JP6826983B2 - 胚移植 - Google Patents

Description

本発明は、授精または胚の移植の前に免疫寛容性の子宮環境を提供することによって、雌における胚移植の成功率および妊娠の成功率を改善する方法およびそのための組成物に関する。本発明の方法は、例えば移植した胚、精子、または他の同種移植組織に対して、子宮をより受容的にするまたはより敵対的でなくする（ｌｅｓｓ ｈｏｓｔｉｌｅ）ために使用される。本発明は、とりわけ、本発明の方法において使用するための組成物および製剤も含む。

子宮環境は、敵対的／非受容的である場合、ヒトおよび類似の動物における良質胚の移植率が低い原因となる可能性がある。また、プライミングが不十分な子宮環境も、移植の失敗および自然流産の観点から、生殖障害の多くの症例に関与している可能性があると考えられている。同様に、子宮プライミングの不良は、ヒトでは適切な胎盤発達を妨げることにより子癇前症および胎児発育遅延などの妊娠合併症の原因となることが認識されている。

遺伝子的に改変されたまたは組み換えられた動物は、新規の遺伝子および薬物療法をインビボで試験するための価値あるモデルを提供し、これは１０年間で動物実験数が増加している主な理由である。英国では、２０１１年には１９９５年と比較して４倍を超える数の遺伝子組み換え動物を使用した科学的処置が実施された。今日では、遺伝子組み換え動物の使用は、動物に対する科学的処置全体の５０％超を占めている。最大の使用カテゴリーは（遺伝子組み換え動物を生み出すための）繁殖であり、げっ歯類は英国で２０１２年だけでほぼ１８０万回の処置を占めており、この数は年々増加する背景傾向にある。げっ歯類における胚移植は、トランスジェニックアプローチの開発、特定株の再誘導を支え、遠く離れた動物系統間の移植を容易にする。典型的には、胚移植にはレシピエントの雌における偽妊娠の誘導が必要である。この現象は胚を移植するために子宮を整えるものであるが、遺伝子組み換え胚の移植の成功率は、偽妊娠の誘導にもかかわらず、比較的低いままである。

マウスは自然排卵動物であり、雌がＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃから入手可能なＴ１４５Ｈ−Ｒｅ株（染色体転座により生殖不能である）などの遺伝子的に生殖不能の雄または精管切除された雄と交尾が行われる発情期の後に、偽妊娠に至り得る。いずれの組の雄も、生殖機能を有する精子を欠いた精漿を射精する。しかしながら、遺伝子的に生殖不能のマウスおよび精管切除されたマウスはいずれも比較的高価である。精管切除された雄の場合、生殖不能性が１００％有効であるとは保証できず、個々の雄の検査が必要であり、一方、遺伝子的に生殖不能の雄の生産は望ましくない余剰の雌を生じることになる。

あるいは、偽妊娠は、例えば振動刻印器具（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｅｎｇｒａｖｉｎｇ ｔｏｏｌ）により、人工的な機械的刺激で交尾させることによって達成される正常な膣刺激の模倣により誘導することができる（Ｋｅｎｎｅｙら；Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１９７７、４９、３０５〜３０９）。挿入の回数と速さが繁殖成功に重要な影響を及ぼしていることが分かった（Ｄｉａｍｏｎｄ；Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７０、１６９、４、９９５〜９９７）。このアプローチはラットおよびマウスである程度成功しているが、機械的刺激はゴールデンハムスターの偽妊娠の誘導には効果がなかった（Ｄｉａｍｏｎｄら Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１９６８、１７、１６５〜１６８）。雌が生殖力のない雄と交尾するか機械的に刺激されると、胚なしで黄体が維持され、偽妊娠に至る。雌は偽妊娠状態で乳腺を発達させ、乳汁分泌し、巣を作ることになる。実験用試験動物の偽妊娠状態を誘導する方法を改善する必要がある。

数多くのげっ歯類における胚移植のプロトコルは比較的よく確立されているが、その最適化が不十分であるということは動物の大幅な損失があることを意味し、世界中の動物部門で多くの財政的および倫理的問題を引き起こしている。先行技術の標準的なアプローチは、現在では、機械的刺激よりもむしろレシピエントの雌を精管切除された雄と交尾させて偽妊娠を誘導することに依存しているが、この場合、交尾行動および母体の生殖器系の精液曝露により、神経内分泌、ならびに、サイトカインの複雑なカスケードおよびプロスタグランジン介在事象が関与する（主に子宮に対する）局所的な炎症応答が誘発され、これらは子宮内で免疫寛容環境を作り出すことに向けられているため、着床前の胚発生および／または胚盤胞の着床ならびに妊娠の確立に有利となる。受精がない場合でさえ黄体発達およびプロゲステロン産生が支持され、移植された胚に対して子宮が最大１０〜１３日間受容性となるように母体の生理機能が調整される。この技術は、通常の（凍結保存株の再生／再誘導）または遺伝子組み換え（トランスジェニック／キメラ／クローン）胚の発生を支持するために日常的に使用されている。

しかしながら、このアプローチの有効性は限られている。典型的には、この処置のために、妊娠に至る雌と比較して４倍もの数の雌が準備される。新鮮なまたは凍結された胚を移植する場合、このことは貴重な生物学的材料および努力のかなりの損失を意味する。さらに、有望なレシピエントとともに多くの精管切除された若い雄も維持する必要があるが、これらは週に２〜３回しか交尾させることができず、典型的にはパフォーマンスを維持するために６〜９カ月ごとに交換される。

交尾はレシピエントの雌が発情期にあるときに主に起こる。発情周期はマウスおよびラットでは４〜５日間続き（女性の平均２８日の月経周期に相当する）、このため、精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄との交尾に参加する可能性のある膨大にプールされた雌のレシピエント候補に依存せざるを得ない。典型的には、不規則な周期の個体群ではレシピエントの７５％は発情していないため、多数の雌および精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄が維持されることとなるが、前者の場合、タイミングを図った移植に用いるための十分な数のレシピエントを確保するために代理母として使用されないことが多い。このことは移植されるべき胚が特に貴重である場合に特に顕著である。このアプローチは、レシピエントの雌においてホイットン効果でタイミングをあわせて発情を誘導することにより改善されている。この戦略はレシピエントの雌のフェロモン刺激に依存しており、典型的には、繁殖用の雄の尿で汚れた床敷に曝露してから３日後にレシピエントの雌が発情状態となる。しかしながら、フェロモン曝露時の雌の周期段階、繁殖用ケージへの近接度、およびレシピエントの年齢はいずれもこのアプローチの信頼性に悪影響を及ぼし得るため、比較的効果のないものとなっている。

雌が適切な時期に発情期にある（性的に受容性である）可能性はそのサイクル長（４日）により１：４である。したがって、４匹のレシピエントが必要な場合、雌１６匹を雄１６匹と交尾させることとなり、これは成功率２５％に換算される。この数字は、雌の中にはパートナーとの交尾を拒否するものもいるため、さらに低くなり得る。重要な点は、ほとんどのブリーダーが、発情期の雌を選択するか、生殖不能の雄と交尾させる前に発情を誘導するにもかかわらず、発情した雌のうち、「交尾栓ができ（ｐｌｕｇｇｅｄ）」これにより偽妊娠であると推定されるのは依然として比較的低い割合に過ぎない（多くの場合約５０％−一部の施設では１５％程度）ことである。さらに、また、雌が胚移植のレシピエントとして機能し得る期間は数月齢と非常に限られている。雌は成熟するにつれて急速に腹部脂肪を蓄積し、（最も一般的かつ成功した方法である）開腹胚移植が技術的に非常に困難になる。

射精液はさまざまなサイトカインおよびプロスタグランジンを豊富に含む複合混合物であり、サイトカインのいくつかは膣／子宮の環境にプラスの影響を及ぼし得るが、有害な効果を有し得るものもあり、いずれも最終的に胚移植に対する受容性に影響を及ぼすことが知られている。例えば、前炎症性サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−２）は射精液中に存在し、また、性交数時間以内は精漿に応答して子宮内膜上皮細胞によって放出され（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ、１９９０．２（４）：３５９〜６８ページ）、また、胎児の生存および成長に母体のＧＭ−ＣＳＦが必要である（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １９９９年２月１日 第６０巻 第２号 ２５１〜２６１）ことも知られている。さらに、ＷＯ１９９９０６７３６４Ａ１には胚盤胞の成長を促進するためのＧＭ−ＣＳＦ補充培地が開示されており、ＷＯ２０１４０８７２１８には再発性流産を予防するための単独作用物質としてＧＭ−ＣＳＦが記載されている。

またサイトカインＩＬ−１２も射精液に存在しており、妊娠に有害であり（Ｒｅｉｎａら Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４年５月；５１（５）：３４５〜５１）、高濃度では、特にＩＬ−１８とＩＬ−２との相乗作用で、母体リンパ球の活性化を介して流産を引き起こす（Ｈａｙａｋａｗａら Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；４１：３２０〜３２９）ことが示されている。他の研究では、ＣＢＡ／ＪマウスへのＩＬ−１２注射（妊娠５、６、７、および８日目に毎日１００ｎｇ腹腔内投与）が対照と比較して流産率を増加させることが示されている（Ｚｅｎｃｌｕｓｓｅｎら Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年６月；５５（６）：５６０〜９）。

本発明の組成物および方法によって、雌マウスの使用を顕著に減少させるとともに、精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄マウスの必要性を劇的に減少させることができることが想定される。

本発明は、人工もしくは自然授精後、または新鮮なもしくは凍結されたもしくは他の方法で保存された胚の移植後における哺乳動物の雌の妊娠率を、妊娠の確立および／または同腹子の数の増加という点で改善することを目的とする。

本発明は、妊娠率を改善するため、および／または、精液／精子もしくは胚もしくは他の同種移植組織に対する母体の同種反応性を低下させるため、および／または、胚の移植前もしくは授精前に雌に免疫寛容性の子宮環境を提供するためのＩＬ−１２の使用に属する。

本発明の第１の態様によれば、妊娠率の改善に使用するため、および／または、精液／精子もしくは胚もしくは他の同種移植組織に対する母体の同種反応性を低下させるため、および／または、胚の移植前もしくは授精前に雌に免疫寛容性の子宮環境を提供するための組成物であって、ＩＬ−１２を含む組成物が提供される。

好ましくは、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−１２ｐ７０のいずれかである。

好ましくは、組成物はＧＭ−ＣＳＦをさらに含む。

好ましくは、組成物は、ＴＧＦβ、エオタキシン、およびＲＡＮＴＥＳのうちの任意の１、２、または３種をさらに含む。

好ましくは、組成物は、ＭＩＰ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＴＮＦ−αを含む群から選択される任意の１、２、３、４、５、６、または７種の追加のサイトカインをさらに含む。

移植された胚、精子、または他の同種移植組織に対してより受容的であるまたはより敵対的でなくなるように子宮を誘導することに使用するための、塩基性ＩＬ−１２と、さらに、例えば、限定されるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ、または、ＩＬ−１２、エオタキシン、およびＲＡＮＴＥＳの組み合わせを、場合により追加のさらなるサイトカインとともに用いた特定のサイトカインの特定の組み合わせの数々を提供することは本発明の範囲内である。

したがって、精液中の特定のサイトカインが高濃度であることはそれらの生物学的意義を必ずしも反映しないと見なされているため、本発明の組成物は、種々の複数のサイトカインを含有し得る。

好ましくは、本発明の第１の態様の組成物は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＦＧＦ、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＴＡＣＫ、ＫＣ、ＧＲＯα、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＬＩＦ、ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、β−ＮＧＦ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ−β、ＳＤＦ−１α、ＴＮＦ−β、ＴＲＡＩＬ、およびＶＣＡＭ−１を含む群から選択される追加のサイトカインのうちの任意の１または複数種をさらに含む。

以下の表１に本発明において言及するサイトカインの頭字語を列挙する。

本発明は、子宮の受容性を助長させる精液物質の性質を利用すること、および、好ましくは、ペッサリー、ゲル、スプレーなどの膣挿入物、または他の任意の溶解可能な担体と同様の形態で、精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄の物理化学的代替物を提供することに属する。

トランスジェニック非ヒト動物モデルに対する需要がさらなる増加へ向かうことを考慮すると、本発明は、偽妊娠を誘導する精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄の代替物を有利には提供し、また、移植された胚に対する子宮の受容性を改善することによって必要とされる雌の数を有利には減少させる。

精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄の寄与が偽妊娠を誘導するのに必要とされる神経内分泌および子宮の炎症応答の誘発のみに関与することを考慮すると、本発明は、該精管切除されたまたは他の方法で生殖不能の雄の必要性を有利に取り除く。

本発明のさらなる態様によれば、妊娠率を改善するため、および／または、精液／精子もしくは胚もしくは他の同種移植組織に対する母体の同種反応性を低下させるため、および／または、胚の移植前もしくは授精前に雌に免疫寛容性の子宮環境を提供するための、本明細書において既述のサイトカインを含む医薬組成物が膣挿入物または子宮内デバイスの形態で提供される。

好ましくは、雌は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

好ましくは、哺乳動物の雌は、マウス、ラット、ウサギ、スナネズミ、モルモット、ハムスター、霊長類（サル、類人猿）、イヌ、ネコ、ブタ、または胚が配置される他の任意の実験動物もしくは絶滅危惧種を含む群から選択される。

好ましくは、雌は哺乳動物であり、より好ましくはさらに、希少品種／種または絶滅危機品種／種である。

好ましくは、雌は、偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）、クジラ目（Ｃｅｔａｃｅａ）、翼手目（Ｃｈｉｒｏｐｔｅｒａ）、皮翼目（Ｄｅｒｍｏｐｔｅｒａ）、貧歯目（Ｅｄｅｎｔａｔａ）、イワダヌキ目（Ｈｙｒａｃｏｉｄａｅ）、食虫目（Ｉｎｓｅｃｔｉｖｏｒａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、有袋目（Ｍａｒｓｕｐｉａｌｉａ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）、有鱗類（Ｐｈｏｌｉｄａｔａ）、鰭脚亜目（Ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａ）、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、長鼻目（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｄｅａ）、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、海牛目（Ｓｉｒｅｎｉａ）、および管歯目（Ｔｕｂｕｌｉｄｅｎｔａｔａ）の動物を含む群から選択することができる。

好ましくは、組成物中に存在するサイトカインのうちの任意の１種が、本明細書において後述する送達可能な形態のうちの任意の１つから、精液中に見られるそれらの近似の生理学的範囲内またはその範囲以上のいずれかの量でインサイチュで放出される。

サイトカインは、当該分野で規格値と認められているｐｇ／ｍｌで測定される。

本発明は、物理化学的製剤を、好ましくは交尾／授精の前または胚の移植前に雌に挿入するための膣内送達に適した形態で提供することによって、精液物質、特に（免疫応答のタンパク質調節因子であり、子宮の受容性を助長させる）サイトカインの特性を利用することに属する。導入された製剤は、子宮環境の受容性を増強する作用剤を放出する。

本発明で使用されるアプローチは、ペッサリー系、ゲル系、溶液系、エマルジョン系、粉末系、またはエアロゾル系の送達システムを使用することによって、精漿に媒介される生化学的シグナル伝達を模倣することである。ペッサリーは、胚移植／人工授精のために発情周期を同期させるために多くの大型家畜種（例えば、ウシ）において既に日常的に使用されている。しかしながら、今日まで、本組成物の組成物を用いたペッサリー、または子宮の受容性を助長させる、および／もしくは、偽妊娠状態を誘導するという特定の機能のためのペッサリーは使用されていない。

好ましくは、サイトカインは組み換え体である。すなわち、これらは、組み換え技術を用いて細菌または他の細胞型を遺伝子工学的に操作することによって作製される。

本発明は、精子／胚に対する母体の免疫同種反応性を低下させ、それにより妊娠率／転帰を改善するための、典型的には授精／胚移植の前に膣内に配置されるペッサリーまたは膣内に放出されるエアロゾルフォームの形態の、組み換えサイトカイン調製物を含む雌用組成物を提供する。子宮内膜の受容性を改善するための戦略としてこのような送達様式を使用することは新規である。

好ましくは、組成物は、防腐剤、抗酸化剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに含む。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、またはフェノールソルビン酸の含有によって微生物の作用を確実に防止し得る。また、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合もある。また、ワックス、水、および共溶媒を含むことも有益であり得る。

好ましくは、組成物は、膣用カプセル、膣用ゲル、膣用錠、膣用粉末、膣用溶液、膣用ペッサリー、膣用カップ、膣用スポンジ、または膣用フォームもしくはスプレーなどの膣送達に適した形態である。最も好ましくは、組成物は、膣用ペッサリーの形態である。

好ましくは、膣用製剤は、溶解性または非溶解性、分解性または非分解性である。

好ましくは、本発明の組成物は、膣に投与されるか膣用デバイスに組み込まれる、膣用の坐剤、錠剤、粉末、生体接着性錠、カプセル、微粒子、生体接着性微粒子、マイクロカプセル、マイクロスフィア、リポソーム、クリーム、ローション、フォーム、スプレー、フィルム、軟膏、溶液、ゲル、または徐放性ゲル、錠剤、もしくはカプセル、または徐放性坐剤として調製される。

本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、経口もしくは直腸投与用に、または胃腸管の粘膜から吸収され得るように胃腸管送達に使用するための腸溶コーティング錠として調製される。これらの投与様式は、消化器系の粘膜免疫系が生殖器系の粘膜免疫系につながっていることを理論的根拠とするものである。このことにより粘膜プライミングが起こり、それにより、胚移植、同種移植片／配偶子／胚寛容性、生殖器系と消化管の両方の自己免疫寛容または内因性／外因性マイクロフローラの寛容性を促すこととなる。

好ましくは、本発明の組成物は、マルチウォール、マルチコア、マイクロカプセル化調製物として調製される。より好ましくは、組成物の活性成分は、乾燥材料として使用される場合、ゼラチンカプセルなどのシェル／コートにカプセル化される。

膣内投与のための組成物は、好ましくは、本発明の組成物を、室温で固体であるが体温で液体であるため直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出する、カカオバター、ポリエチレングリコール、または坐剤用ワックスなどの適切な医薬成分または非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製される。膣ペッサリーの典型的な例は、活性成分と以下の賦形剤：中鎖トリグリセリドおよび硬質脂肪とを含む。

あるいは、組成物は、膣内デバイスもしくは該デバイスの被膜、例えばタンポンもしくはタンポン様デバイスの被膜に組み込むことができ、またはスポンジ、フォーム、ストリップ、粉末、ペッサリー、もしくは他の材料に組み込むこともできる。このようなデバイスの吸収性材料またはマトリックスに、本発明の組成物を、液体溶液、懸濁ローション、粉末、クリーム、リポソームのマイクロエマルジョンもしくは懸濁液、生体接着性ナノ粒子、または生体接着性微粒子として浸み込ませてもよい。好ましくは、膣用デバイスは、溶解性または非溶解性、分解性または非分解性である。

好ましくは、組成物は、粘膜付着剤、収着促進剤、または浸透増強剤をさらに含む。本発明の組成物は、経粘膜膣送達によって送達され、膣粘膜を本発明の組成物と接触させることを含む。

好ましくは、膣送達用組成物は、迅速送達、制御送達、連続送達、またはパルス送達用である。

本発明の組成物は、一実施形態では、連続または迅速送達をそれぞれ達成するために、遅延型ワックス溶融物（ｓｌｏｗ ｗａｘ ｍｅｌｔ）または急速型ワックス溶融物（ｆａｓｔ ｗａｘ ｍｅｌｔ）を用いたペッサリーとして製剤化することが想定される。別の実施形態では、本発明の組成物は、制御放出を可能にする適切な添加剤を用いたフォームまたはゲルに製剤化される。

好ましくは、本発明の組成物を膣用のペッサリー、錠剤、生体接着性錠、カプセル、粉末、微粒子、生体接着性微粒子として提供する場合、被膜はざらざらしている（ａｂｒａｓｉｖｅ）。これは、特に子宮の受容性のために用意するべき種の雄の陰茎が粗い表皮、ケラチン質の突起などを有する場合に送達可能組成物に対する適切な改変である。この場合、挿入される膣送達ビヒクルは、母体の炎症応答を誘発して調製物の粘膜への浸透を改善し、初期の炎症応答を誘発し、包括的な神経内分泌刺激を助けるために、陰茎上のものと同様の粗い外皮を有することが望ましい。

本発明の特に好ましい実施形態では、組成物はペッサリーの形態である。好ましくは、ペッサリーは、雌の膣内に挿入するのに適切な大きさおよび形状である。ペッサリーは、固体コアおよび多孔質外層（ｏｕｔｅｒ ｐｏｒｏｕｓ ｌａｙｅｒ）を有していてもよい。マウスのペッサリーの典型的な寸法は全体の直径が４ｍｍであり長さが７ｍｍである。ペッサリーの直径および長さは、それが挿入される種の膣の大きさに依存するが、ペッサリーを膣に挿入したときに不快感を伴わずに保持されるような大きさおよび形状とすることが望ましい。

本発明のさらなる態様によれば、妊娠率を改善するため、および／または、精液／精子もしくは胚もしくは他の同種移植組織に対する母体の同種反応性を低下させるため、および／または、胚の移植前もしくは授精前に雌に免疫寛容性の子宮環境を提供するための医薬の製造のための本発明の第１の態様の組成物が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、精液／精子、胚、または他の同種移植片（既存のマイクロフローラを含む）に対する非ヒト雌哺乳動物の母体の同種反応性を低下させる方法であって、膣／胃腸管の粘膜を本明細書において既述の組成物に曝露することを含み、
（ｉ）本発明の組成物を含む少なくとも１つの膣送達ビヒクルを雌の膣内に導入すること、
（ｉｉ）任意選択で、さらなる膣送達ビヒクルを挿入すること、
（ｉｉｉ）膣送達ビヒクルの活性成分が放出され、膣内に浸透して経粘膜的に吸収され、ならびに／または拡散し、ならびに／または子宮内におよび／もしくは胃腸管粘膜を介して輸送されるのに十分な時間を経過させること、ならびに
（ｉｖ）雄と交尾させること、または、人工授精、ドナー配偶子、もしくは胚もしくは他の同種移植片を移植のために子宮内に導入することのいずれかによって、雌を授精させること
を含む、方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、授精または胚の移植の前に非ヒト雌哺乳動物の妊娠率または転帰を改善する方法であって、膣／胃腸管の粘膜を本明細書において既述の組成物に曝露することを含み、
（ｉ）本発明の組成物を含む少なくとも１つの膣送達ビヒクルを雌の膣内に導入すること、
（ｉｉ）任意選択で、さらなる膣送達ビヒクルを挿入すること、
（ｉｉｉ）膣送達ビヒクルの活性成分が放出され、膣内に浸透して経粘膜的に吸収され、ならびに／または拡散し、ならびに／または子宮内におよび／もしくは胃腸管粘膜を介して輸送されるのに十分な時間を経過させること、ならびに
（ｉｖ）雄と交尾させること、または、人工授精、ドナー配偶子、もしくは胚もしくは他の同種移植片を移植のために子宮内に導入することのいずれかによって、雌を授精させること
を含む、方法が提供される。

本発明のさらなる実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、人工または自然授精の場合、同時に／近接した時系列で実施される。本発明の方法は、精子／胚／配偶子および内因性または外因性マイクロフローラに対する母体の免疫同種反応性を低下させ、それにより妊娠率を改善するために、授精／胚移植の際に膣に配置される、組み換えサイトカインを含む組成物を含有するペッサリー、ゲル、スプレー、またはフォームを使用する。

投与回数および投与の間隔は必要に応じて変更することができ、種または品種、過排卵／排卵状態（ｓｕｐｅｒ／ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）、季節的影響、授乳状態、および過去の妊娠の失敗または過去の授精もしくはＩＶＦ処置の回数によって異なり得る。また、母体年齢や雌が初妊婦であるかどうかによっても異なり得る。

好ましくは、本発明の方法は、実験用非ヒト動物に使用される場合、レシピエントの雌の発情期を同期させるステップをさらに含む。

本発明のまたさらに別の態様によれば、パーツおよび任意選択でそれらのための一組の指示書のキットが提供され、該キットは、本発明の組成物を含むいくつかの膣送達ビヒクルと、前記膣送達ビヒクルをレシピエントの非ヒト雌哺乳動物の膣に挿入するための装置とを含む。

本発明の第１の態様について記載した特徴は、本発明の任意かつすべての態様に等しく適用可能であり、必要な変更を加えて適用されることが理解されよう。

本発明を、単なる例示として以下の図を参照して説明する。

本発明の実施形態を、添付図面を参照して以下にさらに説明する。

マウス精漿中のサイトカインネットワークのベイジアン数学的モデリングを示す図である。ノード（サイトカイン）は、それらの親ノードのステータスを考慮して、対応するメディエータ相対濃度の条件付き確率にしたがって、高（緑色）、低（赤色）、または中間（白色）濃度に色分けされる（各ノードに隣接する棒グラフは、左側の低濃度から右側の高濃度までの３つの濃度容器のうちの１つへの分類の潜在的な条件付き確率を反映している）。正規化された濃度（低または高）でノード色の強さを決定する。エッジ（ノード間の因果関係接続線）は、ノード間の因果関係の直接的相互作用を表す。これらのサイトカインは母系の生殖器系と相互作用して父系抗原に対する免疫寛容を誘導する。 ラット精漿におけるサイトカインネットワークのベイジアン数学的モデリングを示す図である（詳細は上述したとおりである）。（＞９０％のブートストラッピング相互関係における発生率に基づく）ベイジアン結果の信頼性分析に基づいて、非常に高い信頼性レベルのエッジを赤色で表示する。

本明細書において「胚」という用語は、発生の初期段階、特に雌のレシピエントに移植することが明確に認識可能な形態に到達する前の胞胚、胚盤胞、受精卵、または生体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）を含むことが意図される。これらの用語は互換的に使用される。

本明細書において「改善された妊娠率」という用語は、処理された精液を用いた人工授精もしくは自然授精後、または新鮮なもしくは凍結されたもしくは他の方法で保存された胚の移植後におけるポジティブな妊娠転帰または改善された周産期生存率もしくは包括的生存能を含むことが意図される。以下に使用される妊娠という用語は、自然もしくは人工授精により、または新鮮なもしくは凍結されたもしくは他の方法で保存された胚および配偶子の移植後に起こる妊娠を包含するものと解釈されるべきである。

本明細書において「膣挿入物」または「子宮内デバイス」という用語は、本発明の組成物が膣／子宮環境に対して薬理学的効果をもたらすことができるように本発明の組成物を膣内に送達することが可能な任意のペッサリー系、ゲル系、溶液系、エマルジョン系、粉末系、またはエアロゾル系の送達システムを含むことが意図される。

本明細書において「ペッサリー」という用語は、本発明の医薬物質が膣の粘膜表面を介して容易に吸収されるようにするための、または、例えば炎症に対する局所的作用、もしくは子宮に対する作用をもたらすことが意図された、本発明の医薬物質の送達手段を意図する。

「医薬成分」または「賦形剤」は、本発明の粘膜付着性組成物に添加される薬理学的に不活性な薬学的に許容される化合物を意味する。該成分または賦形剤は薬理学的特性を有さない。

「迅速送達」は、組成物からの成分の初期の即時迅速放出および送達を意味する。典型的には、迅速送達の後、組成物またはデバイスからの成分の放出および血漿／子宮壁組織（または、該当する場合は胃腸管）への薬物の送達は時間依存的に低下する。

「制御送達」は、活性物質が材料から予め設計された様式で放出される放出を意味する。活性物質の放出は、長期にわたって一定であってもよく、長期間にわたって周期的であってもよく、または環境もしくは他の外部的事象に誘発されてもよい。

「連続送達」は、製剤またはデバイスからの成分の連続的かつ中断のない放出、および該成分を連続的な様式で送達することを意味する。連続送達の前に迅速送達が行われてもよい。

「パルス送達」は、断続的な間隔での成分の放出および送達を意味する。このようなパルス送達は、例えば、個々の層に組成物を配合しその間に溶解可能な被膜からなる不活性層を配置することによって、または異なる医薬成分を使用することによって提供することができる。

精液サイトカイン分析
性的に成熟したＣＤ１雄マウス（ｎ＝２０）およびＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝２０）を屠殺し、死後、精嚢腺から精液を採取した。死後のアプローチを選択して電気射精による試料採取を回避したが、これは、この方法では精子の質が変わりやすく、また試料が急速に凝固して分析に問題が生じるためである。貯精嚢の試料採取が理想的であるが、これは、（付属腺のものよりも）この液の方が調査対象の母体系の免疫調節因子を含んでおり、また、腺分泌物の凝固をより容易に回避することができるためである。

精液試料を個々に秤量し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）補充リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、再度秤量した。マウス精液の標準重量：容量比に対する推論により、単離した元の容量とＰＢＳによって導入された希釈係数を決定することができた。このステップは液体がピペットで正確に採取するにはあまりに粘性であるため必要であった。試料を遠心し、上清を以下の２３サイトカイン：インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ケラチノサイト由来ケモカイン（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＫＣ）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、マクロファージ阻害性タンパク質（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＩＰ）−１α、ΜΙΡ−１β、活性化により制御され正常Ｔ細胞で発現分泌される（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αについて同時に分析するまで−８０℃で凍結した。この分析は、ＳｔａｒＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアを搭載したＬｕｍｉｎｅｘ−１００（登録商標）において実行するカスタム２３重（２３−ｐｌｅｘ）液相イムノアッセイキットによって行った。偽陽性／陰性を避けるためにすべての場合に血清希釈液を使用し、希釈液はベースラインレベルに対する感度を最大にするために１：１に調整した。同様の分析をラット精液について行った。

以下の表２に、マウス精液において分析および測定した種々のサイトカインを示す。エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳは５００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルで存在する主要なサイトカインであると思われる。ＩＬ−９、ＴＮＦ−α、およびＭＩＰ−１ａは１００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルを有しており、一方、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのいくつかのサイトカインは５０〜１００ｐｇ／ｍｌの間のレベルを有し、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−βなどの他のいくつかは５０ｐｇ／ｍｌ未満のレベルを有していた。

以下の表３に、ラット精液において分析および測定した種々のサイトカインを示す。ＲＡＮＴＥＳは存在する主要なサイトカインであると思われる。分析したサイトカインのうち、ＲＡＮＴＥＳおよびＧＲＯ／ＫＣのみが２００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルを有していた。ＩＬ−１０およびＩＬ−６は１００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルを有しており、一方、ＭＣＰ−１などのいくつかのサイトカインは５０〜１００ｐｇ／ｍｌの間のレベルを有し、ＩＬ−１７などの他のいくつかは５０ｐｇ／ｍｌ未満のレベルを有していた。

エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳは各々が５００ｐｇ／ｍｌを超える量で存在する主要なサイトカインであると思われる（表１および２を参照されたい）。サイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（Ｐ４０）、ＩＬ−１２（Ｐ７０）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびΜΙΡ−１βは２０ｐｇ／ｍｌ未満のレベルで存在しており、サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＫＣ、ＭＩＰ−１α、およびＩＦＮ−γは２０ｐｇ／ｍｌを超え１５０ｐｇ／ｍｌ未満のレベルで存在していた。しかしながら、本明細書において上述したとおり、存在するサイトカインのレベルは必ずしも効果または効力と相関しない。

これらの分析に基づき、細胞培養液−試験した組み換えマウスサイトカインの溶液を、精液中に見られる濃度（表３）で組み換えサイトカインを用いてＰＢＳ中に作製した。これをペッサリーを浸すのに必要になるまで−８０℃で保存した。

表４ 一度可溶化したマウスペッサリー調製物の子宮内（ｉｎ ｕｔｅｒｏ）におけるサイトカイン濃度

実験動物用ペッサリーの追加配合成分は、（誤飲の場合の）毒性、（摂取をやめさせるための）嗜好性、および管腔ｐＨへの影響（特定のサイトカインの生物活性は膣のｐＨにより促進される）によって主に規定される。ペッサリーの大きさおよび形状は、それらの使用が意図されている種によって主に決定される。例えば、マウスには直径約４ｍｍのペッサリーが特に好適であるが、これは、大きさが過度の不快感なしに挿入するのに適切であるように決定されており、また、膣前庭内に保持されるのに適した大きさであるためでもある。大型実験動物または実際により大きな品種のマウスはより大きなペッサリーを必要とする場合もある。ペッサリーは５〜１０ワットの間の設定でレーザーエッチングされたナイロンから作られ、この技術の使用により、（「保持（ｌｏａｄｉｎｇ）」を容易にする）多孔性度ならびに全体的な形状および寸法を制御することが可能となる。ペッサリーは、さまざまな大きさで提供されるものであること、使用のために所望により柄を中央保持ユニットから折り取ることができること、およびさまざまな大きさのペッサリーをユーザに提供することができることが想定される。ペッサリーは、母体の生殖器系において精液程度の最終濃度を確保するために必要とされる活性物質がペッサリーに保持されるように、１００倍の濃度のサイトカイン溶液５００μｌに一晩浸漬することによって使用のために準備される。次いでペッサリーの頭部を柄から取り外し、適切なデバイスを用いてマウスの膣内に直接挿入する。次いでペッサリーは一定期間マウスの膣内に留置され、その後ペッサリーは、動物に麻酔をかけた場合には胚移植の際に取り出され、あるいは、自己溶解するか活性成分が吸収されてから自然に排出される。

なお、上記実施形態は、本発明の組成物を送達する手段の一例に過ぎず、ペッサリーは遅または速溶融ワックス型製剤の形態であってもよく、また、本発明の組成物を送達する方法は種によって異なっていてもよいことが理解されよう。また、送達手段は生分解性製品の形態であってもよく、また、例えば、ヒトにおいて膣用スポンジはより好都合な組成物の送達方法であり得る。

ＣＤ１マウスへの胚移植を以下のプロトコルおよびサイトカインの組み合わせを用いて調べた。

移植前段階の胚のインビトロ培養のための一般的な培地であるＭ２を用いて胚を処置した。Ｍ２は改変Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩溶液でありＨＥＰＥＳとともに胚移植に使用した。しかしながら、胚を短時間でも（＞４個の胚移植の時間）維持する場合は、胚は重炭酸塩緩衝ＫＳＯＭ＋Ｅａｇｌｅ’ｓ混合物（アミノ酸）＋１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むディッシュに移し、５％ＣＯ２下で３７℃のインキュベータで維持した。マウスドナーはおよそ４〜６週齢であり、レシピエントはおよそ６〜１０週齢である。重量は考慮すべき重要な因子であるため特定の重量範囲を選択したが、２０ｇｍ未満であると妊娠を支持できない場合があり、３０ｇｍを超えると腹部の脂肪により胚移植がより困難になるため、マウスは２０〜３０ｇｍであるべきである。

雌を首筋で保持して落ち着かせ／リラックスさせることによりペッサリーを挿入した後、３５μｌのフラッシュ液を狭先端パスツールピペットに採取し該液を膣内にフラッシュする。液は４〜５回フラッシュおよび収集する（フラッシュで終了する）。次いでマウスを首筋で保持したままペッサリーをフラッシュ後に手で挿入する。ペッサリーを膣の筋肉の向こう側に押し込むためにペッサリーの尾部を使用するが、ペッサリーがそれ以上進まなくなった時点で感じることができる。一部の動物ではペッサリーの保持時間が短いことが多く、ペッサリーはその日にすべてのペッサリーを挿入するのに要する時間の間モニターされるに過ぎない。

胚移植の後、雌をケージメイトとともにホームケージに戻す。手術後５〜７日に手術クリップを除去する。着床（生児出生ではなく）をチェックする場合は、雌を胚移植１０日後に屠殺し子宮角に存在する胎児数を記録する。この段階で再吸収（他の胎児より小さく、色が異なる）が見られ得るのでこれも記録する。生児出生のためには雌を妊娠に向けて約１８日まで群で収容する。これらの妊娠の兆候は視覚的にモニターすることもでき、また、胚移植の前、および、誕生までの毎週秤量を行う。これは、雌が子を失ったかまたは殺したかを、子を確認する前に識別するのに役立つ。子の体重を７日齢および離乳時（２０〜２１日）に記録する。また、離乳時に子の雌雄識別を行う。

以下の表５に１から６日のプロトコルを示す。

処置群は以下のとおり、精管切除された雄（Ｖ_ＳＸ）、ならびに、ＭＩＰ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦの混合物（５種の混合物）からなるペッサリー、これに加えて、単独成分としての５種のサイトカインの他のペッサリー（全データは示さず）、ならびに、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１２およびＩＬ−１３、ならびにＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１２およびＭＩＰの組み合わせの他のペッサリーとした。胚移植を用いた合計成功妊娠数を記録した。表６に、処置（サイトカインペッサリー）を成功妊娠転帰と対比して示す。

このデータは、ＩＬ−１２を単独でまたは組み合わせて、移植率を従来技術の方法と比較して成功裡に増加させるために使用することができることを示している点で本発明を裏付ける。

本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびそれらの変形は「含むがこれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、それらは、他の部分構造、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（かつ、除外しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書は複数ならびに単数を意図するものとして理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態、または実施例とあわせて説明した特徴、整数、特性、化合物、化学部分構造または基は、矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書に開示された特徴のすべて（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面のいずれも含む）、および／または、同様に開示された任意の方法もしくはプロセスのステップのすべては、当該特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述の実施形態の詳細のいずれにも限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面のいずれも含む）に開示された特徴の任意の新規なものもしくは任意の新規の組み合わせまで、または、同様に開示された任意の方法もしくはプロセスの任意の新規のものもしくは任意の新規の組み合わせまで拡張される。

読者の注意は、本明細書と同時にまたはそれ以前に本出願に関連して出願された、および、本明細書とともに公衆の閲覧のために開示されているすべての論文および文書に向けられ、それらのすべての論文および文書の内容は参照により本明細書に援用される。

Claims (10)

1. 組み換え体ＩＬ−１２および組み換え体ＧＭ−ＣＳＦからなり、前記組み換え体ＩＬ−１２および組み換え体ＧＭ−ＣＳＦを、生殖能力のある雄の精液中に見られるＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦに相当する生理学的濃度範囲内で膣内でインサイチュで放出するように構成されている、胚の移植前または授精前に雌において妊娠率の改善に使用するための組成物。
2. 組み換え体ＩＬ−１２がＩＬ−１２ｐ４０またはＩＬ−１２ｐ７０のいずれかである、請求項１に記載の組成物。
3. 組み換え体ＩＬ−１２および組み換え体ＧＭ−ＣＳＦからなり、膣挿入物であり、前記組み換え体ＩＬ−１２および組み換え体ＧＭ−ＣＳＦを、生殖能力のある雄の精液中に見られるＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦに相当する生理学的濃度範囲内で膣内でインサイチュで放出するように構成されている、胚の移植前または授精前に雌において妊娠率の改善に使用するための医薬組成物。
4. 組み換え体ＩＬ−１２および組み換え体ＧＭ−ＣＳＦが、生殖能力のある雄の精液中に見られるそれらの近似の生理学的範囲内またはその範囲以上でのいずれかでインサイチュで放出されるように構成されている、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 膣挿入物が、膣用カプセル、膣用ゲル、膣用錠、膣用粉末、膣用溶液、膣用ペッサリー、膣用カップ、膣用スポンジ、膣用エアロゾル、または膣用フォームもしくはスプレーである、請求項３または４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 医薬組成物が、迅速送達、制御送達、連続送達、またはパルス送達製剤である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 妊娠率の改善に使用するための、請求項１または２のいずれかに記載の組成物を含む経粘膜膣送達用のペッサリー。
8. げっ歯類における子宮の受容性を助長させるための、請求項７に記載のペッサリー。
9. げっ歯類がマウスまたはラットである、請求項８に記載のペッサリー。
10. 請求項１または２のいずれかに記載の組成物、請求項３から６のいずれかに記載の医薬組成物、または請求項７から９のいずれかに記載のペッサリーを含む膣送達ビヒクルと、キットに含まれるときに前記膣送達ビヒクルをレシピエントの雌の膣に挿入するための装置とを含む、キット。

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