JP6864882B2 - IgG type antibody adsorbent carrying a peptide having affinity for immunoglobulin G - Google Patents
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Description
本発明は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する親和性を有するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材に関する。 The present invention relates to an IgG-type antibody adsorbent carrying a peptide having an affinity for immunoglobulin G (IgG).
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、及び臨床検査学の飛躍的な進歩によって、疾患の原因又は疾患の進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、血液中に存在するＩｇＧを本体とする自己抗体及び免疫複合体は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の原因及び病態の進行と密接な関係を持っていると考えられている。 In recent years, breakthroughs in medicine, especially internal medicine, hematology, immunology, and clinical laboratory studies have revealed malignant substances in the blood that are thought to be closely related to the cause or progression of the disease. Is becoming. For example, IgG-based autoantibodies and immune complexes present in the blood can be used as causes and progression of autoimmune diseases related to bioimmune function such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and myasthenia gravis. It is believed to have a close relationship.
そこで、血液及び血漿等の体液成分から、上記自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着除去することで、上述の疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめ、更には疾患の治癒を早めることが期待されている。体液中の自己抗体及び免疫複合体を除去する技術としては、全血を血球成分と血漿成分とに分離し、血漿中に含まれる上記自己抗体及び免疫複合体を吸着材によって吸着し、除去する方法がある。 Therefore, by specifically adsorbing and removing the autoantibodies and immune complexes from body fluid components such as blood and plasma, the progression of the above-mentioned diseases can be prevented, the symptoms of the diseases can be alleviated, and further, the cure of the diseases can be achieved. It is expected to accelerate. As a technique for removing autoantibodies and immune complexes in body fluids, whole blood is separated into blood cell components and plasma components, and the autoantibodies and immune complexes contained in plasma are adsorbed and removed by an adsorbent. There is a way.
従来、このような目的に使用する吸着材としては、水不溶性担体にリガンドとして疎水性アミノ酸であるトリプトファンを固定化した吸着材が知られている（例えば特許文献１）。さらにＩｇＧ型抗体と特異的に相互作用することが知られているプロテインＡ及び抗ヒト免疫グロブリン抗体等の生物由来のＩｇＧ型抗体結合性物質、所謂、生物学的リガンドを、水不溶性担体に固定化した吸着材が知られている（例えば非特許文献１）。例えば、生物学的リガンドの一例であるプロテインＡをシリカマトリックスに結合させた、ＩｇＧ及びＩｇＧ複合体除去のための免疫吸着材が知られている（例えば特許文献２）。 Conventionally, as an adsorbent used for such a purpose, an adsorbent in which tryptophan, which is a hydrophobic amino acid, is immobilized as a ligand on a water-insoluble carrier is known (for example, Patent Document 1). Furthermore, biological IgG-type antibody-binding substances such as protein A and anti-human immunoglobulin antibody, which are known to specifically interact with IgG-type antibodies, so-called biological ligands, are immobilized on a water-insoluble carrier. A modified adsorbent is known (for example, Non-Patent Document 1). For example, an immunoadsorbent for removing IgG and IgG complexes, in which protein A, which is an example of a biological ligand, is bound to a silica matrix is known (for example, Patent Document 2).
トリプトファンをリガンドとして水不溶性担体に固定化させた吸着材は、治療効果が認められる一方で、ＩｇＧ型抗体を吸着する容量が十分に大きいとはいえない。さらに、上記吸着材は病因物質ではないフィブリノーゲン（Ｆｂｇ）も吸着除去し、選択吸着性が悪いという欠点がある。 An adsorbent in which tryptophan is immobilized on a water-insoluble carrier using tryptophan as a ligand has a therapeutic effect, but the capacity for adsorbing IgG-type antibody is not sufficiently large. Further, the adsorbent has a drawback that it also adsorbs and removes fibrinogen (Fbg), which is not a pathogenic substance, and has poor selective adsorbability.
一方で、生物学的リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、トリプトファンをリガンドとした吸着材が有する上述のような問題を解決可能であると考えられる。しかしながら、これらの生物学的リガンドは一般的に原料の確保が困難で製品コストがかかるという不利な点がある。さらに、上記吸着材を体液に接触させて使用する際、上記生物学的リガンドが体液中に溶出して重大な副作用を生じる危険がある。加えて、上記生物学的リガンドの製造工程で混入する可能性がある未知のウィルス又は病原菌に由来する感染のリスクがあるといった難点も含んでいる。 On the other hand, it is considered that the adsorbent in which the biological ligand is immobilized on the water-insoluble carrier can solve the above-mentioned problems of the adsorbent having tryptophan as the ligand. However, these biological ligands generally have the disadvantage that it is difficult to secure raw materials and the product cost is high. Furthermore, when the adsorbent is used in contact with the body fluid, there is a risk that the biological ligand will elute into the body fluid and cause serious side effects. In addition, there is a risk of infection from an unknown virus or pathogen that may be contaminated in the process of manufacturing the biological ligand.
これまで、本発明者らはヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有し、標的のタンパク質と高い親和性で相互作用するペプチドを見出している。このようなペプチドとして、特許文献３には、ＩｇＧ型抗体と相互作用するペプチド及びこのペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材が開示されている。
So far, the present inventors have found a peptide having a helix-loop-helix structure and interacting with a target protein with high affinity. As such peptides,
しかしながら、ＩｇＧ型抗体とさらに親和性の高いＩｇＧ型抗体吸着材が求められている。 However, there is a demand for an IgG antibody adsorbent having a higher affinity for an IgG antibody.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＩｇＧ型抗体と高い親和性で相互作用するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイスを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is an IgG-type antibody adsorbent carrying a peptide that interacts with an IgG-type antibody with high affinity, an IgG-type antibody adsorbent filled with the adsorbent, and an IgG-type antibody adsorbent thereof. An object of the present invention is to provide a body fluid purification device provided with an adsorbent.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、ＩｇＧ型抗体と選択的に結合することを見出した。さらに、本発明者らは、上記ペプチドをＩｇＧ型抗体を結合させるためのリガンドとし、上記リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材が、体液を浄化させるための治療器（体液浄化用治療器、体液浄化デバイス）として、血液、血漿及び血清等の体液中から、自己抗体及び免疫複合体を構成するＩｇＧ型抗体を驚くほど高い吸着容量かつ、高選択的に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have found that a peptide having a specific amino acid sequence selectively binds to an IgG-type antibody. Furthermore, the present inventors use the peptide as a ligand for binding an IgG-type antibody, and an adsorbent in which the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier purifies body fluid (treatment for purifying body fluid). As a vessel, body fluid purification device), we found that it adsorbs self-antibodies and IgG-type antibodies constituting immune complexes from body fluids such as blood, plasma, and serum with a surprisingly high adsorption capacity and high selectivity. The invention was completed.
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが下記配列番号１のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材：
ＦＮＭＱＣＱＡＥＦＹＥＩＬＨＥＸ16Ｘ17ＡＸ19Ｘ20ＧＧＧＧＸ26ＧＧＫＸ29Ｘ30ＡＸ32Ｘ33ＡＫＩＡＡＬＲＤＡＣ （配列番号：１）
（配列番号１中、
Ｘ16は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、
Ｘ17は、Ｒ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、
Ｘ19は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、
Ｘ20は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ26は、Ｇ、Ｅ又は欠失しており、
Ｘ29は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、
Ｘ30は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ32は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、
Ｘ33は、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧである）。
［２］
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖ、Ｌ又はＭであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴである、［１］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［３］
配列番号１中、
Ｘ16が、Ｌ又はＭであり、
Ｘ17が、Ｒ又はＫであり、
Ｘ19が、Ｖであり、
Ｘ20が、Ｇ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ26が、Ｇであり、
Ｘ29が、Ｉ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ30が、Ａ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｘ32が、Ｌ又はＦであり、
Ｘ33が、Ｎである、［１］又は［２］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［４］
前記ペプチドのＩｇＧに対する解離定数が３０００ｎＭ以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［５］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号２〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
［６］
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号４７〜５１のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材。
［７］
前記ペプチドがヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［８］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステインと、同アミノ酸配列中のＣ末端のシステインがジスルフィド結合した、［１］〜［７］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［９］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１０］
前記アミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインがＱで置換された、［１］〜［７］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１１］
前記ペプチドがリンカーを介して前記水不溶性担体に担持された、［１］〜［１０］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１２］
前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、１５万〜１０００万の排除限界分子量を有する、［１］〜［１１］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１３］
液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
前記容器に充填された［１］〜［１２］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、
を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
［１４］
［１３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。
That is, the present invention relates to the following.
[1]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent containing a water-insoluble carrier and a peptide supported on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below:
FNMQCQAEFYEILHEX 16 X 17 AX 19 X 20 GGGGX 26 GGKX 29 X 30 AX 32 X 33 AKIAALRDAC (SEQ ID NO: 1)
(In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L, M, I or F
X 17 is R, K, Y or Q,
X 19 is V, L, M, F or I,
X 20 is an arbitrary amino acid,
X 26 is G, E or missing and
X 29 is I, L, V, M or F,
X 30 is an arbitrary amino acid,
X 32 is L, F, M or I
X 33 is N, D, H, A, T or G).
[2]
In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M,
X 17 is R or K,
X 19 is V, L or M,
X 29 is I, L, V or M,
X 32 is L or F,
The IgG-type antibody adsorbent according to [1], wherein X 33 is N, D, H, A or T.
[3]
In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M,
X 17 is R or K,
X 19 is V,
X 20 is G, Q, R or A,
X 26 is G,
X 29 is I, L or V,
X 30 is A, T, Q, E or S,
X 32 is L or F,
The IgG-type antibody adsorbent according to [1] or [2], wherein X 33 is N.
[4]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [3], wherein the dissociation constant of the peptide with respect to IgG is 3000 nM or less.
[5]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent containing a water-insoluble carrier and a peptide supported on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2-51.
[6]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent containing a water-insoluble carrier and a peptide supported on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 47 to 51.
[7]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [6], wherein the peptide has a helix-loop-helix structure.
[8]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein the fifth cysteine from the N-terminal in the amino acid sequence and the C-terminal cysteine in the amino acid sequence are disulfide-bonded.
[9]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein the fifth cysteine from the N-terminal and / or the C-terminal cysteine in the amino acid sequence is replaced with an arbitrary amino acid.
[10]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein the fifth cysteine from the N-terminal and / or the C-terminal cysteine in the amino acid sequence is replaced with Q.
[11]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [10], wherein the peptide is supported on the water-insoluble carrier via a linker.
[12]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [11], wherein the water-insoluble carrier is a particulate porous body and has an exclusion limit molecular weight of 150,000 to 10 million.
[13]
A container having an inlet port for allowing a liquid to flow in and an outlet port for allowing the liquid to flow out.
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [12] filled in the container.
An IgG antibody adsorber comprising.
[14]
A body fluid purification device including the IgG-type antibody adsorber according to [13].
A body fluid purification device in which the liquid flowing into the IgG antibody adsorber is a body fluid selected from the group consisting of blood, plasma and serum.
本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、ＩｇＧと高い親和性を有するペプチドを担持したＩｇＧ型抗体吸着材であり、ＩｇＧ型抗体を高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能である。 The IgG-type antibody adsorbent of the present invention is an IgG-type antibody adsorbent carrying a peptide having a high affinity for IgG, and can highly selectively adsorb IgG-type antibody with a high adsorption capacity.
さらに、上記ペプチドは体液中でも安定であるため、本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、血漿及び血清等の体液から高い吸着容量かつ、高い選択性でＩｇＧ型抗体を吸着させることが可能である。 Furthermore, since the peptide is stable in body fluids, the IgG-type antibody adsorbent of the present invention can adsorb IgG-type antibodies from body fluids such as plasma and serum with high adsorption capacity and high selectivity.
以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiments are examples for explaining the present invention, and the present invention is not intended to be limited only to this embodiment.
本実施形態における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体吸着材は、ＩｇＧ型抗体を吸着する。本実施形態における「ＩｇＧ型抗体」とは、ＩｇＧクラスと同様のＦｃ領域を有するタンパク質であれば、タンパク質分子内のＦｃ領域以外の領域が変性、及び／又は欠損したタンパク質であってもよい。 The immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent in the present embodiment adsorbs an IgG type antibody. The "IgG type antibody" in the present embodiment may be a protein in which a region other than the Fc region in the protein molecule is denatured and / or deleted as long as it is a protein having an Fc region similar to that of the IgG class.
本明細書においては、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載し、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）方向へ左から右へ記載する。 In the present specification, various amino acid residues are described in one letter notation according to the conventional method in the art, and the amino acid sequence of the peptide is described from left to right in the direction from the amino terminal (N terminal) to the carboxy terminal (C terminal). ..
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、配列番号１〜５１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドをリガンドとして、水不溶性担体に担持させたものである。一態様において、上記ペプチドは配列番号４７〜５１に記載のアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有することが特に好ましい。 The IgG-type antibody adsorbent of the present embodiment is obtained by supporting a peptide having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 51 on a water-insoluble carrier as a ligand. In one embodiment, the peptide preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 47-51, and particularly preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49.
上記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列：
ＦＮＭＱＣＱＡＥＦＹＥＩＬＨＥＸ16Ｘ17ＡＸ19Ｘ20ＧＧＧＧＧＸ26ＧＫＸ29Ｘ30ＡＸ32Ｘ33ＡＫＩＡＡＬＲＤＡＣ （配列番号：１）
を有する場合、
Ｘ16は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＦであり、好ましくはＬ又はＭであり、
Ｘ17は、Ｒ、Ｋ、Ｙ又はＱであり、好ましくはＲ又はＫであり、
Ｘ19は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＩであり、好ましくはＶ、Ｌ又はＭであり、より好ましくはＶであり、
Ｘ20は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＧ、Ｑ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ26は、Ｇ、Ｅ又は欠失しており、好ましくはＧであり、
Ｘ29は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ又はＦであり、好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ又はＭであり、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ30は、任意のアミノ酸であり、好ましくはＡ、Ｔ、Ｑ、Ｅ又はＳであり、
Ｘ32は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＩであり、好ましくはＬ又はＦであり、
Ｘ33は、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｔ又はＧであり、好ましくはＮ、Ｄ、Ｈ、Ａ又はＴであり、より好ましくはＮである。
The above peptide is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
FNMQCQAEFYEILHEX 16 X 17 AX 19 X 20 GGGGGX 26 GKX 29 X 30 AX 32 X 33 AKIAALRDAC (SEQ ID NO: 1)
If you have
X 16 is L, M, I or F, preferably L or M.
X 17 is R, K, Y or Q, preferably R or K.
X 19 is V, L, M, F or I, preferably V, L or M, more preferably V.
X 20 is any amino acid, preferably G, Q, R or A.
X 26 is G, E or deleted, preferably G.
X 29 is I, L, V, M or F, preferably I, L, V or M, more preferably I, L or V.
X 30 is any amino acid, preferably A, T, Q, E or S.
X 32 is L, F, M or I, preferably L or F.
X 33 is N, D, H, A, T or G, preferably N, D, H, A or T, and more preferably N.
本実施形態において、上記ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチドが所望のＩｇＧ親和性有する限り、天然アミノ酸であっても、天然アミノ酸の誘導体や非天然アミノ酸であってもよい。一態様において、好ましくは、上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然アミノ酸である。 In the present embodiment, the amino acids constituting the peptide may be natural amino acids, derivatives of natural amino acids, or unnatural amino acids as long as the peptide has a desired IgG affinity. In one embodiment, preferably the amino acids that make up the peptide are natural amino acids.
天然アミノ酸の誘導体としては、例えば、ヒドロキシル基が導入されたアミノ酸であるヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン等、アミノ基が導入されたアミノ酸であるジアミノプロピオン酸等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては：主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸など；側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するホモアミノ酸（ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）など；が挙げられるがこれらに限定されない。 Examples of the derivative of the natural amino acid include, but are not limited to, hydroxyproline and hydroxylysine, which are amino acids into which a hydroxyl group has been introduced, and diaminopropionic acid, which is an amino acid into which an amino group has been introduced. Examples of unnatural amino acids are: α, α-disubstituted amino acids (such as α-methylalanine), N-alkyl-α-amino acids, D-amino acids, β-amino acids, α, whose main chain structure is different from that of the natural type. -Hydroxyic acid, etc .; Amino acids with different side chain structures (norleucine, homohistidine, etc.), homoamino acids with extra methylene in the side chain (homophenylalanine, homohistidine, etc.) and carboxylic acid functional groups in the side chain Examples include, but are not limited to, amino acids in which amino acids are replaced by sulfonic acid groups (such as cysteine acid).
上記ペプチドは、所望のＩｇＧ親和性有する限り、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加又は欠損、置換されたペプチドでも有り得る。 As long as the peptide has the desired IgG affinity, one or several, preferably 1 to 3 amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 51. It can also be a peptide.
一態様において、上記ペプチドは、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及びＣ末端のシステインのいずれか又は両方が任意のアミノ酸（例えば、荷電を有さないアミノ酸、好ましくはＱ）で置換されたペプチドであり得る。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと構造が類似し、Ｎ末端から５番目及びＣ末端にシステインを有するペプチドにおいて、５番目のシステインを同じく荷電を有さないグルタミンに置換しても、ＩｇＧに対する解離定数に大きな影響がなかったことを確認している。
一態様において、配列番号１〜５１に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目及びＣ末端の２つのシステインは、相互に結合して環状ペプチドを形成するアミノ酸で置換されていてもよい。
In one embodiment, in the peptide, in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 51, either or both of the N-terminal fifth cysteine and the C-terminal cysteine is an arbitrary amino acid (for example, charged). It can be an amino acid that does not have, preferably a peptide substituted with Q). The present inventors have a structure similar to that of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and in the peptide having cysteine at the 5th N-terminal and the C-terminal, the 5th cysteine is replaced with glutamine which is also uncharged. However, it has been confirmed that there was no significant effect on the dissociation constant for IgG.
In one embodiment, in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1-51, the two cysteines at the N-terminal 5th and C-terminal are replaced with amino acids that bind to each other to form a cyclic peptide. You may.
上記ペプチドは、各種動物のＩｇＧ、特にヒトのＩｇＧに対して強い結合性を示す。一態様において、ＩｇＧに対する結合性は、ＩｇＧに対する解離定数（ＫD）により評価することができる。解離定数の算出方法は当業者に公知であり、例えば後述の実施例に記載の方法により、水不溶性担体に担持させる前のペプチドを用いて算出することができる。好ましい態様において、上記ペプチドは、ＩｇＧ（好ましくは、ヒトＩｇＧ）に対する解離定数（ＫD）が３０００ｎＭ以下であり、好ましくは１０００ｎＭ以下であり、より好ましくは５００ｎＭ以下であり、さらに好ましくは１００ｎＭ以下であり、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下であり、特に好ましくは１５ｎＭ以下である。 The above peptides show strong binding to IgG of various animals, especially human IgG. In one embodiment, binding to IgG can be evaluated by a dissociation constant for IgG (K D). A method for calculating the dissociation constant is known to those skilled in the art, and can be calculated using a peptide before being supported on a water-insoluble carrier, for example, by the method described in Examples described later. In a preferred embodiment, the peptide, IgG (preferably human IgG) is the dissociation constant (K D) 3000nM or less with respect to, preferably not more than 1000 nM, more preferably not more than 500 nM, more preferably below 100nM Yes, even more preferably 50 nM or less, and particularly preferably 15 nM or less.
上記ペプチドは、配列番号１〜５１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有しているかぎり特に限定されないが、一態様において、好ましくは、配列番号１〜５１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。 The peptide is not particularly limited as long as it has the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 51, but in one embodiment, it is preferably a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 51. ..
上記ペプチドの全長は、アミノ酸残基で３８〜２００残基であることが好ましく、アミノ酸残基で３８〜１００残基であることがより好ましい。 The total length of the peptide is preferably 38 to 200 amino acid residues, and more preferably 38 to 100 amino acid residues.
上記ペプチドは、非環状であってもよく、環状であってもよい。一態様において、上記ペプチドは好ましくは環状ペプチドである。 The peptide may be acyclic or cyclic. In one embodiment, the peptide is preferably a cyclic peptide.
非環状のペプチドは、当該技術において、それ自体公知のペプチド合成法に従って合成することができる。例えばＦｍｏｃ固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法等があげられる。操作が簡便である点から、ペプチド合成方法は固相合成法であることが好ましい。また、非環状ペプチドは、遺伝子工学的手法を用いて製造することも可能である。例えば、上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターによって適切な宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌）を形質転換する。そして、上記宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養することによって、培養物からペプチドを得ることができる。 The acyclic peptide can be synthesized in the art according to a peptide synthesis method known per se. Examples thereof include liquid phase synthesis methods such as Fmoc solid phase synthesis method and fragment condensation method. The peptide synthesis method is preferably a solid phase synthesis method from the viewpoint of simple operation. The acyclic peptide can also be produced using a genetic engineering technique. For example, a nucleic acid having a base sequence encoding the above-mentioned amino acid sequence is incorporated into an appropriate expression vector, and an appropriate host cell (for example, mammalian cell, insect cell, Escherichia coli) is transformed with the obtained expression vector. Then, the peptide can be obtained from the culture by culturing the host cell under conditions suitable for the expression of the peptide.
環状ペプチドは、非環状ペプチドを得た後、これを公知の手法で環化して得ることができる。ペプチドの環化は、例えば、アミノ酸配列中の２つのシステイン間に、公知の手法によってジスルフィド結合を形成することにより行うことができる。また、公知の手法によって、分子内でチオエステルやチオエーテル結合を形成することによって行うこともできる。さらに、例えば高度希釈法など公知の手法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させることによっても行うこともできる。 The cyclic peptide can be obtained by obtaining a non-cyclic peptide and then cyclizing it by a known method. Peptide cyclization can be performed, for example, by forming a disulfide bond between two cysteines in the amino acid sequence by a known method. It can also be carried out by forming a thioester or thioether bond in the molecule by a known method. Further, it can also be carried out by condensing a carboxy group and an amino group in the molecule by a known method such as a highly diluted method.
好ましい態様において、上記ペプチドは、Ｎ末端側の１０前後のアミノ酸残基及びＣ末端側の１０前後のアミノ酸残基がそれぞれα−ヘリックスを形成し、この２つのα−へリックスが７つのグリシン残基を含むループで結合したヘリックス−ループ−ヘリックス構造（ＨＬＨ構造）を有する。理論に束縛されるものではないが、このＨＬＨ構造を有するペプチドにおいて、２本のα−ヘリックスは、内側に存在するロイシン側鎖の疎水相互作用等により安定なＨＬＨ構造を形成する。さらに、Ｎ末端およびＣ末端のシステインが分子内ジスルフィド架橋することでさらに立体構造の安定性が向上する。
In a preferred embodiment, in the above peptide, about 10 amino acid residues on the N-terminal side and about 10 amino acid residues on the C-terminal side form α-helices, respectively, and these two α-
上記ペプチドを水不溶性担体に担持することによって、本実施形態におけるＩｇＧ型抗体吸着材として利用し得る。 By supporting the peptide on a water-insoluble carrier, it can be used as an IgG-type antibody adsorbent in the present embodiment.
水不溶性担体とは、水に溶けない担体を意味する。上記ペプチドリガンドを担持させる際に使用する水不溶性担体としては、親水基の表面を有し、かつペプチドリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記水不溶性担体は吸着に使用できる有効表面積が広い多孔性であるもの（多孔質体）が好ましい。 The water-insoluble carrier means a carrier that is insoluble in water. Examples of the water-insoluble carrier used for supporting the peptide ligand include amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, etc., which have a surface of a hydrophilic group and can be used to form a covalent bond with the peptide ligand. Those having a reactive functional group are preferable. Further, the water-insoluble carrier preferably has a large effective surface area that can be used for adsorption and is porous (porous material).
上記水不溶性担体は、粒子状、繊維状、シート状、中空糸状等の任意の公知の形状のものを用いることができる。ペプチドリガンドの保持量又は吸着材としての取扱い性を考慮すると、水不溶性担体は粒子状のものが好ましい。 As the water-insoluble carrier, any known shape such as a particle shape, a fibrous shape, a sheet shape, or a hollow thread shape can be used. Considering the retention amount of the peptide ligand or the handleability as an adsorbent, the water-insoluble carrier is preferably in the form of particles.
粒子状担体の平均粒径は、２５μ〜２５００μｍであることが好ましい。担体の比表面積と体液の流通性の面から、上記平均粒径は５０μ〜１５００μｍであることがより好ましい。 The average particle size of the particulate carrier is preferably 25 μm to 2500 μm. From the viewpoint of the specific surface area of the carrier and the flowability of the body fluid, the average particle size is more preferably 50 μm to 1500 μm.
使用できる水不溶性担体としては、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、多孔質ガラス、ビニルポリマー等の有機又は無機の多孔体が挙げられ、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料は全て用いることができる。 Examples of the water-insoluble carrier that can be used include organic or inorganic porous materials such as cellulose-based gel, dextran-based gel, agarose-based gel, polyacrylamide-based gel, porous glass, and vinyl polymer, which are used for ordinary affinity chromatography. All the materials for the carrier to be used can be used.
これらの担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア（旭化成株式会社製）及びＣＭ−セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０6、生化学工業株式会社販売）等のセルロース系担体、特公平１−０４４７２５号公報に記載の全多孔質活性化ゲル、ＣＭ−トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０6、東ソー株式会社製）等のポリビニル系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０7、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のポリアクリルアミド系担体、及び、セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０7、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のアガロース系担体等の有機質担体、並びに、ＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０8、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトローニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕等の多孔性ガラス等の無機質担体が挙げられる。 To illustrate these carriers, Asahi Kasei microcarrier (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and CM- Cellulofine (registered trademark) CH (exclusion limit protein molecular weight: about 3 × 10 6, Seikagaku Corporation sold) cellulose-based carrier, such as , the total porous activated gel described in Japanese Patent Kokoku 1-044725, CM- Toyopearl (TM) 650C (exclusion limit protein molecular weight: 5 × 10 6, manufactured by Tosoh Corporation) polyvinyl carriers such, CM- Trisacryl M (CM-Trisacryl M) [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 7, Sweden Pharmacia -LKB (Pharmacia-LKB) Co. Ltd.] polyacrylamide based carrier, such as, and, Sepharose CL-4B (SepharoseCL-4B ) [exclusion limit protein molecular weight: 2 × 10 7, Sweden Pharmacia-LKB (Pharmacia-LKB) Co. Ltd.] organic carriers agarose-based carrier such as, well, CPG-10-1000 [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 8, the average pore diameter: 100 nm, include inorganic carriers porous glass such as U.S. electroporation over Nucleonics Nix (electro-nucleonics) Co. Ltd.].
上記水不溶性担体は、体液浄化用水不溶性担体であることが好ましい。体液浄化用水不溶性担体とは、吸着材が血液等の体液に接触した場合、体液中に溶け出さない担体であって、タンパク質の非特異吸着が少ない、ブラジキニン産生能が低い、補体活性化能が低い等、血液適合性等の体液適合性が高い担体を意味する。上記体液浄化用水不溶性担体は、ポリビニルアルコールが架橋したもの（架橋化ＰＶＡ）であることが好ましい。 The water-insoluble carrier is preferably a water-insoluble carrier for purifying body fluids. A water-insoluble carrier for body fluid purification is a carrier that does not dissolve in body fluid when the adsorbent comes into contact with body fluid such as blood, and has low nonspecific adsorption of proteins, low brazikinin production ability, and complement activation ability. It means a carrier having high body fluid compatibility such as blood compatibility such as low. The water-insoluble carrier for purifying body fluids is preferably crosslinked with polyvinyl alcohol (crosslinked PVA).
水不溶性担体としては、粒子状の多孔質体が好ましく、例えば、多孔性重合体粒子を用いることができる。粒子状の多孔質体は、ペプチドリガンドを固定化できるものである。目的吸着物質であるＩｇＧ型抗体の分子量が約１５万であることから、粒子状の多孔質体の排除限界分子量（タンパク質）は、１５万〜１０００万であることが好ましい。最も好ましい排除限界分子量は１００万〜５００万である。 As the water-insoluble carrier, a particulate porous material is preferable, and for example, porous polymer particles can be used. The particulate porous body is capable of immobilizing a peptide ligand. Since the molecular weight of the IgG antibody, which is the target adsorbent, is about 150,000, the exclusion limit molecular weight (protein) of the particulate porous body is preferably 150,000 to 10 million. The most preferable exclusion limit molecular weight is 1 million to 5 million.
重合体の組成は、ポリアミド系重合体、ポリエステル系重合体、ポリウレタン系重合体及びビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとり得る公知の重合体を用いることができる。特に親水性モノマーによって親水化したビニル化合物系多孔性重合体が好ましい結果を与える。 As the composition of the polymer, known polymers capable of having a porous structure such as a polyamide-based polymer, a polyester-based polymer, a polyurethane-based polymer, and a polymer of a vinyl compound can be used. In particular, a vinyl compound-based porous polymer hydrophilized with a hydrophilic monomer gives preferable results.
ペプチドリガンドの水不溶性担体への担持方法としては、公知の担体活性化方法及び固定化法を用いることができる。例えば、担体がアミノ基又はカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、ペプチドリガンドと縮合反応させる方法、及び、担体とペプチドリガンドとをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて結合させる方法が挙げられる。また、担体が水酸基を有する場合には、例えば、臭化シアン等のハロゲン化シアンを担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基の部分で反応させる方法、及び、エピクロロヒドリン等のエポキシドを有する化合物を担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基やメルカプト基の部分で反応させる方法等が挙げられる。また、ペプチドリガンドがシステインを有する場合には、マレイミド化した担体と反応させることで固定化することが可能である。 As a method for carrying the peptide ligand on a water-insoluble carrier, known carrier activation methods and immobilization methods can be used. For example, when the carrier has an amino group or a carboxyl group, a method of causing a condensation reaction with a peptide ligand in the presence of a condensation reagent such as dicyclohexylcarbodiimide, and two or more of the carrier and the peptide ligand such as glutarualdehyde. Examples thereof include a method of binding using a compound having a functional group. When the carrier has a hydroxyl group, for example, it has a method of allowing cyanogen halide such as cyanogen bromide to act on the carrier and reacting with the amino group portion of the peptide ligand, and an epoxide such as epichlorohydrin. Examples thereof include a method in which a compound is allowed to act on a carrier and reacted with a portion of an amino group or a mercapto group of a peptide ligand. When the peptide ligand has cysteine, it can be immobilized by reacting with a maleimided carrier.
必要に応じて、水不溶性担体とペプチドリガンドとの間に任意の長さの分子（リンカー）を導入したものを吸着材として使用することもできる。リンカー分子としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアラニン鎖、ポリグリシン鎖等が挙げられる。リンカーの導入は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。 If necessary, a molecule (linker) of an arbitrary length introduced between the water-insoluble carrier and the peptide ligand can be used as an adsorbent. Examples of the linker molecule include a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, a polyalanine chain, and a polyglycine chain. The linker can be introduced using a method known to those skilled in the art.
本実施形態において、具体的には、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよし、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。また、ペプチドリガンドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。 In this embodiment, specifically, it may be immobilized on a water-insoluble carrier by the mercapto group of at least one cysteine residue contained in the peptide ligand, or at least one contained in the peptide ligand. It may be immobilized on a water-insoluble carrier by the amino group of the side chain of one lysine residue, directly or via a linker, or the side chain of at least one glutamate residue or aspartic acid residue contained in the peptide ligand. It may be immobilized on a water-insoluble carrier by the carboxyl group of the above, either directly or via a linker. It may also be immobilized on the water-insoluble carrier by the carboxyl group at the carboxy terminus of the peptide ligand, directly or via the linker, or by the amino group at the amino terminus of the peptide ligand, directly or via the linker. It may be immobilized on an insoluble carrier.
水不溶性担体に対するペプチドの固定化量は、少なすぎると吸着能力が低くなる傾向にあり、多すぎても吸着容量の増大は飽和する。よって、水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌの範囲が好ましく、より好ましくは１〜５０μｍｏｌの範囲である。なお、ペプチドの固定化量は、後述の実施例に示すとおり、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度を紫外可視分光光度計で測定し、反応前後の吸光度の差分に基づいて算出される。 If the amount of peptide immobilized on the water-insoluble carrier is too small, the adsorption capacity tends to be low, and if it is too large, the increase in adsorption capacity is saturated. Therefore, the range of 0.1 to 100 μmol is preferable, and the range of 1 to 50 μmol is more preferable, per 1 mL of the water-insoluble carrier. The amount of peptide immobilized is calculated based on the difference in absorbance before and after the reaction by measuring the absorbance of the reaction solution before and after the peptide introduction reaction with an ultraviolet-visible spectrophotometer, as shown in Examples described later.
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器内に充填保持されることによって、ＩｇＧ型抗体吸着器として使用することができる。このようなＩｇＧ型抗体吸着器としては、例えば、ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールが挙げられる。 The IgG-type antibody adsorbent of the present embodiment can be used as an IgG-type antibody adsorbent by being filled and held in a container having an inlet port for inflowing a liquid and an outlet port for discharging the liquid. Examples of such an IgG-type antibody adsorbent include an extracorporeal circulation module using an IgG-type antibody adsorbent.
図１はＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。図１に示す体外循環モジュール１は、円筒２の一端開口部に、内側にフィルター３を張ったパッキン４を介して体液を流入させる入口ポート５（導入口）を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部に内側にフィルター３’を張ったパッキン４’を介して体液を流出させる出口ポート７（導出口）を有するキャップ８をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター３及び３’の間隙にＩｇＧ型抗体吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。体外循環モジュール１は、例えば、自己抗体及び免疫複合体を除去するための体液浄化デバイスとして使用することができる。
FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an embodiment of an extracorporeal circulation module using an IgG antibody adsorbent. In the
吸着材層９には、ＩｇＧ型抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合して充填してもよい。また、ＩｇＧ型抗体吸着材と他の吸着材とが積層するように充填してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これによって吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用いる場合、５０ｍＬ〜７００ｍＬ程度が適当である。
The
体液浄化デバイスを体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つの方法は、体内から取り出した血液を遠心分離機又は膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化した後、血球成分とあわせて体内に戻す方法である。他の一つの方法は、体内から取り出した血液を直接、上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化する方法である。 When the body fluid purification device is used for extracorporeal circulation, there are roughly the following two methods. One method is to separate the blood taken out of the body into a plasma component and a blood cell component using a centrifuge or a membrane-type plasma separator, and then pass the plasma component through the body fluid purification device to purify the blood. , It is a method of returning to the body together with blood cell components. Another method is a method in which blood taken out of the body is directly passed through the body fluid purification device to purify it.
体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし、又は断続的に通液してもよい。 As a method of passing the body fluid, the fluid may be continuously passed or intermittently depending on the clinical necessity or the installation condition of the equipment.
このような、本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材を備えたＩｇＧ型抗体吸着器を、体液浄化デバイスとすることもできる。 Such an IgG-type antibody adsorbent provided with the IgG-type antibody adsorbent of the present embodiment can also be used as a body fluid purification device.
本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、ＩｇＧ型自己抗体吸着材及びＩｇＧ型自己抗体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織（移植されたものも含む）に対して産生される抗体を意味する。
また、本実施形態のＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、免疫複合体吸着材及び免疫複合体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「免疫複合体」とは、ＩｇＧ型抗体と抗原が結合した複合体を意味する。
The IgG-type antibody adsorbent and the IgG-type antibody adsorbent of the present embodiment may be used as the IgG-type autoantibody adsorbent and the IgG-type autoantibody adsorbent. As used herein, the term "autoantibody" means an antibody produced against its own cells or tissues (including transplanted ones).
Further, the IgG type antibody adsorbent and the IgG type antibody adsorbent of the present embodiment may be used as an immune complex adsorbent and an immune complex adsorbent. As used herein, the term "immune complex" means a complex in which an IgG-type antibody and an antigen are bound.
本実施の形態のＩｇＧ型抗体吸着材は、上記のとおり、装置に充填してＩｇＧ型抗体吸着作用を利用した治療器として用いられるにとどまらず、免疫グロブリン、自己抗体、免疫グロブリン誘導体、免疫グロブリン複合体等の分離用吸着剤、精製用吸着材及び、これらの測定用基材としても極めて有効に利用できる。 As described above, the IgG-type antibody adsorbent of the present embodiment is not only used as a therapeutic device that is packed in an apparatus and utilizes the IgG-type antibody adsorbing action, but also immunoglobulins, autoantibodies, immunoglobulin derivatives, and immunoglobulins. It can be extremely effectively used as an adsorbent for separation of a composite or the like, an adsorbent for purification, and a base material for measuring these.
以下、実施例によって本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present embodiment will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
［実施例１：ＩｇＧ結合性ペプチド］
〔ペプチドライブラリーの作製〕
特許文献３に記載されたＨＬＨ構造を有する非環状ペプチドに種々の改変を加えて、環状構造を有する環状ペプチドライブラリー（配列番号１に示すアミノ酸配列を有する）を作製した。なお、ここでは配列番号１に示すアミノ酸配列中のＸ１６，Ｘ１９，Ｘ２９，Ｘ３２はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌの何れかのアミノ酸となり、Ｘ１７，Ｘ２０，Ｘ３０，Ｘ３３はタンパク質を構成するとされる２０種類のアミノ酸のいずれか１種となり、Ｘ２６は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又は欠失するようにライブラリーを構成した。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドはα−ヘリックス部分のＮ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ｃ５とＱ６）と３つのアミノ酸からなるスペーサ（Ｎ２、Ｍ３、Ｑ４）を介して結合したフェニルアラニン（Ｆ１）と、α−ヘリックス部分のＣ末側にペプチドを環化するための２つのアミノ酸（Ａ４２とＣ４３（Ｘ２６が欠失している場合は４１番目のＡ及び４２番目のＣを指す））を有し、２つのシステインＣ５、Ｃ４３はジスルフィド結合している。
[Example 1: IgG-binding peptide]
[Preparation of peptide library]
Various modifications were made to the non-cyclic peptide having the HLH structure described in
（１）L-Random酵母表層ペプチドライブラリーの構築
overlap extension PCR 及び2nd PCRにより上記で設計したアミノ酸配列を有するL-Random ペプチドライブラリーをコードした遺伝子断片を作製し、制限酵素NcoI及びXho
Iで処理した。同様に処理した酵母表層提示用ベクターpYD11-BxXNとライゲーションする
ことによりL-Randomペプチドライブラリーのプラスミドを構築した。大腸菌にエレクトロポレーション法により形質転換して増幅した後、酵母細胞に酢酸リチウム法により形質転換することで9.4×106のライブラリーサイズをもつL-Random酵母表層提示ペプチドライブラリーを得た。
(1) Construction of L-Random yeast surface peptide library
Gene fragments encoding the L-Random peptide library having the amino acid sequence designed above were prepared by overlap extension PCR and 2nd PCR, and restriction enzymes NcoI and Xho were prepared.
Processed with I. A plasmid for the L-Random peptide library was constructed by ligating with the yeast surface presentation vector pYD11-BxXN treated in the same manner. Escherichia coli was transformed by the electroporation method and amplified, and then yeast cells were transformed by the lithium acetate method to obtain an L-Random yeast surface-presented peptide library having a library size of 9.4 × 10 6.
（２）human IgG-Fcに対するスクリーニング
得られたライブラリーに対してセルソーターBD FACSAria（商標名）II(BDバイオサイエンス社）を用いてhuman IgG-Fcに対する結合性スクリーニングを行った。ペプチドファイブラリーをSG/RCAA培地（で培養することでペプチドの細胞表層への提示を誘導した。PBSで洗浄した後、bio-human IgG-Fc（最終濃度100nM：Bethyl laboratory社）及びmouse anti-FLAG抗体（Sigma社）と反応させた後、SA-PE（Streptavidin-R-phycoerythrin：Invitrogen社）及びanti-mouse-Alexa488（Alexa Flour（登録商標）488 goat anti-mouse IgG（H+L）：Invitrogen社）を結合させることで蛍光ラベルした。BD FACSAria（商標名）を用いて３回ソートした。
(2) Screening for human IgG-Fc The obtained library was screened for binding to human IgG-Fc using a cell sorter BD FACSAria (trade name) II (BD Bioscience). The peptide fibrary was cultured in SG / RCAA medium (culturing in SG / RCAA medium to induce the presentation of the peptide on the cell surface. After washing with PBS, bio-human IgG-Fc (
このとき、human IgG-Fcに対する解離定数（ＫＤ）が既知であるアミノ酸配列（FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC（配列番号：５２））を有するペプチド（FK60）が提示したクローンの蛍光強度よりも高い領域（P5領域)に設定して、スクリーニングを行った。 At this time, in the region (P5 region) higher than the fluorescence intensity of the clone presented by the peptide (FK60) having the amino acid sequence (FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 52)) whose dissociation constant (KD) for human IgG-Fc is known. It was set and screened.
Round1では、1×108細胞をBulk sortモードによりソートし、全体の0.4％に設定したP5エリアに存在する細胞群1.4×105細胞を回収した。Round2ではRound1で回収した細胞を全てBurk sortモードでソートし、P5エリアを全体の9％に設定して9000細胞を回収した。さらに、Round3ではRound2で回収した細胞をsingle-cell sortモードでソートし、P5エリアを全体の13％に設定して96細胞を96 well SDプレート培地に回収した（図２）。RoundごとにP5のエリアを狭めて、蛍光強度の高い酵母細胞のみを選別した。これを30℃で2日間培養した。
In
（３）human IgG-Fc結合性クローンの活性解析
前記Round3で96well SDプレートに回収した酵母細胞96クローンをSDCAA培地で培養して増幅させた後、SG/RCAA培地で再び提示を誘導して、それぞれのbio-human IgG-Fcに対する結合活性を、蛍光プレートリーダー（Varioskan）を用いて測定した。結合活性を示すR-PE(PE-A)の相対蛍光強度（RFU）と、同時に測定したペプチドの提示量を示すAlexa-488の相対蛍光強度（RFU）との関係を図にプロットした（図３）。そのうち、R-PEの相対蛍光強度の高い約５０のクローン（図に薄い黒丸で示される）を選択して、コロニーPCRによってそれぞれのクローンが保持するペプチドをコードした遺伝子断片を増幅させた。得られた遺伝子断片を鋳型としてシーケンシング反応を行い、遺伝子断片のDNA配列を解析することで、提示するクローンが保持するペプチドのアミノ酸配列を決定した。決定した配列（配列番号：２〜５１）を以下に示す。
FNMQCQAEFYEILHEMRAMKGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：２）
FNMQCQAEFYEILHELKAFNGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：３）
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKISALHAKIAALRDAC（配列番号：４）
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：５）
FNMQCQAEFYEILHEMRAIGGGGGGGKLQAMNAKIAALRDAC（配列番号：６）
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKIHALNAKIAALRDAC（配列番号：７）
FNMQCQAEFYEILHELRAVEGGGGGGGKLAALNAKIAALRDAC（配列番号：８）
FNMQCQAEFYEILHEIRAVGGGGGGGGKMRALNAKIAALRDAC（配列番号：９）
FNMQCQAEFYEILHEIRAVRGGGGGGGKIIAMNAKIAALRDAC（配列番号：１０）
FNMQCQAEFYEILHEMKAMSGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC（配列番号：１１）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKITAFDAKIAALRDAC（配列番号：１２）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVAGGGGGGGKIIALDAKIAALRDAC（配列番号：１３）
FNMQCQAEFYEILHELRAVVGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：１４）
FNMQCQAEFYEILHEIRALGGGGGGGGKLQAFNAKIAALRDAC（配列番号：１５）
FNMQCQAEFYEILHEIKAVRGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC（配列番号：１６）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC（配列番号：１７）
FNMQCQAEFYEILHELKALQGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：１８）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVTALHAKIAALRDAC（配列番号：１９）
FNMQCQAEFYEILHEMRAIRGGGGGGGKLQALNAKIAALRDAC（配列番号：２０）
FNMQCQAEFYEILHEMRALEGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：２１）
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC（配列番号：２２）
FNMQCQAEFYEILHEIKAVHGGGGGGGKLTALNAKIAALRDAC（配列番号：２３）
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKVKALNAKIAALRDAC（配列番号：２４）
FNMQCQAEFYEILHEMKALKGGGGGGGKFSALNAKIAALRDAC（配列番号：２５）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVRGGGGGGGKLPALDAKIAALRDAC（配列番号：２６）
FNMQCQAEFYEILHEFKAVYGGGGGGGKLKALNAKIAALRDAC（配列番号：２７）
FNMQCQAEFYEILHELRAMGGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC（配列番号：２８）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGEGKLKALGAKIAALRDAC（配列番号：２９）
FNMQCQAEFYEILHEMRALSGGGGGGGKLNALNAKIAALRDAC（配列番号：３０）
FNMQCQAEFYEILHELKAMGGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC（配列番号：３１）
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：３２）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC（配列番号：３３）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVDGGGGGGGKMQALAAKIAALRDAC（配列番号：３４）
FNMQCQAEFYEILHELYAVQGGGGGGGKIVAINAKIAALRDAC（配列番号：３５）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC（配列番号：３６）
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGGGKMPALDAKIAALRDAC（配列番号：３７）
FNMQCQAEFYEILHEMRALRGGGGGGGKMQALNAKIAALRDAC（配列番号：３８）
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKINALTAKIAALRDAC（配列番号：３９）
FNMQCQAEFYEILHELKAVSGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：４０）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKMSALAAKIAALRDAC（配列番号：４１）
FNMQCQAEFYEILHELQAVLGGGGGGGKVLALNAKIAALRDAC（配列番号：４２）
FNMQCQAEFYEILHELRAVAGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC（配列番号：４３）
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVDAFNAKIAALRDAC（配列番号：４４）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVLALHAKIAALRDAC（配列番号：４５）
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC（配列番号：４６）
FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC（配列番号：４７）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC（配列番号：４８）
FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC（配列番号：４９）
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC（配列番号：５０）
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC（配列番号：５１）
(3) Activity analysis of human IgG-Fc-binding clones The 96 yeast cell clones collected on the 96-well SD plate in
FNMQCQAEFYEILHEMRAMKGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 2)
FNMQCQAEFYEILHELKAFNGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 3)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKISALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 4)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 5)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIGGGGGGGKLQAMNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 6)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKIHALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 7)
FNMQCQAEFYEILHELRAVEGGGGGGGKLAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 8)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVGGGGGGGGKMRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 9)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVRGGGGGGGKIIAMNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 10)
FNMQCQAEFYEILHEMKAMSGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 11)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKITAFDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 12)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVAGGGGGGGKIIALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 13)
FNMQCQAEFYEILHELRAVVGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 14)
FNMQCQAEFYEILHEIRALGGGGGGGGKLQAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 15)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVRGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 16)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 17)
FNMQCQAEFYEILHELKALQGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 18)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVTALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 19)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIRGGGGGGGKLQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 20)
FNMQCQAEFYEILHEMRALEGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 21)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 22)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVHGGGGGGGKLTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 23)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKVKALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 24)
FNMQCQAEFYEILHEMKALKGGGGGGGKFSALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 25)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVRGGGGGGGGGKLPALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 26)
FNMQCQAEFYEILHEFKAVYGGGGGGGKLKALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 27)
FNMQCQAEFYEILHELRAMGGGGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 28)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGEGKLKALGAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 29)
FNMQCQAEFYEILHEMRALSGGGGGGGKLNALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 30)
FNMQCQAEFYEILHELKAMGGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 31)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 32)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 33)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVDGGGGGGGKMQALAAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 34)
FNMQCQAEFYEILHELYAVQGGGGGGGKIVAINAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 35)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 36)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGGGGKMPALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 37)
FNMQCQAEFYEILHEMRALRGGGGGGGGGKMQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 38)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKINALTAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 39)
FNMQCQAEFYEILHELKAVSGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 40)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKMSALAAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 41)
FNMQCQAEFYEILHELQAVLGGGGGGGKVLALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 42)
FNMQCQAEFYEILHELRAVAGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 43)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVDAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 44)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGGGKVLALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 45)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 46)
FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 47)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 48)
FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 49)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 50)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 51)
（４）human IgG-Fc結合性ペプチドの結合性（解離定数の算出）
アミノ酸配列を決定したhuman IgG-Fc結合性ペプチドのうちランダムに５個（ＦＫ６０１４、ＦＫ６０３２、ＦＫ６０５３、ＦＫ６０６３、ＦＫ６０６５）を選択し、アミドレジンを用いて0.023μmolスケールでFmoc固相合成法によりそれぞれを化学合成し、SPR法を用いてhuman IgG-Fcに対する結合活性測定を行った。なお、ＦＫ６０１４、ＦＫ６０３２、ＦＫ６０５３、ＦＫ６０６３、ＦＫ６０６５はそれぞれ、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１で示される配列を有する。
(4) Binding property of human IgG-Fc binding peptide (calculation of dissociation constant)
Five randomly selected human IgG-Fc-binding peptides (FK6014, FK6032, FK6053, FK6063, FK6065) whose amino acid sequences were determined were selected and each was chemically synthesized by the Fmoc solid-phase synthesis method on a 0.023 μmol scale using amid resin. The cells were synthesized and the binding activity to human IgG-Fc was measured using the SPR method. In addition, FK6014, FK6032, FK6053, FK6063, and FK6065 have the sequences shown by SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, and SEQ ID NO: 51, respectively.
100mgのFmoc-PAL-PEG-PS（商標名）アミドレジン（置換率：0.2 mmol/g）をリアクションベッセル量り取り、ペプチド自動合成機PSSM-8（SHIMAZU社）のプロトコルに従ってそれぞれのFmocアミノ酸（10equiv.）を、HCTU（10equiv）、DIEA（20equiv）、30%ピペリジン、5%無水酢酸を調製して、各ペプチドを化学合成した。終了後、レジンをジエチルエーテルで洗浄し乾燥させ、クリベージ溶液（TFA：EMS：Anisole：EDT＝93：3：3：1）を2mL添加して、室温で4時間反応させた。クリベージ溶液をろ過したのち、氷冷したジエチルエーテルを過剰量添加することでペプチドを析出させた。氷上で10分間静置し、6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を捨てた。回収した沈殿物に再び氷冷したジエチルエーテルを加えて激しく撹拌させた後、氷上で10分間静置して6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を除去することで沈殿物を洗浄した。この洗浄行為を2回繰り返した。沈殿物を減圧下で乾燥させたのち、2 mLの滅菌水に溶解し、0.22 mmのフィルターでろ過してペプチド溶液（非環状ペプチド）を得た。ペプチド溶液をRP-HPLCで精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。 Weigh 100 mg of Fmoc-PAL-PEG-PS (trade name) amidoresin (substitution rate: 0.2 mmol / g) by reaction vessel, and follow the protocol of the peptide automatic synthesizer PSSM-8 (SHIMAZU) for each Fmoc amino acid (10equiv. ), HCTU (10equiv), DIEA (20equiv), 30% piperidine, and 5% anhydrous acetic acid were prepared, and each peptide was chemically synthesized. After completion, the resin was washed with diethyl ether, dried, 2 mL of Crivage solution (TFA: EMS: Anisole: EDT = 93: 3: 3: 1) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours. After filtering the Crivage solution, an excess amount of ice-cooled diethyl ether was added to precipitate the peptide. The mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes, centrifuged at 6500 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was discarded. After adding ice-cooled diethyl ether to the recovered precipitate and stirring vigorously, the precipitate was washed by allowing it to stand on ice for 10 minutes and centrifuging at 6500 rpm for 10 minutes at 4 ° C to remove the supernatant. did. This cleaning action was repeated twice. The precipitate was dried under reduced pressure, dissolved in 2 mL of sterile water, and filtered through a 0.22 mm filter to obtain a peptide solution (acyclic peptide). When the peptide solution was purified by RP-HPLC and mass spectrometrically analyzed by MALDI-TOF-MS, it was confirmed that the target peptide was synthesized by obtaining the measured values almost as calculated.
その後、滅菌水で溶解したペプチド溶液を30mM Tris-HCl（pH8.5）に常温で一晩かけて滴下しながら撹拌することで酸化反応させ、分子内ジスルフィド架橋を施した。反応溶液をRP-HPLCを用いて上記と同様の条件で精製した。MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。 Then, the peptide solution dissolved in sterilized water was added dropwise to 30 mM Tris-HCl (pH 8.5) at room temperature overnight while stirring to cause an oxidation reaction, and intramolecular disulfide cross-linking was performed. The reaction solution was purified by RP-HPLC under the same conditions as above. When mass spectrometry was performed by MALDI-TOF-MS, it was confirmed that the target peptide was synthesized by obtaining the measured values almost as calculated.
得られた５つの環状ペプチドについて、Biacore T200（GEヘルスケア社）とThiol coupling kit（GE ヘルスケア社）を用いて各濃度における結合活性を測定した。全ての工程において、ランニングバッファーはHBS-EP+を用いた。Serise S CM5 センサーチップに、human IgG-Fcの固定化用としてフローセル2を用いて、流速10μL/min、25℃の条件で行った。予備試験によりhuman IgG-Fcの固定化に最適なpHを決定した後、フローセル2に前記キット中のEDCとNHSを混合した液（容量比で1：1）を調製し、7分間センサーチップに流すことでカルボキシル基を活性化させた。5 mg/mL human IgG-Fcを10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で調製し、活性化させたフローセル2に7分間流すことでhumanIgG-Fcを固定化した。固定化量は2000RUであった。未反応の活性化されたカルボキシル基はエタノールアミンを7分間流すことによって、全て不活性化した。フローセル1をEDC及びNHSによる活性化とエタノールアミンによるブロッキングを施すことでリファレンスセルとして使用した。各ペプチドをHBS-EP+バッファーで0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μMに段階希釈し，流速30μL/min.でそれぞれの結合活性を測定した。測定結果は、BIA evaluation 4.1ソフトウェアで、平衡値解析により解離定数（KD）を算出した。その結果を表１に示した。
The binding activity of the obtained five cyclic peptides was measured at each concentration using Biacore T200 (GE Healthcare) and Thiol coupling kit (GE Healthcare). HBS-EP + was used as the running buffer in all steps. A
５つのペプチドはどれも非常に高い結合活性（FK6014：ＫD＝９nM、FK6032：ＫD＝８nM、FK6053：ＫD＝５nM、FK6063：ＫD＝１２nM、FK6065：ＫD＝８nM）を示した。比較対照としたペプチドFK60（ＫD＝２１μM＝２１０００nM）に比べて1000倍以上結合活性が向上した。 Five peptides Any very high avidity (FK6014: K D = 9nM, FK6032: K D = 8nM, FK6053: K D = 5nM, FK6063: K D = 12nM, FK6065: K D = 8nM) showed .. Comparison with peptide FK60 (K D = 21μM = 21000nM ) in comparison with 1000-fold higher binding activity was improved.
（５）ＣＤスペクトルの測定
各ペプチドのCDスペクトルを測定した。ペプチドを20mM Phosphate buffer（pH7.4）に最終濃度20mMとなるように調製し、円二色性分散計J-720（JASCO社）、温度コントローラー Peltier PTC-423L（TOMY SEIKO)を用いて、20℃の温度における190nmから260nmの波長でのCDスペクトルを0.2nm間隔で測定した。その結果を図４に示す。それぞれのペプチドは208nm及び222nmに明瞭な負の極大を有しており、安定なα−ヘリックス構造を保持していることがわかった。α−ヘリックスの内側の適切な位置に疎水性アミノ酸が配置されるようデザインしたことにより、α−ヘリックス構造の形成に必要な両親媒性を獲得し、安定な立体構造を形成しているものと推測される。
(5) Measurement of CD spectrum The CD spectrum of each peptide was measured. Peptides were prepared in a 20 mM Phosphate buffer (pH 7.4) to a final concentration of 20 mM, and 20 using a circular dichroism dispersometer J-720 (JASCO) and a temperature controller Peltier PTC-423L (TOMY SEIKO). CD spectra at wavelengths from 190 nm to 260 nm at a temperature of ° C were measured at 0.2 nm intervals. The result is shown in FIG. It was found that each peptide had a clear negative maximum at 208 nm and 222 nm and retained a stable α-helix structure. By designing the hydrophobic amino acids to be placed at appropriate positions inside the α-helix, the amphipathic properties required for the formation of the α-helix structure are acquired, and a stable three-dimensional structure is formed. Guessed.
［実施例２：ＩｇＧ結合性ペプチドを固定化した吸着材］
（１）ペプチド固定化担体の作製
ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍＬ／ｍＬ以上）１８ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）１８０ｍＬに投入し、そこに、エピクロロヒドリン（和光純薬工業株式会社製）１３７ｍＬ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）の水溶液（２１ｇ／３１．５ｍＬ）及び水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）８８ｍｇを添加し、３０℃で５時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、エポキシ基を導入した球状多孔質体をメタノール（キシダ化学株式会社製）で洗浄し、その後、純水で洗浄してエポキシ活性化担体を得た。得られた担体は、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬと、活性化担体１ｍＬに１％フェノールフタレインエタノール溶液（和光純薬工業株式会社製）２滴を滴下し、８０℃で赤色の呈色が確認されなくなるまで０．１Ｍの塩酸（和光純薬工業株式会社製）を加え、「活性化量（単位樹脂量あたりのエポキシ基の量）＝塩酸濃度×塩酸滴定量／樹脂量」の式によって導入されたエポキシ基の量を求め、１１０μｍｏｌ／ｍＬ以上であることを確認した。
[Example 2: Adsorbent on which an IgG-binding peptide is immobilized]
(1) Preparation of peptide-immobilized carrier Spherical porous body made of polyvinyl acetate (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.,
次に、エポキシ化担体を３０ｍＬ秤量し、アンモニア水（濃度：２８−３０％、関東化学株式会社）を４５ｍＬ加え、４０℃で９０分間反応させることで、エポキシ基をアミノ基に変換した。得られたアミノ化担体は元素分析によって、定量的にエポキシ基からアミノ基となっていることを確認した。 Next, 30 mL of the epoxidized carrier was weighed, 45 mL of aqueous ammonia (concentration: 28-30%, Kanto Chemical Co., Inc.) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 90 minutes to convert the epoxidized group into an amino group. It was confirmed by elemental analysis that the obtained amination carrier was quantitatively changed from an epoxy group to an amino group.
次に、アミノ化担体を５ｍＬ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬株式会社製）で膨潤させた後、１０ｍＭのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液１０ｍＬを加え、３０℃で３時間反応させた。反応後、ＤＭＳＯで洗浄し、その後純水で洗浄することで、マレイミド化担体を得た。 Next, 5 mL of the amination carrier was weighed, swollen with dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then 10 mM Succinidiyl-[(N-maleimidopropionamido) -diethyleneglycol] ester (US Thermo Fisher Scientific). 10 mL of DMSO solution (manufactured by the company) was added, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 3 hours. After the reaction, the product was washed with DMSO and then with pure water to obtain a maleimided carrier.
得られたマレイミド化担体を２ｍＬ秤量し、０．８ｍＭのペプチド（配列番号４９のアミノ酸配列からなるペプチドについて、実施例１（４）に記載の方法で５番目のシステイン残基と４３番目のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成しており、Ｎ末端にリンカーとしてグリシン５残基を介してシステインを付与したペプチド）ＰＢＳ溶液５ｍＬを加えた。その後、３７℃で１７時間反応させることで、ペプチド中のメルカプト基と担体中のマレイミド基を共有結合させた。反応後、純水で洗浄することで、ペプチド固定化担体を得た。ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。 2 mL of the obtained maleimidated carrier was weighed, and a 0.8 mM peptide (for a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, the 5th cysteine residue and the 43rd cysteine by the method described in Example 1 (4)) was used. A peptide having a disulfide bond formed between the residue and cysteine being added to the N-terminal via glycine 5 residue as a linker) 5 mL of PBS solution was added. Then, by reacting at 37 ° C. for 17 hours, the mercapto group in the peptide and the maleimide group in the carrier were covalently bonded. After the reaction, the peptide was washed with pure water to obtain a peptide-immobilized carrier. The amount of peptide immobilized was calculated based on the difference in absorbance obtained by measuring the absorbance (280 nm) of the reaction solution before and after the peptide introduction reaction with an ultraviolet-visible spectrophotometer.
（２）血漿タンパク質吸着試験
健常人から採取したＣＰＤ加血液（Ｃｉｔｒａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ加血液）を遠心分離にて血漿分離し、健常人ヒト血漿を得た。次に得られたペプチド固定化担体を０．５ｍＬ秤量し、その６倍容の健常人ヒト血漿を加え、３７℃で１７．５間分振とうさせた。振とう後、遠心分離にてペプチド固定化担体を除き、上澄み血漿中に含まれる血漿タンパク質（ＩｇＧ、フィブリノーゲン（Ｆｂｇ）、アルブミン（Ａｌｂ））を測定することで、ペプチド固定化担体への吸着率を算出した。ＩｇＧについては免疫比濁法、Ｆｂｇについては凝固時間測定法、Ａｌｂについてはネフェロメトリーをそれぞれ用いて、公知の手法により定量した。
(2) Plasma protein adsorption test CPD-added blood (Cirate Phosphate-Dextrose-added blood) collected from a healthy person was separated by centrifugation to obtain healthy human plasma. Next, 0.5 mL of the obtained peptide-immobilized carrier was weighed, 6 times the volume of healthy human plasma was added, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 17.5. After shaking, the peptide-immobilized carrier is removed by centrifugation, and the plasma proteins (IgG, fibrinogen (Fbg), albumin (Alb)) contained in the supernatant plasma are measured to obtain the adsorption rate on the peptide-immobilized carrier. Was calculated. IgG was quantified by an immunoturbidimetric method, Fbg was quantified by a coagulation time measurement method, and Alb was quantified by a known method using neferometry.
［比較例１：トリプトファンを固定化した吸着材］
実施例２（１）で作製したエポキシ化担体を１０ｍＬ秤量し、４６ｍＭのトリプトファン（和光純薬工業株式会社製）炭酸緩衝溶液２０ｍＬを加え、５０℃で１６時間反応させることで、トリプトファンを担体に共有結合させた。反応後、純水で洗浄することでトリプトファン固定化担体を得た。トリプトファンの固定化量は、トリプトファン導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。このトリプトファン固定化担体を用いて、実施例２（２）と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
[Comparative Example 1: Adsorbent with immobilized tryptophan]
Weigh 10 mL of the epoxidized carrier prepared in Example 2 (1), add 20 mL of 46 mM tryptophan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) carbonate buffer solution, and react at 50 ° C. for 16 hours to use tryptophan as the carrier. Covalently combined. After the reaction, the tryptophan-immobilized carrier was obtained by washing with pure water. The amount of tryptophan immobilized was calculated based on the difference in absorbance obtained by measuring the absorbance (280 nm) of the reaction solution before and after the tryptophan introduction reaction with an ultraviolet-visible spectrophotometer. Using this tryptophan-immobilized carrier, a plasma protein adsorption test was carried out using healthy human plasma in the same manner as in Example 2 (2).
［比較例２：アミノ酸及びペプチドを固定化しないアミノ化吸着材］
実施例２（１）で作製したアミノ化担体を用いて、実施例２（２）と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
[Comparative Example 2: Amino Acid Adsorbent that Does Not Immobilize Amino Acids and Peptides]
Using the amination carrier prepared in Example 2 (1), a plasma protein adsorption test was carried out using healthy human plasma in the same manner as in Example 2 (2).
実施例２、並びに、比較例１及び２の結果を表２及び図５に示す。
表１に示すように、ペプチド固定化担体を用いた実施例２は、リガンド固定化量がトリプトファンの１０分の１以下であるにもかかわらず、高いＩｇＧ吸着率を示した。また、トリプトファン固定化担体と比較して、他の血漿タンパク質成分を吸着することなく、ＩｇＧを極めて選択的に吸着することも示された。 As shown in Table 1, Example 2 using the peptide-immobilized carrier showed a high IgG adsorption rate even though the amount of ligand immobilization was 1/10 or less of that of tryptophan. It was also shown to highly selectively adsorb IgG without adsorbing other plasma protein components as compared to tryptophan-immobilized carriers.
本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、例えば、医療産業及び製薬業等で利用可能である。特に、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能であることから、自己免疫疾患の治療に有用である。また、ＩｇＧ型抗体等の分離精製、測定等においても有用である。 The IgG-type antibody adsorbent of the present invention can be used in, for example, the medical industry and the pharmaceutical industry. In particular, since it is possible to highly selectively adsorb autoantibodies and immune complexes, which are considered to be pathogens of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and myasthenia gravis, with a high adsorption capacity. , Useful for the treatment of autoimmune diseases. It is also useful in the separation and purification of IgG-type antibodies and the like, and in measurement and the like.
１…体液浄化デバイス（体外循環モジュール）、２…円筒、３、３’…フィルター、４、４’…パッキン、５…入口ポート（体液導入口）、６…キャップ、７…出口ポート（体液導出口）、８…キャップ、９…ＩｇＧ型抗体吸着材。 1 ... Body fluid purification device (extracorporeal circulation module), 2 ... Cylindrical, 3, 3'... Filter, 4, 4'... Packing, 5 ... Inlet port (body fluid inlet), 6 ... Cap, 7 ... Outlet port (body fluid conduction) Exit), 8 ... cap, 9 ... IgG type antibody adsorbent.
Claims (10)
配列番号２〜５１のいずれかのアミノ酸配列；又は
配列番号２〜５１のいずれかのアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；
を有する、ＩｇＧ型抗体吸着材。 A water-insoluble carrier, the water-insoluble carrier carried on the peptide and the including, a immunoglobulin G (IgG) antibody adsorbent, wherein the peptide:
Amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2-51 ; or
In any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2-51, the amino acid sequence in which the cysteine at the 5th N-terminal and / or the cysteine at the C-terminal is replaced with an arbitrary amino acid;
The a, I g G antibodies adsorbent.
配列番号４７〜５１のいずれかのアミノ酸配列；又は
配列番号４７〜５１のいずれかのアミノ酸配列中、Ｎ末端から５番目のシステイン及び／又はＣ末端のシステインが任意のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；
を有する、ＩｇＧ型抗体吸着材。 A water-insoluble carrier, the water-insoluble carrier carried on the peptide and the including, a immunoglobulin G (IgG) antibody adsorbent, wherein the peptide:
Amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 47-51 ; or
In the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 47 to 51, the amino acid sequence in which the cysteine at the 5th N-terminal and / or the cysteine at the C-terminal is replaced with an arbitrary amino acid;
The a, I g G antibodies adsorbent.
前記容器に充填された請求項１〜８のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、
を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。 A container having an inlet port for allowing a liquid to flow in and an outlet port for allowing the liquid to flow out.
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of claims 1 to 8 filled in the container.
An IgG antibody adsorber comprising.
前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。 A body fluid purification device including the IgG-type antibody adsorbent according to claim 9.
A body fluid purification device in which the liquid flowing into the IgG antibody adsorber is a body fluid selected from the group consisting of blood, plasma and serum.
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