JP2017165656A - Igg-type antibody adsorbent carrying peptide having affinity for immunoglobulin g - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は免疫グロブリンG(IgG)に対する親和性を有するペプチドを担持したIgG型抗体吸着材に関する。 The present invention relates to an IgG type antibody adsorbent carrying a peptide having affinity for immunoglobulin G (IgG).
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、及び臨床検査学の飛躍的な進歩によって、疾患の原因又は疾患の進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、血液中に存在するIgGを本体とする自己抗体及び免疫複合体は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の原因及び病態の進行と密接な関係を持っていると考えられている。 Recent advances in medicine, especially internal medicine, hematology, immunology, and clinical laboratory science, have revealed malignant substances in blood that are thought to be closely related to the cause of the disease or the progression of the disease. It is becoming. For example, autoantibodies and immune complexes mainly composed of IgG present in blood are the cause of autoimmune diseases related to biological immune functions such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, myasthenia gravis, and progression of pathological conditions. It is considered to have a close relationship.
そこで、血液及び血漿等の体液成分から、上記自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着除去することで、上述の疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめ、更には疾患の治癒を早めることが期待されている。体液中の自己抗体及び免疫複合体を除去する技術としては、全血を血球成分と血漿成分とに分離し、血漿中に含まれる上記自己抗体及び免疫複合体を吸着材によって吸着し、除去する方法がある。 Therefore, by specifically adsorbing and removing the autoantibodies and immune complexes from body fluid components such as blood and plasma, the progression of the above-mentioned diseases can be prevented, the symptoms of the diseases can be reduced, and further the healing of the diseases can be achieved. It is expected to be accelerated. As a technique for removing autoantibodies and immune complexes in body fluids, whole blood is separated into blood cell components and plasma components, and the autoantibodies and immune complexes contained in plasma are adsorbed by an adsorbent and removed. There is a way.
従来、このような目的に使用する吸着材としては、水不溶性担体にリガンドとして疎水性アミノ酸であるトリプトファンを固定化した吸着材が知られている(例えば特許文献1)。さらにIgG型抗体と特異的に相互作用することが知られているプロテインA及び抗ヒト免疫グロブリン抗体等の生物由来のIgG型抗体結合性物質、所謂、生物学的リガンドを、水不溶性担体に固定化した吸着材が知られている(例えば非特許文献1)。例えば、生物学的リガンドの一例であるプロテインAをシリカマトリックスに結合させた、IgG及びIgG複合体除去のための免疫吸着材が知られている(例えば特許文献2)。 Conventionally, as an adsorbent used for such a purpose, an adsorbent in which tryptophan, which is a hydrophobic amino acid, is immobilized as a ligand on a water-insoluble carrier is known (for example, Patent Document 1). Furthermore, biologically derived IgG-type antibody binding substances such as protein A and anti-human immunoglobulin antibodies known to specifically interact with IgG-type antibodies, so-called biological ligands, are immobilized on a water-insoluble carrier. Absorbed adsorbents are known (for example, Non-Patent Document 1). For example, an immunoadsorbent for removing IgG and IgG complex, in which protein A, which is an example of a biological ligand, is bound to a silica matrix is known (for example, Patent Document 2).
トリプトファンをリガンドとして水不溶性担体に固定化させた吸着材は、治療効果が認められる一方で、IgG型抗体を吸着する容量が十分に大きいとはいえない。さらに、上記吸着材は病因物質ではないフィブリノーゲン(Fbg)も吸着除去し、選択吸着性が悪いという欠点がある。 While an adsorbent in which tryptophan is immobilized as a ligand on a water-insoluble carrier has a therapeutic effect, it cannot be said that the capacity for adsorbing IgG-type antibodies is sufficiently large. Furthermore, the adsorbent has the disadvantage that it also removes fibrinogen (Fbg), which is not a pathogenic substance, and has poor selective adsorption.
一方で、生物学的リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、トリプトファンをリガンドとした吸着材が有する上述のような問題を解決可能であると考えられる。しかしながら、これらの生物学的リガンドは一般的に原料の確保が困難で製品コストがかかるという不利な点がある。さらに、上記吸着材を体液に接触させて使用する際、上記生物学的リガンドが体液中に溶出して重大な副作用を生じる危険がある。加えて、上記生物学的リガンドの製造工程で混入する可能性がある未知のウィルス又は病原菌に由来する感染のリスクがあるといった難点も含んでいる。 On the other hand, an adsorbent in which a biological ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is considered to be able to solve the above-described problems of an adsorbent having tryptophan as a ligand. However, these biological ligands generally have the disadvantage that it is difficult to secure raw materials and the product cost is high. Furthermore, when the adsorbent is used in contact with body fluids, there is a risk that the biological ligand will elute into the body fluids and cause serious side effects. In addition, there is a drawback that there is a risk of infection from unknown viruses or pathogens that may be introduced in the manufacturing process of the biological ligand.
これまで、本発明者らはヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有し、標的のタンパク質と高い親和性で相互作用するペプチドを見出している。このようなペプチドとして、特許文献3には、IgG型抗体と相互作用するペプチド及びこのペプチドを担持したIgG型抗体吸着材が開示されている。 So far, the present inventors have found a peptide having a helix, loop, helix structure and interacting with a target protein with high affinity. As such a peptide, Patent Document 3 discloses a peptide that interacts with an IgG type antibody and an IgG type antibody adsorbent carrying the peptide.
しかしながら、IgG型抗体とさらに親和性の高いIgG型抗体吸着材が求められている。 However, there is a need for an IgG type antibody adsorbent that has a higher affinity for IgG type antibodies.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、IgG型抗体と高い親和性で相互作用するペプチドを担持したIgG型抗体吸着材、その吸着材を充填したIgG型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイスを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, an IgG type antibody adsorbent carrying a peptide that interacts with an IgG type antibody with high affinity, an IgG type antibody adsorber filled with the adsorbent, and its It is an object to provide a body fluid purification device including an adsorber.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、IgG型抗体と選択的に結合することを見出した。さらに、本発明者らは、上記ペプチドをIgG型抗体を結合させるためのリガンドとし、上記リガンドを水不溶性担体に固定化させた吸着材が、体液を浄化させるための治療器(体液浄化用治療器、体液浄化デバイス)として、血液、血漿及び血清等の体液中から、自己抗体及び免疫複合体を構成するIgG型抗体を驚くほど高い吸着容量かつ、高選択的に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a peptide having a specific amino acid sequence selectively binds to an IgG type antibody. Furthermore, the present inventors use a therapeutic device (treatment for body fluid purification) in which an adsorbent in which the peptide is used as a ligand for binding an IgG antibody and the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier purifies body fluid. As a blood vessel, body fluid purification device), and found that IgG antibodies constituting autoantibodies and immune complexes are adsorbed with surprisingly high adsorption capacity and high selectivity from body fluids such as blood, plasma and serum. The invention has been completed.
すなわち、本発明は以下に関する。
[1]
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが下記配列番号1のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンG(IgG)型抗体吸着材:
FNMQCQAEFYEILHEX16X17AX19X20GGGGX26GGKX29X30AX32X33AKIAALRDAC (配列番号:1)
(配列番号1中、
X16は、L、M、I又はFであり、
X17は、R、K、Y又はQであり、
X19は、V、L、M、F又はIであり、
X20は、任意のアミノ酸であり、
X26は、G、E又は欠失しており、
X29は、I、L、V、M又はFであり、
X30は、任意のアミノ酸であり、
X32は、L、F、M又はIであり、
X33は、N、D、H、A、T又はGである)。
[2]
配列番号1中、
X16が、L又はMであり、
X17が、R又はKであり、
X19が、V、L又はMであり、
X29が、I、L、V又はMであり、
X32が、L又はFであり、
X33が、N、D、H、A又はTである、[1]に記載のIgG型抗体吸着材。
[3]
配列番号1中、
X16が、L又はMであり、
X17が、R又はKであり、
X19が、Vであり、
X20が、G、Q、R又はAであり、
X26が、Gであり、
X29が、I、L又はVであり、
X30が、A、T、Q、E又はSであり、
X32が、L又はFであり、
X33が、Nである、[1]又は[2]に記載のIgG型抗体吸着材。
[4]
前記ペプチドのIgGに対する解離定数が3000nM以下である、[1]〜[3]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[5]
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号2〜51のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンG(IgG)型抗体吸着材。
[6]
水不溶性担体と、前記水不溶性担体に担持されたペプチドとを含み、前記ペプチドが配列番号47〜51のいずれかのアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンG(IgG)型抗体吸着材。
[7]
前記ペプチドがヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有する、[1]〜[6]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[8]
前記アミノ酸配列中、N末端から5番目のシステインと、同アミノ酸配列中のC末端のシステインがジスルフィド結合した、[1]〜[7]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[9]
前記アミノ酸配列中、N末端から5番目のシステイン及び/又はC末端のシステインが任意のアミノ酸で置換された、[1]〜[7]のいずれか一項に記載のIgG型抗体吸着材。
[10]
前記アミノ酸配列中、N末端から5番目のシステイン及び/又はC末端のシステインがQで置換された、[1]〜[7]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[11]
前記ペプチドがリンカーを介して前記水不溶性担体に担持された、[1]〜[10]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[12]
前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であり、15万〜1000万の排除限界分子量を有する、[1]〜[11]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材。
[13]
液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
前記容器に充填された[1]〜[12]のいずれかに記載のIgG型抗体吸着材と、
を備えるIgG型抗体吸着器。
[14]
[13]に記載のIgG型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
前記IgG型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。
That is, the present invention relates to the following.
[1]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent comprising a water-insoluble carrier and a peptide carried on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below:
FNMQCQAEFYEILHEX 16 X 17 AX 19 X 20 GGGGX 26 GGKX 29 X 30 AX 32 X 33 AKIAALRDAC (SEQ ID NO: 1)
(In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L, M, I or F;
X 17 is R, K, Y or Q;
X 19 is V, L, M, F or I;
X 20 is any amino acid,
X 26 is G, E or deleted;
X 29 is I, L, V, M or F;
X 30 is any amino acid,
X 32 is L, F, M or I;
X 33 is N, D, H, A, T or G).
[2]
In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M;
X 17 is R or K;
X 19 is V, L or M;
X 29 is I, L, V or M;
X 32 is L or F;
The IgG type antibody adsorbent according to [1], wherein X 33 is N, D, H, A, or T.
[3]
In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M;
X 17 is R or K;
X 19 is V,
X 20 is G, Q, R or A;
X 26 is G,
X 29 is I, L or V;
X 30 is A, T, Q, E or S;
X 32 is L or F;
The IgG type antibody adsorbent according to [1] or [2], wherein X 33 is N.
[4]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [3], wherein the peptide has a dissociation constant for IgG of 3000 nM or less.
[5]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent comprising a water-insoluble carrier and a peptide carried on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2 to 51.
[6]
An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent comprising a water-insoluble carrier and a peptide carried on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 47 to 51.
[7]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [6], wherein the peptide has a helix-loop-helix structure.
[8]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein the fifth cysteine from the N-terminal in the amino acid sequence and the C-terminal cysteine in the amino acid sequence are disulfide bonded.
[9]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein in the amino acid sequence, the fifth cysteine from the N-terminus and / or the cysteine at the C-terminus is substituted with any amino acid.
[10]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [7], wherein in the amino acid sequence, the fifth cysteine from the N-terminus and / or the cysteine at the C-terminus is substituted with Q.
[11]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [10], wherein the peptide is supported on the water-insoluble carrier via a linker.
[12]
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [11], wherein the water-insoluble carrier is a particulate porous body and has an exclusion limit molecular weight of 150,000 to 10 million.
[13]
A container having an inlet port through which a liquid flows and an outlet port through which the liquid flows out;
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of [1] to [12] filled in the container;
An IgG type antibody adsorber comprising:
[14]
A body fluid purification device comprising the IgG antibody adsorber according to [13],
A body fluid purification device, wherein the liquid flowing into the IgG type antibody adsorber is a body fluid selected from the group consisting of blood, plasma and serum.
本発明のIgG型抗体吸着材は、IgGと高い親和性を有するペプチドを担持したIgG型抗体吸着材であり、IgG型抗体を高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能である。 The IgG type antibody adsorbent of the present invention is an IgG type antibody adsorbent carrying a peptide having a high affinity with IgG, and is capable of adsorbing IgG type antibodies with high adsorption capacity and high selectivity.
さらに、上記ペプチドは体液中でも安定であるため、本発明のIgG型抗体吸着材は、血漿及び血清等の体液から高い吸着容量かつ、高い選択性でIgG型抗体を吸着させることが可能である。 Furthermore, since the peptide is stable even in body fluids, the IgG type antibody adsorbent of the present invention can adsorb IgG type antibodies from body fluids such as plasma and serum with high adsorption capacity and high selectivity.
以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。 The present invention will be described in detail below. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to this embodiment alone.
本実施形態における免疫グロブリンG(IgG)型抗体吸着材は、IgG型抗体を吸着する。本実施形態における「IgG型抗体」とは、IgGクラスと同様のFc領域を有するタンパク質であれば、タンパク質分子内のFc領域以外の領域が変性、及び/又は欠損したタンパク質であってもよい。 The immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent in the present embodiment adsorbs IgG type antibodies. The “IgG type antibody” in the present embodiment may be a protein in which a region other than the Fc region in the protein molecule is denatured and / or deleted as long as it is a protein having the same Fc region as the IgG class.
本明細書においては、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載し、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端(N末端)からカルボキシ末端(C末端)方向へ左から右へ記載する。 In the present specification, according to conventional methods in the art, various amino acid residues are described in one-letter code, and the amino acid sequence of a peptide is described from the amino terminus (N terminus) to the carboxy terminus (C terminus) from left to right. .
本実施形態のIgG型抗体吸着材は、配列番号1〜51のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドをリガンドとして、水不溶性担体に担持させたものである。一態様において、上記ペプチドは配列番号47〜51に記載のアミノ酸配列を有することが好ましく、配列番号49に記載のアミノ酸配列を有することが特に好ましい。 The IgG-type antibody adsorbent of this embodiment is one in which a peptide having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 51 is supported on a water-insoluble carrier as a ligand. In one aspect, the peptide preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 47 to 51, and particularly preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49.
上記ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列:
FNMQCQAEFYEILHEX16X17AX19X20GGGGGX26GKX29X30AX32X33AKIAALRDAC (配列番号:1)
を有する場合、
X16は、L、M、I又はFであり、好ましくはL又はMであり、
X17は、R、K、Y又はQであり、好ましくはR又はKであり、
X19は、V、L、M、F又はIであり、好ましくはV、L又はMであり、より好ましくはVであり、
X20は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG、Q、R又はAであり、
X26は、G、E又は欠失しており、好ましくはGであり、
X29は、I、L、V、M又はFであり、好ましくはI、L、V又はMであり、より好ましくはI、L又はVであり、
X30は、任意のアミノ酸であり、好ましくはA、T、Q、E又はSであり、
X32は、L、F、M又はIであり、好ましくはL又はFであり、
X33は、N、D、H、A、T又はGであり、好ましくはN、D、H、A又はTであり、より好ましくはNである。
The peptide is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1:
FNMQCQAEFYEILHEX 16 X 17 AX 19 X 20 GGGGGGX 26 GKX 29 X 30 AX 32 X 33 AKIAALRDAC (SEQ ID NO: 1)
If you have
X 16 is L, M, I or F, preferably L or M,
X 17 is R, K, Y or Q, preferably R or K;
X 19 is V, L, M, F or I, preferably V, L or M, more preferably V;
X 20 is any amino acid, preferably G, Q, R or A;
X 26 is G, E or deleted, preferably G;
X 29 is I, L, V, M or F, preferably I, L, V or M, more preferably I, L or V;
X 30 is any amino acid, preferably A, T, Q, E or S;
X 32 is L, F, M or I, preferably L or F,
X 33 is N, D, H, A, T or G, preferably N, D, H, A or T, more preferably N.
本実施形態において、上記ペプチドを構成するアミノ酸は、ペプチドが所望のIgG親和性有する限り、天然アミノ酸であっても、天然アミノ酸の誘導体や非天然アミノ酸であってもよい。一態様において、好ましくは、上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然アミノ酸である。 In this embodiment, the amino acid constituting the peptide may be a natural amino acid, a derivative of a natural amino acid, or a non-natural amino acid as long as the peptide has a desired IgG affinity. In one embodiment, preferably, the amino acid constituting the peptide is a natural amino acid.
天然アミノ酸の誘導体としては、例えば、ヒドロキシル基が導入されたアミノ酸であるヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン等、アミノ基が導入されたアミノ酸であるジアミノプロピオン酸等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては:主鎖の構造が天然型と異なる、α,α−二置換アミノ酸(α−メチルアラニンなど)、N−アルキル−α−アミノ酸、D−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸など;側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸(ノルロイシン、ホモヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するホモアミノ酸(ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(システイン酸など)など;が挙げられるがこれらに限定されない。 Examples of derivatives of natural amino acids include, but are not limited to, diaminopropionic acid, which is an amino acid into which an amino group is introduced, such as hydroxyproline, hydroxylysine, which is an amino acid into which a hydroxyl group is introduced. Examples of non-natural amino acids are: α, α-disubstituted amino acids (such as α-methylalanine), N-alkyl-α-amino acids, D-amino acids, β-amino acids, α -Hydroxy acids, etc .; amino acids whose side chain structure is different from the natural type (norleucine, homohistidine, etc.), homoamino acids having extra methylene in the side chain (homophenylalanine, homohistidine, etc.), and carboxylic acid functional groups in the side chain An amino acid in which the amino acid is substituted with a sulfonic acid group (such as cysteic acid);
上記ペプチドは、所望のIgG親和性有する限り、配列番号1〜51に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1又は数個、好ましくは1〜3個のアミノ酸が付加又は欠損、置換されたペプチドでも有り得る。 As long as the peptide has a desired IgG affinity, one or several, preferably 1-3 amino acids are added, deleted, or substituted in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 51 It can be a peptide.
一態様において、上記ペプチドは、配列番号1〜51に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、N末端から5番目のシステイン及びC末端のシステインのいずれか又は両方が任意のアミノ酸(例えば、荷電を有さないアミノ酸、好ましくはQ)で置換されたペプチドであり得る。本発明者らは、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドと構造が類似し、N末端から5番目及びC末端にシステインを有するペプチドにおいて、5番目のシステインを同じく荷電を有さないグルタミンに置換しても、IgGに対する解離定数に大きな影響がなかったことを確認している。
一態様において、配列番号1〜51に記載のいずれかに記載のアミノ酸配列中、N末端から5番目及びC末端の2つのシステインは、相互に結合して環状ペプチドを形成するアミノ酸で置換されていてもよい。
In one embodiment, the peptide has any amino acid (for example, charged) in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 51, wherein either or both of the fifth cysteine from the N-terminus and the cysteine at the C-terminus are present. It may be a peptide substituted with an amino acid without Q, preferably with Q). The present inventors have a structure similar to that of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and in the peptide having cysteine at the 5th from the N-terminus and cysteine at the C-terminus, the 5th cysteine is replaced with an uncharged glutamine. Even so, it was confirmed that there was no significant effect on the dissociation constant for IgG.
In one embodiment, in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 51, two cysteines from the N-terminus to the fifth and C-terminus are substituted with amino acids that bind to each other to form a cyclic peptide. May be.
上記ペプチドは、各種動物のIgG、特にヒトのIgGに対して強い結合性を示す。一態様において、IgGに対する結合性は、IgGに対する解離定数(KD)により評価することができる。解離定数の算出方法は当業者に公知であり、例えば後述の実施例に記載の方法により、水不溶性担体に担持させる前のペプチドを用いて算出することができる。好ましい態様において、上記ペプチドは、IgG(好ましくは、ヒトIgG)に対する解離定数(KD)が3000nM以下であり、好ましくは1000nM以下であり、より好ましくは500nM以下であり、さらに好ましくは100nM以下であり、さらにより好ましくは50nM以下であり、特に好ましくは15nM以下である。 The peptide exhibits strong binding properties to various animal IgGs, particularly human IgG. In one embodiment, binding to IgG can be assessed by the dissociation constant (K D ) for IgG. Methods for calculating the dissociation constant are known to those skilled in the art. For example, the dissociation constant can be calculated using a peptide before being supported on a water-insoluble carrier by the method described in the Examples below. In a preferred embodiment, the peptide has a dissociation constant (K D ) for IgG (preferably human IgG) of 3000 nM or less, preferably 1000 nM or less, more preferably 500 nM or less, and even more preferably 100 nM or less. More preferably 50 nM or less, particularly preferably 15 nM or less.
上記ペプチドは、配列番号1〜51のいずれかに記載のアミノ酸配列を有しているかぎり特に限定されないが、一態様において、好ましくは、配列番号1〜51に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。 The peptide is not particularly limited as long as it has the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 51. In one embodiment, the peptide is preferably a peptide consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 51. .
上記ペプチドの全長は、アミノ酸残基で38〜200残基であることが好ましく、アミノ酸残基で38〜100残基であることがより好ましい。 The total length of the peptide is preferably 38 to 200 amino acid residues, and more preferably 38 to 100 amino acid residues.
上記ペプチドは、非環状であってもよく、環状であってもよい。一態様において、上記ペプチドは好ましくは環状ペプチドである。 The peptide may be acyclic or cyclic. In one embodiment, the peptide is preferably a cyclic peptide.
非環状のペプチドは、当該技術において、それ自体公知のペプチド合成法に従って合成することができる。例えばFmoc固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法等があげられる。操作が簡便である点から、ペプチド合成方法は固相合成法であることが好ましい。また、非環状ペプチドは、遺伝子工学的手法を用いて製造することも可能である。例えば、上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターによって適切な宿主細胞(例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌)を形質転換する。そして、上記宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養することによって、培養物からペプチドを得ることができる。 Acyclic peptides can be synthesized according to peptide synthesis methods known per se in the art. Examples thereof include liquid phase synthesis methods such as Fmoc solid phase synthesis method and fragment condensation method. In view of simple operation, the peptide synthesis method is preferably a solid phase synthesis method. Acyclic peptides can also be produced using genetic engineering techniques. For example, a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence described above is incorporated into an appropriate expression vector, and an appropriate host cell (eg, mammalian cell, insect cell, E. coli) is transformed with the obtained expression vector. Then, the peptide can be obtained from the culture by culturing the host cell under conditions suitable for the expression of the peptide.
環状ペプチドは、非環状ペプチドを得た後、これを公知の手法で環化して得ることができる。ペプチドの環化は、例えば、アミノ酸配列中の2つのシステイン間に、公知の手法によってジスルフィド結合を形成することにより行うことができる。また、公知の手法によって、分子内でチオエステルやチオエーテル結合を形成することによって行うこともできる。さらに、例えば高度希釈法など公知の手法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させることによっても行うこともできる。 The cyclic peptide can be obtained by obtaining a non-cyclic peptide and then cyclizing it by a known method. The cyclization of the peptide can be performed, for example, by forming a disulfide bond between two cysteines in the amino acid sequence by a known method. Moreover, it can also carry out by forming a thioester and a thioether bond in a molecule | numerator by a well-known method. Furthermore, it can also be carried out by condensing a carboxy group and an amino group in the molecule by a known method such as a high dilution method.
好ましい態様において、上記ペプチドは、N末端側の10前後のアミノ酸残基及びC末端側の10前後のアミノ酸残基がそれぞれα−ヘリックスを形成し、この2つのα−へリックスが7つのグリシン残基を含むループで結合したヘリックス−ループ−ヘリックス構造(HLH構造)を有する。理論に束縛されるものではないが、このHLH構造を有するペプチドにおいて、2本のα−ヘリックスは、内側に存在するロイシン側鎖の疎水相互作用等により安定なHLH構造を形成する。さらに、N末端およびC末端のシステインが分子内ジスルフィド架橋することでさらに立体構造の安定性が向上する。 In a preferred embodiment, in the peptide, about 10 amino acid residues on the N-terminal side and about 10 amino acid residues on the C-terminal side each form an α-helix, and these two α-helices have 7 glycine residues. It has a helix-loop-helix structure (HLH structure) linked by a loop containing groups. Without being bound by theory, in the peptide having this HLH structure, the two α-helices form a stable HLH structure due to the hydrophobic interaction of the leucine side chain existing inside. Furthermore, the stability of the steric structure is further improved by intramolecular disulfide crosslinking of the N-terminal and C-terminal cysteines.
上記ペプチドを水不溶性担体に担持することによって、本実施形態におけるIgG型抗体吸着材として利用し得る。 By carrying the peptide on a water-insoluble carrier, it can be used as an IgG-type antibody adsorbent in the present embodiment.
水不溶性担体とは、水に溶けない担体を意味する。上記ペプチドリガンドを担持させる際に使用する水不溶性担体としては、親水基の表面を有し、かつペプチドリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記水不溶性担体は吸着に使用できる有効表面積が広い多孔性であるもの(多孔質体)が好ましい。 A water-insoluble carrier means a carrier that is insoluble in water. Examples of the water-insoluble carrier used for supporting the peptide ligand include amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups and the like that have a hydrophilic surface and can be used to form a covalent bond with the peptide ligand. Those having a reactive functional group are preferred. The water-insoluble carrier is preferably a porous material having a large effective surface area that can be used for adsorption (porous material).
上記水不溶性担体は、粒子状、繊維状、シート状、中空糸状等の任意の公知の形状のものを用いることができる。ペプチドリガンドの保持量又は吸着材としての取扱い性を考慮すると、水不溶性担体は粒子状のものが好ましい。 As the water-insoluble carrier, any known shape such as a particulate shape, a fiber shape, a sheet shape, and a hollow fiber shape can be used. Considering the amount of peptide ligand retained or the handling property as an adsorbent, the water-insoluble carrier is preferably in the form of particles.
粒子状担体の平均粒径は、25μ〜2500μmであることが好ましい。担体の比表面積と体液の流通性の面から、上記平均粒径は50μ〜1500μmであることがより好ましい。 The average particle size of the particulate carrier is preferably 25 μm to 2500 μm. From the viewpoint of the specific surface area of the carrier and the fluidity of the body fluid, the average particle size is more preferably 50 μm to 1500 μm.
使用できる水不溶性担体としては、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、多孔質ガラス、ビニルポリマー等の有機又は無機の多孔体が挙げられ、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料は全て用いることができる。 Examples of water-insoluble carriers that can be used include cellulosic gels, dextran-based gels, agarose-based gels, polyacrylamide-based gels, porous glass, and organic or inorganic porous materials such as vinyl polymers, which are used for ordinary affinity chromatography. Any carrier material that can be used can be used.
これらの担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア(旭化成株式会社製)及びCM−セルロファイン(登録商標)CH(排除限界タンパク質分子量:約3×106、生化学工業株式会社販売)等のセルロース系担体、特公平1−044725号公報に記載の全多孔質活性化ゲル、CM−トヨパール(登録商標)650C(排除限界タンパク質分子量:5×106、東ソー株式会社製)等のポリビニル系担体、CM−トリスアクリルM(CM−Trisacryl M)〔排除限界タンパク質分子量:1×107、スウェーデン国ファルマシア−LKB(Pharmacia−LKB)社製〕等のポリアクリルアミド系担体、及び、セファロースCL−4B(SepharoseCL−4B)〔排除限界タンパク質分子量:2×107、スウェーデン国ファルマシア−LKB(Pharmacia−LKB)社製〕等のアガロース系担体等の有機質担体、並びに、CPG−10−1000〔排除限界タンパク質分子量:1×108、平均細孔径:100nm、米国エレクトローニュークレオニクス(Electro−nucleonics)社製〕等の多孔性ガラス等の無機質担体が挙げられる。 Examples of these carriers are cellulosic carriers such as Asahi Kasei Microcarrier (Asahi Kasei Co., Ltd.) and CM-Cellulofine (registered trademark) CH (exclusion limit protein molecular weight: about 3 × 10 6 , sold by Seikagaku Corporation). A total porous activated gel described in JP-B-1-044725, a polyvinyl carrier such as CM-Toyopearl (registered trademark) 650C (exclusion limit protein molecular weight: 5 × 10 6 , manufactured by Tosoh Corporation), CM- Polyacrylamide-based carriers such as Trisacryl M (CM-Trisacryl M) [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 7 , Pharmacia-LKB, Sweden], and Sepharose CL-4B (Sepharose CL-4B ) [exclusion limit protein molecular weight: 2 × 10 7, sway Emissions Country Pharmacia -LKB (Pharmacia-LKB) Co. Ltd.] organic carriers agarose-based carrier such as, well, CPG-10-1000 [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 8, the average pore diameter: 100 nm, USA Electro chromatography And inorganic carriers such as porous glass such as those manufactured by Electro-Nucleonics.
上記水不溶性担体は、体液浄化用水不溶性担体であることが好ましい。体液浄化用水不溶性担体とは、吸着材が血液等の体液に接触した場合、体液中に溶け出さない担体であって、タンパク質の非特異吸着が少ない、ブラジキニン産生能が低い、補体活性化能が低い等、血液適合性等の体液適合性が高い担体を意味する。上記体液浄化用水不溶性担体は、ポリビニルアルコールが架橋したもの(架橋化PVA)であることが好ましい。 The water-insoluble carrier is preferably a body-insoluble water-insoluble carrier. A water-insoluble carrier for body fluid purification is a carrier that does not dissolve in body fluids when the adsorbent comes in contact with body fluids such as blood, has little nonspecific adsorption of proteins, has a low ability to produce bradykinin, and has a complement activation ability Means a carrier having high fluid compatibility such as blood compatibility. The water-insoluble carrier for body fluid purification is preferably a crosslinked polyvinyl alcohol (crosslinked PVA).
水不溶性担体としては、粒子状の多孔質体が好ましく、例えば、多孔性重合体粒子を用いることができる。粒子状の多孔質体は、ペプチドリガンドを固定化できるものである。目的吸着物質であるIgG型抗体の分子量が約15万であることから、粒子状の多孔質体の排除限界分子量(タンパク質)は、15万〜1000万であることが好ましい。最も好ましい排除限界分子量は100万〜500万である。 As the water-insoluble carrier, a particulate porous body is preferable, and for example, porous polymer particles can be used. The particulate porous body can immobilize the peptide ligand. Since the molecular weight of the IgG type antibody that is the target adsorbing substance is about 150,000, the exclusion limit molecular weight (protein) of the particulate porous material is preferably 150,000 to 10 million. The most preferred exclusion limit molecular weight is 1 million to 5 million.
重合体の組成は、ポリアミド系重合体、ポリエステル系重合体、ポリウレタン系重合体及びビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとり得る公知の重合体を用いることができる。特に親水性モノマーによって親水化したビニル化合物系多孔性重合体が好ましい結果を与える。 The polymer composition may be a known polymer that can have a porous structure, such as a polyamide polymer, a polyester polymer, a polyurethane polymer, and a vinyl compound polymer. In particular, a vinyl compound-based porous polymer hydrophilized with a hydrophilic monomer gives preferable results.
ペプチドリガンドの水不溶性担体への担持方法としては、公知の担体活性化方法及び固定化法を用いることができる。例えば、担体がアミノ基又はカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、ペプチドリガンドと縮合反応させる方法、及び、担体とペプチドリガンドとをグルタルアルデヒド等の2個以上の官能基を有する化合物を用いて結合させる方法が挙げられる。また、担体が水酸基を有する場合には、例えば、臭化シアン等のハロゲン化シアンを担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基の部分で反応させる方法、及び、エピクロロヒドリン等のエポキシドを有する化合物を担体に作用させ、ペプチドリガンドのアミノ基やメルカプト基の部分で反応させる方法等が挙げられる。また、ペプチドリガンドがシステインを有する場合には、マレイミド化した担体と反応させることで固定化することが可能である。 As a method for supporting the peptide ligand on the water-insoluble carrier, a known carrier activation method and immobilization method can be used. For example, when the carrier has an amino group or a carboxyl group, a method of performing a condensation reaction with a peptide ligand in the presence of a condensation reagent such as dicyclohexylcarbodiimide, and two or more of a carrier and a peptide ligand such as glutaraldehyde Examples of the method include bonding using a compound having a functional group. In addition, when the carrier has a hydroxyl group, for example, a method in which cyanogen halide such as cyanogen bromide acts on the carrier and reacts with the amino group portion of the peptide ligand, and an epoxide such as epichlorohydrin is included. Examples thereof include a method of reacting a compound with an amino group or mercapto group part of a peptide ligand by acting on a carrier. When the peptide ligand has cysteine, it can be immobilized by reacting with a maleimidized carrier.
必要に応じて、水不溶性担体とペプチドリガンドとの間に任意の長さの分子(リンカー)を導入したものを吸着材として使用することもできる。リンカー分子としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアラニン鎖、ポリグリシン鎖等が挙げられる。リンカーの導入は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。 If necessary, a material in which a molecule (linker) of an arbitrary length is introduced between the water-insoluble carrier and the peptide ligand can be used as the adsorbent. Examples of the linker molecule include a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, a polyalanine chain, and a polyglycine chain. The linker can be introduced using a technique known to those skilled in the art.
本実施形態において、具体的には、ペプチドリガンドが有する少なくとも1つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよし、ペプチドリガンドが有する少なくとも1つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドが有する少なくとも1つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。また、ペプチドリガンドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドリガンドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。 In this embodiment, specifically, the peptide ligand may be immobilized directly or via a linker by a mercapto group of at least one cysteine residue that the peptide ligand has, or at least one that the peptide ligand has. The side chain of at least one glutamic acid residue or aspartic acid residue which the peptide ligand has may be fixed to the water-insoluble carrier directly or via a linker by the amino group of the side chain of one lysine residue It may be immobilized on the water-insoluble carrier directly or via a linker. The peptide ligand may be immobilized on a water-insoluble carrier directly or via a linker by a carboxyl group at the carboxy terminus, or directly or via a linker by an amino group at the amino terminus of the peptide ligand. It may be immobilized on an insoluble carrier.
水不溶性担体に対するペプチドの固定化量は、少なすぎると吸着能力が低くなる傾向にあり、多すぎても吸着容量の増大は飽和する。よって、水不溶性担体1mLあたり、0.1〜100μmolの範囲が好ましく、より好ましくは1〜50μmolの範囲である。なお、ペプチドの固定化量は、後述の実施例に示すとおり、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度を紫外可視分光光度計で測定し、反応前後の吸光度の差分に基づいて算出される。 If the amount of the peptide immobilized on the water-insoluble carrier is too small, the adsorption ability tends to be low, and if it is too large, the increase in the adsorption capacity is saturated. Therefore, the range of 0.1 to 100 μmol per 1 mL of water-insoluble carrier is preferable, and the range of 1 to 50 μmol is more preferable. The amount of peptide immobilized is calculated based on the difference in absorbance before and after the reaction by measuring the absorbance of the reaction solution before and after the peptide introduction reaction as shown in the Examples below.
本実施形態のIgG型抗体吸着材は、液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器内に充填保持されることによって、IgG型抗体吸着器として使用することができる。このようなIgG型抗体吸着器としては、例えば、IgG型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールが挙げられる。 The IgG type antibody adsorbent of the present embodiment can be used as an IgG type antibody adsorber by being filled and held in a container having an inlet port through which a liquid flows in and an outlet port through which the liquid flows out. Examples of such an IgG type antibody adsorber include an extracorporeal circulation module using an IgG type antibody adsorbent.
図1はIgG型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。図1に示す体外循環モジュール1は、円筒2の一端開口部に、内側にフィルター3を張ったパッキン4を介して体液を流入させる入口ポート5(導入口)を有するキャップ6をネジ嵌合し、円筒2の他端開口部に内側にフィルター3’を張ったパッキン4’を介して体液を流出させる出口ポート7(導出口)を有するキャップ8をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター3及び3’の間隙にIgG型抗体吸着材を充填保持させて吸着材層9を形成してなるものである。体外循環モジュール1は、例えば、自己抗体及び免疫複合体を除去するための体液浄化デバイスとして使用することができる。 FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an embodiment of an extracorporeal circulation module using an IgG type antibody adsorbent. In the extracorporeal circulation module 1 shown in FIG. 1, a cap 6 having an inlet port 5 (introduction port) through which a body fluid flows is inserted into one end opening of a cylinder 2 through a packing 4 with a filter 3 on the inside. Then, a cap 8 having an outlet port 7 (outlet port) through which a body fluid flows out through a packing 4 ′ with a filter 3 ′ on the inside of the other end opening of the cylinder 2 is screwed to form a container, and a filter is formed. The adsorbent layer 9 is formed by filling and holding the IgG type antibody adsorbent in the gap between 3 and 3 ′. The extracorporeal circulation module 1 can be used, for example, as a body fluid purification device for removing autoantibodies and immune complexes.
吸着材層9には、IgG型抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合して充填してもよい。また、IgG型抗体吸着材と他の吸着材とが積層するように充填してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これによって吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層9の容積は、体外循環に用いる場合、50mL〜700mL程度が適当である。 The adsorbent layer 9 may be filled with an IgG type antibody adsorbent alone, or may be mixed with other adsorbents and filled. Alternatively, the IgG type antibody adsorbent and other adsorbent may be stacked so as to be laminated. As another adsorbent, for example, activated carbon having a wide range of adsorbability can be used. This can be expected to have a wide range of clinical effects due to the synergistic effect of the adsorbent. The volume of the adsorbent layer 9 is appropriately about 50 mL to 700 mL when used for extracorporeal circulation.
体液浄化デバイスを体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つの方法は、体内から取り出した血液を遠心分離機又は膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化した後、血球成分とあわせて体内に戻す方法である。他の一つの方法は、体内から取り出した血液を直接、上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化する方法である。 When using a body fluid purification device for extracorporeal circulation, there are two main methods. One method is to separate the blood taken out from the body into a plasma component and a blood cell component using a centrifuge or a membrane plasma separator, and then pass the plasma component through the body fluid purification device and purify it. It is a method of returning to the body together with blood cell components. Another method is a method in which blood taken out from the body is directly passed through the body fluid purification device for purification.
体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし、又は断続的に通液してもよい。 As a method for passing body fluid, it may be passed continuously or intermittently according to clinical necessity or according to the installation status of equipment.
このような、本実施形態のIgG型抗体吸着材を備えたIgG型抗体吸着器を、体液浄化デバイスとすることもできる。 Such an IgG type antibody adsorber provided with the IgG type antibody adsorbing material of the present embodiment can also be used as a body fluid purification device.
本実施形態のIgG型抗体吸着材及びIgG型抗体吸着器は、IgG型自己抗体吸着材及びIgG型自己抗体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織(移植されたものも含む)に対して産生される抗体を意味する。
また、本実施形態のIgG型抗体吸着材及びIgG型抗体吸着器は、免疫複合体吸着材及び免疫複合体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「免疫複合体」とは、IgG型抗体と抗原が結合した複合体を意味する。
The IgG type antibody adsorbent and the IgG type antibody adsorber of this embodiment may be used as an IgG type autoantibody adsorbent and an IgG type autoantibody adsorber. As used herein, “autoantibody” means an antibody produced against autologous cells or tissues (including transplanted ones).
Moreover, you may use the IgG type antibody adsorption material and IgG type antibody adsorption device of this embodiment as an immune complex adsorption material and an immune complex adsorption device. In the present specification, the “immunocomplex” means a complex in which an IgG type antibody and an antigen are bound.
本実施の形態のIgG型抗体吸着材は、上記のとおり、装置に充填してIgG型抗体吸着作用を利用した治療器として用いられるにとどまらず、免疫グロブリン、自己抗体、免疫グロブリン誘導体、免疫グロブリン複合体等の分離用吸着剤、精製用吸着材及び、これらの測定用基材としても極めて有効に利用できる。 As described above, the IgG type antibody adsorbent of the present embodiment is not limited to being used as a treatment device that is charged in an apparatus and uses the IgG type antibody adsorption action, but also an immunoglobulin, an autoantibody, an immunoglobulin derivative, an immunoglobulin. It can also be used very effectively as an adsorbent for separation such as a complex, an adsorbent for purification, and a substrate for measurement thereof.
以下、実施例によって本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an embodiment explains this embodiment still in detail, the present invention is not limited to these.
[実施例1:IgG結合性ペプチド]
〔ペプチドライブラリーの作製〕
特許文献3に記載されたHLH構造を有する非環状ペプチドに種々の改変を加えて、環状構造を有する環状ペプチドライブラリー(配列番号1に示すアミノ酸配列を有する)を作製した。なお、ここでは配列番号1に示すアミノ酸配列中のX16,X19,X29,X32はPhe、Leu、Ile、Met、Valの何れかのアミノ酸となり、X17,X20,X30,X33はタンパク質を構成するとされる20種類のアミノ酸のいずれか1種となり、X26は、Gly、Glu又は欠失するようにライブラリーを構成した。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドはα−ヘリックス部分のN末側にペプチドを環化するための2つのアミノ酸(C5とQ6)と3つのアミノ酸からなるスペーサ(N2、M3、Q4)を介して結合したフェニルアラニン(F1)と、α−ヘリックス部分のC末側にペプチドを環化するための2つのアミノ酸(A42とC43(X26が欠失している場合は41番目のA及び42番目のCを指す))を有し、2つのシステインC5、C43はジスルフィド結合している。
[Example 1: IgG-binding peptide]
[Preparation of peptide library]
Various modifications were made to the non-cyclic peptide having the HLH structure described in Patent Document 3 to prepare a cyclic peptide library having the cyclic structure (having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1). In this case, X16, X19, X29, and X32 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are any one of Phe, Leu, Ile, Met, and Val, and X17, X20, X30, and X33 constitute a protein. The library was constructed so that X26 was Gly, Glu or deleted. Each peptide constituting the peptide library is passed through two amino acids (C5 and Q6) for cyclizing the peptide on the N-terminal side of the α-helix part and a spacer (N2, M3, Q4) consisting of three amino acids. Bound phenylalanine (F1) and two amino acids (A42 and C43 for cyclization of the peptide at the C-terminal side of the α-helix part (41st A and 42nd C when X26 is deleted) And two cysteines C5 and C43 are disulfide-bonded.
(1)L-Random酵母表層ペプチドライブラリーの構築
overlap extension PCR 及び2nd PCRにより上記で設計したアミノ酸配列を有するL-Random ペプチドライブラリーをコードした遺伝子断片を作製し、制限酵素NcoI及びXho
Iで処理した。同様に処理した酵母表層提示用ベクターpYD11-BxXNとライゲーションする
ことによりL-Randomペプチドライブラリーのプラスミドを構築した。大腸菌にエレクトロポレーション法により形質転換して増幅した後、酵母細胞に酢酸リチウム法により形質転換することで9.4×106のライブラリーサイズをもつL-Random酵母表層提示ペプチドライブラリーを得た。
(1) Construction of L-Random yeast surface peptide library
A gene fragment encoding the L-Random peptide library having the amino acid sequence designed above was prepared by overlap extension PCR and 2nd PCR, and restriction enzymes NcoI and Xho
I processed. The plasmid of the L-Random peptide library was constructed by ligating with the yeast surface display vector pYD11-BxXN treated in the same manner. After transforming E. coli by electroporation and amplification, yeast cells were transformed by the lithium acetate method to obtain an L-Random yeast surface-displayed peptide library having a library size of 9.4 × 10 6 .
(2)human IgG-Fcに対するスクリーニング
得られたライブラリーに対してセルソーターBD FACSAria(商標名)II(BDバイオサイエンス社)を用いてhuman IgG-Fcに対する結合性スクリーニングを行った。ペプチドファイブラリーをSG/RCAA培地(で培養することでペプチドの細胞表層への提示を誘導した。PBSで洗浄した後、bio-human IgG-Fc(最終濃度100nM:Bethyl laboratory社)及びmouse anti-FLAG抗体(Sigma社)と反応させた後、SA-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin:Invitrogen社)及びanti-mouse-Alexa488(Alexa Flour(登録商標)488 goat anti-mouse IgG(H+L):Invitrogen社)を結合させることで蛍光ラベルした。BD FACSAria(商標名)を用いて3回ソートした。
(2) Screening for human IgG-Fc The obtained library was screened for binding to human IgG-Fc using a cell sorter BD FACSAria (trade name) II (BD Biosciences). Peptide libraries were cultured in SG / RCAA medium to induce presentation of peptides to the cell surface. After washing with PBS, bio-human IgG-Fc (final concentration 100 nM: Bethyl laboratory) and mouse anti- After reacting with FLAG antibody (Sigma), SA-PE (Streptavidin-R-phycoerythrin: Invitrogen) and anti-mouse-Alexa488 (Alexa Flour (registered trademark) 488 goat anti-mouse IgG (H + L): Invitrogen) was combined and fluorescently labeled, and sorted three times using BD FACSAria (trade name).
このとき、human IgG-Fcに対する解離定数(KD)が既知であるアミノ酸配列(FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC(配列番号:52))を有するペプチド(FK60)が提示したクローンの蛍光強度よりも高い領域(P5領域)に設定して、スクリーニングを行った。 At this time, in a region (P5 region) higher than the fluorescence intensity of the clone presented by the peptide (FK60) having an amino acid sequence (FNMQCQAEFYEILHESAADEGGGGGGGKEAARNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 52)) with a known dissociation constant (KD) for human IgG-Fc Set up and screened.
Round1では、1×108細胞をBulk sortモードによりソートし、全体の0.4%に設定したP5エリアに存在する細胞群1.4×105細胞を回収した。Round2ではRound1で回収した細胞を全てBurk sortモードでソートし、P5エリアを全体の9%に設定して9000細胞を回収した。さらに、Round3ではRound2で回収した細胞をsingle-cell sortモードでソートし、P5エリアを全体の13%に設定して96細胞を96 well SDプレート培地に回収した(図2)。RoundごとにP5のエリアを狭めて、蛍光強度の高い酵母細胞のみを選別した。これを30℃で2日間培養した。 In Round1, 1 × 10 8 cells were sorted by Bulk sort mode, and 1.4 × 10 5 cells in the P5 area set to 0.4% of the total were collected. In Round2, all cells collected in Round1 were sorted in Burk sort mode, and 9000 cells were collected with the P5 area set to 9% of the total. Furthermore, in Round3, cells collected in Round2 were sorted in single-cell sort mode, and the P5 area was set to 13% of the total, and 96 cells were collected in a 96-well SD plate medium (FIG. 2). For each round, the area of P5 was narrowed and only yeast cells with high fluorescence intensity were selected. This was cultured at 30 ° C. for 2 days.
(3)human IgG-Fc結合性クローンの活性解析
前記Round3で96well SDプレートに回収した酵母細胞96クローンをSDCAA培地で培養して増幅させた後、SG/RCAA培地で再び提示を誘導して、それぞれのbio-human IgG-Fcに対する結合活性を、蛍光プレートリーダー(Varioskan)を用いて測定した。結合活性を示すR-PE(PE-A)の相対蛍光強度(RFU)と、同時に測定したペプチドの提示量を示すAlexa-488の相対蛍光強度(RFU)との関係を図にプロットした(図3)。そのうち、R-PEの相対蛍光強度の高い約50のクローン(図に薄い黒丸で示される)を選択して、コロニーPCRによってそれぞれのクローンが保持するペプチドをコードした遺伝子断片を増幅させた。得られた遺伝子断片を鋳型としてシーケンシング反応を行い、遺伝子断片のDNA配列を解析することで、提示するクローンが保持するペプチドのアミノ酸配列を決定した。決定した配列(配列番号:2〜51)を以下に示す。
FNMQCQAEFYEILHEMRAMKGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC(配列番号:2)
FNMQCQAEFYEILHELKAFNGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC(配列番号:3)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKISALHAKIAALRDAC(配列番号:4)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC(配列番号:5)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIGGGGGGGKLQAMNAKIAALRDAC(配列番号:6)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKIHALNAKIAALRDAC(配列番号:7)
FNMQCQAEFYEILHELRAVEGGGGGGGKLAALNAKIAALRDAC(配列番号:8)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVGGGGGGGGKMRALNAKIAALRDAC(配列番号:9)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVRGGGGGGGKIIAMNAKIAALRDAC(配列番号:10)
FNMQCQAEFYEILHEMKAMSGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC(配列番号:11)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKITAFDAKIAALRDAC(配列番号:12)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVAGGGGGGGKIIALDAKIAALRDAC(配列番号:13)
FNMQCQAEFYEILHELRAVVGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC(配列番号:14)
FNMQCQAEFYEILHEIRALGGGGGGGGKLQAFNAKIAALRDAC(配列番号:15)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVRGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC(配列番号:16)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC(配列番号:17)
FNMQCQAEFYEILHELKALQGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC(配列番号:18)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVTALHAKIAALRDAC(配列番号:19)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIRGGGGGGGKLQALNAKIAALRDAC(配列番号:20)
FNMQCQAEFYEILHEMRALEGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC(配列番号:21)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC(配列番号:22)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVHGGGGGGGKLTALNAKIAALRDAC(配列番号:23)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKVKALNAKIAALRDAC(配列番号:24)
FNMQCQAEFYEILHEMKALKGGGGGGGKFSALNAKIAALRDAC(配列番号:25)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVRGGGGGGGKLPALDAKIAALRDAC(配列番号:26)
FNMQCQAEFYEILHEFKAVYGGGGGGGKLKALNAKIAALRDAC(配列番号:27)
FNMQCQAEFYEILHELRAMGGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC(配列番号:28)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGEGKLKALGAKIAALRDAC(配列番号:29)
FNMQCQAEFYEILHEMRALSGGGGGGGKLNALNAKIAALRDAC(配列番号:30)
FNMQCQAEFYEILHELKAMGGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC(配列番号:31)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC(配列番号:32)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC(配列番号:33)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVDGGGGGGGKMQALAAKIAALRDAC(配列番号:34)
FNMQCQAEFYEILHELYAVQGGGGGGGKIVAINAKIAALRDAC(配列番号:35)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC(配列番号:36)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGGGKMPALDAKIAALRDAC(配列番号:37)
FNMQCQAEFYEILHEMRALRGGGGGGGKMQALNAKIAALRDAC(配列番号:38)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKINALTAKIAALRDAC(配列番号:39)
FNMQCQAEFYEILHELKAVSGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC(配列番号:40)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKMSALAAKIAALRDAC(配列番号:41)
FNMQCQAEFYEILHELQAVLGGGGGGGKVLALNAKIAALRDAC(配列番号:42)
FNMQCQAEFYEILHELRAVAGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC(配列番号:43)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVDAFNAKIAALRDAC(配列番号:44)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVLALHAKIAALRDAC(配列番号:45)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC(配列番号:46)
FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC(配列番号:47)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC(配列番号:48)
FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC(配列番号:49)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC(配列番号:50)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC(配列番号:51)
(3) Activity analysis of human IgG-Fc binding clones After 96 clones of yeast cells recovered on 96-well SD plates with Round3 were cultured and amplified in SDCAA medium, presentation was induced again in SG / RCAA medium, The binding activity to each bio-human IgG-Fc was measured using a fluorescence plate reader (Varioskan). The relationship between the relative fluorescence intensity (RFU) of R-PE (PE-A), which shows binding activity, and the relative fluorescence intensity (RFU) of Alexa-488, which indicates the amount of peptide presented simultaneously, is plotted in the figure (Figure 3). Among them, about 50 clones having high relative fluorescence intensity of R-PE (indicated by thin black circles in the figure) were selected, and gene fragments encoding peptides held by each clone were amplified by colony PCR. Sequencing reactions were performed using the obtained gene fragment as a template, and the DNA sequence of the gene fragment was analyzed to determine the amino acid sequence of the peptide retained by the clone to be presented. The determined sequence (SEQ ID NO: 2 to 51) is shown below.
FNMQCQAEFYEILHEMRAMKGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 2)
FNMQCQAEFYEILHELKAFNGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 3)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKISALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 4)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 5)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIGGGGGGGKLQAMNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 6)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKIHALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 7)
FNMQCQAEFYEILHELRAVEGGGGGGGKLAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 8)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVGGGGGGGGKMRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 9)
FNMQCQAEFYEILHEIRAVRGGGGGGGKIIAMNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 10)
FNMQCQAEFYEILHEMKAMSGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 11)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKITAFDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 12)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVAGGGGGGGKIIALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 13)
FNMQCQAEFYEILHELRAVVGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 14)
FNMQCQAEFYEILHEIRALGGGGGGGGKLQAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 15)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVRGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 16)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 17)
FNMQCQAEFYEILHELKALQGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 18)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVTALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 19)
FNMQCQAEFYEILHEMRAIRGGGGGGGKLQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 20)
FNMQCQAEFYEILHEMRALEGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 21)
FNMQCQAEFYEILHELRAVSGGGGGGGKMAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 22)
FNMQCQAEFYEILHEIKAVHGGGGGGGKLTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 23)
FNMQCQAEFYEILHELRALGGGGGGGGKVKALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 24)
FNMQCQAEFYEILHEMKALKGGGGGGGKFSALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 25)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVRGGGGGGGKLPALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 26)
FNMQCQAEFYEILHEFKAVYGGGGGGGKLKALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 27)
FNMQCQAEFYEILHELRAMGGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 28)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGEGKLKALGAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 29)
FNMQCQAEFYEILHEMRALSGGGGGGGKLNALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 30)
FNMQCQAEFYEILHELKAMGGGGGGGGKIRALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 31)
FNMQCQAEFYEILHELRAVRGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 32)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKLIALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 33)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVDGGGGGGGKMQALAAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 34)
FNMQCQAEFYEILHELYAVQGGGGGGGKIVAINAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 35)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKIPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 36)
FNMQCQAEFYEILHEMKAVGGGGGGGGKMPALDAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 37)
FNMQCQAEFYEILHEMRALRGGGGGGGKMQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 38)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKINALTAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 39)
FNMQCQAEFYEILHELKAVSGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 40)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVEGGGGGGGKMSALAAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 41)
FNMQCQAEFYEILHELQAVLGGGGGGGKVLALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 42)
FNMQCQAEFYEILHELRAVAGGGGGGGKVTALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 43)
FNMQCQAEFYEILHELKAVLGGGGGGGKVDAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 44)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVLALHAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 45)
FNMQCQAEFYEILHELRALRGGGGGGGKVPALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 46)
FNMQCQAEFYEILHELRAVGGGGGGGGKVAALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 47)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVQGGGGGGGKITALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 48)
FNMQCQAEFYEILHELKAVRGGGGGGGKIQALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 49)
FNMQCQAEFYEILHEMRAVAGGGGGGGKLEAFNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 50)
FNMQCQAEFYEILHELRAVQGGGGGGGKISALNAKIAALRDAC (SEQ ID NO: 51)
(4)human IgG-Fc結合性ペプチドの結合性(解離定数の算出)
アミノ酸配列を決定したhuman IgG-Fc結合性ペプチドのうちランダムに5個(FK6014、FK6032、FK6053、FK6063、FK6065)を選択し、アミドレジンを用いて0.023μmolスケールでFmoc固相合成法によりそれぞれを化学合成し、SPR法を用いてhuman IgG-Fcに対する結合活性測定を行った。なお、FK6014、FK6032、FK6053、FK6063、FK6065はそれぞれ、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51で示される配列を有する。
(4) Binding of human IgG-Fc binding peptide (calculation of dissociation constant)
Of the human IgG-Fc-binding peptides whose amino acid sequences were determined, 5 were randomly selected (FK6014, FK6032, FK6053, FK6063, FK6065), and each was chemically chemistry by Fmoc solid-phase synthesis method at 0.023 μmol scale using amide resin. The synthesized activity was measured for human IgG-Fc using the SPR method. Note that FK6014, FK6032, FK6053, FK6063, and FK6065 have the sequences represented by SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, and SEQ ID NO: 51, respectively.
100mgのFmoc-PAL-PEG-PS(商標名)アミドレジン(置換率:0.2 mmol/g)をリアクションベッセル量り取り、ペプチド自動合成機PSSM-8(SHIMAZU社)のプロトコルに従ってそれぞれのFmocアミノ酸(10equiv.)を、HCTU(10equiv)、DIEA(20equiv)、30%ピペリジン、5%無水酢酸を調製して、各ペプチドを化学合成した。終了後、レジンをジエチルエーテルで洗浄し乾燥させ、クリベージ溶液(TFA:EMS:Anisole:EDT=93:3:3:1)を2mL添加して、室温で4時間反応させた。クリベージ溶液をろ過したのち、氷冷したジエチルエーテルを過剰量添加することでペプチドを析出させた。氷上で10分間静置し、6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を捨てた。回収した沈殿物に再び氷冷したジエチルエーテルを加えて激しく撹拌させた後、氷上で10分間静置して6500rpm、4℃で10分間遠心分離して上清を除去することで沈殿物を洗浄した。この洗浄行為を2回繰り返した。沈殿物を減圧下で乾燥させたのち、2 mLの滅菌水に溶解し、0.22 mmのフィルターでろ過してペプチド溶液(非環状ペプチド)を得た。ペプチド溶液をRP-HPLCで精製し、MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。 100 mg of Fmoc-PAL-PEG-PS (trade name) amide resin (substitution rate: 0.2 mmol / g) was weighed in reaction vessel, and each Fmoc amino acid (10equiv.) According to the protocol of automatic peptide synthesizer PSSM-8 (SHIMAZU). ) Was prepared from HCTU (10equiv), DIEA (20equiv), 30% piperidine, and 5% acetic anhydride, and each peptide was chemically synthesized. After completion, the resin was washed with diethyl ether and dried, and 2 mL of cribage solution (TFA: EMS: Anisole: EDT = 93: 3: 3: 1) was added and reacted at room temperature for 4 hours. After filtering the cribage solution, an excess amount of ice-cooled diethyl ether was added to precipitate the peptide. The mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes, centrifuged at 6500 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was discarded. Add ice-cold diethyl ether again to the collected precipitate and stir vigorously, then leave it on ice for 10 minutes, centrifuge at 6500 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and wash the precipitate by removing the supernatant. did. This washing action was repeated twice. The precipitate was dried under reduced pressure, dissolved in 2 mL of sterile water, and filtered through a 0.22 mm filter to obtain a peptide solution (acyclic peptide). The peptide solution was purified by RP-HPLC and subjected to mass spectrometry by MALDI-TOF-MS. As a result, an actual measurement value almost as calculated was obtained, confirming that the target peptide was synthesized.
その後、滅菌水で溶解したペプチド溶液を30mM Tris-HCl(pH8.5)に常温で一晩かけて滴下しながら撹拌することで酸化反応させ、分子内ジスルフィド架橋を施した。反応溶液をRP-HPLCを用いて上記と同様の条件で精製した。MALDI-TOF-MSで質量分析したところ、ほぼ計算値どおりの実測値が得られたことで目的とするペプチドが合成されたことを確認した。 Thereafter, the peptide solution dissolved in sterilized water was agitated while being added dropwise to 30 mM Tris-HCl (pH 8.5) at room temperature overnight, and subjected to intramolecular disulfide crosslinking. The reaction solution was purified using RP-HPLC under the same conditions as described above. Mass spectrometry using MALDI-TOF-MS confirmed that the target peptide was synthesized by obtaining actual measurement values almost as calculated.
得られた5つの環状ペプチドについて、Biacore T200(GEヘルスケア社)とThiol coupling kit(GE ヘルスケア社)を用いて各濃度における結合活性を測定した。全ての工程において、ランニングバッファーはHBS-EP+を用いた。Serise S CM5 センサーチップに、human IgG-Fcの固定化用としてフローセル2を用いて、流速10μL/min、25℃の条件で行った。予備試験によりhuman IgG-Fcの固定化に最適なpHを決定した後、フローセル2に前記キット中のEDCとNHSを混合した液(容量比で1:1)を調製し、7分間センサーチップに流すことでカルボキシル基を活性化させた。5 mg/mL human IgG-Fcを10mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で調製し、活性化させたフローセル2に7分間流すことでhumanIgG-Fcを固定化した。固定化量は2000RUであった。未反応の活性化されたカルボキシル基はエタノールアミンを7分間流すことによって、全て不活性化した。フローセル1をEDC及びNHSによる活性化とエタノールアミンによるブロッキングを施すことでリファレンスセルとして使用した。各ペプチドをHBS-EP+バッファーで0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μMに段階希釈し,流速30μL/min.でそれぞれの結合活性を測定した。測定結果は、BIA evaluation 4.1ソフトウェアで、平衡値解析により解離定数(KD)を算出した。その結果を表1に示した。 About the obtained 5 cyclic peptides, the binding activity in each concentration was measured using Biacore T200 (GE Healthcare) and Thiol coupling kit (GE Healthcare). In all steps, HBS-EP + was used as the running buffer. The flow cell 2 was used for immobilizing human IgG-Fc on a Serise S CM5 sensor chip, and the flow rate was 10 μL / min at 25 ° C. After determining the optimal pH for immobilization of human IgG-Fc by a preliminary test, prepare a solution (1: 1 by volume) that mixes EDC and NHS in the kit in the flow cell 2 and put it in the sensor chip for 7 minutes. The carboxyl group was activated by flowing. 5 mg / mL human IgG-Fc was prepared with 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0), and flowed through the activated flow cell 2 for 7 minutes to immobilize human IgG-Fc. The immobilization amount was 2000RU. All unreacted activated carboxyl groups were inactivated by flowing ethanolamine for 7 minutes. Flow cell 1 was used as a reference cell by activation with EDC and NHS and blocking with ethanolamine. Each peptide was serially diluted to 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 μM with HBS-EP + buffer, and each binding activity was measured at a flow rate of 30 μL / min. As the measurement results, the dissociation constant (K D ) was calculated by equilibrium analysis using BIA evaluation 4.1 software. The results are shown in Table 1.
5つのペプチドはどれも非常に高い結合活性(FK6014:KD=9nM、FK6032:KD=8nM、FK6053:KD=5nM、FK6063:KD=12nM、FK6065:KD=8nM)を示した。比較対照としたペプチドFK60(KD=21μM=21000nM)に比べて1000倍以上結合活性が向上した。 Five peptides Any very high avidity (FK6014: K D = 9nM, FK6032: K D = 8nM, FK6053: K D = 5nM, FK6063: K D = 12nM, FK6065: K D = 8nM) showed . The binding activity was improved 1000 times or more compared to the peptide FK60 (K D = 21 μM = 21000 nM) as a comparative control.
(5)CDスペクトルの測定
各ペプチドのCDスペクトルを測定した。ペプチドを20mM Phosphate buffer(pH7.4)に最終濃度20mMとなるように調製し、円二色性分散計J-720(JASCO社)、温度コントローラー Peltier PTC-423L(TOMY SEIKO)を用いて、20℃の温度における190nmから260nmの波長でのCDスペクトルを0.2nm間隔で測定した。その結果を図4に示す。それぞれのペプチドは208nm及び222nmに明瞭な負の極大を有しており、安定なα−ヘリックス構造を保持していることがわかった。α−ヘリックスの内側の適切な位置に疎水性アミノ酸が配置されるようデザインしたことにより、α−ヘリックス構造の形成に必要な両親媒性を獲得し、安定な立体構造を形成しているものと推測される。
(5) Measurement of CD spectrum The CD spectrum of each peptide was measured. Peptide was prepared in 20 mM Phosphate buffer (pH 7.4) to a final concentration of 20 mM, using a circular dichroism dispersometer J-720 (JASCO), temperature controller Peltier PTC-423L (TOMY SEIKO), 20 CD spectra at wavelengths from 190 nm to 260 nm at a temperature of ° C. were measured at 0.2 nm intervals. The result is shown in FIG. Each peptide had a clear negative maximum at 208 nm and 222 nm, and was found to retain a stable α-helix structure. By designing so that a hydrophobic amino acid is arranged at an appropriate position inside the α-helix, it has acquired the amphiphilicity necessary for the formation of the α-helix structure, and forms a stable three-dimensional structure. Guessed.
[実施例2:IgG結合性ペプチドを固定化した吸着材]
(1)ペプチド固定化担体の作製
ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体(旭硝子株式会社製、平均粒径100μm、排除限界分子量約100万以上、樹脂1mLに充填できる分子量4万のプルランの量が0.20mL/mL以上)18gをジメチルスルホキシド(和光純薬工業株式会社製)180mLに投入し、そこに、エピクロロヒドリン(和光純薬工業株式会社製)137mL、水酸化ナトリウム(和光純薬工業株式会社製)の水溶液(21g/31.5mL)及び水素化ホウ素ナトリウム(和光純薬工業株式会社製)88mgを添加し、30℃で5時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、エポキシ基を導入した球状多孔質体をメタノール(キシダ化学株式会社製)で洗浄し、その後、純水で洗浄してエポキシ活性化担体を得た。得られた担体は、1.0Mのチオ硫酸ナトリウム水溶液(和光純薬工業株式会社製)2mLと、活性化担体1mLに1%フェノールフタレインエタノール溶液(和光純薬工業株式会社製)2滴を滴下し、80℃で赤色の呈色が確認されなくなるまで0.1Mの塩酸(和光純薬工業株式会社製)を加え、「活性化量(単位樹脂量あたりのエポキシ基の量)=塩酸濃度×塩酸滴定量/樹脂量」の式によって導入されたエポキシ基の量を求め、110μmol/mL以上であることを確認した。
[Example 2: Adsorbent with immobilized IgG-binding peptide]
(1) Production of peptide-immobilized carrier Spherical porous body made of polyvinyl acetate (Asahi Glass Co., Ltd., average particle size of 100 μm, exclusion limit molecular weight of about 1 million or more, the amount of pullulan having a molecular weight of 40,000 that can be filled in 1 mL of resin 18 g of 0.20 mL / mL or more) is put into 180 mL of dimethyl sulfoxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 137 mL of epichlorohydrin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sodium hydroxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) An aqueous solution (21 g / 31.5 mL) and 88 mg of sodium borohydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added and reacted at 30 ° C. for 5 hours to introduce an epoxy group. After the reaction, the spherical porous body into which the epoxy group was introduced was washed with methanol (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) and then washed with pure water to obtain an epoxy activated carrier. The obtained carrier was 2 mL of 1.0 M sodium thiosulfate aqueous solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2 drops of 1% phenolphthalein ethanol solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 1 mL of the activated carrier. Add 0.1 M hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) until red coloration is not confirmed at 80 ° C., and “activation amount (epoxy group amount per unit resin amount) = hydrochloric acid concentration The amount of the epoxy group introduced by the formula “x hydrochloric acid titration / resin amount” was determined and confirmed to be 110 μmol / mL or more.
次に、エポキシ化担体を30mL秤量し、アンモニア水(濃度:28−30%、関東化学株式会社)を45mL加え、40℃で90分間反応させることで、エポキシ基をアミノ基に変換した。得られたアミノ化担体は元素分析によって、定量的にエポキシ基からアミノ基となっていることを確認した。 Next, 30 mL of the epoxidized carrier was weighed, 45 mL of aqueous ammonia (concentration: 28-30%, Kanto Chemical Co., Inc.) was added, and reacted at 40 ° C. for 90 minutes to convert the epoxy group to an amino group. The obtained aminated carrier was quantitatively confirmed to be an amino group from an epoxy group by elemental analysis.
次に、アミノ化担体を5mL秤量し、ジメチルスルホキシド(DMSO、和光純薬株式会社製)で膨潤させた後、10mMのSuccinimidyl−[(N−maleimidopropionamido)−diethyleneglycol]ester(米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)のDMSO溶液10mLを加え、30℃で3時間反応させた。反応後、DMSOで洗浄し、その後純水で洗浄することで、マレイミド化担体を得た。 Next, 5 mL of the amination carrier was weighed and swelled with dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then 10 mM Succinimidyl-[(N-maleidopropionamido) -diethyleneglycol] ester (American Thermo Fisher Scientific). 10 mL of DMSO solution) was added and reacted at 30 ° C. for 3 hours. After the reaction, it was washed with DMSO and then washed with pure water to obtain a maleimide carrier.
得られたマレイミド化担体を2mL秤量し、0.8mMのペプチド(配列番号49のアミノ酸配列からなるペプチドについて、実施例1(4)に記載の方法で5番目のシステイン残基と43番目のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成しており、N末端にリンカーとしてグリシン5残基を介してシステインを付与したペプチド)PBS溶液5mLを加えた。その後、37℃で17時間反応させることで、ペプチド中のメルカプト基と担体中のマレイミド基を共有結合させた。反応後、純水で洗浄することで、ペプチド固定化担体を得た。ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度(280nm)を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。 The obtained maleimidated carrier was weighed in 2 mL, and a 0.8 mM peptide (the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 was subjected to the fifth cysteine residue and the 43rd cysteine by the method described in Example 1 (4). A peptide in which a disulfide bond was formed with a residue and cysteine was added to the N-terminus via a glycine 5 residue as a linker) 5 mL of PBS solution was added. Then, the mercapto group in a peptide and the maleimide group in a support | carrier were covalently bound by making it react at 37 degreeC for 17 hours. After the reaction, the peptide-immobilized carrier was obtained by washing with pure water. The amount of peptide immobilization was calculated based on the difference in absorbance after measuring the absorbance (280 nm) of the reaction solution before and after the peptide introduction reaction with an ultraviolet-visible spectrophotometer.
(2)血漿タンパク質吸着試験
健常人から採取したCPD加血液(Citrate Phosphate Dextrose加血液)を遠心分離にて血漿分離し、健常人ヒト血漿を得た。次に得られたペプチド固定化担体を0.5mL秤量し、その6倍容の健常人ヒト血漿を加え、37℃で17.5間分振とうさせた。振とう後、遠心分離にてペプチド固定化担体を除き、上澄み血漿中に含まれる血漿タンパク質(IgG、フィブリノーゲン(Fbg)、アルブミン(Alb))を測定することで、ペプチド固定化担体への吸着率を算出した。IgGについては免疫比濁法、Fbgについては凝固時間測定法、Albについてはネフェロメトリーをそれぞれ用いて、公知の手法により定量した。
(2) Plasma protein adsorption test CPD-added blood (Citrate Phosphate Dextrose-added blood) collected from healthy individuals was subjected to plasma separation by centrifugation to obtain healthy human plasma. Next, 0.5 mL of the obtained peptide-immobilized carrier was weighed, 6 times its volume of healthy human plasma was added, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 17.5. After shaking, the peptide-immobilized carrier is removed by centrifugation, and the plasma protein (IgG, fibrinogen (Fbg), albumin (Alb)) contained in the supernatant plasma is measured, and the adsorption rate to the peptide-immobilized carrier Was calculated. IgG was quantified by a known method using an immunoturbidimetric method, Fbg was measured using a clotting time measurement method, and Alb was measured using nepherometry.
[比較例1:トリプトファンを固定化した吸着材]
実施例2(1)で作製したエポキシ化担体を10mL秤量し、46mMのトリプトファン(和光純薬工業株式会社製)炭酸緩衝溶液20mLを加え、50℃で16時間反応させることで、トリプトファンを担体に共有結合させた。反応後、純水で洗浄することでトリプトファン固定化担体を得た。トリプトファンの固定化量は、トリプトファン導入反応前後の反応溶液の吸光度(280nm)を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。このトリプトファン固定化担体を用いて、実施例2(2)と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
[Comparative Example 1: Adsorbent with immobilized tryptophan]
10 mL of the epoxidized carrier prepared in Example 2 (1) was weighed, and 20 mL of 46 mM tryptophan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) carbonate buffer solution was added and reacted at 50 ° C. for 16 hours, so that tryptophan was used as the carrier. Covalently bonded. After the reaction, a tryptophan-immobilized carrier was obtained by washing with pure water. The amount of tryptophan immobilized was calculated based on the difference in absorbance obtained by measuring the absorbance (280 nm) of the reaction solution before and after the tryptophan introduction reaction with an ultraviolet-visible spectrophotometer. Using this tryptophan-immobilized carrier, a plasma protein adsorption test was performed using healthy human plasma in the same manner as in Example 2 (2).
[比較例2:アミノ酸及びペプチドを固定化しないアミノ化吸着材]
実施例2(1)で作製したアミノ化担体を用いて、実施例2(2)と同様の方法で健常人ヒト血漿を用いて血漿タンパク質吸着試験を実施した。
[Comparative Example 2: Aminated adsorbent without immobilizing amino acids and peptides]
Using the aminated carrier prepared in Example 2 (1), a plasma protein adsorption test was performed using healthy human plasma in the same manner as in Example 2 (2).
実施例2、並びに、比較例1及び2の結果を表2及び図5に示す。
表1に示すように、ペプチド固定化担体を用いた実施例2は、リガンド固定化量がトリプトファンの10分の1以下であるにもかかわらず、高いIgG吸着率を示した。また、トリプトファン固定化担体と比較して、他の血漿タンパク質成分を吸着することなく、IgGを極めて選択的に吸着することも示された。 As shown in Table 1, Example 2 using a peptide-immobilized carrier showed a high IgG adsorption rate even though the ligand-immobilized amount was 1/10 or less of tryptophan. It was also shown that IgG can be adsorbed very selectively without adsorbing other plasma protein components as compared to tryptophan-immobilized carriers.
本発明のIgG型抗体吸着材は、例えば、医療産業及び製薬業等で利用可能である。特に、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能であることから、自己免疫疾患の治療に有用である。また、IgG型抗体等の分離精製、測定等においても有用である。 The IgG antibody adsorbent of the present invention can be used in, for example, the medical industry and the pharmaceutical industry. In particular, it is possible to adsorb autoantibodies and immune complexes, which are thought to be the etiological agent of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and myasthenia gravis, with high adsorption capacity and high selectivity. Useful in the treatment of autoimmune diseases. It is also useful for separation and purification of IgG type antibodies and the like.
1…体液浄化デバイス(体外循環モジュール)、2…円筒、3、3’…フィルター、4、4’…パッキン、5…入口ポート(体液導入口)、6…キャップ、7…出口ポート(体液導出口)、8…キャップ、9…IgG型抗体吸着材。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Body fluid purification device (extracorporeal circulation module) 2 ... Cylindrical 3, 3 '... Filter 4, 4' ... Packing, 5 ... Inlet port (body fluid inlet), 6 ... Cap, 7 ... Outlet port (body fluid guide) Outlet), 8 ... cap, 9 ... IgG type antibody adsorbent.
Claims (14)
FNMQCQAEFYEILHEX16X17AX19X20GGGGGX26GKX29X30AX32X33AKIAALRDAC (配列番号:1)
(配列番号1中、
X16は、L、M、I又はFであり、
X17は、R、K、Y又はQであり、
X19は、V、L、M、F又はIであり、
X20は、任意のアミノ酸であり、
X26は、G、E又は欠失しており、
X29は、I、L、V、M又はFであり、
X30は、任意のアミノ酸であり、
X32は、L、F、M又はIであり、
X33は、N、D、H、A、T又はGである)。 An immunoglobulin G (IgG) type antibody adsorbent comprising a water-insoluble carrier and a peptide carried on the water-insoluble carrier, wherein the peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below:
FNMQCQAEFYEILHEX 16 X 17 AX 19 X 20 GGGGGGX 26 GKX 29 X 30 AX 32 X 33 AKIAALRDAC (SEQ ID NO: 1)
(In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L, M, I or F;
X 17 is R, K, Y or Q;
X 19 is V, L, M, F or I;
X 20 is any amino acid,
X 26 is G, E or deleted;
X 29 is I, L, V, M or F;
X 30 is any amino acid,
X 32 is L, F, M or I;
X 33 is N, D, H, A, T or G).
X16が、L又はMであり、
X17が、R又はKであり、
X19が、V、L又はMであり、
X29が、I、L、V又はMであり、
X32が、L又はFであり、
X33が、N、D、H、A又はTである、
請求項1に記載のIgG型抗体吸着材。 In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M;
X 17 is R or K;
X 19 is V, L or M;
X 29 is I, L, V or M;
X 32 is L or F;
X 33 is N, D, H, A or T.
The IgG antibody adsorbent according to claim 1.
X16が、L又はMであり、
X17が、R又はKであり、
X19が、Vであり、
X20が、G、Q、R又はAであり、
X26が、Gであり、
X29が、I、L又はVであり、
X30が、A、T、Q、E又はSであり、
X32が、L又はFであり、
X33が、Nである、
請求項1又は2に記載のIgG型抗体吸着材。 In SEQ ID NO: 1,
X 16 is L or M;
X 17 is R or K;
X 19 is V,
X 20 is G, Q, R or A;
X 26 is G,
X 29 is I, L or V;
X 30 is A, T, Q, E or S;
X 32 is L or F;
X 33 is N,
The IgG-type antibody adsorbent according to claim 1 or 2.
前記容器に充填された請求項1〜12のいずれか一項に記載のIgG型抗体吸着材と、
を備えるIgG型抗体吸着器。 A container having an inlet port through which a liquid flows and an outlet port through which the liquid flows out;
The IgG-type antibody adsorbent according to any one of claims 1 to 12, filled in the container,
An IgG type antibody adsorber comprising:
前記IgG型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿及び血清からなる群から選択される体液である、体液浄化デバイス。 A body fluid purification device comprising the IgG type antibody adsorber according to claim 13,
A body fluid purification device, wherein the liquid flowing into the IgG type antibody adsorber is a body fluid selected from the group consisting of blood, plasma and serum.
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