JP6828884B2 - Probe for detecting type A and / or type B of human herpesvirus 6 - Google Patents
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Description
ヒトヘルペスウイルス６型（HHV6）のタイプＡ及び／又はタイプＢを検出するためのプローブ、並びにそれを用いた遺伝子型の検出／識別方法が開示される。 A probe for detecting type A and / or type B of human herpesvirus 6 (HHV6), and a genotype detection / identification method using the probe are disclosed.
HHV6は、突発性発疹の原因ウイルスであり、多くのヒトに潜伏感染している。造血幹細胞移植後のように免疫能が低下した患者ではヒトヘルペスウイルスの増殖による脳炎がしばしば発症し、ときには致死的結末に至る。脳炎の予防には、ヒトヘルペスウイルス量のモニタリングと早期の抗ウイルス薬の投与が必須である。 HHV6 is the causative virus of exanthema subitum and is latently infected in many humans. Encephalitis due to the proliferation of human herpesvirus often develops in patients with weakened immunity, such as after hematopoietic stem cell transplantation, with sometimes fatal consequences. Monitoring of human herpesvirus levels and early administration of antiviral drugs are essential for the prevention of encephalitis.
HHV6にはタイプＡとタイプＢが存在する。両ウイルス遺伝子は高い相同性を有するが、その病原性に顕著な違いがあり、脳炎を起こすのはタイプＢである。よって、HHV6のタイプＡとタイプＢを区別することは重要である。従来のタイプＡとタイプＢを識別する方法はシークエンシングを要し、必ずしも効率的ではなかった。 There are type A and type B in HHV6. Although both viral genes have high homology, there is a marked difference in their pathogenicity, and it is type B that causes encephalitis. Therefore, it is important to distinguish between type A and type B of HHV6. The conventional method of distinguishing between type A and type B requires sequencing and is not always efficient.
上述のような現状の下、効率的にHHV6のタイプＡとタイプＢを識別する手段を提供することが１つの課題である。 Under the current situation as described above, it is one of the tasks to provide a means for efficiently distinguishing between type A and type B of HHV6.
かかる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有するプローブを用いること、及び／又はそれと特定のプライマーとを組み合わせることにより、シークエンシングを行うことなく効率的にHHV6のタイプＡとタイプＢとを識別できることを見出した。斯かる知見をもとにさらなる研究を重ね、下記に代表される発明を提供するに至った。 As a result of intensive research to solve this problem, by using a probe having a specific structure and / or by combining it with a specific primer, HHV6 type A and / or HHV6 type A can be efficiently obtained without sequencing. It was found that it can be distinguished from type B. Based on such findings, further research has been carried out, and inventions represented by the following have been provided.
項１．
下記の構造（Ｂ）：
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を有する、ヒトヘルペスウイルス６（HHV6）タイプＢを検出するためのプローブ。
項２．
配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いられることを特徴とする、項１に記載のプローブ。
項３．
項１に記載のプローブ、及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を含む、HHV6の遺伝子型を識別するためのキット。
項４．
更に、RNaseを含む、項３に記載のキット。
項５．
HHV6タイプＢを検出するためのプローブが有する蛍光色素がHHV6タイプＡを検出するためのプローブが有する蛍光色素と異なる、項３又は４に記載のキット。
項６．
項１のプローブを用いてHHV6タイプＢを検出する方法。
項７．
項１のプローブの存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程（１）、及び
該プローブが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程（２）
を含む、項６に記載の方法。
項８．
下記の工程（１）及び工程（２）を含むHHV6の遺伝子型を識別する方法：
工程（１）；項１のプローブ（プローブＢ）及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（プローブＡ）の存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、プローブＡが有する蛍光色素はプローブＢが有する蛍光色素と異なる）
工程（２）；プローブＡ及び／又はプローブＢが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程。
Item 1.
The following structure (B):
(B): 5'-Q-gacgGcac-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, and F is a fluorescent dye.)
A probe for detecting human herpesvirus 6 (HHV6) type B.
Item 2.
Item 2. The probe according to Item 1, wherein the probe is used together with a primer pair consisting of a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
Item 3.
Item 1. The probe according to Item 1 and the probe for detecting HHV6 type A having any of the following structures (A-1) to (A-3) (A-1): 5'-Q-gtgtgAcgt-F -3'
(A-2): 5'-Q-ggtgtgAcg-F-3'
(A-3): 5'-Q-gtgtgAcg-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, and F is a fluorescent dye.)
A kit for identifying the genotype of HHV6, including.
Item 4.
Item 3. The kit according to Item 3, further comprising RNase.
Item 5.
Item 3. The kit according to Item 3 or 4, wherein the fluorescent dye contained in the probe for detecting HHV6 type B is different from the fluorescent dye contained in the probe for detecting HHV6 type A.
Item 6.
A method for detecting HHV6 type B using the probe of item 1.
Item 7.
In the presence of the probe of Item 1, the step (1) of performing PCR using the genomic DNA of HHV6 as a template and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the probe Step of detecting fluorescence emitted by the fluorescent dye having (2)
Item 6. The method according to Item 6.
Item 8.
Method for identifying the genotype of HHV6 including the following steps (1) and (2):
Step (1); In the presence of the probe (probe B) of item 1 and the probe (probe A) for detecting HHV6 type A having any of the following structures (A-1) to (A-3). , HHV6 genomic DNA as a template and PCR using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (A-1): 5'-Q-gtgtgAcgt-F-3 '
(A-2): 5'-Q-ggtgtgAcg-F-3'
(A-3): 5'-Q-gtgtgAcg-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, F is a fluorescent dye, and the fluorescent dye possessed by probe A is different from the fluorescent dye possessed by probe B).
Step (2); A step of detecting the fluorescence emitted by the fluorescent dye of probe A and / or probe B.
HHV6の遺伝子型を効率的に（例えば、HHV6のDNAをシークエンシングすることなく）識別することができる。 The genotype of HHV6 can be efficiently identified (eg, without sequencing the DNA of HHV6).
HHV6の遺伝子型を効率的に識別するためには、下記の構造（Ｂ）を有するプローブ（以下、「プローブＢ」と称する場合もある）を用いることが好ましい。
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、「Q」はクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、「F」は蛍光色素であり、「5’」はプローブの5’末端を意味し、「3’」はプローブの3’末端を意味する）
In order to efficiently identify the genotype of HHV6, it is preferable to use a probe having the following structure (B) (hereinafter, may be referred to as "probe B").
(B): 5'-Q-gacgGcac-F-3'
(Here, "Q" is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, "F" is a fluorescent dye, and "5'" means the 5'end of the probe. And "3'" means the 3'end of the probe)
構造（Ｂ）のような構造を有するプローブは、TaqManプローブの一態様であるサイクリングプローブとして知られている。構造Ｂを構成する塩基配列（gacgGcac）は、HHV6タイプＢのゲノムDNA（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）の103978番目〜103985番目の塩基配列に相補的であり、RNA分子であることを示す大文字で示されたＧは、タイプＢに特異的に存在する塩基に対応する。 A probe having a structure like the structure (B) is known as a cycling probe, which is an aspect of the TaqMan probe. The base sequence (gacgGcac) constituting structure B is complementary to the base sequences 103978 to 103985 of the HHV6 type B genomic DNA (Accesssion No (NCBI) AF157706.1), indicating that it is an RNA molecule. The capitalized G corresponds to a base that is specifically present in type B.
クエンチャーとしては、種々のものが市販されており、蛍光色素からの蛍光をクエンチできるものであれば特に制限されない。クエンチャーには蛍光色素と非蛍光色素があり、いずれでもよいが、検出の精度の観点から、非蛍光色素が好ましい。具体的なクエンチャーとしては、6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、Eclipse Dark Quencher、minor groove binder（MGB）、及び非蛍光クエンチャー（NFQ）等を挙げることができる。 Various types of quenchers are commercially available, and are not particularly limited as long as they can quench the fluorescence from the fluorescent dye. The quencher includes a fluorescent dye and a non-fluorescent dye, and either of them may be used, but the non-fluorescent dye is preferable from the viewpoint of detection accuracy. Specific quenchers include 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), Eclipse Dark Quencher, minor groove binder (MGB), and non-fluorescent quencher (NFQ). Can be mentioned.
蛍光色素は、TaqManプローブに使用できるものであれば特に制限されず、適宜選択することができる。具体的な蛍光色素としては、6-FAM、TE、HEX、Quasar 670、Quasar 570、Quasar 705、Pulsar 650、TET、HEX、VIC、JOE、CAL Fluor Orenge、CAL Fluor Gold、CAL Fluor Red、Texas Red、Cy、Cy5等を挙げることができる。 The fluorescent dye is not particularly limited as long as it can be used for the TaqMan probe, and can be appropriately selected. Specific fluorescent dyes include 6-FAM, TE, HEX, Quasar 670, Quasar 570, Quasar 705, Pulsar 650, TET, HEX, VIC, JOE, CAL Fluor Orenge, CAL Fluor Gold, CAL Fluor Red, Texas Red. , Cy, Cy5, etc.
プローブＢは、HHV6タイプＢのゲノムDNAとのみ完全に相補的であり、当該DNAにハイブリダイズするとRNaseの働きにより切断され、結果として蛍光色素が発する蛍光が検出可能となる。RNaseとしては、サイクリングプローブ法に用いることができるRNaseであれば特に制限されない。そのようなRNaseとしては、例えば、DNA/RNAハイブリッド二本鎖を形成しているRNAを切断し、一本鎖DNAを生じるRNase Hを挙げることができる。 Probe B is completely complementary only to HHV6 type B genomic DNA, and when hybridized to the DNA, it is cleaved by the action of RNase, and as a result, the fluorescence emitted by the fluorescent dye can be detected. The RNase is not particularly limited as long as it can be used in the cycling probe method. Examples of such RNases include RNase H, which cleaves RNA forming a DNA / RNA hybrid double strand to produce single-stranded DNA.
プローブＢは、サイクリーブ（cycleave）PCR法において用いることが好ましく、配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いることが好ましい。このプライマー対は、後述する実施例に示すように、HHV6タイプＢのゲノムDNA（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）の103908番目の塩基〜104040番目の塩基で構成される領域を増幅するように設計されている。プローブBとこのプライマー対とを組み合わせて使用することにより高感度にHHV6タイプBを検出することができる。 The probe B is preferably used in the cycleave PCR method, and is preferably used together with a primer pair consisting of a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. This primer pair amplifies the region composed of bases 103908 to 104040 of HHV6 type B genomic DNA (Accesssion No (NCBI) AF157706.1), as shown in Examples described later. It is designed. HHV6 type B can be detected with high sensitivity by using probe B and this primer pair in combination.
HHV6のタイプAを検出する場合は、下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（以下、「プローブＡ」と称する場合もある）をもちいることが好ましい。
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’ -Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’ -Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、「5’」はプローブの5’末端を意味し、「3’」はプローブの3’末端を意味する）
When detecting HHV6 type A, a probe for detecting HHV6 type A having any of the following structures (A-1) to (A-3) (hereinafter, may be referred to as "probe A"). ) Is preferably used.
(A-1): 5'-Q-gtgtgAcgt-F-3'
(A-2): 5'-Q-ggtgtgAcg-F-3'
(A-3): 5'-Q-gtgtgAcg-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, F is a fluorescent dye, "5'" means the 5'end of the probe, and "3". '" Means the 3'end of the probe)
プローブ（Ａ−１）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103976番目〜103984番目の塩基配列に相補的であり、プローブ（Ａ−２）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103975番目〜103983番目の塩基配列に相補的であり、プローブ（Ａ−３）は、HHV6タイプＡのゲノムDNAの103976番目〜103983番目の塩基配列に相補的である。いずれのプローブにおいても、大文字で示されたＡはタイプＡに特異的に存在する塩基に対応する。 The probe (A-1) is complementary to the base sequences of 103976 to 103984 of the HHV6 type A genomic DNA, and the probe (A-2) is the 103975 to 103983 of the HHV6 type A genomic DNA. Complementary to the base sequence, the probe (A-3) is complementary to the base sequences 103976 to 103983 of the HHV6 type A genomic DNA. In both probes, the capitalized A corresponds to a base that is specifically present in type A.
プローブＡを用いたHHV6のタイプAを検出する場合も、上述の配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対を用いることが好ましい。 When detecting type A of HHV6 using probe A, it is preferable to use a primer pair consisting of the above-mentioned primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
一実施形態において、プローブＡとプローブＢとを組み合わせて使用することが好ましい。例えば、遺伝子型が未知であるヘルペスウイルスに感染している（又はそれが疑われる）被検体から取得したサンプルとしてプローブＡ及びプローブＢの存在下でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、被検体がHHV6のタイプA又はBに感染しているか否かを効率的に識別することができる。プローブＡとプローブＢとを組み合わせて使用する場合、プローブＡの蛍光色素とプローブＢの蛍光色素は異なる種類であることが好ましい。そうすることにより、検出した光が、遺伝子型Ａ及びＢのいずれに対応するのか判別可能となる。 In one embodiment, it is preferable to use the probe A and the probe B in combination. For example, by performing real-time PCR in the presence of probe A and probe B as a sample obtained from a subject infected (or suspected to have) herpesvirus of unknown genotype, the subject is HHV6. It is possible to efficiently identify whether or not a person is infected with type A or B. When the probe A and the probe B are used in combination, it is preferable that the fluorescent dye of the probe A and the fluorescent dye of the probe B are of different types. By doing so, it becomes possible to determine whether the detected light corresponds to genotypes A and B.
HHV6の遺伝子型を検出するためのキットは、プローブＡ及び／又はプローブＢを含むことが好ましく、プローブＡ及びＢを含むことがより好ましい。当該キットは、更に上述する配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対を含むことが好ましい。上記キットは、その他、任意の成分、試薬、又は説明書等を含見える。試薬としては、例えばRNase H、dNTPミックス、DNAポリメラーゼ、等を挙げることができる。キットに含まれる各成分は、別個の容器に収容されていてもよく、同一の容器に混合状態で収容されていても良い。また、各成分は、乾燥形態で容器に収容されていてもよく、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。 The kit for detecting the genotype of HHV6 preferably contains probe A and / or probe B, and more preferably contains probes A and B. The kit preferably further contains a primer pair consisting of the above-mentioned primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The kit may include any other ingredients, reagents, instructions, etc. Examples of the reagent include RNase H, dNTP mix, DNA polymerase, and the like. Each component included in the kit may be contained in a separate container or may be contained in a mixed state in the same container. In addition, each component may be contained in a container in a dry form, or may be contained in a container in a form dissolved in a suitable solvent.
PCR及び蛍光の検出は、サイクリーブPCR法に適した市販される装置を用いて行うことができる。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、いずれも通常のDNA自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のDNA合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。プローブとして用いるDNA/RNAキメラポリヌクレオチドもまた、公知の通常の方法で調製することができる。 PCR and fluorescence detection can be performed using a commercially available device suitable for the cyclist PCR method. All of the polynucleotides used in the present invention can be prepared by a known DNA synthesis method (for example, phosphoamidide method) using an ordinary automatic DNA synthesizer (for example, manufactured by Applied Biosystems). The DNA / RNA chimeric polynucleotide used as a probe can also be prepared by a known conventional method.
PCR法における各条件（反応液の濃度及び量、並びに、変性、アニーリング、伸長の各段階の温度、時間、サイクル数等）は当業者が適宜決定することができる。好ましい条件としては以下のものが挙げられる。PCR法に供する反応液には、各プライマー及びプローブがそれぞれ50-500nMの濃度で含まれていることが好ましい。反応液の全量は好ましくは10〜50μlである。PCR条件の好ましい条件としては、例えば、90〜100℃・10秒〜2分間（より好ましくは95℃・30秒間）のインキュベーション後、90〜100℃・2秒〜１分間（より好ましくは95℃・5秒間）、50〜60℃・5秒〜1分間（より好ましくは55℃・10秒間）、70〜80℃・5〜60秒（75°・20秒）の反応を30〜60サイクル（より好ましくは45サイクル）行うという条件が挙げられる。 Each condition (concentration and amount of reaction solution, temperature, time, number of cycles, etc. at each stage of denaturation, annealing, and elongation) in the PCR method can be appropriately determined by those skilled in the art. Preferred conditions include the following. It is preferable that the reaction solution to be subjected to the PCR method contains each primer and probe at a concentration of 50-500 nM. The total volume of the reaction solution is preferably 10 to 50 μl. The preferred PCR conditions are, for example, 90 to 100 ° C. for 10 seconds to 2 minutes (more preferably 95 ° C. for 30 seconds) and then 90 to 100 ° C. for 2 seconds to 1 minute (more preferably 95 ° C.). 30-60 cycles (5 seconds), 50-60 ° C, 5 seconds to 1 minute (more preferably 55 ° C, 10 seconds), 70 to 80 ° C, 5 to 60 seconds (75 °, 20 seconds) More preferably, it is performed for 45 cycles).
PCRの鋳型に用いるDNAは、HHV6のゲノムDNAである限り特に制限されない。一実施形態において、HHV6のDNAは、HHV6に罹患した被験者又はそれが疑われる被験者由来であることが好ましい。HHV6に罹患した被験者又はそれが疑われる被験者から取得する検体の種類は特に制限されず、例えば、血液（全血、血清、又は血漿を含む）を挙げることができる。 The DNA used as a template for PCR is not particularly limited as long as it is HHV6 genomic DNA. In one embodiment, the DNA of HHV6 is preferably derived from a subject suffering from or suspected of having HHV6. The type of sample obtained from a subject suffering from or suspected of having HHV6 is not particularly limited, and examples thereof include blood (including whole blood, serum, or plasma).
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
下記表１に示す構造を有するHHV6のタイプＡ及びタイプＢを検出するためのDNA−RNAキメラプローブを作製した。
Example 1
A DNA-RNA chimeric probe for detecting HHV6 type A and type B having the structures shown in Table 1 below was prepared.
表１において、括弧内に大文字で示される塩基はＲＮＡであり、その他の小文字で示される塩基はDNAである。EclipseとはEclipse Dark Quencherである。結合領域は、HHV6の全遺伝子配列（Accesssion No (NCBI) AF157706.1）において各プローブが結合する領域を示す。 In Table 1, the base shown in uppercase letters in parentheses is RNA, and the other bases shown in lowercase letters are DNA. Eclipse is Eclipse Dark Quencher. The binding region indicates the region to which each probe binds in the entire gene sequence of HHV6 (Accession No (NCBI) AF157706.1).
また、下記表２に示す構造を有する、HHV6の遺伝子のうち103982位を含む領域を増幅するための７種類のプライマー対を作製した。 In addition, seven types of primer pairs having the structures shown in Table 2 below for amplifying the region containing the 103982 position in the HHV6 gene were prepared.
表１のプローブ及び表２のプライマー対を下記表３に示す組み合わせで用い、HHV6のタイプA又はタイプBの遺伝子配列を有するプラスミドDNA（ユーロフィンジェノミクス社製）を鋳型としてPCRを行い、各組み合わせによる遺伝子型の検出を試みた。プラスミドのコピー数を100〜106 copies/mlまでの段階希釈し、Ct値に関する検量線の作成を試みた。PCRには、TaKaRa Cycleve PCR Starter Kit (Cycleave PCR Reaction Mix)、及びABI StepOne Plus Real-Time PCR systemを使用した。PCRは、Takara Cycleave マニュアルに従い下記の表４に示す条件で実施した。 Using the probes in Table 1 and the primer pairs in Table 2 in the combinations shown in Table 3 below, PCR was performed using plasmid DNA having a HHV6 type A or type B gene sequence (manufactured by Eurofin Genomics) as a template, and each combination was performed. I tried to detect the genotype by. Plasmid copy number serially diluted up to 10 0 ~10 6 copies / ml, was attempted to create a calibration curve for Ct value. For PCR, TaKaRa Cycleve PCR Starter Kit (Cycleave PCR Reaction Mix) and ABI StepOne Plus Real-Time PCR system were used. PCR was performed under the conditions shown in Table 4 below according to the Takara Cycleave manual.
PCRサイクルの温度及び回数は下記の通りである。
Step PCR標準プロトコール。
Hold Cycle:1 95℃ 30秒
Step PCR Cycle:45 95℃ 5秒
55℃ 10秒
72℃ 20秒
Cooling Cycle:1 40℃ 1分
The temperature and number of PCR cycles are as follows.
Step PCR standard protocol.
Hold Cycle: 1 95 ℃ 30 seconds
Step PCR Cycle: 45 95 ℃ 5 seconds
55 ℃ 10 seconds
72 ℃ 20 seconds
Cooling Cycle: 1 40 ℃ 1 minute
各試験の結果は表３に示すとおりである。タイプBの検出は、タイプB プローブ1とプライマー対１の組み合わせでのみ従来のシークエンシングを用いた試験と同等に高い感度で検出可能であった（試験No.1）。同じプライマー対１を用いてもプローブの構造が僅かに異なるだけでType Bの検出はできないことが判明した（試験No.2及び3）。また、Type Bプローブ1を用いた場合も、異なるプライマー対2〜4ではType Bを検出できないことが判明した。Type Aの検出については、プローブの構造にある程度のバリエーションは許容されたが（試験No.1〜3）、プライマー対5〜7を用いた場合には検出できないことが判明した。 The results of each test are shown in Table 3. Type B detection was possible only with the combination of type B probe 1 and primer pair 1 with the same high sensitivity as the test using conventional sequencing (Test No. 1). It was found that even if the same primer pair 1 was used, Type B could not be detected with only a slight difference in the probe structure (Tests No. 2 and 3). It was also found that Type B cannot be detected with different primer pairs 2 to 4 even when Type B probe 1 is used. Regarding the detection of Type A, some variation in the structure of the probe was allowed (Test Nos. 1 to 3), but it was found that it could not be detected when primer pairs 5 to 7 were used.
実施例２
ヘルペスウイルス６型に罹患した患者検体１及び２の血漿分離をした。血漿を0.22μｍ（メルク社）のフィルターに通し、不純物を除去した。QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen社）を使用し血漿200μlから100μlのＤＮＡ溶液を回収した。従来のシークエンス法を使いた測定により、患者検体１及び２のいずれについてもＴｙｐｅＢであることを確認した。尚、患者検体１のウイルス量は19048.2 copies /mlであり、患者検体２のウイルス量は9261.28 copies /mlであった。その後、一旦ＤＮＡを凍結保存し、凍結したＤＮＡを再解凍（そのためウイルス量の若干の低下が予測される）して、実施例１と同様に異なるプローブ及びプライマー対の組み合わせでＴｙｐｅＡ及びＢの検出を試みた。その結果、ＴｙｐｅＢプローブ１とプライマー対１の組み合わせでのみ検出が確認された。
Example 2
Plasma separation of patient specimens 1 and 2 affected with herpesvirus 6 was performed. Plasma was passed through a 0.22 μm (Merck) filter to remove impurities. A DNA solution of 200 μl to 100 μl of plasma was recovered using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). By measurement using the conventional sequence method, it was confirmed that both patient samples 1 and 2 were Type B. The viral load of patient sample 1 was 19048.2 copies / ml, and the viral load of patient sample 2 was 9261.28 copies / ml. Then, once the DNA is cryopreserved, the frozen DNA is re-thawed (thus, a slight decrease in viral load is expected), and Type A and B are detected with different combinations of probes and primer pairs as in Example 1. I tried. As a result, detection was confirmed only with the combination of Type B probe 1 and primer pair 1.
Claims (7)
（Ｂ）：5’-Q-gacgGcac-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を有する、ヒトヘルペスウイルス６（HHV6）タイプＢを検出するためのプローブであって、
配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対と共に用いられることを特徴とする、
前記プローブ。 The following structure (B):
(B): 5'-Q-gacgGcac-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, and F is a fluorescent dye.)
A probe for detecting human herpesvirus 6 (HHV6) type B , which has
It is characterized in that it is used together with a primer pair consisting of a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2.
The probe .
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’-Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’-Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素である）
を含む、HHV6の遺伝子型を識別するためのキット。 The probe according to claim 1 and a probe (A-1) for detecting HHV6 type A having any of the following structures (A-1) to (A-3): 5'-Q-gtgtgAcgt- F-3'
(A-2): 5'-Q-ggtgtgAcg-F-3'
(A-3): 5'-Q-gtgtgAcg-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, and F is a fluorescent dye.)
A kit for identifying the genotype of HHV6, including.
該プローブが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程（２）
を含む、請求項５に記載の方法。 The step (1) of performing PCR using the genomic DNA of HHV6 as a template and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the presence of the probe of claim 1 and the probe. Step of detecting the fluorescence emitted by the fluorescent dye possessed by (2)
5. The method of claim 5 .
工程（１）；請求項１のプローブ（プローブＢ）及び下記の構造（Ａ−１）〜（Ａ−３）のいずれかを有するHHV6タイプＡを検出するためのプローブ（プローブＡ）の存在下で、HHV6のゲノムDNAを鋳型として配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いてPCRを行う工程
（Ａ−１）：5’-Q-gtgtgAcgt-F-3’
（Ａ−２）：5’-Q-ggtgtgAcg-F-3’
（Ａ−３）：5’-Q-gtgtgAcg-F-3’
（ここで、Qはクエンチャーであり、小文字アルファベットはDNA分子であり、大文字アルファベットはRNA分子であり、Fは蛍光色素であり、プローブＡが有する蛍光色素とプローブＢが有する蛍光色素の種類は互いに異なる）
工程（２）；プローブＡ及び／又はプローブＢが有する蛍光色素が発する蛍光を検出する工程。 Method for identifying the genotype of HHV6 including the following steps (1) and (2):
Step (1); In the presence of the probe (probe B) of claim 1 and the probe (probe A) for detecting HHV6 type A having any of the following structures (A-1) to (A-3). Then, a step (A-1) of performing PCR using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 using the genomic DNA of HHV6 as a template: 5'-Q-gtgtgAcgt-F- 3'
(A-2): 5'-Q-ggtgtgAcg-F-3'
(A-3): 5'-Q-gtgtgAcg-F-3'
(Here, Q is a quencher, the lowercase alphabet is a DNA molecule, the uppercase alphabet is an RNA molecule, F is a fluorescent dye, and the types of fluorescent dyes that probe A has and probe B have are. Different from each other)
Step (2); A step of detecting the fluorescence emitted by the fluorescent dye of probe A and / or probe B.
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