JP6781873B2 - Electric field agitation method and cap cover for electric field agitation - Google Patents
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Description
本発明は、液滴に変動電界を印加して撹拌を行う電界撹拌方法、及び電界撹拌用キャップカバーに関する。
本発明は、インサイチュハイブリダイゼーション（In situ hybridization、ＩＳＨ）や免疫組織化学（Immunohistochemistry、ＩＨＣ）等の生体分子の検出方法に好適に用いることができる技術に関する。
The present invention relates to an electric field agitation method in which a fluctuating electric field is applied to a droplet to perform agitation, and a cap cover for electric field agitation.
The present invention relates to techniques that can be suitably used for methods for detecting biomolecules such as in situ hybridization (ISH) and immunohistochemistry (IHC).
生体組織切片等の固形の生体組織中に含まれる生体分子（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖等）を、生体分子を抽出することなく固形の生体組織中に存在したままで検出し、その分布をイメージングする方法には様々なものがある。これらの中でも、生体分子に特異的に結合する分子を利用した検出とイメージングが最も広く行われており、核酸同士の相補的結合を利用したインサイチュハイブリダイゼーション（In situ hybridization、ＩＳＨ）や、特定の生体分子に特異的な抗体を用いた、いわゆる免疫組織化学（Immunohistochemistry、ＩＨＣ、別名「免疫染色」とも呼ばれる。）が一般的な手法となっている。 Biomolecules (proteins, DNA, RNA, polysaccharides, etc.) contained in solid biological tissues such as biological tissue sections are detected as they exist in solid biological tissues without extracting biomolecules, and their distribution is determined. There are various methods of imaging. Among these, detection and imaging using molecules that specifically bind to biomolecules are the most widely performed, and in situ hybridization (ISH) using complementary binding between nucleic acids and specific specific So-called immunohistochemistry (Immunohistochemistry, IHC, also known as "immunostaining"), which uses biomolecule-specific antibodies, has become a common technique.
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いれば、患者から採取した組織や細胞に対して、特定の疾患に関連する特定の遺伝子やタンパク質の発現を顕微鏡観察することができるので、これらの手法は病理診断にもよく使用されている。
例えば、ＨＥＲ２遺伝子は、ヒト乳癌症例の１５〜２５％で遺伝子の増幅と、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現が認められる癌遺伝子であるが、ＨＥＲ２遺伝子増幅／ＨＥＲ２タンパク過剰発現のある乳癌患者は予後不良であり、ホルモン療法及びＣＭＦ療法に対する治療抵抗性を示すとの報告がある。また、ＨＥＲ２遺伝子増幅／タンパク過剰発現が確認された乳癌に対しては、ハーセプチチン（登録商標、一般名トラスツズマブ）の投与により、生存期間・生存率の有意な改善が認められている。
したがって、乳癌患者に対しては、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や免疫組織化学（ＩＨＣ）により、ＨＥＲ２遺伝子／ＨＥＲ２タンパク質の検査を行うことが、予後の予測と治療方針の決定において重要となる。
In situ hybridization (ISH) and immunohistochemistry (IHC) can be used to microscopically observe the expression of specific genes and proteins associated with specific diseases in tissues and cells collected from patients. These techniques are also commonly used for pathological diagnosis.
For example, the HER2 gene is a cancer gene in which 15-25% of human breast cancer cases have gene amplification and HER2 protein overexpression, but breast cancer patients with HER2 gene amplification / HER2 protein overexpression have a poor prognosis. There is a report that it shows resistance to hormone therapy and CMF therapy. In addition, for breast cancer in which HER2 gene amplification / protein overexpression was confirmed, administration of Herceptitin (registered trademark, generic name trastuzumab) significantly improved survival time and survival rate.
Therefore, for breast cancer patients, testing the HER2 gene / HER2 protein by in situ hybridization (ISH) or immunohistochemistry (IHC) is important in predicting prognosis and determining treatment strategies.
しかしながら、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や免疫組織化学（ＩＨＣ）による病理診断は、ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応に長時間を要するものであった。インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の場合には、全ての工程で通常１日〜２日程度の時間を要し、免疫組織化学（ＩＨＣ）法の場合には、通常７０分〜２００分程度の時間を要するものであった。 However, pathological diagnosis by in situ hybridization (ISH) or immunohistochemistry (IHC) requires a long time for hybridization and antigen-antibody reaction. In the case of in situ hybridization (ISH), it usually takes about 1 to 2 days for all steps, and in the case of immunohistochemistry (IHC), it usually takes about 70 to 200 minutes. It was necessary.
そこで、本発明者らは、核酸プローブや抗体を含む反応溶液を用いてドーム状の液滴を形成し、液滴に変動電界を印加して液滴を高速で振動させることにより、ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応を促進して、生体分子を迅速に検出する方法を開発した（特許文献１〜１０並びに非特許文献１〜３）。この方法によれば、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）であれば、全ての工程を６時間程度で行うことが可能となり、免疫組織化学（ＩＨＣ）法であれば、１５〜３０分程度で行うことが可能となる。このため、早期診断に基づく早期治療の有無が生死を分ける白血病のような急性疾患の病理診断を迅速に行うことが可能となり、また、癌などの手術中に患者から採取した組織を迅速に病理診断して（術中迅速病理診断）、手術の方針を決定することが可能となった。 Therefore, the present inventors form dome-shaped droplets using a reaction solution containing a nucleic acid probe or an antibody, apply a fluctuating electric field to the droplets, and vibrate the droplets at high speed to perform hybridization. We have developed a method for rapidly detecting a biomolecule by promoting an antigen-antibody reaction (Patent Documents 1 to 10 and Non-Patent Documents 1 to 3). According to this method, for example, in situ hybridization (ISH) can be performed in about 6 hours, and immunohistochemistry (IHC) method can be performed in about 15 to 30 minutes. It becomes possible. Therefore, it is possible to quickly make a pathological diagnosis of an acute disease such as leukemia whose life or death depends on the presence or absence of early treatment based on the early diagnosis, and to quickly pathologically diagnose tissues collected from a patient during surgery such as cancer. It became possible to make a diagnosis (rapid intraoperative pathological diagnosis) and decide the surgical policy.
このように液滴に変動電界を印加して撹拌させる方法は、「電界撹拌」とも呼ばれ、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や免疫組織化学（ＩＨＣ）に用いれば、生体分子を検出する時間を大幅に短縮することができるため、極めて有用な方法であり、さらなる改良発展が望まれていた。 This method of applying a fluctuating electric field to a droplet to stir it is also called "electric field agitation", and when used for in situ hybridization (ISH) or immunohistochemistry (IHC), it takes a large amount of time to detect a biomolecule. It is an extremely useful method because it can be shortened to, and further improvement and development have been desired.
従来の電界撹拌方法は、液滴に変動電界を印加することで液滴を撹拌する方法であるが、液滴の容量は通常１０〜５０μｌと微量であり、液滴が蒸発しやすいという問題があった。電界撹拌により液滴を振動させるためには、振動するための空間が必要となることから、通常のインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や免疫組織化学（ＩＨＣ）のように、カバーガラスで反応溶液を被覆することにより蒸発を防ぐことができない。特に、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）では、液滴を加温してハイブリダイゼーションを行うため、液滴の蒸発がさらに促進されてしまい、試薬濃度が過剰に濃縮され、組織に取り付き強く染色されてしまうという問題があった。 The conventional electric field agitation method is a method of agitating a droplet by applying a fluctuating electric field to the droplet, but the volume of the droplet is usually as small as 10 to 50 μl, and there is a problem that the droplet is easily evaporated. there were. Since a space for vibration is required to vibrate the droplets by electric field agitation, the reaction solution is coated with a cover glass as in normal in situ hybridization (ISH) or immunohistochemistry (IHC). By doing so, evaporation cannot be prevented. In particular, in in situ hybridization (ISH), since the droplets are heated for hybridization, the evaporation of the droplets is further promoted, the reagent concentration is excessively concentrated, and the droplets are attached to the tissue and strongly stained. There was a problem.
本発明者らは以前に、高価な試薬を含む反応溶液を節約するために、油性の被覆液で嵩増しする方法を発明し、これにより液滴の蒸発も抑制できることを見出した（特許文献１０及び非特許文献２）。
しかしながら、油性の被覆液を用いる方法は、油性の被覆液の粘性のために電界撹拌効率が悪くなる上に、反応後の洗浄に手間がかかり、また、油性の被覆液が反応溶液と混合してハイブリダイゼーションにも影響してしまうという問題があった。
The present inventors have previously invented a method of bulking with an oil-based coating liquid in order to save a reaction solution containing an expensive reagent, and have found that this can also suppress evaporation of droplets (Patent Document 10). And non-patent document 2).
However, in the method using an oil-based coating liquid, the electric field stirring efficiency is deteriorated due to the viscosity of the oil-based coating liquid, and cleaning after the reaction is troublesome, and the oil-based coating liquid is mixed with the reaction solution. There was a problem that it also affected hybridization.
そこで、本発明は、上記従来の状況に鑑み、液滴の蒸発を抑制することができる新たな電界撹拌方法を開発することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to develop a new electric field agitation method capable of suppressing evaporation of droplets in view of the above-mentioned conventional situation.
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究した結果、液滴を覆うキャップカバーを使用することにより、液滴の蒸発を抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research in order to solve the above problems, the present inventors have found that the evaporation of droplets can be suppressed by using a cap cover that covers the droplets, and have completed the present invention. It was.
すなわち、本発明は、電界撹拌方法に関する下記の第１の発明と、生体分子の検出方法に関する下記の第２の発明と、電界撹拌用キットに関する下記の第３の発明を提供する。 That is, the present invention provides a first invention described below relates to a field stirring method, a second invention described below relates to a method for detecting biomolecules, the third invention described below relates to electric field stirred kit.
（１） 第１の発明は、液滴に変動電界を印加して前記液滴を撹拌する電界撹拌方法に関するものであり、
平板状の試料台上に前記液滴を形成し、
前記液滴を覆う中空のキャップカバーを、前記キャップカバーの下端が前記試料台上に載置されるように、前記試料台上に設け、
前記液滴に変動電界を印加する
ことを含むことを特徴とする。
（２） 第１の発明の電界撹拌方法においては、前記液滴に変動電界を印加したときに前記液滴が前記キャップカバーに接触することがないように、前記液滴との間に空間を設けて前記キャップカバーを前記試料台上に設けることが好ましい。
（３） 前記いずれかの電界撹拌方法においては、前記キャップカバーにより、前記液滴の周囲の空間を密閉した状態とすることが好ましい。
（４） 前記いずれかの電界撹拌方法においては、前記キャップカバーが、周囲に鍔を有することが好ましい。
（５） 第２の発明は、固形の生体試料中に含有される生体分子と前記生体分子に特異的な検出分子を結合させることにより、前記固形の生体試料中の前記生体分子を検出する方法に関するものであり、
Ａ）平板状の試料台上に前記固形の生体試料を裁置し、
Ｂ）前記検出分子を含む溶液を用いて、前記固形の生体試料を覆うように、前記試料台上に液滴を形成し、
Ｃ）前記液滴を覆う中空のキャップカバーを、前記キャップカバーの下端が前記試料台上に載置されるように、前記試料台上に設け、
Ｄ）前記液滴に変動電界を印加することで前記液滴を撹拌して、前記固形の生体試料中に含まれる生体分子と前記検出分子とを結合させ、
Ｅ）前記生体分子に結合した前記検出分子により、前記生体分子の存在を検出する
ことを含むことを特徴とする。
（６） 第２の発明の生体分子の検出方法においては、前記液滴に変動電界を印加したときに前記液滴が前記キャップカバーに接触することがないように、前記液滴との間に空間を設けて前記キャップカバーを前記試料台上に設けることが好ましい。
（７） 前記いずれかの生体分子の検出方法においては、前記生体分子を核酸とし、前記検出分子を前記核酸に相補的な配列を有する核酸プローブとすることができ、前記Ｄ）において前記核酸と前記核酸プローブとをハイブリダイズさせることができる。
（８） このように前記核酸と前記核酸プローブとをハイブリダイズさせる場合には、前記Ｄ）において、前記液滴の温度を上昇させてハイブリダイズに適した温度に保つことが好ましい。
（９） 前記いずれかの生体分子の検出方法においては、前記生体分子をタンパク質とし、前記検出分子を前記タンパク質に特異的な抗体とすることができる。
（１０） 前記いずれかの生体分子の検出方法においては、前記キャップカバーとして、周囲に鍔を有するキャップカバーを用いることが好ましい。
（１１） 第３の発明は、撥水フレームを有する平板状の試料台と、前記撥水フレームの内部に形成された液滴を覆うために用いる電界撹拌用キャップカバーであって、非導電性の材料により形成され、中空な蓋様の形状を有し、下端を前記試料台上に載置することができる電界撹拌用キャップカバーとを含む、電界撹拌用キットに関する。
（１２） 第３の発明の電界撹拌用キットは、前記電界撹拌用キャップカバーと前記撥水フレームとが嵌合可能に形成されていることが好ましい。
（１３） 前記いずれかの電界撹拌用キットにおいては、前記電界撹拌用キャップカバーが、周囲に鍔を有していることが好ましい。
(1) The first invention relates to an electric field stirring method in which a fluctuating electric field is applied to a droplet to stir the droplet.
The droplets are formed on a flat sample table to form the droplets.
A hollow cap cover covering the droplets is provided on the sample table so that the lower end of the cap cover is placed on the sample table.
It is characterized by including applying a fluctuating electric field to the droplet.
(2) In the electric field agitation method of the first invention, a space is provided between the droplet and the droplet so that the droplet does not come into contact with the cap cover when a fluctuating electric field is applied to the droplet. It is preferable to provide the cap cover on the sample table.
(3) In any of the electric field agitation methods, it is preferable that the space around the droplet is sealed by the cap cover.
(4) In any of the electric field stirring methods, it is preferable that the cap cover has a collar around it.
( 5 ) The second invention is a method for detecting the biomolecule in the solid biosample by binding the biomolecule contained in the solid biosample to a detection molecule specific to the biomolecule. Is about
A) Place the solid biological sample on a flat sample table and place it.
B) Using the solution containing the detection molecule, a droplet is formed on the sample table so as to cover the solid biological sample.
C) A hollow cap cover covering the droplet is provided on the sample table so that the lower end of the cap cover is placed on the sample table.
D) The droplet is agitated by applying a fluctuating electric field to the droplet to bond the biomolecule contained in the solid biological sample and the detection molecule.
E) It is characterized in that the presence of the biomolecule is detected by the detection molecule bound to the biomolecule.
( 6 ) In the method for detecting a biomolecule of the second invention, between the droplet and the droplet so that the droplet does not come into contact with the cap cover when a fluctuating electric field is applied to the droplet. It is preferable to provide a space and provide the cap cover on the sample table.
( 7 ) In the method for detecting any of the biomolecules, the biomolecule can be a nucleic acid, and the detection molecule can be a nucleic acid probe having a sequence complementary to the nucleic acid. In D), the nucleic acid and the nucleic acid. The nucleic acid probe can be hybridized.
( 8 ) When the nucleic acid and the nucleic acid probe are hybridized in this way, it is preferable to raise the temperature of the droplets in D) to maintain the temperature suitable for hybridization.
( 9 ) In any of the above-mentioned methods for detecting a biomolecule, the biomolecule can be a protein and the detection molecule can be an antibody specific to the protein .
(10) In any of the above-mentioned methods for detecting biomolecules, it is preferable to use a cap cover having a brim around it as the cap cover.
(11 ) The third invention is a flat sample table having a water- repellent frame and a cap cover for electric field agitation used to cover the droplets formed inside the water-repellent frame, and is non-conductive. The present invention relates to an electric field agitation kit including a cap cover for electric field agitation, which is formed of the above-mentioned material, has a hollow lid-like shape, and has a lower end capable of being placed on the sample table .
( 12 ) In the electric field agitation kit of the third invention, it is preferable that the electric field agitation cap cover and the water-repellent frame are formed so as to be matable.
(13) In any of the electric field agitation kits, it is preferable that the electric field agitation cap cover has a collar around it.
本発明によれば、平板状の試料台上に形成した液滴を覆うことができる中空のキャップカバーを用いることにより、液滴が振動する空間を確保しつつ、液滴の周囲の空間の水蒸気分圧を高めることができるため、液滴の蒸発を効率的に抑制しつつ電界撹拌を行うことが可能となる。 According to the present invention, by using a flat hollow capable of covering the formed droplets onto the sample stage cap cover, while ensuring a space for droplets vibrates, the space around the droplet steam Since the partial pressure can be increased, it is possible to perform electric field stirring while efficiently suppressing the evaporation of droplets.
１． 電界撹拌方法
１−１． 本発明の電界撹拌方法の概要
本発明の電界撹拌方法は、液滴に変動電界を印加して液滴を撹拌する電界撹拌方法に関するものであり、
試料台上に液滴を形成し、
液滴を覆う中空のキャップカバーを試料台上に設け、
液滴に変動電界を印加する
ことを含むことを特徴とする。
1. 1. Electric field agitation method 1-1. Outline of the Electric Field Stirring Method of the Present Invention The electric field agitation method of the present invention relates to an electric field agitation method in which a fluctuating electric field is applied to a droplet to agitate the droplet.
Droplets are formed on the sample table and
A hollow cap cover covering the droplets is provided on the sample table,
It is characterized by including applying a fluctuating electric field to the droplet.
本発明の電界撹拌方法は、試料台上に液滴を形成し、中空のキャップカバーを試料台上に設けて液滴を覆った状態で、液滴に変動電界を印加する。このため、液滴が振動する空間を確保しつつ液滴を被覆して、液滴の周囲の空間の水蒸気分圧を高めて、液滴の蒸発を効率的に抑制しつつ電界撹拌を行うことが可能となる。 In the electric field agitation method of the present invention, a fluctuating electric field is applied to a droplet in a state where the droplet is formed on the sample table and a hollow cap cover is provided on the sample table to cover the droplet. Therefore, the droplets are coated while securing the space where the droplets vibrate, the partial pressure of water vapor in the space around the droplets is increased, and the electric field stirring is performed while efficiently suppressing the evaporation of the droplets. Is possible.
以下、本発明の電界撹拌方法の概要の理解を促すため、本発明の一例を、図面を参照しつつ説明する。
本発明の電界撹拌方法の一つの実施形態を図１に模式的に示す。
図１（Ａ）は、試料台上に液滴を形成した状態を示す図面であり、図１（Ｂ）は、液滴を覆うキャップカバーを試料台上に設けた状態を示す図面であり、図１（Ｃ）は、液滴に変動電界を印加した状態を示す図面である。
Hereinafter, in order to promote an understanding of the outline of the electric field agitation method of the present invention, an example of the present invention will be described with reference to the drawings.
One embodiment of the electric field agitation method of the present invention is schematically shown in FIG.
FIG. 1A is a drawing showing a state in which droplets are formed on the sample table, and FIG. 1B is a drawing showing a state in which a cap cover covering the droplets is provided on the sample table. FIG. 1C is a drawing showing a state in which a fluctuating electric field is applied to a droplet.
図１（Ａ）に示されるように、試料台１上に溶液を注入することにより液滴２を形成する。液滴２は、表面張力により中央が盛り上がったドーム状の形状となる。そして、液滴２は偏極するため、液滴２の表面にはマイナス電荷３が存在している。
図１（Ｂ）に示されるように、試料台１上に中空のキャップカバー４を設けることにより、液滴２の周囲をキャップカバー４で覆うことができる。このようにキャップカバー４を設けることで、液滴２の周囲の空間を密閉に近い状態とし、液滴２の蒸発によって液滴２の周囲の空間の水蒸気分圧及び湿度が高まり、液滴２のさらなる蒸発を抑制することができる。液滴２の周囲の空間はキャップカバー４により密閉することが好ましいが、密閉しなくとも液滴２の周囲の空間の水蒸気分圧及び湿度を高めることができれば、空気が通過できる貫通孔や試料台との間に隙間があってもよい。
As shown in FIG. 1 (A), the droplet 2 is formed by injecting the solution onto the sample table 1. The droplet 2 has a dome-shaped shape in which the center is raised due to surface tension. Since the droplet 2 is polarized, a negative charge 3 exists on the surface of the droplet 2.
As shown in FIG. 1 (B), by providing the hollow cap cover 4 on the sample table 1, the periphery of the droplet 2 can be covered with the cap cover 4. By providing the cap cover 4 in this way, the space around the droplet 2 is brought into a state close to being sealed, and the evaporation of the droplet 2 increases the partial pressure and humidity of water vapor in the space around the droplet 2, so that the droplet 2 is provided. Further evaporation can be suppressed. The space around the droplet 2 is preferably sealed by the cap cover 4, but if the partial pressure and humidity of water vapor in the space around the droplet 2 can be increased without sealing, a through hole or a sample through which air can pass can be obtained. There may be a gap between the table and the table.
図１（Ｂ）に示されるように、キャップカバー４の形状は液滴２の形状と同じくドーム状となっており、これにより、キャップカバー４内の空隙をできるだけ少なくしつつ、液滴２がキャップカバー４に接触することを防ぐことができる。
キャップカバー４の周囲には円周状の鍔（つば）４０１が設けられており、鍔４０１と試料台１とが密接して、キャップカバー４内を密閉に近い状態とすることができる。
As shown in FIG. 1 (B), the shape of the cap cover 4 is a dome shape similar to the shape of the droplet 2, whereby the droplet 2 can be formed while minimizing the voids in the cap cover 4. It is possible to prevent the cap cover 4 from coming into contact with the cap cover 4.
A circumferential brim 401 is provided around the cap cover 4, and the brim 401 and the sample table 1 are in close contact with each other, so that the inside of the cap cover 4 can be almost sealed.
図１（Ｃ）に示されるように、液滴２に変動電界を印加するには、上部電極５、下部電極６、高圧アンプ７及びファンクションジェネレータ８等からなる変動電界印加装置を用いる。
液滴２を形成した試料台１を変動電界印加装置にセットすると、液滴２の上方に上部電極５が位置し、液滴２の下方に下部電極６が位置する。そして、ファンクションジェネレータ８で発生させた信号を高圧アンプ７で昇圧して上下の電極５，６に供給する。ファンクションジェネレータ８で発生させた信号は、周期的に変化する信号であり、上部電極５と下部電極６に供給する電圧の大きさと符号が周期的に変化し、変動電界が発生する。液滴２の表面にはマイナス電荷３が帯電しているため、変動電界印加装置により変動電界を発生させると、変動電界の周波数に合わせて液滴２が周期的に振動し、液滴２が撹拌される。
As shown in FIG. 1C, in order to apply a fluctuating electric field to the droplet 2, a fluctuating electric field applying device including an upper electrode 5, a lower electrode 6, a high voltage amplifier 7, a function generator 8 and the like is used.
When the sample table 1 on which the droplet 2 is formed is set in the variable electric field application device, the upper electrode 5 is located above the droplet 2 and the lower electrode 6 is located below the droplet 2. Then, the signal generated by the function generator 8 is boosted by the high-voltage amplifier 7 and supplied to the upper and lower electrodes 5 and 6. The signal generated by the function generator 8 is a signal that changes periodically, and the magnitude and sign of the voltage supplied to the upper electrode 5 and the lower electrode 6 change periodically, and a fluctuating electric field is generated. Since the surface of the droplet 2 is charged with a negative charge 3, when a fluctuating electric field is generated by the fluctuating electric field application device, the droplet 2 vibrates periodically according to the frequency of the fluctuating electric field, and the droplet 2 is generated. It is agitated.
図１（Ｃ）に示されるように、上部電極５と液滴２の間には、キャップカバー４や空隙が存在している。また、下部電極６と液滴２の間には、試料台１が存在しており、この実施形態では、試料台１は絶縁性のスライドガラスとなっている。したがって、液滴２は上下の電極５，６とは絶縁されており、変動電界を印加しても液滴２に通電することはない。
図１に示す実施形態においては、キャップカバ−４として、非導電性のＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）等の樹脂製のキャップカバーを用いていることから、変動電界がキャップカバー４によって遮蔽されることなく、液滴２に変動電界を問題なく印加することが可能である。また、図１に示す実施形態においては、キャップカバー４は透明な樹脂製であるため、液滴２に接触しないようにキャップカバー４を設けることが容易であり、また、液滴２が電界撹拌により振動している様子を視認することができる。
As shown in FIG. 1C, there is a cap cover 4 and a gap between the upper electrode 5 and the droplet 2. Further, a sample table 1 exists between the lower electrode 6 and the droplet 2, and in this embodiment, the sample table 1 is an insulating slide glass. Therefore, the droplet 2 is insulated from the upper and lower electrodes 5 and 6, and the droplet 2 is not energized even when a fluctuating electric field is applied.
In the embodiment shown in FIG. 1, since a resin cap cover such as non-conductive PET (polyethylene terephthalate) is used as the cap cover-4, the fluctuating electric field is not shielded by the cap cover 4. , It is possible to apply a fluctuating electric field to the droplet 2 without any problem. Further, in the embodiment shown in FIG. 1, since the cap cover 4 is made of a transparent resin, it is easy to provide the cap cover 4 so as not to come into contact with the droplet 2, and the droplet 2 is electrically agitated. It is possible to visually recognize the state of vibration.
次に、図１に示す実施形態において、変動電界により液滴が振動する様子を図２に示す。
図２（Ａ）は、上部電極に正の電圧が供給され、下部電極に負の電圧が供給された状態を示し、図２（Ｂ）は、上部電極に負の電圧が供給されて、下部電極に正の電圧が供給された状態を示す。
Next, in the embodiment shown in FIG. 1, a state in which the droplet vibrates due to the fluctuating electric field is shown in FIG.
FIG. 2A shows a state in which a positive voltage is supplied to the upper electrode and a negative voltage is supplied to the lower electrode, and FIG. 2B shows a state in which a negative voltage is supplied to the upper electrode and the lower part is supplied. Indicates a state in which a positive voltage is supplied to the electrodes.
図２（Ａ）に示されるように、上部電極５に正の電圧が供給されるときには、下部電極６には、上部電極５とは符号が逆の負の電圧が供給されるため、上部電極５にプラス電荷９が蓄積する一方、下部電極６にはマイナス電荷１０が蓄積する。これにより、上部電極５から下部電極６に向かう電気力線を有する電界が発生している。この電界の中で、液滴２が帯びるマイナス電荷３は、上部電極５に蓄積したプラス電荷９に引きつけられ、下部電極６に蓄積したマイナス電荷１０と反発するので、上方向にクーロン力が働く。これにより、液滴２は、上方向に引きつけられ、盛り上がった形状となっている。
一方、図２（Ｂ）に示されるように、上部電極５に負の電圧が供給され、下部電極６に正の電圧が供給されるときには、上部電極５にマイナス電荷１０が蓄積し、下部電極６にプラス電荷９が蓄積する。これにより、下部電極６から上部電極５に向かう電気力線を有するに電界が発生している。この電界の中で、液滴２が帯びるマイナス電荷３は、上部電極５に蓄積したマイナス電荷１０と反発し、下部電極６に蓄積したプラス電荷９に引きつけられるので、下方向にクーロン力が働く。これにより、液滴２は、下方向につぶされて、平たい形状となる。
As shown in FIG. 2A, when a positive voltage is supplied to the upper electrode 5, a negative voltage whose sign is opposite to that of the upper electrode 5 is supplied to the lower electrode 6, so that the upper electrode is supplied with a negative voltage. The positive charge 9 is accumulated in 5, while the negative charge 10 is accumulated in the lower electrode 6. As a result, an electric field having electric lines of force from the upper electrode 5 to the lower electrode 6 is generated. In this electric field, the negative charge 3 carried by the droplet 2 is attracted to the positive charge 9 accumulated in the upper electrode 5 and repels the negative charge 10 accumulated in the lower electrode 6, so that a Coulomb force acts upward. .. As a result, the droplet 2 is attracted upward and has a raised shape.
On the other hand, as shown in FIG. 2B, when a negative voltage is supplied to the upper electrode 5 and a positive voltage is supplied to the lower electrode 6, a negative charge 10 is accumulated in the upper electrode 5 and the lower electrode 5 is charged. A positive charge 9 is accumulated in 6. As a result, an electric field is generated in having electric lines of force from the lower electrode 6 to the upper electrode 5. In this electric field, the negative charge 3 carried by the droplet 2 repels the negative charge 10 accumulated in the upper electrode 5 and is attracted to the positive charge 9 accumulated in the lower electrode 6, so that a Coulomb force acts downward. .. As a result, the droplet 2 is crushed downward to form a flat shape.
上部電極５と下部電極６に供給する電圧の大きさと符号が周期的に変化し、図２（Ａ）の状態と図２（Ｂ）の状態の間を周期的に往復することとなるため、液滴２はこの周期に従って振動することになる。図２（Ｂ）の状態のように下方向につぶされた液滴２は、スライドガラスの反作用によりバウンドして、電界の変化にあわせてスムーズに図２（Ａ）の状態に戻ることができる。
この液滴の周期的な振動により、液滴内部の液体は撹拌される。液滴の振幅は小さいが、液滴の振動の速度（周波数）は大きいため、液滴を効率よく撹拌することができる。
液滴２を激しく振動させると液滴２の蒸発は促進されるが、本発明においては、液滴２をキャップカバー４で覆うため、液滴２の蒸発を抑制することができる。
Since the magnitude and sign of the voltage supplied to the upper electrode 5 and the lower electrode 6 change periodically, the state of FIG. 2 (A) and the state of FIG. 2 (B) are periodically reciprocated. The droplet 2 vibrates according to this period. The droplet 2 crushed downward as in the state of FIG. 2 (B) bounces due to the reaction of the slide glass, and can smoothly return to the state of FIG. 2 (A) according to the change of the electric field. ..
The liquid inside the droplet is agitated by the periodic vibration of the droplet. Although the amplitude of the droplet is small, the vibration velocity (frequency) of the droplet is large, so that the droplet can be efficiently agitated.
When the droplet 2 is vibrated violently, the evaporation of the droplet 2 is promoted, but in the present invention, since the droplet 2 is covered with the cap cover 4, the evaporation of the droplet 2 can be suppressed.
１−２． 本発明の電界撹拌方法の詳細な条件
本発明において電界撹拌を行う「液滴」は、変動電界を印加することにより撹拌できるものであれば如何なるものであってもよく、純粋な液体を用いて液滴を形成できることができ、また、液体に他の物質が混合、分散若しくは溶解した液体を用いて液滴を形成することもできる。液体に他の物質が混合、分散又は溶解した液体としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、合成化合物、天然化合物、金属粒子等の化学物質、核酸、タンパク質、脂質等の生体分子、細胞、微生物、ウイルス、生体組織等の生物試料が、溶媒中に混合、分散又は溶解したものを用いることができる。
本発明によれば、液滴を電界撹拌することで、特殊な反応場を提供し、液滴内の化学反応、生物反応等を促進することができる。例えば、抗体と抗原が結合する抗原抗体反応や、相補的な核酸が塩基対を形成するハイブリダイゼーションや、有機化合物の合成反応等を電界撹拌により促進することができる。また、電界撹拌を行うことにより、液滴を用いた生体試料の洗浄等において洗浄作用を向上させることができる。さらに、電界撹拌を行うことにより、液滴内に分散した粒子の分散性を高めることや、液滴のゼータ電位を制御することや、液滴内で特殊な細胞培養、組織培養を行うことも可能である。
1-2. Detailed conditions of the electric field agitation method of the present invention The "droplets" for which electric field agitation is performed in the present invention may be any as long as they can be agitated by applying a fluctuating electric field, and a pure liquid is used. Droplets can be formed, and liquid droplets can also be formed using a liquid in which other substances are mixed, dispersed or dissolved in the liquid. The liquid in which other substances are mixed, dispersed or dissolved in the liquid is not limited to these, but for example, chemical substances such as synthetic compounds, natural compounds and metal particles, and biomolecules such as nucleic acids, proteins and lipids. , Cells, microorganisms, viruses, biological tissues and the like mixed, dispersed or dissolved in a solvent can be used.
According to the present invention, by electrically stirring the droplets, it is possible to provide a special reaction field and promote chemical reactions, biological reactions, etc. in the droplets. For example, an antigen-antibody reaction in which an antibody and an antigen bind, hybridization in which complementary nucleic acids form base pairs, a synthesis reaction of an organic compound, and the like can be promoted by electric field stirring. Further, by performing electric field agitation, the cleaning action can be improved in cleaning of a biological sample using droplets. Furthermore, by performing electric field agitation, the dispersibility of the particles dispersed in the droplet can be enhanced, the zeta potential of the droplet can be controlled, and special cell culture and tissue culture can be performed in the droplet. It is possible.
液滴の量は、通常、０．１μｌ〜１０００ｍｌの範囲である。特許文献８（特開２０１６−１４４４２２号公報）に記載されている液滴形成用シャーレを用いれば、大容量の液滴を形成することができ、また、特許文献９（特開２０１６−１４４７８０号公報）に記載されている反応デバイスを用いれば、微小な液滴を形成することができる。また、試料台上に撥水フレームを設けることにより、液滴の形成を容易とし、液滴の形状を維持し、また、液滴底面の径寸法のばらつきを抑制することができる。 The amount of droplets is usually in the range of 0.1 μl to 1000 ml. By using the petri dish for forming droplets described in Patent Document 8 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-144422), a large-capacity droplet can be formed, and Patent Document 9 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-144780) can be used. By using the reaction device described in JP), minute droplets can be formed. Further, by providing the water-repellent frame on the sample table, it is possible to facilitate the formation of droplets, maintain the shape of the droplets, and suppress variations in the diameter dimension of the bottom surface of the droplets.
本発明においては、試料台上に液滴を形成するが、ここで使用する「試料台」は、液滴を形成できるものであれば如何なるものであってもよく、例えば、平板状のものや、凹凸が形成されたものを用いることができる。「試料台」の具体例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、スライドガラス、マイクロタイタープレート、シャーレ、ビーカーや、特許文献８（特開２０１６−１４４４２２号公報）に記載された液体形成用シャーレや、特許文献９（特開２０１６−１４４７８０号公報）に記載された反応デバイス等を用いることができる。
液滴の形状は、変動電界を印加することにより撹拌できるものであれば如何なるものであってもよいが、表面張力により中央が盛り上がったドーム状の液滴を形成することが好ましい。
In the present invention, droplets are formed on the sample table, but the "sample table" used here may be any as long as it can form droplets, for example, a flat plate or the like. , Those having irregularities formed can be used. Specific examples of the "sample table" are not limited to these, but are described in, for example, a slide glass, a microtiter plate, a petri dish, a beaker, and Patent Document 8 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-144422). A petri dish for forming a liquid, a reaction device described in Patent Document 9 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-144780), and the like can be used.
The shape of the droplet may be any shape as long as it can be agitated by applying a fluctuating electric field, but it is preferable to form a dome-shaped droplet whose center is raised by surface tension.
本発明で使用する「キャップカバー」は、液滴を覆うことができ、中空となっていて液滴を振動させることができる空間を確保できるものであれば、如何なるものであってもよい。
キャップカバーとしては、中空の蓋様の形状を有するキャップカバーを用いることが好ましく、このようなキャップカバーで液滴に蓋をして、液滴の蒸発を効率的に抑制しつつ電界撹拌を行うことができる。
中空な蓋様の形状を有するキャップカバーとしては、例えば、これらに限定されるわけではないが、中空なドーム状のキャップカバーや、カップ状のキャップカバーや、円筒の蓋状のキャップカバーや、直方体又は立方体の蓋状のキャップカバー等を用いることができる。
液滴は通常ドーム状に形成されるため、中空なドーム状のキャップカバーを用いることが好ましく、キャップカバー内の空隙をできるだけ少なくしつつ、液滴がキャップカバーに接触することを防ぐことができる。
The "cap cover" used in the present invention may be any as long as it can cover the droplets and can secure a space that is hollow and can vibrate the droplets.
As the cap cover, it is preferable to use a cap cover having a hollow lid-like shape. The droplets are covered with such a cap cover, and electric field stirring is performed while efficiently suppressing the evaporation of the droplets. be able to.
The cap cover having a hollow lid-like shape is not limited to, for example, a hollow dome-shaped cap cover, a cup-shaped cap cover, a cylindrical lid-shaped cap cover, and the like. A rectangular parallelepiped or cubic lid-shaped cap cover or the like can be used.
Since the droplets are usually formed in a dome shape, it is preferable to use a hollow dome-shaped cap cover, which can prevent the droplets from coming into contact with the cap cover while minimizing the voids in the cap cover. ..
キャップカバーは、電界撹拌を行ったときに液滴に接触しないように設置することが好ましい。キャップカバーを液滴に接触させないことにより、液滴の振動が阻害されず、効率的に液滴を電界撹拌することが可能である。
ただし、液滴の振動が阻害されない形態であれば、キャップカバーは液滴の一部と接触してもよい。キャップカバーが液滴の一部と接触していても、液滴が振動できる空間が確保できれば、液滴を電界撹拌することが可能である。
The cap cover is preferably installed so as not to come into contact with the droplets when the electric field is stirred. By not contacting the cap cover with the droplet, the vibration of the droplet is not hindered, and the droplet can be efficiently agitated by electric field.
However, the cap cover may come into contact with a part of the droplet as long as the vibration of the droplet is not inhibited. Even if the cap cover is in contact with a part of the droplet, the droplet can be electrically agitated if a space where the droplet can vibrate can be secured.
本発明においては、キャップカバーにより液滴の周囲の空間を密閉することが好ましい。液滴の周囲の空間を密閉することにより、液滴の周囲の空間の水蒸気分圧及び湿度が高い状態を容易に維持できるため、液滴の蒸発を効率的に抑制することができる。
ただし、本発明においては、キャップカバーにより液滴の周囲の空間を密閉しなくとも、液滴の周囲の空間の水蒸気圧及び湿度を高めて液滴の蒸発を抑制できるのであれば、空気が通過できる貫通孔や試料台との間に隙間があってもよい。
In the present invention, it is preferable to seal the space around the droplet with a cap cover. By sealing the space around the droplet, it is possible to easily maintain a state in which the partial pressure of water vapor and the humidity in the space around the droplet are high, so that evaporation of the droplet can be efficiently suppressed.
However, in the present invention, air can pass through as long as the water vapor pressure and humidity in the space around the droplet can be increased to suppress the evaporation of the droplet without sealing the space around the droplet with the cap cover. There may be a gap between the through hole and the sample table.
本発明で使用するキャップカバーは、非導電性の材料で形成されていることが好ましい。キャップカバーが導電性の材料で形成されていると、キャップカバーの外部から変動電界を印加しても、静電遮蔽が生じて、液滴に印加する変動電界が弱まってしまう。このため、導電性ではなく非導電性の材料により形成されたキャップカバーを用いることにより、効率良く変動電界を液滴に印加することが可能となる。
非導電性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、樹脂、ガラス、エラストマー、セラミック等を用いることができる。樹脂としては、例えば、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂等を使用することができる。
The cap cover used in the present invention is preferably made of a non-conductive material. If the cap cover is made of a conductive material, even if a fluctuating electric field is applied from the outside of the cap cover, electrostatic shielding occurs and the fluctuating electric field applied to the droplet is weakened. Therefore, by using a cap cover formed of a non-conductive material rather than a conductive material, it is possible to efficiently apply a fluctuating electric field to the droplet.
The non-conductive material is not limited to these, and for example, resin, glass, elastomer, ceramic and the like can be used. As the resin, for example, a polyolefin resin, a polyester resin, a polycarbonate resin, or the like can be used.
本発明で使用するキャップカバーは、透明な材料で形成することが好ましい。キャップカバーを透明な材料で形成することにより、液滴に接触しないようにキャップカバーで液滴を覆うことが容易になるとともに、液滴が電界撹拌により振動している様子を視認することもできる。
透明な材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、透明な樹脂や、ガラス等を使用することができる。
The cap cover used in the present invention is preferably formed of a transparent material. By forming the cap cover with a transparent material, it becomes easy to cover the droplet with the cap cover so as not to come into contact with the droplet, and it is also possible to visually recognize how the droplet is vibrating by electric field agitation. ..
The transparent material is not limited to these, and for example, a transparent resin, glass, or the like can be used.
本発明においては、液滴に変動電界を印加するが、液滴を撹拌できるものであればどのような電圧、周期、波形の変動電界であってもよい。印加する変動電界の電圧は、液滴の大きさにより異なるが、十分に撹拌効果を生じさせるためには、０．３５〜２．５ｋｖ／ｍｍとするのが好ましい。また、印加する変動電界を発生させるための信号は、０．１〜８００Ｈｚとするのが好ましい。印加する変動電界を発生させるための信号は、方形波、正弦波、三角波、ノコギリ波などを使用することができるが、撹拌効率を高めるためには、瞬間的な変化の大きい方形波を用いるのが好ましい。また、液滴に波を生じさせるような動きにより撹拌を行う場合には、正弦波を用いることが好ましい。変動電界を発生させるための信号は、プラスとマイナスの間を反転する波形とすることもできるが、プラス側に偏って周期的に変化する波形を用いることもでき、また、マイナス側に偏って周期的に変化する波形を用いることもできる。 In the present invention, a fluctuating electric field is applied to the droplet, but any voltage, period, and waveform fluctuating electric field may be used as long as the droplet can be agitated. The voltage of the fluctuating electric field to be applied varies depending on the size of the droplets, but is preferably 0.35 to 2.5 kv / mm in order to sufficiently produce the stirring effect. Further, the signal for generating the fluctuating electric field to be applied is preferably 0.1 to 800 Hz. A square wave, a sine wave, a triangular wave, a sawtooth wave, etc. can be used as the signal for generating the fluctuating electric field to be applied, but in order to improve the stirring efficiency, a square wave having a large instantaneous change is used. Is preferable. Further, when stirring is performed by a movement that causes a wave in the droplet, it is preferable to use a sine wave. The signal for generating the fluctuating electric field can be a waveform that inverts between plus and minus, but a waveform that is biased to the plus side and changes periodically can also be used, or is biased to the minus side. It is also possible to use a waveform that changes periodically.
図３は、本発明の電界撹拌方法の他の一つの実施形態を示す図面であり、プラス側に偏って周期的に変化する変動電界を液滴に印加して電界撹拌を行う方法を模式的に示す。
図３（Ａ）は、上部電極に印加される正の電圧が最も大きくなった状態を示し、図３（Ｂ）は、上部電極に印加される正の電圧が最も小さくなった状態を示す。
FIG. 3 is a drawing showing another embodiment of the electric field agitation method of the present invention, and schematically shows a method of applying an electric field agitation to a droplet by applying a fluctuating electric field that is biased to the plus side and changes periodically. Shown in.
FIG. 3A shows a state in which the positive voltage applied to the upper electrode is the largest, and FIG. 3B shows a state in which the positive voltage applied to the upper electrode is the smallest.
図３（Ａ）に示されるように、上部電極５には高圧アンプ７から電圧が供給される。ここで、高圧アンプ７には、ファンクションジェネレータ８からプラス側に偏って周期的に変化する波形の信号が供給されることにより、高圧アンプ７から上部電極５に対して、電圧の大きさが周期的に変化する正の電圧が供給される。
図３（Ａ）は、上部電極５に印加される正の電圧が最も大きくなった状態を示しており、上部電極５に蓄積するプラス電荷９の量は、この時点で最大となる。そして、上部電極５に蓄積したプラス電荷９により、液滴２の表面のマイナス電荷３が大きく引きつけられて、液滴２は中央が盛り上がった形状となる。
As shown in FIG. 3A, a voltage is supplied to the upper electrode 5 from the high voltage amplifier 7. Here, the high-voltage amplifier 7 is supplied with a signal having a waveform that changes periodically in a positive direction from the function generator 8, so that the magnitude of the voltage is periodic from the high-voltage amplifier 7 to the upper electrode 5. A positive voltage that changes in a positive manner is supplied.
FIG. 3A shows a state in which the positive voltage applied to the upper electrode 5 is the largest, and the amount of the positive charge 9 accumulated in the upper electrode 5 is the maximum at this point. Then, the positive charge 9 accumulated on the upper electrode 5 greatly attracts the negative charge 3 on the surface of the droplet 2, and the droplet 2 has a shape in which the center is raised.
図３（Ｂ）は、上部電極５に印加される正の電圧が最も小さくなった状態を示しており、上部電極５に蓄積したプラス電荷９の量は、この時点で最小となる。そして、上部電極５に蓄積したプラス電荷９が少ないため、液滴２を引きつける上向きの力が極めて弱くなり、液滴２は重力により下方向に押しつぶされて、平たい形状となる。
上部電極５に印加される正の電圧の大きさは周期的に変化して、図２（Ａ）の状態と図２（Ｂ）の状態の間を周期的に往復することとなるため、液滴２はこの周期に従って振動することになる。
図３に示される実施形態によれば、電圧アンプ７として、上部電極５にのみ電圧を供給する電圧アンプを用いればよいため、変動電界印加装置のコストを削減することが可能となる。
FIG. 3B shows a state in which the positive voltage applied to the upper electrode 5 is the smallest, and the amount of the positive charge 9 accumulated in the upper electrode 5 is the minimum at this point. Since the positive charge 9 accumulated in the upper electrode 5 is small, the upward force that attracts the droplet 2 becomes extremely weak, and the droplet 2 is crushed downward by gravity to form a flat shape.
Since the magnitude of the positive voltage applied to the upper electrode 5 changes periodically and reciprocates periodically between the state of FIG. 2 (A) and the state of FIG. 2 (B), the liquid The drop 2 will vibrate according to this cycle.
According to the embodiment shown in FIG. 3, as the voltage amplifier 7, a voltage amplifier that supplies a voltage only to the upper electrode 5 may be used, so that the cost of the variable electric field application device can be reduced.
本発明においては、液滴に変動電界を印加して電界撹拌を行うが、液滴の振動が極めて小さく観察できないような場合でも、液滴が高速に振動することにより液滴内部において効率的に撹拌を行うことが可能である。 In the present invention, an electric field agitation is performed by applying a fluctuating electric field to the droplet, but even when the vibration of the droplet is extremely small and cannot be observed, the droplet vibrates at high speed to efficiently inside the droplet. It is possible to stir.
本発明においては、図１に示す実施形態のように、液滴を形成した後に、キャップカバーを試料台に設けてもよいが、先にキャップカバーを試料台に設けて、キャップカバーと試料台の間の隙間等から溶液を注入することにより液滴を形成することもできる。
また、本発明においては、図１に示す実施形態のように、キャップカバーを試料台に設けた後に、液滴に変動電界を印加してもよいが、キャップカバーを試料台に設ける前から、液滴に対する変動電界の印加を開始することもできる。ただし、この場合には、液滴の蒸発を防ぐため、変動電界の印加を開始した後すみやかにキャップカバーを設けることが好ましい。
In the present invention, as in the embodiment shown in FIG. 1, the cap cover may be provided on the sample table after forming the droplets, but the cap cover is first provided on the sample table, and the cap cover and the sample table are provided. Droplets can also be formed by injecting the solution through the gaps between them.
Further, in the present invention, as in the embodiment shown in FIG. 1, a fluctuating electric field may be applied to the droplet after the cap cover is provided on the sample table, but before the cap cover is provided on the sample table, It is also possible to start applying a fluctuating electric field to the droplet. However, in this case, in order to prevent the evaporation of the droplets, it is preferable to provide the cap cover immediately after starting the application of the fluctuating electric field.
２． 生体分子の検出方法
２−１． 本発明の生体分子の検出方法の概要
本発明の生体分子の検出方法は、固形の生体試料中に含有される生体分子と生体分子に特異的な検出分子を結合させることにより、固形の生体試料中の生体分子を検出する方法に関する。
ここで、「固形の生体試料」とは、生物の器官、生体組織、それらの一部、又はそれらの切片などの、固形状の生体試料を意味し、生体から抽出したタンパク質や核酸等の液体状の溶液を意味するものではない。固形の生体試料としては、生体組織の切片のように生体組織の形態を維持したものだけでなく、培養した細胞や血液、微生物等を包埋剤やゲル等でブロック状又はシート状にしたもののように、人工的に固形化した生体試料を用いてもよい。
2. Method for detecting biomolecules 2-1. Outline of the biomolecule detection method of the present invention The biomolecule detection method of the present invention is a solid biosample by binding a biomolecule contained in a solid biosample and a detection molecule specific to the biomolecule. The present invention relates to a method for detecting a biomolecule inside.
Here, the "solid biological sample" means a solid biological sample such as an organ, a biological tissue, a part thereof, or a section thereof, and is a liquid such as a protein or nucleic acid extracted from the living body. It does not mean a liquid solution. Solid biological samples include not only those that maintain the morphology of biological tissues such as sections of biological tissues, but also those in which cultured cells, blood, microorganisms, etc. are blocked or sheet-shaped with an embedding agent or gel. As described above, an artificially solidified biological sample may be used.
本発明において、「生体分子」とは、タンパク質、核酸、多糖類、脂質等の生体に存在する分子をいい、糖タンパク質のようにこれらの生体分子同士が結合したものも含む。
本発明において、生体分子に特異的な「検出分子」とは、これらに限定されるわけではないが、例えば、検出目的とするタンパク質に特異的な抗体、核酸に相補的な配列を有する核酸プローブ、生体分子に親和性のある低分子化合物や毒素、糖鎖と結合する能力を有するタンパク質であるレクチン等を用いることができる。
そして、検出分子として核酸プローブを用いることにより、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）による核酸の検出を行うことができ、また、検出分子として抗体を用いることにより、免疫組織化学（ＩＨＣ）によるタンパク質の検出を行うことができる。
In the present invention, the "biomolecule" refers to a molecule existing in a living body such as a protein, nucleic acid, polysaccharide, or lipid, and includes a molecule in which these biomolecules are bound to each other, such as glycoprotein.
In the present invention, the "detection molecule" specific to a biomolecule is not limited to these, but for example, an antibody specific to the protein to be detected and a nucleic acid probe having a sequence complementary to the nucleic acid. , Low molecular weight compounds and toxins that have an affinity for biomolecules, lectin, which is a protein having the ability to bind to sugar chains, and the like can be used.
Then, by using a nucleic acid probe as a detection molecule, nucleic acid can be detected by in situ hybridization (ISH), and by using an antibody as a detection molecule, protein can be detected by immunohistochemistry (IHC). It can be carried out.
本発明の生体分子の検出方法は、次のＡ）〜Ｅ）を含むことを特徴とする。
Ａ）試料台上に固形の生体試料を裁置すること
Ｂ）検出分子を含む溶液を用いて、固形の生体試料を覆うように、試料台上に液滴を形成すること
Ｃ）液滴を覆う中空のキャップカバーを試料台上に設けること
Ｄ）液滴に変動電界を印加することで液滴を撹拌して、固形の生体試料中に含まれる生体分子と検出分子とを結合させること
Ｅ）生体分子に結合した検出分子により、生体分子の存在を検出すること
The method for detecting a biomolecule of the present invention is characterized by including the following A) to E).
A) Placing a solid biosample on the sample table B) Using a solution containing the detection molecule to form droplets on the sample table so as to cover the solid biosample C) Droplets A hollow cap cover to cover is provided on the sample table. D) The droplets are agitated by applying a fluctuating electric field to the droplets to bond the biomolecules contained in the solid biological sample with the detected molecules. ) Detecting the presence of a biomolecule by a detection molecule bound to the biomolecule
以下、本発明の生体分子の検出方法の概要の理解を促すため、本発明の一例を、図面を参照しつつ説明する。
本発明の生体分子の検出方法の一つの実施形態を図４に模式的に示す。
図４（Ａ）は、試料台上に固形の生体試料を裁置した状態を示す図面であり、図４（Ｂ）は、検出分子を含む溶液を用いて、固形の生体試料を覆うように液滴を形成した状態を示す図面であり、図４（Ｃ）は、液滴を覆う中空のキャップカバーを試料台上に設けた状態を示す図面であり、図４（Ｄ）は、液滴に変動電界を印加することで液滴を撹拌して、固形の生体試料中に含まれる生体分子と検出分子とを結合させた状態を示す図面である。
Hereinafter, an example of the present invention will be described with reference to the drawings in order to promote an understanding of the outline of the method for detecting a biomolecule of the present invention.
An embodiment of the method for detecting a biomolecule of the present invention is schematically shown in FIG.
FIG. 4 (A) is a drawing showing a state in which a solid biological sample is placed on a sample table, and FIG. 4 (B) is a drawing showing a state in which a solid biological sample is placed so as to cover the solid biological sample with a solution containing a detection molecule. FIG. 4C is a drawing showing a state in which droplets are formed, FIG. 4C is a drawing showing a state in which a hollow cap cover covering the droplets is provided on a sample table, and FIG. 4D is a drawing showing a state in which the droplets are formed. It is a figure which shows the state in which a biomolecule contained in a solid biological sample and a detection molecule are bonded by agitating a droplet by applying a fluctuating electric field.
図４（Ａ）に示されるように、試料台１の上に、固形の生体試料１１を裁置する。固形の生体試料１１には、検出の対象となる生体分子１２が含まれている。
次に、図４（Ｂ）に示されるように、検出分子１３を含む溶液を用いて、固形の生体試料１１を覆うように、液滴２を形成する。ここで、検出分子１３は、生体分子１２に特異的に結合できる分子であり、あらかじめ蛍光色素又は発色酵素などにより標識しておくことが好ましい。
液滴２は偏極するため、液滴２の表面にはマイナス電荷３が存在している。
As shown in FIG. 4 (A), the solid biological sample 11 is placed on the sample table 1. The solid biological sample 11 contains a biomolecule 12 to be detected.
Next, as shown in FIG. 4B, a solution containing the detection molecule 13 is used to form the droplet 2 so as to cover the solid biological sample 11. Here, the detection molecule 13 is a molecule that can specifically bind to the biomolecule 12, and is preferably labeled in advance with a fluorescent dye, a color-developing enzyme, or the like.
Since the droplet 2 is polarized, a negative charge 3 is present on the surface of the droplet 2.
図４（Ｃ）に示されるように、試料台１上にキャップカバー４を設けることにより、液滴２の周囲をキャップカバー４で覆うことができる。キャップカバー４を設けることで、液滴２の周囲の空間を密閉に近い状態とし、液滴２の蒸発によって液滴２の周囲の空間の水蒸気分圧及び湿度が高まり、液滴２のさらなる蒸発を抑制することができる。 As shown in FIG. 4C, by providing the cap cover 4 on the sample table 1, the periphery of the droplet 2 can be covered with the cap cover 4. By providing the cap cover 4, the space around the droplet 2 is brought into a state close to being sealed, and the evaporation of the droplet 2 increases the partial pressure and humidity of water vapor in the space around the droplet 2, and further evaporation of the droplet 2. Can be suppressed.
図４（Ｄ）に示されるように、上部電極５、下部電極６、高圧アンプ７及びファンクションジェネレータ８等からなる変動電界印加装置により、液滴２に変動電界を印加する。液滴２の表面はマイナス電荷３が帯電しているため、変動電界を印加すると、図２及び３で示したのと同じ原理により、変動電界の周波数に合わせて液滴２が周期的に振動し、液滴２が撹拌される。
変動電界を印加して液滴を電界撹拌することにより、生体分子と検出分子との結合反応を促進することができる。例えば、非特許文献１及び２において実証されているとおり、電界撹拌によって、抗原と抗体の抗原抗体反応を促進し、標的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を促進することができるため、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）や、免疫組織化学（ＩＨＣ）の時間を短縮することや、検出感度を高めることが可能となる。
As shown in FIG. 4D, a fluctuating electric field is applied to the droplet 2 by a fluctuating electric field applying device including an upper electrode 5, a lower electrode 6, a high voltage amplifier 7, a function generator 8, and the like. Since the surface of the droplet 2 is charged with a negative charge 3, when a fluctuating electric field is applied, the droplet 2 oscillates periodically according to the frequency of the fluctuating electric field according to the same principle as shown in FIGS. Then, the droplet 2 is stirred.
By applying a fluctuating electric field to agitate the droplets, the binding reaction between the biomolecule and the detected molecule can be promoted. For example, as demonstrated in Non-Patent Documents 1 and 2, electric field agitation can promote the antigen-antigen reaction between an antigen and an antibody, and promote the hybridization reaction between a target nucleic acid and a nucleic acid probe. It is possible to shorten the time for hybridization (ISH) and immunohistochemistry (IHC), and to increase the detection sensitivity.
液滴のイオン等の濃度やｐＨが変化すると、生体分子と検出分子との結合反応が抑制されることがあるが、本発明の生体分子の検出方法によれば、液滴の蒸発を抑制して、イオン等の濃度やｐＨの変化を防ぐことができるので、安定した条件下に生体分子と検出分子とを結合させることができる。
また、キャップカバーは、液滴の周囲の空間を覆うことにより、液滴の温度の安定化にも寄与し、安定した温度条件下に生体分子と検出分子とを結合させることができる。生体分子と検出分子との結合反応は、温度によって影響され、特に、核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを行う場合には、温度が極めて重要な条件となる。
When the concentration or pH of droplet ions or the like changes, the binding reaction between the biomolecule and the detection molecule may be suppressed, but according to the biomolecule detection method of the present invention, the evaporation of the droplet is suppressed. Therefore, changes in the concentration and pH of ions and the like can be prevented, so that the biomolecule and the detection molecule can be bound under stable conditions.
In addition, the cap cover also contributes to the stabilization of the temperature of the droplet by covering the space around the droplet, and can bind the biomolecule and the detection molecule under stable temperature conditions. The binding reaction between the biomolecule and the detection molecule is affected by temperature, and temperature is a very important condition, especially when hybridization of nucleic acid and nucleic acid probe.
生体分子と検出分子とを結合させた後には、検出分子を含む溶液を取り除き、さらに、界面活性剤と低濃度の塩を有するバッファーを用いて洗浄を行うことにより、未反応の検出分子を取り除く。
検出分子は予め蛍光色素や発色酵素等で標識した場合には、蛍光や酵素による発色により、生体分子の存在を確認することが可能である。また、検出分子を直接標識せずに、検出分子に結合する標識抗体（２次抗体）を用いて、間接的に検出分子を標識して観察することも可能である。標識による発色を顕微鏡観察することにより、固形の生体試料中における生体分子の局在位置と発現量を色彩によりイメージングすることが可能となる。
After binding the biomolecule and the detection molecule, the solution containing the detection molecule is removed, and the unreacted detection molecule is removed by washing with a buffer having a surfactant and a low concentration salt. ..
When the detection molecule is previously labeled with a fluorescent dye, a color-developing enzyme, or the like, the presence of the biomolecule can be confirmed by fluorescence or color development by the enzyme. It is also possible to indirectly label and observe the detection molecule using a labeled antibody (secondary antibody) that binds to the detection molecule without directly labeling the detection molecule. By observing the color development by the label under a microscope, it becomes possible to image the localization position and expression level of biomolecules in a solid biological sample by color.
２−２． 本発明の生体分子の検出方法の詳細な条件
本発明の生体分子の検出方法のＡ）の工程においては、試料台上に、固形の生体試料を載置する。ここで、「試料台」としては、前記１−２．に記載したものを用いることができる。また、「固形の生体試料」とは、前記のとおり、生物の器官、生体組織、それらの一部、又はそれらの切片などの、固形状の生体試料を用いることができる。そして、固形の生体試料としては、生体組織の切片のように、生体組織の形態を維持したものだけでなく、培養した細胞や血液、微生物等を包埋剤やゲルでブロック状又はシート状にしたもののように、人工的に固形化した生体試料を用いることもできる。
2-2. Detailed conditions of the biomolecule detection method of the present invention In the step A) of the biomolecule detection method of the present invention, a solid biosample is placed on a sample table. Here, as the "sample table", the above-mentioned 1-2. Can be used as described in. Further, as the "solid biological sample", as described above, a solid biological sample such as an organ of an organism, a biological tissue, a part thereof, or a section thereof can be used. The solid biological sample is not limited to a solid biological sample that maintains the morphology of the biological tissue, but also a block or sheet of cultured cells, blood, microorganisms, etc. with an embedding agent or gel. It is also possible to use an artificially solidified biological sample as in the case of the above.
本発明の生体分子の検出方法において、「固形の生体試料」は、化学的あるいは物理的に固定されたものを用いてもよく、また、固定されていないものを用いてもよい。化学的な固定としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、スベリミド酸ジメチル二塩酸塩、四酸化オスミウム等を、生体組織や細胞に浸潤させ、生体組織・細胞内の高分子物質を架橋することによって不動化する方法がある。また、物理的な固定としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、煮沸やマイクロウェーブ照射による熱凝固や、凍結により生体組織・細胞内の高分子物質を不動化する方法がある。また、これらを組み合わせ、例えば、固形の生体試料を急速凍結後に、ホルマリン／アセトン中で置換固定したものであってもよい。その他、固形の生体試料に対しては、抗原賦活化等の処理を行ってもよい。
通常、器官や生体組織の一部を固形の生体試料とする場合、そのままの大きさで顕微鏡観察することが難しいため、ある程度の厚さの切片を作製する。切片の作製方法としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、固形の生体試料をＯＣＴコンパウンド等の凍結組織包埋剤に包埋し、凍結してから凍結ミクロトームにて薄切りする方法や、固形の生体試料を凍結せずにそのまま振動式ミクロトーム等により薄切りする方法や、固形の生体試料をパラフィンに包埋し冷却して硬くした後に、ミクロトームにて薄切りする方法などがある。
In the method for detecting a biomolecule of the present invention, the "solid biological sample" may be chemically or physically fixed, or may be non-fixed. The chemical fixation is not limited to these, but for example, formaldehyde, glutaaldehyde, dimethyl dihydrochloride sverimate, osmium tetroxide, etc. are infiltrated into living tissues and cells to infiltrate living tissues and cells. There is a method of immobilizing by cross-linking the polymer substance inside. The physical fixation is not limited to these, but there are, for example, a method of immobilizing a polymer substance in a living tissue / cell by thermal coagulation by boiling or irradiation with microwaves, or by freezing. Further, these may be combined and, for example, a solid biological sample may be rapidly frozen and then replaced and fixed in formalin / acetone. In addition, the solid biological sample may be subjected to a treatment such as antigen activation.
Normally, when a part of an organ or a biological tissue is used as a solid biological sample, it is difficult to observe it with a microscope in the same size, so a section having a certain thickness is prepared. The method for preparing the section is not limited to these, but for example, a method of embedding a solid biological sample in a frozen tissue embedding agent such as OCT compound, freezing it, and then slicing it with a frozen microtome. There are methods such as slicing a solid biological sample as it is without freezing with a vibrating microtome or the like, or burying a solid biological sample in paraffin, cooling and hardening it, and then slicing it with a microtome.
本発明の生体分子の検出方法のＢ）の工程においては、検出分子を含む溶液を用いて、固形の生体試料を覆うように液滴を形成する。液滴は、必ずしも固形の生体試料の全面を覆う必要はなく、一部のみを覆うように形成してもよい。
ここで、「検出分子」とは、検出目的とする生体分子に特異的に結合することができる分子である。そして、「検出分子」としては、前記のとおり、抗体や、核酸プローブ等を用いることができる。核酸プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡのみならず人工核酸を用いることもできる。
液滴の量や液滴の形状等については、固形の生体試料の大きさや形状に応じて適宜設定するが、前記１−２．に記載した条件と同様である。
In the step B) of the method for detecting a biomolecule of the present invention, a solution containing the detected molecule is used to form droplets so as to cover a solid biosample. The droplet does not necessarily have to cover the entire surface of the solid biological sample, and may be formed so as to cover only a part of the solid biological sample.
Here, the "detection molecule" is a molecule capable of specifically binding to a biomolecule to be detected. As the "detection molecule", as described above, an antibody, a nucleic acid probe, or the like can be used. As the nucleic acid probe, not only DNA and RNA but also artificial nucleic acids can be used.
The amount of droplets, the shape of the droplets, and the like are appropriately set according to the size and shape of the solid biological sample. The conditions are the same as those described in.
本発明の生体分子の検出方法のＣ）の工程においては、液滴を覆う中空のキャップカバーを試料台上に設ける。ここで使用する「キャップカバー」は、前記１−２．に記載したものと同様の形状及び材料のものを用いることができる。 In the step C) of the method for detecting a biomolecule of the present invention, a hollow cap cover covering the droplet is provided on the sample table. The "cap cover" used here is described in 1-2. The same shape and material as those described in 1 can be used.
本発明の生体分子の検出方法においては、キャップカバーにより液滴の周囲の空間を密閉することが好ましい。液滴の周囲の空間を密閉することで、液滴の周囲の空間の水蒸気分圧及び湿度が高い状態を容易に維持できるため、液滴の蒸発を効率的に抑制することができる。
ただし、本発明の生体分子の検出方法においては、キャップカバーにより液滴の周囲の空間を密閉しなくとも、液滴の周囲の空間の水蒸気圧及び湿度を高めて液滴の蒸発を抑制できるのであれば、空気が通過できる貫通孔や試料台との間に隙間があってもよい。
In the method for detecting a biomolecule of the present invention, it is preferable to seal the space around the droplet with a cap cover. By sealing the space around the droplet, it is possible to easily maintain a state in which the partial pressure of water vapor and the humidity in the space around the droplet are high, so that evaporation of the droplet can be efficiently suppressed.
However, in the method for detecting a biomolecule of the present invention, the evaporation of the droplet can be suppressed by increasing the water vapor pressure and humidity in the space around the droplet without sealing the space around the droplet with the cap cover. If there is, there may be a gap between the through hole through which air can pass and the sample table.
本発明の生体分子の検出方法においては、キャップカバーは、電界撹拌を行ったときに液滴に接触しないように設置することが好ましい。キャップカバーを液滴に接触させないことにより、液滴の振動が阻害されず、効率的に液滴を電界撹拌することが可能である。
ただし、液滴の振動が阻害されない形態であれば、キャップカバーは液滴の一部と接触してもよい。キャップカバーが液滴の一部と接触していても、液滴が振動できる空間が確保できれば、液滴を電界撹拌することが可能である。
In the method for detecting biomolecules of the present invention, it is preferable that the cap cover is installed so as not to come into contact with droplets when electric field agitation is performed. By not contacting the cap cover with the droplet, the vibration of the droplet is not hindered, and the droplet can be efficiently agitated by electric field.
However, the cap cover may come into contact with a part of the droplet as long as the vibration of the droplet is not inhibited. Even if the cap cover is in contact with a part of the droplet, the droplet can be electrically agitated if a space where the droplet can vibrate can be secured.
本発明の生体分子の検出方法のＤ）の工程においては、液滴に変動電界を印加することで液滴を撹拌して、固形の生体試料中に含まれる生体分子と検出分子とを結合させる。
ここで、液滴に印加する変動電界の電圧、周期、波形等は、前記１−２．に記載した条件と同様の条件とすることができる。
電界撹拌を行う時間は特に限定されないが、抗原抗体反応を行う場合には、通常１０秒〜２０分であり、ハイブリダイゼーションを行う場合には、通常１分〜６０分である。
In the step D) of the method for detecting a biomolecule of the present invention, the droplet is agitated by applying a fluctuating electric field to the droplet to bond the biomolecule contained in the solid biosample and the detected molecule. ..
Here, the voltage, period, waveform, etc. of the fluctuating electric field applied to the droplet are described in 1-2. The conditions can be the same as those described in.
The time for performing electric field stirring is not particularly limited, but is usually 10 seconds to 20 minutes when performing an antigen-antibody reaction, and usually 1 minute to 60 minutes when performing hybridization.
ハイブリダイゼーションを行う場合には、ペルチェ素子等を用いた温度制御装置により、液滴の温度がハイブリダイゼーションに適した温度となるように上昇させて、当該温度に保つことが好ましい。ハイブリダイゼーションに適した温度は、核酸の種類やＧＣ含量及び長さに応じて適宜設定することができ、通常３０〜７０℃である。
このように液滴の温度を上昇させた場合には、液滴がさらに蒸発しやすくなるが、キャップカバーを用いることにより液滴の蒸発を抑制することができる。
When hybridization is performed, it is preferable to raise the temperature of the droplets to a temperature suitable for hybridization by a temperature control device using a Peltier element or the like and maintain the temperature at that temperature. The temperature suitable for hybridization can be appropriately set according to the type of nucleic acid, GC content and length, and is usually 30 to 70 ° C.
When the temperature of the droplet is raised in this way, the droplet is more likely to evaporate, but the evaporation of the droplet can be suppressed by using the cap cover.
本発明の生体分子の検出方法のＥ）の工程においては、生体分子に結合した検出分子により、生体分子の存在を検出する。
Ｅ）における検出は、例えば、検出分子の発色や放射線等を利用して検出することができる。検出分子を発色させる方法としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、検出分子に酵素（発色酵素）、蛍光色素、蛍光タンパク質、色素等の標識をあらかじめ連結させる方法や、検出分子と生体分子が結合した後に、標識を連結した抗体等を検出分子に結合させる方法により、検出分子を発色させる方法がある。また、検出分子から放射線を発する方法としては、あらかじめ検出分子に放射性同位体を取り込ませて標識する方法を用いることができる。
In the step E) of the method for detecting a biomolecule of the present invention, the presence of the biomolecule is detected by the detection molecule bound to the biomolecule.
The detection in E) can be performed by using, for example, the color development of the detected molecule, radiation, or the like. The method for developing the color of the detection molecule is not limited to these, but for example, a method of preliminarily linking the detection molecule with a label such as an enzyme (color-developing enzyme), a fluorescent dye, a fluorescent protein, or a dye, or with the detection molecule. After the biomolecule is bound, there is a method of developing a color of the detected molecule by binding an antibody or the like to which the label is linked to the detection molecule. Further, as a method of emitting radiation from the detected molecule, a method of incorporating a radioisotope into the detected molecule in advance and labeling it can be used.
本発明の生体分子の検出方法において、検出分子として抗体を用いて、免疫組織化学（ＩＨＣ）による検出を行うことができる。また、検出分子として目的とする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブを用いて、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）による検出を行うことができる。
また、他の検出方法としては、例えば、これらに限定されるわけではないが、糖タンパク質の糖鎖にレクチンを結合させて検出する方法、Ｆ―アクチンというタンパク質にファロイジンという毒素を結合させて検出する方法、核酸に結合するタンパク質を、蛍光色素で標識した核酸で検出する方法（サウスウェスタン）等がある。
In the method for detecting a biomolecule of the present invention, an antibody can be used as a detection molecule for detection by immunohistochemistry (IHC). In addition, detection by in situ hybridization (ISH) can be performed using a nucleic acid probe having a sequence complementary to the target nucleic acid as a detection molecule.
In addition, other detection methods include, but are not limited to, a method of detecting by binding a lectin to a sugar chain of a glycoprotein, and a method of detecting by binding a toxin called phalloidin to a protein called F-actin. There are a method of detecting a protein that binds to a nucleic acid with a nucleic acid labeled with a fluorescent dye (Southwestern).
本発明の生体分子の検出方法のＡ）〜Ｄ）の工程は、必ずしもこの順に行う必要はない。例えば、試料台にキャップアカバーを設けるＣ）の工程の後に、キャップカバーと試料台の間の隙間から溶液を注入して液滴を形成することでＢ）の工程を行うことができる。また、キャップカバーを設けるＣ）の工程を行う前から、液滴に変動電界を印加するＤ）の工程を開始することもできる。 The steps A) to D) of the method for detecting a biomolecule of the present invention do not necessarily have to be performed in this order. For example, after the step C) in which the cap cover is provided on the sample table, the step B) can be performed by injecting a solution through the gap between the cap cover and the sample table to form droplets. It is also possible to start the step D) of applying a fluctuating electric field to the droplet before performing the step C) of providing the cap cover.
３． 電界撹拌用キャップカバー
本発明は、非導電性の材料により形成され、中空の蓋様の形状を有し、液滴に変動電界を印加して液滴を撹拌する電界撹拌を行うにあたり、液滴を覆うために用いる電界撹拌用キャップカバーを提供する。
本発明の電界撹拌用キャップカバーは、非導電性の材料により形成されているため、キャップカバーの外部から液滴に変動電界を印加しても、静電遮蔽により電界が遮られることなく、効率良く変動電界を液滴に印加することが可能となる。
非導電性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、樹脂、ガラス、エラストマー、セラミック等を用いることができる。樹脂としては、例えば、ポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂等を使用することができる。
3. 3. Cap cover for electric field agitation The present invention is formed of a non-conductive material, has a hollow lid-like shape, and applies a fluctuating electric field to a droplet to agitate the droplet. A cap cover for electric field agitation used for covering the above is provided.
Since the electric field stirring cap cover of the present invention is made of a non-conductive material, even if a fluctuating electric field is applied to the droplets from the outside of the cap cover, the electric field is not blocked by electrostatic shielding, and efficiency is achieved. It is possible to apply a fluctuating electric field to the droplet well.
The non-conductive material is not limited to these, and for example, resin, glass, elastomer, ceramic and the like can be used. As the resin, for example, a polyester resin, a polyolefin resin, a polycarbonate resin, or the like can be used.
本発明の電界撹拌用キャップカバーは、透明な材料で形成することが好ましい。キャップカバーを透明な材料で形成することにより、液滴に接触しないようにキャップカバーで液滴を覆うことが容易になるとともに、液滴が電界撹拌により振動している様子を視認することもできる。
透明な材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、透明な樹脂や、ガラス等を使用することができる。
The cap cover for electric field agitation of the present invention is preferably formed of a transparent material. By forming the cap cover with a transparent material, it becomes easy to cover the droplet with the cap cover so as not to come into contact with the droplet, and it is also possible to visually recognize how the droplet is vibrating by electric field agitation. ..
The transparent material is not limited to these, and for example, a transparent resin, glass, or the like can be used.
本発明の電界撹拌用キャップカバーは、中空の蓋様の形状を有しているため、液滴を覆うことができるのと同時に、液滴の振動に必要な空間を確保することができる。
中空な蓋様の形状を有するキャップカバーとしては、これらに限定されるわけではないが、例えば、中空なドーム状のキャップカバーや、カップ状のキャップカバーや、円筒の蓋状のキャップカバーや、直方体又は立方体の蓋状のキャップカバー等を用いることができる。
Since the cap cover for electric field agitation of the present invention has a hollow lid-like shape, it is possible to cover the droplets and at the same time secure a space required for vibration of the droplets.
The cap cover having a hollow lid-like shape is not limited to these, but for example, a hollow dome-shaped cap cover, a cup-shaped cap cover, a cylindrical lid-shaped cap cover, and the like. A rectangular parallelepiped or cubic lid-shaped cap cover or the like can be used.
本発明の電界撹拌用キャップカバーは、電界撹拌を行ったときに液滴が接触しない構造とすることが好ましく、これにより液滴の振動を阻害することを防ぐことができる。
液滴は通常ドーム状に形成されるため、電界撹拌用キャップカバーの形状を中空なドーム形状とすることが好ましく、キャップカバー内の空隙をできるだけ少なくしつつ、液滴がキャップカバーに接触することを防ぐ構造とすることができる。
ただし、液滴の振動が阻害されない形態であれば、キャップカバーは液滴の一部と接触してもよい。キャップカバーが液滴の一部と接触していても、液滴が振動できる空間が確保できれば、液滴を電界撹拌することが可能である。
The cap cover for electric field agitation of the present invention preferably has a structure in which the droplets do not come into contact with each other when the electric field agitation is performed, whereby it is possible to prevent the vibration of the droplets from being hindered.
Since the droplets are usually formed in a dome shape, the shape of the electric agitation cap cover is preferably a hollow dome shape, and the droplets come into contact with the cap cover while minimizing the voids in the cap cover. It can be a structure that prevents.
However, the cap cover may come into contact with a part of the droplet as long as the vibration of the droplet is not inhibited. Even if the cap cover is in contact with a part of the droplet, the droplet can be electrically agitated if a space where the droplet can vibrate can be secured.
本発明の電界撹拌用キャップカバーは、液滴の周囲の空間を密閉できる構造とすることが好ましい。そのような構造とするためには、例えば、これらに限定されるわけではないが、貫通孔を有しないキャップカバーとし、また、蓋様の形状のキャップカバーの周囲に、試料台と密接する鍔（つば）を設けることが好ましい。キャップカバーの周囲に形成された鍔と、試料台との間に、毛細管現象により微量の水を浸潤させれば、液滴の周囲の空間を完全に密閉することも可能である。
ただし、本発明の電界撹拌用キャップカバーは、液滴の周囲の空間を密閉しなくとも、液滴の周囲の空間の水蒸気圧及び湿度を高めて液滴の蒸発を抑制できるのであれば、空気が通過できる貫通孔や試料台との間に隙間があってもよい。
The cap cover for electric field agitation of the present invention preferably has a structure capable of sealing the space around the droplet. In order to obtain such a structure, for example, a cap cover having no through hole is used, and a collar close to the sample table is formed around the cap cover having a lid-like shape. It is preferable to provide a (brimmed). It is also possible to completely seal the space around the droplet by infiltrating a small amount of water between the collar formed around the cap cover and the sample table by capillarity.
However, the electric field stirring cap cover of the present invention can suppress the evaporation of droplets by increasing the water vapor pressure and humidity of the space around the droplets without sealing the space around the droplets. There may be a gap between the through hole through which the water vapor can pass and the sample table.
前記のとおり、本発明の電界撹拌用キャップカバーは、液滴が接触せず、貫通孔や試料台との間に隙間を有しない構造とすることが好ましいが、そのような構造に限定されるわけではなく、用途に応じて様々な構造とすることができる。
例えば、図５は、本発明の電界撹拌用キャップカバーの一つの実施形態を示す模式図であるが、キャップカバーの中央に外部と連通する管を有する構造となっている。
図５（Ａ）に示すように、液滴を形成する前に、キャップカバー４を試料台１上に裁置する。キャップカバー４の中央には両端が開放された管１４が設けられており、管１４によってキャップカバー４の内部と外部が連通している。次に、図５（Ｂ）に示すように、マイクロピペットの先端１５を管１４の内部に挿入して、マイクロピペットの先端１５を試料台１の表面に近づけた上で、溶液１６を注入する。溶液１６は、マイクロピペットの先端１５から流出して、試料台１上に広がる。図５（Ｃ）に示すように、溶液１６の注入が完了すると液滴２が形成される。
As described above, the cap cover for electric field agitation of the present invention preferably has a structure in which droplets do not come into contact with each other and have no gap between the through hole and the sample table, but the structure is limited to such a structure. However, various structures can be used depending on the application.
For example, FIG. 5 is a schematic view showing one embodiment of the electric field stirring cap cover of the present invention, which has a structure having a pipe communicating with the outside in the center of the cap cover.
As shown in FIG. 5A, the cap cover 4 is placed on the sample table 1 before forming the droplets. A pipe 14 having both ends open is provided in the center of the cap cover 4, and the inside and the outside of the cap cover 4 communicate with each other by the pipe 14. Next, as shown in FIG. 5 (B), the tip 15 of the micropipette is inserted into the tube 14, the tip 15 of the micropipette is brought close to the surface of the sample table 1, and then the solution 16 is injected. .. The solution 16 flows out from the tip 15 of the micropipette and spreads on the sample table 1. As shown in FIG. 5C, when the injection of the solution 16 is completed, the droplet 2 is formed.
４． 電界撹拌用キット
本発明は、電界撹拌用キャップカバーと、撥水フレームを有する試料台とを含む、電界撹拌用キットを提供する。
本発明の電界撹拌用キットに含まれる電界撹拌用キャップカバーは、非導電性の材料により形成され、中空の蓋様の形状を有しているものであり、前記３．に記載したものと同様のものを使用することができる。
4. Electric Field Stirring Kit The present invention provides an electric field agitation kit including a cap cover for electric field agitation and a sample table having a water-repellent frame.
The electric field agitation cap cover included in the electric field agitation kit of the present invention is formed of a non-conductive material and has a hollow lid-like shape. The same as those described in 1 can be used.
本発明の電界撹拌用キットに含まれる、撥水フレームを有する試料台は、試料台上に撥水性の材料で形成された枠（フレーム）を有しており、これにより液滴の形成を容易とし、液滴の形状を維持し、また、液滴底面の径寸法のばらつきを抑制することができる。
また、電界撹拌用キャップカバーと撥水フレームとを嵌合可能に形成することにより、電界撹拌用キャップカバーの位置ズレを防止し、また、電界撹拌用キャップカバーの内部の空間を密閉することができる。
The sample table having a water-repellent frame included in the electric field stirring kit of the present invention has a frame (frame) formed of a water-repellent material on the sample table, which facilitates the formation of droplets. The shape of the droplet can be maintained, and the variation in the diameter dimension of the bottom surface of the droplet can be suppressed.
Further, by forming the electric field agitation cap cover and the water-repellent frame so as to be matable, it is possible to prevent the electric field agitation cap cover from being displaced and to seal the space inside the electric field agitation cap cover. it can.
図６に、本発明の電界撹拌用キットの一つの実施形態を模式的に示す。図６（Ａ）に示されるように、試料台１上には、リング状の撥水フレーム１７が設けられている。そして、撥水フレーム１７によって囲まれた円形領域の内部に溶液を注入することにより、液滴２を形成することができる。撥水フレーム１７は撥水性の材料で形成されているため、撥水フレーム１７ではじかれて液滴２は円形領域の内部に維持され、容量の大きな液滴でも容易に形成することができ、液滴の形状を維持し、また、液滴底面の径寸法のばらつきを抑制することができる。図６（Ｂ）に示されるように、電界撹拌用キャップカバーと撥水フレームとは嵌合可能に形成されており、電界撹拌用キャップカバー４を試料台１上に設けた場合に、電界撹拌用キャップカバー４の下端の内周面と、撥水フレーム１７の外周面とが密着する。これにより、電界撹拌用キャップカバー４の位置ズレを防止するとともに、電界撹拌用キャップカバー４内の空間を密閉することができる。このような電界撹拌用キットを用いることにより、液滴の蒸発を効率的に抑制しつつ、液滴を電界撹拌することが可能となる。 FIG. 6 schematically shows one embodiment of the electric field agitation kit of the present invention. As shown in FIG. 6A, a ring-shaped water-repellent frame 17 is provided on the sample table 1. Then, the droplet 2 can be formed by injecting the solution into the circular region surrounded by the water-repellent frame 17. Since the water-repellent frame 17 is made of a water-repellent material, it is repelled by the water-repellent frame 17 and the droplet 2 is maintained inside the circular region, and even a large-volume droplet can be easily formed. The shape of the droplet can be maintained, and the variation in the diameter dimension of the bottom surface of the droplet can be suppressed. As shown in FIG. 6B, the electric field agitation cap cover and the water-repellent frame are formed so as to be matable, and when the electric field agitation cap cover 4 is provided on the sample table 1, the electric field agitation is performed. The inner peripheral surface of the lower end of the cap cover 4 and the outer peripheral surface of the water-repellent frame 17 are in close contact with each other. As a result, the position of the electric field stirring cap cover 4 can be prevented from shifting, and the space inside the electric field stirring cap cover 4 can be sealed. By using such an electric field agitation kit, it is possible to efficiently agitate the droplets while suppressing the evaporation of the droplets.
本発明で使用する撥水フレームの形状は、液滴の形成を容易とするものであれば特に限定されないが、リング状の形状とすることが好ましい。ここでリング状とは、円形状、楕円形状、多角形状等とすることができるが、円形又は楕円状とすることが好ましい。また、撥水フレームをリング状の形状とした場合には、液滴を形成できるものであれば、一部が途切れていてもよいが、安定した液滴を形成するためには、途切れることなく連続する周を形成するリングとすることが好ましい。
また、撥水フレームに使用される撥水性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素系樹脂、オルガノポリシロキサンなどのシリコン樹脂等を用いることができる。
The shape of the water-repellent frame used in the present invention is not particularly limited as long as it facilitates the formation of droplets, but it is preferably ring-shaped. Here, the ring shape can be a circular shape, an elliptical shape, a polygonal shape, or the like, but is preferably a circular shape or an elliptical shape. Further, when the water-repellent frame has a ring shape, a part of the water-repellent frame may be interrupted as long as it can form droplets, but in order to form stable droplets, there is no interruption. It is preferable to use a ring that forms a continuous circumference.
The water-repellent material used for the water-repellent frame is not limited to these, but for example, a fluorine-based resin such as polytetrafluoroethylene or a silicon resin such as organopolysiloxane may be used. it can.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
（インサイチュハイブリダイゼーション）
本発明の電界撹拌方法を用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより、ＡＬＫ融合遺伝子の検出を行った。ＡＬＫ融合遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子と他の遺伝子が融合してできた異常なガン遺伝子であり、非小細胞肺がんの患者の３〜５％に認められる。ＡＬＫ遺伝子陽性の患者に対しては、ＡＬＫ阻害剤による治療が有効であることから、肺癌の病理診断においてＡＬＫ融合遺伝子の検出が行われている。
ＡＬＫ融合遺伝子の検出には、Vysis（登録商標）ALK Break Apart FISH probe kit（Abott社）を用いた。ＡＬＫ遺伝子に特異的で緑色蛍光色素で標識された核酸プローブと、ＡＬＫ遺伝子に隣接する領域に特異的で赤色蛍光色素で標識された核酸プローブとを用いて、ＦＩＳＨ（Fluorescence In Situ Hybridization）を行った。ＡＬＫ遺伝子転座がない場合には、２種類の蛍光色素により染色された肺癌細胞において緑と赤のシグナルが近接又は融合して黄色のシグナルとして観察される。一方、ＡＬＫ遺伝子転座がある場合には、２種類の蛍光色素により染色された肺癌細胞において、緑と赤のシグナルが分離して観察される。
ＦＩＳＨは次の実験手順により行った。
１）キットに含まれるPretreatment Bufferを用いて、肺癌患者から摘出された組織切片の前処理を行った。
２）組織切片を洗浄した後、キットに含まれるペプシン溶液に組織切片を浸漬して、ペプシンによるプロテアーゼ処理を行った。
３）組織切片を洗浄してスライドガラス上に裁置し、キットに含まれる核酸プローブ溶液を用いて組織切片上に液滴を形成した。
４）ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）により製造した電界撹拌用キャップカバーを、液滴を覆うようにスライドガラス上に裁置した。
５）スライドガラスを変動電界印加装置にセットして、８０℃に加熱してプローブの熱変成を行った。
６）液滴の温度が３７℃となるように保温し、変動電界を印加して電界撹拌を行いつつ、１８０分間ハイブリダイゼーションを行った。
７）ＳＳＣバッファーを用いて組織切片を５分間洗浄した後、風乾させた。
８）風乾させた組織切片にＤＡＰＩを滴下して核染色を行った。
９）染色した組織切片を蛍光顕微鏡により観察した。
(In situ hybridization)
The ALK fusion gene was detected by in situ hybridization using the electric field agitation method of the present invention. The ALK fusion gene is an abnormal cancer gene formed by fusing the ALK gene with other genes and is found in 3 to 5% of patients with non-small cell lung cancer. Since treatment with an ALK inhibitor is effective for ALK gene-positive patients, the ALK fusion gene is detected in the pathological diagnosis of lung cancer.
A Vysis (registered trademark) ALK Break Apart FISH probe kit (Abott) was used to detect the ALK fusion gene. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) was performed using a nucleic acid probe specific for the ALK gene and labeled with a green fluorescent dye and a nucleic acid probe specific for the region adjacent to the ALK gene and labeled with a red fluorescent dye. It was. In the absence of ALK gene translocation, green and red signals are observed as yellow signals in close proximity or fusion in lung cancer cells stained with two fluorochromes. On the other hand, when there is an ALK gene translocation, green and red signals are observed separately in lung cancer cells stained with two types of fluorescent dyes.
FISH was carried out according to the following experimental procedure.
1) Using the Pretreatment Buffer included in the kit, tissue sections removed from lung cancer patients were pretreated.
2) After washing the tissue section, the tissue section was immersed in the pepsin solution included in the kit and treated with pepsin for protease treatment.
3) The tissue section was washed and placed on a slide glass, and droplets were formed on the tissue section using the nucleic acid probe solution included in the kit.
4) A cap cover for electric field agitation manufactured by PET (polyethylene terephthalate) was placed on a slide glass so as to cover the droplets.
5) The slide glass was set in a variable electric field application device and heated to 80 ° C. to thermally metamorphose the probe.
6) The temperature of the droplet was kept at 37 ° C., and hybridization was performed for 180 minutes while applying a fluctuating electric field and stirring the electric field.
7) Tissue sections were washed with SSC buffer for 5 minutes and then air dried.
8) DAPI was added dropwise to the air-dried tissue sections for nuclear staining.
9) The stained tissue section was observed with a fluorescence microscope.
比較例として、電界撹拌を行わずに、キットのプロトコールに従ったFISHを行った。
すなわち、前記６）の実験手順において、熱変成した核酸プローブ溶液を組織切片上に滴下してカバーガラスで覆い、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
その他の実験手順は、上記と同様に行った。
As a comparative example, FISH was performed according to the kit protocol without electric field agitation.
That is, in the experimental procedure of 6) above, the thermally denatured nucleic acid probe solution was dropped onto a tissue section, covered with a cover glass, and hybridized at 37 ° C. for 16 hours.
Other experimental procedures were carried out in the same manner as above.
（インサイチュハイブリダイゼーションの結果）
インサイチュハイブリダイゼーションを行った組織切片を、顕微鏡観察した結果を図７に示す。
図７（Ａ）は、電界撹拌用キャップカバーを使用して電界撹拌によるハイブリダイゼーションを１８０分間行った場合の結果を示し、図７（Ｂ）は、電界撹拌を行わずに通常のハイブリダイゼーションを１６時間行った場合の結果を示す。
図７に示されるように、電界撹拌により短時間でハイブリダイゼーションを行った場合には、より短時間で従来のハイブリダイゼーションを行った場合と同等のシグナル強度が得られた。
(Result of in situ hybridization)
The results of microscopic observation of the tissue sections subjected to in situ hybridization are shown in FIG.
FIG. 7 (A) shows the result when hybridization by electric field agitation was performed for 180 minutes using a cap cover for electric field agitation, and FIG. 7 (B) shows normal hybridization without electric field agitation. The result when it performed for 16 hours is shown.
As shown in FIG. 7, when hybridization was performed in a short time by electric field stirring, signal intensity equivalent to that in the case of conventional hybridization in a shorter time was obtained.
（免疫組織化学）
本発明の電界撹拌方法を用いた免疫組織化学（免疫染色）により、ＨＥＲ２タンパク質の検出を行った。被検試料として、乳癌患者から摘出された組織切片を用い、１次抗体としてＨＥＲ２抗体を用いた。使用するＨＥＲ２抗体は通常５０倍希釈で用いられるが、検出限界感度を確認するため、１０００倍に希釈して使用した。ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）により製造した電界撹拌用キャップカバーにより液滴を覆い、室温にて電界撹拌を行いつつ、抗原抗体反応を行った。免疫染色は、次の表に示す実験手順により行った。
(Immunohistochemistry)
The HER2 protein was detected by immunohistochemistry (immunostaining) using the electric field stirring method of the present invention. A tissue section excised from a breast cancer patient was used as a test sample, and a HER2 antibody was used as a primary antibody. The HER2 antibody used is usually diluted 50-fold, but it was diluted 1000-fold to confirm the detection limit sensitivity. The droplets were covered with an electric field stirring cap cover manufactured of PET (polyethylene terephthalate), and an antigen-antibody reaction was carried out while performing electric field stirring at room temperature. Immunostaining was performed according to the experimental procedure shown in the following table.
比較例として、前記手順の７．と９．において、通常法として電界撹拌を行わず室温で静置して抗原抗体反応を行う免疫染色を行った。
検出限界を確認するために行った１０００倍希釈実験においては、免疫染色を行った組織切片を顕微鏡観察すると、電界撹拌を行わずに静置して免疫染色を行った場合には、染色は認められなかった。一方、電界撹拌により免疫染色を行った場合には、染色が認められた。
この結果から、電界撹拌を追加すれば、抗体試薬を１０００倍に希釈しても、免疫染色を行うことが可能であることが明らかとなった。
As a comparative example, 7. And 9. In the above, as a usual method, immunostaining was performed in which an antigen-antibody reaction was carried out by allowing the mixture to stand at room temperature without electric field stirring.
In the 1000-fold dilution experiment conducted to confirm the detection limit, when the immunostained tissue section was observed under a microscope, staining was observed when the immunostaining was performed by standing still without electric field stirring. I couldn't. On the other hand, when immunostaining was performed by electric field stirring, staining was observed.
From this result, it was clarified that immunostaining can be performed even if the antibody reagent is diluted 1000 times by adding electric field stirring.
（液滴の蒸発量測定）
１次抗体希釈液（Dako製 Dako REAL Antibody Diluent）を用いて、実施例２の実験手順７により電界撹拌を行った場合における、液滴の蒸発量の測定を行った。電界撹拌用キャップカバーや電界撹拌の有無、そして温度による蒸発量への影響を調べるため、次の各条件により電界撹拌の前後における液滴の重量変化を測定することにより、液滴の蒸発量を測定した。
１） コントロール静置（３７℃）： ３７℃の条件下に電界撹拌を行わない。
２） Ｒ−ＩＨＣ（３７℃）： ３７℃の条件下に電界撹拌を行う。
３） Ｒ−ＩＨＣ（３０℃）： ３０℃の条件下に電界撹拌を行う。
４） Ｒ−ＩＨＣ＋キャップカバー（３７℃）： ３７℃の条件下に電界撹拌用キャップカバーを用いて電界撹拌を行う。
５） Ｒ−ＩＨＣ＋キャップカバー（３０℃）： ３０℃の条件下に電界撹拌用キャップカバーを用いて電界撹拌を行う。
６） Ｒ−ＩＨＣ（室温）： 室温下に電界撹拌を行う。
７） Ｒ−ＩＨＣ＋キャップカバー（室温）： 室温下に電界撹拌用キャップカバーを用いて電界撹拌を行う。
(Measurement of evaporation of droplets)
Using a primary antibody diluent (Dako REAL Antibody Diluent manufactured by Dako), the amount of evaporation of droplets was measured when the electric field was stirred according to the experimental procedure 7 of Example 2. In order to investigate the presence or absence of electric field agitation cap cover and electric field agitation, and the effect of temperature on the amount of evaporation, the amount of evaporation of droplets is measured by measuring the weight change of the droplet before and after electric field agitation under each of the following conditions. It was measured.
1) Control static (37 ° C): No electric field agitation is performed under the condition of 37 ° C.
2) RIHC (37 ° C.): Electric field agitation is performed under the condition of 37 ° C.
3) RIHC (30 ° C.): Electric field agitation is performed under the condition of 30 ° C.
4) R-IHC + cap cover (37 ° C.): Electric field agitation is performed using the electric field agitation cap cover under the condition of 37 ° C.
5) RIHC + cap cover (30 ° C.): Electric field agitation is performed using the electric field agitation cap cover under the condition of 30 ° C.
6) RIHC (room temperature): Electric field agitation is performed at room temperature.
7) R-IHC + cap cover (room temperature): Electric field agitation is performed at room temperature using an electric field agitation cap cover.
図８は、前記各条件にて液滴の蒸発量を測定した結果を示すグラフである。図８中、＊印は、コントロール静置（３７℃）における蒸発量に対して有意差のある蒸発量が計測されたことを示す。
図８に示されるように、室温下に電界撹拌を行っても液滴の蒸発量は静置の場合と大差ないが、３７℃又は３０℃の条件下に電界撹拌を行うと蒸発量が格段に大きくなることが明らかとなった。３７℃はHER2 FISHでハイブリダイゼーションを行う際に最適な温度であるが、かかる条件下に電界撹拌を行うと、液滴が蒸発して抗体が濃縮され、偽陽性をもたらす恐れがある。
一方、３７℃又は３０℃の条件下でも、キャップカバーを用いることにより、蒸発量を抑制できることが明らかとなった。免疫染色を行う場合や、それよりも長時間の電界撹拌を要するインサイチュハイブリダイゼーションを行う場合には、電界撹拌用キャップカバーによる蒸発抑制が極めて重要であることが明らかとなった。
FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the evaporation amount of the droplet under each of the above conditions. In FIG. 8, the * mark indicates that the amount of evaporation significantly different from the amount of evaporation in the control standing (37 ° C.) was measured.
As shown in FIG. 8, the amount of evaporation of the droplets is not much different from that in the case of standing still even if the electric field stirring is performed at room temperature, but the amount of evaporation is significantly increased when the electric field stirring is performed under the condition of 37 ° C. or 30 ° C. It became clear that it would grow in size. 37 ° C. is the optimum temperature for hybridization with HER2 FISH, but if electric field agitation is performed under such conditions, the droplets may evaporate and the antibody may be concentrated, resulting in false positives.
On the other hand, it was clarified that the amount of evaporation can be suppressed by using the cap cover even under the condition of 37 ° C. or 30 ° C. It has been clarified that the suppression of evaporation by the cap cover for electric field agitation is extremely important when performing immunostaining or in situ hybridization which requires electric field agitation for a longer time than that.
本発明の電界撹拌方法、生体分子の検出方法、電界撹拌用キャップカバー、及び電界撹拌用キットは、化学反応、生化学反応等を行うあらゆる産業分野で有用であり、特に、臨床検査、臨床検査用試薬、及び臨床検査装置の産業分野で有用である。 The electric field agitation method, the biomolecule detection method, the electric field agitation cap cover, and the electric field agitation kit of the present invention are useful in all industrial fields where chemical reactions, biochemical reactions, etc. are performed, and in particular, clinical examinations and clinical examinations. It is useful in the industrial field of reagents and clinical testing equipment.
１ 試料台
２ 液滴
３ マイナス電荷
４ キャップカバー
４０１ キャップカバーの鍔（つば）
５ 上部電極
６ 下部電極
７ 高圧アンプ
８ ファンクションジェネレータ
９ プラス電荷
１０ マイナス電荷
１１ 固形の生体試料
１２ 生体分子
１３ 検出分子
１４ 管
１５ マイクロピペットの先端
１６ 溶液
１７ 撥水フレーム
1 Sample stand 2 Droplets 3 Negative charge 4 Cap cover 401 Cap cover brim
5 Upper electrode 6 Lower electrode 7 High-pressure amplifier 8 Function generator 9 Positive charge 10 Negative charge 11 Solid biosample 12 Biomolecule 13 Detection molecule 14 Tube 15 Micropipette tip 16 Solution 17 Water-repellent frame
Claims (13)
平板状の試料台上に前記液滴を形成し、
前記液滴を覆う中空のキャップカバーを、前記キャップカバーの下端が前記試料台上に載置されるように、前記試料台上に設け、
前記液滴に変動電界を印加する
ことを含む電界撹拌方法。 In an electric field stirring method in which a fluctuating electric field is applied to a droplet to stir the droplet.
The droplets are formed on a flat sample table to form the droplets.
A hollow cap cover covering the droplets is provided on the sample table so that the lower end of the cap cover is placed on the sample table.
An electric field agitation method comprising applying a fluctuating electric field to the droplet.
Ａ）平板状の試料台上に前記固形の生体試料を裁置し、
Ｂ）前記検出分子を含む溶液を用いて、前記固形の生体試料を覆うように、前記試料台上に液滴を形成し、
Ｃ）前記液滴を覆う中空のキャップカバーを、前記キャップカバーの下端が前記試料台上に載置されるように、前記試料台上に設け、
Ｄ）前記液滴に変動電界を印加することで前記液滴を撹拌して、前記固形の生体試料中に含まれる生体分子と前記検出分子とを結合させ、
Ｅ）前記生体分子に結合した前記検出分子により、前記生体分子の存在を検出することを含む、生体分子の検出方法。 In a method for detecting a biomolecule in a solid biosample by binding a biomolecule contained in the solid biosample and a detection molecule specific to the biomolecule.
A) Place the solid biological sample on a flat sample table and place it.
B) Using the solution containing the detection molecule, a droplet is formed on the sample table so as to cover the solid biological sample.
C) A hollow cap cover covering the droplet is provided on the sample table so that the lower end of the cap cover is placed on the sample table.
D) The droplet is agitated by applying a fluctuating electric field to the droplet to bond the biomolecule contained in the solid biological sample and the detection molecule.
E) A method for detecting a biomolecule, which comprises detecting the presence of the biomolecule by the detection molecule bound to the biomolecule.
前記撥水フレームの内部に形成された液滴を覆うために用いる電界撹拌用キャップカバーであって、非導電性の材料により形成され、中空な蓋様の形状を有し、下端を前記試料台上に載置することができる電界撹拌用キャップカバーと
を含む、電界撹拌用キット。 A flat sample table with a water- repellent frame and
An electric field stirring cap cover used to cover the droplets formed inside the water-repellent frame, which is made of a non-conductive material and has a hollow lid-like shape, and the lower end is the sample table. An electric field agitation kit that includes an electric field agitation cap cover that can be placed on top .
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