JP6789959B2 - 膜ｓｔｉｍ１を用いた、慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）及び／又は全身性エリテマトーデス（ｓｌｅ）の診断方法、予後診断方法、及び進行のモニタリング方法 - Google Patents
膜ｓｔｉｍ１を用いた、慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）及び／又は全身性エリテマトーデス（ｓｌｅ）の診断方法、予後診断方法、及び進行のモニタリング方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び／又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を診断する方法に関し、並びに進行を予測する方法並びに／又はＣＬＬ及び／若しくはＳＬＥの進行をモニタリングする方法にも関する。
本発明は治療分野、具体的には診断分野に使用される。
下記明細書では、角括弧（［］）内参考文献は本文末に提示される参考文献のリストに戻って参照する。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、今日でも依然として難病であり、非常に多岐にわたる進行を呈し、時としてその診断が非常に難しい。
ＳＬＥは、自己反応性リンパ球及び抗核自己抗体（ＡＮＡ）の存在を特徴とする自己免疫性の稀な疾患である。ＳＬＥは非常に多彩な臨床像をもつ多臓器疾患である。有病率は民族によって異なるが、約１００００人に１人と推定され、女性対男性比が１０：１である。この疾患の臨床的多様性はその疾患原因の複雑さに一致し、遺伝的要因、エピジェネティックな要因、及び環境要因が同時に含まれる。ＳＬＥはすべての臓器を冒しうる。最も良く見られる症状は、発疹、関節炎、及び疲労である。最も重い症状としては、腎障害、神経障害、心臓障害、貧血、及び血小板減少症が挙げられる。ＳＬＥは発作を通して進行する疾患であり、ＳＬＥを明確にするために数種の臨床基準及び生物学的基準を組み合わせる必要があるのでその診断は難しい（Petri M, Orbai AM, Alarcon GS, Gordon C, Merrill JT, Fortin PR, et al. Derivation and validation of the Systemic Lupus International Collaborating Clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2012;64:2677-86, ([1])）。これらの基準の特異度は完全ではなく、すべての基準が現れるのに数年又は数十年待つことが必要な場合もあり、そのため治療処置が遅れることがある。９５％を超える患者がＡＮＡをもち、約１６０倍で陽性とみなされる。ＡＮＡはＳＬＥに特異的ではなく、前記ＡＮＡの検索は、抗ＤＮＡ抗体（民族及び使用手法によって３０〜７０％）、抗Ｓｍ抗体（民族によって５〜３０％）、抗リボソーム抗体（１〜５％）、及び抗ＰＣＮＡ（抗増殖細胞核抗原）抗体（１％）などの特異性がより高い自己抗体を示すことで補われなければならない。
現在の臨床的目的は、生命予後を悪くする可能性がある急性発症を治療するために迅速にＳＬＥの診断を行うこと、次いで比較的安定した期間における発作のリスクを最小限にし、生命予後を危うくすることなく、日々のクオリティ・オブ・ライフに影響する症状をコントロールすることである。疾患の活動性は、所与の時点の疾患の活動性を説明する「全身性エリテマトーデス疾患活動性指数」などの臨床スコアを用いて評価される（Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, Caron D, Chang CH. Derivation of the SLEDAI, a disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum 1992;35:630-40 ([2])）。ヒドロキシクロロキン及び非ステロイド性抗炎症薬は中等症ＳＬＥに適応され、副腎皮質ホルモン及び免疫抑制剤はより重い状態にのみ用いられる。Ｂリンパ球（ＬＢ）を標的にする抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（リツキシマブ、マブセラ（登録商標））及び抗ＢＡＦＦ抗体（ベリムマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））は現在のところ通常の治療に反応しないさらに重症の患者に適応され
ている。副腎皮質ホルモン及び免疫抑制剤の導入以降、予後は改善されているが、ＳＬＥはそれを患う患者の罹患率や死亡率に重大な影響を及ぼし続けている。
ている。副腎皮質ホルモン及び免疫抑制剤の導入以降、予後は改善されているが、ＳＬＥはそれを患う患者の罹患率や死亡率に重大な影響を及ぼし続けている。
ＣＬＬはやはりＬＢを冒す悪性且つ慢性の血液疾患である。これらの細胞は免疫系において重要な役割を担っている。ＣＬＬの間、ＣＬＬ ＬＢはライフサイクルが妨げられ、成熟した際にその産生が続いている。結果的に、こられのＬＢがリンパ節、脾臓、肝臓、及び骨髄の血液中に蓄積してしまい、二次リンパ器官の体積の増加をもたらす。現在利用可能なＣＬＬに対する治療は、ビネー（Binet）スコア（Binet JL, Lepoprier M, Dighiero G, Charron D, D'Athis P, Vaugier G, Beral HM, Natali JC, Raphael M, Nizet B, Follezou JY. A clinical staging system for chronic lymphocytic leukaemia: prognostic significance. Cancer. 1977;40:855-64 ([3])）などの臨床生物学的な基準、生物学的因子（Pflug N, Bahlo J, Shanafelt TD, Eichhorst BF, Bergmann MA, Elter T, et
al. Development of a comprehensive prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukaemia. Blood. 2014;124:49-62, ([4])）、及び細胞の細胞遺伝学的分析（Novak U, Oppliger Leibundgut E, Hager J, Muhlematter D, Jotterand M, Besse C, Leupin N, Ratschiller D, Papp J, Kearsey G, Aebi S, Graber H, Jaggi R, Luthi JM,
Meyer-Monard S, Lathrop M, Tobler A, Fey MF. A high-resolution allelotype of B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). Blood. 2002;100:1787-94, ([5])）によって規定される進行した段階に疾患がある場合に通常使用される。ＣＬＬの集中治療で用いられる化学療法製品は、単独使用のクロランブシル、単独使用のフルダラビン、及びＣＨＯＰタイプ（シクロホスファミド−（Ｈ）アドリアマイシン−オンコビン（ビンクリスチン）−プレドニゾンの４つの薬剤の併用）の毎月の化学療法治療である。標的治療の観点から、白血病ＬＢはＣＤ２０＋であるので、この標的を特異的に認識するモノクローナル抗体が治療の間に使用することができる（リツキシマブ、マブセラ（登録商標）；オファツムマブ、アーゼラ（登録商標）；及びＧＡ１０１、オビヌツズマブ）。別の標的はＬＢ特異的ブルトンチロシンキナーゼであり、その発現が白血病細胞で増加している。イブルチニブはその酵素の阻害剤であるので、白血病細胞のアポトーシス（死）をもたらし、たとえ、難治性又は再発するものであっても、より長期の寛解を可能にする。しかし、該治療は患者を有害な副作用に曝す可能性がある。
al. Development of a comprehensive prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukaemia. Blood. 2014;124:49-62, ([4])）、及び細胞の細胞遺伝学的分析（Novak U, Oppliger Leibundgut E, Hager J, Muhlematter D, Jotterand M, Besse C, Leupin N, Ratschiller D, Papp J, Kearsey G, Aebi S, Graber H, Jaggi R, Luthi JM,
Meyer-Monard S, Lathrop M, Tobler A, Fey MF. A high-resolution allelotype of B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). Blood. 2002;100:1787-94, ([5])）によって規定される進行した段階に疾患がある場合に通常使用される。ＣＬＬの集中治療で用いられる化学療法製品は、単独使用のクロランブシル、単独使用のフルダラビン、及びＣＨＯＰタイプ（シクロホスファミド−（Ｈ）アドリアマイシン−オンコビン（ビンクリスチン）−プレドニゾンの４つの薬剤の併用）の毎月の化学療法治療である。標的治療の観点から、白血病ＬＢはＣＤ２０＋であるので、この標的を特異的に認識するモノクローナル抗体が治療の間に使用することができる（リツキシマブ、マブセラ（登録商標）；オファツムマブ、アーゼラ（登録商標）；及びＧＡ１０１、オビヌツズマブ）。別の標的はＬＢ特異的ブルトンチロシンキナーゼであり、その発現が白血病細胞で増加している。イブルチニブはその酵素の阻害剤であるので、白血病細胞のアポトーシス（死）をもたらし、たとえ、難治性又は再発するものであっても、より長期の寛解を可能にする。しかし、該治療は患者を有害な副作用に曝す可能性がある。
ＳＬＥ及びＣＬＬの病理では、無刺激時及びＬＢ抗原受容体（ＢＣＲ）の刺激後のＳＬＥ及びＣＬＬにおけるＬＢのカルシウムシグナル伝達の乱れが報告されている（Liossis SN, Kovacs B, Dennis G, Kammer GM, Tsokos GC. B cells from patients with systemic lupus erythematosus display abnormal antigen receptor-mediated early signal transduction events. J Clin Invest. 1996;98:2549-57, ([6]; Duhren-von Minden M, Ubelhart R, Schneider D, Wossning T, Bach MP, Buchner M, et al. Chronic lymphocytic leukaemia is driven by antigen-independent cell-autonomous signalling. Nature.
2012;489:309-12, ([7])）。
2012;489:309-12, ([7])）。
よって、ＣＬＬの診断及びＳＬＥの診断は不完全な臨床基準及び生物学的基準を編んだものに基づく。したがって、公知のものと比べて有効な新しい診断基準及び新しい予後診断基準の開発が必要である。
さらに、ＣＬＬには動物モデルがないか、あったとしても完全に正当性が確認されていない。ＳＬＥには数種の動物モデルがあり、最も良く研究されているものの１つは、ヒトＳＬＥの特徴の大部分を再現するループス易発性（lupus prone）マウスモデルＭＲＬ／Ｌｐｒに関する（Shlomchik, M. J., Madio, M. P., Ni, D., Trounstine, M. & Huszar,
D. J. Exp. Med. 180, 1295-1306 (1994) [(10)]）。
D. J. Exp. Med. 180, 1295-1306 (1994) [(10)]）。
したがって、先行技術の欠点、短所、及び障害を克服するＳＬＥ及びＣＬＬの新規の診
断方法を提供することが真に必要である。
断方法を提供することが真に必要である。
本発明は、カルシウムチャネル活性化及び調節に関与するタンパク質である、細胞膜に位置するＳＴＩＭ１タンパク質画分を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び／又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を診断する方法のバイオマーカーとして用いることを通してそれらの必要性を満たすことができる。
本発明が考えだされる以前は、ＣＬＬ及びＳＬＥに対する当時の治療に応答する予測マーカーはなかった。したがって、出願人がＣＬＬ及び／又はＳＬＥの診断及び／又は予後診断の新規方法の開発に成功したことは意義深く且つ革新的な調査研究に関連する。有利には、該方法はＭＲＬ／Ｌｐｒループス易発性マウスモデルに適用しうる。
本発明は、それらの病的状態において膜ＳＴＩＭ１発現の多様性を、ＣＬＬ及び／又はＳＬＥの診断及び／又は予後診断用バイオマーカーとして利用することを完全に革新的なやり方で可能にする。
本発明において驚くべきことに、ループス患者のＬＢ及びＬＴ（Ｔリンパ球）並びにＭＲＬ／Ｌｐｒループス易発性マウスモデルのＬＢでは、ＳＴＩＭ１タンパク質の全体的な発現の増加及び細胞膜にあるＳＴＩＭ１画分の誘導が見られる。ヒト及びネズミ対照ＬＢ及び対照ＬＴでは、該発現の増加や誘導は低いレベルにとどまるか、発現増加や誘導が無いことさえある。よって本発明は、ＳＬＥにおいてＳＴＩＭ１の発現の測定を次のマーカーとして使用することを提案する。
１）診断バイオマーカー。ＬＢ及びＬＴのＳＴＩＭ１発現レベルはＳＬＥの識別マーカーである。出願人は、ループス患者を他の自己免疫性の病態（グージェロ・シェーグレン症候群及び関節リウマチ）と識別するこのマーカーの利点を示した。
２）予後予測バイオマーカー。出願人は本発明において、ヒトの膜ＳＴＩＭ１の量とループス疾患の活動性（ＳＬＥＤＡＩスコア）の間及びマウスループス易発性マウスＭＲＬ／Ｌｐｒの膜ＳＴＩＭ１の量とタンパク尿の間に逆相関があることを示した。
３）治療反応バイオマーカー
１）診断バイオマーカー。ＬＢ及びＬＴのＳＴＩＭ１発現レベルはＳＬＥの識別マーカーである。出願人は、ループス患者を他の自己免疫性の病態（グージェロ・シェーグレン症候群及び関節リウマチ）と識別するこのマーカーの利点を示した。
２）予後予測バイオマーカー。出願人は本発明において、ヒトの膜ＳＴＩＭ１の量とループス疾患の活動性（ＳＬＥＤＡＩスコア）の間及びマウスループス易発性マウスＭＲＬ／Ｌｐｒの膜ＳＴＩＭ１の量とタンパク尿の間に逆相関があることを示した。
３）治療反応バイオマーカー
出願人は驚くべきことに、ＣＬＬ ＬＢでは２つの群の患者が、膜ＳＴＩＭ１タンパク質の存在（群Ｉ）又はそのタンパク質の不在（群ＩＩ）によって識別できることを示した。総ＳＴＩＭ１発現の増加及び群ＩのＣＬＬ ＬＢのＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の欠損も本発明において示される。
よって本発明は、ＣＬＬにおけるＳＴＩＭ１発現及び／又はＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定を次のマーカーとして使用することを提案する
１）診断バイオマーカー。ＳＴＩＭ１発現レベルは診断マーカーとして使用され、特に、初発型（initial forms）及びＭａｔｕｔｅｓスコアが３のＣＬＬ（ＣＬＬの５％）に対して用いられる。
２）予後予測バイオマーカー。ＬＢのＳＴＩＭ１発現レベルは疾患の臨床的進行（ビネースコア）と相関する。
３）治療反応バイオマーカー。本発明に関連して、ＳＴＩＭ１の膜画分の発現レベル及び／又はＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態は、治療及びリツキシマブ（抗ＣＤ２０）に対する反応のマーカーとして使用される。
１）診断バイオマーカー。ＳＴＩＭ１発現レベルは診断マーカーとして使用され、特に、初発型（initial forms）及びＭａｔｕｔｅｓスコアが３のＣＬＬ（ＣＬＬの５％）に対して用いられる。
２）予後予測バイオマーカー。ＬＢのＳＴＩＭ１発現レベルは疾患の臨床的進行（ビネースコア）と相関する。
３）治療反応バイオマーカー。本発明に関連して、ＳＴＩＭ１の膜画分の発現レベル及び／又はＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態は、治療及びリツキシマブ（抗ＣＤ２０）に対する反応のマーカーとして使用される。
本発明はいくつかの点で有利であり、特に、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質は病的細胞でのみ存在し、健康な細胞では存在しないことに起因し、それによって特異度及び選択性の増加が可能になる。さらに、免疫細胞によるＳＴＩＭ１タンパク質の細胞膜での発
現は、より迅速で且つ簡単な診断への利用可能性を高める。
現は、より迅速で且つ簡単な診断への利用可能性を高める。
よって本発明の最初の目的は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び／又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を、該疾患を患っている可能性がある対象において診断する方法に関し、該方法は対象の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現をインビトロで検出することを含む。
本発明の別の目的は、ＣＬＬ及び／若しくはＳＬＥの進行を予測する方法並びに／又はＣＬＬ及び／若しくはＳＬＥの進行を、該疾患を患っている可能性がある対象においてモニタリングする方法に関し、該方法は対象の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現をインビトロで検出することを含む。
本発明では、「生体試料」という用語は、対象のいずれの組織又は細胞、その誘導体を意味することが意図される。該生体試料は、例えば対象から採取された試料に由来しうる。該生体試料は、例えば、血液試料、骨髄試料、又はリンパ節生検の試料でありうる。
本発明では、「対象」という用語は、いずれの生きているヒト又は動物、例えば、動物モデルを意味することが意図される。例えば、動物モデルはマウスでありうる。対象は病的状態を患っているかどうかを知ることが望ましい対象でありうる。代替的に、対象は病的状態を患っている対象でありうる。この場合、対象は病的状態に対する治療を受ける対象又は未治療の対象でありうる。対象はまた対照対象でもありうる。この場合、対象は診断又はモニタリングすることが望ましい疾患を患っている対象を含みうる。その他の実施形態では、対照対象は健常患者、すなわち「健常な（healthy）」と描写される疾患を患っていない個人に該当する。
本発明では、「発現の検出」という用語は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性のいずれの定性的及び／又は定量的特定を意味することが意図される。検出は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性の定量的測定を含みうる。代替的に検出は、例えば、分析される対象について検出される発現を対照対象と比較すること、及び／又は例えばデータベース上の、入手可能な過去の関連データと比較することによって、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を定性的に測定することを含みうる。
検出される発現は、タンパク質の有無若しくは量、又は細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分を標的にする化合物の使用によって調節されるいずれの生物学的効果、例えば、カルシウム流、細胞生存、オートファジー、サイトカイン産生、増殖、及び細胞遊走に対する効果でありうる。使用される検出手段は、例えば、メッセンジャーＲＮＡの定量による、例えば、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ及び／又はハイブリダイゼーション法による、例えば、標識プローブ又はＤＮＡチップを用いることによる当業者に公知のいずれの手段であってよい。その他の実施形態では、本発明による方法は、例えば、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング法、顕微鏡の使用、質量分析、免疫アッセイ、具体的にはＥＬＩＳＡによる抗ＳＴＩＭ１抗体の使用を通した、生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の定量を含む。また、ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態を調べる方法、例えば、クロマチン免疫沈降法、メチル化感受性ＰＣＲ、ＣｐＧチップの使用も含まれ、亜硫酸水素ナトリウムでの処理後のいずれの試験も含まれる。
１つ特定の実施形態では、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の検出はＳＴＩＭ１タンパク質のさまざまな細胞画分の検出も含みうる。ＳＴＩＭ１のさまざまな細胞画分は、細胞膜及び／若しくは小胞体にあるタンパク質の画分、又は総ＳＴＩＭ１画分でありうる。
１つ特定の実施形態では、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現の検出はＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定である。ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定は当業者に公知のいずれの手法でも実施することができる。その手法は、例えば、ＤＮＡメチル化に対して感受性又は非感受性な制限酵素、例えばＭｓｐＩ若しくはＨｐａＩＩの使用、又は抗５−メチルシトシン抗体とのインキュベーションを伴う又は伴わない「メチル化ＤＮＡ免疫沈降」法でありうる。有利には、膜ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態は、ＣＬＬ又はＳＬＥを患っている対象とそれを患っていない健康な対象の間で異なる。例えば、それを患っていない対象の対照プロファイルとは異なるプロファイルは、疾患の陽性診断、又は疾患の治療に対する弱い反応に関する推論、又は疾患の進行に関する推論を可能にする。
本発明では、「細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分」という表現は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質のグリコシル化された画分を意味することを意図される。ＳＴＩＭ１タンパク質は、２つのグリコシル化部位、１３１位のアスパラギン及び１７１位のもう１つのアスパラギンをもつ。ＳＴＩＭ１分子のグリコシル化は、ＳＴＩＭ１分子の細胞表面への輸送に必要で且つ必須のプロセスである（Mignen O, Thompson JL, Shuttleworth TJ. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC)
channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. (2007) 579:703-15, ([9])）。この画分は分子量が約９０±２ｋＤａであり、非グリコシル化型のＳＴＩＭ１（８４±２ｋＤａ）と識別可能である。２つの型はウェスタンブロッティング法で検出可能である。ヒトＳＴＩＭ１分子（間質相互作用分子、ＧＯＫとしても知られる）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ配列：Ｑ１３５８６又はＮＣＢＩ配列：ＮＰ＿００３１４７．２にあたる配列番号１の配列のタンパク質である。このタンパク質は、ＮＣＢＩ配列：ＮＭ＿００３１５６．３（ｍＲＮＡ転写産物）にあたる配列番号２の配列によってコードされる。好ましくは、該画分は完全な細胞又は細胞全体の細胞膜にあり、それは細胞膜が壊れておらず、且つ／又は透過性ではないこと、有利には、非透過分子が細胞に浸透できないことを意味する。
channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. (2007) 579:703-15, ([9])）。この画分は分子量が約９０±２ｋＤａであり、非グリコシル化型のＳＴＩＭ１（８４±２ｋＤａ）と識別可能である。２つの型はウェスタンブロッティング法で検出可能である。ヒトＳＴＩＭ１分子（間質相互作用分子、ＧＯＫとしても知られる）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ配列：Ｑ１３５８６又はＮＣＢＩ配列：ＮＰ＿００３１４７．２にあたる配列番号１の配列のタンパク質である。このタンパク質は、ＮＣＢＩ配列：ＮＭ＿００３１５６．３（ｍＲＮＡ転写産物）にあたる配列番号２の配列によってコードされる。好ましくは、該画分は完全な細胞又は細胞全体の細胞膜にあり、それは細胞膜が壊れておらず、且つ／又は透過性ではないこと、有利には、非透過分子が細胞に浸透できないことを意味する。
「細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分」という表現は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の単離から生じるいずれの生体生成物を意味することが意図される。単離は、いずれかの当業者に公知の手段によって、例えば、分画遠心の後に、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００若しくはトリトン Ｎｌ ０１又はポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの非イオン性若しくはイオン性界面活性剤）の使用によって、又は膜タンパク質標的ステップ（抗体、サーモサイエンティフィック社ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン）を用いる免疫化学的手法若しくはタンパク質化学的手法によって行うことができる。ここに載せた手段は限定的なものではない。
本発明では、「細胞」という用語は、その細胞膜のレベルでのＳＴＩＭ１を発現するいずれの細胞を意味することが意図される。細胞は、単離細胞又は細胞培養物などの一連の細胞でありうる。細胞は細胞全体、言い換えれば完全且つ／又は壊れていない細胞でありうる。よってそのような細胞は透過性ではない。有利には、細胞は免疫細胞でありうる。それらの免疫細胞は、例えば、ＬＢ及びＬＴ、例えば、ＳＬＥ又はＣＬＬを患っているかどうかが知られていない対象及びマウスＬＢでありうる。これに関して、該細胞は、ＳＬＥ又はＣＬＬを患っている対象及びマウスの細胞、具体的には病的状態の治療前又は病的状態の治療中又は病的状態の治療後の細胞でありうる。代替的に健康な対象及び／又は前記病的状態を患っていない対象の細胞でありうる。使用される細胞は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分を内因的に又は組換えによって発現するいずれの細胞でもありうる。例として、細胞は、ニューロン又は初代培養ニューロン、例えば、培養脊髄神経細胞でありうる。細胞は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分を安定的又は一過的に発
現する、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、及びＨＥＫ−２９３などの宿主細胞でもありうる。細胞は、その細胞膜上にＳＴＩＭ１タンパク質を発現するために配列番号２でトランスフェクションすることができる。
現する、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、及びＨＥＫ−２９３などの宿主細胞でもありうる。細胞は、その細胞膜上にＳＴＩＭ１タンパク質を発現するために配列番号２でトランスフェクションすることができる。
本発明では、「診断方法」という用語は、ＳＬＥ及び／若しくはＣＬＬを患っている対象並びに／又はＳＬＥ及び／若しくはＣＬＬを患っていない対象を識別することを可能にするいずれの方法を意味することを意図される。本発明の方法はインビトロでの方法、すなわち、診断が望まれる対象の体外で実施される。その方法は、例えば、診断を受ける対象の生体試料で実施される検査である。
本発明の診断方法に関連して、本発明の方法に関連して検出される発現が、ＳＬＥ又はＣＬＬを患っていない対象の対照細胞の前記画分の発現のレベルと比較して、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の過剰発現である場合、これはＳＬＥ又はＣＬＬの陽性診断を下すことを可能にする。
本発明では、「過剰発現」という用語は、ＳＬＥ又はＣＬＬを患っていない対象で測定されるものと比べて量的に多い発現を意味することが意図される。例えば、過剰発現は前記病的状態を患っていない対象で測定される発現と比べて３倍多いことがある。
本発明の診断方法は、例えば、次から成るステップを含みうる。（ａ）対象の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現及び／又は活性をインビトロで検出又は定量すること、並びに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、１つ以上の対照対象、例えば、健康な対象の１つ以上の生体試料で検出又は定量される細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性と比較すること。
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、１つ以上の対照対象、例えば、健康な対象の１つ以上の生体試料で検出又は定量される細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性と比較すること。
有利には、対象又は患者の生体試料の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性が、健常な患者の試料の発現又は活性と比べて大きい場合、その対象又は患者は該疾患を患っている又は該疾患に罹患しやすいと診断される。他方では、ステップ（ａ）で決定される細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性又は発現が、（健常な）対照患者の試料の活性又は発現と比べて少ない又は同等である場合、診断は陰性であると考えることができる。健康な患者の試料と比べて、試料が少なくとも１０％多い、好ましくは少なくとも２０％多い細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を示す場合、患者の試料は陽性とみなされうる。
本発明では、「進行の予測」という用語は、将来の患者及び／又は疾患の状態に関する予後を判断することを可能にするいずれの過程を意味することが意図される。進行予測は、疾患の進行の見込み及び／又は所与の期間の疾患の考えられる転帰の評価でありうる。進行予測は短期の予測、例えば、３か月〜１年でありうる。予測は、所定の期間内に疾患が軽減する見こみ、同じ状態を保つ見込み、又は増悪する見込みを評価することを可能にし得る。
１つ特定の実施形態では、進行の予測は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現のレベルを、ＳＬＥについてはＳＬＥＤＡＩ（全身性エリテマトーデス疾患活動性指数）スコア及び／又はタンパク尿並びにＣＬＬについてはビネースコアの計算による該疾患の臨床的進行と関連付けることによって行いうる。
ＳＬＥＤＡＩスコアは文献Bombardier et al.([2])に言及されるように計算することができる。
ビネースコアは文献Binet et al.([3])に言及されるように計算することができる。
例えば、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現のレベルが、病的状態を患っていない被験者で測定される値の１０倍未満である場合、ＳＬＥＤＡＩスコアによって計算される疾患の臨床的進行は良好である（陰性的中率）。
例えば、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現のレベルが、病的状態を患っていない対象で測定される値の３倍未満である場合、ビネースコアによって計算される疾患の臨床的進行は良好である（陰性的中率）。
本発明では、「進行をモニタリングすること」という用語は、疾患が軽減するか、同じ状態を保つか、又は増悪するかを決定するいずれの方法を意味することが意図される。進行のモニタリングは、所与の瞬間に検出された細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現を以前に検出されたその画分の発現と比較することによって行うことができる。以前の検出は、例えば疾患の陽性診断の日の検出でありうる。進行のモニタリングは、少なくとも２回の検出、有利には３回以上の検出によって行うことができ、定期的に実施できる可能性もある。３回以上の検出が行われる場合、それらの検出は３か月毎から１年毎でありうる。
患者の疾患の進行のモニタリングは次からなるステップを含みうる。
（ａ）時間ｔ１に患者からとった第１の生体試料、好ましくは血中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性又は発現を検出又は定量すること。
（ｂ）患者からとった第２の生体試料、好ましくは血中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性又は発現を検出又は定量すること、第２の試料は時間ｔ１よりあとの時間ｔ２に採取される。
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、ステップ（ａ）で決定したものと比較すること。
（ａ）時間ｔ１に患者からとった第１の生体試料、好ましくは血中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性又は発現を検出又は定量すること。
（ｂ）患者からとった第２の生体試料、好ましくは血中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性又は発現を検出又は定量すること、第２の試料は時間ｔ１よりあとの時間ｔ２に採取される。
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、ステップ（ａ）で決定したものと比較すること。
ステップ（ｃ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性の比較は、疾患の進行又はステージを決定することを可能にする基準である。よって、疾患が軽減するか、同じ状態を保つか、又は増悪するかを決定することができる。
ステップ（ｂ）の試料が、ステップ（ａ）で決定される発現又は活性より少ない、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現レベルを示す場合、疾患は軽減していると結論付けることできる。逆に、ステップ（ｂ）の試料が、第１のステップで測定された発現又は活性より大きい、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を示す場合、疾患は進行している。
有利には、進行はヒト及びマウスでの治療処置に応答してモニタリングすることができる。これに関連して、モニタリングは、治療のさまざまな時点で細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現をインビトロで検出することによって、及び検出によって得られたデータを、可能であれば同一被験者で治療開始前に得られた対照値又は病的状態を患っていない対象で得られた対照値と比較することによって実施することができる。例えば、モニタリングは、治療が始まる日から開始して、約毎月、又は約２か月毎、又は約３か月毎、又は約６カ月に実施することができる。有利には、モニタリングを通して得られた結果の比較によって、治療に応えて病的状態の進行が低下すること、及び／又は疾患の発症を遅くする若しくは阻止すること、及び／又は疾患の１つ以上の症状が緩和、縮小、若しくは遅延していること、又はそうでなければ前記疾患が治癒していることが特定できるようになりうる。
この実施形態では、疾患の治療処置の有効性のインビトロ評価は次から成るステップを含みうる。
（ａ）対象の、例えば治療前の患者の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること、
（ｂ）対象の、例えば治療後の患者の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること、
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、ステップ（ｂ）で決定されたものと比較すること。
（ａ）対象の、例えば治療前の患者の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること、
（ｂ）対象の、例えば治療後の患者の生体試料中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること、
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、ステップ（ｂ）で決定されたものと比較すること。
治療の有効性は、試料（ａ）及び（ｂ）中の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現を比較することによって決定することができる。細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性が、ステップ（ａ）の試料と比べてステップ（ｂ）の試料のほうが低い場合、治療が有効であることを意味する。細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現が増えている場合、観察される変動の大きさに依存して治療が辛うじて機能している又は機能していないとみなされうる。ある実施形態では、治療が細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％の減少を伴う場合、その治療は疾患に対して治療効果があるとみなされる。治療前及び治療後の採取される生体試料は好ましくは血液試料である。
また、治療処置は前記画分と相互作用する物質を含みうる。該物質は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分と相互作用するいずれの分子でありうる。相互作用は、候補分子が細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質に結合することなどの様式でありうる。代替的には、相互作用はこのタンパク質の活性又は発現の調節でありうる。細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の活性の調節は、ＳＴＩＭ１の細胞膜への変更又はそれと結合するタンパク質との相互作用の変更に起因しうる。タンパク質の活性の調節は、細胞内カルシウムの常時流入の改変、又はストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）などの受容体刺激の間に活性化されるカルシウム流入の改変などのカルシウム流の改変をもたらしうる。発現の調節は、候補分子を適用する前に同一細胞又は同等な細胞で測定されたレベルと比較した、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の発現の増加又は減少でありうる。ＳＴＩＭ１タンパク質の発現の調節は、例えば、転写修飾、エピジェネティック修飾、又はＳＴＩＭ１タンパク質の膜への輸送に必須のグリコシル化プロセスの調節でありうる。
物質は天然に由来しても、合成でもよい。化学的又はいずれかの生物工学的方法、例えば精製によって作られたタンパク質でありうる。物質は例えば、配列番号３の配列の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の細胞外断片に対する抗体でありうる。この配列はＳＴＩＭ１の２３〜２１３位のアミノ酸に相当しうる。抗ＧＯＫ／ＳＴＩＭ−１抗体（クローン：４４ ＢＤバイオサイエンス社 参照９１０９５４）でありうる。
治療は上記で画定された物質の効果を強めるいずれの活性成分も含みうる。その活性成分は、抗ＣＤ２０抗体又はＯｒａｉ及びＴＲＰＣタンパク質などのＳＴＩＭ１タンパク質結合カルシウムチャネルを調節するタンパク質複合体と結合する他のいずれの分子でもありうる。この場合、該分子は、ヒト又は動物治療で公知のいずれの抗ＣＤ２０、例えば、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体（リツキシマブ、ヨーロッパではホフマン・ラ・ロシュ社によって販売、Ｄｒｕｇｂａｎｋ ＤＢ０００７３（ＢＩＯＤ０００１４、ＢＴＤ０００１４））、オファツムマブ（アーゼラ、グラクソ・スミスクライン社）、トシツモマブ（ＧＳＫ、ＤＢ０００８１、ＢＩＯＤ０００８５、ＢＴＤ０００８５）、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ、ロシュ社、ＤＢ０８９３５、ＧＡ１０１）、イブリツモマブ（チウキセタン、アイデック製薬、ＤＢ０００７８、ＢＩＯＤ０００６９、ＢＴＤ０００６９）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＬＦＢ社）、又はＡＭＥ−１３３ｖ（リリー社、ＬＹ２４６９２９８）でありうる。このリストは限定的ではない。
本発明の別の主題は、検知、進行の予測、進行のモニタリング、並びに／又はインビトロでのＣＬＬ及び／若しくはＳＬＥの治療薬の有効性評価のための細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分と相互作用する物質の使用に関する。
有利には、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分と相互作用する物質は、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分との特異的な相互作用に起因して細胞に入り込まずに細胞膜にとどまる。言い換えれば、物質は非透過性分子、すなわち細胞膜を横切らない分子でありうる。有利には、該物質は細胞膜を横切らないので、小胞体にあるＳＴＩＭ１タンパク質と相互作用しない。
実施例１：膜ＳＴＩＭ１を示す方法
フィコール勾配で得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｔリンパ球（ノイラミニダーゼで前処理したヒツジ赤血球を用いたロゼット法）及び単球（ネガティブ・ディプリーション法、ＣＤ４３をもたないＢ細胞キット、ステムセルテクノロジーズ（Stem Cell Technologies）社）を除去した後にＢリンパ球を精製した。ＣＤ１９陽性ＬＢの純度をフローサイトメトリーで検証し、純度は９５％超を示した。
フィコール勾配で得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｔリンパ球（ノイラミニダーゼで前処理したヒツジ赤血球を用いたロゼット法）及び単球（ネガティブ・ディプリーション法、ＣＤ４３をもたないＢ細胞キット、ステムセルテクノロジーズ（Stem Cell Technologies）社）を除去した後にＢリンパ球を精製した。ＣＤ１９陽性ＬＢの純度をフローサイトメトリーで検証し、純度は９５％超を示した。
（Ａ／Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のウェスタンブロッティング法によるＬＢのタンパク質分析から、ＳＬＥ ＬＢ（Ａ）及びあるいくつかのＣＬＬ疾患（Ｂ、ｍＳＴＩＭ１＋群）については、ＳＴＩＭ１の細網画分（８４±２ｋＤａ）にくわえて、膜型及びグリコシル化型のＳＴＩＭ１（９０±２ｋＤａ）を識別することが可能であった。このタンパク質分析では、最初に抗ＳＴＩＭ１抗体、クローンＧｏｋ／４４（ＢＤバイオサイエンス社）を用い、次いでペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア）、そして最後に化学発光（ＥＣＬアドバンスキット、ＧＥヘルスケア）で見えるようにした。
（Ｃ／Ｄ）フローサイトメトリー分析では、精製したＬＢを抗ＳＴＩＭ１抗体、クローンＧｏｋ／４４（ＢＤバイオサイエンス社）４℃で１５分間インキュベーションし、次いで洗浄した後に、抗ＳＴＩＭ１抗体の結合を、フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（ジャクソン研究所（Jackson laboratories））を用いて可視化した。生細胞中のＳＴＩＭ１の膜標識を、アイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、ベックマン・コールター社）に対して決定する。
実施例２：フローサイトメトリーによる膜ＳＴＩＭ１発現の検討
標識には、抗ＳＴＩＭ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（クローン ＧＯＫ／４４、ＢＤバイオサイエンス社、参照６１０９５４）を用いる。このｍＡｂは、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）と結合することができ、他の標識ｍＡｂ、例えば、ヒトでは、クロームオレンジ（Krome Orange）に結合した抗ＣＤ１９ ｍＡｂ（クローンＪ３−１１９、ベックマン・コールター社、参照Ａ９６４１８）及びＡＰＣ−ＡＦ７００に結合した抗ＣＤ５ ｍＡｂ（クローン Ｂｌ１ａ、ベックマン・コールター社、参照Ａ７８８３５）、並びにマウスでは、ＡＰＣ−ＡＦ７００に結合した抗Ｂ２２０ ｍＡｂ（クローンＲＡ３−６Ｂ
２、バイオレジェンド、参照１０３２３（１／２））、Ｃｙ５．５に結合した抗ＣＤ５ ｍＡｂ（クローン５３−７．３、バイオレジェンド、参照１００６２（３／４））、及びフルオレセインと結合した抗ＩｇＭ ｍＡｂ（クローンＲＭＮ−１、バイオレジェンド、参照４０６５０（５／６））との併用を可能にする。結合が無い場合は、抗ＳＴＩＭ１ ｍＡｂはフルオレセイン結合抗ＩｇＧ ｍＡｂ（抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２、ダコ社、参照Ｆ０４７９）を用いて見えるようにすることができる。
標識には、抗ＳＴＩＭ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（クローン ＧＯＫ／４４、ＢＤバイオサイエンス社、参照６１０９５４）を用いる。このｍＡｂは、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）と結合することができ、他の標識ｍＡｂ、例えば、ヒトでは、クロームオレンジ（Krome Orange）に結合した抗ＣＤ１９ ｍＡｂ（クローンＪ３−１１９、ベックマン・コールター社、参照Ａ９６４１８）及びＡＰＣ−ＡＦ７００に結合した抗ＣＤ５ ｍＡｂ（クローン Ｂｌ１ａ、ベックマン・コールター社、参照Ａ７８８３５）、並びにマウスでは、ＡＰＣ−ＡＦ７００に結合した抗Ｂ２２０ ｍＡｂ（クローンＲＡ３−６Ｂ
２、バイオレジェンド、参照１０３２３（１／２））、Ｃｙ５．５に結合した抗ＣＤ５ ｍＡｂ（クローン５３−７．３、バイオレジェンド、参照１００６２（３／４））、及びフルオレセインと結合した抗ＩｇＭ ｍＡｂ（クローンＲＭＮ−１、バイオレジェンド、参照４０６５０（５／６））との併用を可能にする。結合が無い場合は、抗ＳＴＩＭ１ ｍＡｂはフルオレセイン結合抗ＩｇＧ ｍＡｂ（抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２、ダコ社、参照Ｆ０４７９）を用いて見えるようにすることができる。
１０〜１５分間標識した後（表１）、細胞を洗い、次いでフローサイトメトリー（Ｎａｖｉｏｓ １０色システム及びＦＣ５００ ５色システム、ベックマン・コールター社）によって解析する。次いで、フローサイトメトリーによる細胞のサイズ及び構造に応じて、又は他の選ばれた標識、例えば、ヒトではＢリンパ球（ＣＤ１９＋）及びＴリンパ球（ＣＤ１９−ＣＤ５＋）、並びにマウスでは未熟／ナイーブＢ細胞（Ｂ２２０ｌｏｗ ＩｇＭ＋）及び成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉｇｈ ＩｇＭ＋）に準じて識別されるリンパ球について膜ＳＴＩＭ１標識の分析を行うことができる。
さまざまな変形が、（１）赤血球溶解ステップを（ＶｅｒｓｓａＬｙｓｅ（商標）溶解溶液、ベックマン・コールター社、参照Ａ０９７７７）用いる必要のある全血の使用、（２）フィコール・ハイパック密度勾配（ｄ＝１．０７７）で細胞を精製した後のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の使用、及び最後に、（３）ＰＢＭＣに対する除去（Ｂ細胞分離キット、ミルテニー社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）又はノイラミニダーゼで処理したヒツジ赤血球を用いるロゼット法（Tak Yan Yu D. Lymphocyte subpopulations. Human red blood cell rosettes. Clin Exp Immunol. 1975,([8])）によるＢリンパ球の精製に関係する。
図１に関する測定に関連してこのプロトコールを行った。表２ａは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の間のリンパ球並びに健常対照のリンパ球膜表面のＳＴＩＭ１発現のフローサイトメトリーよる測定を示す。各条件に関して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。最小値、最大値、及び分析した試料の数を括弧内に示
す（最小値−最大値及び検査した患者の数）。表３ａは、リンパ球の膜表面のＳＴＩＭ１に関する陽性閾値の測定は健常対照（陰性対照の平均値±３標準偏差）で得られた値から計算されることを示す。この閾値により、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を患っている陽性患者を陰性健常対照に対して識別することが可能になり、陽性割合（percentage positivity）を計算することができる。表２ｂ／３ｂ：測定をループス易発性マウスＭＲＬ／Ｌｐｒ及び対照Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで行ったことを除いて表２ａ／３ａと同様である。
す（最小値−最大値及び検査した患者の数）。表３ａは、リンパ球の膜表面のＳＴＩＭ１に関する陽性閾値の測定は健常対照（陰性対照の平均値±３標準偏差）で得られた値から計算されることを示す。この閾値により、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を患っている陽性患者を陰性健常対照に対して識別することが可能になり、陽性割合（percentage positivity）を計算することができる。表２ｂ／３ｂ：測定をループス易発性マウスＭＲＬ／Ｌｐｒ及び対照Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで行ったことを除いて表２ａ／３ａと同様である。
実施例３：総ＳＴＩＭ１発現の測定
細胞膜及び小胞体膜に含まれるさまざまなＳＴＩＭ１画分を測定するために、細胞を透過処理した後に総ＳＴＩＭ１発現を測定した。実際には、予め精製し、固定（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％のパラホルムアルデヒドの溶液、４℃で１０分間）した後、透過処理（ＰＢＳ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％中の０．１％のサポニンの溶液、４℃で１０分間）した５０００００個のＬＢについて分析を行う。標識には、抗ＳＴＩＭ１ ｍＡｂ（クローンＧＯＫ、ＢＤバイオサイエンス社）を用い、フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ抗体（抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２、ダコ社、参照Ｆ０４７９）を用いて見えるようにする。
細胞膜及び小胞体膜に含まれるさまざまなＳＴＩＭ１画分を測定するために、細胞を透過処理した後に総ＳＴＩＭ１発現を測定した。実際には、予め精製し、固定（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％のパラホルムアルデヒドの溶液、４℃で１０分間）した後、透過処理（ＰＢＳ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％中の０．１％のサポニンの溶液、４℃で１０分間）した５０００００個のＬＢについて分析を行う。標識には、抗ＳＴＩＭ１ ｍＡｂ（クローンＧＯＫ、ＢＤバイオサイエンス社）を用い、フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ抗体（抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２、ダコ社、参照Ｆ０４７９）を用いて見えるようにする。
図２に関する測定に関連してこのプロトコールを行った。
表４は、健常対照（陰性対照の平均値±３標準偏差）で得られた値から計算される総ＳＴＩＭ１関する陽性閾値の測定を示す。この閾値（例では５．０）により、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を患っている陽性患者を陰性患者に対して識別することが可能になり、陽性割合を計算することができる。
実施例４：ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定
ゲノムＤＮＡを予め精製したＢリンパ球から抽出し（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ１５ＤＮＡ血液キット、キアゲン社）、次いで定量した（ナノドロップ２０００ｃ、サーモサイエンティフィック社）。ダウディ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）及びラモス（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）ヒト細胞株をＢリンパ球対照として用いた。２つの手法（３ａ及び３ｂ）を用いて、ＳＴＩＭ１プロモーターのＤＮＡのメチル化状態を決定した。
ゲノムＤＮＡを予め精製したＢリンパ球から抽出し（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ１５ＤＮＡ血液キット、キアゲン社）、次いで定量した（ナノドロップ２０００ｃ、サーモサイエンティフィック社）。ダウディ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）及びラモス（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）ヒト細胞株をＢリンパ球対照として用いた。２つの手法（３ａ及び３ｂ）を用いて、ＳＴＩＭ１プロモーターのＤＮＡのメチル化状態を決定した。
手法３ａ：この第１の手法は、ＣＣＧＧモチーフ内ＣｐＧモチーフのメチル化状態に対
して感受性があるＨｐａＩＩ及びＣｐＧモチーフのメチル化状態に対して非感受性であるＭｓｐＩなどの制限酵素の使用に基づく。実際には、２００ｎｇのＤＮＡを、緩衝液のみ、ＨｐａＩＩ酵素（１０ユニット、ニュー・イングランド・バイオラボ社、参照ｒ０１７１）、又はＭｓｐＩ酵素（１０ユニット、ニュー・イングランド・バイオラボ社、参照Ｒ０１０６）の存在下で３７℃にて１２時間インキュベーションする。
して感受性があるＨｐａＩＩ及びＣｐＧモチーフのメチル化状態に対して非感受性であるＭｓｐＩなどの制限酵素の使用に基づく。実際には、２００ｎｇのＤＮＡを、緩衝液のみ、ＨｐａＩＩ酵素（１０ユニット、ニュー・イングランド・バイオラボ社、参照ｒ０１７１）、又はＭｓｐＩ酵素（１０ユニット、ニュー・イングランド・バイオラボ社、参照Ｒ０１０６）の存在下で３７℃にて１２時間インキュベーションする。
手法３ｂ：この第２の手法はＤＮＡ断片化の最初のステップ（ｄｓＤＮＡ Ｓｈｅｒａｓｅ、４２℃で２０分、次いで酵素を不活性化するために６５℃で５分、ザイモリサーチ社、参照Ｅ２０１８）を要する。次いで、抗５−メチルシトシン抗体及びプロテインＡの存在下でＤＮＡ断片をインキュベーションする（メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＩＰ）キット、ザイモリサーチ社、参照Ｄ５１０１）。最後に、ＤＮＡ／抗体／プロテインＡ複合体を単離した後、抗体を不活化する（７５℃、５分）。
手法３ｃ（このステップは手法３ａ及び３ｂに共通する）：標的領域をゲノムのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅する。増幅にために維持されるＰＣＲサイクルは次の通り。初めに初期変性ステップ（９５℃、５分）、次いで変性フェーズ（９５℃、３０秒）、ハイブリダイゼーションフェーズ（６０℃、３０秒）、及び伸長フェーズ（７２℃、１分）を含むサイクルを３５回、最後に最終伸長ステップ（７２℃、５分）。
手法３ａ＋３ｃの読み取り：ＨｐａＩＩチューブの増幅を、酵素を含まないチューブ（１００％メチル化）及びＭｓｐＩチューブ（０％メチル化）と比較する。
手法３ｂ＋３ｃの読み取り：メチル化ＤＮＡ ＩＰチューブの増幅は、抗５−メチルシトシン抗体によって捕えられたゾーン（zone）のメチル化状態に関する情報を提供する。メチル化ＤＮＡ ＩＰチューブの増幅を、ＩＰを行わなかったチューブ（１００％メチル化）と比較する。
結果を図３に示す。
実施例５：細胞膜表面のＳＴＩＭ１の測定は疾患の活動性の状態についての情報を提供する
図４に図示されるように、細胞膜表面のＳＴＩＭ１の測定は疾患の活動性の状態につい
ての情報を提供する。細胞膜表面にＳＴＩＭ１分子（ｍＳＴＩＭ１）が存在しないことは、ＣＬＬを患っている患者における抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療への生体内反応に関する情報を提供することを表６は示す。
図４に図示されるように、細胞膜表面のＳＴＩＭ１の測定は疾患の活動性の状態につい
ての情報を提供する。細胞膜表面にＳＴＩＭ１分子（ｍＳＴＩＭ１）が存在しないことは、ＣＬＬを患っている患者における抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療への生体内反応に関する情報を提供することを表６は示す。
参考文献リスト
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2- Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, Caron D, Chang CH. Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum 1992;35:630-40.
3- Binet JL, Lepoprier M, Dighiero G, Charron D, D'Athis P, Vaugier G, Beral HM,
Natali JC, Raphael M, Nizet B, Follezou JY. A clinical staging system for chronic lymphocytic leukaemia: prognostic significance. Cancer. 1977;40:855-64.
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5- Novak U, Oppliger Leibundgut E, Hager J, Muhlematter D, Jotterand M, Besse C,
Leupin N, Ratschiller D, Papp J, Kearsey G, Aebi S, Graber H, Jaggi R, Luthi JM, Meyer-Monard S, Lathrop M, Tobler A, Fey MF. A high-resolution allelotype of B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). Blood. 2002;100:1787-94.
6- Liossis SN, Kovacs B, Dennis G, Kammer GM, Tsokos GC. B cells from patients with systemic lupus erythematosus display abnormal antigen receptor-mediated early signal transduction events. J Clin Invest. 1996;98:2549-57.
7- Duhren-von Minden M, Ubelhart R, Schneider D, Wossning T, Bach MP, Buchner M,
et al. Chronic lymphocytic leukaemia is driven by antigen-independent cell-autonomous signalling. Nature. 2012;489:309-12.
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9. Mignen O, Thompson JL, Shuttleworth TJ. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. (2007) 579:703-15.
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Claims (15)
- 対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び／又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を診断するための剤であって、前記対象からの血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現をインビトロで検出するための、前記対象からの血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分に対する抗体を含む、前記剤。
- さらにＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態を測定するための制限酵素又は抗体を含む、請求項１に記載の剤。
- 前記発現が、ＳＬＥ又はＣＬＬを患っていない対象の対照細胞中の前記画分の発現のレベルと比較して、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の過剰発現であり、ＳＬＥ又はＣＬＬの陽性診断が可能になる請求項１又は２に記載の剤。
- 細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の前記検出が、細胞の小胞体にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分を検出することも含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
- 細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現の前記検出が、ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の剤。
- 前記細胞膜が、単離された完全且つ／又は壊れていない細胞の細胞膜である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の剤。
- 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び／若しくは慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の進行を予測するための剤、並びに／又はＳＬＥ及び／若しくはＣＬＬの進行をモニタリングするための剤であって、血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現をインビトロで検出するための、対象からの血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分に対する抗体を含む、前記剤。
- さらにＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態を測定するための制限酵素又は抗体を含む、請求項7に記載の剤。
- 細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の前記検出が、細胞の小胞体にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分を検出することも含む、請求項７又は８に記載の剤。
- 細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現の前記検出が、ＳＴＩＭ１プロモーターのメチル化状態の測定である、請求項８又は９に記載の剤。
- 進行の予測が、ＳＬＥについてはＳＬＥＤＡＩ（全身性エリテマトーデス疾患活動性指数）スコア及びＣＬＬについてはビネースコアを計算することによって、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現のレベルを該疾患の臨床的進行と相互に関連付けることによって実施される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の剤。
- 前記細胞膜が、単離された完全且つ／又は壊れていない細胞の細胞膜である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の剤。
- 前記進行を治療処置に応答してモニタリングする、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の剤であって、
前記モニタリングが、インビトロでの評価ステップ（ａ）〜（ｃ）を含むものであり：
（ａ）治療前の患者の血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること；
（ｂ）治療後の患者の血液試料から単離された細胞の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を検出又は定量すること；及び
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性を、ステップ（ｂ）で決定されたものと比較すること、を含み、
前記治療の有効性が、細胞膜にあるＳＴＩＭ１タンパク質の画分の発現又は活性が、上記ステップ（ａ）の試料と比べて上記ステップ（ｂ）の試料のほうが低い場合、治療が有効であるものである、前記剤。 - 前記抗体が配列番号３の配列のＳＴＩＭ１タンパク質の断片に対する抗体である、請求項１３に記載の剤。
- 前記治療処置が抗ＣＤ２０抗体も含む、請求項１３又は１４に記載の剤。
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