が発現させようとするタンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。さらに、遺伝子発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、後にSV40遺伝子を挿入することにより、遺伝子発現が上昇する。上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。 Furthermore, as shown in Patent Document 4, it may be linked immediately upstream of the DNA encoding the protein to be expressed by RU5 ′. The term “immediately upstream” means that they are directly linked without intervening elements having other specific functions, but a short sequence may be included as a linker. Furthermore, SV40-ori may be linked to the most upstream of the gene expression cassette. SV40-ori is a binding region of the SV40 gene, and gene expression is increased by subsequently inserting the SV40 gene. Each of the above elements needs to be functionally linked. Here, the term “functionally linked” means that each element is linked so as to enhance the expression of the gene to be expressed by exerting its function.
本発明の「遺伝子発現用カセット」を挿入するベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス（Ad）ベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記「遺伝子発現用カセット」を導入したベクターを、感染、エレクトロポレーション等の公知の方法により細胞に導入することができる。遺伝子の導入方法は自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができ、例えば公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。 Examples of the vector into which the “gene expression cassette” of the present invention is inserted include plasmids, adenovirus (Ad) vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors and the like. Non-viral vectors such as viral vectors and biodegradable polymers can be mentioned. The vector into which the “gene expression cassette” has been introduced can be introduced into cells by known methods such as infection and electroporation. As a gene introduction method, a method known per se or any method developed in the future can be applied. For example, the gene may be introduced using a known transfection reagent.
さらに、市販のベクターを改変し、本発明の発現用カセットが含まれるようにしてもよい。例えば、pShuttleベクター等の市販のベクターの遺伝子発現用カセットの下流領域にエンハンサーを組込んで用いることができる。 Furthermore, a commercially available vector may be modified to include the expression cassette of the present invention. For example, an enhancer can be incorporated into a downstream region of a gene expression cassette of a commercially available vector such as a pShuttle vector.
本発明は、さらに、上記の発現させようとする遺伝子発現用カセットを含むウイルスベクターも含まれる。ウイルスベクターのうち例えばAdベクターやAAVベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とするが、本発明の遺伝子発現用カセットは、安定的持続的に遺伝子を発現させることができるので、遺伝子発現の用途に応じて用いるのが望ましい。該ウイルスベクターは、ベクターとして使用可能なウイルスゲノム上に、上記の発現させようとする遺伝子発現用カセットを挿入して作製することができる。 The present invention further includes a viral vector comprising the above-described gene expression cassette to be expressed. Among viral vectors, for example, Ad vector and AAV vector enable specific diagnosis or treatment of diseases such as cancer, but the gene expression cassette of the present invention can stably and continuously express genes. It is desirable to use it depending on the purpose of gene expression. The viral vector can be prepared by inserting the above-described gene expression cassette into a viral genome that can be used as a vector.
本発明の遺伝子発現用カセットを挿入したベクターを細胞に導入し、該細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞で目的遺伝子を発現させ、目的タンパク質を産生することができる。本発明の遺伝子発現用カセットを導入し目的タンパク質を産生させるためには、真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属細菌等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、HEK293細胞、CHO細胞、Hela細胞、COS細胞、BHK細胞、Vero細胞等の哺乳類細胞が用いられる。形質転換された前記の宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して目的とするタンパク質を産生させることができる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の公知の培養用培地を使用することができる。産生されたタンパク質は、分泌タンパク質の場合は培養液中から、非分泌タンパク質の場合は細胞抽出物中から公知の方法で精製することができる。目的タンパク質を産生させる場合、細胞に別々の目的遺伝子を含む複数のベクターを同時にトランスフェクトさせて産生してもよい。このようにすることにより、一度に複数のタンパク質を産生することができる。 By introducing a vector into which a gene expression cassette of the present invention is inserted into a cell and transfecting the cell, the gene of interest can be expressed in the cell to produce the protein of interest. In order to introduce the gene expression cassette of the present invention and produce the target protein, a eukaryotic cell or a prokaryotic cell system can be used. Examples of eukaryotic cells include cells such as established mammalian cell systems, insect cell systems, filamentous fungal cells, and yeast cells. Examples of prokaryotic cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus bacteria, and the like. Bacterial cells are mentioned. Preferably, mammalian cells such as HEK293 cells, CHO cells, Hela cells, COS cells, BHK cells, and Vero cells are used. The transformed host cell can be cultured in vitro or in vivo to produce the target protein. Host cells are cultured according to a known method. For example, a known culture medium such as DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium. The produced protein can be purified by a known method from a culture solution in the case of a secreted protein or from a cell extract in the case of a non-secreted protein. When producing a target protein, a cell may be produced by simultaneously transfecting a plurality of vectors containing different target genes. By doing so, a plurality of proteins can be produced at one time.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）遺伝子発現用カセット
本実施例では、各種コンストラクトの「遺伝子発現用カセット」を構築した。具体的には、IDT社のプロモーターのないクローニング用プラスミドベクター（pIDT-SMART）に特許文献４に示す一過性発現において最も高効率にタンパク質を産生可能な遺伝子発現用カセットを挿入することにより、pCMViR-TSC発現ベクターを作製した（図１）。pCMViRとは、CMV-iプロモーターの下流にRU5'配列が挿入されていることを示す。
Example 1 Gene Expression Cassette In this example, “gene expression cassettes” of various constructs were constructed. Specifically, by inserting a gene expression cassette capable of producing a protein with the highest efficiency in the transient expression shown in Patent Document 4 into a cloning plasmid vector (pIDT-SMART) without a promoter of IDT, A pCMViR-TSC expression vector was prepared (FIG. 1). pCMViR indicates that the RU5 ′ sequence is inserted downstream of the CMV-i promoter.
本発明の「遺伝子発現用カセット」は、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の上流及び下流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」、「複製開始配列（Ｓ）」、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」を図２に示すNo.1〜No.10の各組み合わせで構築した。 The “gene expression cassette” of the present invention comprises a “transposon sequence (T)” and a “replication initiation sequence (S) upstream and downstream of a“ DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence ”. ) "," Nuclear matrix binding sequence (M) "was constructed with each combination of No. 1 to No. 10 shown in FIG.
本実施例において、発現させようとする遺伝子は、GFP（Green fluorescent protein）、Puror（Puromycin耐性）及び2A (2A self-processing peptide - 短い自己プロセッシング性ペプチド）を含み、「GFP-2A-Puror」で示した。また、ポリA付加配列は「BGH polyA」、プロモーター（Ｐ）は「CMViRプロモーター」、エンハンサー（Ｐ'）は、「hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーを連結したもの」を用いた。図２において、トランスポゾン配列（Ｔ）は「TP」、複製開始配列（Ｓ）は「ROIS」又は「ARS」、核マトリックス結合配列（Ｍ）は「MIS」で示した。トランスポゾン配列（Ｔ）には、例えばNo.2, 5, 9で示すように、「TP」で特定される配列が複数含まれていてもよい。 In this embodiment, the gene to be expressed, GFP (Green fluorescent protein), Puro r (Puromycin resistance) and 2A - include (2A self-processing peptide short self-processing peptides), "GFP-2A-Puro r ". Further, “BGH polyA” was used as the polyA addition sequence, “CMViR promoter” as the promoter (P), and “hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer linked” as the enhancer (P ′). In FIG. 2, the transposon sequence (T) is indicated by “TP”, the replication initiation sequence (S) is indicated by “ROIS” or “ARS”, and the nuclear matrix binding sequence (M) is indicated by “MIS”. The transposon sequence (T) may contain a plurality of sequences specified by “TP” as shown by Nos. 2, 5, and 9, for example.
上記において、「プロモーター（Ｐ）」の上流の5'側TP（5'TP）の塩基配列を配列番号１に示し、5'側TP領域の全配列を配列番号２に示した（図３参照）。そして、「エンハンサー（Ｐ'）」の下流の3'側TP（3'TP）の塩基配列を配列番号３に示し、3'側TP領域の全配列を配列番号４に示した（図４参照）。また、「複製開始配列（Ｓ）」のうち、ROISの塩基配列を配列番号５に、ARSの塩基配列を配列番号６に示した。さらに、MISの塩基配列を配列番号７に示した。 In the above, the base sequence of the 5 ′ TP (5′TP) upstream of the “promoter (P)” is shown in SEQ ID NO: 1, and the entire sequence of the 5 ′ TP region is shown in SEQ ID NO: 2 (see FIG. 3). ). The base sequence of the 3 ′ TP (3′TP) downstream of the “enhancer (P ′)” is shown in SEQ ID NO: 3, and the entire sequence of the 3 ′ TP region is shown in SEQ ID NO: 4 (see FIG. 4). ). Of the “replication initiation sequence (S)”, the base sequence of ROIS is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence of ARS is shown in SEQ ID NO: 6. Further, the base sequence of MIS is shown in SEQ ID NO: 7.
5'TP（配列番号１）
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
5'TP (SEQ ID NO: 1)
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
3'TP（配列番号３）
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
3'TP (SEQ ID NO: 3)
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGT GTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
ROIS（配列番号５）
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
ROIS (SEQ ID NO: 5)
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGA CTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
ARS（配列番号６）
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
ARS (SEQ ID NO: 6)
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
MIS（配列番号７）
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
MIS (SEQ ID NO: 7)
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
（実施例２）遺伝子発現用カセットの評価
実施例１で構築したNo.1〜10の各種遺伝子発現用カセット（図２）を含む発現ベクター（No.1〜10の各遺伝子発現ベクター）を作製した。図２に示すpCMViR-TSCを含むベクターをコントロールとした。No.1〜10の内、CHO細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図５（配列番号８）に示した。また、HEK293T細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図６（配列番号９）に示した。図２に示す各遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子であるGFP-2A-PuroをコードするcDNAの配列をEcoRI制限酵素サイトとXbaI制限酵素サイトを用いて正方向に挿入した。
(Example 2) Evaluation of cassette for gene expression Preparation of expression vectors (each gene expression vector of No. 1 to 10) containing the cassettes for gene expression of No. 1 to No. 10 (Fig. 2) constructed in Example 1 did. A vector containing pCMViR-TSC shown in FIG. 2 was used as a control. Among Nos. 1 to 10, the entire base sequence of No. 4 gene expression vector, which is the most efficient high-efficiency expression plasmid vector in CHO cells, is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 8). In addition, FIG. 6 (SEQ ID NO: 9) shows the entire base sequence of the No. 1 gene expression vector, which is the most efficient high-efficiency expression plasmid vector in HEK293T cells. In each of the gene expression cassettes shown in FIG. 2, the cDNA sequence encoding the target gene GFP-2A-Puro was inserted in the forward direction using EcoRI restriction enzyme site and XbaI restriction enzyme site.
No.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを細胞に各々導入し、以下の手順に従い、GFP蛍光タンパク質の発現量を蛍光強度で評価した。
10％ FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞（(Chinese Hamster Ovary cells）及びHEK293T細胞（Human embryonic kidney cells）を6ウェルプレートで70％〜80％までコンフルエントに培養した。FuGENE（商標）-HD（遺伝子導入試薬）を用いて、No.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを、トランスポゼース発現ベクターとDNA量 1 : 1でコトランスフェクトした。トランスポゼース発現ベクターは、一過性発現用のベクターであるpCMViR-TSC ベクターにトランスポゼース遺伝子を搭載しており、このベクターをNo.1〜10の本発明のトランスポゾン配列 (TP) 搭載各遺伝子発現ベクターとコトランスフェクトすることにより、トランスポゾン配列の末端で遺伝子発現用カセットが切り出され、宿主ゲノム中のTTAA部位に効率よく目的遺伝子が挿入される。このような方法でトランスフェクトした細胞を24時間インキュベート後、細胞のGFP蛍光強度を蛍光プレートリーダー (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific) を用いて測定した。ベクターを導入していない細胞を(-)とした。
Each of the gene expression vectors No. 1 to 10 and the control were introduced into the cells, and the expression level of the GFP fluorescent protein was evaluated by the fluorescence intensity according to the following procedure.
6 CHO cells (Chinese Hamster Ovary cells) and HEK293T cells (Human embryonic kidney cells) cultured in GIBCO (R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) containing 10% FCS Cultivated in a well plate to 70% to 80% Using FuGENE ™ -HD (gene transfer reagent), each gene expression vector and control No. 1 to 10 were treated with a transposase expression vector and DNA amount 1 Cotransfected with: 1. Transposase expression vector is a pCMViR-TSC vector, which is a vector for transient expression, carrying the transposase gene. TP) By co-transfecting with each gene expression vector, a gene expression cassette is cut out at the end of the transposon sequence, and efficient at the TTAA site in the host genome. After the cells transfected in this way were incubated for 24 hours, the GFP fluorescence intensity of the cells was measured using a fluorescence plate reader (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific). Cells that were not marked as (-).
さらに同様にNo.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを導入したCHO細胞及びHEK293T細胞を、48時間培養後から、Puromycin（抗生物質）10μg/mLを添加して、3日に１回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。培養3週間経過後の各細胞の蛍光強度を蛍光プレートリーダーにより測定し、コントロール及びトランスフェクト後、24時間培養した細胞の蛍光強度と比較した。CHO細胞での蛍光強度を図７に示し、HEK293T細胞での蛍光強度を図８に示した。CHO細胞では、培養24時間目のGFP蛍光強度はコントロール及びNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)と殆ど差を認めなかったが、3週間経過後ではNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、明らかに高いGFP蛍光強度を示した。特に、No.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図７）。一方HEK293T細胞では、培養24時間目のGFP発現量はコントロールは高い値を示し、一過性の発現を認めたが、No.1〜10の各遺伝子発現ベクターのいずれも、(-)よりやや高い値を示したのみであった。3週間経過後ではNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターを各々導入した細胞では、コントロールに比べて、高いGFP蛍光強度を示す傾向が認められ、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図８）。 Similarly, after culturing CHO cells and HEK293T cells into which No. 1 to 10 gene expression vectors and controls have been introduced for 48 hours, add 10 μg / mL of puromycin (antibiotics) and culture once every 3 days. While exchanging, drug selective culture was performed for 3 weeks. The fluorescence intensity of each cell after 3 weeks of culture was measured with a fluorescence plate reader, and compared with the fluorescence intensity of cells cultured for 24 hours after control and transfection. The fluorescence intensity in CHO cells is shown in FIG. 7, and the fluorescence intensity in HEK293T cells is shown in FIG. In CHO cells, the GFP fluorescence intensity at 24 hours in culture was almost the same as (-) for each of the control and No. 1 to 10 gene expression vectors, but after 3 weeks, No. 1 to The cells into which each of the 10 gene expression vectors had been introduced exhibited a clearly higher GFP fluorescence intensity than the control. In particular, the No. 4 gene expression vector showed a high value (FIG. 7). On the other hand, in the HEK293T cells, the GFP expression level at 24 hours in culture showed a high value in the control and transient expression was observed, but each of the gene expression vectors of No. 1 to 10 was slightly more than (-). It only showed a high value. After 3 weeks, cells transfected with each of the gene expression vectors No. 1 to 10 tend to show higher GFP fluorescence intensity than the control, and in particular, the No. 1 gene expression vector shows a higher value. (FIG. 8).
次に、3週間薬剤選択培養を行った各細胞を蛍光強度測定後回収し、タンパク質定量を行った値を基に細胞の蛍光強度を補正し、その補正値に基づいてNo.1〜10の各遺伝子発現ベクターの比較・検討を行った。その結果、CHO細胞では、特にNo.4の遺伝子発現ベクターで高い値を示し（図９）、HEK293T細胞では、特にNo.1の遺伝子発現ベクターで高い値を示した（図１０）。 Next, each cell that has been subjected to drug selective culture for 3 weeks is collected after fluorescence intensity measurement, and the fluorescence intensity of the cell is corrected based on the value of protein quantification, and No. 1 to 10 based on the correction value Each gene expression vector was compared and examined. As a result, CHO cells showed particularly high values with the No. 4 gene expression vector (FIG. 9), and HEK293T cells showed particularly high values with the No. 1 gene expression vector (FIG. 10).
上記の結果、CHO細胞では、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の上流及び下流にMIS配列とともにROIS配列又はARS配列を含み、さらに上流及び下流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」を含む、本発明の「遺伝子発現用カセット」によれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。またHEK293T細胞では、「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の上流及び下流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」を含む、本発明の「遺伝子発現用カセット」によれば、長期間、目的のタンパク質を安定的に産生可能であることが確認された。 As a result of the above, the CHO cell contains the ROIS sequence or ARS sequence together with the MIS sequence upstream and downstream of the “DNA construct (X) containing the gene to be expressed and the poly A addition sequence”, and further upstream and downstream “ According to the “gene expression cassette” of the present invention including the “transposon sequence (T)”, it was confirmed that the target protein can be stably produced for a long period of time. Further, in the HEK293T cell, the “gene expression cassette” of the present invention containing “transposon sequence (T)” upstream and downstream of “DNA construct (X) containing gene to be expressed and poly A addition sequence”. Thus, it was confirmed that the target protein can be stably produced for a long period of time.
（実施例３）ヒト・ヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）の産生
本実施例では、遺伝子組換えヒトHRGは、以下のように作製した。実施例１に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、発現させようとする遺伝子として、配列番号１０に示すヒトHRGのコーディング領域をコードするDNA（GenBank Accession No.NM000412で特定される塩基配列からなるDNA）を用い、No.4-HRG発現ベクターを作製した（図１１参照） 。具体的には、10％ FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞（(Chinese Hamster Ovary cells）にFuGENE（商標）-HD（遺伝子導入試薬）を用いて、上記No.4-HRG発現ベクター、トランスポゼース発現ベクター、薬剤耐性遺伝子発現ベクターとして実施例１に示すNo.4遺伝子発現ベクターをDNA量 5 : 4：1でコトランスフェクトした。 遺伝子導入し、48時間培養後から、Puromycin（抗生物質）10μg/mLを添加して、3日に１回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。
(Example 3) Production of human histidine-rich glycoprotein (HRG) In this example, recombinant human HRG was prepared as follows. Using the No. 4 gene expression cassette, which is the most effective high-efficiency gene expression cassette in the CHO cells shown in Example 1, the human HRG coding region shown in SEQ ID NO: 10 is encoded as the gene to be expressed. Using DNA (DNA consisting of the base sequence specified by GenBank Accession No. NM000412), a No. 4-HRG expression vector was prepared (see FIG. 11). Specifically, 10% FCS-containing GIBCO (R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) cultured in CHO cells ((Chinese Hamster Ovary cells) FuGENE (trademark)- Using HD (gene introduction reagent), the No. 4 gene expression vector shown in Example 1 as the above No. 4-HRG expression vector, transposase expression vector, and drug resistance gene expression vector was copied at a DNA amount of 5: 4: 1. After the gene was introduced and cultured for 48 hours, Puromycin (antibiotic) 10 μg / mL was added, and drug selection culture was performed for 3 weeks while changing the medium once every 3 days.
成熟HRGのアミノ酸配列（配列番号１０）
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
Amino acid sequence of mature HRG (SEQ ID NO: 10)
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
組換えヒトHRGを含む培養上清を回収した。1×PBS(-) 30 mLで予め洗浄したQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲル（Sepharose CL-6B支持体にNi-NTAを結合したゲル）を前記培養上清に加え、4℃で回転インキュベーションを2時間行ない、組換えヒトHRGをQIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルに結合させた。QIAGEN(R) Ni-NTAアガロースゲルを精製用カラムに移した後、洗浄液１（30 mM Imidazoleを含むPBS（pH7.4）、洗浄液２（1M NaCl +10 mM PB (pH7.4)）、洗浄液３（1×PBS (pH7.4)）で順次カラムを洗浄した。組換えヒトHRG は、500 mM Imidazoleを含むPBS (pH7.4)で、4℃で溶出を行なった。精製品は、ウエスタンブロットとSDS-PAGE 後のタンパク染色でHRGを確認した。 The culture supernatant containing recombinant human HRG was collected. QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel (gel with Ni-NTA bound to Sepharose CL-6B support ) pre-washed with 30 mL of 1 × PBS (-) was added to the culture supernatant and rotated at 4 ° C. the conducted 2 hours, allowed to bind recombinant human HRG in QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel. After transferring QIAGEN (R) Ni-NTA agarose gel to the purification column, Wash Solution 1 (PBS containing 30 mM Imidazole (pH 7.4), Wash Solution 2 (1M NaCl +10 mM PB (pH 7.4)), Wash Solution The column was sequentially washed with 3 (1 × PBS (pH 7.4)) Recombinant human HRG was eluted with PBS (pH 7.4) containing 500 mM Imidazole at 4 ° C. HRG was confirmed by blotting and protein staining after SDS-PAGE.
上記本発明の遺伝子組換え手法により作製したHRG（以下、「遺伝子組換えHRG」）と国際公開WO2013/183494号公報の実施例１で作製したヒト血漿由来のHRG（以下、「血漿由来HRG」）について、各々好中球の正球化活性、CLP敗血症モデルマウスの生存率及び活性酸素分子種の産生抑制活性に及ぼす効果を確認した。 HRG produced by the genetic recombination technique of the present invention (hereinafter referred to as “genetical HRG”) and human plasma-derived HRG produced in Example 1 of International Publication WO2013 / 183494 (hereinafter referred to as “plasma-derived HRG”) ), The effects on the neutrophil neutrophilization activity, the survival rate of CLP sepsis model mice and the production inhibition activity of reactive oxygen molecular species were confirmed.
（実験例３−１）好中球の形態
国際公開WO2013/183494号公報の図５に示すフローチャートに従いHRG:2μM、最終濃度1μM）50μlを好中球浮遊液（5×105 cell/mL）50μlに加えた系での好中球の形態をCalceinで細胞を蛍光標識して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、遺伝子組換えHRG及び血漿由来HRGのいずれも同じ効力で正球状形態を誘導することが観察された（図１２）。
(Experimental Example 3-1) Neutrophil morphology 50 μl of neutrophil suspension (5 × 10 5 cell / mL) according to the flowchart shown in FIG. 5 of International Publication WO2013 / 183494, HRG: 2 μM, final concentration 1 μM) The neutrophil morphology in the system added to 50 μl was fluorescently labeled with Calcein and observed with a fluorescence microscope. As a result, it was observed that both the recombinant HRG and the plasma-derived HRG induced a spherical shape with the same efficacy (FIG. 12).
（実験例３−２）CLP敗血症モデルマウスに及ぼすHRGの効果
本実験例では、盲腸結紮腹膜炎（cecal ligation and puncture: CLP）敗血症モデルで
カプランマイヤー法による生存率を調べた。マウスの腹腔内より盲腸を取り出して、盲腸根部を縫合糸により結紮し、18ゲージ注射針を用いて盲腸壁層に穿刺してCLP敗血症モデルを作製した。単開腹（sham）マウスをコントロールとした。術後5分、24時間及び48時間目に、遺伝子組換えHRG（HRG：400μg/マウス）を尾静脈内投与した（n=10）。HSA及びPBSをコントロールとした（n=10）。その結果、カプランマイヤー法で解析した結果、遺伝子組換えHRG投与グループは有意に高い累積生存率が確認された（図１３）。
(Experimental Example 3-2) Effect of HRG on CLP Sepsis Model Mice In this experimental example, the survival rate by the Kaplan-Meier method was examined in a cecal ligation and puncture (CLP) sepsis model. The cecum was removed from the abdominal cavity of the mouse, the cecal root was ligated with a suture, and the cecal wall layer was punctured with an 18-gauge injection needle to prepare a CLP sepsis model. Single laparotomy (sham) mice served as controls. At 5 minutes, 24 hours and 48 hours after the operation, recombinant HRG (HRG: 400 μg / mouse) was administered into the tail vein (n = 10). HSA and PBS were used as controls (n = 10). As a result, as a result of Kaplan-Meier analysis, a significantly higher cumulative survival rate was confirmed in the recombinant HRG administration group (FIG. 13).
（実験例３−３）活性酸素分子種の産生抑制活性
単離したヒト好中球を、イソルミノール（最終濃度 50 mM）とHorse radish peroxidase type IV（最終濃度 4 U/mL）を添加してインキュベートし、細胞外放出活性酸素分子種レベルを反応開始15分後に化学発光で測定した。HRG非存在下のレベルを100％とし、0.01〜1.0μM濃度のHRG存在下での値を％表示で算出した（図１４）。その結果、遺伝子組換えHRGはヒト血漿から精製したHRGと略等しい活性酸素分子種の産生抑制活性を示した。
(Experimental example 3-3) Production inhibitory activity of active oxygen molecular species Isolated human neutrophils were added with isoluminol (final concentration 50 mM) and Horse radish peroxidase type IV (final concentration 4 U / mL). After incubation, the extracellular released reactive oxygen species level was measured by chemiluminescence 15 minutes after the start of the reaction. The level in the absence of HRG was taken as 100%, and the value in the presence of HRG at a concentration of 0.01 to 1.0 μM was calculated in% (FIG. 14). As a result, the recombinant HRG showed a production inhibitory activity of reactive oxygen molecular species substantially equal to HRG purified from human plasma.
以上詳述したように、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）が、プロモーター（Ｐ）とエンハンサー（Ｐ'）で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター（Ｐ）の上流及びエンハンサー（Ｐ'）の下流にトランスポゾン配列（Ｔ）を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセットによれば、従来遺伝子組み換えによる作製が困難であったタンパク質も大量に産生させることができる。さらに、上記において、トランスポゾン配列（Ｔ）とともに、複製開始配列（Ｓ）の上流に核マトリックス結合配列（Ｍ）を組み合わせて適宜配置することで、より効果的に目的タンパク質を安定的かつ大量に産生することができる。 As described in detail above, in the gene expression cassette having a structure in which the gene to be expressed and the DNA construct (X) containing the poly A addition sequence are sandwiched between the promoter (P) and the enhancer (P ′), According to the gene expression cassette, which contains a transposon sequence (T) upstream of the promoter (P) and downstream of the enhancer (P ′), a large amount of proteins that have been difficult to produce by genetic recombination in the past Can be produced. Further, in the above, the target protein can be produced more stably and in large quantities more effectively by appropriately arranging a combination of the nuclear matrix binding sequence (M) upstream of the replication initiation sequence (S) together with the transposon sequence (T). can do.
本発明は、一過性発現に適した遺伝子発現用カセット（例えば、特許文献４に示すpCMViR-TSCベクター）を「トランスポゾン配列（Ｔ）」で挟むことにより、染色体に高効率に高コピー数の遺伝子発現用カセットを挿入することを可能にする。さらに「複製開始配列（Ｓ）」、「核マトリックス結合配列（Ｍ）」 を遺伝子発現用カセットの上流又は下流、もしくは上流と下流に連結させることにより、遺伝子発現用カセットのコピー数を高効率に増幅させることが可能となる。具体的には、「プロモーター（Ｐ）」の上流に「トランスポゾン配列（Ｔ）」、「プロモーター（Ｐ）」の下流に「発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物（Ｘ）」の下流に「エンハンサー（Ｐ'）」、さらにその下流に「核マトリックス結合配列（Ｍ）」、「複製開始配列（Ｓ）」、「トランスポゾン配列（Ｔ）」を連結させることにより、目的タンパク質を安定かつ高産生する細胞が得られる。本発明の遺伝子発現用ベクターによれば、薬剤選択後の安定発現細胞株にも関わらず、従来の発現ベクターと比較して数倍から数十倍の高発現を達成したpCMViR-TSCベクターの一過性発現量を更に凌駕する発現量を達成した。 In the present invention, a gene expression cassette suitable for transient expression (for example, the pCMViR-TSC vector shown in Patent Document 4) is sandwiched between “transposon sequences (T)”, whereby a high copy number can be efficiently copied to a chromosome. Allows insertion of a gene expression cassette. Furthermore, by connecting the “replication initiation sequence (S)” and “nuclear matrix binding sequence (M)” upstream or downstream of the gene expression cassette, or upstream and downstream, the number of copies of the gene expression cassette can be increased with high efficiency. It can be amplified. Specifically, a DNA construct (X) comprising a “transposon sequence (T)” upstream of the “promoter (P)” and a gene to be expressed and a poly A addition sequence downstream of the “promoter (P)” To the target protein by linking “enhancer (P ′)” downstream of “nuclear matrix binding sequence (M)”, “replication initiation sequence (S)” and “transposon sequence (T)”. Can be obtained stably and highly producing cells. According to the gene expression vector of the present invention, one of the pCMViR-TSC vectors that achieved high expression several to several tens of times compared to conventional expression vectors, despite the stable expression cell line after drug selection. An expression level that exceeded the transient expression level was achieved.
例えば、細胞の種類、遺伝子の種類、トランスフェクション試薬の種類を問わず、遺伝子発現させようとする目的タンパク質を超高発現により、安定かつ大量に産生することができる。バイオテクノロジーの分野での試薬としての適用のみならず、治療用のタンパク質医薬としての適用や臨床での遺伝子を用いた治療・検査・診断のために幅広い応用が可能である。 For example, regardless of the type of cell, the type of gene, and the type of transfection reagent, the target protein to be expressed can be produced stably and in large quantities by ultrahigh expression. In addition to application as a reagent in the field of biotechnology, a wide range of applications are possible, including application as a therapeutic protein drug and clinical treatment, testing, and diagnosis.
疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質として、具体的には「ヒスチジンリッチ糖タンパク質（HRG）」や「抗体」が挙げられる。 Specific examples of therapeutic genes that can be used for treatment of diseases, or proteins that can be used for drugs, diagnostic agents, or reagents include “histidine-rich glycoprotein (HRG)” and “antibodies”.
Claims (15)
１）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
２）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｔ）；
３）（Ｔ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）；
４）（Ｔ）、（Ｓ）、（Ｐ）、（Ｘ）、（Ｐ'）、（Ｓ）、（Ｔ）。 A promoter (P), a DNA construct (X) containing a gene to be expressed and a poly A addition sequence, an enhancer (P ′) and a transposon sequence (T) are included. The gene expression cassette according to claim 1 or 2, wherein the gene expression cassette is contained in the order shown in any of the following 1) to 4):
1) (T), (P), (X), (P ′), (T);
2) (T), (S), (P), (X), (P ′), (T);
3) (T), (P), (X), (P ′), (S), (T);
4) (T), (S), (P), (X), (P ′), (S), (T).
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