JP6787904B2 - 高度に正に荷電したタンパク質のイムノアッセイ - Google Patents

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Description

本発明は、ヒト関節液試料中のＦＧＦ−１８タンパク質に対する抗体の親和性を評価するための、及びＦＧＦ−１８タンパク質の定量化のためのイムノアッセイに関する。
イムノアッセイは、複雑な混合物（例えば、生物学的マトリックス）間の分子を特異的に結合する抗体の能力を開発する生化学的試験である。この能力は、認識された分子、いわゆる分析物、又はその逆を検出するか又は定量化するために使用され得、すなわち抗原は特定の抗体を捕捉し、そして定量化を可能にするために使用され得る。結合事象は、測定可能なシグナルの生成に関連し、このシグナルは通常、既知の濃度で参照シグナルにより生成されるシグナルと比較される。最初のイムノアッセイは、全て放射性ヨウ素による抗体の標識に基づかれていた（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）。６０年代には、酵素に基づくイムノアッセイ（酵素イムノアッセイＥＩＡ、又は酵素結合免疫吸着アッセイＥＬＩＳＡ）を用いた最初の実験が存在し、これは長年にわたって最も普及してきた。今日では、酵素から蛍光プローブ、ＤＮＡ、等まで、使用され得るいくつかの種類の標識が存在する。さらに、未標識の試薬も使用され得る。
異なるイムノアッセイ技法、例えばAlphaLISA 技法、Gyrolab 技法及びImperacer 技法が現在使用されている。
Gyrolabイムノアッセイプラットフォームは、液体ハンドリングシステム、蛍光検出システム及びコンパクトディスク（ＣＤ）マイクロラボラトリにより構成されたマイクロ液体ベースの自動化システムである。イムノアッセイは、マイクロ構造中に埋め込まれた親和性捕捉カラム上でＣＤに実施される。ダイナミックレンジ、感度及びアッセイのタイプに関して異なった性能を有するために、異なった分析物量の処理を可能にする異なった種類のＣＤが存在する。ＣＤには、１２〜１４のセグメントがあり、各セグメントは８つのマイクロ構造により構成されている。各マイクロ構造は、試薬、洗浄緩衝液及び分析物の通過を可能にし、そしてストレプトアビジンビーズにより予め充填された親和性のカラムで終わるナノ液体の複雑なシステムを含む。イムノアッセイは、ＣＤ回転により生成される遠心力を用いることにより行われ、すなわち共通試薬は、共通チャネル（各セグメントに１つ）中の液体ハンドリングシステムにより分配され、試料は、相互汚染を回避するために個々のインレットに堆積される。ＣＤのゆっくりした回転は、オーバフローチャネルを用いて余分な体積を除去することにより体積の規定を可能にし、すなわち疎水性バリアがカラムへの液体の通過を妨げる。体積規定の後、ＣＤのより速い回転が疎水性バリアの破壊を可能にし、そして液体はカラムを通して流れることができる。第１の試薬は、ストレプトアビジンビーズに結合するために、ビオチンにより標識されるべきである。イムノアッセイの終了時（例えば、サンドイッチイムノアッセイにおける二次Ａｂ）、蛍光プローブにより標識された試薬が添加される。ワークステーション内部のレーザーは、蛍光体を励起することができ、そして次に、蛍光応答が読みとられる。試薬添加の異なったステップ間で、イムノアッセイをより特異的にするいくつかの洗浄ステップが存在する。この機器は所定のプロトコルを有するが、しかし最良の結果を得るために方法を最適化するために、多くのパラメーター（洗浄緩衝液の組成、洗浄ステップの数、ＣＤスピニングの長さ）を変えることができる。異なったイムノアッセイフォーマット（サンドイッチ、直接的、間接的、競合及びブリッジング）が設定され得る。唯一の要件は、ビオチン化試薬及び蛍光プローブ標識試薬の利用可能性である。
一態様において、本発明は、イムノアッセイ用のヒト関節液試料を前処理する方法であって、
− ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
− 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
− 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を定量化する方法であって、以下のステップ：
ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
− ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
− 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
− 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含み、
ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
ｅ）前記抗体が前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的に結合して抗体−タンパク質複合体を産生する条件下で、前記カラム中で、前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と接触させ、
ｆ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
ｇ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
ｈ）産生された応答を測定し、
ｉ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
を含む、方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を自動で定量化する方法であって、以下のステップ：
ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
− ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
− 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
− 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含み、
ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
ｅ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ自動輸送するための注入手段を提供し、
ｆ）前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料が前記カラムへ輸送される前に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
ｇ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ輸送し、それにより、前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と、高度に正に荷電した前記タンパク質に前記抗体が特異的に結合する条件下で接触させて、抗体−タンパク質複合体を産生し、
ｈ）前記ステップｇ）の後に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
ｉ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
ｊ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
ｋ）産生された応答を測定し、
ｌ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
を含む、方法を提供する。
図１は、一級アミンとスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンとの反応を示す。ＮＨＳは反応中の脱離基（副産物）であることを注意すること。脱離基及び任意の未反応ビオチン試薬は、脱塩ステップの間、除去される。 図２は、ａｌｅｘａ−６４７標識Ｆ０５との組み合わされたインキュベーションの後に得られたＲＬＵに対する分析物の対数濃度のグラフを示す。３回の反復の平均結果、エラーバーはＳＥＭを示す。 図３は、ａｌｅｘａ−６４７標識Ｆ４４との組み合わされたインキュベーションの後に得られたＲＬＵに対する分析物の対数濃度のグラフを示す。３回の反復の平均結果、エラーバーはＳＥＭを示す。 図４は、独立した４回の実験において、ａｌｅｘａ−６４７標識ｍＡｂ Ｆ０５との組み合わされたインキュベーションの後に得られた平均ＲＬＵに対する分析物の対数濃度のグラフを示す。３回の反復の平均結果。 図５は、独立した４回の実験において、ａｌｅｘａ−６４７標識Ｆ４４との組み合わされたインキュベーションの後に得られた平均ＲＬＵに対する分析物の対数濃度のグラフを示す。３回の反復の平均結果。 図６は、Ｆ４４とＦ０５との間の結合の差の分析を示す。（Ａ）ＣＬＩＰＳ不連続マトリックスデータ組内のすべての約４０００個のペプチドの散布図。各ペプチドに関しては、Ｆ０５及びＦ４４について得られたＥＬＩＳＡ値が、ＸＹscatterとしてプロットされた。赤の線；４５°基準。緑色の線；ＬＯＥＳＳスプラインフィット。１つのデータ点が、図Ｚ−Ｃにわたってトレートするためにマゼンタ色に着色された。（Ｂ）図Ａから得られたＬＯＥＳＳ正規化されたデータ。（Ｃ）図ＢのＭＡ−プロット。０．５及び−０．５以上又は以下の点が記録され、そして着色される。（Ｄ）Ｃにおいて記録されたペプチドの頻度表。青色の線は、Ｆ４４に対するより高い結合を示した。黄色の線は、Ｆ０５に対するより高い結合を示す。 図７は、相同タンパク質の構造上への結合領域の可視化を示す。２１〜２７は緑色に着色されている。７〜２１は黄色に着色されている。１５３〜１６４は青色に着色されている。 図８は、平均ＲＬＵに対する分析物の対数濃度のグラフを示す。３回の反復の平均結果、エラーバーはＳＥＭを示す。 図９は、種々のＭＲＤを有するスパイク試料（ＳＳ）及び関節液ブランク試料（ＳＦ）のＢＣＣの結果を示すヒストグラムを示す。３回の反復の平均、エラーバーはＳＥＭを示す。 図１０は、ヒアルロニダーゼ消化を伴って（処理済）又はそれを伴わないで（未処理）、３種の濃度レベル（ＱＣ−低＝３０ｐｇ／ｍｌ、ＱＣ−中位＝５００ｐｇ／ｍｌ、ＱＣ−高＝１５０００ｐｇ／ｍｌ）でＲｅｘｘｉｐ（登録商標。以下同じ。） ＨＮにおいて調製されたＱＣ試料の平均ＲＬＵの結果を表すヒストグラムを示す。３回の反復の平均、エラーバーはＳＥＭを表す。
発明の詳細な説明
本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組込まれる。本明細書で論じられた出版物及び出願は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格を有さないことの許可として解釈されるものではない。さらに、材料、方法及び実施例は、単なる例示的であり、限定を意図するものではない。
矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するであろう。
特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技法及び科学用語は、本明細書の主題が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、本発明の理解を容易にするために、以下の定義が提供される。
用語「含む（comprise）」は一般的に、包含の意味で使用され、すなわち１又は２以上の特徴又は構成要素の存在を可能にする。
明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。
本明細書において使用される場合、用語「ＦＧＦ−１８化合物」、「ＦＧＦ−１８タンパク質」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を維持するタンパク質を意図する。ＦＧＦ−１８は、その成熟形では、天然であっても、組み換え形又は切断形でもあり得る。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物学的活性は、特に、軟骨細胞又は骨芽細胞増殖（国際公開第９８／１６６４４号を参照のこと）又は軟骨形成（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照のこと）の増強を含む。天然又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞により発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は最初に、ｚＦＧＦ−５と命名され、そして国際公開第９８／１６６４４号に完全に記載されている。配列番号１は、天然のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に対応し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）から成るシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟形は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）のアミノ酸配列（１８０個のアミノ酸）に対応する。本発明において、ＦＧＦ−１８は、国際公開第２００６／０６３３６２号出願により教示されるように、組み換え方法により生成され得る。発現系及び条件に依存して、本発明のＦＧＦ−１８は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基又は分泌のためのシグナル配列を有する組換え宿主細胞において発現される。大腸菌などの原核宿主中で発現される場合、ＦＧＦ−１８は、その配列のＮ末端に追加のＭｅｔ残基を含む。例えば、ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌において発現される場合、Ｎ−期（１位）のＭｅｔ残基で始まり、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）が続く。
本明細書において使用される場合、用語ＦＧＦ１８の「切断された形態（truncated form）」とは、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれらから成るタンパク質のことである。好ましくは、ＦＧＦ−１８タンパク質の切断された形態は、Ｍｅｔ残基（Ｎ末端における）で始まり、続いて、野生型ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）が続く、「ｔｒＦＧＦ−１８」（１７０個のアミノ酸；ｒｈＦＧＦ１８又はスプリフェルミン（sprifermin）としても知られている）と呼ばれるポリペプチドである。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、配列番号２で表される（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０が配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に対応する）。ｔｒＦＧＦ−１８は、大腸菌において生成される、組換え切断形のヒトＦＧＦ−１８である（国際公開第２００６／０６３３６２号を参照のこと）。ｔｒＦＧＦ−１８は、成熟ヒトＦＧＦ−１８に類似する活性を示すことがこれまで示されており、例えば、それは軟骨細胞増殖及び軟膏沈着を増強し、種々の軟骨組織の修復及び再構成をもたらす（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照のこと）。
用語「正に荷電した（positively charged）」とは、負に荷電したアミノ酸よりもより正に荷電した塩基性アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）を含み、そして／又は正の荷電したアミノ酸がそれらの表面上に暴露されるよう折りたたまれ、そして／又は媒体のｐＨで（前記媒体のｐＨが、ｐＩ、すなわち等電点よりも低い場合）、全体的な正電荷を示すタンパク質のことである。それらのタンパク質は通常、塩基性である（ｐＩは通常、７よりも高い）。用語「高度に正に電荷したタンパク質（high positively charged protein）」とは、非常に塩基性であり、すなわち高いｐＩ、好ましくは均９．５又は９．５以上のｐＩを有するタンパク質のことである。リゾチーム、ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−１８は例えば、高度に正に荷電した塩基性タンパク質である。この用語は、十分に当業者の知識の範囲内である。
用語「室温（room temperature）」とは、通常約１５〜２５℃、例えば約１５℃、１８℃、２０℃、２２℃又は２５℃の範囲の温度を指す。
プロジェクト相によれば、例えば初期相においては、迅速且つ汚れた評価のみが要求される、異なったタイプの方法が必要とされるか、又は１つの方法が認定され得る。ＧＬＰ及び臨床研究のためには、方法を検証する必要がある。さらに、あらゆる場合において、免疫原性の評価が要求されるわけではない。
生物学的マトリックスにおける薬物濃度（ＰＫ）及び抗−薬物抗体（ＡＤＡ）の測定は、薬物開発の重要な側面である。毒物動態学的、薬物動態学的及び生物学的同等性研究の結果は、医薬品の安全性及び有効性を支持する重要な決定を行うために用いられる。従って、使用される適用された生物分析法は、信頼性の高い結果を得るために、十分に特徴づけられ、十分に検証され、そして満足のいく標準に文書化されていることが重要である。マーケッティング承認申請書に提出された非臨床（薬理毒性）試験は、優良試験基準（Good Laboratory Practice）に準拠して実施されなければならない。非ＧＬＰ前臨床研究で使用される方法は、適格である必要があるが、しかしＧＬＰ施設で必ずしも開発されるべきではなく、そして十分に検証されるべきである。ヒト生物分析研究は、２００４／１０／ＥＣ指令で定義されているように、ＧＬＰの範囲外であり、優良臨床基準（ＧＣＰ）の原則に従うべきである。規制当局（ＦＤＡ、ＥＭＡ）は、検証された方法を使用して生成されたデータの信頼性を保証するために従わなければならないＰＫ及びＡＤＡアッセイの検証を説明する公式ガイドラインを発表した。さらに、科学コミュニティによって書かれた白書は、公式ガイドラインの異なった版の間で、現場で発生する新しいトピックをカバーしている。アッセイのライフサイクルは、次の３種の一般的相に分類される：方法の開初、試験前の検証及び試験中の検証。方法の開発の間、アッセイ概念が評価され、これは試験前の検証の間、確認され、そして試験中の検証相の間、適用される。試験前検証相は、方法の最適化が行われ、そしてアッセイが実行可能であるとみなされた後に行われ：これは、必要に応じて、決定的なアッセイ試薬が同定され、そして生成されることを意味する。利用可能な試薬に基づいて、最も適切な技法が選択され、アッセイフォーマット及びバッチサイズが定義される。マトリックス効果を最小にするために最小必要希釈度（ＭＲＤ）が選択され、そして方法の範囲が定義され、そして感度が確認される。標準曲線濃度、及び較正データに曲線を適合するための回帰モデルは、方法の開発の間、確立されるべきである。実験相を開始する前、検証相が生成されるべきである。文書には、方法の意図された使用の説明と、検証される性能パラメーターの概要、提案された実験の概要、及び評価された各性能パラメーターについての標的の受容基準を含むべきである。検証作業の完結の後、包括的な報告が作成されるべきである。その報告は、アッセイ性能結果、及び受容基準を侵害することなくアッセイが使用され得る条件に関連する任意の他の関連情報を要約する。分析結果の性能の許容性及び信頼性を保証するために不可欠である生物分析方法の主な特徴は、次のものである：選択性、定量の下限、方法の範囲、応答関数（較正曲線性能）、正確性、精度、マトリックス効果、生物学的マトリックス中の分析物の安定性、及び貯蔵及び処理条件の全期間下での貯蔵溶液及び、作業溶液。
薬物又は抗薬物抗体の定量化のためのイムノアッセイは、使用される抗体の品質に密接に依存する。これは、異なった技法及びフォーマットを使用することができるが、しかし出発点は常に、良好な抗体対でなければならないことを意味する。イムノアッセイ中の抗体の役割は、ＰＫアッセイのための捕捉及び検出試薬、及び免疫原性アッセイのための陽性対照を含む。いくつかのタイプのアッセイフォーマット及び試薬が同じ用途に考慮される場合、異なったタイプの試薬の生成を並行して開始することが推薦され、適切且つ前もって特定された特性を有する最適な試薬を得る可能性が高まる。適切なリスクアセスメントの実施は、リソース及びタイムラインを適切に平衡化する機会を提供する。最良の戦略は、問題の研究の目的、薬物開発プログラムの段階、可能性あるアッセイフォーマット、試験される試料のマトリックスの起源及びタイプ、必要とされるアッセイ感度及び特異性、並びに複数の分析物に対する試薬反応性の潜在的必要性を考慮することである。収集される有用な情報の例は、次のものを含む：（ａ）試薬と標的分析物との間の特異的且つ選択的相互作用と同様に感度についての要件；（ｂ）他のアッセイ成分、例えば異種抗体との潜在的非特異的相互作用及びＰＫアッセイにおけるそれらの相互作用を低減する必要性；（ｃ）標的試料集団（例えば、リウマチ因子）における潜在的交差反応性を低減する必要性；（ｄ）分析物アイソフォームとそのタンパク質分解副産物との間の識別の必要性；（ｅ）より大きな複合体の場合に比較して遊離分析物を検出するための要件；（ｆ）酸による試料の有無にかかわらず、治療薬に結合される抗薬物抗体の検出。各アッセイは、異なった抗体型を必要とする：すなわち初期ＭＡＢ治療発現プログラムの間、標的特異的試薬が生成されるにつれて、あまり望ましくなくなるかもしれない一般的抗−ＩｇＧ試薬が使用され得る。
どのような技法を使用しても、良好な原材料、特に抗体がなければ、アッセイの良さは影響される可能性がある。この理由から、目的の抗体を良好に選択するためには、Gyrolabを用いての親和性決定及びＣＬＩＰＳ技法を用いてのエピトープマッピングが検討された。新規技法の評価は、特定の必要性（例えば、要求される感度、柔軟性、容易な移行）に基づいて使用するための良好なプラットフォームを実装しようとするプロジェクトの相を考慮して行われた。
Gyrolabは、ヒト関節液中の高度に正に荷電した薬物、例えばＦＧＦ−１８タンパク質、好ましくはスプリフェルミンを定量化するＰＫ方法を開発するために選択された。次の２つの困難性が、方法の開発の間、遭遇した：分析物(薬物)の高等電点及びマトリックス（試料）の高粘度。課題は、分子の疾病に関する問題を軽減する助けとなる手段（分析希釈用緩衝液のタイプ、洗浄手順、等）、及び分析物安定性を損なうことなくマトリックスを流動化できる資料前処理を見出すことである。
抗体親和性の決定は、使用される最良のフォーマットのより良好な理解のため、又は新規イムノアッセイの開発の場合、可能性ある落とし穴を理解するために大きな価値を有する。
生物学的相互作用においては、次の２つのパートナーがある：低分子量のものは通常、リガンド（Ｌ）と呼ばれ、そして巨大分子結合パートナーは受容体（Ｒ）と呼ばれる。免疫複合体においては、抗体は受容体として見なされ、そして分析物はリガンドとして見なされる。溶液においては、受容体の全濃度は、受容体遊離及びリガンド結合の割合により構成される（受容体はリガンドのための単一の結合部位を有し、結果的に、任意の分子は遊離しているか、又は結合されていることを仮定して）。同様に、任意のリガンド分子は、遊離しているか、又は受容体分子に結合されていなければならない。これは、それらの大量保存式につながる：
式中、[Ｒ]及び[Ｌ]は、それぞれ受容体及びリガンドの総濃度であり、[Ｒ]f及び[Ｌ]fは、２つの分子の遊離濃度であり、そして[ＲＬ]は、受容体−リガンド複合体の濃度である。
このシステムにおいては、遊離状態から結合状態への分子の連続的通過が存在するであろう。
式中、Ｋonは複合体会合についての二次速度定数であり、そしてＫoffは複合体解離についての一次速度定数である。
複合体の会合及び解離の速度が等しくなる場合、平衡に達する。この平衡の位置は、解離定数Ｋdの観点から定量化される：
異なる受容体−リガンド複合体の相対的親和性は、Ｋd値に反比例し、結果的に、同じ分子への結合の強さは、異なった結合パートナーについてのＫd値を用いて比較され得る。会合定数（Ｋａ）は、Ｋdの逆である。
ほとんどの場合、受容体とリガンドとの間の親和性は、受容体との有意な結合を達成するためには、大過剰のリガンドが必要とされるようなものであり；ほとんどの実験条件下で、二元複合体の形成が遊離リガンドの濃度の変化がほとんどないまま進行する。従って、会合反応は、擬一次反応速度論で進行する：
式中[ＲＬ]ｔは時間ｔでの二元複合体ＲＬの濃度であり、[ＲＬ]ｅｑは平衡時での二元複合体の濃度であり、そしてｋobsは平衡に達するための擬一次速度定数に対する実験的に決定された値である。
可逆的結合に関しては、ｋobsの値は、リガンドの濃度に正比例する：
従って、異なるリガンド濃度でのｋobsの値を決定することができる。リガンド濃度の関数としてｋobsをプロットすることにより、ｋonに等しい傾斜及びｋoffに等しい切片を有する線形近似が得られる。
受容体−リガンド相互作用を研究する最も一般的で且つ容易な方法は、平衡が確立された後に待つことである。なぜならば、それらの反応速度は、通常、短期間で起こるからである。
平衡状態では、ＲＬ複合体の濃度は一定的であり、そして複合体会合及び解離の速度は等しい。
ｋon／ｋoffが会合定数Ｋａに等しいことを考慮して：
親和性測定のために現在使用される種々の技法が存在し；文献によれば、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）及びＫｉｎＥｘＡが最も使用される。
Gyrolab技法は、抗体のその抗原に対する親和性を評価するために使用された。この技法は、平衡状態で遊離抗原の量を高めながら、目的の抗体への結合のための固定された抗原の競争に基づかれる。溶液中の遊離抗原に結合されていない抗体のみが、固定された抗原により捕捉され、検出のための蛍光団（すなわち、蛍光色素）を用いてその濃度の決定を可能にする。開発された手順によれば、親和性の決定のために必要とされるステップは、次の通りである：
・抗原のビオチン化、及び蛍光色素、例えばＡｌｅｘａ−６４７による抗体の標識、
・捕捉条件に関する調査、
・固定されたＡｂ濃度の決定、
・結合平衡時間の決定、
・得られたＫDの確認：Ａｂ濃度における反復及び変動。
試薬の標識は重要なステップであるので、捕捉試薬（スペリフェルミン）は、異なった比率のビオチンにより標識され、そして標識されていない抗原と比較して抗体を捕捉するために使用された。スペリフェルミンは、高度に正に荷電したタンパク質であり、従ってカラム（例えば、Ｇｙｒａｌａｂ技法のＣＤカラム）への分析物の高い非特異的結合が観察された。この効果を低減するために、より厳しい洗浄ステップを有する改変された方法が都合よく使用された。この選択された捕捉試薬は、１：２〜１：２０の比（スペルフェルミン：ビオチン）のビオチン（例えば、１：２、１：１０又は１：２０）、好ましくは１：５〜１：１５の比のビオチン、又はより好ましくは１：１０の比のビオチンにより標識されたスペリフェルミンであった。捕捉試薬が確立されると（スペリフェルミンが好ましくは、１：１０で標識されると）、それを用いて、固定抗体（Ａｂ）濃度を決定し：評価下での両抗体の標準曲線が遊離抗原とそれらの抗体を前もってコングすることなく分析された。最良濃度の選択は、次の２つの要因に基づかれた：選択された濃度が曲線の直線部分に存在するべきであり、そして応答は、プレミックス中の抗原濃度の上昇に伴ってシグナル低減のために十分な余地を可能にするほど十分であったに違いない。ＦＧＦ−１８に対する次の２種の抗体が使用されて来た：Ｆ０５及びＦ４４。蛍光色素により標識されると、両標識された抗体は、０．１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度、例えば０．１又は０．５ｐＭ、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．５、１０、５０又は１００ｎＭの濃度で使用された。好ましくは、濃度は、０．０５〜１ｎＭの範囲である。さらに好ましい濃度は、０．１ｎＭ又は約０．１ｎＭであった。選択された濃度での２種のｍＡｂは、異なった量の抗原（０．５ｐＭ〜２μＭ）と共に、１時間（１ｈ）又は２４時間（２４ｈ）、インキュベートされた。１時間及び２４時間のインキュベーションの後に得られた応答は非常に類似し、従って、計算されたＫDは２つのｍＡｂで同等であった。この時点で平衡がすでに達成されていると考えて、次のすべての実験は、開発全体をスピードアップするために、好ましい条件下で１時間の予備混合で実施された。それらの予備的データはまた、最初のＫD推定のためにも有用であった。Ｆ０５ ｍＡｂのＫDは約１ｎＭ であったが、ｍＡｂ Ｆ４４は約２００ｐＭの推定されたＫDでより高い親和性を有するように見えた。ＫDの良好な計算を行うために、ＫD制御実験が実施され、そして満足される条件は、固定されたｍＡｂ濃度と、計算されたＫDとの間の比率が１以下か又は１に等しいことであった。両者の場合、この要件は満たされており；Ｆ０５についての比率は、約０．０９であり、そしてＦ４４については、約０．２であり、１を大きく下回った。
それらの実験は、開発された手順を用いて評価を４回、反復し、固定されたｍＡｂ濃度を変えることにより確認された。Ｆ０５は、安定した応答で強固な結果を与え、そしてＫD制御方法で実施されたすべての実験で約１ｎＭの推定親和性定数を保存した。Ｆ４４は、約３００ｐＭである、Ｆ０５よりも高い親和性を示し、しかし結果は再現性が低く、この挙動は使用された試薬に起因する可能性があることを示唆しており、より高い親和性の抗体で、その決定はより困難である。
抗体の品質を評価するための第２の側面は、エピトープマッピングであった。それらの抗体はサンドイッチイムノアッセイに使用されるので、認識されたエピトープは、最良の抗体対を選択するのみならず、またデータ解釈のための有用な情報となり得る。抗体により認識される正確なエピトープを知ることにより、無傷の薬物又は消化産物を特異的に認識するアッセイの能力、薬物開発の間、ＰＫデータ解釈のために非常に有用な情報を評価することが可能である。エピトープマッピングは、Pepscan Presto (The Neederland)に従って実施された。この技法は、最も一般的な技法として線状エピトープのみならず、また、短時間でコンホメーション及び断続的エピトープも認識するその能力のために選択された。抗原（スペリフェルミン）は、そのようにして、及び単一残基突然変異誘発で試験された約４０００のオーバーラッピングペプチドのライブラリーにおいて転換された。さらに、それらは、次のようなＣＬＩＰＳ技法を用いてループに適合された：突然変異誘発、及び最終的に、全てのタンパク質長からの配列の並置。すべてのそれらのペプチド組が、使用される抗体の結合性質について最適化されたPepscanベースのＥＬＩＳＡにおいて試験された。２種の抗体は非常に類似する結合パターンを示したが、しかしそれらはサンドイッチＥＬＩＳＡに使用されているので、必然的に、２種のエピトープに差異があるはずであるために、データ分析は困難であった。従って、結合パートナーは、示差的に結合するペプチドを強調することによって比較して分析された。共通の結合領域が見出された（配列番号２のアミノ酸残基２１−２７）。さらに、第二結合領域（Ｆ０５について配列番号２のアミノ酸残基７−２１、及びＦ４４については配列番号２の１５３−１６４）が両ｍＡｂについて見出された。それらの領域はそれぞれ、タンパク質一次配列のＮ末端及びＣ末端ドメインにあり、そしてスペリフェルミンの高相同性を有するタンパク質の三次構造に基づいて、それらは、配列番号２のアミノ酸残基の領域の近くにあるべきである。
２種の抗体、すなわちＦ０５及びＦ４４は、ヒト関節液中のスプリフェルミンを定量化するためのＰＫアッセイを開発するのに使用された。マトリックスは非常に高い干渉を示し、そして患者から採取された試料の体積は非常に限られている可能性があるので、Gyrolabが、ヒト血清中の同じ薬物を定量化するために既に検証されているサンドイッチＥＬＩＳＡに関して、好ましい技法として選択された。抗体対が捕捉と検出の両組み合わせで試験されたところ、Ｆ４４が捕捉試薬として使用され得、そしてＦ０５が検出試薬として使用され得た。この挙動は、Ｆ４４について測定された主要親和性を確認し；実際、ほとんどの関連Ａｂは、通常、複合マトリックス中の分析物を捕捉するために使用される。
発明者が考慮しなければならない重要な側面は、分析物であった。スペリフェルミンは、１０．４の等電点により特徴づけられる、約２０ｋＤａの組換えタンパク質である。これは、中性ｐＨで、タンパク質は正に荷電していることを意味する。結果として、それは粘着性であり、そしてガラス及びプラスチック表面に結合する傾向を有する。従って、試料希釈のための緩衝液は、試料取り扱いの間、分析物の損失を回避するために最適化された。次の異なった緩衝液が試験されている：Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ Ｍａｘ、希釈緩衝液１及び希釈緩衝液１０。それらの緩衝液の中で、最良の性能を有する１つが、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ（正に荷電した分析物のために開発された緩衝液）であった。
この方法の開発に関する第二の問題は、マトリックスの複雑性であった。スパイクされていない関節液及び分析物によりスパイクされた関節液は、最適希釈を見出すために異なったＭＲＤを用いて希釈された。最良のＭＲＤを見出すために行われる実験の間、発明者は、関節液が高い粘性であり、そして取り扱われるのに困難であることを経験した。さらに、アッセイにおける応答の点で次の奇妙な挙動が観察された：より低い希釈、ＣＶ％及び％ＢＩＡＳに関する最良の結果。この理由のために、前処理方法を加えることにより関節液の取り扱いを改善することが決定された。関節液は特に、ヒアルロン酸により製造されるので、ヒアルロニダーゼによる消化が評価された。温度及び持続時間の点で軽度の条件が、分析物安定性に対する処理の影響を低減するために適用された。いくつかの試験の後、発明者は、関節液のヒアルロニダーゼ消化が試料粘度を低めるのに十分ではなかったこと認識し；ヒアルロニダーゼ濃度及びインキュベーション時間を変化させた多くの実験において、針凝固、他の試料の活準、悪い％ＣＶ及び悪い％ＢＩＡＳが観察された。従って、この方法の性能を改善するために遠心分離ステップが、ヒアルロニダーゼ消化と組合して試験され、分析物の安定性に影響を与えることなく、％ＢＩＡＳ及び％ＣＶの点で良好な結果を提供した。最終試料前処理手順が設定され（１３，０００ｒｐｍで５分間、２回の遠心分離、及び２０μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼと共に振盪しながらＲＴでの３０分間のインキュベーション）、試料の取り扱いが改善され、マトリックス流動性が高められ、そして針凝集現象が回避された。分析物が実際に器具に結合しないことを確実にするために、希釈緩衝液、ＭＲＤ及び試料前処理を確立した後、針のキャリーオーバー評価が行われた。予想通り、低濃度のスパイクされた試料（ＳＳ）に影響を与える、Ｒｅｘｘｉｐ ＮＮが使用されたとしても、スペリフェルミンはまだ、Gyrolab針に対する高い結合性を示した（その高い正の電荷のために）。従って、この方法は、分析物添加ステップの前、高塩溶液を用いて追加の洗浄ステップを加えることにより改変された。従って、この方法は少なくとも２つの次の洗浄ステップを含む：１つは分析物添加ステップの前、そして他の１つの前記分析物添加ステップの後。
さらなる側面によれば、本発明は、
−ヒト関節液試料にヒアルロニダーゼ溶液を添加し、
−前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
−前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含む、イムノアッセイのためにヒト関節液試料を前処理するための方法を提供する。
ヒアルロニダーゼ濃度は、０．１〜３０μｇ／ｍｌの範囲、例えば０．１、１、５、１０、１５、２０、２５又は３０μｇ／ｍｌである。好ましくは、それは５〜２０μｇ／ｍｌの範囲である。さらに好ましくは、それは２０μｇ／ｍｌ、又は約２０μｇ／ｍｌである。
ヒアルロニダーゼとヒト関節液とのインキュベーション時間は、少なくとも２０分、好ましくは少なくとも２５分、及びさらに好ましくは、少なくとも３０分である。より好ましくは、ヒアルロニダーゼとヒト関節液とのインキュベーション時間は、３０分又は１時間である。
ヒト関節液試料の遠心分離は、標準方法に従って実施される。例えば、遠心分離は、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、例えば１３，０００ｒｐｍ又は約１３，０００ｒｐｍで、５〜１５分間、好ましくは１０分間、実施され得る。
別の側面において、本発明は、ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を定量化する方法であって、以下のステップ：
ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
− ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
− 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
− 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含み、
ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
ｅ）前記抗体が前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的に結合して抗体−タンパク質複合体を産生する条件下で、前記カラム中で、前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と接触させ、
ｆ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
ｇ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
ｈ）産生された応答を測定し、
ｉ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
を含む、方法を提供する。
さらなる側面において、本発明は、ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を自動で定量化する方法であって、以下のステップ：
ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
− ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
− 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
− 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
を含み、
ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
ｅ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ自動輸送するための注入手段を提供し、
ｆ）前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料が前記カラムへ輸送される前に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
ｇ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ輸送し、それにより、前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と、高度に正に荷電した前記タンパク質に前記抗体が特異的に結合する条件下で接触させて、抗体−タンパク質複合体を産生し、
ｈ）前記ステップｇ）の後に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
ｉ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
ｊ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
ｋ）産生された応答を測定し、
ｌ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
を含む、方法を提供する。
本発明によれば、用語「高度に正に荷電したタンパク質（high positively charged protein）」とは、負に荷電した酸性アミノ酸よりもより正に電荷した塩基性アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）を含み、そして／又は正に荷電したアミノ酸がそれらの表面に暴露されるよう折りたたまれ、そして／又は媒体のｐＨで全体的に正の電荷を示すタンパク質のことである。好ましくは、高度に正に荷電したタンパク質は、ＦＧＦ−１８タンパク質である。より好ましくは、ＦＧＦ−１８タンパク質は、１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれらから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟形を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれらから成るヒトＦＧＦ−１８の切断形を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチドから成る群から選択される。より好ましくは、ＦＧＦ−１８はスプリフェルミンである。
さらなる実施形態によれば、前処理されたヒト関節液試料は、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ緩衝液により、１：２〜１：１０、好ましくは１：５又は約１：５で希釈される（上記ステップｂ）。
別の実施形態によれば、高イオン力緩衝液は、好ましくは、アルコール中、高濃度の塩、例えばＮａＣｌを含む緩衝液である。好ましくは、塩濃度は少なくとも１Ｍである。例えば、高イオン力緩衝液は、２０％エタノール中、１．５ＭのＮａＣｌ液である。
ヒト関節液試料の遠心分離（ステップａ）は、標準の方法に従って実施される。例えば、遠心分離は、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、例えば１３，０００ｒｐｍで又は約１３，０００ｒｐｍで５〜１５分、好ましくは１０分間、実施される。
ヒアルロニダーゼとの関節液のインキュベーション時間（ステップａ）は、少なくとも２０分、好ましくは少なくとも２５分、及びさらに好ましくは少なくとも３０分である。より好ましくは、ヒアルロニダーゼとのヒト関節液のインキュベーション時間は、３０分又は１時間である。ヒアルロニダーゼの濃度は、０．１〜３０μｇ／ｍｌの範囲であり、例えば０．１、１、５、１０、１５、２０、２５又は３０μｇ／ｍｌである。好ましくは、それは５〜２０μｇ／ｍｌの範囲である。さらに好ましくは、それは２０μｇ／ｍｌである。
１つの実施形態によれば、標準洗浄緩衝液は、任意の標準緩衝液であり得る。例えば、それはＴｗｅｅｎ緩衝液、例えばＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０である。
高度に正に荷電したタンパク質、例えばＦＧＦ−１８タンパク質に対する抗体（すなわち、例えば、ＦＧＦ−１８タンパク質に対して特異的に結合する抗体）は、当業界において知られている任意の標準方法により得られる。
本発明の方法に使用されるカラムは、高い特異的相互作用、例えば抗原と抗体との間のその作用に基づいて生化学的混合物を分離するために当業界において知られている任意の適切なカラムである。好ましくは、カラムは親和性捕捉カラムである。より好ましくは、カラムはストレプトアビジン−ビーズカラムである。
カラムの洗浄ステップは常に、末結合試薬（抗体、混合物又はタンパク質）を除去するために行われる。注入手段の洗浄ステップは、いくつかの試料が定量化されなければならない場合、実行中のキャリーオーバーを引起し得る、粘着性の高度に正に荷電したタンパク質、例えばＦＧＦ−１８タンパク質を除去するために常に行われる。
本発明の方法に使用される注入手段は、１つの容器から別の容器に液体試料を移すための、例えば希釈容器からカラムに、前処理された及び希釈されたヒト関節液試料を移すための任意の適切な注入装置である。注入手段は、使い捨て、又は非使い捨てとすることができる。例えば、適切な注入装置は、使い捨てチップ又は本発明の方法のために適合された針を有するピペットシステムであり得る。特に、そのような針は、Ｇｙｒｏｌａｂワークステーション（Ｇｙｒｏｌａｂイムノアッセイプラットフォーム）に使用される針であり得る。
自動定量化においては、１セットの試料群 (a set of samples)が同時に又はほぼ同時に定量化され得る。そのような場合、１セットのカラム群(a set of columns)が必要とされ、分析されるベキヒト関節液試料当たり１つのカラムが必要とされ、そしてこの方法の各ステップは反復されるであろう。通常、同じ注入手段が、試料間のキャリーオーバーを回避するために、すべての洗浄ステップが注意して実施される限り、カラム上に試料を移すために使用され得る。使い捨て注入装置が使用される場合、ステップｆ）及びｈ）の洗浄ステップは必要ではない。
本明細書において使用される場合、蛍光色素は、紫外線又は可視光を吸収することができ、そして実質的に時間の遅延を伴わないで、より長い波長の光として放出する有機着色剤（蛍光）である。本発明の範囲内の蛍光色素は、より大きな単位の色素分子及び白色成分（蛍光色素）の両者、例えば抗体又は他の生体分子に結合される発色団である。そのような蛍光色素、例えばアクリジン色素、シアニン色素、フルオレン色素、オキサジン色素、フェナントリジン色素、ローダミン色素が、蛍光分析に及び免疫学における特異的標識のための蛍光プローブとして使用される。一般的な蛍光色素及びそれらの使用分野の概要は、例えばthe Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, Molecular Probesから当業者に知られている。
好ましい実施形態によれば、Alexa−647蛍光色素が使用される。この蛍光色素は、蛍光色素のAlexa Flourファミリーに属し、そしてMolecular Probes, Inc. により製造されている。Alexa Fluorシリーズの励起及び発光スペクトルは、可視スペクトルをカバーし、赤外領域まで広がる。このファミリーの個々のメンバーは、おおよそそれらの励起最大（ｎｍでの）に応じて番号付けされている。Alexa Fluor色素は、クマリン、ローダミン、キサンテン（例えば、フルオレセイン）及びシアニン色素のスルホン化を通して合成される。スルホン化は、Alexa Fluor 色素を、負に荷電し、そして親水性にする。Alexa Fluor 色素は一般的に匹敵する励起及び発光、及びある程度、新しいシアニンシリーズの一般的な色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン）よりも、より安定し、明るく、且つ低いｐH感受性である。
本発明においては、測定可能な応答は、標識された化合物（抗体又はタンパク質）により放出され、そして当業界において知られている任意の蛍光測定法又は分光蛍光法により測定される蛍光である。Gyrolab技法が使用される場合、放出された蛍光シグナルは、カラム表面の走査を行うことができるgyrolabワークステーションにより測定され、結果として、相対蛍光単位の数値応答、及びカラムへの蛍光のピークの画像として与えられる。
当業者は、本明細書に記載される本発明は、具体的に記載されるもの以外の変形及び修飾が可能であることを理解するであろう。本発明は、その精神又は本質的特性から逸脱することなく、すべてのそのような変形及び修飾を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において、個別に又は集合的に言及されるか又は指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、及び任意の複数の前記ステップ又は特徴の任意の及びすべての組み合わせも含む。従って、本開示は、例示されたものであって、制限するものではないと考えられるべきであり、本発明の範囲は添付の請求項により示され、そして同等物の意味及び範囲内に入るすべての変更は、その中に包含されることが意図される。
上記の記載は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、その実施例は、本発明を実施する方法の例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
配列の説明：
配列番号１：天然のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
配列番号２：組換え切断ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８）のアミノ酸配列。
以下の実施例においては、実際の試料濃度が方法の定量下限（１５０ｐｇ／ｍｌ）以下である場合、それは定量下限値（ＢＱＬ）として報告されるであろう。
１．Gyrolab技法を用いての親和性測定
１．１．１．分析方法
親和性の測定のために、直接的抗体アッセイを使用した。ビオチンにより標識された抗原スプリフェルミンを、ＣＤカラムに結合し、そしてalexa647−標識ｍＡｂを、固定された抗原により捕捉する。マイクロプレートウェル中でＣＤの外側で行われる抗原及び抗体の予備混合ステップが必要である。所定の時間後、混合物を負荷し、そして遊離抗体のみを、固定された抗原により捕捉する。分析された抗体は、Zymogeneticsによるスプリフェルミンに対して生成され、そして前臨床及び臨床ＰＫアッセイのために使用されるモノクローナル抗体（ＩｇＧ）である。抗体を、ＦＳＡ２（ｍＡｂ Ｆ０５としてテキストにおいては言及される）及びＦ４４Ａ２（ｍＡｂ Ｆ４４としてテキストにおいては言及される）として同定した。
１．１．２．スプリフェルミンのビオチン化
ビオチン化のために、キットPierce “EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation：無重量ビオチン（カタログ番号２１３２７）を使用した。ビオチン化された生成物を、Pierce “Zeba Desalt Spin Columns”（カタログ番号８９８４９）を用いて精製し、標識の程度を、Pierce「ビオチン定量化キット」（カタログ番号２５００８）からのキットを用いることにより調べた。ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、ビオチン化試薬の最も一般的なタイプである。ＮＨＳ−活性化ビオチンは、ｐＨ７〜９で一級アミノ基（−ＮＨ2）と効果的に応答し、安定したアミド結合を形成する。タンパク質は典型的には、リシン（Ｋ）残基の側鎖中の一級アミン及び各ポリペプチドのＮ−末端を含む、標識するための多くの部位を有する（図１を参照のこと）。ビオチンのいくつかの異なったＮＨＳエステルが、種々の特性及びスペーサーアーム長で利用可能である。このキット中のスルホ−ＮＨＳエステル試薬は、水溶性であり、有機溶媒の不在下で反応の実施を可能にする。ビオチンは小さいので（２４４Ｄａ）、それは、それらの生物学的活性を変更しないで、多くのタンパク質に接合され得る。
ビオチン化を、この手段に従って実施した：
１．２００μｌの冷Milli−Q水を、１ｍｇのビオチンに添加し、９ｍＭの濃度を得た；
２．スプリフェニルミンを、０．１ｍＭ（２ｍｇ／ｍｌに対応する：分子量１９８３０）の濃度にした。；分析物に対する２／１０／１０倍モル過剰のビオチンを用いる。従って、２．７／３．５／２７μｌの９ｍＭのビオチンを、１２０μｌのスプリフェルミンに添加する；
３．混合物を、振盪条件下で１時間インキュベートした；
４．過剰のビオチンを、PierceからのZeba Desalt Spinカラムにより除去した。このカラムは、タンパク質が７，０００Ｄａ以上のタンパク質の回収を提供しながら、タンパク質が９５％以上の塩及び小分子の保持率で溶解される緩衝液を交換することができる。最初に、カラムを、１５００ｘｇで１分間、遠心分離した。過剰の液体を除去し、そして１２０μｌの試料をロードした。カラムを、１５００ｘｇで２分間、遠心分離した。フロースルーは、遊離ビオチンを含まない標識タンパク質を含む；
５．試料濃度を、Nanodrop ND−1000を用いて２８０ｎｍを読み取ることにより、分光測定により測定した。ＰＢＳを参照として使用した。
ビオチン化の後、標識の程度を、Pierce Biotin Quantitationキットを用いて調べた。ＨＡＢＡ（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）は、ビオチン：タンパク質のモル：モル比の迅速な推定を可能にする試薬である。キットは、ＨＡＢＡ及びアビジンのプレミックス及びビオチン化されたホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）陽性対照ＨＡＢＡ／アイジンを含む。
ビオチン化タンパク質を含む溶液を、ＨＡＢＡ及びアビジンの混合物に添加した。アビジンに対するその高い親和性のために、ビオチンはＨＡＢＡを置換し、そして５００ｎｍでの吸光度は比例して低下する。この方法によれば、溶液に存在する未知の量のビオチンが、ビオチン含有試料の添加の前及び添加の後、ＨＡＢＡ−アビジン溶液の吸光度を測定することによって、単一のマイクロプレートウェル内で定量化され得る。吸光度の変化は、ＨＡＢＡ−アビジン複合体の消衰係数による試料中のビオチンの量に関連する。
以下の手順を適用した：
１．無重量ＨＡＢＡ／アビジンプレミックスを、室温に平衡化し、そして１００μｌのmilliQ水に溶解した；
２．１６０μｌのＰＢＳを、各試料についてのマイクロプレートウェルに及び陽性対照についてのそのウェルにピペットで移した；
３．２０μｌのＨＡＢＡ／アビジンプレミックス溶液を、各ウェル中のＰＢＳに添加した。マイクロプレートを、オービタルシェーカー上に置き、２分間、混合した；
４．５００ｎｍでのウェル中の溶液の吸光度を測定し、そしてその値を、Ａ５００ＨＡＢＡ／アビジンとして記録した；
５．２０μｌのビオチン化試料／ビオチン化ＨＲＰ（既知のビオチン化率を有する陽性対照）を、ＨＡＢＡ／アビジン反応混合物を含むウェルに添加し、そして上記のようにして混合した；
６．ウェル中の溶液の吸光度を、５００ｎｍで読み取り、そしてその値が少なくとも１５秒間、一定であれば、Ａ５００ＨＡＢＡ／アビジン／ビオチン試料として記録した；
７．最後に、１ｍモルのタンパク質当たりの１ｍモルのビオチン（最初の試料中）を、以下の式に従って計算した：
１．１．３．抗体のＡｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ６４７標識
Molecular Probes “AlexaFluor（登録商標） 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit”（カタログ番号Ａ２０１８６）からのキットを用いて、生成物を標識し、そして精製した。Nanodrop 1000を用いて、標識の程度を調べた。接合体は、それぞれ、約６５０ｎｍ及び６６８ｎｍの吸光度及び蛍光最大を有する。Alexa Fluor647反応性色素は、タンパク質の第一級アミンと効果的に反応し、安定した色素−タンパク質接合体を形成するスクシンイミジルエステル成分を有する。
標識を、この手順に従って実施した：
１．抗体を、１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そして次に、１／１０体積の炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を添加した。（スクシンイミジルエステルは、ｐＨ７．５−８．５で効果的に反応するので、炭酸水素塩（ｐＨ約８．３）を添加し、反応混合物のｐＨを高める）
２．１００μｌのタンパク質溶液（ステップ１からの）を、反応性色素を含むバイアルに移し、そして軽く反転し、色素を完全に溶解した；
３．溶液を、振盪下で２２℃で１時間インキュベートした；
４．未反応生成物から標識された抗体を分離するために、過剰の色素を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）及び２ｍＭのアジ化ナトリウム中、３０，０００ＭＷのサイズ排除樹脂を用いて除去した。回転カラムを、５ｍｌの管に配置し、そして精製樹脂を攪拌した。１ｍｌの懸濁液を、カラムに添加し、そして沈殿した。次に、５００μｌを添加した。総懸濁の体積は、１．５ｍｌである。カラム緩衝液を、重力によりカラムから排出した。最初は、最初の数滴の緩衝液を溶出させるために、いくらかの圧力が必要とされ得；
５．回転カラムを、１本の採取菅に配置し、そしてスイングバスケットロールを用いて、１１００ｘｇで３分間、遠心分離した。緩衝液を捨てた。回転カラムは、接合された抗体を精製するための準備ができている；
６．ステップ３（標識混合物）からの生成物を、回転カラムの中心に滴下し、そしてゲル床への吸収を可能にした；
７．回転カラムを、空の収集管に配置し、そして１１００ｘｇで５分間、遠心分離した；
８．遠心分離の後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）及び２ｍＭのアジ化ナトリウム中、１００μｌの標識されたタンパク質を収集した。遊離色素がカラム床に残った。
標識率を定量化するために、接合体溶液の吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置を用いて、２８９ｎｍ及び６５０ｎｍの両者で読み取った。試料中のタンパク質の濃度を、次の式に従って計算した：
式中、２０３’０００は、２８０ｎｍで典型的なＩｇＧのｃｍ-1Ｍ-1でのモル消衰係数（ε）であり、そして０．０３は、２８０ｎｍでの吸光度に対する蛍光団の寄与の補正係数である。
標識の程度を、この方法で計算した：
式中、２３９’０００ｃｍ-1Ｍ-1は、６５０ｎｍでのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７色素のおおよそのそのモル消衰係数である。ＩｇＧについては、最適標識は、抗体１モル当たり３〜７モルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７色素である。
１．１．４．捕捉試薬調査
捕捉試薬（ビオチン化されたスプリフェルミン）のための最良の実験条件を決定するために、異なった条件を、２−ステップGyrolabアッセイにおいて試験した。ビオチン化された捕捉試薬を、分析−特異的捕捉カラムを創造するビーズに結合した。アッセイステップの間、ａｌｅｘａ−６４７標識抗体を、カラムに通し、ここで抗体が特異的に捕捉される。
以下の捕捉試薬を用いた：
・標識されていないスプリフェルミンのみ；
・標識されていないスプリフェルミン＋ビオチン化された血清アルブミン（Ｂｉｏ−ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ａ４５４９）（比１：３）；
・標識されていないスプリフェルミン＋Ｂｉｏ−ＢｓＡ（比１：９）；
・スプリフェルミン、ビオチン化された標識（１：２）
・スプリフェルミン、ビオチン化された標識（１：１０）
・スプリフェルミン、ビオチン化された標識（１：２０）
全ての捕捉試薬を、ＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝溶液中、０．０％ Tween20）又はRexxip HN 緩衝液(Gyros, P0004996)中、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。検出試薬（Ａｌｅｘａ−647標識されたｍＡｂ抗−スプリフェルミン）を、Rexxip Ｆ緩衝液(Gyros、 P0004825)に希釈された５、１０及び５０ｎＭの濃度で試験した。最初の実験を、Ｇｙｒａｌａｂ方法「Bioaffy 1000 2 ステップ C-AD wiz-v1」を用いて実施した。第２の実験を、洗浄溶液２（ＷＳ２：２０％エタノール中の１．５Ｍ のＮａＣｌ）を使用しての余分な洗浄ステップを追加して、Ｇｙｒａｌａｂ方法「Bioaffy 1000wash x2 C-AD wiz-v1」を用いて実施した。
結果
最良の捕捉条件を評価するための第１の実験を、３種の異なった程度のビオチン化されたスプリフェルミン（スプリフェルミン：ビオチンの比：１：２、１：１０、１：２０）、及び負の対照としての標識されていないスプリフェルミンを比較することにより実施した。評価下の検出ｍＡｂを、３種の異なった濃度で調製した。異なった捕捉の条件の組み合わせの結果は、スプレプトアビジン捕捉カラムへの薬物の結合のために、高い非特異的シグナルが存在することを示した（表１、標識されていないスプリフェルミンを参照のこと）。
表１：捕捉試薬調査の結果。第１の実験。ＡＶＧ ＲＬＵ：３回の反復の平均応答。
特異性を得るために、ｇｙｒｏｌａｂ方法の変更を行った。高イオン力緩衝液（ＷＳ２）を用いて洗浄ステップを加えて、非特異的結合を低めた。標識されていないスプリフェルミンをまた、カラムの遊離結合部位をブロックスするために、Ｂｉｏ−ＢＳＡと組合して試験した。第２の実験の結果は、表２に示される。
表２：捕捉試薬調査の結果。第２の実験。ＡＶＧ ＲＬＵ：３回の反復の平均応答。
ＷＳ２洗浄ステップを伴っての新規方法を用いて、カラムへのバイオ−スプリフェルミン (bio-Sprifermin)の結合による特異的シグナルは、標識されていない薬物のシグナルに関してより高い（５０ｎＭのＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂで、第１の方法では、１：２で標識されたスウリフェルミンと標識されていないスプリフェルミンとの間の比が約５である。第２の実験では、その比は約５０である）。標識されていない薬物の応答は、実験２にかけて劇的に減少するが、標識された薬物の応答は一定のままである。Ｂｉｏ−ＢＳＡの添加は、非特異的シグナルを有意に助けるとは思われない。異なった条件のピークを分析することにより、標識された及び標識されていないスプリフェルミンを用いることにより生成されたシグナル間には、明白な差異が存在する。ピーク形状及びシグナル飽和に関して最も興味深い条件は、スプリフェルミンビオチン化度１：１０であると思われる。
１．１．５．固定された抗体（Ａｂ）濃度の決定
ＫD実験についての固定されたＡｌｅｘａ−６４７標識されたｍＡｂ濃度を選択するために、異なった濃度のＡｌｅｘａ−６４７標識されたＭＡｂにまたがる標識曲線を、抗原とプレインキュベーションなしに調製した。異なったＡｂ濃度を、２ステップＧｙｒｏｌａｂアッセイ「Bioaffy 1000washx2 C-AD wiz-v1」において試験した。捕捉試薬、Ｂｉｏ−スプリフェルミン、標識度１：１０を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮに希釈された０．１ｍｇ／ｍｌで使用した。標準曲線を、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆに、５０、１、０．１、０．０１、０．００５、０．００１ｎＭ、０．５及び ０．１ ｐＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ０５を、及びＲｅｘｘｉｐ Ｆに、５０、１、０．１、０．０１、０．００５、０．００１ｎＭ、０．５及び ０．１ ｐＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ４４を希釈することにより調製した。
結果
ＫD実験のために使用される固定されたｍＡｂ濃度を確立するために、２種の抗体を、薬物とのプレインキュベーションを伴わないで、異なった濃度で調製した。Ｓ字曲線の直線部分を決定するための２回の実験の後、０．１ｎＭ以下では、応答は非常に類似する挙動性を示す両抗体については不安定であるように見える（表３を参照のこと）。％ＣＶは、０．０１ｎＭまで非常に高かった。選択された濃度は、両抗体について０．１ｎＭであった。
表３：Ｆ０５及びＦ４４固定Ａｂ濃度決定実験いついての結果。ＡＶＧ ＲＬＵ：３回の反復の平均応答、ＣＶ％：３回の反復の変動係数。赤：許容基準の％ＣＶ（±２０％）
１．１．６．平衡時間の決定及び評価の比[Ａｂ]／ＫD
ＫD実験についての正しいインキュベーション時間を選択するために、異なった濃度の標識されていないスプリフェルミンにわたる標準曲線を調製し、そして固定されたａｌｅｘａ−６４７標識ＭＡｂと共に１又は２４時間インキュベートし、そして次に、試験した。標準曲線を、２ステップＧｙｒｏｌａｂアッセイ「Bioaffy 1000washx2 C-AD wiz-v1」において試験した。捕捉試薬、Ｂｉｏ−スプリフェルミン、標識度１：１０を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮに希釈された０．１ｍｇ／ｍｌで使用した。標準曲線を、標識されていないスプリフェルミンを、０．０００５、０．０１、０．０５、０．２５、０．５、５、１０、５００、１０００及び２０００ｎＭの最終濃度で希釈することにより調製した。希釈度は、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ中、０．１ｎＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ０５、及びＲｅｘｘｉｐ Ｆ中、０．１ｎＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ４４において実施された１：２０であった。それらの混合物を、２２℃で１又は２４時間、暗室において振盪下で維持した。
結果
０．１ｎＭの濃度の選択されたｍＡｂを、ＫD決定のための好ましいインキュベーション時間を選択するために、種々の濃度のスプリフェルミンにプレインキュベートした。プレインキュベーションを、１又は２４時間、実施し、そして次に、より短いインキュベーションが反応の平衡を可能にできたかどうかを評価するために試験した（ｍＡｂ Ｆ０５結果についての図２を参照のこと）
ｍＡｂ Ｆ４４については、安定した結果を得るためには困難であり、従って、固定ｍＡｂ濃度を０．１から０．０５に低めることが決定された。％ＢＩＡＳに関する結果は、最適ではなかったが、しかし多くの実施において確認された。計算されたＫDは１及び２４時間のインキュベーションの後、類似したので、インキュベーション時間を１時間に保つことが決定された（ｍＡｂ Ｆ４４についての図３を参照のこと）。
両抗体について、[Ａｂ]／ＫD比は、１よりも十分に低く、結果的に、実施された実験はＫD制御と呼ばれ、ＫDの正確な決定を可能にする。
１．１．７．ＫDの確認
得られたデータを確認するために、ＫDの決定を、１．１．６に見られるのと同じ手順に従って、各抗体について４度、反復した。
結果
ＫD実験を、結果を確認するために、各抗体について４度、反復した。ｍＡｂ Ｆ０５については図４、ｍＡｂ Ｆ４４については図５を参照のこと。Ｆ０５は強い結果を示し、計算されたＫDは全ての実験において保存され、そして応答は安定している。計算されたＫDは約１ｎＭであった。Ｆ４４は再現性が低く、たぶんその理由は使用される試薬の濃度が低いことに起因すると見られる。しかしながら、ｍＡｂ Ｆ４４は、計算されたＫDが約３００ｐＭであり、そしてこの高い親和性がおそらくこの技術の課題であるという事実に起因する機器応答の高い変動のために、ｍＡｂ Ｆ０５よりもスプリフェルミンに対する高い親和性を示す。
１．１．８．異なるＡｂ固定された濃度でのＫDの決定
計算されたＫDの良さを確立するために、標識されていないスプリフェルミンを、種々のｍＡｂ濃度でインキュベートした。異なった濃度の標識されていないスプリフェルミンにわたる標準曲線を調製し、そして次に、４つの固定された、ａｌｅｘａ−６４７標識ＭＡｂと共に１時間インキュベートした。標準曲線を、２ステップＧｙｒｏｌａｂアッセイ「Bioaffy 1000 wash x2 C-AD wiz-v1」において試験した。
捕捉試薬、バイオ−スプリフェルミン、標識度１：１０を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮに希釈され、０．１ｍｇ／ｍｌで使用した。標準曲線を、０．０００５、０．０１、０．０５、０．２５、０．５、５、５０、５００、１０００及び２０００ｎＭの最終濃度で標識されていないスプリフェルミンを希釈することにより調製した。希釈度は、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ中、０．０１、０．１、１及び１０ｎＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ０５、及びＲｅｘｘｉｐ Ｆ中、５．５０ｐＭ、０．５及び５ｎＭでＡｌｅｘａ標識されたｍＡｂ Ｆ４４において実施された１：２０であった。それらの混合物を、２２℃で１時間、又は２４時間、暗室において振盪下で維持した。
結果
計算されたＫDの信頼性を確認するために、２種のｍＡｂを、異なる濃度で、標識されていないスプリフェルミンと共にインキュベートした（前の実験と同様）。この実験を、得られたＫDが、以前のすべての実験において使用された選択されたＡｂ濃度に対してのみ有効であり得ることを排除するために、行った。ｍＡｂ Ｆ０５については、濃度の変動は、計算されたＫDに及ぼす影響が低かった。試験された最高濃度：１０ｎＭ（選択された０．１ｎＭよりも１００倍高い）のみが異なった結果を示したが、しかし[Ａｂ]／ＫDが１．６であるので、この測定は他のものほど正確であるとは見なされ得ない（データは示されていない）。ｍＡｂ Ｆ４４についても同様のことが起こった（データは示されていない）。しかしながら、ＫDは、以前の実験において得られたものよりも高く、このことは、その抗原に対するこの抗体のより高い親和性がＧｙｒｏｌａｂ技法にとって困難である仮設を確認した。
２．Ｐｅｐｓｃａｎ ＣＬＩＰＳ技法を用いてのエピトープマッピング
Ｐｅｐｓｃａｎ ＣＬＩＰＳ技法を、血清及び関節液中のスプリフェルミンを定量化するためのＰＫイムノアッセイに使用される２種のｍＡｂ（Ｆ４４及びＦ０５）の特徴付に使用した。標的薬物は、組み合わせマトリックス企画を用いて、約４０００個の重複するペプチドコンストラクトのライブラリーにおいて転換された。ＣＬＩＰＳ技法は、ペプチドを単一ループ、二重ループ又は三重ループに構造化することを可能にする。この場合、単一及び二重ループを試験した。ＣＬＩＰＳ鋳型をペプチド中のシステイン残基にカップリングする合成を行った。各ペプチドへの抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡを用いて試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄の後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼ接合体（ＳＢＡ、カタログ番号２０１０−０５）の１：１０００希釈液と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄の後、ペルオキシダーゼ基質２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン（ＡＢＴＳ）及び２μｌ／ｍｌの３％Ｈ2Ｏ2を添加した。１時間後、発色を測定し、そしてＣＣＤカメラ及び画像処理システムにより定量化した。
次の６種の異なった組を合成した：
第１組：単一残基突然変異誘発スキャン：１９個の天然アミノ酸（約３００個のペプチド）の何れかによる塩基配列の単一位置の系統的置換；
第２組：ＣＬＩＰＳ組み合わせループ：単一ループ組み合わせＣＬＩＰＳペプチド、１９個の残基（約１５０個のペプチド）のオーバーラップを有する２０量体の完全組；
第３組：ミスマッチ破壊を伴うＣＬＩＰＳ組み合わせループ：第２組と同一であるが、しかし中心位置における２個のアミノ酸がＡｌａ（約１５０個のペプチド）により置換されている；第２組及び第３組の結果の比較は、突然変異した位置の関連性を示すことができる。
第４組：線状：線状の２０量体が１９個の残基（約１５０個のペプチド）で重複する；
第５組：ミスマッチ破壊を伴う線状：第４組と同一であるが、しかし中心位置における２個のアミノ酸がＡｌａ（約１５０個のペプチド）により置換される；
第６組：ＣＬＩＰＳ不連続マトリクス：１６個の残基の重複を有する２６×１５４の１７量体のマトリクス。それを、Ｔ３ ＣＬＩＰＳ足場（約４０００個のペプチド）上でモデル化する。
結合条件を最適化するために、種々の濃度の抗体、希釈緩衝液の組成及びアレイの前処理を伴って、実験企画を実施した。
結果
最良の結合ペプチドを強調するために、使用され得る統計学的ツールは、ボックス−プロット法（box-plot method）である。結果の分布は、共通のバックグラウンドレベルを示し、統計学的異常値の決定を可能にする：潜在的な結合ペプチドを示すことができる。ノイズ間の統計学的に関連する高い結合を有するペプチド。ボックス−プロット分析を用いて、特異的結合を強調する最良の条件は、プロッキング緩衝液中の競争タンパク質の１％で５μｇ／ｍｌでの抗体濃度であった。
線状及びＣＬＩＰＳペプチドの分析は、両抗体が類似する結合パターンを有し、Ｎ及びＣ末端でより高い結合を有することを示す。不連続ＣＬＩＰＳマトリックスの分析は、２種の抗体の特異的結合パターンを示した。以下のアミノ酸番号付けは、配列番号２に基づく。Ｆ０５及びＦ４４の両者について、観察された優性結果領域は、２１−２７及び３６−４５であった。Ｆ４４による結合がまた、領域１２１−１２９、１４１−１５１及び１５３−１６３でも観察された。それらの２つの領域はまた、Ｆ０５１に対するいくらかの結合を示したが、しかしはるかに低かった。Ｆ０５はまた、Ｎ末端１−２１にも結合することが示された。
２つの抗体間の結合差異を明らかにするために、このデータ組からの値を比較した：各応答値を、ペアワイズ散布図（pair wise scatter plot）にプロットした。１つのペプチドについて、一方の抗体についての結合が他方の抗体に対してよりも高い場合、この点群は１：１のラインの中央に位置され得なかった。Ｆ４４の全体的結合はＦ０５の場合よりも高いので、実際、この点群は１：１のラインの中央に配置されない（図６Ａを参照のこと）。全体的結合を調節し、そして２つの試料間の特異的差異に焦点を当てるために、点群をＬＯＥＳＳ曲線適合を用いて規準化した（図６Ｂを参照のこと）。規準化の後、点群はほぼ１：１の中心に位置される。示差的に結合するペプチドを同定するために、図６Ｂからのデータを、ＭＡプロット（Ｘ軸上の２つの試料の平均値及びＹ軸上の差異のｌｏｇ２を示すプロットタイプ）に再適合させる。このプロット上で、示差的に結合するペプチドは、高いＹ値を有するそれらのペプチドである。ノイズを除くために、平均結合及び差分結合の両者のカットオフを適用することができる。図６Ｃにおいては、残りの示差的に結合するペプチドは、青色（Ｆ４４においてより高い結合）及び黄色（Ｆ０５においてより高い結合）である。同定された２１８のペプチド（４０００個の中の）を、標的タンパク質上の配列位置に従って採点した（図６Ｄ）。Ｆ４４に対する明確な高められた結合が、領域１５３−１６４をカバーするペプチドについて観察される。Ｆ０５については、高い相対的結合が主に、７−２１で観察される。
両抗体は、領域２１−２７に対する最も強い結合性を示し、このことは、この領域がＦ０５及びＦ４４のためのエピトープであることを示唆している。しかしながら、二次的証拠は、それらの２つの抗体が、「サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ」実験において一緒に使用され得るので、異なったエピトープを有することを示している。Ｆ０５とＦ４４との間の差異分析は、Ｎ末端ドメイン上のＦ０５による特的結合、及びＣ末端ドメイン上のＦ４４による結合を示唆する。それらの両ドメインは、優性結合領域に近接して存在する。それらの結果は、スプリフェルミンの同じファミリーに属するタンパク質を用いることにより、図７のようにして可視化され得る。
従って、Ｆ０５及びＦ４４のための推定上のエピトープは、下記のものである：
Ｆ０５：７〜２１と共に２１〜２７
Ｆ４４：１５３〜１６４と共に２１〜２７
３．分析物及びマトリックスを用いたＰＫ（薬物動態）のためのＧｙｒｏｌａｂベースのアッセイの開発
３．１．最良の抗体組み合わせについての調査
最良の抗体カップルの組み合わせを決定するために、２つの異なった条件を、３ステップＧｙｒｏｌａｂアッセイで試験した：洗浄溶液２（ＷＳ２：２０％エタノール中、１．５ＭのＮａＣｌ）の添加を伴っての「Bioaffy 1000 wiz v1 mod wash」。分析物スプリフェルミンの標準（ｓｔｄ）曲線を、５０、１０、２ｎｇ／ｍｌ、４００、８０、１６、３．２ｐｇ／ｍｌで、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ緩衝液（Ｃｙｒｏｓ，Ｐ０００４９９６）中、独立した希釈液を用いて調製した。ブランク試料を付加した（標準０、「ＳＩＤＯ」、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮのみ）。捕捉試薬（ＦＦ４４及びＦ０５抗体、ビオチン標識された）を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。検出試薬（ａｌｅｘａ６４７標識Ｆ４４及びＦ０５）を、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ、Ｐ０００４８２５）で希釈し、２５ｎＭの濃度で使用した。
結果
このＰＫアッセイのための最適な抗体の組み合わせを決定するために、３ステップGyrolab方法「Bioaffy 1000 wiz v1 mod wash」を用いて、及び洗浄溶液２（図８を参照のこと）の添加を伴って、２つのｍＡｂ（捕捉としてＦ０５／検出としてＦ４４、及び捕捉としてＦ４４／検出としてＦ０５）の組み合わせを試験した。この実験を３回、反復し、検出抗体濃度の変動もまた示した（データは示されていない）。最良の組み合わせは、捕捉としてＦ４４及び検出としてＦ０５を有するものであり：この結合配置はより鋭い形状のピークを生成し、そしてそれは、曲線の下部においても良好な直線性を可能にすることを示した（データは示されていない）。
３．２．緩衝液の選択
分析物希釈のための緩衝液の選択は、イムノアッセイの性能にとって重要である。以下の４種の緩衝液を、スプリフェルミンの標準曲線の調製のために使用し、そしてＡｌｐｈａＬＩＳＡ技法手順に従って分析した：
・Rexxip HN緩衝液 (Gyros, P0004996)；
・Rexxip HN MAX 緩衝液 (Gyros, P0004997)；
・希釈緩衝液１（７ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２．７ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ７．３）中、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ７９０６）、０．０５％Ｌｕｔｒｏｌ（ＢＡＳＦカタログ番号Ｓ３０１０１））；
・希釈緩衝液１０（７ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２．７ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ７．３）中、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ７９０６）、０．０５％Ｌｕｔｒｏｌ（ＢＡＳＦカタログ番号Ｓ３０１０１））。
ＳＴＤ曲線を、２０、５、１ｎｇ／ｍｌ、２００、５０、２５、１０ｐｇ／ｍｌ（ウェル中での最終濃度）で調製した。ブランク試料を付加した（ＳＴＤＯ、緩衝液のみ）。捕捉試薬、標識されたＦ４４ビオチンを、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。検出試薬、ａｌｅｘａ−６４７標識Ｆ０５を、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ，Ｐ０００４８２５）に希釈して、２５ｎＭの濃度で使用した。
結果
最良の緩衝液は、スプリフェルミンがそうであるように、正に荷電した分析物についての増強されたイオン強度を有する、異種抗体を中和する剤を含む市販の試薬Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮであった。Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて調製された標準曲線は、他の曲線に対してより良好な正確度（表５を参照のこと）及び精度（表４を参照のこと）を有した。
表４：緩衝液選択のための実験の要約表。ＡＶＧ ＲＬＵ：３回の反復の平均応答、％ＣＶ：３回の反復の精度。下線：許容基準の％ＣＶ（±２０％）
表５：緩衝液選択のための実験の要約表。ＡＶＧ ＢＣＣ：３回の反復の平均逆算濃度、％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。標準曲線回帰を、ＸＩｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ロジスティック自動推定値１／ｙ2を用いて得た。式２０１。下線：許容基準の％ＢＩＡＳ（±２０％）
３．３．最小必須希釈（ＭＲＤ）
方法が緩衝液下で最適化されると、それはマトリックス下で翻訳された。この目的のために、実験を、Ｇｙｒｏｌａｂ技法手順に従って実施した。Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて調製された標準曲線を用いて、プールされたヒト関節液（Sera Laboratories International）において調製された分析物を、０．５、１、２、５及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度で定定化し、そして次に、それぞれ１：５、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００に希釈した。平衡して、ブランクマトリックスを、試験前に同じ手段で処理した。
結果
試料試験のために適用されるＭＲＤを設定するために、プールされたヒト関節液下で調製された試料を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ下で調製された標準曲線に対して分析した。関節液を用いて最初の実験を実施すると、マトリックスは非常に粘性であり、且つピペットで移すのが困難であり、さらに、高い粘土のために、また針の凝固を引越す可能性がある。それらの理由から、ＭＲＤを見出すために行われた実験の結果は、正確度及び精度に関して満足のいくものではなく：％ＣＶは、１：１０の希釈度で高く（表６及び図９を参照のこと）、そして％ＢＩＡＳは、低いＭＲＤ（１：５及び１：１０）で許容できるが、しかし高い希釈度では許容できなかった。この理由のために、ＭＲＤの前、マトリックスの前処理ステップを追加することにより、関節液の取り扱いを改善することが決定された。
表６：ＭＲＤについての実験の要約表。ＡＶＧ ＢＣＣ：３回の反復の平均逆算濃度、％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。％ＣＶ：３回の反復の精度。ＢＱＬ＝定量の下限以下。標準曲線回帰を、ＸＩｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ロジスティック自動推定値１／ｙ2を用いて得た。式２０１。下線：許容基準から外れた結果。
３．４．マトリックス前処理
マトリックス粘土を低めるために、遠心分離ステップ及びヒアルロニダーゼによる消化を設定した。
３．４．１．ヒアルロニダーゼ消化
ヒアルロニダーゼの原液（Bovine Testes Sigma からのヒアルロニダーゼ型、 Ｈ３５０６）を、２００及び２μｇ／ｍｌの濃度で、０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて希釈した。それらの溶液を、次の３種の試料に添加した：１）ブランクの関節液、２）１０００ｐｇ／ｍｌ（最終濃度１００ｐｇ／ｍｌ）での分析物の添加を伴っての関節液、及び３）２００ｐｇ／ｍｌ（最終濃度４０ｐｇ／ｍｌ）での分析物の添加を伴っての関節液。それらの試料を、ＲＴ下で３０分間、振盪下でインキュベートした。インキュベーションの最後で、試料を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにより１：５又は１：１０に希釈し、そしてパラグラフ３．１に記載される手段に従って分析した。
結果
表７に示されるように、ヒアルロニダーゼにより関節液を消化することによる結果の改善が、ブランク試料及びスパイク試料の両者について１：５の希釈度でのみ得られた。試験される２種の濃度のヒアルロニダーゼ間で、最良のものは１０μｇ／ｍｌである。この処理は、スパイク試料について非常に低い％バイアスを生成したが、しかし実際の改善はブランク試料に関するものであるが、示される前の結果（表６を参照のこと）とは対照的に、処理されたほとんどすべての試料はＢＱＬであった。
表７：関節液消化のための実験の要約表。０．０１％ＢＳＡ＝ヒアルロニダーゼにより処理されていない試料、Ｈｙａｌ０．１μ濃度のヒアルロニダーゼにより処理された試料、Ｈｙａｌ１０μｇ／ｍｌ＝高濃度のヒアルロニダーゼにより処理された試料。ＡＶＧ ＢＣＣ：３回の反復の平均逆算濃度、％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。％ＣＶ：３回の反復の精度。ＢＱＬ＝定量の下限以下。標準曲線回帰を、ＸＩｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ロジスティック自動推定値１／ｙ2を用いて得た。式２０１。下線：許容基準から外れた結果。
３．４．２．遠心分離
分析物を含む３種のスパイク試料を、７５、２．５及び０．１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、プールされたヒト関節液を用いて調製し（ウェル中の最終濃度はそれぞれ、１５０００、５００及び３０ｐｇ／ｍｌである）、そして１３０００ｒｐｍで５分間、２度、遠心分離した。遠心分離の後、試料をＲｅｘｘｉｐ ＨＮ中で１：５に希釈し、そして２０、１０、５、１ｎｇ／ｍｌ、２００、５０、２０ｐｇ／ｍｌ（ウェル中の最終濃度）で、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ、Ｐ０００４９９６）において調製された標準曲線を用いて分析した。ブランク試料が追加された（ＳＴＤ０、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮのみ）。ブランクマトリックスも同様に処理した。この操作を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ技法手順に従って実施した。
結果
表８に示されるように、遠心分離ステップは、選択されたＭＲＤ１：５の後に分析されたスパイクされた試料の％ＢＩＡＳを改善しなかった。しかしながら、すべての試料は過大評価されたが、遠心分離後の試料は、ヒアルロニダーゼにより単に処理された試料よりも取り扱いが容易であった。この理由のために、２つの前処理を組合すことが決定された。
表８：関節液遠心分離についての実験の要約表。ＡＶＧ ＢＣＣ：３回の反復の平均逆算濃度、％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。％ＣＶ：３回の反復の精度。ＢＱＬ＝定量の下限以下。ＡＬＱ＝定量の限界以上。標準曲線回帰を、ＸＩｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ロジスティック自動推定値１／ｙ2を用いて得た。式２０１。
３．４．３．ヒアルロニダーゼ消化＋遠心分離
３種のスパイクされた試料及びブランク試料を、７５、２．５及び０．１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、ヒト関節液プールを用いて調製し（それぞれ、ウェル中の最終濃度は、１５００、５００及び３０ｐｇ／ｍｌであった）、そして１３０００ｒｐｍで５分間、２度、遠心分離した。０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、２００μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼの溶液を、それらのスパイクされた試料中で１：２０に希釈し、そして振盪下でＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後で、試料を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ中で１：５に希釈し、そして２０、１０、５、１ｎｇ／ｍｌ、２００、５０、２０ｐｇ／ｍｌ（ウェル中、最終濃度）で、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ緩衝液（Ｇｙｒｏｓ、Ｐ０００４９９６）において調製された標準曲線を用いて分析した。ブランク試料を加えた（ＳＴＤＯ、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮのみ）。この操作を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ技法手順に従って実施した。
結果
遠心分離及び酵素消化の組み合わせは、定量できなかった低ＳＳ（２０ｐｇ／ｍｌ未満、最も低い標準曲線点であった；表９を参照のこと）を除いて、試験されたすべての遠心分離についてよりも良好な結果を与えた。この時点で、選択された前処理は、以下の通りであった：
−１３’０００ｒｐｍで５分間、２度、試料の遠心分離；
−ヒアルロニダーゼ消化：１０μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼと共に振盪下での３０’ＲＴ；
−Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ中、ＭＲＤ１：５。
表９：関節液二重処理についての実験要約表。ＡＶＧ ＢＣＣ：３回の反復の平均逆算濃度、％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。％ＣＶ：３回の反復の精度。ＢＱＬ＝定量の下限以下。標準曲線回帰を、ＸＩｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ロジスティック自動推定値１／ｙ2を用いて得た。式２０１。
３．４．４．分析物への処理の影響
緩衝液中、３つの品質管理物を、１５０、１５００及び７５′０００ｐｇ／ｍｌの濃度で調製した（それぞれ、最終濃度は、３０、３００、１５′０００ｐｇ／ｍｌであった）。調製物の半分を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮ中で１：５に希釈し、そして他の半分を、１０μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼと共に２２℃で３０分間インキュベートした。
結果
試料の前処理がスプリフェルミンに害を及ぼすかどうかを検証するために、試料前処理の有無にかかわらず、３つの品質管理物を分析した。結果は、ヒアルロニダーゼ消化が分析物に影響を及ぼさないことを示し、処理された及び処理されていないＱＣから得られたＲＬＵは同等である（表１０及び図１０を参照のこと）。
表１０：結果の要約表。ヒアルロニダーゼ消化を伴って（処理された）又は伴わないで（処理されなかった）、３種のレベルの濃度（ＱＣ−低＝３０ｐｇ／ｍｌ、ＱＣ−中位＝５００ｐｇ／ｍｌ、ＱＣ−高＝１５０００ｐｇ／ｍｌ）でＲｅｘｘｉｐ ＨＮ中で調製されたＱＣ試料のＲＬＵ。
３．４．５．マトリックス前処理：最適化及び選択性の評価
方法の選択性を評価するための実験を、９個の個々のヒト関節液試料を用いて実施した。ヒアルロニダーゼの原液を、４００μｇ／ｍｌの濃度で、０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて調製し、９個の個々の関節液試料に添加した（１：２０の希釈度）。試料を、振盪下でＲＴで３０分間インキュベートし、そして次に、１３０００ｒｐｍで３０分間、２度、遠心分離した。マトリックス前処理の後、スプリフェルミンを、１００ｐｇ／ｍｌ（ＬＬＯＱ）の濃度で各９個の試料に添加し、そしてＡｌｐｈａＬＩＳＡ技法手順に従って、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて１：５に希釈した。
結果
いくつかの個々のヒト関節液試料を試験した後、ヒアルロニダーゼの濃度を２０μｇ／ｍｌに上げ、その後、遠心分離ステップを延期することが決められた。これは、異なった個体からの関節液がすべての場合において明らかにならなかったために行われた（データは示されていない）。表１１に示されるように、１０個の試料のうち９個の試料は、平均％ＢＩＡＳが±２５％以内であった。選択性についての許容基準は次の通りである：ＬＬＯＱ濃度でスパイクされた個々の試料の少なくとも８０％が±２５％の％ＢＩＡＳを有さなければならない。従って、許容基準が満たされます。
表１１：結果の要約表。ＬＬＯＱ濃度（１００μｇ／ｍｌ、最終濃度２０ｐｇ／ｍｌ）で平均３回反復してスパイクされた個々の関節液試料の逆算濃度。％ＢＩＡＳ：ＢＣＣの正確度。％ＣＶ＝ＢＣＣの精度。赤色：許容基準からの％ＣＶ又は％バイアス（±２５％）。
３．５．キャリーオーバー評価及びＧｙｒｏｌａｂ方法の最適化
キャリ−オーバー効果の存在を評価するために、洗浄溶液２（ＷＳ２：２０％エタノール中、１．５ＭのＮａＣｌ）を添加したカスタムメソド「Bioaffy 1000v1 mod wash」を用いてのカスタムランを実施した。以下の調製を行った：１）Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて次の濃度：２０、１０、５、１ｎｇ／ｍｌ、２００、５０、２０ｐｇ／ｍｌでスプリフェルミンを希釈することにより、標準曲線を調製し；２）ＱＣを、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて ２０ｎｇ／ｍｌで調製し；３）ブランク試料を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮのみにより調製した。
８本の針のそれぞれを負荷するための操作を設定した：
１．最初のブランク試料：
２．１つの標準曲線点；
３．２０ｎｇ／ｍｌのＱＣ試料；
４．最後のブランク試料。
捕捉試薬及び検出試薬を、すでに定義された濃度で使用した。
結果
Ｇｙｒｏｌａｂは、試料が、固定された組の針を用いて処理されるロボットシステムであるので、特定の評価を実行することにより、キャリーオーバー効果の可能性を排除する必要がある。この目的のために、各針にブランク試料、次に高濃度標準及び次にブランク試料を各針に負荷するよう実験を設定した。高濃度ＱＣの前後のすべてのブランクが濃度ＢＱＬを与えれたが（表１２を参照のこと）、しかしながら、前記の前後間の平均応答が増強し、このことは低い効果であっても、キャリーオーオバーが存在する可能性を示唆する。
表１２：キャリーオーバー評価の結果。前のブランクＲＬＵ、高いＱＣのＲＬＵ及び後のブランクのＲＬＵが、各針について報告されている。各試料についての平均データが提供されている。安定限界でのＳＴＤ．１ＲｌＵは、０．６５５であった。下線：外れ値。
３．５．１．ＬＬＯＱ試料に対する影響
前の実験で観察されたわずかなキャリーオーバーがＬＬＯＱ濃度で試料に影響を及ぼすかどうかを評価するために、実験を実施した。ブランク試料を、ＬＬＯＱ濃度（１００ｐｇ／ｍｌ、ウェル中の最終濃度２０ｐｇ／ｍｌ）でプールされた関節液スパイクされた試料により置換することにより、同じ評価を行った。
８本の針のそれぞれを負荷するための走査を設定した：
１．最初のＬＬＯＱ試料；
２．１つの標準曲線点；
３．２０ｎｇ／ｍｌのＱＣ試料；
４．最後のＬＬＯＱ試料。
前の実験に使用された同じ方法を用いて、高濃度試料の前後でＬＬＯＱ試料を試験し、そして針洗浄手順のわずかなマイナーな変化を伴っての修正された方法をまた評価した。ＷＳ２溶液を用いた針洗浄の追加のステップを、分析物添加のステップの前後に加えた。そらに、分析物添加ステップの間、追加の洗浄を付加し、この改変された方法を、「Bioaffy 1000 wash station 2 v2 beta1」と称した。
結果
試料に対するこの挙動性の影響を良く理解するために、ブランク試料を、ＬＬＯＱの濃度で分析物を含む試料により置換することにより、同じ評価を反復した。低濃度試料に対する実際の影響（表１３を参照のこと）を観察し、キャリーオーバーの実質的な存在を確認した。
表１３．キャリーオーバー評価の結果。ＬＬＯＱ前及びＬＬＯＱ後の逆算濃度（ｐｇ／ｍｌ）が各針について報告されている。平均データが各試料について提供される。濃度についての許容基準は、７５〜１２５ｐｇ／ｍｌである。下線：許容基準から外れた濃度（１００±２５％）。
表１４：キャリーオーバー評価の結果。ＬＬＯＱ前及びＬＬＯＱ後の逆算濃度（ｐｇ／ｍｌ）が各針について報告されている。平均データが各試料について提供される。濃度についての許容基準は、７５〜１２５ｐｇ／ｍｌである。下線：許容基準から外れた濃度（１００±２５％）。
逆に、針洗浄手順が改善された場合、低濃度試料に対する影響は、非常に限られており（表１４を参照のこと）、このことは、非常に低い濃度で実際の関節液試料を定量化する最適化された方法の正確性を確認した。
３．６．最終方法
３．６．１．要約
スプリフェルミンに対するビオチン化されたマウスモノクローナル抗体を、捕捉試薬（Ｆ４４）として使用し、そしてスプリフェルミンに対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６４７標識されたモノクローナル抗体を、検出試薬（Ｆ０５）として使用する。較正標準及び品質管理を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて調製する。未知の試料を、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮにおいて１：５の最小希釈液による前処理の後、分析する。この方法の範囲は、１５０ｐｇ／ｍｌ〜５０′０００ｐｇ／ｍｌであり、そしてＲｅｘｘｉｐ ＨＮを用いての希釈により、９．６μｇ／ｍｌまでさらに拡張される。較正曲線点：１０‘０００、５’０００、１０００、２００、１００、５０、３０、０ pg/mL。品質管理：ＱＣ−Ｈ： ７‘０００ pg/mL、ＱＣ−Ｍ: ５００ pg/mL、ＱＣ−Ｌ: ９０ pg/mL。
３．６．２．未知の試料の前処理
未知試料を、２０μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ溶液により処理する。ヒアルロニダーゼを、未知試料に添加し（例えば、３８μｌの未知試料への２μｌのヒアルロニダーゼ４００μｇ／ｍｌの添加）、揺り動かし、そして振盪下で２２℃で３０分間インキュベートする。ミニスピン遠心分離を用いて、１３，０００ｒｐｍで１０分間、未知試料を遠心分離する。分析の前、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮを用いて、処理された未知試料を、１：５に希釈する（例えば、４μｌの未知試料＋１６μｌのＲｅｘｘｉｐ ＨＰ）。
３．６．３．抗体の調製
コーティング抗体は、それが使用準備できていない場合、ＰＢＳ−Ｔ中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈されるべきである。検出抗体は、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆにおいて２０ｎＭで希釈され、そして光から保護されるべきである。
３．６．４．手順
１．すべての試薬を、分析の前、室温に戻し、
２．Ｇｙｒｏｌａｂを、スタンバイモードにし、Ｇｙｒｏｌａｂ制御ソフトウェア及び機器の電源を切り、そしてｍｉｌｌｉＱにより内部洗浄ステーションを実施し、
３．機器及びＧｙｒｏｌａｂ制御ソフトウェアの電源を入れ、ユーザーガイドに記載されるようにして、ＰＢＳ−Ｔによりシステムを初期化し、そしてプライミングし、
４．１週間に１度、ユーザーガイドに記載されるように、針の脱着を実施し、
５．洗浄ステーション２にＷＳ２溶液を連結し、そしてユーザーガイドに記載されるようにして、システムをプライムし、
６．３ステップウィザード方法「Bioaffy 1000 PBTM-087_PMT 5」を用いて新規の走査を創造する。較正標準及び品質管理は、３回反復してアッセイされるべきであり、一方、試料は単一レプリカでアッセイされるべきである。
７．較正基準、品質管理、未知の試料、捕捉及び検出抗体、及び洗浄緩衝液を、Ｇｙｒｏｌａｂ制御負荷リストに従って、マイクロプレートに添加する。マイクロプレートの蓋を覆い、そして光から保護する。
８．機器補助負荷手順により、必要に応じてマイクロプレート及びＣＤを負荷し、そして操作を開始する。
各ＳＤ溶液を三重反復して使用する。回帰分析にＳＴＤ−０を含めない。各校正標準の各反復の機器応答を用いて、ロジステック（自動推定、重み係数１／Ｙ2）式と標準曲線とを適用する。
それらの試料が定量の上限（５０，０００ｐｇ／ｍｌ）以上の濃度を有することが示唆される場合、分析の前、いくつかの未知試料を希釈することが可能である。最低希釈（１：５）で希釈された最初の試料から出発して、Ｒｅｘｘｉｐ ＨＮを用いて希釈を実施する。しかしながら、それは文書化されるべきである。
実際の試料濃度が方法の定量化の下限値（１５０ｐｇ／ｍｌ）以下である場合、それは、定量化の下限値以下（ＢＱＬ）として報告されるであろう。

Claims (11)

  1. ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を定量化する方法であって、以下のステップ：
    ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
    − ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
    − 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
    − 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
    を含み、
    ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
    ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
    ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
    ｅ）前記抗体が前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的に結合して抗体−タンパク質複合体を産生する条件下で、前記カラム中で、前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と接触させ、
    ｆ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
    ｇ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
    ｈ）産生された応答を測定し、
    ｉ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
    を含み、ここで、前記高度に正に荷電したタンパク質はＦＧＦ−１８タンパク質である、方法。
  2. ヒト関節液試料中の高度に正に荷電したタンパク質を自動で定量化する方法であって、以下のステップ：
    ａ）ヒト関節液試料を前処理し、ここで前記前処理ステップは、
    − ヒアルロニダーゼ溶液を前記ヒト関節液試料に添加し、
    − 前記試料を室温（ＲＴ）でインキュベートし、
    − 前記ヒト関節液試料を遠心分離すること
    を含み、
    ｂ）前処理された前記ヒト関節液試料を緩衝液で希釈し、
    ｃ）高度に正に荷電したタンパク質に対するビオチン化抗体をカラムに固定化し、
    ｄ）標準洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄して、未結合の抗体を除去し、
    ｅ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ自動輸送するための注入手段を提供し、
    ｆ）前処理され且つ希釈された前記ヒト関節液試料が前記カラムへ輸送される前に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
    ｇ）前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を前記カラムへ輸送し、それにより、前処理され且つ希釈されたヒト関節液試料を、固定化された前記ビオチン化抗体と、高度に正に荷電した前記タンパク質に前記抗体が特異的に結合する条件下で接触させて、抗体−タンパク質複合体を産生し、
    ｈ）前記ステップｇ）の後に、高イオン力緩衝液で前記注入手段を洗浄し、
    ｉ）前記カラムを標準洗浄緩衝液で洗浄し、
    ｊ）前記カラム中の抗体−タンパク質複合体へ、前記高度に正に荷電したタンパク質に特異的な、蛍光色素で標識した抗体を添加して、測定可能な応答を産生し、そして標準洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、
    ｋ）産生された応答を測定し、
    ｌ）前記試料で産生される応答を、較正標準を用いて産生される応答と比較することによって、前記試料中の高度に正に荷電したタンパク質の量を決定すること
    を含み、ここで、前記高度に正に荷電したタンパク質はＦＧＦ−１８タンパク質である、方法。
  3. 前記ＦＧＦ−１８タンパク質は、
    ａ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜２０７を含む、又はから成る、ポリペプチド；
    ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６を含む、又はから成る、ポリペプチド；及び
    ｃ）配列番号２を含む、又はから成る、ポリペプチド；
    から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＦＧＦ−１８タンパク質はスプリフェルミン（sprifermin）である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. ステップｂ）の希釈緩衝液はＲｅｘｘｉｐ（登録商標） ＨＮである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記高イオン力緩衝液は、少なくとも１Ｍの塩濃度を有する、請求項２に記載の方法。
  7. 前記高イオン力緩衝液は、２０％エタノール中の１．５Ｍ ＮａＣｌ液である、請求項６に記載の方法。
  8. ステップａ）のインキュベート時間は１時間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ヒト関節液試料は、１セットの試料群の一部である、請求項２に記載の方法。
  10. ステップｃ）のカラムは、１セットのカラム群中の１つのカラムである、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 全てのステップは、分析されるべき１セットのヒト関節液試料群中の高度に正に荷電したタンパク質を自動で定量化するために必要とされる限り繰り返される、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
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