JP6829357B2 - Antibody sugar chain detection method - Google Patents
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Description
本発明は、抗体、特に組み換え技術により産生されたＩｇＧ抗体のＦａｂ領域に付加された糖鎖の簡便な検出法及びそのためのキットに関する。 The present invention relates to a simple method for detecting a sugar chain added to the Fab region of an antibody, particularly an IgG antibody produced by a recombination technique, and a kit for that purpose.
組み換えＤＮＡ技術、細胞融合などのバイオテクノロジーで製造されたタンパク質性医薬品の多くは宿主の生合成系による糖鎖修飾を受ける。糖鎖修飾としては、タンパク質のアスパラギン残基にＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合して開始されるＮ型糖鎖と、セリンまたはトレオニン残基にＮ-アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合して開始されるＯ型糖鎖とが挙げられる。糖タンパク質に結合している糖鎖を構成する糖としては、ガラクトース、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミン、Ｎ-アセチルノイラミン酸、Ｎ-グリコリルノイラミン酸、キシロースなどが挙げられる。タンパク質に付加される糖鎖は細胞や培養条件によって多様に変化し、ヒトには存在しない糖鎖構造、例えばＮ-グリコリルノイラミン酸やα１−３ガラクトースが付加され異種抗原が形成される場合もある（第十七改正日本薬局方「2.64糖鎖試験法」、Nat Biotechnol. 2011 Jul 11;29(7):574-6.）。
バイオ医薬品の生産においては、異種抗原を有する医薬品は投与された患者の免疫系により薬効の漸次低下やアナフィラキシーショックを誘発する可能性があるため、バイオ医薬品に異種抗原が付加されないように生産系を制御することが求められる。
Many proteinaceous drugs produced by biotechnology such as recombinant DNA technology and cell fusion undergo sugar chain modification by the host biosynthetic system. As sugar chain modification, an N-type sugar chain started by binding N-acetylglucosamine (GlcNAc) to an asparagine residue of a protein and N-acetylgalactosamine (GalNAc) started by binding to a serine or threonine residue. An O-type sugar chain to be produced can be mentioned. The sugars that make up the sugar chain bound to glycoproteins include galactose, mannose, fucose, glucose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid, and xylose. And so on. The sugar chain added to the protein changes variously depending on the cells and culture conditions, and when a sugar chain structure that does not exist in humans, such as N-glycolylneuraminic acid or α1-3 galactose, is added to form a heterologous antigen. There is also (17th revised Japanese Pharmacopoeia "2.64 sugar chain test method", Nat Biotechnol. 2011 Jul 11; 29 (7): 574-6.).
In the production of biopharmacy, since a drug having a heterologous antigen may induce a gradual decrease in efficacy and anaphylactic shock due to the immune system of the patient to which the drug is administered, the production system should be designed so that the heterologous antigen is not added to the biopharmacy. It is required to control.
健常人の血清中のＩｇＧ抗体は、Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎにそれぞれ一つのＮ−グリコシド糖鎖を有しており、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）や血中安定性に関わっているため、抗体医薬にとって重要である。典型的には下記に示す複合糖鎖であるが、一部に多型がある。Ｆｕｃ残基の除去、又はバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基の付加量の増加によりＡＤＣＣ活性が増強できることと共に、非還元末端のＧａｌ残基の付加がＣＤＣ活性に影響することが知られている（Chromatography, Vol.34 No.2, 2013, 83-88、Shinkawa T,et al., J.Biol. Chem.278, 3466-3473 2003）。 The IgG antibody in the serum of a healthy person has one N-glycoside sugar chain at Asn at position 297 of the Fc region, and has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). It is important for antibody drugs because it is involved in CDC) and blood stability. It is typically a complex sugar chain shown below, but there are some polymorphisms. It is known that ADCC activity can be enhanced by removing Fuc residues or increasing the addition amount of bisecting GlcNAc residues, and that addition of Gal residues at the non-reducing terminal affects CDC activity (Chromatography, Vol. .34 No.2, 2013, 83-88, Shinkawa T, et al., J.Biol. Chem.278, 3466-3473 2003).
したがって、抗体医薬の製造の際には糖鎖を付加できる動物細胞、酵母などが宿主として選択されるが、選択されたＣＤＲ配列によってはＦａｂ領域に糖鎖が付加されることもある。Ｆａｂ領域は抗体の外側に位置するため糖鎖が付加された場合には、抗体医薬品の抗原性や薬効に与える影響はＦｃ領域の糖鎖よりも大きいと考えられる。特に非ヒト型の糖鎖（Ｎｅｕ５Ｇｃ、Ｇａｌ-α１-３Ｇａｌなど）が付加された場合生体内で免疫反応を引き起こす可能性が高い。セツキシマブマブでは、Ｆａｂ領域に付加されたＧａｌ-α１-３Ｇａｌにより、一部の患者でアナフラキシーを惹起することが報告されている(Christine H., et al, N.Engl.J.Med., 2008; 358: 1109-17、Curr Allergy Asthma Rep. 2010 January;10(1):29-33)。 Therefore, in the production of antibody drugs, animal cells, yeasts, etc. to which sugar chains can be added are selected as hosts, but sugar chains may be added to the Fab region depending on the selected CDR sequence. Since the Fab region is located outside the antibody, when a sugar chain is added, the effect on the antigenicity and drug efficacy of the antibody drug is considered to be greater than that of the sugar chain in the Fc region. In particular, when a non-human type sugar chain (Neu5Gc, Gal-α1-3Gal, etc.) is added, there is a high possibility of inducing an immune reaction in vivo. In cetuximab, Gal-α1-3Gal added to the Fab region has been reported to cause anaphylaxis in some patients (Christine H., et al, N. Engl. J. Med., 2008). 358: 1109-17, Curr Allergy Asthma Rep. 2010 January; 10 (1): 29-33).
また、製造承認申請や品質管理においては抗体の糖鎖不均一性を評価する必要があるが、複数の部位に糖鎖が付加されている場合は分析が複雑になり開発コストに大きく影響するため、抗体医薬開発の初期段階において好ましくない抗体生産株をふるい落とすことが求められている。とりわけ、生体内での副作用が懸念されるＦａｂ領域に糖鎖が付加された抗体の生産株を、開発初期のスクリーニング工程で、迅速で簡便な手段でふるい落とせることが望ましい。 In addition, it is necessary to evaluate the sugar chain heterogeneity of the antibody in manufacturing approval application and quality control, but if sugar chains are added to multiple sites, the analysis becomes complicated and the development cost is greatly affected. , It is required to screen out unfavorable antibody-producing strains in the initial stage of antibody drug development. In particular, it is desirable that an antibody-producing strain having a sugar chain added to the Fab region, which may cause side effects in vivo, can be screened out by a quick and simple means in the screening step at the initial stage of development.
抗体医薬品の糖鎖を分析する一般的な方法では、まずＮ-グリカナーゼを用いて抗体から糖鎖を切断し、次いで遊離した糖鎖の構造を高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)や質量分析(ＭＳ）などにより分析していた（非特許文献１，２）。しかしこれらの方法では、糖鎖を抗体から遊離する段階で糖鎖が結合していた部位の情報は失われる。また、糖鎖を遊離させることなく抗体分子全体の分子量を質量分析計で測定するインタクトＭＳ法により、抗体に結合している糖鎖の分子量分布を知ることができるが、この方法でも糖鎖の結合部位の情報は得られない（非特許文献３）。
糖鎖結合部位を明らかにするためには抗体医薬品をトリプシンなどのプロテアーゼで消化することによりペプチド断片とし、得られたペプチド混合物から糖ペプチドを液体クロマトグラフィーなどにより分離し、さらに質量分析計で詳細に分析することを必要とする（特許文献１）。
現在では液体クロマトグラフィーと質量分析計を組み合わせたＬＣ−ＭＳを用いて分析されることが多い。しかし、この方法は高価な質量分析計を必要とするだけでなく、まず抗体医薬品を精製分離し、その後トリプシン消化するという煩雑な工程が必要であり、多検体処理が必要なスクリーニングには向いていない。
A common method for analyzing sugar chains in antibody drugs is to first cleave the sugar chains from the antibody using N-glycanase, and then analyze the structure of the free sugar chains by high performance liquid chromatography (HPLC) or mass spectrometry (MS). It was analyzed by such means (Non-Patent Documents 1 and 2). However, in these methods, the information on the site where the sugar chain was bound is lost at the stage of releasing the sugar chain from the antibody. In addition, the molecular weight distribution of the sugar chain bound to the antibody can be known by the intact MS method in which the molecular weight of the entire antibody molecule is measured with a mass spectrometer without releasing the sugar chain. Information on the binding site cannot be obtained (Non-Patent Document 3).
In order to clarify the sugar chain binding site, the antibody drug is digested with a protease such as trypsin to form a peptide fragment, and the glycopeptide is separated from the obtained peptide mixture by liquid chromatography or the like, and further detailed by mass spectrometry. (Patent Document 1).
Currently, it is often analyzed using LC-MS, which is a combination of liquid chromatography and mass spectrometer. However, this method not only requires an expensive mass spectrometer, but also requires a complicated process of first purifying and separating the antibody drug and then digesting it with trypsin, and is suitable for screening that requires multisample processing. Absent.
また別の方法では、抗体医薬品をパパインで消化することによりＦｃ部分とＦａｂ部分に分離した後、糖鎖を分析することによりＦａｂ部分の糖鎖を明らかにすることができる。この方法も、まず抗体医薬品を精製分離し、その後パパイン消化、さらにはＮ-グリカナーゼ処理や糖鎖の蛍光標識など糖鎖分析の多段階の処理が必要であり、迅速性や簡便性が求められるスクリーニングには向いていない。 In another method, the antibody drug can be separated into an Fc portion and a Fab portion by digesting with papain, and then the sugar chain of the Fab portion can be clarified by analyzing the sugar chain. This method also requires first purification and separation of the antibody drug, then papain digestion, and then multi-step treatment of sugar chain analysis such as N-glycanase treatment and fluorescent labeling of sugar chains, which requires speed and convenience. Not suitable for screening.
従来から特定の疾患に罹患した患者血清中の抗体等の糖タンパク質に発現する疾患特異的な糖鎖を検出する方法としてレクチンを用いる手法が多数開発されており、ＩｇＧ抗体の特異的糖鎖についても、プロテインＡ又はプロレインＧとＭａｎ糖鎖認識レクチンであるＣｏＡ（コンカナバリンＡ）又はＬＣＡ（レンズカリナリスアグリチニン）との組合せた診断薬によりＦｃ領域糖鎖における非還元末端のＧａｌ欠損の有無を検出するリウマチ診断法（特許文献２）などが知られている。
抗体医薬品の糖鎖を分析するための手法としては、還元処理で変性させたＩｇＧ抗体のＦｃ領域糖鎖のＡＤＣＣ活性に関わるＦｕｃ修飾の有無が、ＡＡＬレクチンを用いて検出できること（非特許文献４）が知られている。同様に、Ｆｃ領域中のＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性に関わる他の各種糖鎖に対しても、それぞれ認識するレクチンを用いて検出できる（特許文献３、４）ことが示唆されている。
しかしながら、いずれも特定の疾患特異的に発現する特異的な糖鎖、又は抗体医薬品として必須のＦｃ領域中のＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性に関わる特定の糖鎖の検出に当該糖鎖特異的なレクチンを利用しようというものであって、抗体のＦａｂ領域に付加された糖鎖のみを全て検出するための手法ではなかった。
Many methods using lectins have been developed as methods for detecting disease-specific sugar chains expressed in glycoproteins such as antibodies in the serum of patients suffering from a specific disease, and the specific sugar chains of IgG antibodies have been developed. Also, the presence or absence of Gal deficiency at the non-reducing end in the Fc region sugar chain was determined by a diagnostic agent in combination with protein A or prorain G and the Man sugar chain recognition lectin CoA (concanavalin A) or LCA (lenscarinaris aglycinin). A method for diagnosing rheumatism (Patent Document 2) for detecting is known.
As a method for analyzing the sugar chain of an antibody drug, the presence or absence of Fuc modification related to ADCC activity of the Fc region sugar chain of the IgG antibody denatured by the reduction treatment can be detected using AAL lectin (Non-Patent Document 4). )It has been known. Similarly, it has been suggested that various other sugar chains involved in ADCC activity or CDC activity in the Fc region can also be detected using lectins that recognize them (Patent Documents 3 and 4).
However, in each case, the sugar chain-specific lectin is used to detect a specific sugar chain expressed specifically for a specific disease or a specific sugar chain related to ADCC or CDC activity in the Fc region essential as an antibody drug. This was an attempt, and was not a method for detecting all sugar chains added to the Fab region of an antibody.
本発明は、こうした諸問題に鑑み、Ｆａｂ領域に糖鎖が付加された抗体を検出するための簡便な方法、特に組み換え技術により産生されたＩｇＧ抗体のＦａｂ領域に糖鎖が付加された抗体のみを，簡便で迅速、かつ正確に検出する方法を提供することを課題とする。そのことにより、抗体医薬開発早期の段階でのスクリーニング工程において、抗原性や体内動態への影響が懸念される抗体産生株を簡便かつ迅速に除去することのできる方法を提供しようとするものである。 In view of these problems, the present invention is a simple method for detecting an antibody having a sugar chain added to the Fab region, particularly only an antibody having a sugar chain added to the Fab region of an IgG antibody produced by a recombination technique. It is an object of the present invention to provide a simple, quick, and accurate method for detecting. By doing so, it is intended to provide a method capable of easily and quickly removing antibody-producing strains that may affect antigenicity or pharmacokinetics in the screening process at an early stage of antibody drug development. ..
本発明者は上記課題を解決すべく、Ｆｃ領域と共にＦａｂ領域にも糖鎖を有することが知られ、それぞれの糖鎖情報も明らかとなっている市販の抗体医薬であるセツキシマブ（イムノクローンシステムズ社製）をモデルとして用い、Ｆｃ領域のみに糖鎖を有するパリビズマブなどとの反応性をアフィニティ分子マトリクス電気泳動（特許文献５）により比較した。その際、対象抗体は還元処理などの変性処理や、他のタンパク質との融合体形成などの前処理を施すことなく用いた。
その結果、レクチンのうちでも典型的なＲ-型（Ｒタイプ）レクチンに属するＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０）では、抗体のＦａｂ領域に付加された糖鎖とは相互作用するが、抗体本来のＦｃ領域の糖鎖とは相互作用しないことが観察された。
ＲＣＡ−ＩはＧａｌ認識性レクチンであり、Ｇａｌ残基を非還元末端に有する糖鎖はＦａｂ領域のみならずＦｃ領域にも存在していることを考慮すると、ＲＣＡ−ＩがＦａｂ糖鎖のみを認識できたことは驚くべきことである。同じＲ-型レクチンに属するＳＳＡでも同様にＦａｂ糖鎖のみに反応性を示した。
Ｆａｂ糖鎖を有する抗体が含まれているヒト血清由来ＩｇＧを未変性の状態で各種レクチンとの反応性を確認したところ、明らかな反応性を確認できたのは、Ｒ-型レクチンに属するＳＳＡのみであった。
In order to solve the above problems, the present inventor is known to have sugar chains in the Fab region as well as the Fc region, and cetuximab (Immunoclon Systems), which is a commercially available antibody drug whose sugar chain information is also clarified. (Manufactured) was used as a model, and the reactivity with paribismab or the like having a sugar chain only in the Fc region was compared by affinity molecule matrix electrophoresis (Patent Document 5). At that time, the target antibody was used without any denaturation treatment such as reduction treatment or pretreatment such as fusion formation with other proteins.
As a result, in RCA-I (RCA120), which belongs to a typical R-type (R type) lectin among lectins, it interacts with the sugar chain added to the Fab region of the antibody, but the Fc region inherent to the antibody. It was observed that it did not interact with the sugar chains of.
Considering that RCA-I is a Gal-recognizable lectin and that sugar chains having a Gal residue at the non-reducing end are present not only in the Fab region but also in the Fc region, RCA-I has only Fab sugar chains. It is amazing to be able to recognize it. Similarly, SSAs belonging to the same R-type lectin also showed reactivity only with Fab sugar chains.
When the reactivity of human serum-derived IgG containing an antibody having a Fab sugar chain with various lectins was confirmed in an undenatured state, the clear reactivity was confirmed by SSA belonging to R-type lectin. It was only.
そこで、これらの現象が、Ｒ-型レクチンで一般的な現象かどうかを調べるために、本発明者らが開発したレクチンアレイを用いて、Ｆａｂ領域にも糖鎖を有する抗体であるセツキシマブと、パリビズマブなどのＦｃ領域のみに糖鎖を有する抗体との各種レクチンの反応性を網羅的に検討した。
その結果、Ｒ-型レクチンに属するＲＣＡ−Ｉ及びＳＳＡと共にＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ）、ｒＰＳＬ１a（Polyporus squamosusレクチンの組み換え体）、ｒＡＣＧ（Agrocybe cylindraceaレクチンの組み換え体）、ｒＭＯＡ（Marasmius oreadesレクチンの組み換え体）は全てＦａｂ領域の糖鎖のみに反応する特性を有していることが確認できた。
Therefore, in order to investigate whether these phenomena are general phenomena in R-type lectins, cetuximab, which is an antibody having a sugar chain also in the Fab region, is used with the lectin array developed by the present inventors. The reactivity of various lectins with an antibody having a sugar chain only in the Fc region such as paribismab was comprehensively examined.
As a result, along with RCA-I and SSA belonging to R-type lectins, SNA (SNA-I), rPSL1a (recombinant of Polyporus squamosus lectin), rACG (recombinant of Agrosybe cylindracea lectin), rMOA (recombinant of Marasmius oreades lectin) ), It was confirmed that all of them have the property of reacting only with the sugar chain in the Fab region.
また、各種の測定方法での挙動を確認するため、Ｒ-型レクチンのＲＣＡ−Ｉなどについてラテラルフローアッセイ及びＥＬＩＳＡ法により、各抗体の糖鎖との反応性を測定したところ、電気泳動結果と同様に、Ｆａｂ領域に糖鎖を有する抗体のみと反応することを確認できた。 In addition, in order to confirm the behavior of various measurement methods, the reactivity of each antibody with the sugar chain was measured by the lateral flow assay and ELISA method for RCA-I of R-type lectin, and the result was an electrophoresis result. Similarly, it was confirmed that it reacts only with the antibody having a sugar chain in the Fab region.
以上のように、Ｒ-型レクチンに属するレクチン群は、抗体のＦａｂ領域に付加された糖鎖とは相互作用するがＦｃ領域の糖鎖は相互作用しないという特異的な性質を有していることがわかった。このようなレクチンを用いた簡易アッセイ系により、簡便かつ迅速にＦａｂ領域に糖鎖を有する抗体を検出できる。これらは抗体医薬の研究開発において非常に画期的かつ重要である。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。
As described above, the lectin group belonging to the R-type lectin has a specific property that it interacts with the sugar chain added to the Fab region of the antibody but does not interact with the sugar chain in the Fc region. I understood it. By such a simple assay system using a lectin, an antibody having a sugar chain in the Fab region can be detected easily and quickly. These are very epoch-making and important in the research and development of antibody drugs.
By obtaining the above findings, the present invention could be completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕Ｆａｂ領域糖鎖特異的な親和性を有する少なくとも一種類のＲ-型レクチンを用いることを特徴とする、Ｆａｂ領域に糖鎖を有する抗体の検出方法。
〔２〕 抗体が、遺伝子組み換え技術により合成された重鎖及び軽鎖を有するモノクローナル抗体である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 検出方法において、前記少なくとも一種類のＲ-型レクチンが固定化されている固相が用いられることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 検出方法が、アフィニティ電気泳動法、ラテラルフローアッセイ、レクチン−レクチンサンドイッチ法、及びＥＬＩＳＡからなる群から選択されたいずれかの方法である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記少なくとも一種類のＲ-型レクチンが、ＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０）、ＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ）、ＳＳＡ、ＰＳＬ（ＰＳＬ１ａ）、及びＭＯＡレクチンからなる群から選択されたいずれか一種類のレクチンであることを特徴とする，前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕に記載のいずれかの方法に用いるための固相であって、Ｆａｂ領域糖鎖特異的な親和性を有する少なくとも一種類のＲ-型レクチンを固定化した固相。
〔７〕 固相が、多孔性膜、プレート及びビーズからなる群から選択されたいずれか一種類の固相である、前記〔６〕に記載の固相。
〔８〕 前記〔１〕〜〔５〕に記載のいずれかの方法でＦａｂ領域に糖鎖を有する抗体を検出するための装置又はキットであって、Ｆａｂ領域糖鎖特異的な親和性を有する少なくとも一種類のＲ-型レクチンを含むことを特徴とする装置又はキット。
〔９〕 検出用装置又はキットが、前記少なくとも一種類のＲ-型レクチンに属するレクチンが固定化された固相を含むことを特徴とする、前記〔８〕に記載の装置又はキット。
〔１０〕 前記少なくとも一種類のＲ-型レクチンが、ＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０）、ＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ）、ＳＳＡ、ＰＳＬ（ＰＳＬ１ａ）、及びＭＯＡレクチンからなる群から選択されたいずれか一種類のレクチンであることを特徴とする、前記〔８〕又は〔９〕に記載の装置又はキット。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for detecting an antibody having a sugar chain in the Fab region, which comprises using at least one type of R-type lectin having a Fab region sugar chain-specific affinity.
[2] The method according to [1] above, wherein the antibody is a monoclonal antibody having a heavy chain and a light chain synthesized by a gene recombination technique.
[3] The method according to the above [1] or [2], wherein a solid phase in which at least one type of R-type lectin is immobilized is used in the detection method.
[4] The detection method is any of the methods selected from the group consisting of affinity electrophoresis, lateral flow assay, lectin-lectin sandwich method, and ELISA, according to any one of the above [1] to [3]. The method described.
[5] The at least one type of R-type lectin is any one type selected from the group consisting of RCA-I (RCA120), SNA (SNA-I), SSA, PSL (PSL1a), and MOA lectin. The method according to any one of the above [1] to [4], which is characterized by being a lectin.
[6] At least one type of R-type lectin having a Fab region sugar chain-specific affinity, which is a solid phase for use in any of the methods described in [1] to [5] above, is immobilized. Solid phase.
[7] The solid phase according to the above [6], wherein the solid phase is any one type of solid phase selected from the group consisting of a porous membrane, a plate and beads.
[8] An apparatus or kit for detecting an antibody having a sugar chain in the Fab region by any of the methods described in [1] to [5] above, which has a Fab region sugar chain-specific affinity. A device or kit comprising at least one R-type lectin.
[9] The device or kit according to the above [8], wherein the detection device or kit includes a solid phase in which a lectin belonging to at least one type of R-type lectin is immobilized.
[10] The at least one type of R-type lectin is any one type selected from the group consisting of RCA-I (RCA120), SNA (SNA-I), SSA, PSL (PSL1a), and MOA lectin. The device or kit according to the above [8] or [9], which is a lectin.
本発明の方法により、Ｒ-型レクチンを抗原抗体反応で一般的に用いられる親和電気泳動、ラテラルフローラルアッセイ、ＥＬＩＳＡ法などの免疫測定手段に適用でき、Ｆａｂ領域に糖鎖を有する抗体のみを簡便に検出することができる。そのことにより、抗体医薬開発の早期の段階で、抗原性や体内動態への影響が懸念される抗体産生株を速やかに排除することができる。 According to the method of the present invention, the R-type lectin can be applied to immunoassay means such as affinity electrophoresis, lateral floral assay, and ELISA method generally used in antigen-antibody reaction, and only an antibody having a sugar chain in the Fab region is simplified. Can be detected. As a result, antibody-producing strains that may affect antigenicity or pharmacokinetics can be promptly eliminated at an early stage of antibody drug development.
１．Ｒ-型（Ｒ-タイプ）レクチン
本発明は、Ｆａｂ領域に糖鎖を有する抗体の検出に際して、Ｆａｂ領域糖鎖特異的な親和性を有するＲ-型レクチンを用いることを特徴としている。
本発明で用いられるＲ-型（Ｒ-タイプ）レクチンに属するレクチンは、リシンＢレクチン（Ricin-type beta-trefoil lectin domain、リシンＢ関連レクチン）などとも呼ばれる。タンパク質ドメインファミリーデータベース（Pfam）のRicin_B_lectin (PF00652)及びRicinB_lectin_2(PF14200)に属するタンパク質群である。細菌を含む生物界で広く見いだされるレクチンで、いずれの生物種由来レクチンのＣＤＲ（carbohydrate-recognition domein；糖質認識ドメイン）も保存性が高く、ヒマ種子毒リシンのＣＲＤと立体構造的に類似している（Rajesh K.Gupta et al, Animal Lectins: Form, Function and Clinical Applications (2012),pp.313-330）。
具体的には、Ａｂｒｉｎ、ＣＢＭ１３、ＣＥＬ−ＩＩＩ、ＥＷ２９、ＥＷ２９−Ｃｈ、Ｅｂｕｌｉｎ、ＨＡ１（ｔｙｐｅＣ）、ＬＳＬ、ＭＣＬ、ＭＯＡ、ＰＳＬ、ＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０）、ＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ）、ＳＮＡ−ＩＩ、ＳＮＡ−ＩＩＩ、ＳＮＡ−Ｖ、ＳＮＡ−ＩＶ、ＳＲＣ、ＳＳＡ、ＳｏＣＢＭ１３、ＶＡＡなどが例示できる（LfDB-Lectin Frontier DataBaseによる。）
本発明の好ましいＲ−型レクチンとしは、Ａｂｒｉｎ（トウアズキ（jequirity bean）由来のＧａｌ認識レクチン）、ＣＢＭ１３（放線菌（Streptomyces lividans）由来のＧａｌ等認識レクチン）、ＥＷ２９−Ｃｈ（ミミズ（Earth worm）由来のＧａｌ認識レクチン）、Ｅｂｕｌｉｎ（スイカズラ（Danewort）由来のＧａｌ認識レクチン）、ＬＳＬ（アイカワタケ（Laetiporus sulphureus）由来のラクトース認識レクチン）、ＭＯＡ（シバフタケ（Scotch bonnet）由来のＧａｌα１−３Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ認識レクチン）、ＰＳＬ（組換え体ＰＳＬ１ａ、アミヒラタケ(Polyporus squamosus)由来のＳｉａ（α２−６Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ）認識レクチン）、ＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０、ヒマ、トウゴマ（Castor oil bean,Caster Bean）由来のＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ認識レクチン）、ＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ、セイヨウニワトコ（Elderberry）由来のＮｅｕＡｃ／ａ２−６Ｓｉａ認識レクチン）、ＳＲＣ（ミミズ（Earth worm）由来のＮｅｕＡｃ認識レクチン）、ＳＳＡ（ニワトコ（Red-berried Elder）由来のＮｅｕＡｃ、Ｓｉａ認識レクチン）、ＳｏＣＢＭ１３（放線菌（Streptomyces oliveceoviridis E-86）由来のＧａｌ等認識レクチン）、ＭＬ−Ｉ（ヤドリギ（Viscum album L.）由来のＧａｌＮＡｃ認識レクチン）であり、より好ましくは、ＲＣＡ−Ｉ（ＲＣＡ１２０）、ＳＮＡ（ＳＮＡ−Ｉ）、ＳＳＡ、ＰＳＬ（ＰＳＬ１ａ）、又はＭＯＡレクチンである。
1. 1. R-type (R-type) lectin The present invention is characterized in that an R-type lectin having a Fab region sugar chain-specific affinity is used in detecting an antibody having a sugar chain in the Fab region.
The lectin belonging to the R-type (R-type) lectin used in the present invention is also called a ricin-type beta-trefoil lectin domain (ricin-type beta-trefoil lectin domain) or the like. It is a group of proteins belonging to Ricin_B_lectin (PF00652) and RicinB_lectin_2 (PF14200) of the protein domain family database (Pfam). It is a lectin widely found in the biological world including bacteria, and the CDR (carbohydrate-recognition domein) of lectins derived from any species is highly conserved and is three-dimensionally similar to the CRD of castor bean venom ricin. (Rajesh K. Gupta et al, Animal Lectins: Form, Function and Clinical Applications (2012), pp.313-330).
Specifically, Abrin, CBM13, CEL-III, EW29, EW29-Ch, Ebulin, HA1 (typeC), LSL, MCL, MOA, PSL, RCA-I (RCA120), SNA (SNA-I), SNA- Examples thereof include II, SNA-III, SNA-V, SNA-IV, SRC, SSA, SoCBM13, and VAA (according to LfDB-Lectin Frontier DataBase).
Preferred R-type lectins of the present invention include Abrin (Gal recognition lectin derived from jequirity bean), CBM13 (Gal recognition lectin derived from Streptomyces lividans), and EW29-Ch (Earth worm). Gal recognition lectin derived from Galin (Gal recognition lectin derived from Danewort), LSL (Lactose recognition lectin derived from Laetiporus sulphureus), MOA (Gal α1-3Gal / GalNAc recognition lectin derived from Scotch bonnet) ), PSL (recombinant PSL1a, Sia (α2-6 Scientific Acid) recognition lectin derived from Polyporus squamosus), RCA-I (RCA120, Hima, Gal / GalNAc recognition derived from castor bean) Lectin), SNA (SNA-I, NeuAc / a2-6Sia recognition lectin derived from Elderberry), SRC (NeuAc recognition lectin derived from Earth worm), SSA (Red-berried Elder) NeuAc (Sia recognition lectin), SoCBM13 (Gal recognition lectin derived from streptomyces oliveceoviridis E-86), ML-I (GalNAc recognition lectin derived from Yadrigi (Viscum album L.)), more preferably. RCA-I (RCA120), SNA (SNA-I), SSA, PSL (PSL1a), or MOA lectin.
また、これらＲ-型レクチンはいずれも単独で用いることができるが、糖鎖認識性の異なる２以上のレクチンを組み合わせて用いてもよい。例えば、ＲＣＡ−Ｉ（Ｇａｌ認識レクチン）及びＳＮＡ（ＮｅｕＡｃ、Ｓｉａ認識レクチン）を組み合わせることができる。組み合わせる際に、いずれかのＲ-型レクチンを固相化し、他のレクチンを液相中で捕捉用レクチンとして用いてもよいが、両者を同じ固相表面に固定化してもよい。
さらに、キット化に際しては、コントロールとしてＦａｂ領域の糖鎖認識能のないＲ-型以外のレクチンを組み合わせても良い。その際には、Ｒ-型レクチンと同じ固相表面に固定化してコントロールとするか、また、液相中で捕捉用レクチンとして用いるＲ-型レクチンと競合させるために液相中に共存させておくこともできる。
Further, although any of these R-type lectins can be used alone, two or more lectins having different sugar chain recognizability may be used in combination. For example, RCA-I (Gal recognition lectin) and SNA (NeuAc, Sia recognition lectin) can be combined. At the time of combination, either R-type lectin may be immobilized and the other lectin may be used as a capture lectin in the liquid phase, or both may be immobilized on the same solid phase surface.
Further, in making a kit, a lectin other than R-type having no ability to recognize sugar chains in the Fab region may be combined as a control. In that case, it is immobilized on the same solid phase surface as the R-type lectin to control it, or it is allowed to coexist in the liquid phase in order to compete with the R-type lectin used as a capture lectin in the liquid phase. You can also leave it.
なお、Ｒ-型レクチンには属さないが、本発明のＦａｂ領域糖鎖検出用レクチンとしては、他にｒＡＣＧ（Agrocybe cylindraceaレクチンの組み換え体）、ＴＪＡＩ（Trichosanthes japonicaレクチン）、ｒＧａｌ９Ｎ（ガレクチン９のＮ末端ドメインの組み換え体）、ｒＯｒｙｓａｔａ（Oryza sativaレクチンの組み換え体）及びＰＳＡ（Pisum sativumレクチン））ｒＧＣ２、ｒＲＯＡを用いることもできる。 Although it does not belong to the R-type lectin, other lectins for detecting Fab region sugar chains of the present invention include rACG (recombinant of Agrocybe cylindracea lectin), TJAI (Trichosanthes japonica lectin), and rGal9N (N of galectin 9). Terminal domain recombinants), rOrysata (recombinant of Oryza sativa lectin) and PSA (Pisum sativum lectin) rGC2, rROA can also be used.
２．本発明の検出対象
（２−１）検出対象となる糖鎖
本発明の検出対象となる糖鎖としては、Ｆａｂ領域に結合した糖鎖であれば、Ｎ−結合型糖鎖であっても、Ｏ−結合型糖鎖であっても、またどのような糖鎖構造を有する糖鎖であってもよい。例えば、非ヒト型糖鎖構造を検出することができる。
典型的なＦａｂ糖鎖としては、従来シアル酸含有糖鎖（ＮｅｕＧｃ含む）やαガラクトース含有糖鎖（非特許文献３、５）が知られているがこれら糖鎖には限定されない。
2. 2. Detectable target (2-1) of the present invention Sugar chain to be detected The sugar chain to be detected of the present invention may be an N-linked sugar chain as long as it is a sugar chain bound to the Fab region. It may be an O-linked sugar chain or a sugar chain having any sugar chain structure. For example, a non-human sugar chain structure can be detected.
Conventionally, sialic acid-containing sugar chains (including NeuGc) and α-galactose-containing sugar chains (Non-Patent Documents 3 and 5) are known as typical Fab sugar chains, but the sugar chains are not limited to these.
（２）検出対象となる抗体
本発明が対象とする抗体は、Ｆａｂ領域に糖鎖を有するモノクローナル抗体であり、通常はＦｃ領域にも糖鎖を有する。特に、遺伝子組み換え技術により人工的に合成された、重鎖及び軽鎖を含みかつＦｃ領域を有するモノクローナル抗体を対象とする。当該抗体のクラスは、ＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＭなどの様々なクラスの抗体であり得るが、ＩｇＧ抗体であることが好ましい。
なお、ヒトなど正常な哺乳動物の血液やリンパ液などの体液中には、Ｆａｂ領域に糖鎖を有するＩｇＧ抗体もある一定の割合で含まれているが、本発明では、これらの正常な個体が産生する抗体の検出は意図していない。典型的には、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞を宿主とした形質転換体により産生された組換えＩｇＧ抗体である。
本発明の対象となる抗体のＦａｂ領域の糖鎖としては、どのような糖鎖も対象となるが、例えば「Ｇａｌ-α１-３Ｇａｌ」などのヒト体内では見られない糖鎖を含む糖鎖、及び／又は宿主細胞由来の糖鎖であることが好ましい。
(2) Antibody to be detected The antibody to be detected by the present invention is a monoclonal antibody having a sugar chain in the Fab region, and usually has a sugar chain in the Fc region as well. In particular, monoclonal antibodies containing heavy and light chains and having an Fc region, which are artificially synthesized by genetic recombination technology, are targeted. The class of the antibody can be various classes of antibodies such as IgG, IgA, IgM, but is preferably an IgG antibody.
In addition, IgG antibodies having sugar chains in the Fab region are also contained in a certain proportion in body fluids such as blood and lymph of normal mammals such as humans, but in the present invention, these normal individuals are contained. The detection of the antibody produced is not intended. Typically, it is a recombinant IgG antibody produced by a transformant hosted on mammalian cells, including human cells.
Any sugar chain can be used as the sugar chain in the Fab region of the antibody that is the subject of the present invention, but for example, a sugar chain containing a sugar chain that is not found in the human body, such as "Gal-α1-3Gal". And / or a sugar chain derived from a host cell is preferable.
（３）検出対象となる抗体含有試料
本発明の検出対象となる抗体含有試料は、典型的には抗体医薬製造時の組換え細胞などから産生された抗体を含有する試料である。その際、対象となる抗体は精製されていることは好ましいが、精製前の培養液を含む状態であっても、本発明を適用することができる。
抗体医薬の製造において、創薬段階で候補を絞り込む際に、９６穴プレートなどを用いたセルスクリーニングにより高生産株をピックアップした後の工程で、本発明のＦａｂ糖鎖修飾検出法を適用することで、Ｆａｂ領域に糖鎖修飾を有する抗体のみをふるい落とすことができる。または、組換え細胞やハイブリドーマなどによって医薬用として各種抗体を産生する場合に、まれにＦａｂ領域に糖鎖が結合する場合があるため、その品質管理のためにＦａｂ糖鎖の検出に用いることができる。
(3) Antibody-containing sample to be detected The antibody-containing sample to be detected in the present invention is typically a sample containing an antibody produced from recombinant cells or the like during the production of an antibody drug. At that time, it is preferable that the target antibody is purified, but the present invention can be applied even in a state containing the culture solution before purification.
In the production of antibody drugs, when narrowing down candidates at the drug discovery stage, the Fab sugar chain modification detection method of the present invention is applied in the step after picking up high-producing strains by cell screening using a 96-well plate or the like. Therefore, only the antibody having the sugar chain modification in the Fab region can be screened out. Alternatively, when various antibodies are produced for pharmaceutical use by recombinant cells or hybridomas, sugar chains may rarely bind to the Fab region, so that they can be used to detect Fab sugar chains for quality control. it can.
または、本発明の検出対象となる試料が生体細胞由来の抗体を含む血清など血液や、唾液、鼻汁などの体液であってもよい。
例えば、がんや病原体により特定の疾患に罹患した際にＦａｂ領域に糖鎖が結合することが知られている場合であれば、罹患したおそれのある患者や動物由来の血液、唾液、鼻汁などの試料を用いて、本発明を適用して当該Ｆａｂ糖鎖の存在を検出することで、その疾患への罹患の有無や程度を判定することができる。
Alternatively, the sample to be detected in the present invention may be blood such as serum containing an antibody derived from a living cell, or body fluid such as saliva or nasal discharge.
For example, if it is known that sugar chains bind to the Fab region when a specific disease is caused by cancer or a pathogen, blood, saliva, nasal discharge, etc. derived from a patient or animal that may be affected, etc. By applying the present invention to detect the presence of the Fab sugar chain using the sample of the above, it is possible to determine the presence or absence and degree of morbidity with the disease.
３．本発明の測定方法及びそのためのキット
本発明のＲ-型レクチンを、担体に固定化し、既知のアフィニティ電気泳動（アフィノフォレシス、親和性電気泳動、親和膜電気泳動）、ラテラルフローアッセイ、レクチン−レクチンサンドイッチ法、ＥＬＩＳＡ等を適用する。レクチン−レクチンサンドイッチ法又はＥＬＩＳＡの場合は、担体に固定化しないＲ-型レクチンを、直接的又は間接的に標識し、オーバーレイすることも可能である。本発明では、親和膜電気泳動法、ラテラルフローアッセイ、又はＥＬＩＳＡが好ましい。２種類のＲ-型レクチンを組み合わせたレクチン−レクチンサンドイッチ法も有効である。
3. 3. The measurement method of the present invention and the kit for the present invention, the R-type lectin of the present invention is immobilized on a carrier, and known affinity electrophoresis (affinophoresis, affinity electrophoresis, affinity membrane electrophoresis), lateral flow assay, lectin- The lectin sandwich method, ELISA, etc. are applied. In the case of the lectin-lectin sandwich method or ELISA, it is also possible to directly or indirectly label and overlay the R-type lectin that is not immobilized on the carrier. In the present invention, affinity membrane electrophoresis, lateral flow assay, or ELISA is preferred. The lectin-lectin sandwich method, which combines two types of R-type lectins, is also effective.
（３−１）Ｒ-型レクチンの固定化
Ｒ-型レクチンを固定化する担体としては、一般的な固定化用担体が適用でき、その固定化方法も既知の固定化方法を適用すればよい。固定化用担体としては、特に、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜などの多孔質膜、又はガラスやプラスチック製のプレート、ビーズなどが好ましい。
また、レクチンの担体への固定化方法は、既知の物理的吸着法、化学的な結合法のいずれでも好く、担体に直接固定化する直接法でも、レクチンをビオチン化してからアビジンコートプレートに固定化するビオチン−アビジン間接法でもよい。
(3-1) Immobilization of R-type lectin As a carrier for immobilizing R-type lectin, a general immobilization carrier can be applied, and a known immobilization method may be applied as the immobilization method. .. As the immobilization carrier, a porous membrane such as a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane, or a glass or plastic plate or beads is particularly preferable.
Further, as the method for immobilizing the lectin on the carrier, either a known physical adsorption method or a chemical binding method is preferable. Even in the direct method of directly immobilizing the lectin on the carrier, the lectin is biotinylated and then applied to the avidin-coated plate. The biotin-avidin indirect method for immobilization may also be used.
（３−２）アフィニティ電気泳動
アフィニティ電気泳動としては、レクチンをアフィニティリガンドとして含むゲルで電気泳動を行う、レクチン親和性電気泳動が一般的であるが、レクチンを、疎水性ポリマー膜に結合させた電気泳動であるアフィニティ分子マトリクス電気泳動を用いることができる。
Ｒ-型レクチンを用いるアフィニティ分子マトリクス電気泳動は、Ｒ-型レクチンを含む疎水性ポリマー膜に被検抗体試料を塗布して泳動を行い、その後、標識抗体コンジュゲートで発色させる方法などを用いることができる。また、被検抗体試料をあらかじめ蛍光色素などで標識した後に、Ｒ-型レクチンを含む疎水性ポリマー膜に塗布し、泳動後の膜を、蛍光イメージャーなどで可視化する方法などを用いることができる（特許文献５）。
(3-2) Affinity Electrophoresis As the affinity electrophoresis, lectin-affinity electrophoresis, in which electrophoresis is performed on a gel containing lectin as an affinity ligand, is common, but lectin is bound to a hydrophobic polymer film. Affinity molecule matrix electrophoresis, which is electrophoresis, can be used.
Affinity molecule matrix electrophoresis using R-type lectins is performed by applying a test antibody sample to a hydrophobic polymer film containing R-type lectins, performing electrophoresis, and then using a labeled antibody conjugate to develop color. Can be done. Further, a method can be used in which the test antibody sample is labeled with a fluorescent dye or the like in advance, then applied to a hydrophobic polymer membrane containing an R-type lectin, and the membrane after migration is visualized with a fluorescent imager or the like. (Patent Document 5).
レクチン親和膜電気泳動法では、多孔質膜（例えば、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜など）又はプレートに、本発明のＲ-型レクチンを固定化させて用いる。レクチン親和膜電気泳動法のキットとしては、１つ以上のＲ-型レクチンを結合させたＰＶＤＦ膜などのメンブレン、検出用の標識化抗体を含むものが好ましく、さらに緩衝液などを組み合わせたキットがより好ましい。 In the lectin-affinity membrane electrophoresis method, the R-type lectin of the present invention is used by immobilizing it on a porous membrane (for example, PVDF membrane, nitrocellulose membrane, etc.) or a plate. As the lectin-affinity membrane electrophoresis kit, a membrane such as a PVDF membrane to which one or more R-type lectins are bound, a kit containing a labeled antibody for detection is preferable, and a kit in which a buffer solution or the like is further combined is preferable. More preferred.
（３−３）ラテラルフローアッセイ（ラテラルフローイムノアッセイ）
ラテラルフローアッセイ（ラテラルフローイムノアッセイ）では、検出用に標識したコロイド貴金属ナノ粒子（金ナノ粒子）,ラテックス微粒子、蛍光色素などと抗体（典型的にはヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体）とのコンジュゲートを用いる。メンブレン（ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜など）上には、あらかじめＲ-型レクチンをライン状に固定化したテストラインを設けておき、被検抗体を含む液体試料をメンブレンの一端にアプライし、次いで標識抗体コンジュゲートをアプライする。テストライン上での標識（蛍光）量を測定することで、又は目視で、Ｒ-型レクチンと被検抗体との結合性の有無簡便に検出できる。なお、必要に応じ、結合しなかったレクチンを検出するためのコントロールラインを設けておくこともできる。
(3-3) Lateral flow assay (lateral flow immunoassay)
The lateral flow assay (lateral flow immunoassay) uses a conjugate of colloidal noble metal nanoparticles (gold nanoparticles), latex microparticles, fluorescent dyes, etc. labeled for detection with an antibody (typically a goat anti-human IgG antibody). .. A test line in which R-type lectins are immobilized in a line shape is provided in advance on the membrane (nitrocellulose membrane, cellulose acetate membrane, etc.), and a liquid sample containing the test antibody is applied to one end of the membrane, and then Apply labeled antibody conjugate. The presence or absence of binding between the R-type lectin and the test antibody can be easily detected by measuring the amount of label (fluorescence) on the test line or visually. If necessary, a control line for detecting the unbound lectin can be provided.
ラテラルフローアッセイ用キットとしては、１つ以上のＲ−型レクチンを含むものであり、さらに、例えば金ナノ粒子とヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体とのコンジュゲート、及び１つ以上のＲ−型レクチンを固定化したニトロセルロース膜などのメンブレンなどを組み合わせたキットなどが好ましい。 The kit for the lateral flow assay includes one or more R-type lectins, and further, for example, a conjugate of gold nanoparticles and a goat anti-human IgG antibody, and one or more R-type lectins are immobilized. A kit or the like that combines a membrane such as a nitrocellulose membrane that has been converted is preferable.
（３−４）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡでは、通常のＥＬＩＳＡ用装置をそのまま用いることができ、少なくとも１つのＲ-型レクチンと抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＦｃ抗体等の被検抗体のタンパク質領域を認識する抗体とを組み合わせる。Ｒ-型レクチンは、固相側に固定化しても、オーバーレイする側に用いてもよいが、ビオチン化したＲ-型レクチンをアビジンプレートに固定化し、被検抗体を含む液体試料を反応させ、洗浄後にＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体など標識を反応させる検出法が好ましい。
そのようなＥＬＩＳＡ用キットの好ましい例としては、１つ以上のＲ-型レクチンを固定化したレクチンプレートを含み、さらに検出用のＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体などを組み合わせることができる。
(3-4) ELISA
In ELISA, a normal ELISA device can be used as it is, and at least one R-type lectin is combined with an antibody that recognizes a protein region of a test antibody such as an anti-human IgG antibody and an anti-human Fc antibody. The R-type lectin may be immobilized on the solid phase side or used on the overlay side, but the biotinylated R-type lectin is immobilized on an avidin plate, and a liquid sample containing the test antibody is reacted. A detection method in which a label such as an HRP-labeled anti-human Fc antibody is reacted after washing is preferable.
A preferred example of such an ELISA kit includes a lectin plate on which one or more R-type lectins are immobilized, and can be further combined with an HRP-labeled anti-human Fc antibody for detection.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、例示のみを意図したものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。材料や試薬は特に断らない限り、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製できる。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
Examples are shown below and the present invention will be specifically described, but the present invention is intended only as an example and does not limit the technical scope of the present invention.
Other terms and concepts in the present invention are based on the meanings of terms commonly used in the art, and various techniques used to carry out the present invention particularly include techniques that clearly indicate their source. Except for this, those skilled in the art can easily and surely carry out the procedure based on known documents and the like. Unless otherwise specified, materials and reagents are commercially available or can be obtained or prepared according to methods commonly used in the art and procedures in publicly known literature. In addition, various analyzes were performed by applying the methods described in the analytical instruments or reagents used, the instruction manuals for the kits, catalogs, and the like mutatis mutandis.
The technical documents, patent gazettes, and patent application specifications cited in the present specification shall be referred to as the description contents of the present invention.
本実施例では、Ｆｃ領域と共にＦａｂ領域にも糖鎖を有する抗体モデルとして下記（表１）に示す市販抗体医薬のセツキシマブを、Ｆｃ領域のみに糖鎖を有する抗体モデルとしては、同パリビズマブ、モガリズマブ、パニツムマブ及びデノスマブを用いた。 In this example, cetuximab, a commercially available antibody drug shown in the following (Table 1), is used as an antibody model having a sugar chain in the Fab region as well as the Fc region, and panitumumab and mogarizumab are used as antibody models having a sugar chain only in the Fc region. , Panitumumab and denosumab were used.
（実施例１） ＲＣＡ−Ｉレクチン親和膜電気泳動によるFab糖鎖抗体の検出
（１−１）レクチン親和電気泳動膜の作成
市販のＰＶＤＦ膜（Immobilon-P,ミリポア社製）を縦６センチ、横３センチに切り取り、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）に３０分間浸した。その後、膜を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＣＡ−Ｉ（Ricinus communis AgglutininＩ)を含む前記緩衝液に３０分間浸し、ついで０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。レクチンを結合させない膜は、メタノールからとりだした後、直接ポリビニルアルコールを含む上記緩衝液に浸した。膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、電気泳動に使用した。
(Example 1) Detection of Fab sugar chain antibody by RCA-I lectin-affinity membrane electrophoresis (1-1) Preparation of lectin-affinity electrophoresis membrane A commercially available PVDF membrane (Immobilon-P, manufactured by Millipore) is 6 cm in length. It was cut to a width of 3 cm and immersed in methanol for several minutes. The PVDF membrane was then removed from methanol and immersed in 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) for 30 minutes. The membrane was then immersed in the buffer containing RCA-I (Ricinus communis Agglutinin I) at a concentration of 1 mg / ml for 30 minutes and then in the buffer containing 0.25% polyvinyl alcohol for 30 minutes. The membrane to which the lectin was not bound was taken out from methanol and then directly immersed in the above buffer solution containing polyvinyl alcohol. The excess solution adhering to the membrane was lightly wiped off with a filter paper and then used for electrophoresis.
（１−２）レクチン親和膜電気泳動
泳動槽には、セルロースアセテート膜電気泳動装置（ＥＰＣ１０５ＡＡ型、アドバンテック社製）を使用した。抗体医薬であるセツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）とパニツムマブ（アムジェン社製）を膜の下端から１センチの部位にそれぞれ１００ナノグラムをアプライし、通電した。通電条件は、膜の幅１ｃｍあたり１．０ｍＡとし、泳動時間は３０分間とした。泳動緩衝液には０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用した。
(1-2) Lectin Affinity Membrane Electrophoresis A cellulose acetate membrane electrophoresis apparatus (EPC105AA type, manufactured by Advantech Co., Ltd.) was used for the electrophoresis tank. 100 nanograms of cetuximab (manufactured by ImClone Systems) and panitumumab (manufactured by Amgen), which are antibody drugs, were applied to a site 1 cm from the lower end of the membrane and energized. The energization condition was 1.0 mA per 1 cm of membrane width, and the migration time was 30 minutes. A 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) was used as the electrophoresis buffer.
（１−３）抗体の検出
泳動後の膜をアセトン中で１５分間振とうした後、従来公知の方法に従い実施した。具体的には、固定化後の膜を、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ｔｗｅｅｎ）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した。
振とう洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔで５,０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ｔｗｅｅｎ）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した後、ＰＢＳで洗浄しWestern Lightning Plus-ECLキット（パーキンエルマー社製）により発光させゲルイメージャーChemDoc XRS（バイオラッド社製）により画像データを取得した。
(1-3) Detection of antibody The membrane after electrophoresis was shaken in acetone for 15 minutes and then carried out according to a conventionally known method. Specifically, the immobilized membrane was blocked by shaking in phosphate buffered saline (PBS) containing 5% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour. The membrane was washed with PBS-T (0.05% tween) for 5 minutes, and this washing operation was repeated a total of 3 times.
After washing with shaking, the horseradish peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody was immersed in a solution diluted 5,000-fold with PBS-T and shaken for 1 hour. Then, the membrane was washed with PBS-T (0.05% tween) for 5 minutes, and this washing operation was repeated a total of 3 times, then washed with PBS and made to emit light with a Western Lightning Plus-ECL kit (manufactured by PerkinElmer). Image data was acquired by the gel imager ChemDoc XRS (manufactured by Biorad).
（１−４）泳動結果
Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブは、ＲＣＡ−Ｉを用いたレクチン親和膜電気泳動では、レクチンを用いない膜電気泳動に比べて明らかに泳動速度が減少した。一方、Ｆａｂ領域に糖鎖を有さないパニツムマブはどちらの膜電気泳動でも泳動速度は変わらなかった（図１）。
(1-4) Migration Results Cetuximab, which has been shown to have a sugar chain in the Fab region, is clearly migrated in the lectin-affinitive membrane electrophoresis using RCA-I as compared with the membrane electrophoresis without lectin. The speed has decreased. On the other hand, panitumumab, which does not have a sugar chain in the Fab region, did not change the migration rate in either membrane electrophoresis (Fig. 1).
（実施例２）市販抗体医薬品の抗体表面の糖鎖と各種レクチンとの反応性の解析
本実施例では、前記（表１）で示したＦａｂ領域に糖鎖を有するセツキシマブ及びＦａｂ領域には糖鎖を有さないパリビズマブなどの抗体モデルの含有糖鎖と各種レクチンとの反応性を、レクチンアレイ（産総研）を用いて解析した。
レクチンアレイのmean normalize値 １００以上のレクチンをリスト化して、Ｆａｂに糖鎖をもつセツキシマブで反応のあったレクチンから、Ｆｃのみに糖鎖をもつパリビズマブ、モガムリズマブ、パニツムマブ、デノスマブで反応したレクチンを除いた結果、Ｒ-型レクチンに属するｒＡＣＧ（Agrocybe cylindraceaレクチンの組み換え体）、ＳＮＡ（Sambucus nigraレクチン）、ＳＳＡ（Sambucus sieboldianaレクチン）、ＲＣＡ１２０（Ricinus communisレクチン）ＰＳＬ１ａ（Polyporus squamosus由来レクチン）、ＭＯＡ（Scotch bonnet由来レクチン）はＦａｂ糖鎖選択的に反応することが分かった（図２）。
その他には、ＴＪＡＩ（Trichosanthes japonicaレクチン）、ｒＧａｌ９Ｎ（ガレクチン９のＮ末端ドメインの組み換え体）、ｒＯｒｙｓａｔａ（Oryza sativaレクチンの組み換え体）及びＰＳＡ（Pisum sativumレクチン）が、Ｆａｂ糖鎖選択的反応性を示した（Data not shown）。
(Example 2) Analysis of reactivity between sugar chains on the antibody surface of a commercially available antibody drug and various lectins In this example, setuximab having a sugar chain in the Fab region shown in (Table 1) above and sugar in the Fab region. The reactivity of various lectins with sugar chains contained in antibody models such as paribismab without chains was analyzed using a lectin array (AIST).
List the lectins with a mean normalize value of 100 or more in the lectin array, and exclude the lectins that reacted with sesximab having a sugar chain in Fab from the lectins that reacted with paribismab, mogamurizumab, panitumumab, and denosumab having sugar chains only in Fc. As a result, rACG (recombinant of Agrocybe cylindracea lectin), SNA (Sambucus nigra lectin), SSA (Sambucus sieboldiana lectin), RCA120 (Ricinus communis lectin) PSL1a (polyporus squamosus-derived lectin), MOA (Scotch) belonging to R-type lectin It was found that the bonnet-derived lectin) reacts selectively with Fab sugar chains (Fig. 2).
In addition, TJAI (Trichosanthes japonica lectin), rGal9N (recombinant of N-terminal domain of galectin 9), rOrysata (recombinant of Oryza sativa lectin) and PSA (Pisum sativum lectin) have Fab sugar chain selective reactivity. Shown (Data not shown).
以下に、各抗体試薬についての糖鎖の特徴を述べる。
＜セツキシマブ＞
セツキシマブは、ヒト上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的とするヒト・マウスキメラモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）であり、商品名「アービタックス（Ｒ）（イムクローンシステムズ社製）」で販売され、大腸がんなどに対する分子標的治療薬として用いられる。セツキシマブの糖鎖は、Ｆｃ領域のみならずＦａｂ領域にも存在していることが既知であり、レクチンアレイによると、Ｆｃ領域糖鎖由来と見られるＦｕｃ（コアフコース）、Ｍａｎ、αＧａｌの他、Ｆａｂ領域に結合していると考えられるα２−３Ｓｉａ、α２−６Ｓｉａなどのシグナルが観察された（Data not shown，以下同様。）。
The characteristics of sugar chains for each antibody reagent are described below.
<Cetuximab>
Cetuximab is a human-mouse chimeric monoclonal antibody (IgG1) that targets the human epithelial growth factor receptor (EGFR), and is marketed under the trade name "Erbitux (R) (manufactured by ImClone Systems)" for colon cancer, etc. It is used as a molecular-targeted therapeutic agent for. It is known that the sugar chain of cetuximab is present not only in the Fc region but also in the Fab region. According to the lectin array, Fuc (core fucose), Man, αGal, and Fab, which are considered to be derived from the Fc region sugar chain, are also present. Signals such as α2-3Sia and α2-6Sia, which are considered to be bound to the region, were observed (Data not shown, the same applies hereinafter).
＜パリビズマブ＞
パリビズマブは、組換えマウスにより製造されたヒト化モノクローナル抗体であり、商品名「シナジス（Ｒ）（アッヴィ社製）」で販売され、ＲＳウイルスの風邪予防に用いられる。パリビズマブの糖鎖は、Ｆｃ領域のみに存在し、コアフコースを含有する２本鎖である(非特許文献６)。
<Palivizumab>
Palivizumab is a humanized monoclonal antibody produced by recombinant mice, sold under the trade name "Synagis (R) (manufactured by AbbVie Inc.)", and used for the prevention of colds of RS virus. The sugar chain of palivizumab is a double chain that exists only in the Fc region and contains core fucose (Non-Patent Document 6).
＜モガムリズマブ＞
モガムリズマブは、組換えマウスにより製造されたヒト化モノクローナル抗体であり、商品名「ポテリジオ（Ｒ）（協和キリン社製）」で販売され、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）治療薬として用いられている。モガムリズマブの糖鎖は、Ｆｃ領域のみに存在し、かつＡＤＣＣ活性を高めるためにフコースが除去されている。レクチンアレイ観察でも、コアフコースに相当するシグナルが欠如している。
<Mogamulizumab>
Mogamulizumab is a humanized monoclonal antibody produced by recombinant mice, sold under the trade name "Poterigio (R) (manufactured by Kyowa Kirin Co., Ltd.)", and used as a therapeutic agent for adult T-cell leukemia (ATL). The sugar chain of mogamulizumab is present only in the Fc region, and fucose has been removed to enhance ADCC activity. Lectin array observations also lack a signal corresponding to core fucose.
＜パニツムマブ＞
パニツムマブは、組換えマウスにより製造されたヒト上皮増殖因子レセプターを標的とするヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ２）であり、商品名「ベクティビックス（Ｒ）（アムジェン社製）」で販売され、作用機序はセツキシマブと概ね同じであるがセツキシマブと比較して、アレルギー反応は低いが、ＡＤＣＣ活性が低いとされている。パニツムマブの糖鎖はＦｃ領域のみであり、かつコアフコースを含有する２本鎖である（非特許文献７）。レクチンアレイでも、ＡＤＣＣ活性増強に関わる糖鎖のシグナルは観察されない。
<Panitumumab>
Panitumumab is a humanized monoclonal antibody (IgG2) produced by recombinant mice that targets the human epithelial growth factor receptor, and is marketed under the trade name "Vectubix (R) (manufactured by Amgen)" and has a mechanism of action. The order is generally the same as cetuximab, but the allergic reaction is lower but the ADCC activity is lower than that of cetuximab. The sugar chain of panitumumab is a double chain containing only the Fc region and core fucose (Non-Patent Document 7). Even in the lectin array, no signal of sugar chains involved in ADCC activity enhancement is observed.
＜デノスマブ＞
デノスマブは、ＲＡＮＫリガンドを標的とするヒト型モノクローナル抗体であり、商品名「ランマーク（Ｒ）（アムジェン社製）」で販売され、骨粗鬆症治療薬として用いられている。デノスマブの糖鎖は、Ｆｃ領域のみに存在する。
<Denosumab>
Denosumab is a human monoclonal antibody that targets a RANK ligand, is marketed under the trade name "Lanmark (R) (manufactured by Amgen)", and is used as a therapeutic agent for osteoporosis. The sugar chain of denosumab is present only in the Fc region.
（実施例３） ＲＣＡ−Ｉレクチンを局所固定した親和膜電気泳動によるＦａｂ糖鎖抗体の検出（ＰＶＤＦ膜の場合）
(４−１)レクチンを局所固定したＰＶＤＦ膜の作成
縦６センチ、横は1サンプル辺り１センチに切り取ったＰＶＤＦ膜（Immobilon-P,ミリポア社製）の下端から１センチおよび１．５センチの部位に横幅８ミリの線を鉛筆で薄く描き、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）に３０分間浸した。該ＰＶＤＦ膜を膜電気泳動槽にセットし、膜が乾かないようにろ紙で緩衝液を補充しながら、鉛筆で線を引いた部分に１ｍｇ／ｍＬの濃度でＲＣＡ−Ｉ（Ricinus communis AgglutininＩ)を含む前記緩衝液を１０μLアプライし、膜に浸み込ませた。該膜を電気泳動槽からはずし、乾燥させた後、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、電気泳動に使用した。
(Example 3) Detection of Fab sugar chain antibody by affinity membrane electrophoresis with locally fixed RCA-I lectin (in the case of PVDF membrane)
(4-1) Preparation of PVDF membrane with locally fixed lectin 1 cm and 1.5 cm from the lower end of PVDF membrane (Immobilon-P, manufactured by Millipore) cut to a length of 6 cm and a width of 1 cm per sample. A thin line with a width of 8 mm was drawn on the site with a pencil and immersed in methanol for several minutes. The PVDF membrane was then removed from methanol and immersed in 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) for 30 minutes. The PVDF membrane is set in a membrane electrophoresis tank, and RCA-I (Ricinus communis Agglutinin I) is applied to the part drawn with a pencil at a concentration of 1 mg / mL while replenishing the buffer solution with a filter paper so that the membrane does not dry. 10 μL of the buffer solution containing the mixture was applied and impregnated into the membrane. The membrane was removed from the electrophoresis tank, dried, and then immersed in methanol for several minutes. The PVDF membrane was then removed from methanol and immersed in the buffer containing 0.25% polyvinyl alcohol for 30 minutes. The excess solution adhering to the membrane was lightly wiped off with a filter paper and then used for electrophoresis.
（４−２）レクチン親和膜電気泳動による抗体の検出結果
実施例１と同様の方法で、セツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）、パニツムマブ（アムジェン社製）、パリビズマブ（アッヴィ社製）、モガムリズマブ（協和キリン社製）、デノスマブ（アムジェン社製）を膜の下端から０．５センチの部位にそれぞれ１００ナノグラムをアプライし、通電した。
(4-2) Results of antibody detection by lectin affinity membrane electrophoresis In the same manner as in Example 1, cetuximab (manufactured by ImClone Systems), panitumumab (manufactured by Amgen), paribismab (manufactured by AbbVie), mogamulizumab (Kyowa) 100 nanograms of each of Kirin) and denosumab (Amgen) were applied to a site 0.5 cm from the lower end of the membrane, and electricity was applied.
実施例１と同様に、泳動後の膜をブロッキングし、洗浄後、標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体により染色したところ、Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブのみが、ＲＣＡ−Ｉを固定化した部位（２箇所）に明瞭なバンドを示した。他の抗体による染色は何もアプライしていないレーン（ネガティブコントロール）と同等だった（図３）。 Similar to Example 1, when the membrane after electrophoresis was blocked, washed, and stained with a labeled goat anti-human IgG antibody, only cetuximab, which was found to have a sugar chain in the Fab region, was RCA-I. A clear band was shown at the sites where the cells were immobilized (2 sites). Staining with other antibodies was comparable to the unapplied lane (negative control) (Fig. 3).
（実施例４） ＲＣＡ−Ｉレクチンを局所固定した親和膜電気泳動によるＦａｂ糖鎖抗体の検出（ニトロセルロース膜の場合）
(５−１)レクチンを局所固定したニトロセルロース膜の作成
縦６センチ、横は1サンプル辺り１センチに切り取ったニトロセルロース膜（Hybond HLC,GEヘルスケア社製）の下端から１センチおよび１．５センチの部位に横幅８ミリの線を鉛筆で薄く描き、０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）に３０分間浸した。該ニトロセルロース膜を膜電気泳動槽にセットし、膜が乾かないようにろ紙で緩衝液を補充しながら、鉛筆で線を引いた部分に１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＣＡ−Ｉ（Ricinus communis AgglutininＩ)を含む前記緩衝液を１０μLアプライし、膜に浸み込ませた。該膜を電気泳動槽からはずし、乾燥させた後、０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、電気泳動に使用した。
(Example 4) Detection of Fab sugar chain antibody by affinity membrane electrophoresis with locally fixed RCA-I lectin (in the case of nitrocellulose membrane)
(5-1) Preparation of nitrocellulose membrane with locally fixed lectin 1 cm from the lower end of the nitrocellulose membrane (Hybond HLC, manufactured by GE Healthcare) cut to a length of 6 cm and a width of 1 cm per sample. A thin line with a width of 8 mm was drawn thinly on a 5 cm site with a pencil, and immersed in 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) for 30 minutes. The nitrocellulose membrane is set in a membrane electrophoresis tank, and while replenishing the buffer solution with filter paper to prevent the membrane from drying, RCA-I (Ricinus communis Agglutinin I) at a concentration of 1 mg / ml on the part drawn with a pencil. 10 μL of the buffer solution containing the above was applied and impregnated into the membrane. The membrane was removed from the electrophoresis tank, dried, and then immersed in the buffer solution containing 0.25% polyvinyl alcohol for 30 minutes. The excess solution adhering to the membrane was lightly wiped off with a filter paper and then used for electrophoresis.
（５−２）レクチン親和膜電気泳動による抗体の検出結果
実施例１と同様の方法で、セツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）、パニツムマブ（アムジェン社製）を膜の下端から０．５センチの部位にそれぞれ１００ナノグラムをアプライし、通電した。
(5-2) Results of antibody detection by lectin-affinity membrane electrophoresis In the same manner as in Example 1, cetuximab (manufactured by ImClone Systems) and panitumumab (manufactured by Amgen) were applied to a site 0.5 cm from the lower end of the membrane. 100 nanograms were applied to each and energized.
実施例１と同様に、泳動後の膜をブロッキングし、洗浄後、標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体により染色したところ、Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブのみが、RCA-Iを固定化した部位（２箇所）に明瞭なバンドを示した（図４）。 Similar to Example 1, when the membrane after electrophoresis was blocked, washed, and stained with a labeled goat anti-human IgG antibody, only cetuximab, which was found to have a sugar chain in the Fab region, was RCA-I. A clear band was shown at the sites (2 sites) where the cells were immobilized (Fig. 4).
（実施例５） ＲＣＡ−Ｉレクチンをニトロセルロース膜に局所固定した親和膜電気泳動によるＦａｂ糖鎖抗体の検出(蛍光標識抗体を用いた場合)
(６−１)レクチンを局所固定したニトロセルロース膜の作成
縦６センチ、横１センチに切り取ったニトロセルロース膜（HiFlow Plus HFC07502, ミリポア社製）の下端から１センチの部位に横幅８ミリの線を鉛筆で薄く描き、鉛筆で線を引いた部分に５ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＣＡ−Ｉ（Ricinus communis AgglutininＩ)を含む０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１μLアプライし、膜に浸み込ませた。該膜を乾燥させた後、０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、電気泳動に使用した。
(Example 5) Detection of Fab sugar chain antibody by affinity membrane electrophoresis in which RCA-I lectin is locally immobilized on a nitrocellulose membrane (when a fluorescently labeled antibody is used)
(6-1) Preparation of nitrocellulose membrane with locally fixed lectin A line with a width of 8 mm from the lower end of the nitrocellulose membrane (HiFlow Plus HFC07502, manufactured by Millipore) cut to a length of 6 cm and a width of 1 cm. Apply 1 μL of 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) containing RCA-I (Ricinus communis Agglutinin I) at a concentration of 5 mg / ml to the part drawn with a pencil, and immerse it in the membrane. I let you in. After the membrane was dried, it was immersed in the buffer solution containing 0.25% polyvinyl alcohol for 30 minutes. The excess solution adhering to the membrane was lightly wiped off with a filter paper and then used for electrophoresis.
（６−２）レクチン親和膜電気泳動による抗体の検出結果
実施例１と同様の方法で、セツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）、パニツムマブ（アムジェン社製）、パリビズマブ（アッヴィ社製）、モガムリズマブ（協和キリン社製）、デノスマブ（アムジェン社製）を膜の下端から０．５センチの部位にそれぞれ２μｇをアプライし、通電した。
(6-2) Results of antibody detection by lectin affinity membrane electrophoresis In the same manner as in Example 1, cetuximab (manufactured by ImClone Systems), panitumumab (manufactured by Amgen), paribismab (manufactured by AbbVie), mogamulizumab (Kyowa) 2 μg of each of Kirin) and denosumab (Amgen) was applied to a portion 0.5 cm from the lower end of the membrane, and electricity was applied.
移動後の膜を乾燥させ、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を膜の下端に２０μＬアプライし、蒸留水を浸み込ませたろ紙を膜の下端に載せ、膜全体が濡れるまで放置した。その後、蛍光イメージスキャナー（GELSCAN、アイメジャー社製）を用いてレクチン固定化部位に結合した抗体の画像データを取得した。 After the transfer, the membrane is dried, 20 μL of FITC-labeled anti-human IgG antibody solution (0.1 mg / mL) is applied to the lower end of the membrane, and a filter paper soaked with distilled water is placed on the lower end of the membrane, and the entire membrane is placed. I left it until it got wet. Then, image data of the antibody bound to the lectin immobilization site was acquired using a fluorescence image scanner (GELSCAN, manufactured by Eye Major).
Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブのみが、ＲＣＡ−Ｉを固定化した部位に明瞭なバンドを示した（図５）。 Only cetuximab, which was found to have sugar chains in the Fab region, showed a clear band at the site where RCA-I was immobilized (Fig. 5).
（実施例６） ＲＣＡ−Ｉレクチンを用いたラテラルフローアッセイによるＦａｂ糖鎖抗体の検出（金ナノ粒子標識抗体を用いる場合）
(７−１)レクチンを局所固定したニトロセルロース膜の作成
縦６センチ、横１センチに切り取ったニトロセルロース膜（HiFlow Plus HFC 09002、ミリポア社製）の下端から１センチの部位に横幅８ミリの線を鉛筆で薄く描き、鉛筆で線を引いた部分に５ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＣＡ−Ｉ（Ricinus communis AgglutininＩ)を含む０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１μLアプライし、膜に浸み込ませた。該膜を乾燥させた後、０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。前記緩衝液で膜を洗浄後、０．５％の濃度でウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水に１時間浸した。その後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し室温で自然乾燥させたものをラテラルフローアッセイ用の膜として用いた。
(Example 6) Detection of Fab sugar chain antibody by lateral flow assay using RCA-I lectin (when using gold nanoparticle-labeled antibody)
(7-1) Preparation of nitrocellulose membrane with locally fixed lectin A nitrocellulose membrane (HiFlow Plus HFC 09002, manufactured by Millipore) cut to a length of 6 cm and a width of 1 cm with a width of 8 mm at a site 1 cm from the lower end. Draw a thin line with a pencil, and apply 1 μL of 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) containing RCA-I (Ricinus communis Agglutinin I) at a concentration of 5 mg / ml to the part drawn with the pencil, and apply it to the membrane. Soaked. After the membrane was dried, it was immersed in the buffer solution containing 0.25% polyvinyl alcohol for 30 minutes. After washing the membrane with the buffer solution, the membrane was immersed in a phosphate buffered saline containing bovine serum albumin at a concentration of 0.5% for 1 hour. Then, the membrane washed with phosphate buffered saline and air-dried at room temperature was used as a membrane for the lateral flow assay.
(７−２)金ナノ粒子で標識した検出用抗体の作成
「40nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit(Cytodiagnostics社製)」を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を標識した。前記抗体のＰＢＳ溶液（２．３ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ社製）の８０μＬにキットに添付の反応緩衝液を１００μＬ添加し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化された金ナノ粒子に加えて４時間室温で攪拌した。キットに添付の反応停止液を１７μＬ添加後、４０００ｇにて３０分間、遠心分離し、沈殿物に０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μＬ加えて懸濁させたものを検出用抗体として用いた。
(7-2) Preparation of detection antibody labeled with gold nanoparticles The goat anti-human IgG antibody was labeled using "40 nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit (manufactured by Cytodiagnostics)". Add 100 μL of the reaction buffer attached to the kit to 80 μL of the PBS solution of the antibody (2.3 mg / mL, manufactured by Sigma-Aldrich), add to the gold nanoparticles activated with N-hydroxysuccinimide, and room temperature for 4 hours. Was stirred with. After adding 17 μL of the reaction terminator solution attached to the kit, centrifuge at 4000 g for 30 minutes, add 100 μL of 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) to the precipitate, and suspend the antibody for detection. Used as.
(７−３)ラテラルフローアッセイによる検出結果
セツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）、パニツムマブ（アムジェン社製）、パリビズマブ（アッヴィ社製）、モガムリズマブ（協和キリン社製）、デノスマブ（アムジェン社製）、ヒト血清由来ＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をそれぞれ５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、膜の下端から０．５センチの部位にそれぞれ５μＬをアプライし、０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を浸み込ませたろ紙を膜の下端に載せて溶液が膜の上端まで浸み込むまで放置した。その後、膜の下端から０．５センチの部位に金ナノ粒子で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の懸濁液をそれぞれ２μＬをアプライし、前記緩衝液を浸み込ませたろ紙を膜の下端に載せて、１０分間放置した。
(7-3) Detection results by lateral flow assay Setuximab (manufactured by Imclon Systems), panitumumab (manufactured by Amgen), paribismab (manufactured by Avi), mogamulizumab (manufactured by Kyowa Kirin), denosumab (manufactured by Amgen), human Prepare serum-derived IgG (manufactured by Sigma Aldrich) to a concentration of 5 mg / mL, apply 5 μL to each 0.5 cm site from the lower end of the membrane, and apply 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4). The soaked filter paper was placed on the lower end of the film and left until the solution soaked to the upper end of the film. Then, apply 2 μL of each suspension of goat anti-human IgG antibody labeled with gold nanoparticles to a site 0.5 cm from the lower end of the membrane, and apply a filter paper impregnated with the buffer solution to the lower end of the membrane. It was placed and left for 10 minutes.
Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブとヒト血清由来ＩｇＧのみが、ＲＣＡ−Ｉを固定化した部位に明瞭なバンドを示した（図６）。 Only cetuximab and human serum-derived IgG, which have been shown to have sugar chains in the Fab region, showed a clear band at the site where RCA-I was immobilized (Fig. 6).
（実施例７） ＲＣＡ−Ｉレクチンを用いたラテラルフローアッセイによるＦａｂ糖鎖抗体の検出（ＦＩＴＣ標識抗体を用いる場合）
(８−１)レクチンを局所固定したニトロセルロース膜を用いたラテラルフローアッセイ
実施例５と同様の方法で作成したラテラルフローアッセイ用の膜を用いてＦＩＴＣ標識抗体によるラテラルフローアッセイを行った。
具体的には、セツキシマブ（イムクローンシステムズ社製）、パニツムマブ（アムジェン社製）、パリビズマブ（アッヴィ社製）、モガムリズマブ（協和キリン社製）、デノスマブ（アムジェン社製）、ヒト血清由来ＩｇＧ（シグマアルドリッチ社製）をそれぞれ５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、膜の下端から０．５センチの部位にそれぞれ５μＬをアプライし、０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を浸み込ませたろ紙を膜の下端に載せて溶液が膜の上端まで浸み込むまで放置した。
その後、膜の下端から０．５センチの部位にＦＩＴＣで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ベチルラボラトリーズ社製）を前記緩衝液で１０倍に希釈した溶液を、それぞれ５μＬアプライし、さらに前記緩衝液を浸み込ませたろ紙を膜の下端に載せて１５分間放置し、その後、室温で自然乾燥させた。
(Example 7) Detection of Fab sugar chain antibody by lateral flow assay using RCA-I lectin (when using FITC-labeled antibody)
(8-1) Lateral flow assay using a nitrocellulose membrane on which a lectin is locally fixed A lateral flow assay using a FITC-labeled antibody was performed using a membrane for a lateral flow assay prepared in the same manner as in Example 5.
Specifically, cetuximab (manufactured by Imclon Systems), panitumumab (manufactured by Amgen), paribismab (manufactured by Avi), mogamulizumab (manufactured by Kyowa Kirin), denosumab (manufactured by Amgen), human serum-derived IgG (Sigma Aldrich). 3) was prepared to a concentration of 5 mg / mL, 5 μL was applied to each 0.5 cm from the lower end of the membrane, and a filter paper impregnated with 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) was applied. Was placed on the lower end of the membrane and left until the solution penetrated to the upper end of the membrane.
Then, 5 μL of each of a solution obtained by diluting a goat anti-human IgG antibody (manufactured by Bethyl Laboratories) 0.5 cm from the lower end of the membrane with the buffer solution 10-fold with FITC was applied, and the buffer was further applied. A filter paper impregnated with the solution was placed on the lower end of the membrane and left for 15 minutes, and then air-dried at room temperature.
蛍光イメージスキャナー（ＧＥＬＳＣＡＮ、アイメジャー社製）を用いてレクチン固定化部位に結合した抗体の画像データを蛍光イメージとして取得した。
その結果、Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブとヒト血清由来ＩｇＧのみが、ＲＣＡ−Ｉを固定化した部位に明瞭なバンドを示した（図７）。
Image data of the antibody bound to the lectin immobilization site was acquired as a fluorescence image using a fluorescence image scanner (GELSCAN, manufactured by Eye Major).
As a result, only cetuximab and human serum-derived IgG, which were found to have sugar chains in the Fab region, showed a clear band at the site where RCA-I was immobilized (Fig. 7).
（実施例８） ＳＳＡレクチンを用いたラテラルフローアッセイによるＦａｂ糖鎖抗体の検出（ＦＩＴＣ標識抗体を用いる場合）
本実施例では、レクチンとしてＳＳＡ（Sambucus sieboldiana agglutinin)を用い、実施例５と同様の方法でニトロセルロース膜に局所固定した。その際、ＳＳＡレクチンを２ｍｇ／ｍＬの濃度で含む０．０５Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３μＬアプライすることにより膜への固定化を行った。
次いで、実施例６と同様の方法でラテラルフローアッセイを行い、蛍光イメージを取得した。
その結果、Ｆａｂ領域に糖鎖を有することが明らかとなっているセツキシマブとヒト血清由来ＩｇＧのみが、ＳＳＡを固定化した部位に明瞭なバンドを示した（図８）。
(Example 8) Detection of Fab sugar chain antibody by lateral flow assay using SSA lectin (when using FITC-labeled antibody)
In this example, SSA (Sambucus sieboldiana agglutinin) was used as a lectin and locally fixed to a nitrocellulose membrane in the same manner as in Example 5. At that time, immobilization on the membrane was performed by applying 3 μL of 0.05 M Tris acetate buffer (pH 7.4) containing SSA lectin at a concentration of 2 mg / mL.
Then, a lateral flow assay was performed in the same manner as in Example 6 to obtain a fluorescence image.
As a result, only cetuximab and human serum-derived IgG, which were found to have sugar chains in the Fab region, showed a clear band at the site where SSA was immobilized (Fig. 8).
（実施例９） ＳＮＡレクチンを用いたＥＬＩＳＡによるＦａｂ糖鎖の検出
本実施例では、レクチンとしてａ２−６シアル酸結合性レクチンの一種であるＳＮＡレクチンを用いた。
具体的には、ビオチン化したａ２−６シアル酸結合性レクチンの一種であるＳＮＡレクチンを５０ｎｇ／ｗｅｌｌでアビジンプレート（住友ベークライト社製）に固定化した。次に、異なる濃度の抗体を反応させて洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch社製、１万倍希釈）を反応させた。洗浄後に基質液を加えて３０分発色反応を行った。発色停止後、吸光度４５０ｎｍ（主波長）／６２０ｎｍ（副波長）で測定した。その結果、パリビズマブ、セツキシマブ、モガリズマブ、パニツムマブ、デノスマブセツキシマブの５種の抗体のうち、セツキシマブのみ反応性が確認された（図９）。
(Example 9) Detection of Fab sugar chain by ELISA using SNA lectin In this example, SNA lectin, which is a kind of a2-6 sialic acid-binding lectin, was used as the lectin.
Specifically, SNA lectin, which is a kind of biotinylated a2-6 sialic acid-binding lectin, was immobilized on an avidin plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) at 50 ng / well. Next, antibodies having different concentrations were reacted and washed, and then an HRP-labeled anti-human Fc antibody (manufactured by Jackson Immuno Research, diluted 10,000 times) was reacted. After washing, a substrate solution was added and a color reaction was carried out for 30 minutes. After the color development was stopped, the absorbance was measured at 450 nm (main wavelength) / 620 nm (secondary wavelength). As a result, among the five antibodies of palivizumab, cetuximab, mogamulizumab, panitumumab, and denosumab cetuximab, only cetuximab was confirmed to be reactive (Fig. 9).
本発明における抗体のＦａｂ領域に存在する糖鎖検出技術は、化学（免疫工学・バイオ医薬品）分野及び製薬産業（抗体医薬品の開発）に利用可能である。その際に利用できる、装置、機器としては膜電気泳動用薄膜、ラテラルフローアッセイ用ストリップ、ＥＬＩＳＡ用装置があり、本発明のレクチンを単独又は組み合わせることで、これら測定用キットとして提供できる。 The sugar chain detection technique existing in the Fab region of the antibody in the present invention can be used in the field of chemistry (immunology / biopharmacy) and the pharmaceutical industry (development of antibody drugs). Devices and devices that can be used at that time include thin films for membrane electrophoresis, strips for lateral flow assays, and devices for ELISA, which can be provided as a measurement kit by using or combining the lectin of the present invention alone or in combination.
Claims (9)
Ｆａｂ領域糖鎖特異的な親和性を有する少なくとも一種類のＲ−型レクチンを用いることを特徴とする、Ｆａｂ領域に糖鎖が付加された抗体のみを検出し除去する方法。 A sugar chain was added to the Fab region during the antibody synthesis process for a monoclonal antibody having heavy and light chains synthesized by gene recombination technology in the manufacturing process, quality control process, or screening process at the time of development of an antibody drug. A method of detecting and removing only antibodies,
A method for detecting and removing only an antibody having a sugar chain added to the Fab region, which comprises using at least one type of R-type lectin having a Fab region sugar chain-specific affinity.
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