JP6841468B1 - Quantitative method - Google Patents
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Abstract
ヒスタミンを定量する定量方法では、ヒスタミンを含む含有溶液が、酵素が製膜された酵素膜を表面に有する電極に滴下され、含有溶液に含まれるヒスタミンが酵素と反応して分解し、分解物が生成される(S19)。次いで、ヒスタミンが酵素により分解物に分解される過程で、含有溶液中の酸素が酸化反応により消費される(S21)。次いで、電極に対する電圧印加によって含有溶液中の酸素が分解されるときに流れる電流の電流値が取得される(S23)。次いで、取得された電流値に基づき、ヒスタミンが定量される(S25)。In the quantification method for quantifying histamine, a solution containing histamine is dropped onto an electrode having an enzyme membrane on which an enzyme is formed, and the histamine contained in the solution reacts with the enzyme to be decomposed, resulting in a decomposition product. It is generated (S19). Next, in the process of decomposing histamine into decomposition products by an enzyme, oxygen in the contained solution is consumed by an oxidation reaction (S21). Next, the current value of the current that flows when oxygen in the contained solution is decomposed by applying a voltage to the electrode is acquired (S23). Then, histamine is quantified based on the acquired current value (S25).
Description
本発明は、ヒスタミンの定量方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying histamine.
ヒスタミンの定量方法が各種提案されている。例えば特許文献1に記載の定量方法では、次の第一工程〜第六工程を経てヒスタミンが定量される。第一工程では、魚介類や食肉等からヒスタミンが抽出される。第二工程では、抽出されたヒスタミンを含むヒスタミン含有水溶液の温度が測定される。第三工程では、第二工程において測定された温度におけるヒスタミン含有水溶液の飽和溶存酸素濃度と化学量論的に等しい第1仮想ヒスタミン濃度が、あらかじめ用意されたテーブルを参照することにより求められる。第四工程では、ヒスタミンオキシダーゼ活性を有する酵素がヒスタミン含有水溶液に注入される。第五工程では、ヒスタミン含有水溶液中のヒスタミンに酵素が反応してイミダゾールアセトアルデヒドが生成される過程で、ヒスタミン含有水溶液中の酸素が酸化反応により消費される。酸化反応後、ヒスタミン含有水溶液の飽和溶存酸素濃度と化学量論的に等しい第2仮想ヒスタミン濃度が、酸素センサからの出力信号に基づいて求められる。第六工程では、第1仮想ヒスタミン濃度と第2仮想ヒスタミン濃度との差が算出されることにより、ヒスタミン含有水溶液中のヒスタミンの濃度が定量される。
Various methods for quantifying histamine have been proposed. For example, in the quantification method described in
上記方法では、ヒスタミンを定量するために必要な工程が多く、手順が煩雑である。これに対し、より簡易な方法で高精度にヒスタミンを定量したいという要求がある。 In the above method, many steps are required to quantify histamine, and the procedure is complicated. On the other hand, there is a demand for quantifying histamine with high accuracy by a simpler method.
本発明の目的は、より簡易な方法で高精度にヒスタミンを定量することが可能な定量方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a quantification method capable of quantifying histamine with high accuracy by a simpler method.
本発明に係る定量方法は、ヒスタミンを定量する定量方法であって、酵素が製膜された酵素膜を表面に有する作用極と、対極とを少なくとも有する電極に対し、前記ヒスタミンを含む含有溶液を滴下し、前記含有溶液に含まれる前記ヒスタミンを前記酵素と反応させて分解し、分解物を生成する分解工程と、前記分解工程において前記ヒスタミンが前記酵素により前記分解物に分解される過程で、前記含有溶液中の酸素が酸化反応により消費される消費工程と、前記電極に対する電圧印加によって前記含有溶液中の前記酸素が分解されるときに流れる電流の電流値を取得する取得工程と、前記取得工程により取得された前記電流値に基づき、前記ヒスタミンの濃度を定量する定量工程と、前記酵素膜の膜厚を、前記ヒスタミンの定量範囲に基づき決定する決定工程とを備え、前記定量工程は、前記電流値及び前記ヒスタミンの濃度との対応関係を前記膜厚別に示した第1情報における線形領域を適用し、前記取得工程により取得された前記電流値と、前記決定工程により決定された前記膜厚とに対応する前記ヒスタミンの濃度を特定することを特徴とする。 The quantification method according to the present invention is a quantification method for quantifying histamine, in which a solution containing the histamine is applied to an electrode having at least an working electrode having an enzyme film formed by an enzyme on the surface and a counter electrode. In a decomposition step of dropping and reacting the histamine contained in the contained solution with the enzyme to decompose it to produce a decomposition product, and in a process of decomposing the histamine into the decomposition product by the enzyme in the decomposition step. A consumption step in which oxygen in the contained solution is consumed by an oxidation reaction, an acquisition step of acquiring a current value of a current flowing when the oxygen in the contained solution is decomposed by applying a voltage to the electrode, and the acquisition. The quantification step comprises a quantification step of quantifying the concentration of the histamine based on the current value acquired in the step, and a determination step of determining the film thickness of the enzyme membrane based on the quantification range of the histamine. The linear region in the first information showing the correspondence relationship between the current value and the histamine concentration for each film thickness is applied, and the current value acquired in the acquisition step and the film determined by the determination step are applied. It is characterized in that the concentration of the histamine corresponding to the thickness is specified.
本発明に係る定量方法では、酵素が製膜された酵素膜を表面に有する作用極と、対極とを含む電極が用いられる。このため、含有溶液に酵素が注入される方法と比べて、ヒスタミンの定量作業を容易化できる。又、電極は繰り返し使用可能となるため、コストの面でも有効である。又、ヒスタミンの濃度を酵素膜の膜厚別に定量できる。又、ヒスタミンの定量範囲に基づいて酵素膜の膜厚を決定することにより、ヒスタミンの定量範囲に対して最適な酵素膜の膜厚を選択して適用できる。 In the quantification method according to the present invention, an electrode including an working electrode having an enzyme membrane on which an enzyme is formed on the surface and a counter electrode is used. Therefore, the quantification work of histamine can be facilitated as compared with the method in which the enzyme is injected into the contained solution. Moreover, since the electrodes can be used repeatedly, it is also effective in terms of cost. In addition, the concentration of histamine can be quantified according to the thickness of the enzyme membrane. Further, by determining the film thickness of the enzyme membrane based on the histamine quantification range, the optimum enzyme membrane film thickness for the histamine quantification range can be selected and applied.
本発明において、前記取得工程では、前記電極に印加する電圧をスイープした場合に流れる前記電流に基づき、前記電流値を取得してもよい。この場合、ヒスタミンの定量を高精度に実行できる。 In the present invention, in the acquisition step, the current value may be acquired based on the current that flows when the voltage applied to the electrode is swept. In this case, the quantification of histamine can be performed with high accuracy.
本発明において、前記酵素は、ヒスタミンオキシダーゼであり、前記分解物は、イミダゾールアセトアルデヒドであってもよい。この場合、ヒスタミンがヒスタミンオキシダーゼにより分解されることで、含有溶液中の酸素は酸化反応により消費される。従って、酸素の消費量に応じて変動する電流値に基づき、ヒスタミンの濃度を適切に定量できる。 In the present invention, the enzyme may be histamine oxidase and the degradation product may be imidazole acetaldehyde. In this case, histamine is decomposed by histamine oxidase, so that oxygen in the contained solution is consumed by the oxidation reaction. Therefore, the concentration of histamine can be appropriately quantified based on the current value that fluctuates according to the amount of oxygen consumed.
本発明において、イオン交換体を前記含有溶液に混合し、夾雑物を除去する第1前工程を備え、前記分解工程は、前記第1前工程により前記夾雑物が除去された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成してもよい。この場合、ヒスタミンの定量を更に高精度に行うことができる。 In the present invention, the present invention comprises a first pre-step of mixing an ion exchanger with the contained solution to remove contaminants, and the decomposition step uses the contained solution from which the contaminants have been removed by the first pre-step. The decomposition product may be produced. In this case, the quantification of histamine can be performed with higher accuracy.
本発明において、前記イオン交換体は、陰イオン交換体であってもよい。この場合、含有溶液に含まれる陰イオンの夾雑物を、陰イオン交換体により適切に除去できる。 In the present invention, the ion exchanger may be an anion exchanger. In this case, the anion contaminants contained in the contained solution can be appropriately removed by the anion exchanger.
本発明において、タンパク質凝集剤を前記含有溶液に混合し、タンパク質を除去する第2前工程を備え、前記分解工程は、前記第2前工程により前記タンパク質が除去された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成してもよい。この場合、ヒスタミンの定量を更に高精度に行うことができる。 In the present invention, the present invention comprises a second pre-step of mixing a protein flocculant with the containing solution to remove the protein, and the decomposition step is the same using the containing solution from which the protein has been removed by the second pre-step. Decomposition may be produced. In this case, the quantification of histamine can be performed with higher accuracy.
本発明において、前記タンパク質凝集剤はポリエチレングリコール及びデキストランのうち何れかであってもよい。この場合、含有溶液に含まれるタンパク質を、ポリエチレングリコール及びデキストランの何れかにより適切に除去できる。 In the present invention, the protein flocculant may be either polyethylene glycol or dextran. In this case, the protein contained in the contained solution can be appropriately removed by either polyethylene glycol or dextran.
本発明において、pH調整剤を前記含有溶液に混合する第3前工程を備え、前記分解工程は、前記第3前工程によりpHが調整された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成してもよい。この場合、ヒスタミンの定量を更に高精度に行うことができる。 In the present invention, a third pre-step of mixing a pH adjuster with the contained solution is provided, and the decomposition step produces the decomposed product using the contained solution whose pH has been adjusted by the third pre-step. May be good. In this case, the quantification of histamine can be performed with higher accuracy.
本発明を具体化した実施形態について、図面を参照して順に説明する。参照する図面は、本発明が採用しうる技術的特徴を説明するために用いられるものであり、記載されている装置の構成等は、それのみに限定する趣旨ではなく、単なる説明例である。本実施形態に係るヒスタミンの定量方法は、酵素の触媒作用によりヒスタミンが分解されるという化学反応を利用し、電気化学的手法によりヒスタミンを定量するものである。 Embodiments embodying the present invention will be described in order with reference to the drawings. The drawings to be referred to are used to explain the technical features that can be adopted by the present invention, and the configurations and the like of the devices described are not intended to be limited thereto, but are merely explanatory examples. The method for quantifying histamine according to the present embodiment utilizes a chemical reaction in which histamine is decomposed by the catalytic action of an enzyme, and quantifies histamine by an electrochemical method.
<定量方法の概要>
図1、図2を参照し、ヒスタミンの定量方法の概要について説明する。図1に示すように、ヒスタミンは、酵素として用いられるヒスタミンオキシダーゼ(HOD)と反応することにより、酸化及び脱アミノ化され分解される。この反応により、ヒスタミンからイミダゾールアセトアルデヒドが生成され(矢印Y11)、HODは還元反応により酸化型から還元型に変位する(矢印Y12)。又、還元型のHODの酸化反応(矢印Y13)により酸素が分解され、分解された酸素と水から過酸化水素が生成される(矢印Y14)。つまり、HODによるヒスタミン1分子の分解反応に応じ、ヒスタミン及び酸素が夫々1分子ずつ消失し、イミダゾールアセトアルデヒド及び過酸化水素が夫々1分子ずつ生成される。
<Outline of quantification method>
The outline of the method for quantifying histamine will be described with reference to FIGS. 1 and 2. As shown in FIG. 1, histamine is oxidized, deaminated and decomposed by reacting with histamine oxidase (HOD) used as an enzyme. By this reaction, imidazole acetaldehyde is produced from histamine (arrow Y11), and HOD is displaced from the oxidized form to the reduced form by the reduction reaction (arrow Y12). In addition, oxygen is decomposed by the oxidation reaction of reduced HOD (arrow Y13), and hydrogen peroxide is generated from the decomposed oxygen and water (arrow Y14). That is, in response to the decomposition reaction of one molecule of histamine by HOD, one molecule each of histamine and oxygen disappears, and one molecule each of imidazole acetaldehyde and hydrogen peroxide is produced.
図2に示すように、本実施形態では、酵素が製膜された酵素膜10を表面に有する電極11、12、13が用いられる。電極11は作用極であり、電極12は対極であり、電極13は参照極である。ヒスタミンを含む溶液(以下、「含有溶液21」という。)として、魚肉等の生体から得られたサンプルを溶媒に溶解した溶液が調製される。調製された含有溶液21が、酵素膜10に滴下される。このとき、含有溶液21に含まれるヒスタミンは、酵素膜10のHODと反応して分解し、イミダゾールアセトアルデヒド(IAA)が生成される(矢印Y21)。又、ヒスタミンがHODにより分解される過程で、含有溶液21中の酸素が酸化反応により消費され、過酸化水素が生成される(矢印Y22)。
As shown in FIG. 2, in the present embodiment,
測定部3により、電極11に電圧が印加される。含有溶液21中に残留する酸素は、電極11の酵素膜10を浸透して電極11に到達する。酸素は、電極11から供給される電子と結合し、分解する(矢印Y23)。
A voltage is applied to the
このため、電圧印加時において電極11に流れる電流値を、測定部3にて電気化学的に計測することにより、分解された酸素の量、言い換えれば、含有溶液21中に残留する酸素の量を測定できる。なお、含有溶液21中に残留する酸素の量は、含有溶液21に含有されるヒスタミンが酵素反応により分解される程、少なくなる。即ち、含有溶液21に含有されるヒスタミンの量と、電圧印加時において電極11に流れる電流の電流値とは、相関がある。従って、測定部3にて計測された電流値に基づき、含有溶液21に含有されるヒスタミンの濃度が定量可能となる。
Therefore, by electrochemically measuring the current value flowing through the
<定量手順>
図3を参照し、ヒスタミンの定量手順について説明する。はじめに準備工程が実行される(S11)。準備工程では、魚肉等の生体からサンプルが抽出される。サンプルにはヒスタミンが含まれる。サンプルが溶媒に溶解されることにより、ヒスタミンを含む含有溶液21が調製される。
<Quantitative procedure>
The procedure for quantifying histamine will be described with reference to FIG. First, the preparation step is executed (S11). In the preparatory step, a sample is extracted from a living body such as fish meat. The sample contains histamine. By dissolving the sample in a solvent, a containing
次に、含有溶液21から夾雑物を除去するための工程として、第1前工程が実行される(S13)。第1前工程では、陰イオン交換体が含有溶液21に混合されることにより、含有溶液21中の陰イオンの夾雑物が除去される。陰イオン交換体は、官能基としてアミノ基が導入されたイオン交換樹脂であり、Clイオン、SO4イオン、アミノ酸等の陰イオンの夾雑物を除去できる。
Next, as a step for removing impurities from the contained
次に、含有溶液21からタンパク質を除去するための工程として、第2前工程が実行される(S15)。第2前工程では、ポリエチレングリコール及びデキストランの何れかがタンパク質凝集剤として含有溶液21に混合されることにより、含有溶液21中のタンパク質が除去される。
Next, as a step for removing the protein from the contained
次に、含有溶液21のpHを調整するための工程として、第3前工程が実行される(S17)。第3前工程では、pH調整剤としてリン酸粉末が含有溶液21に混合されることにより、含有溶液21のpHが中性〜弱アルカリ性に調整される。
Next, as a step for adjusting the pH of the contained
次に、酵素膜10を表面に有する電極11が準備される。第1前工程(S13)、第2前工程(S15)、及び第3前工程(S17)を経て調製された含有溶液21が、酵素膜10に滴下される。これにより、含有溶液21に含まれるヒスタミンが酵素膜10のHODと反応して分解され、イミダゾールアセトアルデヒドが生成される(S19)。又、ヒスタミンを分解したHODにより、含有溶液21中の酸素が酸化反応により消費される(S21)。
Next, the
次に、測定部3によって電極11に電圧が印加される。より詳細には、測定部3は、電極11に印加される電圧をスイープする。含有溶液21中に残留する酸素は分解され、過酸化水素が生成される。又、酸素が分解する時に流れる電流の電流値が、測定部3により計測され取得される(S23)。より詳細には、電圧のスイープ時に流れた電流の極値が、測定部3により電流値として取得される。
Next, a voltage is applied to the
次に、S23の工程により取得された電流値に基づき、ヒスタミンが定量される(S25)。ヒスタミンの具体的な定量方法は、次の通りである。図4に示すように、電流値とヒスタミンの濃度との対応関係を示した第1グラフが予め準備される。第1グラフにおいて、x軸はヒスタミンの濃度を規定する。y軸は、電極に印加する電圧をスイープさせた時に測定部3で取得される電流値を規定する。ヒスタミンの濃度(変数x)と電流値(変数y)とは、略線形の関係を有する。第1グラフを線形近似した直線を示す関数は、式(1)の関係を満たす。但し、変数xの単位はppmであり、変数yの単位はnAである。
y=51.742x−9372.2 (1)
ヒスタミンの定量時、S23の工程で取得された電流値が式(1)の変数yに代入されたときに算出される変数xの値が、ヒスタミンの濃度として特定される。
Next, histamine is quantified based on the current value obtained in the step of S23 (S25). The specific method for quantifying histamine is as follows. As shown in FIG. 4, a first graph showing the correspondence between the current value and the histamine concentration is prepared in advance. In the first graph, the x-axis defines the concentration of histamine. The y-axis defines the current value acquired by the measuring unit 3 when the voltage applied to the electrodes is swept. The histamine concentration (variable x) and the current value (variable y) have a substantially linear relationship. The function showing a straight line linearly approximated to the first graph satisfies the relation of the equation (1). However, the unit of the variable x is ppm, and the unit of the variable y is nA.
y = 51.742x-9372.2 (1)
At the time of quantification of histamine, the value of the variable x calculated when the current value acquired in the step of S23 is substituted into the variable y of the equation (1) is specified as the histamine concentration.
図5は、図4の第1グラフを導出するために測定された測定結果を示す。キハダマグロの生肉から抽出されたサンプルについて、ヒスタミンの濃度が0ppm、50ppm、100ppmとなるように調製された含有溶液21が用いられた。pHは略7とされた。そして、電極11の電圧を、0mVから−800mVまでの間で−20mV/secの条件でスイープさせ、この時に電極11に流れた電流の電流値が、夫々2回ずつ測定された。図4に示す第1グラフは、図5に示す測定結果の夫々において極小となる時の電流値と、対応するヒスタミンの濃度との関係をプロットしたものである。
FIG. 5 shows the measurement results measured to derive the first graph of FIG. For the sample extracted from the raw meat of yellowfin tuna, the containing
図4に示す第1グラフでは、ヒスタミンの濃度が増加する程、電流値の絶対値は小さくなっている。この結果は、ヒスタミンの濃度が増加する程、酵素の酸化反応(矢印Y13、図1参照)により分解される酸素(矢印Y14、図1参照)の量も増加し、含有溶液21に残留する酸素の量が少なくなることを示している。
In the first graph shown in FIG. 4, the absolute value of the current value becomes smaller as the histamine concentration increases. As a result, as the concentration of histamine increases, the amount of oxygen decomposed by the oxidation reaction of the enzyme (arrow Y13, see FIG. 1) also increases (arrow Y14, see FIG. 1), and the oxygen remaining in the containing
なお、上記のS25の工程は、測定部3により実行されてもよいし、別の方法で実行されてもよい。例えば測定部3は、取得した電流値を外部に出力してもよい。使用者は、出力された電流値に基づき、式(1)を参照することによってヒスタミンを定量してもよい。 The above-mentioned step S25 may be executed by the measuring unit 3 or may be executed by another method. For example, the measuring unit 3 may output the acquired current value to the outside. The user may quantify histamine by referring to the equation (1) based on the output current value.
<本実施形態の作用、効果>
以上のように、本実施形態に係るヒスタミンの定量方法では、酵素として用いるHODが製膜された酵素膜10を表面に有する電極11が用いられる。このため、含有溶液21に酵素が注入される従来の方法と比べて、ヒスタミンの定量作業を容易化できる。又、酵素膜10を有する電極11は繰り返し使用可能となるため、ヒスタミンの定量に要するコストを削減できる。
<Action and effect of this embodiment>
As described above, in the method for quantifying histamine according to the present embodiment, an
なお、酸素が電圧印加により分解するときに要する電圧は、−1000mV〜−400mVである(図4参照)。一方、ヒスタミンがHODにより分解されることに応じて生成されるイミダゾールアセトアルデヒド(図1参照)が電圧印加により分解するときの電圧は、300〜500mVである。又、酸素がHODにより分解されることに応じて生成される過酸化水素(図1参照)が電圧印加により分解するときの電圧は、700mV〜1000mVである。つまり、酸素は負電圧で分解することができるため、正電圧で容易に酸化される物質による影響を受けない。このため、含有溶液21に残留する酸素の量を電気化学測定により測定してヒスタミンを定量する本実施形態の定量方法は、含有溶液21に残留するイミダゾールアセトアルデヒド又は過酸化水素の量を電気化学的に測定してヒスタミンを定量する場合と比べて、安定的に実行可能である。従って、上記方法によりヒスタミンを定量することにより、ヒスタミンの濃度を精度よく定量できる。
The voltage required when oxygen is decomposed by applying a voltage is −1000 mV to −400 mV (see FIG. 4). On the other hand, the voltage when imidazole acetaldehyde (see FIG. 1) produced in response to histamine being decomposed by HOD is decomposed by applying a voltage is 300 to 500 mV. Further, the voltage when hydrogen peroxide (see FIG. 1) generated when oxygen is decomposed by HOD is decomposed by applying a voltage is 700 mV to 1000 mV. That is, since oxygen can be decomposed at a negative voltage, it is not affected by substances that are easily oxidized at a positive voltage. Therefore, in the quantification method of the present embodiment in which the amount of oxygen remaining in the contained
S23の工程において、電極11に印加する電圧が測定部3によりスイープされ、その時に流れる電流に基づいて電流値が取得される。なお、電極11に印加する電圧をスイープさせることにより、含有溶液21及び酵素膜10中の酸素の移動、拡散を考慮して電流値を取得できる。従って、取得された電流値に基づくヒスタミンの定量を高精度に実行できる。
In the step of S23, the voltage applied to the
S25の工程において、S23の工程で取得された電流値に対応するヒスタミンの濃度は、式(1)の変数yに電流値が代入されたときに算出される変数xの値として算出される。この場合、取得された電流値に基づき、ヒスタミンの濃度を容易に定量できる。 In the step of S25, the concentration of histamine corresponding to the current value acquired in the step of S23 is calculated as the value of the variable x calculated when the current value is substituted into the variable y of the equation (1). In this case, the concentration of histamine can be easily quantified based on the acquired current value.
ヒスタミンを分解するための酵素として、ヒスタミンオキシダーゼ(HOD)が用いられる。ヒスタミンがヒスタミンオキシダーゼにより分解される場合、含有溶液21中の酸素は酸化反応により消費される。又、ヒスタミンはイミダゾールアセトアルデヒドに分解される(図1参照)。従って、酸素の消費量に応じて変動する電流値に基づき、ヒスタミンの濃度を適切に定量できる。
Histamine oxidase (HOD) is used as an enzyme for degrading histamine. When histamine is decomposed by histamine oxidase, the oxygen in the contained
第1前工程(S13)では、イオン交換体が含有溶液21に混合され、夾雑物が除去される。S19〜S25の工程では、夾雑物が除去された含有溶液21が用いられてヒスタミンが定量される。この場合、酵素によるヒスタミンの分解が夾雑物により阻害されることを抑制できるので、ヒスタミンの定量を更に高精度に行うことができる。又、イオン交換体として陰イオン交換体が用いられることにより、含有溶液21に含まれる陰イオンの夾雑物を、陰イオン交換体により適切に除去できる。
In the first pre-step (S13), the ion exchanger is mixed with the containing
第2前工程(S15)では、タンパク質凝集剤が含有溶液21に混合され、タンパク質が除去される。S19〜S25の工程では、タンパク質が除去された含有溶液21が用いられてヒスタミンが定量される。この場合、酵素によるヒスタミンの分解がタンパク質により阻害されることを抑制できるので、ヒスタミンの定量を更に高精度に行うことができる。又、タンパク質凝集剤としてポリエチレングリコール及びデキストランのうち何れかが用いられることにより、含有溶液21に含まれるタンパク質をより適切に除去できる。
In the second pre-step (S15), the protein flocculant is mixed with the containing
第3前工程(S17)では、pH調整剤が含有溶液21に混合され、pHが中性〜弱アルカリ性に調整される。S19〜S25の工程では、pHが調整された含有溶液21が用いられてヒスタミンが定量される。この場合、適切なpHとすることにより酵素によるヒスタミンの分解を促進できるので、ヒスタミンの定量精度を更に向上させることができる。
In the third pre-step (S17), the pH adjuster is mixed with the containing
<変形例>
本発明は上記実施形態に限定されず、種々の変更が可能である。上記実施形態において、測定部3に測定機本体が接続されてもよい。測定機本体には、測定部3により測定された電流値が出力されてもよい。測定機本体の記憶部に、式(1)が記憶されてもよい。測定機本体のCPUは、測定部3が出力した電流値を取得して式(1)を適用することにより、ヒスタミンの濃度を特定してもよい。CPUは、特定したヒスタミンの濃度を、測定機本体の表示部に出力してもよい。更に例えば、測定部3は、電極11に印加する電圧をスイープさせたときに流れる電流の電流値を、そのまま測定機本体に出力してもよい。測定機本体は、測定部3から出力された電流値に基づき、極値を特定してもよい。測定機本体は、特定した極値を式(1)に適用することにより、ヒスタミンの濃度を特定してもよい。
<Modification example>
The present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications can be made. In the above embodiment, the measuring machine main body may be connected to the measuring unit 3. The current value measured by the measuring unit 3 may be output to the measuring machine main body. Equation (1) may be stored in the storage unit of the measuring machine main body. The CPU of the measuring machine main body may specify the histamine concentration by acquiring the current value output by the measuring unit 3 and applying the equation (1). The CPU may output the specified histamine concentration to the display unit of the measuring machine main body. Further, for example, the measuring unit 3 may output the current value of the current flowing when the voltage applied to the
測定部3、及び電極11〜13が一体となった測定チップであってもよい。測定チップは、測定機本体のインタフェースに接続されて使用されてもよい。測定部3は、測定された電流値を、インタフェースを介して測定器本体に出力してもよい。
It may be a measuring chip in which the measuring unit 3 and the
S23の工程で取得される電流値は、電圧のスイープ時に流れた電流の極値でなくてもよい。例えば、電圧のスイープ時に流れた電流の総量が、電流値として取得されてもよい。又、S23の工程で電極11に印加される電圧は、スイープされなくてもよい。例えば測定部3は、酸素が分解される電圧を、電極11に一定時間連続して印加し、その時に流れる電流の電流値を取得してもよい。
The current value acquired in the step of S23 does not have to be the extreme value of the current flowing during the sweep of the voltage. For example, the total amount of current flowing during a voltage sweep may be acquired as a current value. Further, the voltage applied to the
S25の工程でヒスタミンを定量する方法は、式(1)を用いる方法に限定されない。例えば、電流値とヒスタミンの濃度との対応関係を示すテーブルが予め準備されてもよい。この場合、テーブルのうちS23の工程で取得された電流値に対応するヒスタミンの濃度を取得することにより、ヒスタミンが定量されてもよい。ヒスタミンを分解するための酵素として用いられる物質は、ヒスタミンオキシダーゼである場合に限定されず、ヒスタミンを分解可能な他の酵素が用いられてもよい。 The method for quantifying histamine in the step of S25 is not limited to the method using the formula (1). For example, a table showing the correspondence between the current value and the histamine concentration may be prepared in advance. In this case, histamine may be quantified by acquiring the concentration of histamine corresponding to the current value acquired in the step S23 in the table. The substance used as an enzyme for decomposing histamine is not limited to histamine oxidase, and other enzymes capable of decomposing histamine may be used.
第1前工程において含有溶液21に混合されるイオン交換体は、陰イオン交換体に限定されず、含有物質を吸着しない条件下では陽イオン交換体を使用してもよい。又、陰イオン交換体と陽イオン交換体との両方が含有溶液21に混合されてもよい。第2前工程において含有溶液21に混合されるタンパク質凝集剤は、ポリエチレングリコール及びデキストランに限定されず、他の材料であってもよい。第3前工程において含有溶液21に混合されるpH調整剤は、リン酸粉末に限定されず、含有溶液21を中性〜弱アルカリ性とすることが可能な他の物質が用いられてもよい。第1前工程(S13)、第2前工程(S15)、第3前工程(S17)のうち一部または全部は、ヒスタミンの定量過程で実行されなくてもよい。
The ion exchanger mixed with the contained
定量方法の準備工程(S11)において、電極11の表面に形成される酵素膜10の膜厚が、ヒスタミンの定量範囲に基づいて決定されてもよい。膜厚の具体的な決定方法は、次の通りである。
In the preparation step (S11) of the quantification method, the film thickness of the
図6に示す第2グラフでは、含有溶液21中のヒスタミンの濃度と、電極11に電圧が印加されることに応じて分解される酸素の量との関係を示す理論曲線が、酵素膜10の膜厚毎に示されている。酵素膜10の膜厚が大きくなる程、ヒスタミンの濃度に対する酸素の消費量の割合が大きくなる。又、理論曲線は、酵素膜10の膜厚が大きくなる程、線形部分の範囲がヒスタミンの濃度の小さい領域に分布し、傾きは急峻となる。一方、酵素膜10の膜厚が小さくなる程、線形部分の範囲がヒスタミンの濃度の大きい部分まで広く分布し、傾きは緩やかになる。なお、第2グラフを用いてヒスタミンの濃度が特定される場合、理論曲線の線形部分を利用した方が、より詳細かつ正確に濃度を特定できるため好ましい。
In the second graph shown in FIG. 6, the theoretical curve showing the relationship between the concentration of histamine in the contained
従って、例えば準備工程(S11)において、サンプルに含まれるヒスタミンの濃度として想定される値が小さく、且つ定量範囲が狭い程、酵素膜10の膜厚として大きい値が決定される。一方、サンプルに含まれるヒスタミンの濃度として想定される値が大きく、且つ定量範囲が広い程、酵素膜10の膜厚として小さい値が決定される。具体的には、例えばヒスタミンの定量範囲が範囲31(約20〜50ppm)であることが想定される場合、最も膜厚の大きい理論曲線32に基づき、対応する膜厚が決定される。又、例えばヒスタミンの定量範囲が範囲33(約50〜170ppm)であることが想定される場合、最も膜厚の小さい理論曲線34に基づき、対応する膜厚が決定される。
Therefore, for example, in the preparation step (S11), the smaller the value assumed as the concentration of histamine contained in the sample and the narrower the quantification range, the larger the value as the film thickness of the
又、S25の工程でヒスタミンが定量される場合、図6に示す第2グラフが用いられる。具体的には次の通りである。S23の工程により取得された電流値は、所定の関数が用いられることにより、酸素消費量に換算される。第2グラフにおいて、使用された酵素膜10の膜厚に対応する理論曲線が参照され、換算された酸素消費量に対応するヒスタミンの濃度が特定される。例えば、理論曲線32に対応する膜厚の酵素膜10が使用された場合、範囲31(約20〜50ppm)内のヒスタミンの濃度は、理論曲線32の線形部分32Aを利用して特定される。又、例えば、理論曲線34に対応する膜厚の酵素膜10が使用された場合、範囲33(約50〜170ppm)内のヒスタミンの濃度は、理論曲線34の線形部分34Aを利用して特定される。
When histamine is quantified in the step of S25, the second graph shown in FIG. 6 is used. Specifically, it is as follows. The current value acquired in the step of S23 is converted into oxygen consumption by using a predetermined function. In the second graph, the theoretical curve corresponding to the film thickness of the
以上のように、電極11に電圧を印加した時に流れる電流の電流値に基づき、ヒスタミンの濃度を酵素膜10の膜厚別に定量できる。従って、酵素膜10の膜厚が変動した場合でも、ヒスタミンの濃度を高精度に定量できる。又、酵素膜10の膜厚を、ヒスタミンの定量範囲に応じて決定することにより、第2グラフの理論曲線のうち線形部分を利用してヒスタミンの濃度を特定できる。従って、より詳細かつ正確にヒスタミンの濃度を特定できる。
As described above, the concentration of histamine can be quantified according to the film thickness of the
図7に示す第3グラフは、含有溶液21中のヒスタミンの濃度と、電極11に印加する電圧をスイープさせた時に測定部3で取得される電流値との関係を、酵素膜10の膜厚(1μm、3μm)毎に示した実測値である。第3グラフから、特にヒスタミンの濃度が約10ppmよりも大きい場合において、酵素膜10の膜厚が大きくなる程電流値が増加することが明らかとなった。
The third graph shown in FIG. 7 shows the relationship between the concentration of histamine in the contained
<その他>
S19の処理は、本発明の「分解工程」の一例である。S21の処理は、本発明の「消費工程」の一例である。S23の処理は、本発明の「取得工程」の一例である。S25の処理は、本発明の「定量工程」の一例である。S11の処理は、本発明の「決定工程」の一例である。第2グラフは、本発明の「第1情報」の一例である。
<Others>
The treatment of S19 is an example of the "decomposition step" of the present invention. The treatment of S21 is an example of the "consumption step" of the present invention. The process of S23 is an example of the "acquisition step" of the present invention. The treatment of S25 is an example of the "quantitative step" of the present invention . The process of
3 :測定部
10 :酵素膜
11、12、13 :電極
21 :含有溶液
3: Measuring unit 10:
Claims (8)
酵素が製膜された酵素膜を表面に有する作用極と、対極とを少なくとも有する電極に対し、前記ヒスタミンを含む含有溶液を滴下し、前記含有溶液に含まれる前記ヒスタミンを前記酵素と反応させて分解し、分解物を生成する分解工程と、
前記分解工程において前記ヒスタミンが前記酵素により前記分解物に分解される過程で、前記含有溶液中の酸素が酸化反応により消費される消費工程と、
前記電極に対する電圧印加によって前記含有溶液中の前記酸素が分解されるときに流れる電流の電流値を取得する取得工程と、
前記取得工程により取得された前記電流値に基づき、前記ヒスタミンの濃度を定量する定量工程と、
前記酵素膜の膜厚を、前記ヒスタミンの定量範囲に基づき決定する決定工程と
を備え、
前記定量工程は、
前記電流値及び前記ヒスタミンの濃度との対応関係を前記膜厚別に示した第1情報における線形領域を適用し、前記取得工程により取得された前記電流値と、前記決定工程により決定された前記膜厚とに対応する前記ヒスタミンの濃度を特定することを特徴とする定量方法。 A quantification method for quantifying histamine
A containing solution containing the histamine is added dropwise to an electrode having at least an action electrode having an enzyme membrane on which an enzyme is formed and an counter electrode, and the histamine contained in the containing solution is reacted with the enzyme. The decomposition process that decomposes and produces decomposition products,
In the decomposition step, the oxygen in the contained solution is consumed by the oxidation reaction in the process of decomposing the histamine into the decomposition product by the enzyme, and the consumption step.
The acquisition step of acquiring the current value of the current flowing when the oxygen in the contained solution is decomposed by applying a voltage to the electrode, and
A quantification step for quantifying the concentration of histamine based on the current value acquired in the acquisition step, and a quantification step .
A determination step of determining the film thickness of the enzyme membrane based on the quantitative range of histamine.
With
The quantification step is
The linear region in the first information showing the correspondence relationship between the current value and the histamine concentration for each film thickness is applied, and the current value acquired by the acquisition step and the film determined by the determination step are applied. A quantification method comprising specifying the concentration of the histamine corresponding to the thickness.
前記電極に印加する電圧をスイープした場合に流れる前記電流に基づき、前記電流値を取得することを特徴とする請求項1に記載の定量方法。 In the acquisition process,
The quantification method according to claim 1, wherein the current value is acquired based on the current that flows when the voltage applied to the electrode is swept.
前記分解物は、イミダゾールアセトアルデヒドであることを特徴とする請求項1又は2に記載の定量方法。 The enzyme is histamine oxidase,
The quantification method according to claim 1 or 2 , wherein the decomposed product is imidazole acetaldehyde.
前記分解工程は、
前記第1前工程により前記夾雑物が除去された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成することを特徴とする請求項1から3の何れかに記載の定量方法。 A first pre-step of mixing the ion exchanger with the containing solution and removing impurities is provided.
The decomposition step is
The quantification method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the decomposition product is produced using the containing solution from which the contaminants have been removed by the first pre-step.
前記分解工程は、
前記第2前工程により前記タンパク質が除去された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成することを特徴とする請求項1から5の何れかに記載の定量方法。 A second pre-step of mixing the protein flocculant with the containing solution and removing the protein is provided.
The decomposition step is
The quantification method according to any one of claims 1 to 5 , wherein the decomposition product is produced using the containing solution from which the protein has been removed by the second prior step.
前記分解工程は、
前記第3前工程によりpHが調整された前記含有溶液を用いて前記分解物を生成することを特徴とする請求項1から7の何れかに記載の定量方法。 A third pre-step of mixing the pH regulator with the containing solution is provided.
The decomposition step is
The quantification method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the decomposition product is produced using the containing solution whose pH has been adjusted by the third prior step.
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