JP6866164B2 - 固形生体腫瘤の空間的分子プロファイリングおよびプロファイルの保存 - Google Patents

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Description

本発明は、腫瘍などの生体腫瘤のｅｘ ｖｉｖｏの空間的分子プロファイリングおよびこのようなプロファイルの保存に関する。
本明細書において、「空間的分子プロファイリング」は、分子またはマクロ分子レベルの生体物質の構成決定を指す。本明細書において、マクロ分子としては、ゲノム、ＲＮＡ発現、プロテオミクスおよび酵素の情報が挙げられる。本発明者は、生体腫瘍および細胞構成物などの他の生体腫瘤の空間的分子プロファイリングが、例えば固形腫瘍、限定するものではないが、乳房、肺、前立腺および結腸直腸のがんなどにおいてさまざまな細胞型の特徴となる生体変化をもたらす、遺伝子およびタンパク質発現のパターンを決定するために必須であると考える。しかし、腫瘍の分子プロファイリングは、腫瘍の固有な生物学的不均一性により非常に複雑である。腫瘍および周囲の細胞外マトリックス両方にわたる、「空間的分子マップ」中の複数のバイオマーカーの分析を可能にする技術の必要性が増加している。実施形態において、本発明は、腫瘍領域に特異的な遺伝子発現および遺伝子再配列のプロファイルならびにタンパク質発現プロファイルの特定を可能にし、これにより、腫瘍不均一性についての生体情報を提供し、治療的および臨床的判断、予後予測ならびに腫瘍生物学基礎研究が容易になる。
悪性腫瘍の分子プロファイリングは、適切な腫瘍特異的治療計画の決定および予後予測に必須である。がんによる死亡率は、非常に多くの場合、原発性腫瘍からはもたらされないが、他の臓器において引き起こされる二次性腫瘍（転移）からもたらされるので、浸潤性腫瘍を特徴付ける分子マーカーの分析が特に重要である。このような分子マーカーとしては上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関与するものが挙げられ、ＥＭＴは、より間葉系様の表現型を得る非侵襲性上皮細胞をもたらし、したがってそれらの挙動が次第に浸潤性になる過程である。
現在のところ、腫瘍の分子プロファイリング方法としては、バルク腫瘍試料由来の多数の遺伝子発現のマイクロアレイ分析が挙げられるが、これは高価であり時間がかかる。
分子プロファイリングは、腫瘍が固有な生物学的不均一性を有し、それによって、採取されたバルク試料の部分に依存して、非常に異なる遺伝子発現プロファイルが存在するという事実によりさらに複雑になる。現在、臨床および研究両方の場において、バルク腫瘍試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックで保存されている。これらのブロックから単離された核酸は通常分解されており、非固定組織から単離された核酸と比較してより多くのＰＣＲ阻害剤を含有しているので、この保存方法は広範囲には採用されない。さらに、多数の標本の保存に必要な物理的空間は、多くの場合利用不可能である。さらに、２次元（２Ｄ）腫瘍構造が喪失されることがあるので、腫瘍全体にわたる特異的遺伝子発現パターンは、必ずしも容易には分析できない。このことは、ＥＭＴに関係するような浸潤の分子マーカーを分析しようとする場合、このマーカーは腫瘍の辺縁または浸潤最深部においてだけ主として差次的に発現されるので、特に問題となる（Ｋａｈｌｅｒｔ Ｃ，Ｌａｈｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＺＥＢ２ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７，２４：７６５４−７６６３．；Ｕｓａｍｉ Ｙ，Ｓａｔａｋｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｎａｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００８；２１５，３，３３０−３３９）。
先の研究により、リアルタイムＰＣＲに基づくＫＲＡＳアッセイに使用するための結腸直腸腫瘍試料から収集されたＤＮＡの収集および単離のための、商品名ＦＴＡ（登録商標）で販売された固体紙支持体の使用が検査された（Ｐｅｔｒａｓ ＭＬ，Ｌｅｆｆｅｒｔｓ ＪＡ ｅｔ ａｌ．ＫＲＡＳ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｔｕｍｏｕｒｓ ｂｙ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＦＴＡ Ｐａｐｅｒ：Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｕｃｈ−ｐｒｅｐ．Ｄｉａｇｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１；２０，４：１８９−１９３）。結腸腫瘍由来のＤＮＡは、腫瘍から切片を採取して、その後ＦＴＡ紙を切断表面に直接適用することによって収集された。ＫＲＡＳ突然変異分析は、これらの試料および一致するＦＦＰＥブロックから抽出されたＤＮＡに対して実施された。結果は、２つのＤＮＡ収集方法の間に１００％の相関があることを実証し、将来の核酸単離および下流分析のための腫瘍試料保存の成功のために紙支持体を使用することの実行可能性を強調した。しかし、１種のゲノム突然変異だけが分析され、この研究は、２次元の腫瘍遺伝子発現プロファイルを実施しておらず、酵素などの他の分析物を検討していない。
この背景を考慮して、「バンク」などに一定期間保存後、２Ｄ腫瘍構造を問い合わせ可能にし、それによって、空間的に関連する下流の遺伝子発現分析などを実行可能にする、高品質な核酸、タンパク質および酵素の保存システムに関する必要性が存在する。
国際公開第２０１４／０６０４８３号
本発明者らは、腫瘍細胞ならびにｍＲＮＡおよび酵素タンパク質を含むタンパク質などの他のバイオマーカーを、元の２Ｄ空間的コンテキストで保存するために組織表面から適切な固体支持体に直接転写可能な、例えば、ＦＴＡなどの洗浄剤処理紙を使用して長期保存を可能にする、腫瘍分子プロファイリング方法およびキットの必要条件を認識した。
必要に応じて、試料、例えばこの紙からパンチされた試料が、腫瘍のその領域に特異的な下流の分子分析のために、腫瘍がインプリントされた紙支持体の任意の領域から後に採取可能である。
本発明は、請求項１に従属する請求項により定義される好ましい特徴を有する、請求項１に記載の方法を提供する。
本発明は、従属する請求項により定義される好ましい特徴を有する請求項により定義される装置もさらに提供する。
本発明は、乾燥試薬のセットを、例えばプライマーを含有する即時使用可能なビーズの形態で含み、特異的遺伝子発現サインを分析するキットにも拡がる。本方法は、多くの場合、腫瘍の浸潤最深部において差次的にだけ発現され、バルク腫瘍分析では特定されない、浸潤関連遺伝子の差次的発現の特定に特に有用である。このキットは、臨床試料の分析および前臨床腫瘍生物学研究の両方に利用することができる。
本発明は、未処理紙を使用するタンパク質発現プロファイリングおよび下流のタンパク質に基づくアッセイに拡がり、この開示は今までに他のどこにおいても報告されていない。本発明は、製品、方法およびキットの請求項を包含する。
本発明は、本明細書において明確に述べられているかどうかにかかわらず、本明細書に開示の特色の任意の組み合わせにまで拡がる。さらに、２以上の特色が組み合わせて述べられる場合、このような特色は、本発明の範囲を拡げることなく、個別に特許請求され得ることが意図される。
本発明は多数の方法で実行でき、その例示的実施形態を、図面を参照しながら下記に記載する。
腫瘍横断切片を保持するトレイの平面図を示す図である。 図１に示された腫瘍のインプリントを含む固体支持体を示す図である。 図１に示された腫瘍の画像を示す図である。 アンプリコンの実験画像を示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。 実験データをグラフ形状で示す図である。
本発明ならびにその目的および有利性は、下記の説明を添付の図面と併せて参照することによってより理解を深められると考えられ、図面において同様の参照番号は図中の同様の要素を特定するものである。
図１を参照すると、ホルダー１０に保持された癌性腫瘍の横断切片Ｔを概略的に示しており、ホルダー１０は、この実施形態において、下記の装置に対応したサイズのトレイである。横断切片Ｔは、トレイ１０に平坦に置かれた腫瘍の平行スライスである。トレイ１０は、直立スパイク１２の形態で保持手段を備え、次々に腫瘍スライスを所定の場に保持する底部１１を有する。この実例において、辺縁部２２を含む腫瘍２０の外部領域の細胞型は単斜線で表され、腫瘍の内部領域２４の細胞型は二重斜線で表される。腫瘍は概して、図１に概略的に例示された明確な描写ではなく、内部領域と辺縁部の細胞型の間で複雑な不均一性を有する不明瞭な、またはランダムな推移を有することは理解すべきである。
図２を参照すると、トレイ１０内にぴったりと収まるＦＴＡ（登録商標）紙支持体３０が示される。図１のホルダー１０は支持体３０と横断切片Ｔとの接触をガイドする形態、すなわちトレイ面を有する。支持体３０は、使用の際の曲げを防止して、この紙を乾燥させる裏張り層またはパッド（図示せず）により支持されてもよい。該支持体は、その上に事前に印刷されたパターン３２、この場合は番号着きの格子を有する。支持体３０はトレイ内に収められ、横断切片２０は手で５秒以上穏やかに押圧され、腫瘍２０の反転インプリント１２が提供される。このインプリントは、押圧の際に転写された、少量であるが検出可能な量の生体物質からなる。この実施形態において、ＦＴＡ紙はフェノールレッドなどの染料を含み、この染料により腫瘍由来の流体が紙を湿潤させたウィットネスマークが提供される。
図３を参照すると、腫瘍横断切片Ｔは、腫瘍に対する見解をよりよく規定するためにヘマトキシリンおよびエオシンにより染色されており、その後撮影または画像化され、図３に概略的に示した画像が提供される。この場合、格子パターン３２’は画像に重ね合わされ、支持体３０に印刷された格子パターン３２と同じサイズパターンを提供する。格子パターンは透明なシートに印刷され、横断切片に重ねられてもよく、または公知の技術に従ってデジタル式に重ねることもできる。便宜上、図３に示された画像は、インプリント１２と一致するように反転することもできる。
使用に当たって、下記のステップが実行される：
１）病理学者または研究者は患者または動物から腫瘍を摘出後、腫瘍の横断面を滑らかに切断して腫瘍を横切する。
２）横断切片はトレイ１０に置かれ、保持手段１２により所定の場に保持される。
３）支持体３０を裏張り層に載置して、十分な圧力を腫瘍の露出された切断面に印加し、腫瘍全体を十分な時間（少なくとも５秒）の確実に接触させる。着色染料のウィットネスマークの目視検査により、完全な転写が行われたことを確認する。
４）この紙を乾燥させる。
５）場合により、横断切片の画像を撮影し、横断切片の表面処理により質を上げることも可能である。
６）腫瘍インプリント由来ＤＮＡは、その後元の空間的コンテキストで紙支持体に必要な限り長期保存することができる。
７）紙パンチの形態の試料を、腫瘍インプリントの任意の関連領域、特に、多くの場合浸潤最深部を含む辺縁部から採取することができる。
試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、等温増幅もしくはＲＮＡ発現アッセイなどの遺伝子増幅技術または遺伝子再構成アッセイおよび／または他のアッセイ、例えばＥＬＩＳＡもしくは酵素アッセイに供して、特定のタンパク質または酵素の存在を特定することができる。ＰＣＲのための調製において、核酸をパンチから溶出し、例えば、所定量の溶媒と一緒にキットの形態で、乾燥ビーズフォーマットに含有された逆転写酵素（ＲＴ）製剤を添加することができる。このビーズはイントロン／エクソン境界に設計されたＰＣＲプライマーを含有し、腫瘍のその領域における遺伝子発現を分析することができる。プライマーセットは、例えば、腫瘍の辺縁部から採取された試料に使用可能な、Ｅ−カドへリン、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、ＴｗｉｓｔおよびＺＥＢ−２などのＥＭＴマーカー含んでよい。試料は、紙の任意の領域から採取することができるが、画像（図３）を参照し、該紙上の画像から基準格子を相互参照することによって特定された辺縁部がより望ましい。
本発明の実施形態は以下を提供する：
１）試料が十分規定された領域から採取可能なように、腫瘍の二次元「空間的マップ」を維持する能力。
２）腫瘍の明確な領域において発生すると思われる特異的遺伝子サイン（例えば浸潤遺伝子）を分析するための適切なプライマーセットを含有するＲＴＧビーズ。
３）採取する臨床的または研究的腫瘍試料がわずかに少量であるという必要条件。
４）後続の下流分析のための、室温における核酸の容易な長期保存。
５）上記のステップ７）に述べたさまざまなアッセイのための使用の容易さ。
確認実験の結果を下記に示す。
ＤＮＡ試料の収集および保存
ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＮＯＳ３ヌルマウス（バックグラウンド１２９／Ｂ６）由来のネズミ組織を、Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃから販売されているＦＴＡクラシックマイクロカード、ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇマイクロカードおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅマイクロカードを含むいくつかの異なる固体支持媒体に適用した。これらのマウスを安楽死させ、解剖して臓器（血液、心臓、脳、肺、肝臓および腎臓）を収集した。臓器を、２層の上記のさまざまなＦＴＡマトリックスの間に「サンドイッチ」した。それぞれの化学的にコーティングされたセルロースマトリックスにはめ込まれた組織に滅菌ピペットにより圧力を印加した。組織ホモジネート用に、およそ５ｇの組織をプラスチックダウンス型ホモジナイザーを使用して、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて処理し、次いで適切なＦＴＡマトリックスに適用した。適用後、すべての試料を２時間風乾させ、その後密閉されたポーチにおいて乾燥剤と一緒に保存した。場合により、試料は処理まで最大２ヶ月保存した。
ＤＮＡの精製、遺伝子型判定および定量
Ｈａｒｒｉｓの使い捨てマイクロパンチ（直径１．２ｍｍまたは３ｍｍ）を使用して、ＦＴＡマイクロカードおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅマイクロカードから乾燥組織試料を、それぞれパンチされたディスクの形態で切り取った。試料ディスクを乾燥試料の中心から切り取り、清潔なＤＮａｓｅ非含有１．５ｍｌ微小遠心管に入れた。ゲノムＤＮＡをＦＴＡカードおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅカードから抽出するために、標準的精製手順を製造業者の使用説明書にしたがって続けた。
ヌルまたは遺伝子ノックアウトＮＯＳ３マウスを、内皮型酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）エクソン１０特異的フォワードプライマー（配列リスト１を参照されたい）、ｅＮＯＳ Ｎｅｏ特異的フォワードプライマー（配列リスト２）およびｅＮＯＳエクソン１２特異的リバースプライマー（配列リスト３を参照されたい）を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定した。
標的ＤＮＡを、初回１０分の変性ステップ、次いで９４℃３５秒、６５℃１分および７２℃１分を３６サイクル、その後７２℃５分間の最終伸長で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎキャピラリー電気泳動システムを使用して可視化させた。マウスＤＮＡの定量を、マウス試料用Ｐｒｉｍｅｒ ＤｅｓｉｇｎゲノムＤＮＡ定量キット（ｇＤＮＡ−ｍｏ−ｑ−ＤＤ）を使用して製造業者の使用説明書に従って行った。
個別の野生型（ＷＴ）およびＮＯＳヌルの組織試料を、さまざまなＦＴＡカードに別々に適用した。いくつかの限定された場合に、ＫＯおよびＮＯＳヌル両方の肝臓組織試料を含有する乾燥試料のスポットを作製した。ＤＮＡをこの細胞混合物から単離し、３種すべての遺伝子型判定プライマー、すなわち、ｅＮＯＳエクソン１０特異的フォワードプライマー、ｅＮＯＳ Ｎｅｏ特異的フォワードプライマーおよびｅＮＯＳエクソン１２特異的リバースプライマーの組み合わせを含む非最適化マルチプレックスＰＣＲに供した。シングルＰＣＲ反応において混合組織源から両方の産物の同時増幅を示す、代表的ゲルを図４ａに示す。
ＰＣＲ分析による遺伝子型識別
ＦＴＡマトリックスに保存されたＤＮＡから遺伝子型変異体を識別する能力を例示するために、ある領域のＰＣＲ増幅をＷＴおよびトランスジェニック（ＮＯＳ３ヌル、遺伝子ノックアウト）マウスに実施した。
図４ｂおよび表１（下記）は、ＷＴおよびＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウス由来の両方のＤＮＡ増幅産物をそれぞれ示している。結果は、両方の試料源に関して、正確にサイズ決定されたＤＮＡアンプリコンが、ＦＴＡマトリックスに適用されたすべての臓器／組織源から単離されたＤＮＡから作製されたことを示している。同様の結果が、ＦＴＡ ｅｌｕｔｅマトリックスに関しても提示された（データ非掲載）。これらのデータは、１．２ｍｍのＨａｒｒｉｓマイクロパンチがＦＴＡおよびＦＴＡマイクロカードに保存された組織から十分なＤＮＡを切り取り、２つの遺伝子型変異体を識別可能であることを示している。
図４ｂにおいて、ＦＴＡカード由来の組織から単離されたＤＮＡを増幅鋳型として使用した、ＮＯＳ遺伝子座に関係するバンド化されたＰＣＲアンプリコンを示す。レーン１−５はＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺および腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６−１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺および腎臓）から増幅されたＤＮＡである。同様の結果がＦＴＡ ｅｌｕｔｅおよびｉｎｄｉｃａｔｉｎｇＦＴＡからも見出されている。
Figure 0006866164
表１において、さまざまなＦＴＡ紙に保存された組織から単離されたＤＮＡの増幅が成功したことが記録されている。ＤＮＡを１．２ｍｍのパンチから単離した。「＋」は、アンプリコンの存在を示し、ＮＤは未判定を表す。
ＲＮＡの精製および定量
組織試料を上記のＦＴＡカードに適用した。ＦＴＡ試料パンチを切り取り、ＲＮＡを下記のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用して単離した。ＲＮＡの定量を、ＡＢＩ７９００リアルタイムＰＣＲシステムで市販のｍＲＮＡ定量キットを利用して表２に詳細に示すように実施した。
Ｈａｒｒｉｓの３ｍｍ使い捨てマイクロパンチを使用して、パンチを乾燥試料スポットの中心から切り取り、清潔なＲＮａｓｅ非含有１．５ｍｌの微小遠心管に入れた。ｉｌｌｕｓｔｒａバッファーＲＡ１（３５０μｌ）を３．５μｌのβ−メルカプトエタノールと組み合わせ、この溶液をディスクに添加した。ディスクを、２０ゲージの針を使用して均質化した。得られたホモジネートを、その後で残留物質を除去するためにＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターカラムに移した。このカラムを１１，０００×ｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターを廃棄した。均質化された溶解物はＲＮＡを含有し、このろ液を新しいＲＮａｓｅ非含有の１．５ｍｌ微小遠心管に移した。
エタノール（７０％；３５０μｌ）を均質化溶解物に添加し、２×５秒のパルスでボルテックスにより混合した。各調製物に関して、溶解物をピペットにより２−３回上下させ、２ｍｌの微小遠心管に入れたＲＮＡミニスピンカラムに適用した。この遠心管を８０００×ｇで３０秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。ＲＮＡスピンカラムを新しい採取管に移した。
ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭＤＢバッファー（３５０μｌ）を加え、この管を１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。ＤＮａｓｅ反応混合物を製造業者の使用説明書に従って調製し、ＲＮＡスピンカラム内に入っているフィルター表面に添加した。このＤＮＡｓｅインキュベーションは、室温に置いて１５分間実施した。
洗浄バッファーＲＡ２（２００μｌ）をＲＮＡミニスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。
６００μｌのバッファーＲＡ３をＲＮＡ Ｍｉｎｉスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。バッファーＲＡ３（２５０μｌ）でさらにカラムを洗浄した。膜を完全に乾燥させるために、カラムを１１０００×ｇで２分間遠心分離し、このカラムを最終的にヌクレアーゼ非含有１．５ｍｌ微小遠心管内に入れた。
ＲＮａｓｅ非含有水（４０μｌ）を該カラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。精製されたＲＮＡは、直ちに下流の用途に使用するか、または使用まで−８０℃において使用まで保存するかのどちらかであった。
長期保存後の複数組織由来のＲＮＡの完全性を判定するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、ＦＴＡおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅカードに保存されたマウス組織試料から単離されたＲＮＡに対して実施した。カードを、乾燥剤の存在下で２ヶ月保存した。ｍＲＮＡの定量を、製造業者の使用説明書に従って、ｉ）ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎの齧歯類ＧＡＰＤＨ コントロールキット（部品番号４３０８３１３）、ｉｉ）ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのネズミＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨおよびＢｅｔａ−Ａｃｔｉｎ遺伝子用リアルタイムＬＵＸｍＲＮＡプライマーセット（それぞれ、カタログ番号１０５Ｍ−０２、１００Ｍ−０２および１０１Ｍ−０２）またはｉｉｉ）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓによる組織特異的遺伝子プライマーセットのいずれかを使用して成し遂げた（詳細は表２を参照されたい）。
Figure 0006866164
図５は、ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールキットを使用した、いくつかの組織源からのＧＡＤＰＨの相対発現レベルを示す。ＦＴＡカード由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。同程度のＧＡＰＤＨ ＲＮＡレベルが、両方の紙タイプから単離されたＲＮＡから検出された。このことは、ＦＴＡおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅ両方の紙マトリックスが、組織由来ＲＮＡの適切な短期−中期保存のための適切な固体支持マトリックスであることを示している。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来する組織のネズミＲＮＡを、ＦＴＡおよびＦＴＡ Ｅｌｕｔｅの単一の３ｍｍパンチから単離した。ＲＮＡを、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＲＮＡミニスピンキットを使用して精製した。
ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンをコードするネズミｍＲＮＡの絶対定量を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの適切なリアルタイムＬＵＸプライマーセットを用いて実施した。ＦＴＡカード由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。ＦＴＡカードからのＲＮＡの単離に関係するデータを図６に記載するが、このデータは、ＦＴＡカードが多数の組織型由来のＲＮＡの保存を支持できることを実証している。同様の観察がＦＴＡ ｅｌｕｔｅに保存されたＲＮＡに関しても明らかであった。
ＦＴＡおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅに保管された組織試料中のｍＲＮＡレベルを調査するために、表２に記載のｍＲＮＡの相対発現レベルを、リアルタイム組織特異的ＲＴ−ＰＣＲプローブを使用して決定した（図７を参照されたい）。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ転写産物を使用して、各試料中の全ＲＮＡレベルを標準化した。追加の対照は、ＦＴＡカードに適用された均質化組織およびＲＮＡミニスピンキットに由来する新しく単離されたＲＮＡの使用を伴った。
結果は、他のｍＲＮＡと比較して、腎臓中のアルカリホスファターゼ、脳内のミエリン塩基性タンパク質、心臓および肺におけるＭｙｈ６メッセージに関するｍＲＮＡレベルの上昇ならびに肺組織源由来のＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの上昇を示した。この傾向は、試料型、すなわち、ＦＴＡに直接保存された組織、均質化後に保存された組織または新たに単離されたＲＮＡに関係なく明確であった。これらのデータは予測発現パターンおよびこれらの組織源由来のこれらのｍＲＮＡのレベルと一致する。これらのデータは、ＦＴＡおよびＦＴＡ ｅｌｕｔｅの両方が、試料型、すなわちカード系または新たなフォーマットに関係なくすべての組織源由来のｍＲＮＡレベルを維持できることを実証している。
固体支持体から調製された遺伝子標的を使用する、腫瘍由来ＲＮＡの分析
２次元（２Ｄ）腫瘍マッピングを使用して、腫瘍の辺縁において主に発生する上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｓｔｉｏｎ）（ＥＭＴ）に関係するマーカーなどの腫瘍浸潤の分子マーカーを分析することができる。下記の表３は、腫瘍の浸潤性を決定するために使用可能な適切な遺伝子マーカーの例を記載している。
Figure 0006866164
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細胞または固体支持体に転写された酵素からの酵素の検出
タンパク質および酵素試験を、完全に構成されたＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＡＭ１９７０およびＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って実施した。
実験の第１段階において、０．１２５−０．５ＵのＤＮａｓｅを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃから販売されているＦＴＡおよび９０３ブランドの紙に体積１０μｌで適用した。ＤＮＡｓｅおよびＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した。
実験の第２段階において、ＦＴＡおよび９０３紙に体積１０μｌで上記のように適用された１０6のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍのパンチを採取した。ＤＮＡｓｅおよびＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した。
実験の第３段階において、１．２ｍｍのパンチを、ＦＴＡおよび９０３紙に体積１０μｌで適用された、０．５ＵのＤＮａｓｅまたは１０μＵのＲＮａｓｅのいずれかを含有する１０6のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ ２８）から採取した。
ＤＮａｓｅ活性の検出を、切断可能な蛍光標識ＤＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）およびヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍの基質はＤＮａｓｅにより切断されると、ピンク色の蛍光を発する改変されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ５３５／５９５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ ｇａｉｎ）使用）で測定した。ＤＮａｓｅ活性を含む溶液はピンク色の蛍光を発生し、一方、ＤＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＤＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。ＤＮＡａｓｅ活性は、９０３またはＦＴＡ紙を使用して、変化量依存様式で検出および定量することができる。
図８および９は、すぐ上に述べた方法論を使用した、ＦＴＡ紙および９０３紙に保存された試料の相対蛍光を例示している。
ＲＮａｓｅの検出を、切断可能な蛍光標識ＲＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）およびヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、この試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍの基質はＲＮａｓｅにより切断されると、緑色の蛍光を発する改変されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ４８５／５３５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ ｇａｉｎ）使用）において測定した。ＲＮａｓｅを含む溶液は緑色の蛍光を発生し、一方、ＲＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＲＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。ＲＮＡａｓｅ活性は、９０３またはＦＴＡ紙を使用して、変化量依存様式で検出および定量することができる。
図１０および１１は、すぐ上に述べた方法論を使用した、ＦＴＡ紙および９０３紙に保存された試料の相対蛍光を例示している。
固体支持体に適用されたモデルタンパク質の検出
組み換え体ＩＬ−２±キャリア（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれカタログ番号２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９１１２およびカタログ番号２０２−ＩＬ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９０８１）を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコＰＢＳ（ＰＡＡ；カタログ番号Ｈ１５−００２、ロットＨ００２０８−０６７３）、ＥＤＴＡ−抗凝固処理ヒト、ウサギまたはウマ血液（ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかに５０ｐｇまたは１００ｐｇ／μｌで溶解した。
アリコート（０．５（Ｂ）または１００（Ａ）ｐｇのＩＬ−２を含有する１μｌ；（図１２を参照されたい）を、下記のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅろ紙；９０３ Ｎｅｏｎａｔａｌ ＳＴＤカード、カタログ番号１０５３８０６９、ロット６８３３９０９ Ｗ０８２；ＤＭＰＫ−Ａカード、カタログ番号ＷＢ１２９２４１、ロットＦＴ６８４７５０９；ＤＭＰＫ−Ｂカード、カタログ番号ＷＢ１２９２４２、ロットＦＥ６８４７６０９およびＤＭＰＫ−Ｃカード、カタログ番号ＷＢ１２９２４３、ロットＦＥ６８４７００９に適用した。試料を、周囲温度および湿度において一晩乾燥させた。
パンチ（直径３ｍｍ）を、適切にサイズ化されたＨａｒｒｉｓ Ｕｎｉ−ｃｏｒｅ ｐｕｎｃｈ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ７０８８６０−２５ｅａ、ロット３１１０）を使用して各紙タイプから抜き出した。単一のパンチをＨｕｍａｎ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ０２５０、ロット２７３２７５）によるＩＬ−２マイクロプレートの個別のウェルに入れた。これらのプレートをＩＬ−２に対するマウスモノクローナル抗体でコーティングした。ＩＬ−２タンパク質を、紙パンチからＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキットにより提供されるアッセイバッファー（１００μｌ）を使用して溶出した。すべてのその後のステップを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキットにより提供された使用指示書に従って、「ペーパーイン」法（紙パンチを直接アッセイバッファー内に入れ、分析物をｉｎ ｓｉｔｕで直接溶出する）を使用して実施した。アッセイの完了において、マイクロプレートの光学密度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔを使用して４５０ｎｍにおいてモニターした。ＩＬ−２の回収を、公知のＩＬ−２濃度の標準曲線と値とを比較することによって決定した。それぞれの個別の実験に対して、新しいＩＬ−２標準曲線を作成した。
試料ＡおよびＢそれぞれに対して、ＤＭＰＫ−Ｃカードからのモデルタンパク質（インターロイキン２ ＩＬ−２）の回収率を、図１２に例示する。
１つの実施形態を記載および例示してきたが、特許請求する発明の範囲から逸脱することなくそれらの実施形態に対する付加、省略および改良が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、図１２および３に示された特定の実施例は、ＦＴＡブランドで販売された固体支持体３０を用いるように記載されているが、上記の実験データは、例えば下記に詳細に示すように、この技術が他の固体支持体でも使用できることを例示している。
本明細書において、ＦＴＡ（ＦＴＡマイクロカード、ＦＴＡ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇおよびＦＴＡクラシックを含む）は、安定化化学物質、例えば弱塩基、キレート化剤および陰イオン界面活性剤で処理して、支持体表面に安定化化学物質を含浸させたセルロース繊維紙である。このようにして、生体試料物質は、数ヶ月または数年でも装置において保存可能であり、必要に応じて室温において装置を実験室へ輸送でき、保存された試料および試薬を単に溶解することによって、適切な回収が可能である。本明細書においてＦＴＡ Ｅｌｕｔｅは、チオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤でコーティングされ、生体物質の直接アッセイが可能な、ＦＴＡ紙に用いられた化学物質を除去する必要がない同様の紙を表す。本明細書において９０３は未コーティングのセルロース繊維紙を表す。
ガラス繊維／マイクロファイバー材料などの他の固体支持体または多孔質ポリマー、例えばポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、硝酸セルロース、酢酸セルロースまたは酸化アルミニウムなどの多孔質膜材料を使用することも可能である。
上記の固体支持体は、概して平坦な構成での使用が意図されるが、別の方法では、例えば、筒状の上で、腫瘍／腫瘤表面に転がして使用することもできる。
さらに、特定の実施例は腫瘍横断切片について述べているが、他の生体腫瘤も同じ技術に従ってプロファイリング可能である。
１０ トレイ、ホルダー
１１ 底部
１２ 直立スパイク、反転インプリント、保持手段
２０ 腫瘍、横断切片
２２ 辺縁部
２４ 内部領域
３０ 支持体
３２ 印刷された格子パターン
３２’ 画像に重ねられた格子パターン

Claims (8)

  1. 生体物質から形成される生体腫瘤の空間的分子プロファイリングを取り込む方法であって、
    ａ）横切された生体腫瘤、例えば腫瘍の露出した部分の面積と少なくとも同じ面積の固体支持体を提供するステップ、
    ｂ）生体物質を前記腫瘤の露出した部分から前記支持体に転写して、前記腫瘤の露出した部分に存在する生体物質の２次元インプリントを前記支持体に提供するステップ、
    ｃ）前記腫瘤の露出した部分の空間的分子プロファイルを決定するために、前記インプリントのさまざまな所定の位置から前記転写された生体物質の生物学的アッセイを複数回実施するステップ
    を含み、前記固体支持体表面に、弱塩基、キレート化剤、陰イオン界面活性剤および／またはカオトロピック剤を含む化学物質が含浸されており、
    前記転写された生体物質が、ＲＮＡを含む、方法。
  2. 前記生体物質を転写するステップが、前記腫瘤の露出した部分と前記支持体とを接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記腫瘤の露出した部分が、前記腫瘤の辺縁部を含み、更に、前記腫瘤の概ね中心部分を含む、または含まない、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記複数回のアッセイが、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、定量的リアルタイムＰＣＲ、等温増幅などの核酸増幅を含む、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 本明細書の表３に記号化された遺伝子の１または複数の存在を決定するさらなるステップを含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 横切された生体腫瘤を画像化するさらなるステップを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記固体支持体に基準格子を提供するステップ、および前記画像に同様の格子を重ね合わせるステップを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 腫瘍などの生体腫瘤の少なくとも一部から生体物質の空間的プロファイルを取り込むためのキットであって、
    前記腫瘤と接触させるための、前記腫瘤の一部の面積と少なくとも等しい面積の固体支持体、および目的の核酸の増幅の開始に適切なプライマーを含む乾燥試薬を含み、
    前記固体支持体表面に、弱塩基、キレート化剤、陰イオン界面活性剤および／またはカオトロピック剤を含む化学物質が含浸されており、
    前記生体物質が、ＲＮＡを含む、キット。
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