JP2004347594A - Dispensing method of reagent to biological specimen and analysis method for biological specimen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞生物学、病理学、生化学等の医学・生物学分野に属し、特に生物試料標本に試薬を添加し反応させる方法及び反応産物を検出する方法に関する。 The present invention belongs to the medical and biological fields such as cell biology, pathology, and biochemistry, and particularly relates to a method for reacting a biological sample by adding a reagent thereto and a method for detecting a reaction product.
細胞、組織等の生体標本を解析する手段としては、顕微鏡観察が多く用いられる。この場合、標的の物質（タンパク質分子等）を同定する目的においては、特異抗体を介して標的の物質を標識し、その標識の発色、発光、蛍光等を検出するという方法が用いられてきた。また近年では、例えば特開２００１−２４９１２５号公報に記載されているように、試料切片に直接レーザー照射してマススペクトルを得る方法も提示されている。また、標的の物質の局在分布を知る目的においては、上記標識を用いた染色法、例えば米国特許第５８０８３００号明細書に記載されているようなＭＡＬＤＩ質量分析に基づくイメージング及び遺伝子組換えによって標的タンパク質に蛍光タンパク質を共発現させる方法等が用いられてきた。 Microscopic observation is often used as a means for analyzing biological specimens such as cells and tissues. In this case, for the purpose of identifying the target substance (protein molecule or the like), a method of labeling the target substance via a specific antibody and detecting the color development, luminescence, fluorescence, and the like of the label has been used. In recent years, as described in, for example, JP-A-2001-249125, a method of directly irradiating a sample section with a laser to obtain a mass spectrum has been proposed. For the purpose of knowing the local distribution of the target substance, the target is determined by a staining method using the above label, for example, imaging and genetic recombination based on MALDI mass spectrometry as described in US Pat. No. 5,808,300. A method of co-expressing a fluorescent protein with a protein has been used.
また、特開平１１−１８７９００号公報には、固相に対し、プローブを含む液体をインクジェット法によって供給し付着させ、プローブアレイを製造することが記載されている。 Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-187900 describes that a liquid containing a probe is supplied to and adhered to a solid phase by an ink-jet method to produce a probe array.
上記の生体標本を解析する手段はいずれも、サンプル全体に対してか、又は撥水性ゴム等を用いてサンプルの必要な部分を区画すること等によって限定した領域に対して処理を行っているため、処理に用いる試薬等の量を極限まで減らすことができない。また、特定の微小区域のみを解析したい場合でも隣接する区域のシグナルがバックグラウンドとして影響する。従って、１つのサンプル内の異なる領域において、異なる試薬を用いたり異なる手法の解析をしたりすることは困難であった。 All of the means for analyzing the biological specimen described above perform processing on the entire sample or on a limited area by partitioning a necessary portion of the sample using a water-repellent rubber or the like. However, the amount of reagents and the like used in the treatment cannot be reduced to the utmost. Further, even when it is desired to analyze only a specific minute area, a signal in an adjacent area affects the background. Therefore, it has been difficult to use different reagents or analyze different techniques in different regions in one sample.
そこで本発明の目的は、生体標本上の任意の位置に、数百ミクロンレベルの領域に限局して試薬を分注するとともに、分注される試薬の量をナノリットルレベルで制御する方法、及びその方法を用いた生体標本の解析方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to dispense a reagent at an arbitrary position on a biological specimen, limited to an area of several hundred microns, and to control the amount of the dispensed reagent at a nanoliter level, and An object of the present invention is to provide a method for analyzing a biological specimen using the method.
本発明者は、鋭意検討した結果、インクジェット技術を用いることによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventor has found that the above object can be achieved by using an ink-jet technology, and has completed the present invention.
本発明は以下の発明を含む。
（１） 細胞又は組織を含む生体標本上の特定の領域に対して、試薬溶液をインクジェット法により供給し付着させる、生体標本への試薬の分注方法。
（２） 前記細胞又は組織が、生体内における微細構造を保持している、（１）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
The present invention includes the following inventions.
(1) A method for dispensing a reagent to a biological specimen, in which a reagent solution is supplied to and adhered to a specific region on the biological specimen including cells or tissues by an inkjet method.
(2) The method for dispensing a reagent to a biological specimen according to (1), wherein the cells or tissues retain a microstructure in a living body.
（３） 前記生体標本は、前記細胞又は組織が包埋剤によって包埋されている、（１）又は（２）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（４） 前記包埋剤が、水、パラフィン、セロイジン、カーボワックス、ゼラチン、アルブミン、アガロース、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂、及びグリコールメタクリレートからなる群から選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の生体標本への試薬の分注方法。
(3) The method for dispensing a reagent into a biological specimen according to (1) or (2), wherein the biological specimen has the cells or tissues embedded by an embedding agent.
(4) The embedding agent is selected from the group consisting of water, paraffin, celloidin, carbowax, gelatin, albumin, agarose, epoxy resin, polyester resin, and glycol methacrylate, any of (1) to (3). 2. The method for dispensing a reagent to a biological specimen according to item 1.
（５） 前記試薬が、前記細胞又は組織中の標的物質と化学反応する化合物及び／又は前記細胞又は組織中の標的物質と特異的に結合する物質である、（１）〜（４）のいずれかに記載の生体標本への試薬の分注方法。
（６） 前記試薬溶液を供給し付着させた後、前記標的物質と前記試薬とを化学的又は生物学的に反応させる、（５）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
(5) Any of (1) to (4), wherein the reagent is a compound that chemically reacts with a target substance in the cell or tissue and / or a substance that specifically binds to a target substance in the cell or tissue. A method for dispensing a reagent into a biological specimen according to the above item.
(6) The method for dispensing a reagent into a biological specimen according to (5), wherein the target substance and the reagent are reacted chemically or biologically after supplying and attaching the reagent solution.
（７） 前記細胞又は組織中の標的物質と特異的に結合する物質が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、及び脂質からなる群から選ばれる少なくとも１つの生体物質、及び／又は前記生体物質と同様又は類似の結合能を有する類似化合物を含む、（５）又は（６）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
本発明においては、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方が含まれる。
(7) The substance that specifically binds to a target substance in the cell or tissue is at least one biological substance selected from the group consisting of proteins, peptides, nucleic acids, sugars, and lipids, and / or similar to the biological substance. Alternatively, the method for dispensing a reagent into a biological specimen according to (5) or (6), comprising a similar compound having a similar binding ability.
In the present invention, the nucleic acid includes both DNA and RNA.
（８） 前記細胞又は組織中の標的物質と特異的に結合する物質が、抗体、抗原及び酵素からなる群から選ばれる少なくとも１つの生体物質、及び／又は前記生体物質と同様又は類似の結合能を有する類似化合物を含む、（５）又は（６）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（９） 前記細胞又は組織中の標的物質と特異的に結合する物質が、前記生体物質の標識物質による標識体及び標識物質との複合体、及び、前記類似化合物の標識物質による標識体及び標識物質との複合体からなる群から選ばれる少なくとも１つである、（５）〜（８）のいずれかに記載の生体標本への試薬の分注方法。
(8) the substance that specifically binds to a target substance in the cell or tissue is at least one biological substance selected from the group consisting of an antibody, an antigen, and an enzyme; and / or the same or similar binding ability to the biological substance. The method for dispensing a reagent to a biological specimen according to (5) or (6), comprising a similar compound having
(9) A substance that specifically binds to a target substance in the cell or tissue is a labeled substance of the biological substance and a complex with the labeled substance, and a labeled substance and a labeled substance of the similar compound with a labeled substance The method for dispensing a reagent into a biological specimen according to any one of (5) to (8), which is at least one selected from the group consisting of a complex with a substance.
（１０） 前記標識物質が、蛍光物質、酵素、重金属含有物質、及び放射線同位元素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つである、（９）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（１１） 前記蛍光物質が、フルオレセインイソチオシアネート及び／又はテトラメチルローダミンイソチオシアネートである、（１０）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（１２） 前記酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、及びチロシナーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つである、（１０）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（１３） 前記重金属含有物質が、フェリチン及び／又は金コロイドである、（１０）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
(10) The method for dispensing a reagent into a biological specimen according to (9), wherein the labeling substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent substance, an enzyme, a heavy metal-containing substance, and a radioisotope-containing compound. .
(11) The method according to (10), wherein the fluorescent substance is fluorescein isothiocyanate and / or tetramethylrhodamine isothiocyanate.
(12) The method according to (10), wherein the enzyme is at least one selected from the group consisting of horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase, and tyrosinase.
(13) The method according to (10), wherein the heavy metal-containing substance is ferritin and / or colloidal gold.
（１４） 前記生体標本が、ガラス製支持体、樹脂製支持体及び金属製支持体からなる群から選ばれる支持体の表面に固着されているか、メンブレンに転写されているか、又は前記メンブレンに転写され且つ転写されたメンブレンが前記支持体の表面に固着されている、（１）〜（１３）のいずれかに記載の生体標本への試薬の分注方法。
（１５） 前記金属製支持体が質量分析用サンプルプレートである、（１４）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
（１６） 前記メンブレンがポリビニリデンジフルオリド、ニトロセルロース、ポリアミド、及びポリエチレンからなる群から選ばれる有機合成高分子又はその誘導体である、（１４）又は（１５）に記載の生体標本への試薬の分注方法。
(14) The biological specimen is fixed to the surface of a support selected from the group consisting of a glass support, a resin support and a metal support, is transferred to a membrane, or is transferred to the membrane. The method according to any one of (1) to (13), wherein the transferred and transferred membrane is fixed to the surface of the support.
(15) The method according to (14), wherein the metal support is a sample plate for mass spectrometry.
(16) The reagent according to (14) or (15), wherein the membrane is an organic synthetic polymer selected from the group consisting of polyvinylidene difluoride, nitrocellulose, polyamide, and polyethylene or a derivative thereof. Dispensing method.
（１７） 細胞又は組織を含む生体標本上の特定の領域に対して、試薬溶液をインクジェット法により供給し付着させて生体標本への試薬の分注を行った後、前記細胞又は組織中の標的物質を、顕微鏡観察又は質量分析によって解析する、生体標本の解析方法。
ここで、試薬の分注の方法としては、上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法を用いることができる。
（１８） 前記顕微鏡観察による解析において、前記標的物質の発色、発光、蛍光又は前記標的物質における放射性同位元素の存在を検出する、（１７）に記載の生体標本の解析方法。
（１９） 前記質量分析法が、レーザー脱離イオン化質量分析法である、（１７）に記載の生体標本の解析方法。
(17) After dispensing the reagent to the biological specimen by supplying and attaching the reagent solution to a specific area on the biological specimen including the cell or the tissue by the inkjet method, and then performing the target in the cell or the tissue, A method for analyzing a biological specimen, in which a substance is analyzed by microscopic observation or mass spectrometry.
Here, as a method for dispensing the reagent, the method described in any of the above (1) to (16) can be used.
(18) The method for analyzing a biological specimen according to (17), wherein in the analysis by the microscopic observation, color development, emission, fluorescence, or the presence of a radioisotope in the target substance is detected.
(19) The method for analyzing a biological specimen according to (17), wherein the mass spectrometry is laser desorption / ionization mass spectrometry.
本発明によれば、生体標本上の任意の位置に、数百ミクロンレベルの領域に限局して試薬を分注するとともに、分注される試薬の量をナノリットルレベルで制御する方法、及びその方法を用いた生体標本の解析方法が提供される。 According to the present invention, a method of dispensing a reagent to an arbitrary position on a biological specimen, limited to an area of several hundred microns level, and controlling the amount of the dispensed reagent at a nanoliter level, and a method thereof A method for analyzing a biological specimen using the method is provided.
本発明においては、生体標本の特定の領域に対し、インクジェット法を用いて試薬溶液を供給する。生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給することによって、生体標本に含まれる細胞又は組織中の、特定の構造及びその構成分子に試薬が分配される。このように、液滴を供給することによる試薬の分配を、分注と記載する。 In the present invention, a reagent solution is supplied to a specific region of a biological specimen using an inkjet method. By supplying the reagent solution to a specific region of the biological specimen, the reagent is distributed to a specific structure and its constituent molecules in cells or tissues contained in the biological specimen. In this way, the distribution of the reagent by supplying the droplet is referred to as dispensing.
また、本発明においては、インクジェット法を用いた分注方法を用い、標的物質を認識可能な形態にしたうえで解析する。これには顕微鏡観察や質量分析による方法等が用いられる。 In addition, in the present invention, a target substance is analyzed in a recognizable form by using a dispensing method using an inkjet method. For this, a method based on microscopic observation or mass spectrometry is used.
本発明における生体標本は、固相化処理を受けていない生物の細胞又は組織を含んでいる。細胞又は組織は、生体内における微細構造をそのまま保持した状態のものを用いることができる。このような状態を得るために、細胞又は組織が適当な包埋剤によって包埋されたものを用いることができる。包埋剤としては、観察の方法及び生体試料の適性に応じて特に限定することなく用いることができる。例えば、水、パラフィン、セロイジン、カーボワックス、ゼラチン、アルブミン、アガロース、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂等や、グリコールメタクリレート等の水溶性樹脂等を用いることができ、これら包埋剤は、当業者が適宜選択することができる。このような生体標本としては、例えば凍結切片等の未固定試料、パラフィン包埋切片等の固定化試料等を用いることができる。 The biological specimen according to the present invention contains cells or tissues of an organism that has not been subjected to the solid-phase treatment. As the cells or tissues, those in which the fine structure in the living body is maintained as they are can be used. In order to obtain such a state, cells or tissues embedded with an appropriate embedding agent can be used. The embedding agent can be used without any particular limitation depending on the observation method and the suitability of the biological sample. For example, water, paraffin, celloidin, carbowax, gelatin, albumin, agarose, epoxy resin, polyester resin and the like, and water-soluble resins such as glycol methacrylate and the like can be used, and these embedding agents are appropriately selected by those skilled in the art. can do. As such a biological specimen, for example, an unfixed sample such as a frozen section or an immobilized sample such as a paraffin-embedded section can be used.
このように、生体内における微細構造を保持した生体標本を用いることができるため、本発明の方法によって解析することができる標的物質の局在は、生体内におけるのと同じものとして形態学的に検証することができる。 As described above, since a biological specimen having a fine structure in a living body can be used, the localization of a target substance that can be analyzed by the method of the present invention is morphologically the same as that in a living body. Can be verified.
前記生体標本は、ガラス製支持体、樹脂製支持体、金属製支持体等の支持体の表面に固着させて使用するか、又は電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。メンブレンとしては、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ポリアミド、ポリエチレン等の有機合成高分子及びその誘導体を挙げることができる。ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられる。本発明において質量分析法を用いて解析する場合は、前記支持体には好ましくは金属製支持体、例えば質量分析用サンプルプレートを用い、これに生体標本を固着するか、又は生体標本をメンブレンに転写したものを前記サンプルプレートに貼り付ける等行うことによって固着して使用することができる。固着には導電性両面粘着テープ等を用いた固定を行うと良い。
これら標本は、必要に応じ、常法による染色、洗浄、脱塩等の前処理を行う。
The biological specimen can be used by being fixed to the surface of a support such as a glass support, a resin support, or a metal support, or electrically transferred to a membrane. Examples of the membrane include organic synthetic polymers such as polyvinylidene difluoride (PVDF), nitrocellulose, polyamide, and polyethylene, and derivatives thereof. Examples of the polyamide include nylon and the like. When analyzing using mass spectrometry in the present invention, the support is preferably a metal support, for example, using a sample plate for mass spectrometry, to which a biological sample is fixed, or the biological sample is attached to a membrane. The transcribed material can be fixed and used by attaching it to the sample plate or the like. For fixing, it is preferable to perform fixing using a conductive double-sided adhesive tape or the like.
These samples are subjected to pretreatment such as staining, washing, and desalting according to a conventional method, if necessary.
上述のようにして用意した生体標本上の特定の領域に対し、試薬溶液を分注する。本発明においては、分注方法としてインクジェット法を用い、試薬溶液の微小滴を前記特定の領域に供給し付着させる。本発明において用いるインクジェット法の機構としては、例えばピエゾ素子を利用したＵＳ４８７７７４５号公報に記載の機構（ピエゾジェット法）等を用いることができるが、これに限定されない。また、分注のための装置としては、例えばＷＯ９８／４７００６号公報に記載の装置を用いることができるが、これに限定されない。 The reagent solution is dispensed to a specific region on the biological specimen prepared as described above. In the present invention, an ink jet method is used as a dispensing method, and minute droplets of the reagent solution are supplied to and adhere to the specific region. As a mechanism of the ink jet method used in the present invention, for example, a mechanism (piezo jet method) described in US Pat. No. 4,877,745 using a piezo element can be used, but is not limited thereto. Further, as an apparatus for dispensing, for example, an apparatus described in WO98 / 47006 can be used, but the present invention is not limited to this.
図１は、本発明における試薬の分注の概念図である。これは本発明の実施の一態様を模式的に表している。生体標本又は生体標本を転写したメンブレン１は、ガラス、樹脂、金属等のサンプル支持体２に固着させている。生体標本又は生体標本を転写したメンブレン１の一部分に、試薬溶液を分注する特定の領域３を定める。前記特定の領域３上に、インクジェット吐出部４を配置し、領域３に対して試薬液滴５を吐出する。 FIG. 1 is a conceptual diagram of the dispensing of a reagent in the present invention. This schematically shows one embodiment of the present invention. The biological specimen or the membrane 1 to which the biological specimen has been transferred is fixed to a sample support 2 made of glass, resin, metal or the like. A specific region 3 for dispensing a reagent solution is defined in a biological specimen or a part of the membrane 1 to which the biological specimen has been transferred. An ink jet unit 4 is arranged on the specific area 3, and a reagent droplet 5 is discharged to the area 3.
本発明の分注方法においては、インクジェット法を用いることにより、極微量の試薬を吐出することが可能となる。このとき、１個のインクジェット吐出部からの１回の吐出につき分注される試薬量を例えば１００ｐｌ程度に制御することができるが、インクジェットの機構によっては、さらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことができるため、試薬量を分注する量の上限は特に限定されない。特定の１つの領域に対しては、例えばナノリットルレベル、通常１００ｎｌ程度の試薬量を分注することができる。従って、抗体溶液等、希少かつ高価な試薬であっても必要最低限の使用量しか消費しないため、大幅なコストダウンを図ることができる。 In the dispensing method of the present invention, it is possible to discharge a trace amount of reagent by using the ink jet method. At this time, the amount of reagent dispensed for one ejection from one inkjet ejection unit can be controlled to, for example, about 100 pl, but can be controlled to a smaller amount depending on the inkjet mechanism. Further, since the ejection can be repeated, the upper limit of the amount of the dispensed reagent is not particularly limited. For one specific region, for example, a reagent amount of a nanoliter level, usually about 100 nl can be dispensed. Therefore, even a rare and expensive reagent such as an antibody solution consumes only a minimum necessary amount, so that a significant cost reduction can be achieved.
本発明においては、例えば１００ｐｌ程度の吐出によって７８００μｍ２程度の極小の分注範囲を生じる。この分注範囲は、インクジェットの機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。さらに、インクジェット吐出部４の生体試料１平面上の相対位置を変えて分注位置をずらしていくと、任意の領域に試薬溶液を分注することができるため、分注範囲の上限は特に限定されない。特定の１つの領域に対する試薬溶液の分注範囲は、例えば数ｍｍ２程度であり、好ましくは１０ｍｍ２程度までである。 In the present invention, for example, a small dispensing range of about 7800 μm 2 is generated by discharging about 100 pl. This dispensing range can be limited to a smaller range by an ink jet mechanism. Furthermore, if the dispensing position is shifted by changing the relative position of the inkjet discharge unit 4 on the biological sample 1 plane, the reagent solution can be dispensed to an arbitrary region, and the upper limit of the dispensing range is particularly limited. Not done. The dispensing range of the reagent solution to one specific area is, for example, about several mm 2 , and preferably up to about 10 mm 2 .
また、同一生体標本上に特定の領域を２つ以上設定することも可能である。従って、同一生体標本上でも異なる領域で別種の試薬溶液を添加することが可能になり、複数種の解析を行うことが可能になる。 It is also possible to set two or more specific regions on the same biological specimen. Therefore, it is possible to add different types of reagent solutions in different regions even on the same biological specimen, and it is possible to perform a plurality of types of analysis.
本発明においては、上述のように極少量の試薬溶液を生体標本上の極小の領域に供給することができるため、従来のようにサンプル上に物理的な区画を構築する等の必要がない。このため、作業時間を低減することができるとともに区画の構築等によるサンプルの損傷を避けることができる。 In the present invention, since a very small amount of a reagent solution can be supplied to a very small area on a biological specimen as described above, there is no need to construct a physical compartment on the sample as in the related art. For this reason, the working time can be reduced and the sample can be prevented from being damaged due to the construction of the compartment.
本発明においては、生体標本中の特定の組織、さらには組織中の特定の分子等を標的物質とすることができる。例えば、抗原（ハプテンを含む）、抗体及び酵素等標的物質とすることができる。そして、これらの物質を含め、一般的にタンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を標的物質とすることができる。本発明における試薬としては、生体標本中の標的物質を認識可能な形態にすることによって、その局在を検出することができるものを用いると良い。なお、認識可能とは、可視化や質量分析等によって検出することができるこという。 In the present invention, a specific tissue in a biological specimen, or a specific molecule or the like in a tissue can be a target substance. For example, target substances such as antigens (including haptens), antibodies and enzymes can be used. And, generally, proteins, peptides, nucleic acids, sugars, lipids and the like, including these substances, can be targeted. As the reagent in the present invention, it is preferable to use a reagent capable of detecting the localization of a target substance in a biological specimen by forming the reagent in a recognizable form. Note that “recognizable” means that it can be detected by visualization, mass spectrometry, or the like.
本発明においては、前記試薬として、標的物質と化学反応する化合物や、標的物質と特異的に結合する物質を用いて、直接的又は間接的に認識化することができる。標的物質と化学反応する化合物としては、標的物質の化学的性質に応じて発色、発光、蛍光等の常法によって検出することができるものを特に限定されることなく用いることができる。 In the present invention, the reagent can be directly or indirectly recognized using a compound that chemically reacts with the target substance or a substance that specifically binds to the target substance. As the compound that chemically reacts with the target substance, a compound that can be detected by a conventional method such as coloring, luminescence, or fluorescence according to the chemical properties of the target substance can be used without particular limitation.
標的物質と特異的に結合する物質としては、生体物質でも合成物でも良い。前記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を挙げることができ、これら生体物質が有する特異的な結合能を利用することができる。すなわち、抗原とそれに対応する抗体、酵素とそれに対応する基質、核酸とそれに対応する核酸等の特異的結合を利用することができる。従って、前記標的物質と特異的に結合する物質は、例えば、抗体、抗原、酵素等として用いることができる。前記合成物としては、これら生体物質が有する機能と同様又は類似の結合能を有する、有機化合物や金属錯体等の類似化合物を用いることができる。類似化合物は、前記生体物質と構造において類似したものだけでなく、前記生体物質の特異的結合能としての機能において同様又は類似したものも含まれる。そのような類似化合物としては、前記生体物質の修飾体や、酵素モデル等が挙げられる。また、認識化の方法によっては、これら標的物質と特異的に結合する物質は、標識が導入されたものであっても良い。すなわち、標識物質によって標識された標識体や、標識物質との複合体であっても良い。 The substance that specifically binds to the target substance may be a biological substance or a synthetic substance. Examples of the biological substance include proteins, peptides, nucleic acids, sugars, lipids, and the like, and specific binding ability of these biological substances can be used. That is, specific binding between an antigen and its corresponding antibody, an enzyme and its corresponding substrate, and a nucleic acid and its corresponding nucleic acid can be used. Therefore, the substance that specifically binds to the target substance can be used, for example, as an antibody, an antigen, an enzyme, or the like. As the synthetic substance, an analogous compound, such as an organic compound or a metal complex, having the same or similar binding ability as the function of these biological substances can be used. Similar compounds include not only those that are similar in structure to the biological material, but also those that are similar or similar in function as the specific binding ability of the biological material. Examples of such similar compounds include modified forms of the above-mentioned biological substances, enzyme models, and the like. Further, depending on the recognition method, the substance that specifically binds to these target substances may be a substance into which a label has been introduced. That is, it may be a labeled body labeled with a labeling substance or a complex with the labeling substance.
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が抗原（ハプテンを含む）である場合、認識化のために免疫組織化学的手法を用いることができる。抗原としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等が挙げられる。免疫組織化学的手法としては、常法を用いることができる。すなわち、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属抗体法、放射線同位元素抗体法等を特に限定されることなく用いることができる。また、これら方法においては、標識抗体法及び非標識抗体法、さらには直接抗体法及び間接抗体法を問わない。従ってこの場合、本発明における試薬としては、タンパク質、ペプチド、又はこれらに標識物質が導入されたもの等、すなわち一次抗体、二次抗体等が挙げられる。さらにこれら抗体に対して染色等の可視化を行う場合は染色剤等も挙げられる。 In the present invention, when a biological substance as a target substance in a biological specimen is an antigen (including a hapten), an immunohistochemical technique can be used for recognition. Antigens include proteins, peptides, nucleic acids, sugars, lipids and the like. Conventional methods can be used as the immunohistochemical technique. That is, a fluorescent antibody method, an enzyme antibody method, a heavy metal antibody method, a radioisotope antibody method, or the like can be used without particular limitation. In addition, these methods are not limited to a labeled antibody method and an unlabeled antibody method, and may be a direct antibody method or an indirect antibody method. Therefore, in this case, examples of the reagent in the present invention include proteins, peptides, or those into which a labeling substance is introduced, such as a primary antibody and a secondary antibody. Further, in the case where visualization such as staining is performed on these antibodies, a staining agent or the like may be used.
標識物質としては、蛍光物質、酵素、重金属含有物質、放射線同位元素含有化合物、その他の化合物等を挙げることができる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が挙げられる。酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。重金属含有物質としては、フェリチン、金コロイド等が挙げられる。その他の化合物としては、酵素モデル等が挙げられる。また、標識物質としてビオチンを用いることもできる。さらにこれに伴い、標識されたビオチンとアビジンとの複合体や標識されたストレプトアビジンを試薬として用いることができる。
上記例示した試薬は、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
Examples of the labeling substance include a fluorescent substance, an enzyme, a heavy metal-containing substance, a radioisotope-containing compound, and other compounds. Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). Examples of the enzyme include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase, and tyrosinase. Examples of the heavy metal-containing substance include ferritin and gold colloid. Other compounds include enzyme models and the like. Biotin can also be used as a labeling substance. Along with this, a complex of labeled biotin and avidin or a labeled streptavidin can be used as a reagent.
The reagents exemplified above may be used alone or in combination of two or more.
なお、生体標本の標的物質の認識化は、前記抗体又は抗体に導入された標識物質に対応した方法で行う。具体的には、発色、発光、蛍光、放射性同位元素の存在等を検出することによって行う。認識化された生体標本の標的物質は、顕微鏡観察又は質量分析によって解析する。 The recognition of the target substance in the biological specimen is performed by a method corresponding to the antibody or the labeling substance introduced into the antibody. More specifically, the detection is performed by detecting color development, light emission, fluorescence, the presence of a radioisotope, and the like. The recognized target substance of the biological specimen is analyzed by microscopic observation or mass spectrometry.
図２は、標的物質の検出の一例を表す概念図であり、図１における試薬溶液を分注する特定の領域３を拡大して模式的に表したものである。試薬溶液を分注した特定の領域３には、可視化された標的物質のシグナル６が認識される。このシグナル６の局在を顕微鏡などを用いて観察する。 FIG. 2 is a conceptual diagram illustrating an example of the detection of a target substance, and schematically illustrates an enlarged specific region 3 into which a reagent solution is dispensed in FIG. In the specific region 3 into which the reagent solution has been dispensed, the visualized signal 6 of the target substance is recognized. The localization of this signal 6 is observed using a microscope or the like.
顕微鏡観察を行う場合は、例えば酵素に対しては、それに応じた適当な基質溶液を分注した上で発色法や発光法によって可視化し、光学顕微鏡で観察することができる。蛍光物質に対しては、適当な励起光を照射して蛍光を得る方法によって可視化し、蛍光顕微鏡やレーザー顕微鏡によって観察することができる。重金属含有物質に対しては、照射光の散乱によって可視化し、電子顕微鏡によって観察することができる。放射性同位元素に対しては、オートラジオグラフィー法によって可視化して観察することができる。 In the case of microscopic observation, for example, for an enzyme, an appropriate substrate solution is dispensed, visualized by a color-forming method or a luminescence method, and observed with an optical microscope. The fluorescent substance can be visualized by irradiating appropriate excitation light to obtain fluorescence, and can be observed with a fluorescence microscope or a laser microscope. The heavy metal-containing substance is visualized by scattering of irradiation light and can be observed with an electron microscope. The radioisotope can be visualized and observed by autoradiography.
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が酵素である場合、認識化のために酵素組織化学的手法を用いることができる。この場合、前記試薬としては、標的物質である酵素に応じた適当な基質を用い、常法によって標的物質の酵素を認識化することができる。 In the present invention, when a biological substance as a target substance in a biological specimen is an enzyme, an enzyme histochemical technique can be used for recognition. In this case, an appropriate substrate corresponding to the target substance enzyme can be used as the reagent, and the enzyme of the target substance can be recognized by a conventional method.
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）である場合、in situハイブリッド形成法を用いることができる。この場合、試薬としては、標的となる遺伝子を含む核酸とハイブリッド形成することができるＤＮＡプローブの標識体を用い、常法によって標的物質の核酸を認識化することができる。標識体の標識物質としては、免疫組織化学的手法において例示したものを含め、当業者が適宜定めると良い。 In the present invention, when a biological substance as a target substance in a biological specimen is a nucleic acid (including DNA and RNA), an in situ hybridization method can be used. In this case, a labeled substance of a DNA probe capable of hybridizing with a nucleic acid containing a target gene can be used as a reagent, and the nucleic acid of the target substance can be recognized by a conventional method. The labeling substance of the label may be appropriately determined by those skilled in the art, including those exemplified in the immunohistochemical technique.
質量分析を行う場合は、例えばレーザー脱離イオン化質量分析法を用いることができる。この場合、認識化された標的物質に対して例えば以下の操作を行う。まず、必要に応じて消化等の処理を行う。消化においては、例えば、トリプシンなどのタンパク質消化酵素溶液を添加し、湿潤条件下にてインキュベートする。このように必要に応じ処理された標的物質に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。あるいは、前記必要に応じ処理された標的物質に対し、必要に応じてマトリクス溶液を重ねて分注し、その分注位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。本発明においては、微小な範囲に限定して分注を行うため、このときに得られるマススペクトルにおいては、特定の領域以外からの不必要なシグナル、すなわちバックグラウンドを低減することができる。また、マトリクス溶液の分注及びレーザー照射を、試料上の一点の位置のみでなく、一定の範囲にわたって繰り返し行うことによって、特定の細胞又は組織の、質量分布に基づいたイメージングが可能になり、生体標本上で標的物質のマッピングができる。 When performing mass spectrometry, for example, laser desorption / ionization mass spectrometry can be used. In this case, for example, the following operation is performed on the recognized target substance. First, processing such as digestion is performed as necessary. In the digestion, for example, a protein digestion enzyme solution such as trypsin is added and incubated under humid conditions. The target substance thus processed as necessary is irradiated with a laser to obtain a mass spectrum. Alternatively, a matrix solution is superposed and dispensed as needed on the target substance that has been processed as required, and the dispensed position is irradiated with a laser to obtain a mass spectrum. In the present invention, since dispensing is performed only in a minute range, unnecessary signals from other than a specific region, that is, background can be reduced in the mass spectrum obtained at this time. Also, by dispensing the matrix solution and irradiating the laser not only at one point on the sample but also over a certain range, it becomes possible to perform imaging based on the mass distribution of specific cells or tissues, A target substance can be mapped on a specimen.
上述のように本発明によると、生体標本上の微小な区画のみに限定して試薬を分注するため、従来法に比べ使用する試薬の消費量を大幅に減らすことができる。また解析対象となる生体標本は病理組織標本等希少なものが多く想定されるが、同一検体上で複数種の解析が可能になるので、生体標本をより有効に活用できる。さらに、質量分析に導入するときは、試薬を分注した領域以外からのシグナルすなわちバックグラウンドの低減が期待できる。 As described above, according to the present invention, the reagent is dispensed only to a minute section on the biological specimen, so that the consumption of the reagent to be used can be greatly reduced as compared with the conventional method. Further, many rare biological specimens such as pathological tissue specimens are assumed to be analyzed. However, since a plurality of types of analysis can be performed on the same specimen, the biological specimen can be used more effectively. Furthermore, when introducing into mass spectrometry, reduction of the signal, that is, the background, other than the region where the reagent is dispensed can be expected.
以下に、組織切片サンプルにおける微細な領域をレーザー脱離イオン化質量分析法により解析した例を示す。 Hereinafter, an example in which a fine region in a tissue section sample is analyzed by laser desorption / ionization mass spectrometry will be described.
サンプルの調製にあたりマウス脳凍結切片を作製し、これをPVDF膜上に固定した。さらにこの膜をDirect Blue 71により染色し、導電性両面テープを介してMALDIターゲットプレートに固定した。これに対し、ケミカルプリンタ（CHIP-1000, 島津製作所）を使用して、サンプル上に位置を指定し、微小領域にポリビニルピロリドン溶液を7 nL、続けて200 μg/mLトリプシン溶液を50 nL分注した。 In preparing the sample, a mouse brain frozen section was prepared and fixed on a PVDF membrane. The membrane was further stained with Direct Blue 71 and fixed to a MALDI target plate via a conductive double-sided tape. On the other hand, using a chemical printer (CHIP-1000, Shimadzu Corporation), specify the position on the sample and dispense 7 nL of the polyvinylpyrrolidone solution into the micro area, followed by 50 nL of the 200 μg / mL trypsin solution in the micro area. did.
これを湿潤条件下30℃にて終夜インキュベートした後、同一箇所に100 nLのマトリクス溶液（10 mg/mL CHCA（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸））を分注した。この結果、各分注位置では約400 μmの液の広がりを生じた。 This was incubated overnight at 30 ° C. under humid conditions, and then 100 nL of a matrix solution (10 mg / mL CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)) was dispensed to the same location. As a result, a liquid spread of about 400 μm occurred at each dispensing position.
このとき分注したサンプル上の位置を図３に示す。図３左の写真は、試薬溶液が分注されたサンプルである。このサンプルにおいて丸で囲った部分を、図３右に拡大して図示した。図３右図が示すように、丸で囲った部分には９個の微小領域a〜iが設けられた。これら領域は500 μm間隔で配置されている。分注された９個の領域の各々についてMALDI-TOF質量分析装置AXIMA-CFR（島津製作所）を用いて直接質量分析した。 The position on the sample dispensed at this time is shown in FIG. The photograph on the left in FIG. 3 is a sample into which the reagent solution has been dispensed. The part circled in this sample is shown enlarged on the right side of FIG. As shown in the right diagram of FIG. 3, nine small regions a to i are provided in the circled portion. These regions are arranged at intervals of 500 μm. Each of the nine dispensed regions was directly mass analyzed using a MALDI-TOF mass spectrometer AXIMA-CFR (Shimadzu Corporation).
このとき得られた質量分析スペクトルを図４の（a）〜（i）に示す。これら符号（a）〜（i）は、図３に示した９個の領域a〜iに対応している。図４においては、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）、縦軸にイオンピークの相対強度を示す。図４が示すように、近接した微小な領域のそれぞれにおいて異なるスペクトルが得られた。この結果が示すように、本発明の方法は、生体標本の微細な領域の解析において効果的に利用することができる。 The mass spectrometry spectra obtained at this time are shown in FIGS. These codes (a) to (i) correspond to the nine areas a to i shown in FIG. In FIG. 4, the horizontal axis shows mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis shows the relative intensity of the ion peak. As shown in FIG. 4, different spectra were obtained in each of the adjacent minute regions. As shown by the results, the method of the present invention can be effectively used in the analysis of a fine region of a biological specimen.
１：生体標本又は生体標本を転写したメンブレン
２：サンプル支持体
３：試薬溶液を分注する特定の領域
４：インクジェット吐出部
５：試薬液滴
６：可視化された標的物質のシグナル
1: a biological specimen or a membrane onto which a biological specimen has been transferred 2: a sample support 3: a specific area where a reagent solution is dispensed 4: an inkjet discharge unit 5: a reagent droplet 6: a signal of a visualized target substance
Claims (19)
The method for analyzing a biological specimen according to claim 17, wherein the mass spectrometry is laser desorption / ionization mass spectrometry.
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