JP6846719B2 - サンプルの分析方法、及びサンプル分析用デバイス - Google Patents
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Description
本発明は、サンプルの分析方法、及びサンプルの分析用デバイスに関し、特に、サンプル分析用デバイスの測定領域をサンプルが通過する際のイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析するサンプルの分析方法、及びサンプル分析用デバイスに関する。
サンプル中に含まれる細胞や菌等の生物サンプル、また、ＰＭ（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｔｔｅｒ）等の非生物サンプルの個数や大きさを測定することは、健康な生活を送る上で大切な情報であり、近年、ますます測定精度の向上が望まれている。
サンプルの大きさや個数等を測定する装置及び方法としては、シリコン等の基板上に形成した細孔（マイクロポア）にサンプルを通過させ、細孔に印加した電圧によって細孔の内部を流れる定常電流が変化する様子から細胞の大きさや個数を解析する装置及び方法が知られている（非特許文献１参照）。
また、非特許文献１の細孔にサンプルを通過させる方法に換え、基板上にサンプル移動流路を形成し、該サンプル移動流路を挟むように第１測定流路及び第２測定流路を形成することでサンプルの駆動回路と測定回路を別回路として設計し、駆動回路の電圧を高く設定することで検出感度を高められることも知られている（特許文献１参照）。
Ｗａｓｅｅｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ， Ｖｏｌ．１２， ｐｐ．２３４５−２３５２ （２０１２）
上記非特許文献１に記載の装置及び方法は、細孔を細胞等のサンプルが流れる際の定常電流の変化を測定することで、サンプルの大きさや個数を解析できる。しかしながら、非特許文献１に記載の装置及び方法では、測定するのはサンプルの大きさである。したがって、細胞等の生物サンプル、又は大気中の微粒子等の非生物サンプル等の種類が異なる場合でも、サンプルの大きさが同じであればサンプルの種類が判別できないという問題がある。
一方、上記特許文献１に記載の装置及び方法は、測定感度を高めることで過渡電流を読み取ることができる。その結果、サンプル移動流路へのサンプルの入出タイミングを正確に測定できるようになり、通過速度からサンプルの表面電荷及び変形能を測定できるようになった。しかしながら、特許文献１に記載の方法では、サンプルの種類が異なる場合でも、大きさや表面電荷が同じであれば判別ができないという問題がある。
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、サンプル分析用デバイスの測定部をサンプルが通過する際のイオン電流の値を測定し、測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析し、そして、解析の際には、サンプルが移動部を移動する際にサンプルから漏出したイオン量を併せて解析することで、従来の装置及び方法から得られる情報に加え、サンプルが生物サンプルであるのか、又は非生物サンプルであるのか分析できることを新たに見出した。
すなわち、本発明の目的は、サンプルから漏出したイオン量を併せて解析できるサンプルの分析方法及びサンプル分析用デバイスを提供することである。
本発明は、以下に示す、サンプルの分析方法及びサンプル分析用デバイスに関する。
（１）サンプル分析用デバイスを用いたサンプルの分析方法であって、
前記サンプル分析用デバイスは、
前記サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
を少なくとも含み、
前記分析方法は、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定工程、
前記測定工程で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析工程、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
分析方法。
（２）前記解析工程が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記（１）に記載の分析方法。
（３）前記解析工程が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
上記（２）に記載の分析方法。
（４）前記解析工程で解析した傾きを、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾きと対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記（２）に記載の分析方法。
（５）前記解析工程で解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布を、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布と対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記（３）に記載の分析方法。
（６）前記傾きに代え、前記傾きをサンプルの体積で割った値を用いる、
上記（２）〜（５）の何れか一つに記載の分析方法、
（７）前記解析工程が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記（１）に記載の分析方法。
（８）サンプル分析用デバイスであって、該デバイスは、
サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
前記測定部で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析部、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
デバイス。
（９）前記解析部が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記（８）に記載のデバイス。
（１０）前記解析部が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
上記（９）に記載のデバイス。
（１１）予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾きを少なくとも記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾きと前記記憶部に記憶した傾きを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む、上記（９）に記載のデバイス。
（１２）予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布を記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布と、前記記憶部に記憶した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布とを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む上記（１０）に記載のデバイス。
（１３）前記傾きに代え、前記傾きをサンプル体積で割った値を用いる、
上記（９）〜（１２）の何れか一つに記載のデバイス。
（１４）前記解析部が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記（８）に記載のデバイス。
（１５）前記移動部に電場を形成できる駆動部を含み、前記駆動部は電場の大きさを変更できる電圧印加手段を有する、
上記（８）〜（１４）の何れか一つに記載のデバイス。
前記サンプル分析用デバイスは、
前記サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
を少なくとも含み、
前記分析方法は、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定工程、
前記測定工程で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析工程、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
分析方法。
（２）前記解析工程が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記（１）に記載の分析方法。
（３）前記解析工程が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
上記（２）に記載の分析方法。
（４）前記解析工程で解析した傾きを、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾きと対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記（２）に記載の分析方法。
（５）前記解析工程で解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布を、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布と対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記（３）に記載の分析方法。
（６）前記傾きに代え、前記傾きをサンプルの体積で割った値を用いる、
上記（２）〜（５）の何れか一つに記載の分析方法、
（７）前記解析工程が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記（１）に記載の分析方法。
サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
前記測定部で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析部、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
デバイス。
（９）前記解析部が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記（８）に記載のデバイス。
（１０）前記解析部が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
上記（９）に記載のデバイス。
（１１）予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾きを少なくとも記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾きと前記記憶部に記憶した傾きを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む、上記（９）に記載のデバイス。
（１２）予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布を記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布と、前記記憶部に記憶した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布とを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む上記（１０）に記載のデバイス。
（１３）前記傾きに代え、前記傾きをサンプル体積で割った値を用いる、
上記（９）〜（１２）の何れか一つに記載のデバイス。
（１４）前記解析部が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記（８）に記載のデバイス。
上記（８）〜（１４）の何れか一つに記載のデバイス。
本明細書で開示するサンプルの分析方法及びサンプル分析用デバイスを用いると、サンプルから漏出したイオン量を併せて解析できるので、従来より詳しくサンプルの分析を行うことができる。
以下に、サンプルの分析方法（以下、「分析方法」と記載することがある。）、及びサンプル分析用デバイス（以下、「デバイス」と記載することがある。）について説明する。
実施形態に係るデバイスは、サンプルが移動する移動部、移動部の途中に形成されサンプルが通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、測定部で測定したイオン電流の値からイオン電流の経時変化を解析する解析部、を少なくとも含んでいれば、どのような構造であってもよい。
図１は、デバイスの実施形態の一例を示す図である。図１に示すデバイス１は、基板２、基板２上に形成されたサンプルが移動する移動部３、移動部３の途中に形成され、サンプルが通過する際のイオン電流の値を測定する測定部４、測定部４で測定したイオン電流の値からイオン電流の経時変化を解析する解析部５を少なくとも含んでいる。
図１に示すデバイス１は、移動部３の一端にはサンプル投入部３１、移動部３の他端にはサンプル回収部３２が接続している。なお、図１に示す実施形態の移動部３、サンプル投入部３１、及びサンプル回収部３２は、基板２に形成された流路である。また、必要に応じて、予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、数理モデル等を記憶する記憶部６、解析部５で解析した結果に応じてサンプルの種類を判別する判別部７を設けてもよい。また、移動部３に電場をかけるための駆動部８も、必要に応じて設けてもよい。図１に示すデバイス１では、駆動部８はサンプル投入部３１に挿入する第３電極８１、サンプル回収部３２に挿入する第４電極８２、電圧印加手段８３を含んでいる。
測定部４は、第１電極４１及び第２電極４２、電流計４３を少なくとも含んでおり、第１電極４１及び第２電極４２からの電流を電流計４３で測定すればよい。また、移動部３に電場をかけるための駆動部８と測定部４の電圧を釣り合わせた状態にし、釣り合った状態からの電流の差分を検出することでより高感度検出を行う場合は、測定部４に電圧印加手段４４、可変抵抗４５、固定抵抗４６、更に、必要に応じて増幅手段を含ませることで、測定したイオン電流の差分のみを測定できるようにしてもよい。なお、図１に示す実施形態では、移動部３に接続する第１測定流路３３に第１電極４１を挿入し、第１測定流路３３とは反対側から移動部３に接続する第２測定流路３４に第２電極４２を挿入しているが、第１測定流路３３及び第２測定流路３４に代え、移動部３を挟むように一対の測定用電極を形成してもよい。その場合、測定部４の第１電極４１及び第２電極４２は不要で、形成した測定用電極と電流計４３を、電線等で接続すればよい。なお、後述するとおり、第１測定流路３３及び第２測定流路３４（又は、一対の電極）は、移動部３を挟んで非対称の位置に形成することが好ましい。
移動部３を形成した基板２は、微細加工技術を用いて製造することができる。図２は、デバイス１の製造手順の一例を示す断面図である。
（１）基板２の上に、エッチング可能な材料２１を化学蒸着で形成する。
（２）ポジ型フォトレジスト２２をスピンコータで塗布する。
（３）移動部３を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光・現像処理し、流路を形成する部分のポジ型フォトレジスト２２を除去する。
（４）移動部３を形成する箇所の材料２１をエッチングし、移動部（流路）を形成する。
（５）ポジ型フォトレジスト２２を除去することで、基板２上に移動部３を形成する。
（１）基板２の上に、エッチング可能な材料２１を化学蒸着で形成する。
（２）ポジ型フォトレジスト２２をスピンコータで塗布する。
（３）移動部３を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光・現像処理し、流路を形成する部分のポジ型フォトレジスト２２を除去する。
（４）移動部３を形成する箇所の材料２１をエッチングし、移動部（流路）を形成する。
（５）ポジ型フォトレジスト２２を除去することで、基板２上に移動部３を形成する。
基板２は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無い。基板２の材料としては、例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ等が挙げられる。
ポジ型フォトレジスト２２としては、ＴＳＭＲ Ｖ５０、ＰＭＥＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。また、ポジ型に代え、ネガティブ型フォトレジストを用いてもよく、ＳＵ−８、ＫＭＰＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。フォトレジストの除去液は、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
基板２の上に堆積し、移動部３を形成する材料２１としては、電気絶縁性の材料であれば特に制限は無く、例えば、ＳｉＯ2、Ｓｉ3Ｎ4、ＢＰＳＧ、ＳｉＯＮ等が挙げられる。なお、図２に示す製造工程は、エッチング可能な材料２１を用いて移動部３を形成しているが、材料２１として、上記のポジ型フォトレジストやネガティブ型フォトレジスト等の感光性樹脂を用いてもよい。感光性樹脂を用いる場合は、基板２上に感光性樹脂を塗布し、移動部を形成できる形状のフォトマスクを用い、露光・現像により、感光性樹脂で流路を形成すればよい。
図２に示す方法は、基板２上に基板２とは異なる材料を堆積して移動部３を形成する方法であるが、その他の方法であってもよい。例えば、移動部３を形成する鋳型を微細加工技術で作製し、鋳型を転写することで、移動部を含む基板を一体的に形成してもよい。鋳型を転写する材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック等の電気絶縁性材料が挙げられる。なお、転写して作製した移動部を含む基板は、取扱いの利便性を向上するため、ガラス、プラスチック等の補助基板に貼り付けてもよい。また、微細加工技術に代え、３Ｄプリンタを用いて移動部を含む基板を形成してもよい。
第１電極４１及び第２電極４２の材料としては、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の金属などの導電性材料を用いればよい。また、第１電極４１及び第２電極４２に代え、測定用電極を基板側に形成する場合は、移動部３を形成する材料２１、または、移動部を一体的に形成した基板上にマスクをして、前記電極用の材料を蒸着することで作製すればよい。
電流計４３は、一般的に使用されている電流計を用いればよい。電圧印加手段４４は直流電流が流せればよく、公知の直流電圧源を用いればよい。例えば、電池等を用いればよい。増幅手段も、一般的に使用されているアンプを用いればよい。
可変抵抗４５及び固定抵抗４６を用いた場合、移動部３中の測定領域の電位差と、固定抵抗４６の両端の電位差を釣り合った状態にし、サンプルが移動部３に入った際の過渡電流の発生及びイオン電流の変化（定常電流からの変化）を、釣り合った状態からのズレとして測定することができるので、検出感度を高めることができる。なお、本願において「測定領域」とは、移動部３の途中の第１測定流路３３と第２測定流路３４の間の部分（又は、一対の測定用電極の間の部分）を意味する。また、「過渡電流」とは測定部４に瞬間的に流れるイオン電流を意味し、「定常電流」とは測定領域に定常的に流れているイオン電流を意味する。より具体的には、一定電圧下（駆動部８を駆動している状態）で可変抵抗４５の抵抗値を操作することで、固定抵抗４６と可変抵抗４５の各電位差を変化させることができる。移動部３中の測定領域の電位差と、固定抵抗４６の両端の電位差が釣り合うことで、キルヒホッフの法則に基づき、移動部３中の測定領域と、固定抵抗４６と第１電極４１及び第２電極４２を含む回路には電流が流れない状態が作られる。この状態でサンプルが流入すると、サンプル流入によるイオン電流の変化は、イオン電流が流れない状態からの差分として測定することができる。可変抵抗４５及び固定抵抗４６は、市販されているものを用いればよい。
解析部５は、測定部４で測定したイオン電流の値から、イオン量（サンプルから漏出したイオン量を含む）の経時変化を解析できる演算手段を含んでいる。なお、図１に示す実施形態では、解析部５と測定部４とは回路で繋がっていない。これは、電流計４３で測定した値を記憶媒体等に格納し、記憶媒体等に格納した値を解析部５で解析してもよいためである。勿論、測定部４と解析部５を回路で繋ぎ、電流計４３で測定した値を直接解析部５に送り、解析してもよい。解析部５で解析する方法としては、イオン電流の値から傾きを解析する方法、サンプル内の電荷を放出しながら流路を移動するサンプルのイオン電流の数理モデル（以下、単に「数理モデル」と記載することがある。）を用いた解析方法、機械学習を用いた解析方法等が挙げられる。
図３〜５を用いて、イオン電流の値から傾きを解析する方法について説明する。図３は、図１に示すデバイス１を用いて測定したイオン電流の値（強度）を示している。
先ず、測定の前に、ＰＢＳ、リン酸バッファー、ＴＢＥバッファー等の緩衝液を毛管現象で流路に導入し、次いで、サンプル液をサンプル投入部３１に投入する。次に、駆動部８を用いて電圧を印加すると、サンプルが、サンプル回収部３２に向けて移動する。サンプル投入部３１と移動部３の境界付近（図３中のaの位置）にサンプルが移動すると、測定部４は先ず過渡電流を測定する。次に、サンプルが、aの位置から移動部３と第１測定流路３３の接続部分（図３中のｂの位置）の付近に移動するまで、測定部４はイオン電流（定常電流）を測定する。そして、サンプルが測定領域（図３のｂからｃの位置）に位置する時、測定部４はイオン電流の大きな変化を測定する。そして、サンプルが、ｃの位置から移動部３とサンプル回収部３２の境界付近（図３中のｄの位置）に移動するまで、測定部４はイオン電流（定常電流）を測定し、そして、サンプルがサンプル回収部３２に出る際に、測定部４は過渡電流を測定する。本明細書において、「測定したイオン電流の値から傾きを解析する」とは、測定領域をサンプルが通過した際に、イオン電流が大きく変化した部分の傾きを解析することを意味する。
図４は、イオン電流の値から傾きを解析する方法の一例を示す図で、具体的手順は以下のとおりである。
（Ａ）サンプルが移動部３を通過する際のイオン電流の値（強度の変化）を測定する。
（Ｂ）サンプルが測定領域以外の移動部を通過した際のイオン電流の値から、近似直線（ベースライン、図４（Ｂ）中の直線）を演算する。
（Ｃ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の△）、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の□）を演算する。そして、演算した両点の中点（△及び□の横軸（時間軸）の中点。図４（Ｃ）の○）を演算する。
（Ｄ）サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の□）を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する（図４（Ｄ）の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図４（Ｄ）の○）。
（Ｅ）図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）で求めた２つの○を結んだ線の傾き（図４（Ｅ）の点線）を演算する。
（Ａ）サンプルが移動部３を通過する際のイオン電流の値（強度の変化）を測定する。
（Ｂ）サンプルが測定領域以外の移動部を通過した際のイオン電流の値から、近似直線（ベースライン、図４（Ｂ）中の直線）を演算する。
（Ｃ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の△）、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の□）を演算する。そして、演算した両点の中点（△及び□の横軸（時間軸）の中点。図４（Ｃ）の○）を演算する。
（Ｄ）サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図４（Ｃ）の□）を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する（図４（Ｄ）の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図４（Ｄ）の○）。
（Ｅ）図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）で求めた２つの○を結んだ線の傾き（図４（Ｅ）の点線）を演算する。
図５は、イオン電流の値から傾きを解析する方法の他の例を示す図で、具体的手順は以下のとおりである。
（Ａ）図４（Ａ）と同様である。
（Ｂ）図４（Ｂ）と同様である。
（Ｃ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の△）、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の□）を演算する。
（Ｄ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の△）を通り、イオン電流の大きな下向きの変化に近似する近似直線を演算する（図５（Ｄ）の左側の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図５（Ｄ）の左側の○）。
また、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の□）を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する（図５（Ｄ）の右側の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図５（Ｄ）の右側の○）。
（Ｅ）図５（Ｄ）で求めた２つの○を結んだ線の傾き（図５（Ｅ）の点線）を演算する。
（Ａ）図４（Ａ）と同様である。
（Ｂ）図４（Ｂ）と同様である。
（Ｃ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の△）、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の□）を演算する。
（Ｄ）サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の△）を通り、イオン電流の大きな下向きの変化に近似する近似直線を演算する（図５（Ｄ）の左側の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図５（Ｄ）の左側の○）。
また、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点（図５（Ｃ）の□）を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する（図５（Ｄ）の右側の鎖線）。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する（図５（Ｄ）の右側の○）。
（Ｅ）図５（Ｄ）で求めた２つの○を結んだ線の傾き（図５（Ｅ）の点線）を演算する。
なお、図４及び図５に示すイオン電流の値から傾きを解析する方法は単なる例示であって、その他の方法で解析してもよい。また、後述する実施例で示すとおり、解析部５（解析工程）は、傾きの解析に加え、個々のサンプルから傾きを解析した際の標準偏差、サンプルの体積分布について解析を行ってもよい。また、傾きは、図４及び図５に示す方法で解析した傾きをそのまま用いてもよいし、傾きをサンプルの体積で割った値を用いてもよい。傾きをサンプルの体積で割った値を用いると、サンプルの大きさにばらつきがある場合の分析に有用である。
解析部５は、パソコン等のコンピュータを接続することで形成してもよいし、デバイス１にＣＰＵ等の演算手段を組み込んで形成してもよい。
図６は、分析方法の原理を説明するための図である。図６（Ａ）はサンプルが非生物サンプルの場合、図６（Ｂ）はサンプルが生物サンプルの場合、のイオン電流の強度の変化を示している。サンプルが測定領域を通過する際、サンプルが大きいほどイオン電流の強度の変化幅（ベースラインとの距離）が大きくなる。そして、サンプルが測定領域を通過している間は、サンプルの大きさに変化がなければ、イオン電流の強度は、図６（Ａ）に示すとおり通常同じである。しかしながら、本発明者らは、サンプルが生物サンプルの場合、サンプルが測定領域を通過する間にイオン電流の強度が変化する（傾く）ことを新たに見出した。生物サンプルが測定領域を通過する間にイオン電流の強度が傾く理由は、移動部３にかかる電場の影響により、サンプルに穿孔が形成され、サンプルの内容物が外に漏れだすことで、移動部３に満たされる溶液中のイオン量が変化したためと考えられる。したがって、実施形態に係るデバイス又は分析方法で分析が可能な生物サンプルとしては、電圧をかけることで穿孔が形成されるものであれば特に制限はなく、細菌、酵母、細胞等が挙げられる。
従来の微小サンプルの測定用デバイスは、サンプルの測定感度を挙げるため、測定領域の体積は少ない（測定領域が短い）方が好ましいとされてきた。しかしながら、図６に示すように、実施形態に係るデバイス又は分析方法では、サンプルが測定領域を通過した時のイオン電流の傾きを解析している。したがって、誤差を少なくするためには、測定領域は所定の長さがあることが好ましい。例えば、測定対象サンプルの大きさ（図５（Ｄ）の左側の○とベースラインの電流値の差が粒子の体積と比例関係を持つことをもとに演算した平均粒子径）を１とした場合、測定領域の長さは、４０〜８０とすることが好ましく、６０〜８０とすることがより好ましい。４０より短いと傾きを計算する領域が少なくなり、傾きを解析し難くなる。一方、８０より長いと測定領域の全体の抵抗値が大きくなり、サンプルが測定領域に入った時の抵抗値の変化が相対的に小さくなり、その結果、イオン電流の下向きの変化が小さくなるため好ましくない。測定領域の長さは、図２に示す製造工程において、フォトマスクの形状で調節することができる。
次に、数理モデルを用いた解析方法について、説明する。図７は、数理モデルを構築するにあたっての概念図である。図７Ａは、サンプルが測定領域（Ｌは測定領域の長さを表す）を通過する際に、サンプルから電荷を有する内容物Ｑが外に漏出する場合の概念図である。一方、図７Ｂは、ポリスチレン等、サンプルが測定領域を通過する際に、サンプルから電荷を有する内容物Ｑが外に漏出しない場合の概念図である。また、ｔはサンプルが移動部（測定領域）を移動する時間軸を表し、ｔ1はサンプルの頭部が測定領域に到達する時間、ｔ2はサンプル尾部が測定領域に到達する時間、ｔ3はサンプル頭部が測定領域の出口に到達する時間、ｔ4はサンプル尾部が測定領域の出口に到達する時間、を表す。
そして、電場が存在するバッファー溶液中において、荷電粒子が一定速度ｖで移動するときの運動方程式、測定領域（断面積Ｓ、長さＬ）のイオン電流密度、時刻ｔにおける荷電量Ｑ等を総合的に勘案し、ｔ1＜ｔ＜ｔ2、及び、ｔ2＜ｔ＜ｔ3におけるイオン電流等の数理モデルを構築した。
本明細書において、「数理モデル」と記載した場合、少なくとも上記式（３）〜（５）を意味し、必要に応じて上記式（１）及び（２）を加えてもよい。そして、解析部（解析工程）は、上記数理モデルを用いて、以下の手順で解析を行う。
・実験の際の実測値である、t1、t2、I1、I2を式（３）〜（５）に代入する。また、用いたサンプルの半径（a）及びバッファー溶液の電荷密度を式（３）〜（５）に代入する。
・上記値を数理モデルに代入することで、v、β、ζを計算する。なお、本実施形態では、ｔ2＜ｔ＜ｔ3のデータを数理モデルにより解析をしているが、ｔ1＜ｔ＜ｔ2のデータからサンプルの移動速度ｖを求める場合は、実測値であるI1、I2の値を式（１）〜（２）に代入してｖについて解けばよい。
・上記式（３）の変数であるγ、式（４）の変数であるＱ0を調整し、測定したイオン電流の値と上記式（３）が、ｔ2＜ｔ＜ｔ3の区間で最小二乗フィットするγ及びＱ0を求める。
・同じ種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は同じになると推定できる。一方、異なる種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は異なると推定できる。そのため、サンプルの種類が異なれば、ｔ2＜ｔ＜ｔ3の区間で最小二乗フィットするγ及びＱ0の値も異なる。したがって、γ及びＱ0の値を比較することで、サンプルの種類を判別できる。
・実験の際の実測値である、t1、t2、I1、I2を式（３）〜（５）に代入する。また、用いたサンプルの半径（a）及びバッファー溶液の電荷密度を式（３）〜（５）に代入する。
・上記値を数理モデルに代入することで、v、β、ζを計算する。なお、本実施形態では、ｔ2＜ｔ＜ｔ3のデータを数理モデルにより解析をしているが、ｔ1＜ｔ＜ｔ2のデータからサンプルの移動速度ｖを求める場合は、実測値であるI1、I2の値を式（１）〜（２）に代入してｖについて解けばよい。
・上記式（３）の変数であるγ、式（４）の変数であるＱ0を調整し、測定したイオン電流の値と上記式（３）が、ｔ2＜ｔ＜ｔ3の区間で最小二乗フィットするγ及びＱ0を求める。
・同じ種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は同じになると推定できる。一方、異なる種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は異なると推定できる。そのため、サンプルの種類が異なれば、ｔ2＜ｔ＜ｔ3の区間で最小二乗フィットするγ及びＱ0の値も異なる。したがって、γ及びＱ0の値を比較することで、サンプルの種類を判別できる。
次に、機械学習を用いた解析方法について説明する。機械学習を用いた解析は、同じ種類のサンプルから測定したイオン電流の値を複数準備し、公知の機械学習手順を用いてサンプルを判別するための判別基準等を抽出し、アルゴリズムを発展させる方法で行えばよい。例えば、測定したイオン電流の値を機械学習する方法としては、国際公開第２０１７／１１０７５３号、特開２０１７−１２０２５７号公報等を参照することができる。
記憶部６は、解析した傾き、更に、必要に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等、数理モデル及びサンプル種類に応じた変数であるγ、Ｑ0等の値、機械学習のアルゴリズム等を記憶できれば特に制限はなく、公知の揮発性メモリ、不揮発性メモリ等を用いればよい。
判別部７は解析部５で解析した解析結果と、記憶部６に記憶したデータを対比し、サンプルの種類を判断できれば特に制限はなく、ＣＰＵ等が挙げられる。例えば、解析部５で解析した傾きと、記憶部６に記憶した傾きとを対比し、サンプルの種類を判別すればよい。判別部７は、必要に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等に基づき、サンプルの判別を行ってもよい。また、数理モデルに基づき解析を行う場合は、解析した変数γ、Ｑ0と、記憶部６に記憶した変数γ、Ｑ0とを対比し、サンプルの種類を判別すればよい。また、機械学習に基づき解析を行う場合は、記憶部６に記憶した機械学習のアルゴリズムにより測定したイオン電流の値を解析し、測定したサンプルの種類を判別部７で判別すればよい。
駆動部８の第３電極８１及び第４電極８２は、第１電極４１及び第２電極４２と同様の材料で形成すればよい。また、駆動部８に含まれる電圧印加手段８３も、測定部４の電圧印加手段４４と同様の直流電圧源を用いればよい。なお、上記のとおり、生物サンプルに電圧を印加すると、生物サンプルに穿孔が形成されると考えられる。図１に示す駆動部８は、第３電極８１をサンプル投入部３１に挿入し、第４電極８２をサンプル回収部３２に挿入している。そのため、電圧印加手段８３により移動部３に電圧を印加することで、サンプルが電界から受ける力により投入したサンプルをサンプル投入部３１からサンプル回収部３２に輸送（泳動）させる作用と、サンプルが生物サンプルの場合は、生物サンプルに穿孔を生じさせる作用を奏する。なお、駆動部８の電圧印加手段８３は、印加する電圧の大きさを調整可能としてもよい。調整可能な電圧印加手段８３としては、市販されている電圧調整が可能な直流電圧源を用いてもよいし、電池を用いる場合は、複数の電池を直列で接続すればよい。電圧を調整することで、生物サンプルの穿孔の形成程度を調整できると考えられる。なお、駆動部８における電圧印加手段８３の向き（＋、−の向き）は図１に示す方向に限定されず、サンプルの表面電荷に応じて逆方向としてもよい。又は、電圧印加手段８３の向きは固定し、サンプル回収部３２をサンプル投入部として用い、サンプル投入部３１をサンプル回収部として用いてもよい。電圧印加手段８３の向きを図１に示す向きと逆にした場合は、移動部３中の測定領域の電位差と、固定抵抗４６の両端の電位差を釣り合った状態にするために、電圧印加手段４４の向きも逆にすればよい。
なお、図１に示す駆動部８は、サンプルの駆動と穿孔の２つの作用を同時に実施できるので好ましい形態ではあるが、サンプルが移動部３を移動し穿孔が形成できれば特に制限はない。例えば、シリンジポンプ等を用いて移動部３をサンプルが移動できるようにするとともに、測定領域に電圧を印加する電極を形成することで、測定領域において生物サンプルに穿孔を形成してもよい。
なお、サンプルを分散する緩衝液については、濃度が濃すぎると、生物サンプルに穿孔が形成され内容物が外に漏れ出しても、イオン電流の測定値に反映しにくくなることが想定される。したがって、緩衝液の濃度は、投入したサンプルをサンプル投入部３１からサンプル回収部３２に移動させる作用を奏する範囲内で、可能な限り薄くする等、適宜調節することが好ましい。
図８は、デバイスの実施形態のその他の例を示す図である。図８中、図１と同じ番号は同じ機能を有する構成要素を意味する。図８に示すデバイス１−１は、基板２上に移動部３（流路）を形成することに代え、基板２３に測定領域に相当する貫通孔（ナノポア）２４を形成し、基板２３の一方の面側の少なくとも貫通孔２４を含む面とで緩衝液を充填する第１チャンバーを形成できる第１チャンバー部材２５、基板２３の他方の面側の少なくとも貫通孔２４を含む面とで緩衝液を充填する第２チャンバーを形成できる第２チャンバー部材２６とで、移動部３を形成している。デバイス１−１は、更に、測定部９、解析部５を少なくとも含んでいる。また、必要に応じて、記憶部６、判別部７を設けてもよい。なお、図８に示す実施形態では、解析部５と測定部９とは回路で繋がっていないが、図１に示す実施形態と同様に測定部９と解析部５を回路で繋いでもよい。
第１チャンバー部材２５及び第２チャンバー部材２６は、電気的および化学的に不活性な材料で形成することが好ましく、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ2、ＳｉＮ、Ａｌ2Ｏ3などが挙げられる。
第１チャンバー部材２５及び第２チャンバー部材２６は、貫通孔２４を挟むように形成されて、第１チャンバーに投入したサンプルが、貫通孔２４を通り第２チャンバーに移動できるように形成されている。なお、図示はしていないが、第１チャンバー部材２５及び第２チャンバー部材２６には、緩衝液及びサンプル液を充填・排出、電極及び／又はリードを挿入するための孔を必要に応じて形成してもよい。
測定部９は、第１チャンバー内の緩衝液と接する箇所に形成された第５電極９１、第２チャンバー内の緩衝液と接する個所に形成された第６電極９２、電流計９３を少なくとも含んでいる。第５電極９１及び第６電極９２を形成する材料は、第１電極４１及び第２電極４２と同じでよい。第１電９１及び第６電極９２は、貫通孔２４を挟むように形成し、直流電流を印加することで緩衝液中のイオンを輸送する。したがって、第５電極９１は、第１チャンバー内の緩衝液に接する場所に形成されていればよく、基板２３の面上、第１チャンバー部材２５の内面、又は第１チャンバー内の空間にリードを介して配置すればよい。第６電極９２も第５電極９１と同様に、第２チャンバー内の緩衝液に接する場所に形成されていればよく、基板２３の面上、第２チャンバー部材２６の内面、又は第２チャンバー内の空間にリードを介して配置すればよい。なお、図８に示す例では、第５電極９１は第１チャンバー部材２５の内面に、第６電極９２は第２チャンバー部材２６の内面にそれぞれ形成されているが、第５電極９１及び第６電極９２は、第１チャンバー部材２５及び第２チャンバー部材２６に形成した孔から挿入してもよい。
第５電極９１は、リードを介して電源９４、アース９５に接続している。第６電極９２は、リードを介して電流計９３、アース９６に接続している。なお、図８に示す例では、電源９４は第５電極９１側に、電流計９３は第６電極９２側に接続しているが、電源９４と電流計９３は、同じ電極側に設けてもよい。
電源９４は、第５電極９１及び第６電極９２に直流電流を通電できるものであれば特に制限はなく、電圧印加手段８３と同様の直流電圧源を用いればよい。電流計９３は、第５電極９１及び第６電極９２に通電した際に、発生するイオン電流を経時的に測定できるものであれば特に制限はなく、電流計４３と同様に、市販の電流計を用いればよい。なお、図８には図示していないが、必要に応じてノイズ除去回路や電圧安定化回路等を設けてもよい。
デバイス１−１の貫通孔２４をサンプルが通過すると、貫通孔２４を流れているイオン電流がサンプルにより遮断され、イオン電流が減少し、図３と同様にイオン電流が変化する。イオン量の経時変化は、解析部５で上記と同様に解析すればよい。なお、図８に示すデバイスは、貫通孔２４がイオン量の経時変化を解析するための測定領域に相当する。所期の測定領域の長さとするためには、基板２３の厚さを適宜調節すればよい。
デバイス１−１はデバイス１と異なり、測定部９は駆動部の役割も果たすことから、別途駆動部を設けなくてもイオン電流の値を測定することができる。勿論、デバイス１−１においても、駆動部と測定部を別々に設けてもよい。その場合、貫通孔２４を挟むように図１と同様の測定部４の第１電極４１と第２電極４２を設け、駆動部８の第３電極を第１チャンバーの貫通孔２４以外の部分、第４電極８２を第２チャンバーの貫通孔２４以外の部分に形成すればよい。
基板２３は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている電気絶縁性の材料であれば特に制限は無い。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、ＳｉＮ等が挙げられる。また、基板２３は、ＳｉＮ、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2等の材料を用い、固体メンブレンと呼ばれる薄膜状、または、グラフェン、酸化グラフェン、二酸化モリブデン（ＭｏＳ2）、窒化ホウ素（ＢＮ）等の材料を用い、２次元材料と呼ばれるシート状に形成してもよい。貫通孔２４は、貫通孔２４を形成する部分を電子線描画法により描画を行い、反応性イオンエッチング等により形成すればよい。
図９（Ａ）は、サンプルの分析方法の手順の一例を示すフローチャートである。
１．緩衝液に分散したサンプルを、デバイス１（１−１）に投入する（Ｓ１００）。
２．サンプルが移動部を移動した時のイオン電流の値を測定する（Ｓ１１０）。
３．測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化（例えば傾き、数理モデルを用いた変数）を解析する（Ｓ１２０）。
１．緩衝液に分散したサンプルを、デバイス１（１−１）に投入する（Ｓ１００）。
２．サンプルが移動部を移動した時のイオン電流の値を測定する（Ｓ１１０）。
３．測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化（例えば傾き、数理モデルを用いた変数）を解析する（Ｓ１２０）。
上記の工程により解析したイオン量の経時変化から、サンプルが生物サンプルであるのか、或いは、非生物サンプルであるのか判別できる。
図９（Ｂ）は、サンプルの分析方法の手順の他の例を示すフローチャートである。図９（Ｂ）に示す手順では、
３．（Ｓ１２０）において、経時変化として傾きを解析し、傾きの解析に加え、必要に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値も解析する。
４．解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等を、予め解析した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等と対比し、サンプルの種類を判別する（Ｓ１３０）。
３．（Ｓ１２０）において、経時変化として傾きを解析し、傾きの解析に加え、必要に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値も解析する。
４．解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等を、予め解析した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等と対比し、サンプルの種類を判別する（Ｓ１３０）。
後述する実施例に示すとおり、サンプルの種類に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布等が異なる。したがって、図９（Ｂ）に示す分析方法では、生物サンプルの種類も判別できる。また、数理モデルを用いて変数γ、Ｑ0を求める方法や機械学習を用いた方法でも、生物サンプルの種類を判別できる。
以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、この実施例は具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、本願で開示する発明の範囲を限定、あるいは制限することを表すものではない。
〔デバイス１の作製〕
＜実施例１＞
以下の手順により、デバイス１を作製した。
（１）厚さ６００μｍのシリコン基板２（フェローテックシリコン社製 直径７６ｍｍ）を準備した。
（２）ネガ型フォトレジストＳＵ−８ ３００５（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）をスピンコータにより塗布した。
（３）フォトリソグラフィにより、移動部を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光した。露光後は、ＳＵ−８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）を用いてレジストを現像した。現像後は、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤーで水分を飛ばし乾燥させ、鋳型を作製した。
（４）作製した鋳型に、ポリジメチルシロキサン（東レ社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）を流し込み、硬化させた。
（５）硬化したＰＤＭＳを鋳型から取り外し、次いで、市販のカバーガラス（厚み：０．１７ｍｍ）をＰＤＭＳに密着させた。図１０は、作製した基板の写真で、移動部３の長さは１５０μｍ、幅は３．０μｍ、深さは８．２μｍであった。第１測定流路３３及び第２測定流路３４の深さは８．２μｍ、移動部３との接続部分の長さは３．０μｍで、移動部３と第１測定流路３３の角度は約６０°であった。また、移動部３を挟んだ第２測定流路３４と第１測定流路３３の位置のズレ（第１測定流路３３の端部と第２測定流路３４の端部の長さ）は、８０μｍであった。サンプル投入部３１及びサンプル回収部３２の深さは８．２μｍであった。
（６）次に、駆動部８を作製した。第３電極８１及び第４電極８２は、電線（オヤイデ電気社製ＦＴＶＳ−４０８）の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。電圧印加手段８３は、電池を挿入した電池ボックス（誠南工業社製）を用いた。第３電極８１はサンプル投入部３１に、第４電極８２サンプル回収部３２に挿入した。
（７）次に、測定部４を作製した。第１電極４１及び第２電極４２は、電線（オヤイデ電気社製ＦＴＶＳ−４０８）の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。増幅手段は、ＦＥＭＴＯ社製Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｇａｉｎ Ｌｏｗ Ｎｏｉｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒを用いた。電圧印加手段４４は、電池を挿入した電池ボックス（誠南工業社製）を用いた。可変抵抗４５は、ＢＩ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製精密ポテンションメーターを用いた。電流計４３は、増幅手段で増幅したシグナルをＵＳＢ−ＤＡＱ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いてＰＣ用の電気信号に変換し、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて作成したソフトウェアで読み取った。固定抵抗４６は、金属皮膜抵抗（１ｋΩ パナソニック製）を用いた。第１電極４１は第１測定流路３３に、第２電極４２は第２測定流路３４に挿入した。
＜実施例１＞
以下の手順により、デバイス１を作製した。
（１）厚さ６００μｍのシリコン基板２（フェローテックシリコン社製 直径７６ｍｍ）を準備した。
（２）ネガ型フォトレジストＳＵ−８ ３００５（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）をスピンコータにより塗布した。
（３）フォトリソグラフィにより、移動部を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光した。露光後は、ＳＵ−８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）を用いてレジストを現像した。現像後は、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤーで水分を飛ばし乾燥させ、鋳型を作製した。
（４）作製した鋳型に、ポリジメチルシロキサン（東レ社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）を流し込み、硬化させた。
（５）硬化したＰＤＭＳを鋳型から取り外し、次いで、市販のカバーガラス（厚み：０．１７ｍｍ）をＰＤＭＳに密着させた。図１０は、作製した基板の写真で、移動部３の長さは１５０μｍ、幅は３．０μｍ、深さは８．２μｍであった。第１測定流路３３及び第２測定流路３４の深さは８．２μｍ、移動部３との接続部分の長さは３．０μｍで、移動部３と第１測定流路３３の角度は約６０°であった。また、移動部３を挟んだ第２測定流路３４と第１測定流路３３の位置のズレ（第１測定流路３３の端部と第２測定流路３４の端部の長さ）は、８０μｍであった。サンプル投入部３１及びサンプル回収部３２の深さは８．２μｍであった。
（６）次に、駆動部８を作製した。第３電極８１及び第４電極８２は、電線（オヤイデ電気社製ＦＴＶＳ−４０８）の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。電圧印加手段８３は、電池を挿入した電池ボックス（誠南工業社製）を用いた。第３電極８１はサンプル投入部３１に、第４電極８２サンプル回収部３２に挿入した。
（７）次に、測定部４を作製した。第１電極４１及び第２電極４２は、電線（オヤイデ電気社製ＦＴＶＳ−４０８）の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。増幅手段は、ＦＥＭＴＯ社製Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｇａｉｎ Ｌｏｗ Ｎｏｉｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒを用いた。電圧印加手段４４は、電池を挿入した電池ボックス（誠南工業社製）を用いた。可変抵抗４５は、ＢＩ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製精密ポテンションメーターを用いた。電流計４３は、増幅手段で増幅したシグナルをＵＳＢ−ＤＡＱ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いてＰＣ用の電気信号に変換し、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて作成したソフトウェアで読み取った。固定抵抗４６は、金属皮膜抵抗（１ｋΩ パナソニック製）を用いた。第１電極４１は第１測定流路３３に、第２電極４２は第２測定流路３４に挿入した。
〔デバイス１を用いた測定１：非サンプルとサンプルの比較〕
＜実施例２＞
５×ＴＢＥバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｉｒｉｓ、和光社製のホウ酸、及び和光社製のＥＤＴＡが、それぞれ、０．４５Ｍ、０．４５Ｍ、及び０．０１Ｍとなるように蒸留水に溶解させたもの）に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ ７００６９９）及び蛍光マイクロビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ）を分散することで、非生物サンプルと生物サンプルの混合サンプル液を作製した。黄色ブドウ球菌は、細胞膜染色試薬ＦＭ１−４３（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）社製）を混合サンプル液に加えることで染色した。なお、黄色ブドウ球菌及び蛍光マイクロビーズの大きさは、ほぼ同じ（直径約１μｍ）である。次に、５×ＴＢＥバッファーを毛管現象により移動部（流路）に導入し、作製したサンプル液３０μｌをサンプル投入部３１に投入し、駆動部８に５０Ｖの電圧を印加した。また、測定部４には、１８Ｖの電圧を印加した。可変抵抗４５を操作し、駆動部８及び測定部４の見かけ上の抵抗を釣り合った状態にし、サンプルが移動部３を移動した際のイオン電流の値を測定した。
＜実施例２＞
５×ＴＢＥバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｉｒｉｓ、和光社製のホウ酸、及び和光社製のＥＤＴＡが、それぞれ、０．４５Ｍ、０．４５Ｍ、及び０．０１Ｍとなるように蒸留水に溶解させたもの）に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ ７００６９９）及び蛍光マイクロビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ）を分散することで、非生物サンプルと生物サンプルの混合サンプル液を作製した。黄色ブドウ球菌は、細胞膜染色試薬ＦＭ１−４３（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）社製）を混合サンプル液に加えることで染色した。なお、黄色ブドウ球菌及び蛍光マイクロビーズの大きさは、ほぼ同じ（直径約１μｍ）である。次に、５×ＴＢＥバッファーを毛管現象により移動部（流路）に導入し、作製したサンプル液３０μｌをサンプル投入部３１に投入し、駆動部８に５０Ｖの電圧を印加した。また、測定部４には、１８Ｖの電圧を印加した。可変抵抗４５を操作し、駆動部８及び測定部４の見かけ上の抵抗を釣り合った状態にし、サンプルが移動部３を移動した際のイオン電流の値を測定した。
図１１（Ａ）は測定したイオン電流の値の生データ、図１１（Ｂ）は黄色ブドウ球菌のイオン電流の値、図１１（Ｃ）は蛍光マイクロビーズのイオン電流の値を示している。また、図１１（Ｂ）に黄色ブドウ球菌の蛍光顕微鏡写真、図１１（Ｃ）に蛍光マイクロビーズの蛍光顕微鏡写真も併せて示す。なお、測定領域をサンプルが通過する際のシグナルは、測定と同時に蛍光顕微鏡で観察することで、黄色ブドウ球菌又は蛍光マイクロビーズの何れのシグナルであるのか確認を行いながら測定した。図１１（Ｄ）は図１１（Ｂ）及び図１１（Ｃ）の測定結果を２０個ずつ重ね合わせたイオン電流の値を示している。図１１（Ｄ）から明らかなように、非生物サンプル（蛍光マイクロビーズ）と生物サンプル（黄色ブドウ球菌）では、サンプルが測定領域を通過する際の傾きが明らかに違うことを確認した。
〔デバイス１を用いた測定２：生物サンプルの比較〕
＜実施例３＞
サンプルとして、以下の菌を用いた以外は、実施例２と同様にイオン電流の値を測定し、それぞれ、測定結果を２０個重ね合わせた。
（Ａ）表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；ＡＴＣＣ １４９９０）
（Ｂ）実施例２と同様の黄色ブドウ球菌（ただし、染色をしていない。）
（Ｃ）殺菌（熱変性）した黄色ブドウ球菌（上記黄色ブドウ球菌を、オートクレーブを用１２０℃で２０分加熱した。）
＜実施例３＞
サンプルとして、以下の菌を用いた以外は、実施例２と同様にイオン電流の値を測定し、それぞれ、測定結果を２０個重ね合わせた。
（Ａ）表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；ＡＴＣＣ １４９９０）
（Ｂ）実施例２と同様の黄色ブドウ球菌（ただし、染色をしていない。）
（Ｃ）殺菌（熱変性）した黄色ブドウ球菌（上記黄色ブドウ球菌を、オートクレーブを用１２０℃で２０分加熱した。）
図１２（Ａ）は表皮ブドウ球菌、図１２（Ｂ）は黄色ブドウ球菌、図１２（Ｃ）は熱変性した黄色ブドウ球菌、の測定結果を示している。図１２（Ａ）〜（Ｃ）の結果から、菌の状態（生菌または殺菌）にかかわらず、測定領域を通過する際のイオン電流は傾きを示した。この結果から、生物サンプルの場合、生死の状態にかかわらず、非生物サンプルと区別できることが明らかとなった。
〔デバイス１を用いた測定３：データ解析の例〕
＜実施例４＞
図１３（Ａ）は、実施例２で測定した黄色ブドウ球菌の体積を横軸、電流［ｐＡ］／時間［ｍｓ］を縦軸にプロットした図である。なお、横軸の体積は図５（Ｄ）の左側の○とベースラインの電流値の差が粒子の体積と比例関係を持つことをもとに演算した値である。また、縦軸の傾き（ｓｌｏｐｅ ａｎｇｌｅ）は図４に示す手順で求めた値で、電流［ｐＡ］／時間［ｍｓ］は傾きの単位（単位時間当たりの電流値の変化）を表す。したがって、図１３（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、細菌の大きさが異なる場合であっても、傾きを体積で割ることで、図１３（Ｄ）に示すように同じように比較できることが明らかとなった。
＜実施例４＞
図１３（Ａ）は、実施例２で測定した黄色ブドウ球菌の体積を横軸、電流［ｐＡ］／時間［ｍｓ］を縦軸にプロットした図である。なお、横軸の体積は図５（Ｄ）の左側の○とベースラインの電流値の差が粒子の体積と比例関係を持つことをもとに演算した値である。また、縦軸の傾き（ｓｌｏｐｅ ａｎｇｌｅ）は図４に示す手順で求めた値で、電流［ｐＡ］／時間［ｍｓ］は傾きの単位（単位時間当たりの電流値の変化）を表す。したがって、図１３（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、細菌の大きさが異なる場合であっても、傾きを体積で割ることで、図１３（Ｄ）に示すように同じように比較できることが明らかとなった。
〔デバイス１を用いた測定４：様々な細菌の判別〕
＜実施例５＞
サンプルとして、以下の菌を用いた。
（Ａ）実施例３と同様の表皮ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
（Ｂ）実施例３と同様の黄色ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
（Ｃ）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＡＴＣＣ ６６３３）。グラム陽性。桿菌。
（Ｄ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；タカラバイオ社製ＪＭ１０９）。グラム陰性。桿菌。
各サンプルは、実施例２と同様の手順でイオン電流の値を測定した。そして、個々の菌について、図４に示す手順で傾きを解析し、横軸をサンプルの体積、縦軸を［傾き／サンプルの体積］としてプロットした。
＜実施例５＞
サンプルとして、以下の菌を用いた。
（Ａ）実施例３と同様の表皮ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
（Ｂ）実施例３と同様の黄色ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
（Ｃ）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ＡＴＣＣ ６６３３）。グラム陽性。桿菌。
（Ｄ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；タカラバイオ社製ＪＭ１０９）。グラム陰性。桿菌。
各サンプルは、実施例２と同様の手順でイオン電流の値を測定した。そして、個々の菌について、図４に示す手順で傾きを解析し、横軸をサンプルの体積、縦軸を［傾き／サンプルの体積］としてプロットした。
図１４（Ａ）〜（Ｄ）は、上記サンプル（Ａ）〜（Ｄ）のプロットと［傾き／サンプルの体積］の分布、図１４（Ｅ）は各サンプルの［傾き／サンプルの体積］、図１４（Ｆ）は各サンプルの［傾き／サンプルの体積］のばらつき（標準偏差）を表す。図１４（Ｅ）に示すように、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、［傾き／サンプルの体積］のみを見た場合は、サンプルの判別は困難であるが、標準偏差（サンプルのばらつき）及び／又はサンプルの体積分布も併せて対比することで、細菌の種類を判別できることが明らかとなった。
また、図１４（Ａ）及び（Ｂ）の球菌と、図１４（Ｃ）及び（Ｄ）の桿菌とでは、図１４（Ａ）〜（Ｄ）に示すプロット及び図１４（Ｆ）に示す標準偏差から明らかなように、球菌の方が［傾き／サンプルの体積］のばらつきが大きかった。この結果より、［傾き／サンプルの体積］及び標準偏差を解析することで、サンプルが球菌であるのか、或いは、桿菌であるのか判別することもできる。
更に、図１４（Ｅ）に示すように、グラム陰性菌である大腸菌の［傾き／サンプルの体積］の値は、グラム陽性菌である表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及び枯草菌の値より、大きかった。細菌の細胞表層の膜厚は、グラム陰性菌の場合は１０ｎｍ程度、グラム陽性菌の場合は１０〜１００ｎｍ程度である（青木健次編著、「基礎生物学テキストシリーズ４ 微生物学」、第４版、（株）化学同人、２０１０年９月２０日、ｐ５５−５６）。グラム陰性菌の方が［傾き／サンプルの体積］の値が大きかった理由として、細胞膜が薄いことから、駆動部により電場をかけることでグラム陽性菌より細胞膜に穿孔があきやすく、細胞内物質が移動部により多く漏れ出したためと考えられる。
〔デバイス１を用いた測定５：数理モデルを用いた解析〕
＜実施例６＞
サンプルとして、以下の菌を用いた。
（Ａ）実施例５と同様の枯草菌。
（Ｂ）実施例５と同様の大腸菌。
（Ｃ）実施例２と同様の黄色ブドウ球菌。
（Ｄ）バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ７００６９９）
各サンプルは、実施例２と同様の手順でイオン電流の値を測定した。図１５（Ａ）乃至（Ｄ）は、順に、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌のイオン電流の測定結果を示すグラフである。
＜実施例６＞
サンプルとして、以下の菌を用いた。
（Ａ）実施例５と同様の枯草菌。
（Ｂ）実施例５と同様の大腸菌。
（Ｃ）実施例２と同様の黄色ブドウ球菌。
（Ｄ）バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ７００６９９）
各サンプルは、実施例２と同様の手順でイオン電流の値を測定した。図１５（Ａ）乃至（Ｄ）は、順に、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌のイオン電流の測定結果を示すグラフである。
次に、以下の数理モデルに、表１に示す実測値、定数を代入し、ｔ2＜ｔ＜ｔ3の区間で最小二乗フィットするγ及びＱ0を求めた。なお、求めたγ及びＱ0の値も表１に示す。
なお、上記表１の中で、ｔ1、ｔ2、I1、I2は実測値、aは黄色ブドウ球菌の大きさを基準として決定したサンプルの半径、ρ0は５×ＴＢＥバッファーから見積もられる電解質の電荷密度、v、βおよびζは前述の値を数理モデルに代入して得られる計算値である。ここで、aの値は、サンプルに依らず一定値としている。aの値を一定値とした場合、サンプルのイオン電流の変化を測定し、測定結果から求めた最小二乗フィットするγ及びＱ0は、aの値を基準値とした相対的な値として得られる。相対的なγ及びＱ0の値は、サンプルが同じであれば同じ値になり、サンプルが異なれば異なる値となる。したがって、ａの値を一定値としても、サンプルの判別に支障はない。勿論、サンプルの大きさを正確に測定できる場合は、ａとして実際のサンプルの大きさを代入してもよい。
上記表１に示すように、最小二乗フィットするためのγ及びＱ0の値は、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌で明らかに異なっており、数理モデルを用いた解析でも、異なる種類のサンプルの判別ができた。
なお、薬剤耐性菌は、マイクロ流路や孔をサンプルが通過する際のイオン電流の変化では判別できず、ＤＮＡを用いた判別法が一般的に用いられてきた。一方、本明細書で開示する方法により、薬剤耐性を獲得したバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌の判別ができた。その理由としては、黄色ブドウ球菌はバンコマイシン耐性を獲得した後は細胞壁が厚くなることが知られており、黄色ブドウ球菌とバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌が移動部を移動する際に、穿孔から漏出するイオン量が異なり、漏出したイオン量の差を解析できたためと考えられる。
以上のとおり、測定領域を通過する際のイオン電流の値を測定するデバイスを用いたサンプルの分析方法において、測定領域を通過する際のサンプルから漏出したイオン量も含めてイオン量の経時変化を解析することで、より詳細な分析ができることが明らかとなった。
本願のデバイスおよび分析方法を用いることで、サンプルの大きさのみでなく、サンプルの種類を判別することができる。したがって、企業、研究機関等において、サンプルを正確に分析するための測定機器の開発に有用である。
１…デバイス、１−１…デバイス、２…基板、２１…エッチング可能な材料、２２…ポジ型フォトレジスト、２３…基板、２４…貫通孔、２５…第１チャンバー部材、２６…第２チャンバー部材、３…移動部、３１…サンプル投入部、３２…サンプル回収部、３３…第１測定流路、３４…第２測定流路、４…測定部、４１…第１電極、４２…第２電極、４３…電流計、４４…電圧印加手段、４５…可変抵抗、４６…固定抵抗、５…解析部、６…記憶部、７…判別部、８…駆動部、８１…第３電極、８２…第４電極、８３…電圧印加手段、９…測定部、９１…第５電極、９２…第６電極、９３…電流計、９４…電源、９５…アース、９６…アース
Claims (15)
- サンプル分析用デバイスを用いたサンプルの分析方法であって、
前記サンプル分析用デバイスは、
前記サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成された測定領域、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
を少なくとも含み、
前記分析方法は、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定工程、
前記測定工程で測定したイオン電流の値の内、前記サンプルが前記測定領域を通過した時のイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析工程、
を少なくとも含み、
前記イオン量の経時変化を解析する解析工程が、前記サンプルが前記測定領域を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含めて解析できる、
分析方法。 - 前記解析工程が、前記サンプルの尾部が前記測定領域に到達し、前記サンプルの頭部が前記測定領域の出口に到達するまでのイオン電流の値から傾きを解析する、
請求項１に記載の分析方法。 - 前記解析工程が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
請求項２に記載の分析方法。 - 前記解析工程で解析した傾きを、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾きと対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、請求項２に記載の分析方法。 - 前記解析工程で解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布を、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布と対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、請求項３に記載の分析方法。 - 前記傾きに代え、前記傾きをサンプルの体積で割った値を用いる、
請求項２〜５の何れか一項に記載の分析方法、 - 前記解析工程が、下記に示す数理モデルを用いる、
請求項１に記載の分析方法。
- サンプル分析用デバイスであって、該デバイスは、
サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成された測定領域、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
前記測定部で測定したイオン電流の値の内、前記サンプルが前記測定領域を通過した時のイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析部、を少なくとも含み、
前記イオン量の経時変化を解析する解析部が、前記サンプルが前記測定領域を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含めて解析できる、
デバイス。 - 前記解析部が、前記サンプルの尾部が前記測定領域に到達し、前記サンプルの頭部が前記測定領域の出口に到達するまでのイオン電流の値から傾きを解析する、
請求項８に記載のデバイス。 - 前記解析部が、前記傾きの標準偏差、及び／又はサンプルの体積分布も解析する、
請求項９に記載のデバイス。 - 予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾きを少なくとも記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾きと前記記憶部に記憶した傾きを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む、請求項９に記載のデバイス。 - 予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布を記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布と、前記記憶部に記憶した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び／又はサンプルの体積分布とを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む請求項１０に記載のデバイス。 - 前記傾きに代え、前記傾きをサンプル体積で割った値を用いる、
請求項９〜１２の何れか一項に記載のデバイス。 - 前記解析部が、下記に示す数理モデルを用いる、
請求項８に記載のデバイス。
- 前記移動部に電場を形成できる駆動部を含み、前記駆動部は電場の大きさを変更できる電圧印加手段を有する、
請求項８〜１４の何れか一項に記載のデバイス。
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