JP6846719B2 - サンプルの分析方法、及びサンプル分析用デバイス - Google Patents
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Description
前記サンプル分析用デバイスは、
前記サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
を少なくとも含み、
前記分析方法は、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定工程、
前記測定工程で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析工程、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
分析方法。
(2)前記解析工程が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記(1)に記載の分析方法。
(3)前記解析工程が、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布も解析する、
上記(2)に記載の分析方法。
(4)前記解析工程で解析した傾きを、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾きと対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記(2)に記載の分析方法。
(5)前記解析工程で解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布を、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布と対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、上記(3)に記載の分析方法。
(6)前記傾きに代え、前記傾きをサンプルの体積で割った値を用いる、
上記(2)〜(5)の何れか一つに記載の分析方法、
(7)前記解析工程が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記(1)に記載の分析方法。
サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成され、前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
前記測定部で測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析部、
を少なくとも含み、
前記イオン量が、前記サンプルが前記移動部を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含む、
デバイス。
(9)前記解析部が、測定したイオン電流の値から少なくとも傾きを解析する、
上記(8)に記載のデバイス。
(10)前記解析部が、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布も解析する、
上記(9)に記載のデバイス。
(11)予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾きを少なくとも記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾きと前記記憶部に記憶した傾きを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む、上記(9)に記載のデバイス。
(12)予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布を記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布と、前記記憶部に記憶した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布とを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む上記(10)に記載のデバイス。
(13)前記傾きに代え、前記傾きをサンプル体積で割った値を用いる、
上記(9)〜(12)の何れか一つに記載のデバイス。
(14)前記解析部が、下記に示す数理モデルを用いる、
上記(8)に記載のデバイス。
上記(8)〜(14)の何れか一つに記載のデバイス。
(1)基板2の上に、エッチング可能な材料21を化学蒸着で形成する。
(2)ポジ型フォトレジスト22をスピンコータで塗布する。
(3)移動部3を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光・現像処理し、流路を形成する部分のポジ型フォトレジスト22を除去する。
(4)移動部3を形成する箇所の材料21をエッチングし、移動部(流路)を形成する。
(5)ポジ型フォトレジスト22を除去することで、基板2上に移動部3を形成する。
(A)サンプルが移動部3を通過する際のイオン電流の値(強度の変化)を測定する。
(B)サンプルが測定領域以外の移動部を通過した際のイオン電流の値から、近似直線(ベースライン、図4(B)中の直線)を演算する。
(C)サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点(図4(C)の△)、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点(図4(C)の□)を演算する。そして、演算した両点の中点(△及び□の横軸(時間軸)の中点。図4(C)の○)を演算する。
(D)サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点(図4(C)の□)を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する(図4(D)の鎖線)。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する(図4(D)の○)。
(E)図4(C)及び図4(D)で求めた2つの○を結んだ線の傾き(図4(E)の点線)を演算する。
(A)図4(A)と同様である。
(B)図4(B)と同様である。
(C)サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点(図5(C)の△)、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点(図5(C)の□)を演算する。
(D)サンプルが測定領域に入った時のイオン電流の大きな下向きの変化とベースラインが交わる点(図5(C)の△)を通り、イオン電流の大きな下向きの変化に近似する近似直線を演算する(図5(D)の左側の鎖線)。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する(図5(D)の左側の○)。
また、サンプルが測定領域から出た時のイオン電流の大きな上向きの変化とベースラインが交わる点(図5(C)の□)を通り、イオン電流の大きな上向きの変化に近似する近似直線を演算する(図5(D)の右側の鎖線)。そして、イオン電流の強度が鎖線からそれる点を演算する(図5(D)の右側の○)。
(E)図5(D)で求めた2つの○を結んだ線の傾き(図5(E)の点線)を演算する。
・実験の際の実測値である、t1、t2、I1、I2を式(3)〜(5)に代入する。また、用いたサンプルの半径(a)及びバッファー溶液の電荷密度を式(3)〜(5)に代入する。
・上記値を数理モデルに代入することで、v、β、ζを計算する。なお、本実施形態では、t2<t<t3のデータを数理モデルにより解析をしているが、t1<t<t2のデータからサンプルの移動速度vを求める場合は、実測値であるI1、I2の値を式(1)〜(2)に代入してvについて解けばよい。
・上記式(3)の変数であるγ、式(4)の変数であるQ0を調整し、測定したイオン電流の値と上記式(3)が、t2<t<t3の区間で最小二乗フィットするγ及びQ0を求める。
・同じ種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は同じになると推定できる。一方、異なる種類のサンプルであれば、サンプルから漏出するイオン量は異なると推定できる。そのため、サンプルの種類が異なれば、t2<t<t3の区間で最小二乗フィットするγ及びQ0の値も異なる。したがって、γ及びQ0の値を比較することで、サンプルの種類を判別できる。
1.緩衝液に分散したサンプルを、デバイス1(1−1)に投入する(S100)。
2.サンプルが移動部を移動した時のイオン電流の値を測定する(S110)。
3.測定したイオン電流の値から、イオン量の経時変化(例えば傾き、数理モデルを用いた変数)を解析する(S120)。
3.(S120)において、経時変化として傾きを解析し、傾きの解析に加え、必要に応じて、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値も解析する。
4.解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等を、予め解析した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、傾きの標準偏差、サンプルの体積分布、傾きをサンプルの体積で割った値等と対比し、サンプルの種類を判別する(S130)。
<実施例1>
以下の手順により、デバイス1を作製した。
(1)厚さ600μmのシリコン基板2(フェローテックシリコン社製 直径76mm)を準備した。
(2)ネガ型フォトレジストSU−8 3005(MICRO CHEM社製)をスピンコータにより塗布した。
(3)フォトリソグラフィにより、移動部を形成する箇所に光が照射するように、フォトマスクを用いて露光した。露光後は、SU−8 developer(MICRO CHEM社製)を用いてレジストを現像した。現像後は、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤーで水分を飛ばし乾燥させ、鋳型を作製した。
(4)作製した鋳型に、ポリジメチルシロキサン(東レ社製、SILPOT184)を流し込み、硬化させた。
(5)硬化したPDMSを鋳型から取り外し、次いで、市販のカバーガラス(厚み:0.17mm)をPDMSに密着させた。図10は、作製した基板の写真で、移動部3の長さは150μm、幅は3.0μm、深さは8.2μmであった。第1測定流路33及び第2測定流路34の深さは8.2μm、移動部3との接続部分の長さは3.0μmで、移動部3と第1測定流路33の角度は約60°であった。また、移動部3を挟んだ第2測定流路34と第1測定流路33の位置のズレ(第1測定流路33の端部と第2測定流路34の端部の長さ)は、80μmであった。サンプル投入部31及びサンプル回収部32の深さは8.2μmであった。
(6)次に、駆動部8を作製した。第3電極81及び第4電極82は、電線(オヤイデ電気社製FTVS−408)の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。電圧印加手段83は、電池を挿入した電池ボックス(誠南工業社製)を用いた。第3電極81はサンプル投入部31に、第4電極82サンプル回収部32に挿入した。
(7)次に、測定部4を作製した。第1電極41及び第2電極42は、電線(オヤイデ電気社製FTVS−408)の皮を剥いで金属部分を露出させて作製した。増幅手段は、FEMTO社製Variable Gain Low Noise Current Amplifierを用いた。電圧印加手段44は、電池を挿入した電池ボックス(誠南工業社製)を用いた。可変抵抗45は、BI Technologies社製精密ポテンションメーターを用いた。電流計43は、増幅手段で増幅したシグナルをUSB−DAQ(National Instruments社製)を用いてPC用の電気信号に変換し、Lab View(National Instruments社製)を用いて作成したソフトウェアで読み取った。固定抵抗46は、金属皮膜抵抗(1kΩ パナソニック製)を用いた。第1電極41は第1測定流路33に、第2電極42は第2測定流路34に挿入した。
<実施例2>
5×TBEバッファー(Life Technologies社製のTiris、和光社製のホウ酸、及び和光社製のEDTAが、それぞれ、0.45M、0.45M、及び0.01Mとなるように蒸留水に溶解させたもの)に、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus;ATCC 700699)及び蛍光マイクロビーズ(Polyscience社製Fluoresbrite)を分散することで、非生物サンプルと生物サンプルの混合サンプル液を作製した。黄色ブドウ球菌は、細胞膜染色試薬FM1−43(サーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific Inc.)社製)を混合サンプル液に加えることで染色した。なお、黄色ブドウ球菌及び蛍光マイクロビーズの大きさは、ほぼ同じ(直径約1μm)である。次に、5×TBEバッファーを毛管現象により移動部(流路)に導入し、作製したサンプル液30μlをサンプル投入部31に投入し、駆動部8に50Vの電圧を印加した。また、測定部4には、18Vの電圧を印加した。可変抵抗45を操作し、駆動部8及び測定部4の見かけ上の抵抗を釣り合った状態にし、サンプルが移動部3を移動した際のイオン電流の値を測定した。
<実施例3>
サンプルとして、以下の菌を用いた以外は、実施例2と同様にイオン電流の値を測定し、それぞれ、測定結果を20個重ね合わせた。
(A)表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis;ATCC 14990)
(B)実施例2と同様の黄色ブドウ球菌(ただし、染色をしていない。)
(C)殺菌(熱変性)した黄色ブドウ球菌(上記黄色ブドウ球菌を、オートクレーブを用120℃で20分加熱した。)
<実施例4>
図13(A)は、実施例2で測定した黄色ブドウ球菌の体積を横軸、電流[pA]/時間[ms]を縦軸にプロットした図である。なお、横軸の体積は図5(D)の左側の○とベースラインの電流値の差が粒子の体積と比例関係を持つことをもとに演算した値である。また、縦軸の傾き(slope angle)は図4に示す手順で求めた値で、電流[pA]/時間[ms]は傾きの単位(単位時間当たりの電流値の変化)を表す。したがって、図13(B)及び(C)に示すように、細菌の大きさが異なる場合であっても、傾きを体積で割ることで、図13(D)に示すように同じように比較できることが明らかとなった。
<実施例5>
サンプルとして、以下の菌を用いた。
(A)実施例3と同様の表皮ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
(B)実施例3と同様の黄色ブドウ球菌。グラム陽性。球菌。
(C)枯草菌(Bacillus subtilis;ATCC 6633)。グラム陽性。桿菌。
(D)大腸菌(Escherichia coli;タカラバイオ社製JM109)。グラム陰性。桿菌。
各サンプルは、実施例2と同様の手順でイオン電流の値を測定した。そして、個々の菌について、図4に示す手順で傾きを解析し、横軸をサンプルの体積、縦軸を[傾き/サンプルの体積]としてプロットした。
<実施例6>
サンプルとして、以下の菌を用いた。
(A)実施例5と同様の枯草菌。
(B)実施例5と同様の大腸菌。
(C)実施例2と同様の黄色ブドウ球菌。
(D)バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(ATCC 700699)
各サンプルは、実施例2と同様の手順でイオン電流の値を測定した。図15(A)乃至(D)は、順に、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌のイオン電流の測定結果を示すグラフである。
Claims (15)
- サンプル分析用デバイスを用いたサンプルの分析方法であって、
前記サンプル分析用デバイスは、
前記サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成された測定領域、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
を少なくとも含み、
前記分析方法は、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定工程、
前記測定工程で測定したイオン電流の値の内、前記サンプルが前記測定領域を通過した時のイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析工程、
を少なくとも含み、
前記イオン量の経時変化を解析する解析工程が、前記サンプルが前記測定領域を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含めて解析できる、
分析方法。 - 前記解析工程が、前記サンプルの尾部が前記測定領域に到達し、前記サンプルの頭部が前記測定領域の出口に到達するまでのイオン電流の値から傾きを解析する、
請求項1に記載の分析方法。 - 前記解析工程が、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布も解析する、
請求項2に記載の分析方法。 - 前記解析工程で解析した傾きを、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾きと対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、請求項2に記載の分析方法。 - 前記解析工程で解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布を、予め測定した各種サンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布と対比し、サンプルの種類を判別する判別工程、
を更に含む、請求項3に記載の分析方法。 - 前記傾きに代え、前記傾きをサンプルの体積で割った値を用いる、
請求項2〜5の何れか一項に記載の分析方法、 - サンプル分析用デバイスであって、該デバイスは、
サンプルが移動する移動部、
該移動部の途中に形成された測定領域、
前記サンプルが前記移動部を通過する際のイオン電流の値を測定する測定部、
前記測定部で測定したイオン電流の値の内、前記サンプルが前記測定領域を通過した時のイオン電流の値から、イオン量の経時変化を解析する解析部、を少なくとも含み、
前記イオン量の経時変化を解析する解析部が、前記サンプルが前記測定領域を移動する際に、前記サンプルから漏出したイオン量を含めて解析できる、
デバイス。 - 前記解析部が、前記サンプルの尾部が前記測定領域に到達し、前記サンプルの頭部が前記測定領域の出口に到達するまでのイオン電流の値から傾きを解析する、
請求項8に記載のデバイス。 - 前記解析部が、前記傾きの標準偏差、及び/又はサンプルの体積分布も解析する、
請求項9に記載のデバイス。 - 予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾きを少なくとも記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾きと前記記憶部に記憶した傾きを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む、請求項9に記載のデバイス。 - 予め測定したサンプルのイオン電流の値から解析した傾き、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布を記憶する記憶部、
前記解析部で解析した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布と、前記記憶部に記憶した傾き、並びに、前記傾きの標準偏差及び/又はサンプルの体積分布とを対比し、サンプルの種類を判別する判別部、
を更に含む請求項10に記載のデバイス。 - 前記傾きに代え、前記傾きをサンプル体積で割った値を用いる、
請求項9〜12の何れか一項に記載のデバイス。 - 前記移動部に電場を形成できる駆動部を含み、前記駆動部は電場の大きさを変更できる電圧印加手段を有する、
請求項8〜14の何れか一項に記載のデバイス。
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