JP6757079B2 - 電気化学センサ及び電気化学センサの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、電気化学センサ及び電気化学センサの製造方法に関する。

近年、図１Ａに示すように、複数の電極１０１をアレイ状に配置し、各電極１０１で測定した電流値を基にサンプル１０３をイメージングするバイオセンサ１００が考えられている。この種のバイオセンサ１００は、例えば、細胞塊の代謝活動の評価や、脳細胞の神経伝達物質の放出挙動の観察等に利用することが考えられている（例えば、非特許文献１参照）。

K. Hayashi, T. Horiuchi, R. Kurita, K. Torimitsu, O. Niwa, Biosens. Bioelectron. 15 (2000) 523-529

ところで、従来のバイオセンサ１００では、各電極１０１をそれぞれリード線１０２により回路基板（図示せず）と電気的に接続させる必要がある。そのため、バイオセンサ１００では、各電極１０１からリード線１０２を引き出せる領域を電極１０１間に確保する必要があり、電極１０１の高密度化には限界があった。

その結果、各電極１０１で測定した電流値を基にサンプル１０３のイメージングを行うと、図１Ｂに示すように、サンプル１０３を示した領域Ｌが粗い低解像の解析データ１００ａしか得られず、正確な解析が行えないという問題があった。

そこで、本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、従来よりも一段と正確に検出対象分子の解析を行うことができる電気化学センサ及び電気化学センサの製造方法を提供することを目的とする。

本発明による電気化学センサは、サンプル溶液を保持するサンプル溶液保持部と、電気化学発光溶液を保持する電気化学発光溶液保持部と、前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に配置された電極形成板と、を備え、前記電極形成板は、前記サンプル溶液と前記電気化学発光溶液とを仕切る基板と、前記基板にアレイ状に配置された複数の検出電極と、を備え、各前記検出電極は、前記基板の板厚方向を貫通しており、一端が前記サンプル溶液に接し、他端が前記電気化学発光溶液に接し、前記一端で前記サンプル溶液内の検出対象分子が還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる。

また、本発明の電気化学センサの製造方法は、サンプル溶液を保持するサンプル溶液保持部と、電気化学発光溶液を保持する電気化学発光溶液保持部と、を準備する準備工程と、電極形成板を作製する電極形成板作製工程と、前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に前記電極形成板を設ける設置工程と、を備えており、前記電極形成板作製工程は、板厚方向に貫通する貫通孔を基板に対してアレイ状に形成する貫通孔形成工程と、導電性部材を前記貫通孔に埋めることで検出電極を形成する検出電極形成工程と、を備え、前記設置工程は、前記検出電極の一端が前記サンプル溶液に接し、前記検出電極の他端が前記電気化学発光溶液に接するように前記電極形成板を前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に設け、前記一端で前記サンプル溶液内の検出対象分子が還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる電気化学センサを製造する。

本発明によれば、各検出電極にリード線を設けなくても、電気化学発光溶液の発光を基にサンプル溶液内の検出対象分子を確認できるので、リード線が不要となる分、検出電極を高密度で配置させることができる。よって、検出電極を高密度で配置できる分、高解像の解析データを得ることができ、従来よりも一段と正確に検出対象分子の解析を行うことができる。

図１Ａは、従来のバイオセンサの構成を示した概略図であり、図１Ｂは、図１Ａのバイオセンサにより得られる解析結果を示した概略図である。 検出電極における還元反応及び酸化反応を説明するための概略図である。 電気化学発光溶液で起こる発光について説明するための概略図である。 図４Ａは、本発明による電気化学センサの概略を説明するための概略図であり、図４Ｂは、図４Ａの電気化学センサにより得られる解析結果を示した概略図である。 第１実施形態による電気化学センサの構成を示す概略図である。 サンプル溶液保持部、電極形成板及び電気化学発光溶液保持部の構成を示す分解斜視図である。 電極形成板の構成を示す概略図である。 電極形成板の第１の製造方法を説明するための概略図である。 図９Ａは、電極形成板の第２の製造方法において基板に貫通孔を形成したときの概略図であり、図９Ｂは、電極形成板の第２の製造方法において貫通孔を検出電極で埋めたときの概略図である。 貫通孔に検出電極を形成する手法を説明するための概略図である。 図１１Ａは、カーボンペーストを塗布して検出電極を形成する際の概略図であり、図１１Ｂは、余分なカーボン層を除去して貫通孔に検出電極を形成したときの概略図である。 図１２Ａは、サンプル溶液内の検出対象分子の濃度を変えたときの発光状態を示した写真であり、図１２Ｂは、検出対象分子の濃度と発光強度との関係を示したグラフである。 図１３Ａは、０．０ｓのときに取得した撮像画像の写真であり、図１３Ｂは、１．８ｓ後に取得した撮像画像の写真であり、図１３Ｃは、４．０ｓ後に取得した撮像画像の写真であり、図１３Ｄは、８．３ｓ後に取得した撮像画像の写真である。 過酸化水素を検出対象分子とした検証試験を行ったときの検証結果であり、図１４Ａは、サンプル溶液内の過酸化水素の濃度を０ｍＭとしたときに取得した撮像画像の写真であり、図１４Ｂは、サンプル溶液内の過酸化水素の濃度を２ｍＭとしたときに取得した撮像画像の写真である。 過酸化水素の検出能評価を行ったときに取得した撮像画像の写真である。 第２実施形態による電気化学センサの構成を示す概略図である。 図１７Ａは、ガラス基板に形成した酸化用電極の構成を示した写真であり、図１７Ｂは、酸化用電極を電極形成板と対向するように設置したときの構成を示す写真であり、図１７Ｃは、酸化用電極を配置した領域での発光強度が増強したことを示す写真である。 電気化学発光溶液内に還元用電極を設けた構成を示す概略図である。 還元用電極を設けていないときの構成を示す概略図である。 サンプル溶液内に酸化用電極を設けた第３実施形態の構成を示す概略図である。 サンプル溶液内で酸化反応により生成された分子の酸化還元反応を説明するための概略図である。 第４実施形態の電気化学センサの概要を説明するための概略図である。 第４実施形態による電気化学センサの構成を示す概略図である。 第４実施形態による電極形成板の構成を示す概略図である。 Ｏｓ−ＨＲＰポリマーフィルムを電子伝達メディエータ層として設けた構成を示す概略図である。 プルシアンブル−層を電子伝達メディエータ層として設けた構成を示す概略図である。 １種類の酵素層を設けたときの構成を示す概略図である。 電極形成板から所定距離離れた位置に酵素層を設けたときの概略図である。 図２９Ａは、他の実施形態による検出電極の構成（１）を示す概略図であり、図２９Ｂは、他の実施形態による検出電極の構成（２）を示す概略図である。 他の実施形態による電極形成板の構成を示す概略図である。 軸方向が平行に並んだ検出電極を有する電極形成板と、図３０に示す電極形成板とを比較して説明するための概略図である。 図３０に示す電極形成板の製造方法を説明するための概略図である。

（１）本発明の電気化学センサの概要
図２は、本発明の電気化学センサに設けられる電極形成板３の一部を拡大した概略図である。図２に示すように、電極形成板３は、一方の面にサンプル溶液１０ａが存在し、他方の面に電気化学発光溶液１０ｂが存在しており、サンプル溶液１０ａ及び電気化学発光溶液１０ｂを仕切っている。

電極形成板３は、絶縁部材からなる基板３ａを備え、この基板３ａの板厚方向を貫通するように検出電極３ｂが形成されている。これにより、検出電極３ｂは、一端がサンプル溶液１０ａに接し、他端が電気化学発光溶液１０ｂに接している。

ここで、サンプル溶液１０ａは、還元反応を起こす検出対象分子を含んでいる。ここでは、検出対象分子の一例として、フェリシアン化カリウムを用いて説明する。また、電気化学発光溶液１０ｂは、酸化反応により発光する発光物質を含んでいる。ここでは、電気化学発光溶液１０ｂの一例として、発光物質の一例としてルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ（bipyridine：ビピリジン））_３）を含んだ、［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］Ｃｌ_２とトリプロピルアミン（Trypropylamine：ＴＰＡ）の混合水溶液を用いて説明する。

駆動電極８ａ，８ｂ間に所定の電位が印加されると、サンプル溶液１０ａに接している検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元される（図中、「ｒｅｄ」と表記）。これにより、電気化学発光溶液１０ｂに接している検出電極３ｂの他端では、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が酸化し（図中、「ＯＸ」と表記）、これに伴い電気化学発光溶液１０ｂで発光（電気化学発光とも称する）Ｌ１が生じる。

ここでの例では、図３に示すように、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内のＲｕ（ｂｐｙ）_３ ^２＋とＴＰＡが酸化され、その後、酸化したＲｕ（ｂｐｙ）_３ ^３＋がＴＰＡ^＊（＊は励起状態を示す）から電子を得て還元されて励起状態となる。励起状態となったＲｕ（ｂｐｙ）_３ ^３＋＊は光を発して基底状態に戻る。このようにして、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元されると、これに応じて検出電極３ｂの他端では電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が酸化され、発光物質が励起状態から基底状態に戻る過程で電気化学発光Ｌ１が生じる。

以上より、図４Ａに示すように、本発明の発光原理を利用した電気化学センサ１は、従来と同様に、検出電極３ｂをアレイ状に配置させた際、リード線が無くても、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を還元させることで、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化による電気化学発光Ｌ１が生じる。

よって、電気化学センサ１は、検出電極３ｂからそれぞれリード線を引き出す必要がない分、各検出電極３ｂの間隔を狭めることができるので、高密度に検出電極３ｂをアレイ状に配置させることができる。かくして、電気化学センサ１では、各検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂの酸化により生じる電気化学発光Ｌ１を基にサンプル溶液１０ａのイメージングを行う際、高密度に検出電極３ｂが配置されている分、図４Ｂに示すように、発光Ｌ１が高解像に写った画像（解析データ）１００ｂが得られ、正確な解析結果を得ることができる。

（２）第１実施形態
（２−１）第１実施形態による電気化学センサの全体構成
次に、上述した本発明の電気化学センサの具体的な構成について以下説明する。図５に示すように、本発明の電気化学センサ１は、サンプル溶液保持部２と、電極形成板３と、電気化学発光溶液保持部４と、光学顕微鏡５と、撮像部６と、画像処理部７とを備えており、サンプル溶液保持部２及び電気化学発光溶液保持部４の間に電極形成板３が設けられた構成を有する。なお、図２は、図５の領域ＥＲ１を拡大した概略図となる。

サンプル溶液保持部２は、例えば、アクリル等の樹脂部材により形成されたプレート２ａを有しており、プレート２ａの枠に囲まれた液体保持領域２ｂ内にサンプル溶液１０ａを保持している。

プレート２ａには、電極形成板３と対向する領域に開口部２ｃが形成されている。これにより、サンプル溶液保持部２は、液体保持領域２ｂ内のサンプル溶液１０ａが開口部２ｃで電極形成板３の一方の面に接している。

サンプル溶液保持部２のプレート２ａには、第１の駆動電極８ａが設置されており、サンプル溶液１０ａ内に駆動電極８ａが浸漬されている。また、本実施形態の場合、サンプル溶液１０ａには、参照電極８ｃが浸漬されている。

サンプル溶液保持部２に電極形成板３を介在させて設けられる電気化学発光溶液保持部４は、例えば、アクリル等の樹脂部材により形成されたプレート４ａを有しており、プレート４ａの枠に囲まれた液体保持領域４ｂ内に電気化学発光溶液１０ｂを保持している。

プレート４ａには、電極形成板３と対向する領域に開口部４ｃが形成されている。これにより、電気化学発光溶液保持部４は、液体保持領域４ｂ内の電気化学発光溶液１０ｂが開口部４ｃで電極形成板３の他方の面に接している。

電気化学発光溶液保持部４には、電極形成板３と対向する底面領域に、ガラス等の透明部材により形成された透明基板４ｄが設けられている。これにより、電気化学発光溶液１０ｂに接する電極形成板３の他面を、透明基板４ｄを介して撮像部６により撮像することができる。

電気化学発光溶液保持部４のプレート４ａには、上述した第１の駆動電極８ａと対となる第２の駆動電極８ｂが設置されており、電気化学発光溶液１０ｂ内に駆動電極８ｂが浸漬されている。

電極形成板３は、サンプル溶液１０ａと電気化学発光溶液１０ｂとを仕切る基板３ａを備えており、基板３ａには、複数の検出電極３ｂがアレイ状に配置されている。基板３ａは、例えばエポキシ樹脂等の絶縁部材により板状に形成されており、サンプル溶液保持部２の開口部２ｃと、電気化学発光溶液保持部４の開口部４ｃとを封止している。

これにより、基板３ａは、サンプル溶液保持部２に保持されたサンプル溶液１０ａと開口部２ｃにおいて一面が接し、電気化学発光溶液保持部４で保持された電気化学発光溶液１０ｂと開口部４ｃにおいて他面が接している。なお、基板３ａの板厚は、サンプル溶液１０ａと電気化学発光溶液１０ｂとを仕切れ、かつ、所定の機械的強度を担保することができれば、種々の板厚まで薄くすることができる。

また、基板３ａの板厚は、特に限定されず、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることが可能な板厚であればよい。

基板３ａにおいてアレイ状に配置された検出電極３ｂは、例えば、金属部材や導電性カーボン等のように、導電性部材により柱状に形成されており、基板３ａの板厚方向を貫通するように形成されている。これにより、検出電極３ｂは、一端がサンプル溶液１０ａに接し、他端が電気化学発光溶液１０ｂに接している。

ここで、電気化学発光溶液１０ｂに接している各検出電極３ｂの他端は、電気化学発光溶液保持部４に設けられた透明基板４ｄ及び光学顕微鏡５を介して撮像部６により撮像される。光学顕微鏡５は、対物レンズ５ａとミラー５ｂとを備えており、撮像部６は、これら対物レンズ５ａ及びミラー５ｂを介して、検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３のセンサエリアを撮像する。

なお、本実施形態の場合、撮像部６は、光学顕微鏡５を介して各検出電極３ｂの他端を撮像しているが、本発明はこれに限らず、例えば、電極形成板３の透明基板４ｄに撮像部６を直接設け、光学顕微鏡５を介さずに各検出電極３ｂの他端を撮像部６により撮像するようにしてもよい。

撮像部６は、例えばＣＣＤカメラであり、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂの酸化によって生じる発光Ｌ１を撮像し、取得した撮像画像を画像処理部７に出力する。画像処理部７は、解析部７ａと提示部７ｂとを備えており、これら解析部７ａ及び提示部７ｂによって撮像画像に対して各種処理を実行する（後述する）。このようにして得られた処理結果を基に、電気化学センサ１を使用する作業者はサンプル溶液１０ａの解析を行うことができる。

（２−２）サンプル溶液保持部、電極形成板及び電気化学発光溶液保持部の構成
次に、図６を用いて、サンプル溶液保持部２、電極形成板３及び電気化学発光溶液保持部４の詳細な構成について以下説明する。なお、図５は、図６のＡ−Ａ部分、Ｂ−Ｂ部分及びＣ−Ｃ部分の側断面構成を示した断面図である。

図６に示すように、サンプル溶液保持部２のプレート２ａには、電極形成板３と対向した領域に形成された開口部２ｃの他に、駆動電極８ａが設けられる開口部２ｅが形成されている。この開口部２ｅには、底面領域に板状の駆動電極８ａが設けられており、当該駆動電極８ａにより底面領域が封止されて液体保持領域２ｆが形成されている。この液体保持領域２ｆには、サンプル溶液１０ａが保持されている。

サンプル溶液保持部２のプレート２ａは、駆動電極８ａが設けられた液体保持領域２ｆと、電極形成板３が配置される開口部２ｃの液体保持領域２ｂとが連通し、液体保持領域２ｆ内の駆動電極８ａによりサンプル溶液１０ａに電位が印加されると、開口部２ｃの液体保持領域２ｂ内で保持されているサンプル溶液１０ａにも電位が印加される。

なお、駆動電極８ａは、検出電極３ｂでの反応を律速しないために、その大きさは、サンプル溶液１０ａに触れている、各検出電極３ｂの一端の接触面積の合計の１０倍以上であることが望ましい。

一方、電気化学発光溶液保持部４のプレート４ａには、電極形成板３と対向した領域に形成された開口部４ｃの他に、駆動電極８ｂが設けられる開口部４ｅが形成されている。この開口部４ｅには、底面領域に板状の駆動電極８ｂが設けられており、当該駆動電極８ｂにより底面領域が封止されて液体保持領域４ｆが形成されている。この液体保持領域４ｆには、電気化学発光溶液１０ｂが保持されている。

電気化学発光溶液保持部４のプレート４ａは、駆動電極８ｂが設けられた液体保持領域４ｆと、電極形成板３が配置される開口部４ｃの液体保持領域４ｂとが連通し、液体保持領域４ｆ内の駆動電極８ｂにより電気化学発光溶液１０ｂに電位が印加されると、開口部４ｃの液体保持領域４ｂ内で保持されている電気化学発光溶液１０ｂにも電位が印加される。

なお、駆動電極８ｂは、検出電極での反応を律速しないために、その大きさは、サンプル溶液１０ａに触れている検出電極面積の合計の１０倍以上であることが望ましい。

次に、電極形成板３について説明する。本実施形態の場合、電極形成板３は、円盤状に形成されており、図７に示すように、複数の検出電極３ｂがアレイ状に配置されたセンサエリアを有する。ここでは、このセンサエリアは上面から見て六角形状に形成されている。

基板３ａにおいてアレイ状に配置される検出電極３ｂは、例えば、５μｍ以下の間隔で配置されることが望ましい。本実施形態の電気化学センサ１において、検出電極３ｂが５μｍ以下の間隔で配置されていれば、サンプル溶液１０ａ内の微細な物質移動のイメージングが可能となる。検出電極３ｂの間隔は小さいほどよいが、後述する撮像部６での光学限界もあるため、検出電極３ｂは５００ｎｍ以上の間隔で配置されることが望ましい。

なお、検出電極３ｂの配置間隔は等間隔であることが望ましいが、本発明はこれに限らず、検出電極３ｂをアレイ状に配置させた際に一方向と他方向とで検出電極３ｂの配置間隔を変化させてもよい。

本実施形態の場合、各検出電極３ｂは同じ大きさ、同じ形状からなり、例えば円柱状に形成されている。検出電極３ｂの直径は、例えば５μｍ以下であることが望ましい。本実施形態の電気化学センサ１において、検出電極３ｂの直径を５μｍ以下とすれば、サンプル溶液１０ａ内の微細な物質移動のイメージングが可能となる。また、検出電極３ｂを５００ｎｍの間隔で配置する場合、検出電極３ｂの配置領域を考慮し、検出電極３ｂの直径は５００ｎｍ±５０ｎｍであることが望ましい。

なお、ここでは、検出電極３ｂがアレイ状に配置されるセンサエリアを、上面から見て六角形状に形成したが、本発明はこれに限らず、センサエリアを上面から見て三角形状や四角形状、円形状等に形成してもよい。検出電極３ｂがアレイ状に配置されるセンサエリアを上面から見て四角形状に形成した場合には、少なくとも縦×横が５０μｍ以上×５０μｍ以上であり、検出電極３ｂが縦×横で３つ以上×３つ以上であることが望ましい。このようなセンサエリアを確保することで、サンプル溶液１０ａ内の微細な物質移動のイメージングが可能となる。また、センサエリアは、ある程度大きな試料を解析することを考慮し、例えば、直径４ｍｍ以上であることがより好ましい。

ここで、駆動電極８ａ，８ｂ間に印加される電位は、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａの検出対象分子が還元され、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が発光する電位に設定すればよい。

（２−３）電極形成板の製造方法
次に、電極形成板３の製造方法について説明する。以下、代表的な製造方法について順に説明する。なお、以下の各製造方法により製造された電極形成板３は、予め準備したサンプル溶液保持部２及び電気化学発光溶液保持部４（準備工程）の間に設けられ（設置工程）、図５に示すような構成の電気化学センサ１になり得る。

（２−３−１）第１の製造方法
電極形成板３の第１の製造方法としては、始めに、図８Ａに示すように、例えば、導電性部材を予め棒状に形成した棒状部材（例えば、金ワイヤ）を検出電極３ｂとして用意する。次いで、図８Ｂに示すように、検出電極３ｂの周側面に、エポキシ等の絶縁部材をコーティングしてゆき絶縁層３ｃを形成する。次いで、図８Ｃに示すように、周側面に絶縁層３ｃを形成した検出電極３ｂを束ねて、その周辺を絶縁層３ｃと同じ絶縁部材により固め、検出電極３ｂがアレイ状に配置されたセンサエリアを形成する。

次いで、アレイ状に検出電極３ｂを配置させたセンサエリアの周辺にも、絶縁層３ｃと同じ絶縁部材で板状部を形成することで、基板３ａに複数の検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３（図７）を製造することができる。

（２−３−２）第２の製造方法
次いで、電極形成板３の他の製造方法としては、始めに、図９Ａに示すように、絶縁部材によって所定の板厚に形成した基板３ａを用意し、基板３ａの板厚方向を貫通する貫通孔３ｄを、基板３ａに対してアレイ状に形成する（貫通孔形成工程）。なお、基板３ａに貫通孔３ｄを穿設する手法は、エッチング等の公知の手法を適用すればよい。

次いで、図９Ｂに示すように、各貫通孔３ｄ内を金属部材により埋めて検出電極３ｂを形成することで、基板３ａに複数の検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３（図７）を製造することができる（電極形成板作製工程、検出電極形成工程）。

ここで、貫通孔３ｄ内に検出電極３ｂを形成する手法としては、図１０に示すように、例えば、水にＨＡｕＣｌ_４（塩化金酸）等を含有させた金酸溶液１２ａと、水又はエタノールにＮａＢＨ_４（水素化ホウ素ナトリウム）等を含有させた還元剤溶液１２ｂとを、基板３ａの各貫通孔３ｄ内で接触させる。これより、基板３ａの各貫通孔３ｄ内に金を析出させることができ、各貫通孔３ｄを金部材で埋めた検出電極３ｂを形成することができる。

なお、検証試験によって、金酸溶液１２ａとして、ＨＡｕＣｌ_４を５０ｍＭ含んだ水溶液を用い、還元剤溶液１２ｂとして、ＮａＢＨ_４を５０ｍＭ含んだ水溶液と、ＮａＢＨ_４を５０ｍＭ含んだエタノールとを用いることで、基板３ａの各貫通孔３ｄ内に金を析出させ、各貫通孔３ｄに検出電極３ｂを形成できることを確認している。

（２−３−３）第３の製造方法
次に、カーボンからなる検出電極３ｂを有した電極形成板３の製造方法について説明する。この場合、絶縁部材によって所定の板厚に形成した基板３ａを用意し、基板３ａの板厚方向を貫通する貫通孔３ｄを、基板３ａに対してアレイ状に形成する（貫通孔形成工程）。

次いで、図１１Ａに示すように、基板３ａの一面にカーボンペースト１３を塗布してゆき、基板３ａの各貫通孔３ｄ内をカーボンペースト１３により埋め、カーボンペースト１３により貫通孔３ｄを塞いだ閉塞部１３ｂを形成する。この際、閉塞部１３ｂの他端が基板３ａの他面と揃うように、貫通孔３ｄ内にカーボンペースト１３が充填される。

次いで、所定の加熱温度で所定時間（例えば、１２０℃で３０分）、カーボンペースト１３を焼成することにより、基板３ａの各貫通孔３ｄに検出電極３ｂを形成する。次いで、基板３ａの一面にある余分なカーボン層１３ａを、アセトン等の除去液で除去することにより、図１１Ｂに示すように、基板３ａの一面に検出電極３ｂの一端が揃った電極形成板３を形成することができる。

（２−４）解析部による定量性評価
次に、電気化学センサ１での発光強度の定量性評価について以下説明する。ここでは、図５に示すような電気化学センサ１を作製し、発光強度の定量性評価を確認する検証試験を行った。この場合、検出対象分子を含むサンプル溶液１０ａとしては、濃度０．１ＭのＫＣｌ水溶液（塩化カリウム水溶液）にフェリシアン化カリウムを含有させたフェリシアン化カリウム溶液を用いた。電気化学発光溶液１０ｂとしては、［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］Ｃｌ_２の濃度を１０ｍＭとし、ＴＰＡの濃度を１００ｍＭとした、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液（塩化カリウム水溶液）を用いた。

ポテンショスタットの対極端子、作用電極端子及び参照電極端子にそれぞれ、駆動電極８ａ，８ｂ及び参照電極８ｃを接続し、ポテンショスタットを用いて駆動電極８ｂに参照電極８ｃに対して−１．１Ｖの電位（以下、検出電位とも称する）を印加し、撮像部６として設けたＣＣＤカメラによって、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１を撮像し、得られた撮像画像から発光強度を確認した。

この際、ＫＣｌ水溶液内のフェリシアン化カリウムの濃度を、０．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ及び１０ｍＭとしたサンプル溶液１０ａをそれぞれ用い、フェリシアン化カリウムの濃度を変えたときに発光強度がどのように変化するかを確認した。その結果、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すような結果が得られた。

図１２Ａは、ＣＣＤカメラにより撮像した白黒の撮像画像であり、フェリシアン化カリウムの濃度が高くなるに従って発光Ｌ１を示す白色が濃くなってゆき、発光強度が大きくなることが目視により確認することができた。また、撮像画像毎にそれぞれ３点の白色を任意に選択し、白色の度合いから発光強度を特定した。そして、特定した発光強度の平均値を算出し、得られた算出結果を、図１２Ｂに示すように、濃度を横軸とし、発光強度を縦軸としてグラフに示した。図１２Ｂのｎは測定の実施回数を示し、Ｒ^２は決定係数を示す。図１２Ｂ中の黒丸は３回の実験結果の平均値を示し、エラーバーは３回の実験結果の±標準偏差を示す。

図１２Ｂに示すように、検出対象分子の濃度が高くなるに従って発光強度も大きくなることが確認できた。このことから、発光強度を基に検出対象分子の濃度の定量性評価が行えることが確認できた。

そこで、本実施形態では、図５に示した電気化学センサ１に、電気化学発光溶液１０ｂにおける発光強度を基に、サンプル溶液１０ａ内における検出対象分子の濃度の定量性評価を行う解析部７ａを設けるようにした。

この場合、電気化学センサ１を用いて、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子の濃度と、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂが発光する発光強度との関係を予め調べておき、図１２Ｂに示すように、検出対象分子の濃度と発光強度との関係を示す検量線を作製する。

解析部７ａは、検出対象分子の濃度と発光強度との関係を表した検量線を予め記憶する。その後、解析部７ａは、撮像部６により取得した撮像画像を受け取ると、画像処理ソフトを用いて撮像画像から発光強度を算出し、検量線に基づいてサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子の濃度を特定する。

以上のような構成とすることで、電気化学センサ１では、撮像部６により取得した撮像画像に基づいてサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子の濃度を自動的に特定することができる。

なお、解析部７ａは、撮像画像から電気化学発光溶液１０ｂでの発光強度を特定する際、画像処理ソフトにより、予め規定した輝度値以上の画素を特定し、これら画素の輝度値の平均値を算出するようにしてもよく、また、所定輝度値以上の画素集団を特定し、全ての画素集団、又は、所定数の画素集団の輝度値の平均値を算出して、電気化学発光溶液１０ｂでの発光強度を算出するようにしてもよい。また、画像処理部７では、撮像画像を生成する際、検出電極が写る位置間を数値計算により補間し、輝度値が滑らかに移り変わるような撮像画像を生成してもよい。

（２−５）提示部による拡散イメージの提示
次に、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」の検証試験により用いた、図５に示す電気化学センサ１を用い、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子の移動を、電気化学発光溶液１０ｂの発光変化により確認できるか否かについて検証試験を行った。

ここでは、サンプル溶液１０ａ内で検出対象分子が移動してゆく過程を実現するために、濃度０．１ＭのＫＣｌ水溶液（塩化カリウム水溶液）内に、濃度が５０ｍＭのフェリシアン化カリウムを注入してゆき、ＫＣｌ水溶液内にフェリシアン化カリウムを拡散させていった。

なお、電気化学発光溶液１０ｂは、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」の検証試験で用いた電気化学発光溶液１０ｂと同じものを用いた。また、参照電極８ｃに対して−１．１Ｖの検出電位を、駆動電極８ｂに印加し、サンプル溶液（ＫＣｌ水溶液）１０ａ内にフェリシアン化カリウムを拡散させていったときに、撮像部６として設けたＣＣＤカメラによって、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光を所定時間間隔で撮像していった。

その結果、図１３に示すような結果が得られた。図１３Ａは、サンプル溶液１０ａ内にフェリシアン化カリウムを注入した直後（０．０ｓ）に、検出電極３ｂの他端での電気化学発光溶液１０ｂを、撮像部６により撮像したときの写真である。図１３Ｂは、サンプル溶液１０ａ内にフェリシアン化カリウムを注入してから１．８ｓ経過後に、検出電極３ｂの他端での電気化学発光溶液１０ｂを、撮像部６により撮像したときの写真である。

図１３Ｃは、サンプル溶液１０ａ内にフェリシアン化カリウムを注入してから４．０ｓ経過後に、検出電極３ｂの他端での電気化学発光溶液１０ｂを、撮像部６により撮像したときの写真である。図１３Ｄは、サンプル溶液１０ａ内にフェリシアン化カリウムを注入してから８．３ｓ経過後に、検出電極３ｂの他端での電気化学発光溶液１０ｂを、撮像部６により撮像したときの写真である。

図１３Ａ〜図１３Ｄの結果から、発光箇所が時間経過とともに次第に移動してゆくことが確認でき、また、発光強度も次第に大きくなることが確認できた。このことから、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１の時間的変化を観察することで、サンプル溶液１０ａ内における検出対象分子の移動イメージが得られることが確認できた。

そこで、本実施形態では、図５に示した電気化学センサ１に、電気化学発光溶液１０ｂにおける発光箇所の変化を基に、サンプル溶液１０ａ内における検出対象分子の拡散イメージを提示する提示部７ｂを設けるようにした。提示部７ｂは、例えば液晶ディスプレイ等の表示部を備えており、撮像部６で時系列順に取得した撮像画像を、表示部に順次表示させる。

これにより、電気化学センサ１では、サンプル溶液１０ａ内における検出対象分子の移動イメージを、電気化学センサ１の使用者に対して目視確認させることができる。

（２−６）サンプル溶液について
上述した実施形態においては、サンプル溶液１０ａ内で還元反応が起こる検出対象分子の一例として、フェリシアン化カリウムを適用した場合について述べたが、本発明はこれに限らず、サンプル内で還元反応が起きる物質であれば、その他種々の物質を検出対象分子として適用することができる。

他の検出対象分子として、例えば、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を適用することができる。ここで、過酸化水素を検出対象分子として含有させたサンプル溶液１０ａを用いて、電気化学センサ１において、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基に過酸化水素を検出できるか否かの検証試験を行った。

この検証試験では、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」の検証試験により用いた、図５に示す電気化学センサ１を用いた。また、電気化学発光溶液１０ｂも、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」の検証試験と同じものを用いた。

サンプル溶液１０ａとしては、過酸化水素の濃度を３．８ｍＭとした濃度０．１ＭのＫＣｌ溶液を用意した。また、比較例のサンプル溶液１０ａとして、過酸化水素を含まない濃度０．１ＭのＫＣｌ溶液を用意した。

参照電極８ｃに対して−１．８Ｖとした検出電位を、駆動電極８ｂに印加し、上記の各サンプル溶液１０ａを用いたときに、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光を、撮像部６として設けたＣＣＤカメラによって撮像した。その結果、図１４Ａ及び図１４Ｂの結果が得られた。

図１４Ａは、過酸化水素が含まれていないサンプル溶液１０ａでの結果であり、図１４Ｂは、過酸化水素の濃度を３．８ｍＭとしたサンプル溶液１０ａでの結果である。図１４Ａから、過酸化水素が含まれていないサンプル溶液１０ａでは、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂが発光しないことが確認できた。

一方、図１４Ｂから、過酸化水素の濃度を３．８ｍＭとしたサンプル溶液１０ａでは、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂが発光することが確認できた。

次に、駆動電極８ｂに印加する検出電位を変えて、電気化学センサ１の過酸化水素の検出能評価を行った。この検証試験では、過酸化水素の濃度を５．０ｍＭとしたリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline：ＰＢＳ）をサンプル溶液１０ａとして用いた点と、駆動電極８ｂに印加する検出電位を変えた点以外は、上記の検証試験と同じ条件とした。

駆動電極８ｂに印加する検出電位は、−０．０Ｖ、−０．５Ｖ、−１．０Ｖ、−１．５Ｖ、−２．０Ｖ及び−２．５Ｖとした。そして、検出電位を印加後３０ｓ後に、検出電極３ｂの他端を撮像部６により撮像した。その結果、図１５に示すような撮像画像が得られた。

図１５の上段の写真は、過酸化水素が含まれていないサンプル溶液１０ａを用いたときの結果を示し、下段の写真は、過酸化水素の濃度を５．０ｍＭとしたサンプル溶液１０ａを用いたときの結果を示す。

過酸化水素の濃度を５．０ｍＭとしたサンプル溶液１０ａを用いたときの検証結果から、駆動電極８ｂに印加する検出電位を−１．５Ｖとすると、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂの発光が明確になることが分かった。この検証試験の条件において、過酸化水素を検出する場合は、駆動電極８ｂに−２．０Ｖ程度の検出電位を印加することが望ましいことが分かった。

なお、過酸化水素が含まれていないサンプル溶液１０ａでも、駆動電極８ｂに印加する検出電位を−２．５Ｖとすると、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂが発光している状態が撮像画像内に現れたが、これはサンプル溶液１０ａ内の溶存酸素の還元に起因するものと考えられる。

以上より、本発明の電気化学センサ１では、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の過酸化水素を還元させることで、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化による電気化学発光が生じることが確認できた。よって、上述した電気化学センサ１は、過酸化水素の検出用にも用いることができる。

（２−７）電気化学発光溶液について
上述した実施形態においては、検出電極３ｂの他端で酸化することにより発光する電気化学発光溶液として、［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］Ｃｌ_２とトリプロピルアミン（ＴＰＡ）の混合水溶液を用いた場合について述べたが、本発明はこれに限らない。本発明では、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を還元させることで、検出電極３ｂの他端で発光物質の酸化が生じて発光する種々の電気化学発光溶液を適用できる。

例えば、他の電気化学発光溶液としては、ルミノール（Luminol）と過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の混合溶液（Luminol／Ｈ_２Ｏ_２）を適用してもよい。この場合、下記のような酸化反応によって発光する。

また、他の電気化学発光溶液としては、下記の化学式で示されるＩｒ（ｐｐｙ）_３とトリプロピルアミン（ＴＰＡ）の混合溶液を適用してもよい。

（２−８）作用及び効果
以上の構成において、電気化学センサ１では、サンプル溶液１０ａを保持するサンプル溶液保持部２と、電気化学発光溶液１０ｂを保持する電気化学発光溶液保持部４と、の間に電極形成板３を設けるようにした。また、電極形成板３は、サンプル溶液１０ａと電気化学発光溶液１０ｂとを仕切る基板３ａに、複数の検出電極３ｂをアレイ状に設け、各検出電極３ｂを、基板３ａの板厚方向を貫通するように設けるようにした。

これにより、各検出電極３ｂは、一端がサンプル溶液１０ａに接し、他端が電気化学発光溶液１０ｂに接した構成となり、一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元されることによって、他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることができる。

このように、電気化学センサ１では、各検出電極３ｂにリード線を設けなくても、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基にサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を確認できるので、リード線が不要となる分、検出電極３ｂを高密度で配置させることができる。よって、電気化学センサ１では、検出電極３ｂを高密度で配置できる分だけ、高解像の解析データを得ることができ、従来よりも一段と正確に検出対象分子の解析を行うことができる。

（２−９）電気化学発光溶液の発光物質が還元により発光する場合
上述した実施形態においては、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「還元」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「酸化」させて発光させる場合について述べたが、本発明はこれに限らない。例えば、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「酸化」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させる電気化学センサであってもよい。

この場合、電気化学センサの構成は、図５に示した、上述の電気化学センサ１と同じ構成となるものの、使用するサンプル溶液１０ａ及び電気化学発光溶液１０ｂが異なるものとなる。

検出電極３ｂの一端で検出対象分子が「酸化」されるサンプル溶液１０ａとしては、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）や、ドーパミンを含んだサンプル溶液１０ａを適用することができる。なお、ドーパミンは神経細胞から放出される物質であることから、ドーパミンを検出する電気化学センサとすることで、神経細胞の活動を解析することができる。

一方、検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂとしては、下記の化学式で示すように、ルテニウム錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）_３ ^２＋）とペルオキソ二硫酸イオン（Ｓ_２Ｏ_８ ^２−）を含む混合溶液を適用することができる。

また、検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂとしては、下記の化学式で示される溶液を適用してもよい。

以上の構成であっても、上述した第１実施形態と同様の効果を得ることができるとともに、サンプル溶液１０ａ内で酸化する検出対象分子であっても、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基にサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を確認できる。

（３）第２実施形態
（３−１）第２実施形態の電気化学センサの構成
次に、自己誘発レドックスサイクルを発現可能な第２実施形態の電気化学センサについて以下説明する。第２実施形態の電気化学センサは、図５に示した第１実施形態の電気化学センサ１と基本的構成は同じであり、図１６に示すような酸化用電極１７ａが設けられている点で相違している。

なお、図１６に示す電気化学センサ１６は、上述した第１実施形態と異なる酸化用電極１７ａに着目したものであり、第１実施形態と同じであるサンプル溶液保持部２や電気化学発光溶液保持部４、光学顕微鏡５、撮像部６、画像処理部７、駆動電極８ａ，８ｂ及び参照電極８ｃの各構成については省略している。

第２実施形態の電気化学センサ１６は、電極形成板３の各検出電極３ｂの一端と対向するようにサンプル溶液１０ａ内に酸化用電極１７ａが配置されている。本実施形態の場合、酸化用電極１７ａは、ガラス基板１８の表面に板状に形成されており、当該ガラス基板１８によってサンプル溶液１０ａ内に支持されている。酸化用電極１７ａは、例えば白金等の導電性部材により形成されている。また、酸化用電極１７ａは、電源等には接続されていないフローティング電極であってもよく、電源に接続して電位を印加してもよく、駆動電極８ａと兼用であってもよい。

このような構成を有する電気化学センサ１６では、駆動電極８ｂ及び対極８ａに電位が印加され、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内で検出対象分子が還元されると、還元された検出対象分子が、当該検出電極３ｂと対向配置された酸化用電極１７ａで酸化される。また、酸化用電極１７ａで酸化されたサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子は、再び、検出電極３ｂの一端で還元される。

このようにして、電気化学センサ１６では、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元と酸化とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができる。検出対象分子が還元と酸化とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現した領域ＥＲ２では、検出電極３ｂの一端で検出対象分子が繰り返し還元されるため、その分、酸化用電極１７ａを設けなかった領域ＥＲ３に比して、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂの酸化が進み発光Ｌ１の強度が増強される。

なお、図１６に示す電気化学センサ１６では、酸化用電極１７ａが検出電極３ｂと対向配置されている領域ＥＲ２と、酸化用電極１７ａが検出電極３ｂと対向配置されていない領域ＥＲ３と、を比較するために、電極形成板３の一部の検出電極３ｂにのみ酸化用電極１７ａを対向させているが、電極形成板３の検出電極３ｂがアレイ状に配置されたセンサエリア全てに対向するように酸化用電極１７ａを設けることが望ましい。

（３−２）検証試験
次に、酸化用電極１７ａを設けることで、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂの発光強度が増強されるか否かを確認する検証試験を行った。この検証試験に用いる電気化学センサ及び電気化学発光溶液１０ｂは、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」の検証試験と同じものを用いた。サンプル溶液１０ａは、フェリシアン化カリウムの濃度を５．０ｍＭとしたサンプル溶液１０ａを用いた。

そして、図１７Ａに示すように、所定の大きさでなる板状のガラス基板１８を用意し、ガラス基板１８の半分の領域に、スパッタによって白金（Ｐｔ）を成膜し、酸化用電極１７ａを形成した。

次いで、図１７Ｂに示すように、検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３のセンサエリアと、サンプル溶液１０ａ内で対向するように、酸化用電極１７ａを有するガラス基板１８をサンプル溶液保持部２に設置した。この際、検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３のセンサエリアの半分だけが酸化用電極１７ａと対向するようにし、当該センサエリアの残りの半分の領域はガラス基板１８のみが対向するようにした。

次いで、駆動電極８ｂに−１．１Ｖの検出電位を印加し、撮像部６として設けたＣＣＤカメラによって、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１を撮像した。その結果、図１７Ｃのような撮像画像が得られた。

図１７Ｃから、ガラス基板１８のみを対向させた領域に比べて、酸化用電極１７ａを対向させた領域の方が、発光Ｌ１を示す白色の輝度が大きくなっており、酸化用電極１７ａを設けることで発光強度が増強することが確認できた。

（３−３）作用及び効果
以上の構成において、第２実施形態による電気化学センサでも、上述した第１実施形態と同様に、各検出電極３ｂにリード線を設けなくても、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基にサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を確認できるので、リード線が不要となる分、検出電極３ｂを高密度で配置させることができる。よって、第２実施形態の電気化学センサでも、検出電極３ｂを高密度で配置できる分だけ、高解像の解析データを得ることができ、従来よりも一段と正確に検出対象分子の解析を行うことができる。

また、第２実施形態の電気化学センサでは、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元と酸化とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができるので、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化が進み、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光強度を増強させることができる。さらに、駆動電極８ｂに印加する電位を下げた場合でも、自己誘発レドックスサイクルの発現により、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂを発光させることができる。

（３−４）サンプル溶液内に還元用電極を設け、かつ発光物質が還元により発光する電気化学発光溶液を用いた場合
上述した実施形態においては、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「還元」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「酸化」させて発光させる電気化学センサに対して、サンプル溶液１０ａ内に酸化用電極１７ａを設けた場合について述べたが、本発明はこれに限らない。

例えば、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「酸化」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させる電気化学センサに対して、サンプル溶液１０ａ内に還元用電極を設けても、上記と同様の効果を得ることができる。

この場合、還元用電極は、図１６に示した酸化用電極１７ａと同一の構成となるものの、使用するサンプル溶液１０ａ及び電気化学発光溶液１０ｂが異なるものとなる。なお、還元用電極は、図１６に示した酸化用電極１７ａと同一の構成となるため、ここではその説明は省略する。

検出電極３ｂの一端で検出対象分子が「酸化」されるサンプル溶液１０ａを用い、検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂを用いることで、サンプル溶液１０ａ内の還元用電極により、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元と酸化とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができ、上記と同様の効果を得ることができる。

（３−５）電気化学発光溶液内に還元用電極を設けた他の実施形態
（３−５−１）電気化学発光溶液内に還元用電極を設けた構成
上述した第２実施形態においては、サンプル溶液保持部２に、サンプル溶液１０ａ内で検出電極３ｂとの間で自己誘発レドックスサイクルを発現させる酸化用電極１７ａを設け、検出電極３ｂの他端で発生する電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の発光強度を増強させた場合について述べたが、本発明はこれに限らない。

例えば、電気化学発光溶液保持部４に、電気化学発光溶液１０ｂ内で検出電極３ｂとの間で自己誘発レドックスサイクルを発現させる還元用電極を設けるようにしてもよい。このような構成であっても、上述した第２実施形態と同様に、検出電極３ｂの一端で検出対象分子が還元されることで、検出電極３ｂの他端で発生する電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の発光強度を増強させることができる。

図１８は、電気化学発光溶液１０ｂ内で検出電極３ｂとの間で自己誘発レドックスサイクルを発現させる還元用電極１７ｂを設けた電気化学センサの一例を示す。この場合、上述した第１実施形態の電気化学センサ１と基本的構成は同じであり、図１８に示すような還元用電極１７ｂが設けられている点のみが相違しているため、ここでは、サンプル溶液保持部２や電気化学発光溶液保持部４、光学顕微鏡５、撮像部６、画像処理部７、駆動電極８ａ，８ｂ及び参照電極８ｃの各構成については省略している。

この場合、還元用電極１７ｂは、ＩＴＯ（Tndium Tin Oxide）等の透明導電性部材により板状に形成されており、電極形成板３の検出電極３ｂの他端に対向するように、電気化学発光溶液保持部４（図示せず）の透明基板４ｄ上に形成される。還元用電極１７ｂは、電源等には接続されていないフローティング電極であってもよく、電源に接続して電位を印加してもよく、駆動電極８ｂと兼用であってもよい。

還元用電極１７ｂが設けられた電気化学センサでも、駆動電極８ｂに電位が印加され、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が還元され、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が酸化されると発光する。この際、還元用電極１７ｂは、検出電極３ｂの他端で酸化された電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を還元する。これにより、還元用電極１７ｂで還元された電気化学発光溶液１０ｂは、再び、検出電極３ｂの他端で発光物質が酸化されて発光する。

このようにして、還元用電極１７ｂを設けた電気化学センサでは、電気化学発光溶液１０ｂ内で酸化と還元とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができ、上述した第２実施形態と同様に、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化と還元とが繰り返され、その分、発光Ｌ１の強度が増強する。

また、還元用電極１７ｂは透明導電性部材により形成されていることから、透明基板４ｄの下側から各検出電極３ｂの他端を撮像部６により撮像する際、透明基板４ｄ上に還元用電極１７ｂを設けても、各検出電極３ｂの他端を撮像することができる。

（３−５−２）電気化学発光溶液内の発光物質による発光の正しい解析手法
ここで、図１８に示すように、検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板３のセンサエリア内で発生する電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の発光を、撮像部６によって局所的に観察するためには、光学顕微鏡５（図５）により拡大率を上げる必要がある。そのため、電極形成板３と、光学顕微鏡５の対物レンズ５ａとの距離を極力小さくすることが望ましい。

よって、図１８に示すように、還元用電極１７ｂを設けた構成でも、電極形成板３と還元用電極１７ｂとの距離Ｈ１を小さく選定することが望ましい。ここで、電極形成板３と還元用電極１７ｂとの距離Ｈ１を小さくすると、その分、電極形成板３と還元用電極１７ｂとの間にある電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の存在領域が小さくなる。

ここで、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１によって正しく解析するためには、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の還元反応が律速になる必要がある。しかしながら、このように電気化学発光溶液１０ｂの存在領域が小さくなると、電気化学発光溶液１０ｂ内において検出電極３ｂの他端に拡散する発光物質が不足してしまい、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化反応が律速になる恐れがある。この場合、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を電気化学発光溶液１０ｂの発光によって正しく解析することが難しい。

この点、図１８に示した、還元用電極１７ｂを設けた構成では、電極形成板３と還元用電極１７ｂとの距離Ｈ１を小さくし、電気化学発光溶液１０ｂを極薄層としても、電極形成板３と還元用電極１７ｂとの距離Ｈ１を小さくした分だけ効率的に自己誘発レドックスサイクルを発現させることができる。このため、還元用電極１７ｂを設けた構成では、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の酸化反応が律速にならずに、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を、電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１によって正しく解析することができる。

なお、図１９に示すように、還元用電極１７ｂを設けない構成とした場合には、電気化学発光溶液１０ｂ内において検出電極３ｂの他端に拡散する発光物質が不足してしまうことを抑制するために、例えば、所定方向Ａ１に新たな電気化学発光溶液１０ｂを供給することが望ましい。これにより、電極形成板３と透明基板４ｄとの距離Ｈ２を小さくし、電気化学発光溶液１０ｂを極薄層としても、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の酸化反応が律速にならずに、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を、電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１によって正しく解析することができる。

以上のように、還元用電極１７ｂを設けた電気化学センサでは、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化と還元とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができるので、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化が進み、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光強度を大きくさせることができる。

（３−５−３）電気化学発光溶液内に酸化用電極を設け、かつ発光物質が還元により発光する電気化学発光溶液を用いた場合
上述した実施形態においては、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「還元」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「酸化」させて発光させる電気化学センサに対して、電気化学発光溶液１０ｂ内に還元用電極１７ｂを設けた場合について述べたが、本発明はこれに限らない。

例えば、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「酸化」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させる電気化学センサに、電気化学発光溶液１０ｂ内に酸化用電極を設けても、上記と同様の効果を得ることができる。

この場合、酸化用電極は、図１８に示した還元用電極１７ｂと同一の構成となるものの、使用するサンプル溶液１０ａ及び電気化学発光溶液１０ｂが異なるものとなる。なお、酸化用電極は、図１８に示した還元用電極１７ｂと同一の構成となるため、ここではその説明は省略する。

ここでは、検出電極３ｂの一端で検出対象分子が「酸化」されるサンプル溶液１０ａを用い、検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂを用いることで、電気化学発光溶液１０ｂ内の酸化用電極により、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が還元と酸化とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させることができ、上記と同様の効果を得ることができる。

なお、第２実施形態では、サンプル溶液１０ａ内に酸化用電極１７ａ（還元用電極）を設けるか、又は、電気化学発光溶液１０ｂ内に還元用電極１７ｂ（酸化用電極）を設け、いずれか一方のみを設けた電気化学センサについて説明したが、本発明はこれに限らず、酸化用電極１７ａ及び還元用電極１７ｂ（還元用電極及び酸化用電極）の両方を設けた電気化学センサとしてもよい。

（４）第３実施形態
（４−１）発光物質が酸化により発光する電気化学発光溶液を用いた場合
次に、サンプル溶液内に含まれる測定物質から、酸化反応により検出対象分子を得る場合について以下説明する。図２０に示す第３実施形態の電気化学センサは、図５に示した第１実施形態の電気化学センサ１と基本的構成は同じであり、図２０に示すような酸化用電極２０が設けられている点で相違している。

なお、図２０は、上述した第１実施形態と異なる酸化用電極２０に着目したものであり、第１実施形態と同じであるサンプル溶液保持部２や電気化学発光溶液保持部４、光学顕微鏡５、撮像部６、画像処理部７、駆動電極８ａ，８ｂ及び参照電極８ｃの各構成については省略している。

第３実施形態の電気化学センサは、電極形成板３の各検出電極３ｂの一端と対向するようにサンプル溶液１０ａ内に酸化用電極２０が配置されている。本実施形態の場合、酸化用電極２０は、板状に形成されており、サンプル溶液保持部２（図示せず）によりサンプル溶液１０ａ内に支持されている。酸化用電極２０は、例えば白金等の導電性部材により形成されている。また、酸化用電極２０は、電源等には接続されていないフローティング電極であってもよく、電源に接続して電位を印加してもよく、駆動電極８ａと兼用であってもよい。

サンプル溶液１０ａには、酸化反応に基づいて検出対象分子が得られる測定物質が含まれている。第３実施形態では、測定物質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を適用することができる。なお、その他の測定物質として、ドーパミンを適用してもよい。

第３実施形態の電気化学センサでは、サンプル溶液１０ａ内の測定物質を検出する際、駆動電極８ａ，８ｂ（図５）間に電位が印加される。これにより、サンプル溶液１０ａ内では、酸化用電極２０により酸化反応が起こり、測定物質に基づいて検出対象分子が生成される。

酸化用電極２０による酸化によって得られた、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子は、酸化用電極２０と対向する検出電極３ｂの一端で還元される。このように、第３実施形態の電気化学センサでは、酸化用電極２０を設けることで、サンプル溶液１０ａ内の測定物質が、酸化反応により検出される分子であっても、酸化用電極２０を設けることで、酸化反応により検出対象分子を得られ、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内で検出対象分子を還元されることができる。よって、上述した第１実施形態等と同様に、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることができる。

ここで、図２１は、サンプル溶液１０ａ内の測定物質として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を適用した際に、サンプル溶液１０ａ内で発生する酸化還元反応を示した概略図である。この場合、サンプル溶液１０ａでは、パラアミノフェニルリン酸を基質とし、ＡＬＰにより生成されるパラアミノフェノール（ｐＡＰ）を、酸化用電極２０によって、一旦酸化してキノンイミン（ＱＩ）を生成させる。次いで、検出電極３ｂの一端でＱＩを還元することにより、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることができる。

なお、第３実施形態の電気化学センサでは、酸化用電極２０でサンプル溶液１０ａ内の測定物質を効率的に酸化させるために、電極形成板３の検出電極３ｂがアレイ状に配置されたセンサエリア全てに対向するように酸化用電極２０を設けることが望ましい。

以上の構成において、第３実施形態による電気化学センサでも、上述した第１実施形態と同様に、各検出電極３ｂにリード線を設けなくても、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基にサンプル溶液１０ａ内の測定物質を確認できるので、リード線が不要となる分、検出電極３ｂを高密度で配置させることができる。よって、第２実施形態の電気化学センサでも、検出電極３ｂを高密度で配置できる分だけ、高解像の解析データを得ることができ、従来よりも一段と正確に検出対象分子の解析を行うことができる。

（４−２）発光物質が還元により発光する電気化学発光溶液を用いた場合
上述した実施形態においては、サンプル溶液１０ａ内に含まれる測定物質から、酸化用電極２０による酸化反応により検出対象分子を得、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「還元」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「酸化」させて発光させる電気化学センサについて述べたが、本発明はこれに限らない。

例えば、サンプル溶液１０ａ内に還元用電極を設け、サンプル溶液１０ａ内に含まれる測定物質から、還元用電極による還元反応により検出対象分子を得、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「酸化」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させる電気化学センサであってもよい。

この場合、還元用電極は、図２０に示した酸化用電極２０と同一の構成となるものの、使用するサンプル溶液１０ａ及び電気化学発光溶液１０ｂが異なり、サンプル溶液１０ａ内で還元反応を起こさせるものである。なお、還元用電極は、図２０に示した酸化用電極２０と同一の構成となるため、ここではその説明は省略する。

この実施形態により、検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂ（例えば上記の化３等）を用いても、サンプル溶液１０ａ内に還元用電極を設けることで、還元反応に基づいて検出対象分子が得られるサンプル溶液１０ａの測定物質について、上記と同様に、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の発光を基に検出することができる。

なお、第３実施形態の電気化学センサでも、上述した第２実施形態の還元用電極１７ｂ（酸化用電極）を電気化学発光溶液１０ｂ内に設けることで、電気化学発光溶液１０ｂ内で酸化と還元とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させるようにしてもよい。また、第３実施形態の電気化学センサでも、上述した第２実施形態の酸化用電極１７ａ（還元用電極）をサンプル溶液１０ａ内に設けることで、サンプル溶液１０ａ内で酸化と還元とを繰り返す自己誘発レドックスサイクルを発現させるようにしてもよい。この場合、電気化学発光溶液１０ｂ内の発光Ｌ１を増強できる。

（５）第４実施形態
（５−１）第４実施形態の電気化学センサの概要
次に、本発明の電気化学センサを利用して、サンプル溶液１０ａ内における、グルコースやグルタミン酸、尿酸、ピルビン酸、アミノ酸、アルコール、コレステロール、マルトース等の測定物質を検出可能な第４実施形態について以下説明する。

図２２は、第４実施形態の電気化学センサの概要を説明するための概略図である。第４実施形態では、図５に示した第１実施形態の電気化学センサ１と基本的構成は同じであるが、上記の測定物質と酸素との反応を触媒し、過酸化水素を発生させるオキシダーゼを設ける点で相違する。

第４実施形態では、サンプル溶液１０ａ内において、オキシダーゼにより測定物質を酸化させて酸化体とし、この酸化反応によって過酸化水素を発生させる。これにより、検出電極３ｂでは、一端でサンプル溶液１０ａ内の過酸化水素が還元され、これに応じて他端で電気化学発光溶液１０ｂが酸化し、この酸化反応により電気化学発光溶液１０ｂを発光させることができる。

（５−２）第４実施形態の電気化学センサの構成
次に、このように、オキシダーゼを利用して測定物質を検出する電気化学センサの構成について以下説明する。図２３は、第４実施形態の電気化学センサ２２を示しており、図５に示した第１実施形態の電気化学センサ１とは、検出対象分子ではない測定対象が含まれたサンプル溶液１０ａを使用する点と、グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂをサンプル溶液１０ａ内に設けている点とで相違する。

なお、サンプル溶液保持部２や電気化学発光溶液保持部４、図示しない光学顕微鏡５、画像処理部７等の各構成については、図５に示した第１実施形態の電気化学センサ１と同じであるため、ここではその説明は省略する。

第４実施形態の電気化学センサ２２は、サンプル溶液１０ａ内の測定物質として、例えばグルタミン酸及び乳酸を適用する場合を例として説明する。この場合、サンプル溶液１０ａには、グルタミン酸溶液及び乳酸溶液が含まれる。

電極形成板３には、サンプル溶液１０ａと接する一方の面に、層状のグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂが設けられている。これらグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂは、図２４に示すように、電極形成板３にアレイ状に設けられており、同じくアレイ状に配置された検出電極３ｂ（図示せず）の一端をそれぞれ覆うように形成されている。

本実施形態では、グルタミン酸反応酵素層２４ａと、乳酸反応酵素層２４ｂとが交互に配置された列が並走するように規則的に並んでいる。なお、図２３に示す電極形成板３の断面は、図２４の電極形成板３のＤ−Ｄ部分の側断面の一部を示すものである。本実施形態の場合、グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂは、円盤状に形成されており、図２３に示すように、幅Ｗ１及び厚さが同じに選定されている。

グルタミン酸反応酵素層２４ａは、例えばグルタミン酸と酸化反応して過酸化水素を生成するグルタミン酸オキシダーゼ等により形成されている。このグルタミン酸反応酵素層２４ａは、駆動電極８ａ，８ｂ間に電位が印加された際に、サンプル溶液１０ａにグルタミン酸が含まれていると、当該グルタミン酸とグルタミン酸オキシダーゼとが酸化反応して過酸化水素を生成する。

これにより、グルタミン酸反応酵素層２４ａが一端に配置された検出電極３ｂは、グルタミン酸反応酵素層２４ａで生成された過酸化水素を一端で還元し、この還元反応によって他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることができる。かくして、グルタミン酸反応酵素層２４ａが設けられた検出電極３ｂは、グルタミン酸検出用の電極として機能する。

一方、乳酸反応酵素層２４ｂは、例えば乳酸と酸化反応して過酸化水素を生成する乳酸オキシダーゼ等により形成されている。この乳酸反応酵素層２４ｂは、駆動電極８ａ，８ｂ間に電位が印加された際に、サンプル溶液１０ａに乳酸が含まれていると、当該乳酸と乳酸オキシダーゼとが酸化反応して過酸化水素を生成する。

これにより、乳酸反応酵素層２４ｂが一端に配置された検出電極３ｂは、乳酸反応酵素層２４ｂで生成された過酸化水素を一端で還元し、この還元反応によって他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を酸化させて発光させることができる。かくして、乳酸反応酵素層２４ｂが設けられた検出電極３ｂは、乳酸検出用の電極として機能する。

以上の構成において、第４実施形態の電気化学センサ２２は、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の発光状況を撮像部６により撮像し、得られた撮像画像から発光強度を確認することで、サンプル溶液１０ａ内に含まれている測定物質であるグルタミン酸及び乳酸を検出することができる。

なお、第４実施形態の電気化学センサ２２では、撮像画像内でのグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂの各位置を画像処理部７に予め記憶しており、例えば、撮像画像に撮像された電気化学発光溶液１０ｂの発光位置と、撮像画像内のグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂの位置とを比較する。

これにより、電気化学センサ２２では、撮像画像に撮像された電気化学発光溶液１０ｂの発光位置から、サンプル溶液１０ａ内に含まれるグルタミン酸及び乳酸を、区別して同時に検出することができる。

また、第４実施形態の電気化学センサ２２でも、上述した「（２−４）解析部による定量性評価」と同様に、解析部７ａによって、電気化学発光溶液１０ｂにおける発光強度を基に、サンプル溶液１０ａ内における測定物質（この場合、グルタミン酸及び乳酸）の濃度の定量性評価を行うことができる。

具体的には、電気化学センサ２２を用いて、サンプル溶液１０ａ内の測定物質の濃度と、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が発光する発光強度との関係を予め調べておき、測定物質の濃度と発光強度との関係を示す検量線を作製する。

解析部７ａは、測定物質の濃度と発光強度との関係を表した検量線を予め記憶する。解析部７ａは、撮像部６により取得した撮像画像を受け取ると、画像処理ソフトを用いて撮像画像から発光強度を算出し、検量線に基づいてサンプル溶液１０ａ内の測定物質の濃度を特定することができる。以上のような構成とすることで、第４実施形態の電気化学センサ２２でも、撮像部６により取得した撮像画像に基づいてサンプル溶液１０ａ内の測定物質の濃度を自動的に特定することができる。

さらに、第４実施形態の電気化学センサ２２でも、上述した「（２−５）提示部による拡散イメージの提示」と同様に、提示部７ｂによって、電気化学発光溶液１０ｂにおける発光箇所の変化を基に、サンプル溶液１０ａ内における測定物質（この場合、グルタミン酸及び乳酸）の拡散イメージを提示することができる。

提示部７ｂは、撮像部６で時系列順に取得した撮像画像を、表示部に順次表示させる。これにより、電気化学センサ２２でも、サンプル溶液１０ａ内における測定物質の拡散イメージを、電気化学センサ２２の使用者に対して目視確認させることができる。

（５−３）酵素層の製造方法
グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂは、次のような手順により製造することができる。例えば、グルタミン酸オキシダーゼを含む酵素溶液と、乳酸オキシダーゼを含む酵素溶液とを作製し、ナノインジェクションプリンタを使用して、これらを電極形成板３の表面にアレイ状に滴下してゆく。そして、電極形成板３の表面にアレイ状に滴下した酵素溶液を乾燥させ、電極形成板３の表面に吸着固化させることでグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを形成できる。

より具体的には、リン酸緩衝液で１ｍｇ/ｍLに調製したグルタミン酸オキシダーゼまたは乳酸オキシダーゼと、５ｍｇ/ｍウシ血清アルブミンと１．２５ｗｔ％グルタルアルデヒドを等量ずつ混合した酵素溶液をナノインジェクションプリンタのインクとして使用することにより、グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを形成できる。

（５−４）作用及び効果
以上の構成において、第４実施形態による電気化学センサ２２でも、上述した第１実施形態と同様に、各検出電極３ｂにリード線を設けなくても、電気化学発光溶液１０ｂの発光を基にサンプル溶液１０ａ内の過酸化水素を確認できるので、リード線が不要となる分、検出電極３ｂを高密度で配置させることができる。

また、これに加えて、第４実施形態の電気化学センサ２２では、サンプル溶液１０ａ内に測定物質（この場合、グルタミン酸及び乳酸）と酸化反応して過酸化水素を生成するグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを設けるようにした。従って、第４実施形態の電気化学センサ２２では、サンプル溶液１０ａ内の測定物質がグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂのオキシダーゼにより酸化され、この酸化反応によって過酸化水素を発生させることができる。これにより、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の過酸化水素が還元されることで、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質が酸化し、この酸化反応により電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を発光させることができる。

よって、第４実施形態の電気化学センサ２２では、サンプル溶液１０ａ内の測定物質を検出する際、検出電極３ｂを高密度で配置できる分だけ、高解像の解析データを得ることができ、従来よりも一段と正確に過酸化水素（検出対象分子）の解析を行え、これを基に測定物質の解析をも行うことができる。

（５−５）他の実施形態
（５−５−１）その他の酵素層について
なお、上述した第４実施形態においては、サンプル溶液１０ａ内のグルタミン酸及び乳酸を検出可能な電気化学センサ２２について説明したが、本発明はこれに限らず、上述したように、グルコースや尿酸、ピルビン酸、アミノ酸、アルコール、コレステロール、マルトース等の測定物質を検出する電気化学センサとしてもよい。この場合、測定物質毎に、測定物質と酸化反応して過酸化水素を生成する下記の表１の酵素を含む酵素層を設ければよい。

なお、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を含む酵素層を形成する場合には、下記の手順により製造することができる。先ず、グルコースオキシダーゼ溶液とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液とを混合した後、グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液を混合して混合溶液を作製する。

作製した混合溶液を、ナノインクジェットプリンタにより電極形成板３上に滴下してゆき、一晩自然乾燥させる。これにより、グルタルアルデヒド（ＧＡ）がグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のアミノ基とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のアミノ基を架橋し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と電極形成板３との疎水性相互作用で吸着固定し、これにより電極形成板３上に酵素層を形成することができる。

（５−５−２）電子伝達メディエータ層を設けた構成
上述した第４実施形態においては、電極形成板３の上にグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを直接形成した場合について述べたが、本発明はこれに限らず、図２５及び図２６に示すように、電極形成板３と酵素層２４との間に、電子伝達メディエータ層２５ａ，２５ｂを設けるようにしてもよい。

図２５は、ＨＲＰ配置−Ｏｓポリマーフィルム（ＢＡＳ株式会社製）を、電子伝達メディエータ層２５ａとして設けた例である。このような電子伝達メディエータ層２５ａを設けることで、酵素層２４から検出電極３ｂへの電子移動を電子伝達メディエータ層２５ａが仲介し、酵素層２４から検出電極３ｂへの電子移動を促進することができる。

また、図２６は、プルシアンブル−により形成されたプルシアンブル−層を、電子伝達メディエータ層２５ｂとして設けた例である。このような電子伝達メディエータ層２５ｂを設けても、酵素層２４から検出電極３ｂへの電子移動を電子伝達メディエータ層２５ｂが仲介し、酵素層２４から検出電極３ｂへの電子移動を促進することができる。

（５−５−３）酵素層の構成に関する他の実施形態
なお、上述した第４実施形態においては、異なる種類の酵素で形成したグルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを設けた場合について述べたが、本発明はこれに限らず、例えば、図２７に示すように、一方のグルタミン酸反応酵素層２４ａのみを電極形成板３上に形成するようにしてもよい。また、乳酸反応酵素層２４ｂのみを電極形成板３上に形成するようにしてもよく、さらに、３種以上の酵素層を電極形成板３上に形成するようにしてもよい。

また、上述した実施形態においては、グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂを電極形成板３の一方の面上に形成してサンプル溶液１０ａ内に浸漬させるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らない。例えば、図２８に示すように、電極形成板３の表面には形成せずに、電極形成板３から所定距離離れた位置に酵素層２４を配置するようにしてもよい。

この場合、ガラス等でなる支持基板２７の表面に酵素層２４を形成する。支持基板２７は、電極形成板３の一方の面から所定距離離れた位置に酵素層２４が配置されるように、図示しないサンプル溶液保持部２に設けられる。これにより、酵素層２４をサンプル溶液１０ａに浸漬させ、上述した第４実施形態と同様の効果を得ることができる。

（５−５−４）酵素層を設けた電気化学センサにおいて、発光物質が還元により発光する電気化学発光溶液を用いた場合
上述した第４実施形態においては、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「還元」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「酸化」させて発光させる電気化学センサ２２に対して、サンプル溶液１０ａ内に酵素層を設けて、測定物質を検出する場合ついて述べたが、本発明はこれに限らない。

例えば、検出電極３ｂの一端でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子が「酸化」されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させる電気化学センサに対して、サンプル溶液１０ａ内に酵素層を設けて、測定物質を検出するようにしてもよい。

この場合、電気化学センサの構成は、図２３、図２７、図２８等に示した、上述の電気化学センサと同じ構成になるものの、使用する電気化学発光溶液１０ｂのみが異なるものとなる。検出電極３ｂの他端で発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂとしては、上記の化３〜化７の化学式で示される溶液を適用することができる。

このように、発光物質を「還元」させて発光させる電気化学発光溶液１０ｂを用いた場合には、酵素層（例えば、グルタミン酸反応酵素層２４ａ及び乳酸反応酵素層２４ｂ）によりサンプル溶液１０ａ内で発生する過酸化水素を、還元検出するのではなく、酸化検出することになる。サンプル溶液１０ａ内に発生する、この過酸化水素が検出電極３ｂの一端で酸化されることによって、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質を「還元」させて発光させることになる。このような構成であっても、上述した第４実施形態と同様の効果を得ることができる。

（６）検出電極の他の実施形態
上述した第１実施形態から第４実施形態においては、検出電極として、サンプル溶液１０ａに接する一端と、電気化学発光溶液１０ｂに接する他端とが同じ直径に選定された円柱状の検出電極３ｂを設けるようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らない。例えば、サンプル溶液１０ａに接する一端の面積を、電気化学発光溶液１０ｂに接する他端の面積よりも小さくした柱状の検出電極であってもよい。

例えば、図２９Ａに示すように、サンプル溶液１０ａに接する一端に球状の電極部３０を設け、電極部３０によりサンプル溶液１０ａに接する面積を大きくした検出電極３ｂを適用してもよい。このような電極部３０を一端に有した検出電極３ｂがアレイ状に配置された電極形成板２９では、電極部３０により検出電極３ｂがサンプル溶液１０ａと接する面積を増大させることができる。これにより、検出電極３ｂの電極部３０でサンプル溶液１０ａ内の検出対象分子の還元反応が促進し、その分、検出電極３ｂの他端で電気化学発光溶液１０ｂ内の発光物質の酸化が進み発光強度を増強させることができる。

なお、上述した第４実施形態における酵素層は平板状に形成する必要はないため、球状の電極部３０を検出電極３ｂの一端に設けた場合には、当該電極部３０上に酵素層を形成すればよい。

また、その他の検出電極としては、図２９Ｂに示すように、円錐状の検出電極３２を設け、検出電極３２の平面を一端としてサンプル溶液１０ａに接するように設け、検出電極３２の頂点を他端として電気化学発光溶液１０ｂに接するように設けるようにしてもよい。

さらに、その他の検出電極としては、円柱状の検出電極３ｂの一端を基板３ａの表面から突出させてサンプル溶液１０ａ内に露出させたり、或いは、段差を設けた円錐状や円柱状の検出電極等を設けたりして、検出電極の一端でサンプル溶液１０ａとの接触面性を増大できれば種々の形状でなる検出電極を適用してもよい。

また、上述した第１実施形態から第４実施形態においては、円柱状の検出電極３ｂの軸方向が互いに平行に並ぶように各検出電極３ｂを配置させた電極形成板３について説明したが、本発明はこれに限らない。例えば、図３０に示すように、基板３ａの所定位置を中心Ｃにして、検出電極３５の軸方向がサンプル溶液保持部のサンプル溶液１０ａから電気化学発光溶液保持部の電気化学発光溶液１０ｂに向かって末広がりに延びている電極形成板３４を適用してもよい。

この場合、例えば、中心Ｃに位置する検出電極３５は、サンプル溶液１０ａから電気化学発光溶液１０ｂに垂直に向かう方向に軸方向が選定され、中心Ｃから遠ざかるに従って、検出電極３５の他端３５ｂが一端３５ａよりも中心Ｃから遠ざかる位置に形成される。

ここで、図３１は、第１実施形態等で適用した、軸方向が平行に並んだ検出電極３ｂと、中心Ｃを基準に、サンプル溶液１０ａから電気化学発光溶液１０ｂに向かって軸方向が末広がりに延びている検出電極３５とを比較した概略図である。

軸方向が平行に並んだ検出電極３ｂでは、サンプル溶液１０ａ内の検出対象分子を緻密に検出するために一端の間隔を小さくすると、他端でも間隔が小さくなる。その結果、検出電極３ｂの他端で生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１が重なってしまい、撮像部６により解像度が高い撮像画像が得られ難い場合もある。

これに対して、中心Ｃを基準に、サンプル溶液１０ａから電気化学発光溶液１０ｂに向かって軸方向が末広がりに延びている検出電極３５では、検出電極３５の一端３５ａの間隔を小さくしても、他端３５ｂの間隔を広げることができる。よって、検出電極３５の他端３５ｂで生じる電気化学発光溶液１０ｂの発光Ｌ１が重ならずに、撮像部６により解像度が高い撮像画像を得ることができる。これにより、回折限界を超えた分解能でのイメージングが可能になる。

なお、このような他端３５ｂが放射状に広がった検出電極３５は、下記の手順により製造することができる。図３２に示すように、金属部材によって板状の土台３５ｃ上に、軸方向が所定の中心Ｃに向かう棒状の検出電極３５を形成する。このような検出電極３５は、土台３５ｃ上での金属成長により形成してもよく、また、ナノインクジェットプリンタを用いて形成してもよい。

その後、土台３５ｃ上に絶縁部材を流して検出電極３５を絶縁部材内に埋没させた後、絶縁部材を固化させて基板３ａを形成する。そして、土台３５ｃが設けられた領域ＥＲ４を、平坦処理を行い、検出電極３５の他端を基板３ａから露出させる。これにより、検出電極３５の一端３５ａの間隔よりも他端３５ｂの間隔を大きくした、末広がりの検出電極３５を有する電極形成板３４を製造できる。

また、上述した第１実施形態から第４実施形態においては、駆動電極８ａ，８ｂ及び参照電極８ｃを設けた構成を適用したが、本発明はこれに限らない。検出電極の一端でサンプル溶液１０ａの検出対象分子が還元される電位を発生できれば、駆動電極８ａ，８ｂのみを設ける等、種々の構成としてもよい。

なお、上述した第１実施形態から第４実施形態については、それぞれ他の実施形態の構成を組み合わせた構成としてもよい。

１ 電気化学センサ
２ サンプル溶液保持部
３ 電極形成板
３ａ 基板
３ｂ 検出電極
４ 電気化学発光溶液保持部
１０ａ サンプル溶液
１０ｂ 電気化学発光溶液

Claims (14)

1. サンプル溶液を保持するサンプル溶液保持部と、
   電気化学発光溶液を保持する電気化学発光溶液保持部と、
   前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に配置された電極形成板と、
   を備え、
   前記電極形成板は、
   前記サンプル溶液と前記電気化学発光溶液とを仕切る基板と、
   前記基板にアレイ状に配置された複数の検出電極と、
   を備え、
   各前記検出電極は、
   前記基板の板厚方向を貫通しており、一端が前記サンプル溶液に接し、他端が前記電気化学発光溶液に接し、
   前記一端で前記サンプル溶液内の検出対象分子が還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる、
   電気化学センサ。
2. 前記電気化学発光溶液内に配置された各前記検出電極の前記他端を撮像する撮像部を備える、請求項１に記載の電気化学センサ。
3. 前記検出対象分子の濃度と発光強度との関係を表した検量線を予め記憶しており、前記撮像部により取得した撮像画像から前記発光強度を特定し、前記検量線に基づいて前記サンプル溶液内の前記検出対象分子の濃度を解析する解析部を備える、請求項２に記載の電気化学センサ。
4. 前記撮像部により時系列に取得した複数の撮像画像に基づいて、発光状態の時間的な変化を提示する提示部を備える、請求項２又は３に記載の電気化学センサ。
5. 前記基板には板厚方向に貫通する貫通孔がアレイ状に形成されており、前記検出電極が前記貫通孔を埋めている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
6. 前記電気化学発光溶液保持部には、前記電気化学発光溶液内で前記検出電極との間で自己誘発レドックスサイクルを発現させる還元用電極又は酸化用電極を備える、請求項１〜５のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
7. 前記サンプル溶液保持部には、前記サンプル溶液内で前記検出電極との間で自己誘発レドックスサイクルを発現させる酸化用電極又は還元用電極を備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
8. 前記検出対象分子は、前記サンプル溶液内の酸化反応又は還元反応に基づいて得られ、
   前記サンプル溶液保持部には、前記サンプル溶液内で酸化反応又は還元反応を起こさせる酸化用電極又は還元用電極を備え、
   各前記検出電極は、
   前記酸化用電極による酸化又は還元により得られた、前記サンプル溶液内の前記検出対象分子が、前記一端で還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
9. 前記サンプル溶液には測定物質を含み、
   前記サンプル溶液内には、前記測定物質と反応して過酸化水素を発生させる酵素を含んだ酵素層が設けられており、
   前記サンプル溶液内で起こる前記測定物質と前記酵素との反応で発生した前記過酸化水素を前記検出対象分子とし、各前記検出電極の前記一端で前記サンプル溶液内の前記検出対象分子が還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
10. 前記測定物質は、グルタミン酸及び乳酸のうち少なくともいずれか一方であり、
    前記酵素層として、
    前記サンプル溶液内の前記グルタミン酸と反応して前記過酸化水素を発生させるグルタミン酸反応酵素層と、
    前記サンプル溶液内の前記乳酸と反応して前記過酸化水素を発生させる乳酸反応酵素層と、のうち少なくともいずれか一方を有する、請求項９に記載の電気化学センサ。
11. 前記電極形成板と前記酵素層との間に、電子伝達メディエータ層を設けた、請求項９又は１０に記載の電気化学センサ。
12. 前記検出電極は、前記サンプル溶液に接する前記一端の接触面積が、前記電気化学発光溶液に接する前記他端の接触面積よりも大きい、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
13. 前記電極形成板は、前記基板の所定位置を中心にして、前記検出電極の軸方向が前記サンプル溶液から前記電気化学発光溶液に向かって末広がりに延びている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の電気化学センサ。
14. サンプル溶液を保持するサンプル溶液保持部と、電気化学発光溶液を保持する電気化学発光溶液保持部と、を準備する準備工程と、
    電極形成板を作製する電極形成板作製工程と、
    前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に前記電極形成板を設ける設置工程と、
    を備えており、
    前記電極形成板作製工程は、
    板厚方向に貫通する貫通孔を基板に対してアレイ状に形成する貫通孔形成工程と、
    導電性部材を前記貫通孔に埋めることで検出電極を形成する検出電極形成工程と、
    を備え、
    前記設置工程は、
    前記検出電極の一端が前記サンプル溶液に接し、前記検出電極の他端が前記電気化学発光溶液に接するように、前記電極形成板を前記サンプル溶液保持部及び前記電気化学発光溶液保持部の間に設け、
    前記一端で前記サンプル溶液内の検出対象分子が還元又は酸化されることによって、前記他端で前記電気化学発光溶液内の発光物質を酸化又は還元させて発光させる電気化学センサを製造する、
    電気化学センサの製造方法。