JP6760784B2 - 神経活性化組成物 - Google Patents
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Description
シナプスとは、神経情報を出力する側と入力される側の間に発達した、情報伝達のための接触構造である。最も基本的な構造は、シナプス前細胞の軸索末端がシナプス後細胞の樹状突起に接触しているものである。シナプスには大別して化学シナプス(chemical synapse)と電気シナプス(electrical synapse)があり、化学シナプスでは、出力する側の細胞をシナプス前細胞、入力される側の細胞をシナプス後細胞という。中枢神経系の多くのシナプスを占める化学シナプスでは、活動電位の到来により、シナプス前部の電位依存性カルシウムチャネルが開口してカルシウムが流入し、シナプス顆粒の開口放出を引き起こす。その結果、シナプス顆粒に含まれている神経伝達物質がシナプス間隙に放出される。
神経伝達物質は、シナプス後部にある神経伝達物質受容体に結合し、直接膜電位を変化させるか、細胞内二次メッセンジャーを活性化することで伝達を行う。化学シナプスは興奮性シナプスと抑制性シナプスに細分される。一方、電気シナプスは接触膜上のギャップ結合を介して、膜電位変化を直接的に次の神経細胞に伝える構造である。このように受け取られたシナプス電位が細胞体まで伝わり、軸索小丘で統合され、最終的にシナプス後細胞が発火するかどうかが決まる。この影響の相互作用を神経統合と呼ぶ。またシナプス伝達の効率は必ずしも一定ではなく、入力の強度により変化する。これをシナプス可塑性と呼び、学習・記憶の細胞メカニズムであると考えられている。
(1)シナプス前細胞の軸索で活動電位(膜の脱分極)が伝わり、カルシウムイオンがシナプス前終末に流入する、
(2)カルシウムイオンの上昇による神経伝達物質のシナプス間際での放出、
(3)神経伝達物質がシナプス後部の受容体に結合することにより、電気的または化学的変化をもたらし、シグナルが伝達される。
この過程で、神経細胞中で複数の遺伝子が活性化されて、情報シグナルの下流側への伝達を担うことになる。この一群の遺伝子群は、最初期遺伝子と総称されている。最初期遺伝子は、増殖シグナルや分化シグナル等が細胞へ伝わると、既に細胞内に存在する因子のみを用いて速やかに、且つ、一過的に転写が引き起こされる。コードされているタンパク質は、転写制御因子・成長因子・細胞骨格など様々なカテゴリーを含む。神経細胞においては、シナプス活動に伴う細胞内カルシウム濃度上昇や神経調節物質によるシグナル活性化などによって最初期遺伝子の発現が誘導されることが明らかになっている。一部の最初期遺伝子は、シナプス可塑性を引き起こす電気刺激や学習・記憶課題によって特定の脳領域に特異的な発現誘導パターンを示すことから、シナプスや神経回路の長期可塑的変化への関与が示唆されている。また、最初期遺伝子の発現は、数分〜数十分前の神経活動状態をよく反映することから、最初期遺伝子のmRNAやタンパク質は神経活動の分子マーカーとして広く利用されている。
神経細胞において最初期遺伝子は、シナプス活動や活動電位に伴うカルシウムイオンの流入などによって発現が誘導される活動依存的遺伝子であり、脳における代表的な最初期遺伝子としてc-fosやEgr-1などの転写制御因子をコードする遺伝子やArc、Homer1a/Vesl-1s等のシナプス関連タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。これら遺伝子のmRNAや発現産物であるタンパク質は神経活動の指標マーカーとしてすでに用いられている。
特許文献1には、c-fos、zif268、Arc等の最初期遺伝子の発現量変化を観察することで、薬物などに対する脳細胞の感受性や反応性を評価する技術が記載されている。
特許文献2には、神経栄養因子であるワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の効果を評価するためにCREBのリン酸化促進作用を指標とする方法が開示されている。また、このCREBのリン酸化を、c-fosの産生を測定することで評価できることも記載されている。
特許文献3には、末梢投与で作用を示す食欲抑制ペプチドPYYが、末梢投与においては、視床下部の弓状核内におけるc-fosの増加、および、視床下部の神経ペプチドY(NPY)mRNAの低下を引き起こし、さらに、PYY3-36が、NPY神経末端のシナプス活動を阻害し、POMCニューロンを活性化することを記載している。すなわちPYYが神経において、c-fosを介して、食欲抑制神経を活性化していることを明らかにしている。
非特許文献1、2には、c-fos、Arc、ノックアウトマウスでは、神経可塑性の障害、空間恐怖記憶が障害されること、またc-fos、Arc発現細胞を光遺伝学的手法により不活性化することで、記憶障害が誘発されるというこれまでの研究成果がレビューされている。
このように、神経系の活性化には最初期遺伝子の活性化が大きな役割を果たしていることが明らかになっている。
特許文献4には杏仁、麻黄、桂枝、人参、当帰、川きゅう、乾姜、甘草及び石膏、又はこれらの抽出物を有効成分として含有する神経栄養因子(BDNF)合成促進剤が記載されている。
特許文献5にはプラセンタ抽出物を含有する脳由来神経栄養因子(BDNF)合成促進剤が記載されている。
さらに特許文献6には、ヒトES細胞を神経細胞組織に分化誘導するに当たって、PI3K−Akt経路のキナーゼ阻害によってニューロンの分化を調整できることが記載されている。
(1)キンミズヒキ抽出物を有効成分とする神経細胞の直接活性化用組成物。
(2)キンミズヒキ抽出物が水及び/又はエタノール抽出物である(1)に記載の神経細胞の直接活性化用組成物。
(3)キンミズヒキ抽出物を有効成分とするアセチルコリン濃度の低下を伴わない認知症の改善剤。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
株式会社ファンケルが保有している天然化合物及び天然物抽出物ライブラリーの中から100%エタノール抽出物650検体、70%エタノール抽出物730検体、天然化合物380検体を試料として以下の1次スクリーニングに付した。
妊娠17日目のSDラット(日本エスエルシー)から調製した初代神経細胞を4×105cells/mlの濃度になるように懸濁し、ポリ-L-リジンコートの96ウエルプレート(住友ベークライト)に200μlずつ播種し、37℃、5% CO2下で7日間培養した。
ファンケル所有の天然化合物及び天然抽出物ライブラリー中の植物100%エタノール抽出物、70%エタノール抽出物または天然物化合物を添加し、20分培養した後上清を除去しPBSで細胞を洗浄した。次いで4%パラホルムアルデヒド溶液(和光純薬工業)を添加し、室温で30分間細胞固定を行った。その後PBSで洗浄し、0.1% Triton-Xを含むPBS-T(0.1% Tween-PBS(-))溶液を加え、室温で15分反応後、PBS-T溶液で洗浄し、ブロッキング溶液(25% Blocking One (Nacalai Tesque)/PBS-T)を加え1時間ブロッキングを行った。
その後ブロッキング溶液で1/3000倍に希釈した抗phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (197G2)抗体(Cell Signaling Technology)を加え、室温で1時間反応させた。
PBS-T溶液で3回洗浄後、ブロッキング溶液で1/1000倍に希釈したRabbit IgG, HRP-linked F(ab')2 Fragment (GE Healthcare)を加え1時間反応させた。その後、PBS-T溶液で3回洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL)を100μl加え室温で10分間反応させたのち、等量の1N HClを加え反応を停止させ、450nmの吸光度を測定した。なお試験試料N=1で試験した。
試験サンプル無添加の試験に対してpERKが1.5倍以上に上昇した試料を陽性と評価した。この検体を、再度N=3で試験を行い、活性の再現性確認を行った。さらに再現性の得られた試料をラット初代神経培養細胞(DIV10)に添加し、20分経過後のpERKの上昇を、抗pERK抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。
スクリーニングで陽性となった検体からキンミズヒキを選択し、試験を行った。
乾燥した生薬原料である植物体の乾燥キンミズヒキは親和物産株式会社より購入した。
乾燥キンミズヒキをミキサーで粉砕した後、10倍量の100%エタノールを加え3日間撹拌し、ろ過した抽出液からエバポレーターを用いて植物抽出物を得た。得られた抽出物は、DMSOで溶解した。
妊娠17日目のSDラット(日本エスエルシー)から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した後、神経細胞分散液キット(住友ベークライト)を用いて添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。調製したラット初代神経細胞を2% B27(Gibco)、0.5mM L-グルタミン(Gibco)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma Aldrich)を含むニューロベイサル培地(Gibco)で4×105 cells/mlの濃度になるように懸濁し、ポリ-L-リジンコートの48ウエルプレート(住友ベークライト)に350μlずつ播種し、37℃、5% CO2下で培養した。
培養11日目に100%エタノール抽出物をDMSOに溶解させたキンミズヒキを添加し、20分培養後に上清を除去し、PBS(Gibco)で細胞を洗浄後、プロテアーゼ阻害剤、フォスファターゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を加えたRIPA溶液(50mM Tris-HCl (pH8.0)、150mM NaCl、0.1% SDS、0.5% DOC、1% NP-40)150μlを加え細胞抽出液を調製した。BCA assay kit(Pierce Chemical)でタンパク質定量を行った後、調製した細胞抽出液に4倍希釈 Laemmli sample溶液(Bio-rad)、終濃度50mMになるようDTT(和光純薬工業)を加え95℃、5分加熱し、電気泳動用のサンプルを調製した。1レーンあたり1μgのタンパク質量のサンプルをMini PROTEAN TGX Gels(4-20%:15レーン、Bio-rad)にロードし、電気泳動を行った後、トランスブロットTurboミディPVDF転写パック(Bio-rad)を用いて2.5A、25V、7分の条件で転写反応を行った。
転写させたメンブレンをBlocking One(Nacalai Tesque)に浸し、室温で1時間振盪させながらブロッキングした後、10% Blocking One -TBS-T(0.1% Tweenを含むTBS溶液)溶液で1/5000倍に希釈した抗phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (197G2)抗体(Cell Signaling Technology)に浸し、室温で1時間振盪させながら反応させた。TBS-T溶液で3回洗浄後、10% Blocking One -TBS-T溶液で1/10000倍に希釈したHRP標識抗ラビットIgG抗体(Invitrogen)で浸し、室温で振盪させながら1時間反応させた。TBS-T溶液で3回洗浄した後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)で5分反応させ発光量をLAS-4000(富士フィルム)を用いて測定した。
得られたウエスタンブロッティングのバンドの発光強度をMulti Gaugeソフトを使用して測定した。測定結果を図1に示す。
図1に示すように、キンミズヒキの100%エタノール抽出物の添加により、リン酸化ERK(pERK)の増強作用が認められた。
上記「2)pERKの増加作用確認試験」に記載の方法により、ラット初代神経細胞を調製し、11日間培養した。キンミズヒキの100%エタノール抽出液を添加し1時間培養した後、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用い添付の説明書に従ってRNAを調製した。調製した200ngのRNAを用いて、PrimeScript RT reagent kit(Takara Bio)を使用し、添付の説明書に従いcDNAを作製した。最初期遺伝子であるc-fos及び Arc発現量は、2μl cDNA、ラットc-fos、またはArc taq man probe(TaqMan Gene expression assays: Applied Biosystems)とLightCycler 480 Probe Master(Roche Diagnostics)を混合し、LightCycler 480 II(Roche Diagnostics)を用いて、95℃、5分、(95℃、10秒→60℃、30秒)×45サイクル、50℃、30秒の反応条件で測定を行った。内部標準としてGAPDHの発現量をRodent GAPDH control Reagent(Thermo Fisher Scientific)を使用し、上記と同様な反応で測定した。測定により得られたCp値からGAPDHを内部標準としてΔΔCt法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
試験結果を図2、3に示す。図2、3に示すようにラット初代神経細胞において、キンミズヒキの100%エタノール抽出物の添加により、最初期遺伝子であるc-fos、Arcの発現増加作用が認められた。
上記「2)pERKの増加作用確認試験」に記載の方法により、ラット初代神経細胞を調製し、11日間培養した。100%エタノール抽出物溶液を各濃度になるように添加し、20分培養後に上清を除去し、2)に記載した同様の方法でサンプルを調製し、電気泳動、トランスファーを行った。
転写させたメンブレンをBlocking One(Nacalai Tesque)に浸し、室温で1時間振盪させながらブロッキングした後、10% Blocking One -TBS-T溶液で1/1000倍に希釈した抗phospho-Akt (Ser473)抗体(Cell Signaling Technology)に浸し、室温で1時間振盪させながら反応させた。TBS-T溶液で3回洗浄後、10% Blocking One -TBS-T溶液で1/10000倍に希釈したHRP標識抗ラビットIgG抗体(Invitrogen)で浸し、室温で振盪させながら1時間反応させた。TBS-T溶液で3回洗浄した後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)で5分反応させ発光量をLAS-4000(富士フィルム)を用いて測定した。測定したメンブレンは、リプローブ溶液(62.5mM Tris-HCl (pH6.7)、2% SDS、100mM 3-メルカプト-1,2-プロパンジオール)で50℃、30分反応後、TBS-T溶液で洗浄した。
その後、上記と同様な方法でBlocking Oneでブロッキング後、抗Akt抗体(1/1000希釈、Cell Signaling Technology)、HRP標識抗ラビットIgG抗体(1/10000希釈:Invitrogen)で反応後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)で5分反応させ発光量をLAS-4000(富士フィルム)を用いて測定した。得られたウエスタンブロッティングのバンドの発光強度をMulti Gaugeソフトを使用して測定し、リン酸化Aktタンパク質の発光強度を総Aktタンパク質の発光強度で補正した。キンミズヒキにAktの増強作用が認められた。結果を図4に示す。測定結果は、コントロールを1としたときの相対値で示した。
上記2)に記載の方法により、ラット初代神経細胞を調製し、11日間培養した。キンミズヒキ100%エタノール抽出液を添加し1時間培養した後、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用い添付の説明書に従ってRNAを調製した。調製した200ngのRNAを用いて、PrimeScript RT reagent kit(Takara Bio)を使用し、添付の説明書に従いcDNAを作製した。BDNF発現量は、2μl cDNA、ラットBDNF taq man probe(TaqMan Gene expression assays: Applied Biosystems)とLightCycler 480 Probe Master(Roche Diagnostics)を混合し、LightCycler 480 II(Roche Diagnostics)を用いて、95℃、5分、(95℃、10秒→60℃、30秒)×45サイクル、50℃、30秒の反応条件で測定を行った。内部標準としてGAPDHの発現量をRodent GAPDH control Reagent(Thermo Fisher Scientific)を使用し、上記と同様な反応で測定した。測定により得られたCp値からGAPDHを内部標準としてΔΔCt法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
その結果を図5に示す。キンミズヒキの100%エタノール抽出物に、BDNFの発現量増加作用が認められた。
マウスは、本来新奇物体を新奇と認識すると接近し、形状の確認、匂いを嗅ぐなどの探索行動を行う。このとき、記憶している物体に対しては探索行動をとらないか、新奇物体に比べて短い時間しか探索しない。この性質を利用するのが新奇物体認識試験である。
図6に実験の概要を示す。以下に図6に沿って試験の概要を説明する。
6週齢ICRマウス雄(日本エスエルシー)1群8匹を1週間飼育部屋で順化の後、試験を行った。試験前日に試験用のボックス(40cm×40cm×40cm)でマウスに60分の順化(Habituation)を行った。
この容器の隣り合った角から一定距離ずつ中央へ離れた場所に2つの同じ形をした同じ大きさの積み木Object 1及びObject 2を設置した。
試験当日開始1時間前に、vehicle (コーン油:和光純薬工業)、キンミズヒキの100%エタノール抽出液(コーン油で懸濁)を200mg/10mL/kgで経口投与した。
投与60分後にマウスをこの容器に入れて、5分間自由探索を行わせ、object1,2に対する探索時間を測定した。終了後は飼育ケージへ戻した。これを獲得試行とした。この獲得試行により記憶が形成される。
48時間後に片方の物体を新奇の物体Novel (Object 1')に変えたボックスにマウスを戻し、5分間自由探索を行わせて2つの物体への接触時間を各々測定した。これをテスト試行とする。両物体Object 1'及びObject 2への探索行動の時間の長さの違いから、記憶の保持を評価した。
新奇物体への接触時間を測定した。なおObject 2は設置した当初のままである。これをFamiliarとする。
Claims (2)
- 70%以上のエタノールによるキンミズヒキ抽出物を有効成分とするアセチルコリン濃度の低下を伴わない認知症の改善剤。
- 100%エタノールによるキンミズヒキ抽出物を有効成分とする請求項1記載のアセチルコリン濃度の低下を伴わない認知症の改善剤。
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