WO2021002030A1 - Dengue virus detection reagent - Google Patents

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上田　哲也
雪子 羽田野
サーウィーサック ティラワトナポン
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株式会社ミルジェン
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Definitions

  • the present invention relates to a dengue virus detection reagent and a method for discriminating the serotype of the virus using the reagent.
  • Dengue Fever is a viral infectious disease that is prevalent in tropical or subtropical regions centered on Southeast Asia, Africa, and Central and South America. Although it is a benign disease with a high tendency to heal spontaneously, it rarely progresses to dengue hemorrhagic fever (DHF) with bleeding symptoms, and further becomes more serious and progresses to dengue shock syndrome (DSS). It is known to do. Therefore, if appropriate treatment is not given at an early stage, there is a risk of death (Non-Patent Document 1). According to the WHO, it is estimated that about 100 million people worldwide develop dengue fever annually and about 250,000 develop dengue hemorrhagic fever.
  • the Fw primers include, for example, positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 131 to 148 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and Examples thereof include oligonucleotides containing the base sequences of positions 133 to 150 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a more specific example of the Fw primer is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • R stands for G (guanine) or A (adenine)
  • M stands for A or C (cytosine)
  • Y stands for T (thymine) or C.
  • the "fluorescent substance” refers to a substance having the property of being excited by absorbing excitation light of a specific wavelength and emitting fluorescence when returning to the original ground state.
  • FITC Fluorescent Chemical
  • Texas cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, Quasar® 670, Quasar® 705, CAL Fluor®
  • Red 610 fluorescein or a derivative thereof, or rhodamine or a derivative thereof. However, these are not limited.
  • Example 3 A commercially available dengue virus panel sample is used as a sample for the dengue virus serotyping method of the present invention to verify whether the serotype results determined in the present invention match the serotype presented in the panel sample.

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Abstract

A purpose of the invention is to develop and provide a detection reagent for easily determining the serotype of a dengue virus at high sensitivity.　Provided is a dengue virus detection reagent that includes a primer set configured to permit amplification of specific regions on the 5' end side of the dengue genome and at least one probe capable of hybridizing to each of the serotype-specific regions present in the fragment amplified by the primer set.

Description

デングウイルス検出試薬Dengue virus detection reagent
　本発明は、デングウイルス検出試薬、及びそれを用いた該ウイルスの血清型を判別する方法に関する。 The present invention relates to a dengue virus detection reagent and a method for discriminating the serotype of the virus using the reagent.
　デング熱（Dengue Fever）は、東南アジア、アフリカ、及び中南米等を中心とした熱帯又は亜熱帯地域で流行するウイルス感染性疾患である。自然治癒傾向の高い良性の疾患ではあるが、稀に出血症状を伴ったデング出血熱（Dengue Hemorrhagic Fever：DHF）に移行し、さらに重篤化してデングショック症候群(Dengue Shock Syndrome：DSS)に進行することが知られている。それ故に、早期に適切な治療を施さない場合、死に至る危険性も伴う（非特許文献１）。WHOによれば、全世界では年間約1億人がデング熱を発症し、約25万人がデング出血熱に移行すると推定されている。 Dengue Fever is a viral infectious disease that is prevalent in tropical or subtropical regions centered on Southeast Asia, Africa, and Central and South America. Although it is a benign disease with a high tendency to heal spontaneously, it rarely progresses to dengue hemorrhagic fever (DHF) with bleeding symptoms, and further becomes more serious and progresses to dengue shock syndrome (DSS). It is known to do. Therefore, if appropriate treatment is not given at an early stage, there is a risk of death (Non-Patent Document 1). According to the WHO, it is estimated that about 100 million people worldwide develop dengue fever annually and about 250,000 develop dengue hemorrhagic fever.
　人的往来の活発化により、デング熱は、近年、流行地域から輸入感染症として持ち込まれる症例が増えている。また、温暖化に伴う媒介蚊の分布拡大により、感染リスクのある地域が世界的に拡大しつつある。日本でも2014年に東京で約70年ぶりにデング熱の国内感染例が見つかる等、その発生率は世界的に急激な増加を示しており、今後の世界的な流行状況を注視すべき感染症となっている。 Due to active human traffic, dengue fever has been increasingly brought in from endemic areas as an imported infectious disease in recent years. In addition, due to the expansion of the distribution of vector mosquitoes due to global warming, areas at risk of infection are expanding worldwide. In Japan as well, the incidence of dengue fever has been increasing rapidly worldwide, including the first domestic infection of dengue fever found in Tokyo in 2014, and it is an infectious disease that should be watched for the future global epidemic. It has become.
　デング熱は、フラビウイルス科に属するデングウイルスの感染により発症する。このウイルスは、ヒト－蚊－ヒトのサイクルで伝播することが知られている。デングウイルスの主な媒介蚊は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）をはじめとするヤブカ属（Aedes）の蚊であり、日本国内ではヒトスジシマカ（Aedes albopictus）やヤマダシマカ（Aedes flavopictus）等が媒介蚊になり得る（非特許文献１）。 Dengue fever is caused by infection with dengue virus belonging to the Flaviviridae family. The virus is known to propagate in a human-mosquito-human cycle. The main mosquitoes of dengue virus are Aedes mosquitoes such as Aedes aegypti, and Aedes albopictus and Aedes flavopictus can be mosquitoes in Japan (non-Aedes flavopictus). Patent Document 1).
　デングウイルスには、4つの血清型（第1型～第4型）が存在する。これらの血清型は互いに交叉反応性を示すが、交叉防御免疫性がない。例えば、第1型に罹患した場合、第1型に対する防御免疫は終生持続するが、他の血清型に対する防御免疫は数ヶ月で消失し、その後は他の血清型にも感染し得る。ただし、2つの血清型に感染した後は、全ての血清型に対する交叉防御免疫が誘導されるため、一般的には、3度目の感染はないとされている（非特許文献２）。一方、デング熱は、2つ目の血清型感染時に重症化する確率が高いとされている。それ故に、感染時のデングウイルスの血清型情報を含む実験室内診断が重要となっている。 There are four serotypes (types 1 to 4) of dengue virus. These serotypes are cross-reactive with each other but lack cross-defense immunity. For example, when affected with type 1, protective immunity to type 1 lasts for life, but protective immunity to other serotypes disappears within a few months, after which other serotypes can be infected. However, after infection with two serotypes, cross-protective immunity against all serotypes is induced, so it is generally said that there is no third infection (Non-Patent Document 2). On the other hand, dengue fever is said to have a high probability of becoming severe during the second serotype infection. Therefore, laboratory diagnosis including dengue serotype information at the time of infection is important.
　従来、デングウイルスの検出には、簡便性と即時性からリアルタイムRT-PCRを用いた検出方法が採用されてきた。しかし、デングウイルスの血清型を判別する場合には、それぞれの血清型毎にプライマーペアとプローブを設計しなければならなかった（非特許文献１及び特許文献１）。したがって、単一チューブ内で4種の血清型を一度に検出するには、少なくとも4組以上のプライマーペアと4種以上のプローブを混合させる必要がある（特許文献１）。しかし、複数種のプライマーペアが存在する条件下で増幅反応を行った場合、各プライマー間で増幅干渉を生じるため、血清型毎に検出可能なウイルス濃度が異なるという問題が生じていた（非特許文献３及び４）。この問題を回避するために、血清型間で増幅効率が異ならないようなプライマーペアを設計することは事実上困難とされてきた。 Conventionally, a detection method using real-time RT-PCR has been adopted for the detection of dengue virus because of its simplicity and immediacy. However, when determining the serotype of dengue virus, a primer pair and a probe had to be designed for each serotype (Non-Patent Document 1 and Patent Document 1). Therefore, in order to detect four serotypes at one time in a single tube, it is necessary to mix at least four or more primer pairs and four or more probes (Patent Document 1). However, when the amplification reaction is carried out under the condition that a plurality of types of primer pairs are present, amplification interference occurs between the primers, which causes a problem that the detectable virus concentration differs depending on the serotype (non-patented). Documents 3 and 4). In order to avoid this problem, it has been practically difficult to design a primer pair in which the amplification efficiency does not differ between serotypes.
　デングウイルスは、第１型及び第3型、又は第2型及び第4型で遺伝子配列が類似している。そこで、従来のデングウイルス検出用試薬の多くは、4種の血清型を検出する場合、類似性が比較的低い第1型及び第4型の2種、並びに第2型及び第3型の2種をそれぞれ検出チューブに分けて検出を行い、その結果を総合して判断していた（非特許文献３）。 Dengue virus has similar gene sequences in types 1 and 3, or types 2 and 4. Therefore, most of the conventional reagents for detecting dengue virus have two types, type 1 and type 4, which have relatively low similarity when detecting four types of serotypes, and two types, type 2 and type 3. Was divided into detection tubes for detection, and the results were comprehensively judged (Non-Patent Document 3).
　現在では、単一チューブ内で4種の血清型を一度に検出する検出試薬も開発され、一部で市販もされている。しかし、上述したように血清型毎に検出可能なウイルス濃度が異なるという問題は依然解決されておらず、それ故に検出感度の低さが問題となっていた（非特許文献４）。 Currently, detection reagents that detect four serotypes at once in a single tube have been developed, and some are commercially available. However, as described above, the problem that the detectable virus concentration differs depending on the serotype has not yet been solved, and therefore the low detection sensitivity has been a problem (Non-Patent Document 4).
特開2017-85905JP 2017-85905
　本発明の課題は、デングウイルスの血清型を簡便かつ高感度で判別するための検出試薬を開発し、提供することである。また、その試薬を用いて単一チューブ内で全ての血清型を一度の反応で検出可能とする方法を提供することである。 An object of the present invention is to develop and provide a detection reagent for easily and highly sensitively discriminating the serotype of dengue virus. It is also to provide a method of using the reagent to detect all serotypes in a single tube in a single reaction.
　上記課題を解決するために、本発明者らは、デングウイルスゲノム上でこれまで着目されていなかった5’末端側の特定の領域を検出対象領域としたときに、全ての血清型を増幅することができる1組のプライマーペア、及びそのプライマーペアによる増幅断片中に存在する各血清型特異的な領域を認識できるプローブを設計できることを見出した。実際にそれらのプライマーペア及び各血清型特異的なプローブを用いてデングウイルスの検出を行った結果、各血清型間の検出可能なウイルス濃度を変えることなく、単一チューブ内で4種の血清型を一度に、かつ市販のデングウイルス検出試薬よりも高い感度で検出できることが明らかとなった。本発明は、当該研究結果に基づくものであり、以下を提供する。 In order to solve the above problems, the present inventors amplify all serotypes when a specific region on the 5'terminal side, which has not been noticed so far on the dengue virus genome, is set as a detection target region. We have found that it is possible to design a pair of primer pairs capable of recognizing each serotype-specific region present in an amplified fragment of the primer pair. As a result of actually detecting dengue virus using those primer pairs and each serotype-specific probe, four serotypes in a single tube without changing the detectable virus concentration between each serotype. It was clarified that can detect serotypes at once and with higher sensitivity than commercially available dengue virus detection reagents. The present invention is based on the research results and provides the following.
（１）プライマーセット及び少なくとも1つのプローブを含むデングウイルス検出試薬であって、前記プライマーセットは配列番号１で示す塩基配列において129位～285位を含む250塩基以下の領域を増幅可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成され、かつ前記プローブは配列番号１で示す塩基配列の203位～223位、配列番号２で示す塩基配列の199位～222位、配列番号３で示す塩基配列の208位～225位、及び配列番号４で示す塩基配列の207位～231位に相補的な塩基配列にハイブリダイゼーション可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されている前記試薬。
（２）前記プライマーセットのフォワードプライマーは配列番号１で示す塩基配列の129位～146位の塩基配列を含み、リバースプライマーは配列番号１で示す塩基配列の276位～285位に相補的な塩基配列を含む、（１）に記載のデングウイルス検出試薬。
（３）前記フォワードプライマーが配列番号５で示す塩基配列からなり、前記リバースプライマーが配列番号６で示す塩基配列からなる、（２）に記載のデングウイルス検出試薬。
（４）前記プローブが配列番号７～１１で示すいずれか一以上の塩基配列からなる、（１）～（３）のいずれかに記載のデングウイルス検出試薬。
（５）内部コントロール用のプライマーペア及びプローブをさらに含む、（１）～（４）のいずれかに記載のデングウイルス検出試薬。
（６）前記内部コントロールがsirtuin1遺伝子である、（５）に記載のデングウイルス検出試薬。
（７）前記内部コントロール用プライマーペアのフォワードプライマーが配列番号１３で示す塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１４で示す塩基配列からなる、（６）に記載のデングウイルス検出試薬。
（８）前記内部コントロール用プローブが配列番号１５で示す塩基配列からなる、（７）に記載のデングウイルス検出試薬。
（９）前記各プローブがそれぞれ異なる標識物質で標識されている、（１）～（８）のいずれかに記載のデングウイルス検出試薬。
（１０）デングウイルスの血清型判別方法であって、（１）～（９）のいずれかに記載のデングウイルス試薬及び被験者由来の核酸試料を用いて、標的核酸の特定の領域を増幅する核酸増幅工程、及び前記核酸増幅工程で増幅される各血清型の増幅断片に基づいてデングウイルスの血清型を判別する血清型判別工程を含む前記方法。
（１１）前記各血清型の増幅断片を定量的に測定する、（１０）に記載のデングウイルスの血清型判別方法。
（１２）（９）に記載のデングウイルス試薬を用いて、単一の容器内で標的核酸の増幅を行う、（１０）又は（１１）に記載のデングウイルスの血清型判別方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-123319号の開示内容を包含する。 (1) A dengue virus detection reagent containing a primer set and at least one probe, wherein the primer set is derived from a base sequence capable of amplifying a region of 250 bases or less including positions 129 to 285 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The probe is composed of the oligonucleotides (positions 203 to 223) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 199 to 222 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and positions 208 to of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. The reagent composed of an oligonucleotide consisting of a base sequence capable of hybridizing to a base sequence complementary to the base sequence at positions 225 and 207 to 231 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(2) The forward primer of the primer set contains the base sequences of positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the reverse primer is a base complementary to the positions 276 to 285 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The dengue virus detection reagent according to (1), which comprises a sequence.
(3) The dengue virus detection reagent according to (2), wherein the forward primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the reverse primer has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.
(4) The dengue virus detection reagent according to any one of (1) to (3), wherein the probe comprises any one or more base sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 11.
(5) The dengue virus detection reagent according to any one of (1) to (4), further comprising a primer pair and a probe for internal control.
(6) The dengue virus detection reagent according to (5), wherein the internal control is the sirtuin1 gene.
(7) The dengue virus detection reagent according to (6), wherein the forward primer of the internal control primer pair consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the reverse primer consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
(8) The dengue virus detection reagent according to (7), wherein the internal control probe comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15.
(9) The dengue virus detection reagent according to any one of (1) to (8), wherein each probe is labeled with a different labeling substance.
(10) A nucleic acid amplification step for serotyping a dengue virus, in which a specific region of a target nucleic acid is amplified using the dengue virus reagent according to any one of (1) to (9) and a nucleic acid sample derived from a subject. The method comprising a serotype determination step of determining the serotype of dengue virus based on the amplified fragment of each serotype amplified in the nucleic acid amplification step.
(11) The method for determining the serotype of dengue virus according to (10), wherein the amplified fragment of each serum type is quantitatively measured.
(12) The method for determining the serotyping of dengue virus according to (10) or (11), wherein the target nucleic acid is amplified in a single container using the dengue virus reagent according to (9).
This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2019-123319, which is the basis of the priority of the present application.
　本発明のデングウイルス検出試薬によれば、デングウイルスの血清型を簡便かつ高感度で判別することができる。また、増幅時に検出可能なウイルス量が血清型毎に異なるという問題は生じず、それ故に、単一チューブ内で全ての血清型を一度の反応で、高い感度で検出することができる。 According to the dengue virus detection reagent of the present invention, the serotype of dengue virus can be easily and highly sensitively discriminated. In addition, there is no problem that the amount of virus that can be detected at the time of amplification differs for each serotype, and therefore all serotypes can be detected with high sensitivity in a single reaction in a single tube.
デングウイルスゲノムの各血清型における5’末端領域の塩基配列（それぞれ5’末端から約400までを表示）をアラインメントした図である。図中、DENV Type Iはデングウイルスの1型を、DENV Type IIは2型を、DENV Type IIIは3型を、DENV Type IVは4型を示している。また、塩基配列中の「-」はギャップを示す。図中、黒枠及び破線枠で囲まれた領域は、それぞれ本発明のデング検出試薬のFwプライマー及びRvプライマーがハイブリダイゼーションする領域を示す。また、図中下線を引いた領域は、本発明のデング検出試薬における各血清型特異的なプローブ（血清型検出用プローブ）がハイブリダイゼーションする領域である。It is a figure which aligned the base sequence of the 5'end region (displaying from the 5'end to about 400 respectively) in each serotype of the dengue virus genome. In the figure, DENV Type I indicates dengue virus type 1, DENV Type II indicates type 2, DENV Type III indicates type 3, and DENV Type IV indicates type 4. In addition, "-" in the base sequence indicates a gap. In the figure, the regions surrounded by the black frame and the broken line frame indicate the regions where the Fw primer and the Rv primer of the dengue detection reagent of the present invention hybridize, respectively. The underlined region in the figure is a region where each serotype-specific probe (serotype detection probe) in the dengue detection reagent of the present invention hybridizes. 本発明のデングウイルス検出試薬と対照試薬を用いて、各血清型に対する定量RT-PCRを行った時のそれぞれのCt値を比較したΔCtである。検体No.は、それぞれの血清型に罹患している患者から得られた血清試料である。ΔCt comparing the Ct values of each serotype when quantitative RT-PCR was performed using the dengue virus detection reagent of the present invention and the control reagent. Specimen No. is a serum sample obtained from a patient suffering from each serotype. 本発明のデングウイルス検出試薬と対照試薬を用いて、デングウイルス濃度が異なる3つの試料（低濃度、中濃度、高濃度）のそれぞれに対して定量RT-PCRを行い、算出された両者のCt値を比較したΔCtである。図３は低濃度試料の結果を示す。また、Aは1型、Bは2型、Cは3型、及びDは4型である。Using the dengue virus detection reagent and the control reagent of the present invention, quantitative RT-PCR was performed on each of the three samples (low concentration, medium concentration, and high concentration) having different dengue virus concentrations, and the calculated Ct values of both were obtained. It is the compared ΔCt. FIG. 3 shows the results of the low concentration sample. In addition, A is type 1, B is type 2, C is type 3, and D is type 4. 図３と同じ目的の実験であり、中濃度試料の結果を示す。また、Aは1型、Bは2型、Cは3型、及びDは4型である。This is an experiment for the same purpose as in FIG. 3, and the results of a medium concentration sample are shown. In addition, A is type 1, B is type 2, C is type 3, and D is type 4. 図３と同じ目的の実験であり、高濃度試料の結果を示す。また、Aは1型、Bは2型、Cは3型、及びDは4型である。This is an experiment for the same purpose as in FIG. 3, and the results of a high-concentration sample are shown. In addition, A is type 1, B is type 2, C is type 3, and D is type 4.
１．デングウイルス検出試薬
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、デングウイルス検出試薬である。本発明のデング検出試薬は、プライマーセット及び少なくとも1種のプローブを含む。本発明のデングウイルス検出試薬によれば、デングウイルスを検出できるだけでなく、そのデングウイルスが4種の血清型のいずれであるかを1度の検出回数で判別することができる。 1. 1. Dengue virus detection reagent 1-1. Overview The first aspect of the present invention is a dengue virus detection reagent. The dengue detection reagent of the present invention includes a primer set and at least one probe. According to the dengue virus detection reagent of the present invention, not only can dengue virus be detected, but which of the four serotypes the dengue virus is can be determined by the number of detections at one time.
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　「デングウイルス」とは、前述のように、フラビウイルス科に属する球形の1本鎖RNAウイルスで、デング熱の原因ウイルスである。デングウイルスには、4種の血清型、すなわち、第1血清型、第2血清型、第3血清型、及び第4血清型が存在する。本明細書では、しばしば、前述の血清型をそれぞれ1型、2型、3型、及び4型と表記する。 1-2. Definitions The following terms that are frequently used herein are defined.
As mentioned above, "dengue virus" is a spherical single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family and is the causative virus of dengue fever. There are four serotypes of dengue virus, namely the first serotype, the second serotype, the third serotype, and the fourth serotype. As used herein, the aforementioned serotypes are often referred to as type 1, type 2, type 3, and type 4, respectively.
　「デングウイルス（の）ゲノム」とは、デングウイルスのRNAからなる全ゲノムをいう。本明細書では、1型デングウイルスゲノム（1型ゲノム）の塩基配列を配列番号１で、2型デングウイルスゲノム（2型ゲノム）の塩基配列を配列番号２で、3型デングウイルスゲノム（3型ゲノム）の塩基配列を配列番号３で、そして4型デングウイルスゲノム（4型ゲノム）の塩基配列を配列番号４で示す。なお、デングウイルスゲノムは本来RNAであるが、配列番号１～４ではDNAに変換したcDNA配列で表記している。 "Dengue virus (of) genome" means the entire genome consisting of dengue virus RNA. In the present specification, the nucleotide sequence of the type 1 dengue virus genome (type 1 genome) is designated by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of the type 2 dengue virus genome (type 2 genome) is referred to by SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of is shown by SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the type 4 dengue virus genome (type 4 genome) is shown by SEQ ID NO: 4. The dengue virus genome is originally RNA, but in SEQ ID NOs: 1 to 4, it is represented by a cDNA sequence converted into DNA.
　本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、天然、すなわち自然界に存在するヌクレオチドをいう。例えば、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びDNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。 As used herein, the term "natural nucleotide" refers to a nucleotide that exists in nature, that is, in nature. For example, ribonucleotides known as RNA constituent units and deoxyribonucleotides known as DNA constituent units can be mentioned.
　本明細書において「非天然型ヌクレオチド」とは、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する自然界に存在しないヌクレオチドである。具体的には、人工的に構築された又は人工的に化学修飾されたヌクレオチド、又は非天然型ヌクレオシド若しくは非天然型塩基を含むヌクレオチドをいう。前記人工的に構築されたヌクレオチドには、例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が含まれる。人工的に化学修飾されたヌクレオチドには、例えば、メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体が含まれる。前記非天然型ヌクレオシドには、例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2′-デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド等が含まれる。また、前記非天然型塩基には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等の他、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等の修飾塩基が含まれる。 As used herein, the term "non-natural nucleotide" is a nucleotide that does not exist in nature and has properties and / or structures similar to those of the natural nucleotide. Specifically, it refers to an artificially constructed or artificially chemically modified nucleotide, or a nucleotide containing an unnatural nucleoside or an unnatural base. Examples of the artificially constructed nucleotides include peptide nucleic acids (PNA: Peptide Nucleic Acid), peptide nucleic acids having phosphate groups (PHONA), crosslinked nucleic acids (BNA / LNA: Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid), and the like. Morphorinonucleic acid and the like are included. Artificially chemically modified nucleotides include, for example, chemically modified nucleic acids such as methylphosphonate type DNA / RNA, phosphorothioate type DNA / RNA, phosphoramidate type DNA / RNA, and 2'-O-methyl type DNA / RNA. And nucleic acid analogs are included. The non-natural nucleosides include, for example, debased nucleosides, arabinonucleosides, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleosides, β-L-deoxyribonucleosides and the like. The non-natural base includes, for example, 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 5-position substituted-2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 2-amino-6-. Others such as (2-thiazolyl) purine-9-yl group, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purine-9-yl group, 2-amino-6- (2-oxazolyl) purine-9-yl group Includes modified bases such as modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycitosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil), modified purines (eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine) and other heterocyclic bases. ..
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。 The "oligonucleotide" refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several tens of hydroxyl groups and phosphate groups of a sugar moiety between adjacent nucleotides.
　本明細書において「試料」とは、第１態様に記載のデングウイルス検出試薬を用いたデングウイルス検出方法（例えば、第２態様に記載のデングウイルス血清型判別方法）に供される、被験者から採取した生体試料であって、例えば、体液、組織、又は細胞が該当する。ここで「体液」とは、液体状の生体試料をいう。例えば、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、髄液（脳脊髄液）、尿、リンパ液、消化液、腹水、胸水、神経根周囲液、各組織若しくは細胞の抽出液等が挙げられる。本発明において、好ましい試料は、限定はしないが血液である。 As used herein, the term "sample" refers to a living body collected from a subject, which is used in a dengue virus detection method using the dengue virus detection reagent described in the first aspect (for example, the dengue virus serotyping method described in the second aspect). A sample, for example, body fluid, tissue, or cell. Here, the "body fluid" refers to a liquid biological sample. Examples thereof include blood (including serum, plasma and interstitial fluid), cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), urine, lymph, digestive juice, ascites, pleural effusion, perineural fluid, and extracts of each tissue or cell. .. In the present invention, the preferred sample is, but not limited to, blood.
　本明細書において「核酸試料」とは、前記試料から抽出された核酸（DNA及び／又はRNA）をいう。 As used herein, the term "nucleic acid sample" refers to nucleic acid (DNA and / or RNA) extracted from the sample.
　本明細書において「被験者」とは、前記試料を提供し、検査に供されるヒト個体をいう。被験者は、デングウイルス感染の疑いのある個体又はデングウイルス感染個体のいずれであってもよい。「デングウイルス感染の疑いのある個体」とは、デング熱発生地域に滞在した期間に蚊に刺された個体、又はデング熱発生地域に滞在した後、発熱した個体等を含む。「デングウイルス感染個体」とは、現在デング熱に罹患している患者の他、過去デング熱に罹患し、現在は治癒したと考えられるデング熱既往歴者を含む。 In the present specification, the "subject" means a human individual who provides the sample and is subjected to an examination. The subject may be either an individual suspected of being infected with dengue virus or an individual infected with dengue virus. The “individual suspected of being infected with dengue virus” includes an individual bitten by a mosquito during the period of stay in the dengue outbreak area, or an individual who has a fever after staying in the dengue fever outbreak area. "Dengue virus-infected individuals" include patients currently suffering from dengue fever, as well as persons with a history of dengue fever who have previously suffered from dengue fever and are now considered to have been cured.
１－３．構成
　発明のデングウイルス検出試薬は、必須の構成要素としてプライマーセット及び少なくとも1種のプローブを含み、選択的な構成要素として内部コントロールプライマーセット及び内部コントロールプローブを含む。以下、これらの構成について具体的に説明をする。 1-3. Constituents The dengue virus detection reagent of the present invention contains a primer set and at least one probe as essential components, and an internal control primer set and an internal control probe as selective components. Hereinafter, these configurations will be specifically described.
（１）プライマーセット
　本発明のデングウイルス検出試薬は、デングウイルスゲノムの所定の領域を増幅するためのプライマーセットを含む。 (1) Primer set The dengue virus detection reagent of the present invention contains a primer set for amplifying a predetermined region of the dengue virus genome.
　前記「所定の領域」とは、デングウイルスの4種の血清型について、それぞれ特異的な塩基配列を含み、かつ共通のプライマーセットで増幅することのできる、デングウイルスポリプロテインのancC（anchored capsid protein C）の一部をコードする領域である。具体的には、配列番号１で示す1型ゲノムの129位～285位、配列番号２で示す2型ゲノムの131位～287位、配列番号３で示す3型ゲノムの129位～285位、及び配列番号４で示す4型ゲノムの133位～289位に相当する領域である。これらの領域は、図１で示すように互いに対応する類似領域である。 The "predetermined region" is ancC (anchored capsid protein C) of dengue virus polyprotein, which contains a specific base sequence for each of the four serotypes of dengue virus and can be amplified with a common primer set. This is the area that codes a part of. Specifically, positions 129 to 285 of the type 1 genome shown by SEQ ID NO: 1, positions 131 to 287 of the type 2 genome shown by SEQ ID NO: 2, positions 129 to 285 of the type 3 genome shown by SEQ ID NO: 3, It is a region corresponding to positions 133 to 289 of the type 4 genome shown in SEQ ID NO: 4. These regions are similar regions that correspond to each other as shown in FIG.
　前記プライマーセットによる増幅断片の塩基長は、157塩基～200塩基、160塩基～195塩基、165塩基～190塩基、170塩基～185塩基、又は175塩基～180塩基の範囲内にあればよい。一例として、配列番号１で示す1型ゲノムの123位～300位、配列番号２で示す2型ゲノムの125位～302位、配列番号３で示す3型ゲノムの123位～300位、及び配列番号４で示す4型ゲノムの127位～304位に相当する178塩基が挙げられる。 The base length of the amplified fragment by the primer set may be in the range of 157 bases to 200 bases, 160 bases to 195 bases, 165 bases to 190 bases, 170 bases to 185 bases, or 175 bases to 180 bases. As an example, positions 123 to 300 of the type 1 genome shown by SEQ ID NO: 1, positions 125 to 302 of the type 2 genome shown by SEQ ID NO: 2, positions 123 to 300 of the type 3 genome shown by SEQ ID NO: 3, and sequences. 178 bases corresponding to positions 127 to 304 of the type 4 genome represented by No. 4 can be mentioned.
　前記プライマーセットはフォワードプライマー（本明細書では「Fwプライマー」と表記する）とリバースプライマー（本明細書では「Rvプライマー」と表記する）で構成される。それぞれのプライマーは、天然型ヌクレオチド及び／又は非天然型ヌクレオチドで構成される。通常は、DNA、又はRNAの天然型ヌクレオチドで構成されている。中でも安定性が高く、合成が容易で低廉なDNAは特に好ましい。また、必要に応じてDNAとRNAの天然型ヌクレオチドを組み合わせたり、一部にLNAのような非天然型ヌクレオチドを組み合わせることもできる。 The primer set is composed of a forward primer (referred to as "Fw primer" in the present specification) and a reverse primer (referred to as "Rv primer" in the present specification). Each primer is composed of native and / or non-natural nucleotides. It is usually composed of DNA or natural nucleotides of RNA. Among them, DNA having high stability, easy to synthesize and inexpensive is particularly preferable. In addition, if necessary, natural nucleotides of DNA and RNA can be combined, or non-natural nucleotides such as LNA can be partially combined.
　FwプライマーとRvプライマーは、前記所定の領域を増幅可能なように、またTm値が限定はしないが55℃～80℃、好ましくは60℃～75℃の範囲となるように設計され、かつ当該分野の技術常識の範囲内であれば、その塩基長や塩基配列は特に限定しない。ただし、デングウイルスゲノム上の連続する18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、24塩基以上、又は25塩基以上にハイブリダイゼーション可能な塩基長と塩基配列であることが好ましい。 The Fw primer and Rv primer are designed so that the predetermined region can be amplified, and the Tm value is not limited, but is in the range of 55 ° C to 80 ° C, preferably 60 ° C to 75 ° C. The base length and base sequence are not particularly limited as long as they are within the range of common general technical knowledge in the field. However, the base length and base sequence that can be hybridized to consecutive 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, 21 bases or more, 22 bases or more, 23 bases or more, 24 bases or more, or 25 bases or more on the Dengvirus genome. Is preferable.
　Fwプライマーには、例えば、配列番号１で示す塩基配列の129位～146位、配列番号２で示す塩基配列の131位～148位、配列番号３で示す塩基配列の129位～146位、及び配列番号４で示す塩基配列の133位～150位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。より具体的なFwプライマーの例として、配列番号５で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。この塩基配列において、RはG（グアニン）又はA（アデニン）を、MはA又はC（シトシン）を、YはT(チミン）又はCを示す。配列番号５のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示す塩基配列の123位～146位、配列番号２で示す塩基配列の125位～148位、配列番号３で示す塩基配列の123位～146位、及び配列番号４で示す塩基配列の127位～150位の塩基配列のいずれにもハイブリダイゼーションすることができる。 The Fw primers include, for example, positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 131 to 148 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and Examples thereof include oligonucleotides containing the base sequences of positions 133 to 150 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. A more specific example of the Fw primer is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5. In this base sequence, R stands for G (guanine) or A (adenine), M stands for A or C (cytosine), and Y stands for T (thymine) or C. The oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 are positions 123 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 125 to 148 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and positions 123 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. And it can be hybridized to any of the base sequences of positions 127 to 150 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
　Rvプライマーは、例えば、配列番号１で示す塩基配列の276位～285位、配列番号２で示す塩基配列の278位～287位、配列番号３で示す塩基配列の276位～285位、及び配列番号４で示す塩基配列の280位～289位のそれぞれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。より具体的なRvプライマーの例として、配列番号６で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。この塩基配列において、RはG又はAを、MはA又はCを、YはT又はCを、DはA、T、又はGを、そしてKはT又はGを示す。配列番号６のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示す塩基配列の276位～300位、配列番号２で示す塩基配列の278位～302位、配列番号３で示す塩基配列の276位～300位、及び配列番号４で示す塩基配列の280位～304位のそれぞれに相補的な塩基配列のいずれにもハイブリダイゼーションすることができる。 The Rv primer is, for example, positions 276 to 285 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 278 to 287 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 276 to 285 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a sequence. Examples thereof include oligonucleotides containing a base sequence complementary to each of the 280th to 289th positions of the base sequence represented by No. 4. A more specific example of the Rv primer is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. In this sequence, R stands for G or A, M stands for A or C, Y stands for T or C, D stands for A, T, or G, and K stands for T or G. The oligonucleotides of SEQ ID NO: 6 are positions 276 to 300 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 278 to 302 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and positions 276 to 300 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. And any of the base sequences complementary to each of the 280th to 304th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be hybridized.
　プライマーは、その5’末端側に鋳型核酸の塩基配列とは異なる付加配列を含むことができる。付加配列は、デングウイルスゲノム、プライマー、又は後述するプローブとハイブリダイゼーション等の相互作用を生じない限り、任意の塩基配列とすることができる。例えば、制限酵素部位や新たなプライマー結合部位を含む塩基配列が挙げられる。さらに、プライマーは、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識物質で標識されていてもよい。プライマーにおける標識物質の標識位置は、その標識物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよく、限定はしないが、通常は伸長反応に寄与しない5’末端部が好ましい。核酸標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素、DIG、蛍光色素、クエンチャー、化学発光物質、ビオチン、又は磁気ビーズ等が挙げられる。これらの核酸標識物質については、次の「（２）プローブ」の項で詳述する。 The primer can contain an additional sequence different from the base sequence of the template nucleic acid on the 5'end side thereof. The additional sequence can be any base sequence as long as it does not cause an interaction such as hybridization with the dengue virus genome, a primer, or a probe described later. For example, a base sequence containing a restriction enzyme site or a new primer binding site can be mentioned. Further, the primer may be labeled with a phosphate group, a sugar and / or a base with a labeling substance. The labeling position of the labeling substance in the primer may be appropriately determined according to the characteristics of the labeling substance and the purpose of use, and is not limited, but usually a 5'end portion that does not contribute to the extension reaction is preferable. As the nucleic acid labeling substance, any substance known in the art can be used. For example, radioisotopes, DIGs, fluorescent dyes, quenchers, chemiluminescent substances, biotin, magnetic beads and the like can be mentioned. These nucleic acid labeling substances will be described in detail in the next section “(2) Probe”.
　前記プライマーセットは、後述する構成を有した1組で足りる。ただし、ネスティッドプライマーのように増幅範囲に目的とする所定の領域を包含する複数のプライマーペアを含んでいてもよい。 The primer set need only be one set having the configuration described later. However, a plurality of primer pairs including a predetermined region of interest may be included in the amplification range, such as a nested primer.
（２）プローブ
　本発明のデングウイルス検出試薬は、少なくとも1種のプローブを含む。本プローブは、前記プライマーセットによって増幅されるデングウイルスゲノム断片（本明細書では、しばしば「DENV増幅断片」と表記する）中に存在する、4種の血清型に特異的な塩基配列に対して、それぞれハイブリダイゼーションでき、かつDENV増幅断片を検出可能なように構成されている。したがって、それぞれの血清型に対応する少なくとも4種のプローブが存在する。本明細書では、デングウイルスの血清型に対応するプローブをしばしば「血清型検出用プローブ」とも表記する。 (2) Probe The dengue virus detection reagent of the present invention contains at least one probe. The probe refers to four serotype-specific nucleotide sequences present in a dengue virus genomic fragment (often referred to herein as a "DENV amplified fragment") amplified by the primer set. They are configured so that they can hybridize and detect DENV amplified fragments. Therefore, there are at least four probes corresponding to each serotype. In the present specification, the probe corresponding to the serotype of dengue virus is often referred to as "serotype detection probe".
　前記血清型検出プローブには、1型検出用プローブとして、配列番号１で示す塩基配列の203位～223位（21塩基）にハイブリダイゼーション可能なプローブ、2型検出用プローブとして、配列番号２で示す塩基配列の199位～222位（24塩基）にハイブリダイゼーション可能なプローブ、3型検出用プローブとして、配列番号３で示す塩基配列の208位～225位（18塩基）にハイブリダイゼーション可能なプローブ、及び4型検出用プローブとして、配列番号４で示す塩基配列の207位～231位（25塩基）にハイブリダイゼーション可能なプローブが挙げられる。 The serum type detection probe includes a probe capable of hybridizing to positions 203 to 223 (21 bases) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a type 1 detection probe, and SEQ ID NO: 2 as a type 2 detection probe. A probe capable of hybridizing to positions 199 to 222 (24 bases) of the indicated base sequence, and a probe capable of hybridizing to positions 208 to 225 (18 bases) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a type 3 detection probe. , And a probe for type 4 detection includes a probe capable of hybridization to positions 207 to 231 (25 bases) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
　それぞれのプローブは、天然型ヌクレオチド及び／又は非天然型ヌクレオチドで構成される。通常は、DNA、又はRNAの天然型ヌクレオチドで構成されている。中でも安定性が高く、合成が容易で低廉なDNAは特に好ましい。また、必要に応じてDNAとRNAの天然型ヌクレオチドを組み合わせたり、一部にLNAやPNAのような非天然型ヌクレオチドを組み合わせることもできる。 Each probe is composed of natural nucleotides and / or non-natural nucleotides. It is usually composed of DNA or natural nucleotides of RNA. Among them, DNA having high stability, easy to synthesize and inexpensive is particularly preferable. In addition, if necessary, natural nucleotides of DNA and RNA can be combined, and some non-natural nucleotides such as LNA and PNA can be combined.
　プローブの塩基長や塩基配列は、各血清型に特異的な前記領域にハイブリダイゼーション可能なように、またTm値が55℃～80℃、好ましくは60℃～75℃の範囲となるように設計され、かつ当該分野の技術常識の範囲内であれば、特に限定しない。一般にプローブの塩基長は、鋳型核酸鎖上の連続する16塩基～40塩基にハイブリダイゼーション可能な塩基長と塩基配列であることが好ましい。 The base length and base sequence of the probe are designed so that they can hybridize to the above-mentioned region specific to each serotype, and the Tm value is in the range of 55 ° C to 80 ° C, preferably 60 ° C to 75 ° C. It is not particularly limited as long as it is within the range of common general technical knowledge in the field. Generally, the base length of the probe is preferably a base length and a base sequence capable of hybridizing to consecutive 16 to 40 bases on the template nucleic acid chain.
　各血清型検出用プローブの具体的な例として、1型検出用プローブには配列番号７で示す塩基配列からなる21塩基のオリゴヌクレオチドを、2型検出用プローブには配列番号８で示す塩基配列からなる24塩基のオリゴヌクレオチドを、3型検出用プローブには配列番号９で示す塩基配列からなる18塩基のオリゴヌクレオチド又は配列番号１０で示す塩基配列からなる21塩基のオリゴヌクレオチドを、そして4型検出用プローブには配列番号１１で示す塩基配列からなる21塩基のオリゴヌクレオチドを、使用すればよい。 As a specific example of each serum type detection probe, the type 1 detection probe has a 21-base oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the type 2 detection probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. A 24-base oligonucleotide consisting of, and a type 3 detection probe containing an 18-base oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or a 21-base oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 and type 4 As the detection probe, a 21-base oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 may be used.
　プローブは、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識物質で標識されていてもよい。プローブにおける標識物質の標識位置は、その標識物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよく、限定はしないが、通常、5’末端部及び／又は3’末端部が好ましい。標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素、DIG、蛍光物質、クエンチャー、化学発光物質、ビオチン、又は磁気ビーズ等が挙げられる。 The probe may be labeled with a phosphate group, sugar and / or base with a labeling substance. The labeling position of the labeling substance in the probe may be appropriately determined according to the characteristics of the labeling substance and the purpose of use, and is not limited, but usually 5'end and / or 3'end is preferable. As the labeling substance, any substance known in the art can be used. For example, radioisotopes, DIGs, fluorescent materials, quenchers, chemiluminescent materials, biotin, magnetic beads and the like can be mentioned.
　前記「放射性同位元素」とは、質量数が異なる同位元素のうち、放射線を放出する元素をいう。例えば、32P、33P、又は35Sが挙げられる。 The "radioactive isotope" refers to an element that emits radiation among isotopes having different mass numbers. For example, 32 P, 33 P, or 35 S.
　前記「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質をいう。例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、ROX、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA、Quasar（登録商標）670、Quasar（登録商標） 705、CAL Fluor（登録商標） Red 610、フルオレサミン若しくはその誘導体、又はローダミン若しくはその誘導体等が挙げられる。ただし、これらに限定はしない。 The "fluorescent substance" refers to a substance having the property of being excited by absorbing excitation light of a specific wavelength and emitting fluorescence when returning to the original ground state. For example, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, Quasar® 670, Quasar® 705, CAL Fluor® Examples thereof include Red 610, fluorescein or a derivative thereof, or rhodamine or a derivative thereof. However, these are not limited.
　前記「クエンチャー」とは、前記蛍光物質の励起エネルギーを吸収し、蛍光を抑制する性質を有する物質をいう。例えば、AMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等が挙げられる。 The "quencher" refers to a substance having a property of absorbing the excitation energy of the fluorescent substance and suppressing fluorescence. For example, AMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 and the like can be mentioned.
　前記「化学発光物質」とは、化学反応によって励起された後、基底状態に戻る際に、差分のエネルギーを光として放出する性質を有する物質をいう。例えば、アクリジニウムエステル等が挙げられる。 The "chemiluminescent substance" refers to a substance having the property of emitting differential energy as light when returning to the ground state after being excited by a chemical reaction. For example, acridinium ester and the like can be mentioned.
　本発明のデングウイルス検出試薬が2種以上のプローブを含む場合、各プローブは、それぞれ異なる標識物質で標識されることが好ましい。これは、標識物質に基づいてプローブの種類を識別できるからである。例えば、1型、2型、3型、及び4型の各検出用プローブを蛍光物質で標識する場合、それぞれ、例えば、FAM、HEX、TAMRA、及びROXのように異なる蛍光物質で標識すればよい。それにより、例えば、FAMが検出されたときは、それが1型検出用プローブに由来するものであることが容易に識別できる。このとき、例えば、1型検出用プローブを2種使用するのであれば、検出目的が同じであるため、両プローブを同一の標識物質で標識することができる。 When the dengue virus detection reagent of the present invention contains two or more kinds of probes, it is preferable that each probe is labeled with a different labeling substance. This is because the type of probe can be identified based on the labeling substance. For example, when labeling each of the type 1, type 2, type 3 and type 4 detection probes with a fluorescent substance, they may be labeled with different fluorescent substances such as FAM, HEX, TAMRA, and ROX, respectively. .. Thereby, for example, when FAM is detected, it can be easily identified that it is derived from the type 1 detection probe. At this time, for example, if two types of Type 1 detection probes are used, both probes can be labeled with the same labeling substance because the detection purpose is the same.
　前記標識物質のヌクレオチドへの標識は公知の方法で行うことができる。
　本発明のデングウイルス検出試薬におけるプローブにおいて、好適な標識は、限定はしないが、蛍光物質とクエンチャーとの組み合わせである。クエンチャーは、その種類によって蛍光の抑制波長範囲が異なるため、蛍光物質とクエンチャーとの組み合わせでは、標識に使用する蛍光物質の蛍光を抑制可能なクエンチャーと組み合わせる。例えば、蛍光物質がFAM、HEX、TET等の場合には、抑制波長範囲が480nm～580nmのBHQ1と、蛍光物質がCy3、Cy5、ROX、TAMRA、Texas等の場合には、抑制波長範囲が550nm～650nmのBHQ2と組み合わせればよい。プローブにおける蛍光物質とクエンチャーの配置は、蛍光物質による蛍光をクエンチャーが抑制できるように両物質を配置すれば、特に限定はしない。例えば、プローブの一方の末端（5’末端又は3’末端）を蛍光物質で標識化し、他方の末端（それぞれ3’末端又は5’末端）をクエンチャーで標識化すればよい。 Labeling of the labeling substance on nucleotides can be performed by a known method.
In the probe in the dengue virus detection reagent of the present invention, a suitable label is, but is not limited to, a combination of a fluorescent substance and a quencher. Since the fluorescence suppression wavelength range of the quencher differs depending on the type, the combination of the fluorescent substance and the quencher is combined with the quencher capable of suppressing the fluorescence of the fluorescent substance used for labeling. For example, when the fluorescent substance is FAM, HEX, TET, etc., the suppression wavelength range is BHQ1 of 480 nm to 580 nm, and when the fluorescent substance is Cy3, Cy5, ROX, TAMRA, Texas, etc., the suppression wavelength range is 550 nm. It may be combined with BHQ2 of ~ 650 nm. The arrangement of the fluorescent substance and the quencher in the probe is not particularly limited as long as both substances are arranged so that the quencher can suppress the fluorescence caused by the fluorescent substance. For example, one end (5'end or 3'end) of the probe may be labeled with a fluorescent substance and the other end (3'end or 5'end, respectively) may be labeled with a quencher.
　本発明のデングウイルス検出試薬は、少なくとも1種のプローブを包含する。プローブが1種類の場合、デングウイルス検出試薬は、そのプローブが検出可能ないずれか1種の血清型のデングウイルスのみを検出することができる血清型特異的なデングウイルス検出試薬となる。より具体的には、1型デングウイルス検出試薬、2型デングウイルス検出試薬、3型デングウイルス検出試薬、又は4型デングウイルス検出試薬のいずれかとなる。この場合、各血清型に特異的なデングウイルス検出試薬を含む容器（チューブ等）を4つ揃え、それぞれの容器に同じ試料を添加して検出を実施することで、デングウイルス感染の有無と共に、感染ウイルスがいずれの血清型かを検出することが可能となる。同様に、検出すべき対象の血清型の種類に応じて、デングウイルス検出試薬に包含される血清型検出用プローブを2種又は3種と増やすことができる。 The dengue virus detection reagent of the present invention includes at least one probe. When there is only one type of probe, the dengue virus detection reagent is a serum type-specific dengue virus detection reagent capable of detecting only one of the serotypes of dengue virus that can be detected by the probe. More specifically, it is either a type 1 dengue virus detection reagent, a type 2 dengue virus detection reagent, a type 3 dengue virus detection reagent, or a type 4 dengue virus detection reagent. In this case, by preparing four containers (tubes, etc.) containing dengue virus detection reagents specific to each serotype and adding the same sample to each container for detection, the presence or absence of dengue virus infection and the infectious virus are detected. It is possible to detect which serotype is. Similarly, the number of serotype detection probes included in the dengue virus detection reagent can be increased to 2 or 3 depending on the type of serotype to be detected.
　本発明のデングウイルス検出試薬の好ましい形態は、4種全ての血清型検出用プローブを包含する場合である。この場合、試料中に含まれ得るデングウイルスの血清型に関係なく、1つの容器で1度の反応によりデングウイルスがいずれの血清型であるかを簡便かつ高い感度で判別することができる。 A preferred form of the dengue virus detection reagent of the present invention is a case where all four types of serotype detection probes are included. In this case, regardless of the serotype of dengue virus that can be contained in the sample, it is possible to easily and highly sensitively determine which serotype of dengue virus is by one reaction in one container.
　なお、本発明のデングウイルス検出試薬において血清型検出用プローブは、それぞれの血清型に対して2種以上存在していてもよい。それ故に、本発明のデングウイルス検出試薬は5種以上であってもよい。さらに、本発明のデングウイルス検出試薬は、前記血清型検出用プローブに加え、後述するIC-プローブを含むことができる。 In the dengue virus detection reagent of the present invention, two or more types of serotype detection probes may be present for each serotype. Therefore, the dengue virus detection reagent of the present invention may be 5 or more kinds. Further, the dengue virus detection reagent of the present invention can include an IC-probe described later in addition to the serotype detection probe.
（３）内部コントロールプライマーセット（ICプライマーセット）
　本発明のデングウイルス検出試薬は、内部コントロールプライマーセット（本明細書では「IC（Internal Control）プライマーセット」と表記し、前記プライマーセットと区別する）を選択的な構成要素として含むことができる。 (3) Internal control primer set (IC primer set)
The dengue virus detection reagent of the present invention can include an internal control primer set (referred to as "IC (Internal Control) primer set" in the present specification to distinguish it from the primer set) as a selective component.
　ICプライマーセットは、試料中に存在する鋳型核酸分子を内部コントロールとして増幅可能なように構成されている。ICプライマーセットは、本発明のデングウイルス検出試薬を核酸増幅反応に供したときに、増幅反応の可否や状態をモニターする場合に、必要に応じて添加される。 The IC primer set is configured so that the template nucleic acid molecule existing in the sample can be amplified as an internal control. The IC primer set is added as necessary when the dengue virus detection reagent of the present invention is subjected to a nucleic acid amplification reaction and the presence or absence and state of the amplification reaction are monitored.
　内部コントロールとなる鋳型核酸分子は、試料中に適当な核酸分子を外部から添加して、それを鋳型核酸分子もよいし、試料中に存在する内在性の核酸分子（遺伝子転写産物等）を鋳型核酸分子とすることもできる。内在性の核酸分子は、ハウスキーピング遺伝子のような恒常的に発現している遺伝子を選択することが好ましい。本発明のデングウイルス検出試薬の場合、好適な内部コントロールとして、限定はしないが、例えば、ヒト血清中に含まれるsirtuin 1遺伝子の転写産物（mRNA）が挙げられる。 The template nucleic acid molecule that serves as an internal control may be a template nucleic acid molecule obtained by adding an appropriate nucleic acid molecule to the sample from the outside, or an endogenous nucleic acid molecule (gene transcript, etc.) existing in the sample may be used as a template. It can also be a nucleic acid molecule. For the endogenous nucleic acid molecule, it is preferable to select a constitutively expressed gene such as a housekeeping gene. In the case of the dengue virus detection reagent of the present invention, suitable internal controls include, but are not limited to, a transcript (mRNA) of the sirtuin 1 gene contained in human serum.
　ICプライマーセットによる増幅断片の塩基長、ICプライマーセットを構成するIC-FwプライマーとIC-Rvプライマーの構造的特徴、構成成分、塩基長、及び塩基配列は、基本的には前記プライマーセット及びそれを構成するFwプライマー及びRvプライマーに準ずる。ICプライマーセットの例として、限定はしないが、配列番号１２で示す塩基配列からなるヒトsirtuin 1遺伝子の568位～664位を増幅可能なプライマーセットが挙げられる。具体的には、IC-Fwプライマーであれば、配列番号１２における568位～591位に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが、またIC-Rvプライマーであれば、配列番号１２における641位～664位に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、IC-Fwプライマーであれば、例えば、配列番号１３で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用すればよい。またIC-Rvプライマーであれば、例えば、配列番号１４で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用すればよい。 The base length of the amplified fragment by the IC primer set, the structural features, components, base length, and base sequence of the IC-Fw primer and IC-Rv primer constituting the IC primer set are basically the primer set and its base sequence. Follow the Fw and Rv primers that make up the above. Examples of the IC primer set include, but are not limited to, a primer set capable of amplifying positions 568 to 664 of the human sirtuin 1 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12. Specifically, if it is an IC-Fw primer, it is an oligonucleotide containing a base sequence corresponding to positions 568 to 591 in SEQ ID NO: 12, and if it is an IC-Rv primer, it is a position 641 to 664 in SEQ ID NO: 12. Examples thereof include oligonucleotides containing a base sequence complementary to the base sequence corresponding to the position. More specifically, if it is an IC-Fw primer, for example, an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 may be used. If it is an IC-Rv primer, for example, an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 may be used.
（４）内部コントロールプローブ（ICプローブ）
　本発明のデングウイルス検出試薬は、内部コントロールプローブ（本明細書では「ICプローブ」と表記し、前記プローブ（血清型検出用プローブ）と区別する）を選択的な構成要素として含むことができる。 (4) Internal control probe (IC probe)
The dengue virus detection reagent of the present invention may include an internal control probe (referred to herein as "IC probe" to distinguish it from the probe (serotype detection probe)) as a selective component.
　ICプローブは、前記ICプライマーセットによって増幅された内部コントロールの増幅断片（本明細書では、しばしば「IC増幅断片」と表記する）にハイブリダイゼーションでき、かつIC増幅断片を検出可能なように構成され、ている。したがって、本プローブは、本発明のデングウイルス検出試薬において、前記ICプライマーセットとセットで使用される。 The IC probe is configured to be able to hybridize to an internal control amplification fragment (often referred to herein as "IC amplification fragment") amplified by the IC primer set and to detect the IC amplification fragment. ,ing. Therefore, the probe is used in combination with the IC primer set in the dengue virus detection reagent of the present invention.
　ICプローブの構造的特徴、構成成分、塩基長、及び塩基配列は、基本的には前記プローブに準ずる。ICプライマーセットの例として、限定はしないが、配列番号１２で示す塩基配列からなるヒトsirtuin 1遺伝子において、開始コドンのアデニンを1位としたときの531位～556位にハイブリダイゼーション可能なプローブが挙げられる。より具体的には、例えば、配列番号１５で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用すればよい。 The structural features, components, base length, and base sequence of the IC probe basically conform to the probe. As an example of the IC primer set, although not limited, in the human sirtuin 1 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, a probe capable of hybridizing to positions 531 to 556 when the start codon adenine is set to position 1 is available. Can be mentioned. More specifically, for example, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 may be used.
（５）その他の構成要素
　本発明のデングウイルス検出試薬は、上述の構成要素の他にも、任意で選択的な構成要素を含むことができる。 (5) Other Components The dengue virus detection reagent of the present invention may optionally include optional components in addition to the above-mentioned components.
　本発明のデングウイルス検出試薬は、核酸増幅工程で使用される。また、本発明の検出対象となる鋳型核酸分子のデングウイルスゲノムはRNAである。したがって、検出方法には、逆転写反応を伴う核酸増幅方法が用いられる。したがって、その他の構成要素としては、例えば、核酸増幅用反応液、逆転写酵素、RNase阻害剤等を含むことができる。 The dengue virus detection reagent of the present invention is used in the nucleic acid amplification step. Further, the dengue virus genome of the template nucleic acid molecule to be detected in the present invention is RNA. Therefore, a nucleic acid amplification method accompanied by a reverse transcription reaction is used as the detection method. Therefore, other components can include, for example, a nucleic acid amplification reaction solution, a reverse transcriptase, an RNase inhibitor, and the like.
　「核酸増幅用反応液」は、PCR等の核酸増幅反応に必要な各種試薬を含む混合溶液である。核酸増幅用反応液の組成は、使用する核酸増幅法によって異なるものの、一般的にはDNAポリメラーゼ、dNTP、Mg2+、及びバッファを含む。ただし、通常、核酸増幅用反応液に含まれ得るプライマーは、前述のプライマーセットやIC-プライマーセットを用いるため、ここでは含まない。核酸増幅用反応液は、逆転写酵素を添加することで、逆転写反応の溶液にもなり得る。DNAポリメラーゼは、限定はしないが、熱耐性DNAポリメラーゼが好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼの他、市販の各種熱耐性DNAポリメラーゼを使用することができる。 The "nucleic acid amplification reaction solution" is a mixed solution containing various reagents necessary for a nucleic acid amplification reaction such as PCR. The composition of the nucleic acid amplification reaction solution generally includes DNA polymerase, dNTP, Mg 2+ , and buffer, although it depends on the nucleic acid amplification method used. However, usually, the primers that can be contained in the nucleic acid amplification reaction solution are not included here because the above-mentioned primer set and IC-primer set are used. The reaction solution for nucleic acid amplification can also be a solution for reverse transcription reaction by adding reverse transcriptase. The DNA polymerase is not limited, but a heat-resistant DNA polymerase is preferable. For example, Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, KOD DNA polymerase, and various commercially available heat-resistant DNA polymerases can be used.
（６）デングウイルス検出試薬の形態
　本発明のデングウイルス検出試薬の形態は、上述の構成要素の全部又は一部が個別に分離され、それらが一つにまとめられたキット又はパッケージの状態であってもよいし、あるいは構成要素を1つの容器（例えば、チューブやプレートウェル）内に全て包含した状態であってもよい。必要に応じて、本発明のデングウイルス検出試薬の使用法を記載したプロトコルや専用の反応容器等を添付することもできる。 (6) Form of dengue virus detection reagent The form of the dengue virus detection reagent of the present invention is in the state of a kit or package in which all or a part of the above-mentioned components are individually separated and they are put together into one. It may be in a state where all the components are contained in one container (for example, a tube or a plate well). If necessary, a protocol describing how to use the dengue virus detection reagent of the present invention, a dedicated reaction vessel, or the like can be attached.
　本発明のデングウイルス検出試薬の状態は、プライマーセット及びプローブ、そして必要に応じて追加される選択的構成要素を含んだ液体状態であってもよいし、あるいは液体が蒸発除去された乾燥固体の状態であってもよい。即時性を要する場合には液体状態が好ましく、安定性や長期保存を要する場合は固体状態が好ましい。液体状態の場合、少なくとも-20℃以下、好ましくは-80℃等のディープフリーザー内で保存することが望ましい。また、固体状態の場合、使用前にバッファや各種酵素を追加して、核酸反応用の混合溶液を調製する必要がある。用途に合わせて適宜選択することができる。 The state of the dengue virus detection reagent of the present invention may be a liquid state containing a primer set and a probe and optional components added as needed, or a dry solid state in which the liquid is evaporated and removed. It may be. The liquid state is preferable when immediacy is required, and the solid state is preferable when stability and long-term storage are required. In the liquid state, it is desirable to store in a deep freezer at least -20 ° C or lower, preferably -80 ° C or the like. In the solid state, it is necessary to add a buffer and various enzymes before use to prepare a mixed solution for nucleic acid reaction. It can be appropriately selected according to the application.
２．デングウイルス血清型判別方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、デングウイルス血清型判別方法である。本発明は、前記第１態様に記載のデングウイルス検出試薬を用いる。本発明のデングウイルス血清型判別方法によれば、試料中のデングウイルスの有無、及びその血清型を簡便かつ高い感度で判別することができ、それによって試料検体である被験者のデングウイルス感染の有無を判定することが可能となる。 2. 2. Dengue virus serotyping method 2-1. Overview A second aspect of the present invention is a dengue virus serotyping method. The present invention uses the dengue virus detection reagent described in the first aspect. According to the dengue virus serotyping method of the present invention, the presence or absence of dengue virus in a sample and the serotype thereof can be determined easily and with high sensitivity, thereby determining the presence or absence of dengue virus infection in a subject as a sample sample. It becomes possible.
２－２．方法
　本発明のデングウイルス血清型判別方法は、核酸増幅工程、及び血清型判別工程を必須工程として含み、核酸抽出工程を選択的工程として含む。以下、各工程について、具体的に説明をする。 2-2. Method The dengue virus serotyping method of the present invention includes a nucleic acid amplification step and a serotyping step as essential steps, and includes a nucleic acid extraction step as a selective step. Hereinafter, each step will be specifically described.
（１）核酸抽出工程
　「核酸抽出工程」は、被験者から採取された試料より核酸、特にRNAを抽出する工程で、本態様のデングウイルス血清型判別方法において、後述の核酸増幅工程に先立ち行われる選択的工程である。 (1) Nucleic Acid Extraction Step The "nucleic acid extraction step" is a step of extracting nucleic acid, particularly RNA, from a sample collected from a subject, and is a selection performed prior to the nucleic acid amplification step described later in the dengue virus serotyping method of this embodiment. It is a target process.
　本工程で使用する試料は、限定はしないが、採取の時期を選ばずに容易に入手可能な点、被験者への侵襲性が低い点、液体のため操作が容易な点、及びデングウイルスの主な感染細胞が単球、マクロファージ等である点を勘案した場合、血液が最も好ましい。採取の簡便性から末梢血は特に好適である。 The sample used in this step is not limited, but it can be easily obtained at any time of collection, it is less invasive to the subject, it is easy to operate because it is a liquid, and the main components of dengue virus. Considering that the infected cells are monocytes, macrophages and the like, blood is most preferable. Peripheral blood is particularly suitable because of its ease of collection.
　試料が血液の場合、血液は公知の方法に従って採取されたものであればよく、特に限定はしない。例えば、静脈等から注射をして直接採血された血液の他、採取された全血にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した血液、血漿若しくは血清として分離された血液、一旦冷蔵若しくは冷凍で保存された血液等、いずれの血液も試料として使用することができる。 When the sample is blood, the blood may be collected according to a known method and is not particularly limited. For example, in addition to blood directly collected by injection from a vein or the like, blood that has been subjected to anticoagulant treatment by adding heparin or the like to the collected whole blood, blood that has been separated as plasma or serum, and once refrigerated or frozen. Any blood, such as blood stored in, can be used as a sample.
　使用する試料の容量は、血液であれば10μL～5mL、好ましくは50μL～3mL、又は100μL～1mLあればよい。採取された血液が全血の場合は、血清又は血漿に調製することができる。血清を調製する場合には、全血を室温で20分間～１時間程度放置した後、氷冷し、4℃にて2500rpm～4000rpmで10分～20分間遠心して、その上清を得ればよい。また、血漿を調製する場合には、全血を、例えば、4℃にて5000×gで15分間遠心すればよい。 The volume of the sample to be used may be 10 μL to 5 mL, preferably 50 μL to 3 mL, or 100 μL to 1 mL for blood. If the collected blood is whole blood, it can be prepared into serum or plasma. When preparing serum, leave the whole blood at room temperature for 20 minutes to 1 hour, cool it on ice, and centrifuge it at 2500 rpm to 4000 rpm for 10 minutes to 20 minutes at 4 ° C to obtain the supernatant. Good. In addition, when preparing plasma, whole blood may be centrifuged at, for example, at 4 ° C. at 5000 × g for 15 minutes.
　血液（全血、血漿、血清及びその組み合わせ）から、核酸を抽出するには、当該分野で公知の核酸抽出方法を用いればよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の核酸抽出法（RNA抽出方法）に従って抽出することができる。抽出するRNAは総RNA（Total RNA）でよい。近年では各ライフサイエンスメーカーから優れた核酸抽出キットが市販されており、それらのキットを利用することもできる。キットを利用する場合には、具体的な抽出方法については、添付のプロトコルに従って又は準じて行なえばよい。 To extract nucleic acid from blood (whole blood, plasma, serum and combinations thereof), a nucleic acid extraction method known in the art may be used. For example, extract according to the nucleic acid extraction method (RNA extraction method) described in Green, MR and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Can be done. The RNA to be extracted may be total RNA. In recent years, excellent nucleic acid extraction kits have been put on the market by each life science maker, and these kits can also be used. When using the kit, the specific extraction method may be performed according to or according to the attached protocol.
（２）核酸増幅工程
　「核酸増幅工程」は、第１態様のデングウイルス検出試薬及び被験者由来の核酸試料を用いて、標的核酸の特定の領域を増幅する工程である。 (2) Nucleic Acid Amplification Step The "nucleic acid amplification step" is a step of amplifying a specific region of a target nucleic acid by using the dengue virus detection reagent of the first aspect and a nucleic acid sample derived from a subject.
　本工程で使用する「被験者由来の核酸試料」とは、デングウイルスが存在し得る試料から抽出された核酸である。例えば、前記核酸抽出工程で抽出された核酸が好適である。 The "subject-derived nucleic acid sample" used in this step is a nucleic acid extracted from a sample in which dengue virus may be present. For example, the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is suitable.
　本態様において「標的核酸」とは、検出対象のデングウイルスゲノムである。
　本態様において「特定の領域」とは、第１態様のデングウイルス検出試薬に含まれるプライマーペアによって増幅されるデングウイルスゲノム上の一部領域である。 In this aspect, the "target nucleic acid" is the dengue virus genome to be detected.
In this aspect, the "specific region" is a partial region on the dengue virus genome amplified by the primer pair contained in the dengue virus detection reagent of the first aspect.
　前記標的核酸の特定の領域を増幅する方法は、核酸増幅法によって達成される。核酸増幅法は、Fw/Rvプライマーに挟まれた標的核酸上の特定の領域を核酸ポリメラーゼによる核酸伸長反応を繰り返すことで増幅させる方法をいう。例えば、DNAポリメラーゼを使用するPCR法、ICAN法、LAMP（登録商標）法、RNAポリメラーゼ及びDNAポリメラーゼを使用するNASBA法が挙げられる。好ましくはPCR法である。これは、PCR法が当該分野で最も広く利用され、様々な応用技術が開発されている方法であり、また最適化された試薬、キット、及び反応機器等が充実しているためである。 The method of amplifying a specific region of the target nucleic acid is achieved by the nucleic acid amplification method. The nucleic acid amplification method refers to a method of amplifying a specific region on a target nucleic acid sandwiched between Fw / Rv primers by repeating a nucleic acid extension reaction with a nucleic acid polymerase. For example, the PCR method using DNA polymerase, the ICAN method, the LAMP® method, the NASBA method using RNA polymerase and DNA polymerase can be mentioned. The PCR method is preferable. This is because the PCR method is the most widely used method in the field, various applied techniques have been developed, and optimized reagents, kits, reaction instruments, and the like are available.
　本工程で使用する標的核酸はデングウイルスゲノムである。試料から直接抽出した核酸試料中に存在するデングウイルスゲノムは一本鎖RNAであることから、核酸増幅法にPCR法を採用する場合、鋳型はDNAである必要がある。したがって、通常は、逆転写反応（RT反応）を介したRT-PCR法が採用される。 The target nucleic acid used in this step is the dengue virus genome. Since the dengue virus genome existing in the nucleic acid sample directly extracted from the sample is a single-stranded RNA, the template needs to be DNA when the PCR method is adopted as the nucleic acid amplification method. Therefore, the RT-PCR method via a reverse transcription reaction (RT reaction) is usually adopted.
　本発明のデングウイルス血清型判別方法では、後述の血清型判別工程において、本工程で増幅される増幅断片に基づいていずれの血清型であるか判定がなされる。この判定方法は、各血清型の増幅断片の量により達成され得る。したがって、定量的核酸増幅法を用いて、増幅断片を定量的に測定してもよい。定量的核酸増幅法は、限定はしないが、例えば、リアルタイムPCR法（リアルタイムRT-PCR法）が便利である。 In the dengue virus serotyping method of the present invention, in the serum serotyping step described later, which serotype is determined based on the amplified fragment amplified in this step. This determination method can be achieved by the amount of amplified fragments of each serotype. Therefore, the amplified fragment may be quantitatively measured by using the quantitative nucleic acid amplification method. The quantitative nucleic acid amplification method is not limited, but for example, a real-time PCR method (real-time RT-PCR method) is convenient.
　リアルタイムPCRの反応条件は、一般に、公知のPCR法を基礎として、増幅する核酸断片の塩基長及び鋳型用核酸の量、並びに使用するプライマーの塩基長及びTm値、使用する核酸ポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等により変動するため、これらの条件を勘案し適宜定めればよい。一例として、通常、変性反応を94～95℃で5秒～5分間、アニーリング反応を50～70℃で10秒～1分間、伸長反応を68～72℃で30秒～3分間行い、これを１サイクルとして15～40サイクルほど繰り返し、最後に68～72℃で30秒～10分間の伸長反応を行うことができる。市販のPCRキットを使用する場合には、原則としてキットに添付のプロトコルに従って行えばよい。 The reaction conditions for real-time PCR are generally based on known PCR methods, including the base length of the nucleic acid fragment to be amplified and the amount of nucleic acid for the template, the base length and Tm value of the primer used, and the optimum reaction of the nucleic acid polymerase used. Since it varies depending on the temperature, optimum pH, etc., it may be determined as appropriate in consideration of these conditions. As an example, the degeneration reaction is usually carried out at 94 to 95 ° C. for 5 seconds to 5 minutes, the annealing reaction is carried out at 50 to 70 ° C. for 10 seconds to 1 minute, and the extension reaction is carried out at 68 to 72 ° C. for 30 seconds to 3 minutes. One cycle can be repeated for about 15 to 40 cycles, and finally the elongation reaction can be carried out at 68 to 72 ° C. for 30 seconds to 10 minutes. When using a commercially available PCR kit, in principle, the protocol attached to the kit may be followed.
　リアルタイムPCR法では、通常、核酸増幅反応の過程で増幅産物が蛍光を発する反応系が利用される。それ故、蛍光検出装置の備わったサーマルサイクラーを用いて核酸増幅反応を行うことが好ましい。リアルタイムPCR法であれば、反応中の産物の量をサンプリングすることなくリアルタイムでモニターでき、その結果をコンピュータで回帰分析することができる点で優れている。増幅産物を標識する方法としては、例えば、TaqMan（登録商標）PCR法のような蛍光標識したプローブを用いる方法、又は二本鎖DNAに特異的に結合する試薬を用いる方法とがある。TaqMan PCR法は、一方の末端部がクエンチャーで、また他方の末端部が蛍光物質で、それぞれ修飾されたプローブを用いる。通常は、プローブ上でクエンチャーが蛍光物質の蛍光を抑制しているが、PCRにおける核酸伸長反応で、Taqポリメラーゼのもつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により当該プローブが分解され、それによってクエンチャー物質の抑制が解除されるため蛍光を発するようになる。その蛍光量は、増幅産物の量を反映する。 In the real-time PCR method, a reaction system in which the amplification product fluoresces in the process of nucleic acid amplification reaction is usually used. Therefore, it is preferable to carry out the nucleic acid amplification reaction using a thermal cycler equipped with a fluorescence detection device. The real-time PCR method is superior in that the amount of product in the reaction can be monitored in real time without sampling, and the result can be regression-analyzed by a computer. Examples of the method for labeling the amplification product include a method using a fluorescently labeled probe such as the TaqMan (registered trademark) PCR method, and a method using a reagent that specifically binds to double-stranded DNA. The TaqMan PCR method uses a probe modified with one end being a quencher and the other end being a fluorescent substance. Normally, the quencher suppresses the fluorescence of fluorescent substances on the probe, but in the nucleic acid extension reaction in PCR, the probe is degraded by the 5'→ 3'exonuclease activity of Taq polymerase, which causes the quencher. Since the suppression of the substance is released, it becomes fluorescent. The amount of fluorescence reflects the amount of amplification product.
（３）血清型判別工程
　「血清型判別工程」は、前記核酸増幅工程で増幅された増幅断片に基づいてデングウイルスの血清型を判別する工程である。 (3) Serotyping Step The “serotyping step” is a step of discriminating the serotype of dengue virus based on the amplified fragment amplified in the nucleic acid amplification step.
　本工程で「増幅断片に基づいて」とは、増幅断片の有無、及び／又は量に基づくことをいう。本発明のデングウイルス血清型判別方法では、第1態様のデングウイルス検出試薬を使用する。この試薬に含まれるプライマーセットは、全ての血清型の所定の領域を増幅可能なため、試料中にデングウイルスが存在する限り、いずれの血清型であっても増幅産物が生じ得る。 In this step, "based on the amplified fragment" means based on the presence / absence and / or amount of the amplified fragment. In the dengue virus serotyping method of the present invention, the dengue virus detection reagent of the first aspect is used. Since the primer set contained in this reagent can amplify a predetermined region of all serotypes, an amplification product can be produced in any serotype as long as dengue virus is present in the sample.
　したがって、プライマーセットに由来する増幅産物が生じた場合には、試料提供の被験者はデングウイルスに感染していると判定できる。このとき、増幅断片がいずれの血清型由来であるかは、血清型検出用プローブにより判別できる。例えば、リアルタイムPCR法による核酸増幅工程において増幅反応に伴い1型検出用プローブに特異的な標識蛍光強度が増加した場合、増幅断片は1型由来であり、試料提供の被験者は1型デングウイルスに感染していると判定できる。各血清型検出用プローブをそれぞれ異なる標識物質で標識化しておけば、単一の容器内で標的核酸の増幅を行った場合でも、生じた蛍光の種類により、いずれの血清型検出用プローブ由来であるかを識別でき、それによりどの血清型が増幅したかを容易に判別できる。 Therefore, when an amplification product derived from the primer set is generated, it can be determined that the subject who provided the sample is infected with dengue virus. At this time, which serotype the amplified fragment is derived from can be determined by a serotype detection probe. For example, in the nucleic acid amplification step by the real-time PCR method, when the labeled fluorescence intensity specific to the type 1 detection probe increases with the amplification reaction, the amplified fragment is derived from type 1 and the sample-provided subject is infected with type 1 dengue virus. It can be determined that it is. If each serotype detection probe is labeled with a different labeling substance, even if the target nucleic acid is amplified in a single container, it can be derived from any serotype detection probe depending on the type of fluorescence generated. The presence can be identified, which makes it easy to determine which serotype is amplified.
　逆に、その増幅産物が生じなかった場合、IC-プライマーセットに由来する増幅産物が生じていれば、試料提供の被験者はデングウイルスに感染していないと判定できる。 On the contrary, when the amplification product is not produced, if the amplification product derived from the IC-primer set is generated, it can be determined that the subject who provided the sample is not infected with dengue virus.
≪実施例１≫
（目的）
　本発明のデングウイルス検出試薬を用いたデングウイルスの血清型判別方法により、試料中のデングウイルスを検出すると共に、その血清型を実際に判別できることを検証する。 << Example 1 >>
(Purpose)
The dengue virus serotyping method using the dengue virus detection reagent of the present invention detects dengue virus in a sample and verifies that the serotype can be actually discriminated.
（材料及び方法）
（１）核酸抽出
　各血清型のデングウイルスに感染した、それぞれ8名の被験者から、EDTAを用いて採取された5mLの全血を、4℃にて16時間放置した。その後、1000×gで4℃にて30分間遠心分離を行い、上清を血清として得た。得られた血清200μLから市販の核酸抽出キット（magLEAD 12gC；プレシジョン・システム・サイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従い総核酸を抽出精製した。 (Materials and methods)
(1) Nucleic acid extraction 5 mL of whole blood collected using EDTA from each of 8 subjects infected with each serotype of dengue virus was left at 4 ° C. for 16 hours. Then, the mixture was centrifuged at 1000 × g at 4 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was obtained as serum. Total nucleic acid was extracted and purified from 200 μL of the obtained serum using a commercially available nucleic acid extraction kit (magLEAD 12 gC; Precision System Science, Inc.) according to the attached protocol.
（２）RT-PCR溶液の調製
　市販のリアルタイムPCR用キット（SensiFASTTM Probe No-ROX One-Step Kit；bioline社）を用いて、表１に示す試薬を混合し、RT-PCR溶液を調製した。 (2) Preparation of RT-PCR solution Using a commercially available real-time PCR kit (SensiFAST TM Probe No-ROX One-Step Kit; bioline), the reagents shown in Table 1 were mixed to prepare an RT-PCR solution. ..
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記プライマー混合液に含まれる各種プライマーの塩基配列を表２に示す。 Table 2 shows the base sequences of various primers contained in the above primer mixture.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記プローブ混合液に含まれる各種プローブの塩基配列を表３に示す。 Table 3 shows the base sequences of various probes contained in the above probe mixture.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 * CFR610: CAL Fluor Red 610; ** Q670: *** Quasar 670; Q705: Quasar 705
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 * CFR610: CAL Fluor Red 610; ** Q670: *** Quasar 670; Q705: Quasar 705
（３）リアルタイムRT－PCR
　市販のサーマルサイクラー（CFX-96 touchリアルタイムPCR解析システム；Bio-rad社）にRT-PCRの反応条件として[45℃, 10min]×1、[95℃, 2min]×1、[95℃, 10sec→ 57℃, 45sec]×45をプログラムし、リアルタイムPCRを行い、Ct値を算出した。デングウイルス検出試薬の対照には、abTESTM DEN 4 qPCR I Kit（AIT biotech社）（本明細書では、「対照試薬」と表記する）を用いた。abTESTMDEN 4 qPCR I Kitは、リアルタイムPCR法を利用して、デングウイルス血清型の1型、2型、3型、及び4型を単一の反応チューブで識別可能な市販のデングウイルス検出用PCR試薬である。 (3) Real-time RT-PCR
[45 ℃, 10min] × 1, [95 ℃, 2min] × 1, [95 ℃, 10sec] as reaction conditions for RT-PCR on a commercially available thermal cycler (CFX-96 touch real-time PCR analysis system; Bio-rad) → 57 ℃, 45sec] × 45 was programmed, real-time PCR was performed, and the Ct value was calculated. As a control of the dengue virus detection reagent, abTES TM DEN 4 qPCR I Kit (AIT biotech) (referred to as “control reagent” in the present specification) was used. The abTES TM DEN 4 qPCR I Kit is a commercially available PCR reagent for dengue virus detection that can identify dengue virus serotypes 1, 2, 3, and 4 in a single reaction tube using real-time PCR. Is.
（結果）
　図２に対照試薬とのCt値を比較したΔCtを示す。図２からも明らかなように、本発明のデングウイルス検出試薬では、全ての血清型において対照試薬よりもCt値が小さい値となった。この結果は、4種の血清型検出用プローブを含む本発明のデングウイルス検出試薬であれば、単一の反応チューブで全てのデングウイルスの血清型を判別でき、また対照試薬よりも高い検出感度を有することが示された。 (result)
FIG. 2 shows ΔCt comparing the Ct values with the control reagent. As is clear from FIG. 2, in the dengue virus detection reagent of the present invention, the Ct value was smaller than that of the control reagent in all serotypes. This result shows that the dengue virus detection reagent of the present invention containing four types of serotype detection probes can discriminate the serotypes of all dengue viruses in a single reaction tube, and has higher detection sensitivity than the control reagent. Was shown.
≪実施例２≫
（目的）
　本発明のデングウイルス検出試薬が試料中のデングウイルスの濃度に依存せず血清型を判別できることを検証する。 << Example 2 >>
(Purpose)
It is verified that the dengue virus detection reagent of the present invention can discriminate the serotype independently of the concentration of dengue virus in the sample.
（材料及び方法）
　低濃度（Ct＜30）、中濃度（Ct＝20～30)、及び高濃度(Ct＜20)の各血清型のデングウイルスに感染したヒト血清を試料とし、本発明のデングウイルス検出試薬と市販のデングウイルス検出用PCR試薬（Reference: SimplexaTMDengue；FOCUS Diagnostics社)を対照試薬として用いて、試料中のデングウイルスの検出を行った。基本操作は、実施例１に準じて実施し、リアルタイムPCRにより算出されたそれぞれのCt値を比較した。 (Materials and methods)
Using human sera infected with dengue virus of each serotype of low concentration (Ct <30), medium concentration (Ct = 20 to 30), and high concentration (Ct <20) as a sample, the dengue virus detection reagent of the present invention and commercially available A PCR reagent for dengue virus detection (Reference: Simplexa TM Dengue; FOCUS Diagnostics) was used as a control reagent to detect dengue virus in the sample. The basic operation was carried out according to Example 1, and the Ct values calculated by real-time PCR were compared.
（結果）
　図３に結果を示す。本発明のデングウイルス検出試薬は、試料中のデングウイルス濃度が低濃度、中濃度、及び高濃度のいずれの場合であっても単一の反応チューブで全てのデングウイルスの血清型を判別できることが示された。また、3型以外は対照試薬よりもCt値が小さい値となり、検出感度が高いことが示された。 (result)
The results are shown in FIG. It has been shown that the dengue virus detection reagent of the present invention can discriminate serotypes of all dengue viruses in a single reaction tube regardless of whether the dengue virus concentration in the sample is low, medium, or high. .. In addition, the Ct value was smaller than that of the control reagent except for type 3, indicating that the detection sensitivity was high.
≪実施例３≫
（目的）
　市販のデングウイルスパネル検体を本発明のデングウイルスの血清型判別方法の試料に用いて、本発明で判別される血清型の結果が、パネル検体で提示される血清型と一致するかを検証する。 << Example 3 >>
(Purpose)
A commercially available dengue virus panel sample is used as a sample for the dengue virus serotyping method of the present invention to verify whether the serotype results determined in the present invention match the serotype presented in the panel sample.
（材料及び方法）
　デングウイルスのパネル検体(標準検体）には、QCMD社のQCMD 2017 Dengue virus RNA EQA Programme、及びQCMD 2018 Dengue virus RNA EQA Programmeを用いた。その他の基本操作については、実施例１に準じて実施し、リアルタイムPCRにより算出されたCt値から、各パネル検体の血清型を判定した。 (Materials and methods)
As the panel sample (standard sample) of dengue virus, QCMD 2017 Dengue virus RNA EQA Program and QCMD 2018 Dengue virus RNA EQA Program of QCMD were used. Other basic operations were carried out according to Example 1, and the serotype of each panel sample was determined from the Ct value calculated by real-time PCR.
（結果）
　表４及び表５にQCMD社が公開する各パネル検体の血清型の結果を含む情報、及び本発明のデングウイルス血清型判別方法の判定結果を示す。表４は、QCMD 2017 Dengue virus RNA EQA Programmeのパネル検体を用いた結果であり、表５は、QCMD 2018 Dengue virus RNA EQA Programmeのパネル検体を用いた結果である。 (result)
Tables 4 and 5 show information including the serotype results of each panel sample published by QCMD, and the determination results of the dengue virus serotype determination method of the present invention. Table 4 shows the results using the panel sample of the QCMD 2017 Dengue virus RNA EQA Program, and Table 5 shows the result using the panel sample of the QCMD 2018 Dengue virus RNA EQA Program.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表中、「-」は、いずれのデングウイルスも検出できなかったことを示す。また、「DEN1」、「DEN2」、「DEN3」、「DEN4」はそれぞれ1型、2型、3型、及び4型を示す。 In the table, "-" indicates that neither dengue virus could be detected. In addition, "DEN1", "DEN2", "DEN3", and "DEN4" indicate type 1, type 2, type 3, and type 4, respectively.
　表中、「Sample Status」における「Core」は、科学的情報、臨床的関連、最新の文献、及び専門的臨床ガイドラインに基づいて専門家（評価施設）によって検出されなければいけないレベルを意味し、また「Educational」は、試験的に評価されるレベルを意味する。つまり、サンプル状態はEducationalの方が検出難易度は高く、施設によっては検出できないこともある。したがって、Educationalの結果が仮に陰性であっても評価施設のレベルには影響しない。 In the table, "Core" in "Sample Status" means the level that must be detected by a specialist (evaluation facility) based on scientific information, clinical relevance, the latest literature, and professional clinical guidelines. “Educational” means a level that is evaluated on a trial basis. In other words, the sample state is more difficult to detect in Educational, and it may not be possible to detect it depending on the facility. Therefore, even if the Educational result is negative, it does not affect the level of the evaluation facility.
　表４及び表５に記載の結果からパネル検体で確定しているデングウイルスの血清型と本発明のデングウイルスの血清型判別方法で明らかになった血清型は完全に一致した。表４及び表５は、共に検出難易度が高いEducationalサンプルであっても、その血清型を正確に判別できている。これらの結果から、本発明のデングウイルスの血清型判別方法によれば、非常に高い特異度及び検出感度を有し、施設によっては検出ができない検出難易度の高いサンプルであっても、高い精度で正確な判別ができることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。 From the results shown in Tables 4 and 5, the serotype of dengue virus confirmed in the panel sample and the serotype revealed by the method for discriminating the serotype of dengue virus of the present invention completely matched. In Tables 4 and 5, even if the Educational sample has a high degree of difficulty in detection, the serotype can be accurately determined. From these results, according to the dengue virus serotyping method of the present invention, even a sample having extremely high specificity and detection sensitivity and difficult to detect depending on the facility can be detected with high accuracy. It was shown that accurate discrimination is possible.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (12)

  1. 　プライマーセット及び少なくとも1つのプローブを含むデングウイルス検出試薬であって、
    　前記プライマーセットは配列番号１で示す塩基配列において129位～285位を含む250塩基以下の領域を増幅可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成され、かつ
    　前記プローブは配列番号１で示す塩基配列の203位～223位、配列番号２で示す塩基配列の199位～222位、配列番号３で示す塩基配列の208位～225位、及び配列番号４で示す塩基配列の207位～231位に相補的な塩基配列にハイブリダイゼーション可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されている
    前記試薬。     A dengue virus detection reagent containing a primer set and at least one probe.
    The primer set is composed of an oligonucleotide consisting of a base sequence capable of amplifying a region of 250 bases or less including positions 129 to 285 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the probe has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Complemented to positions 203 to 223, positions 199 to 222 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 208 to 225 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and positions 207 to 231 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. The reagent composed of an oligonucleotide having a base sequence capable of being hybridized to a specific base sequence.
  2. 　前記プライマーセットのフォワードプライマーは配列番号１で示す塩基配列の129位～146位の塩基配列を含み、リバースプライマーは配列番号１で示す塩基配列の276位～285位に相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載のデングウイルス検出試薬。 The forward primer of the primer set contains the base sequences of positions 129 to 146 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the reverse primer contains a base sequence complementary to the base sequences of positions 276 to 285 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. , The dengue virus detection reagent according to claim 1.
  3. 　前記フォワードプライマーが配列番号５で示す塩基配列からなり、前記リバースプライマーが配列番号６で示す塩基配列からなる、請求項２に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to claim 2, wherein the forward primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the reverse primer consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  4. 　前記プローブが配列番号７～１１で示すいずれか一以上の塩基配列からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to any one of claims 1 to 3, wherein the probe comprises any one or more base sequences shown in SEQ ID NOs: 7 to 11.
  5. 　内部コントロール用のプライマーペア及びプローブをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to any one of claims 1 to 4, further comprising a primer pair and a probe for internal control.
  6. 　前記内部コントロールがsirtuin1遺伝子である、請求項５に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to claim 5, wherein the internal control is the sirtuin1 gene.
  7. 　前記内部コントロール用プライマーペアのフォワードプライマーが配列番号１３で示す塩基配列からなり、リバースプライマーが配列番号１４で示す塩基配列からなる、請求項６に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to claim 6, wherein the forward primer of the primer pair for internal control comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the reverse primer consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  8. 　前記内部コントロール用プローブが配列番号１５で示す塩基配列からなる、請求項７に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to claim 7, wherein the internal control probe comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  9. 　前記各プローブがそれぞれ異なる標識物質で標識されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のデングウイルス検出試薬。 The dengue virus detection reagent according to any one of claims 1 to 8, wherein each probe is labeled with a different labeling substance.
  10. 　デングウイルスの血清型判別方法であって、
    　請求項１～９のいずれか一項に記載のデングウイルス試薬及び被験者由来の核酸試料を用いて、標的核酸の特定の領域を増幅する核酸増幅工程、及び
    　前記核酸増幅工程で増幅される各血清型の増幅断片に基づいてデングウイルスの血清型を判別する血清型判別工程
    を含む前記方法。     A method for serotyping dengue virus
    A nucleic acid amplification step of amplifying a specific region of a target nucleic acid using the dengue virus reagent according to any one of claims 1 to 9 and a nucleic acid sample derived from a subject, and each serotype amplified in the nucleic acid amplification step. The method comprising a serotyping step of determining the serotype of dengue virus based on an amplified fragment of.
  11. 　前記各血清型の増幅断片を定量的に測定する、請求項１０に記載のデングウイルスの血清型判別方法。 The method for determining the serotype of dengue virus according to claim 10, wherein the amplified fragment of each of the serotypes is quantitatively measured.
  12. 　請求項９に記載のデングウイルス試薬を用いて、単一の容器内で標的核酸の増幅を行う、請求項１０又は１１に記載のデングウイルスの血清型判別方法。 The method for determining the serotype of dengue virus according to claim 10 or 11, wherein the target nucleic acid is amplified in a single container using the dengue virus reagent according to claim 9.
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