JP6751384B2 - 充填されたクロマトグラフィカラムの平衡化のための方法および装置 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、液体クロマトグラフィに関し、より具体的には、高圧を用いて液体をクロマトグラフィカラムに通すフラッシュクロマトグラフィに関する。

背景
高圧クロマトグラフィ（high pressure chromatography：ＨＰＬＣ）とは、加圧された液体を用いて、固定相として知られている好適な粒子媒体で充填されたクロマトグラフィカラムに試料を通す周知のクロマトグラフィモードである。フラッシュクロマトグラフィは、高速の用途を可能にするためにより大きな粒子が用いられ、典型的な粒径が２０〜６０μｍの広範囲にわたるという点において、分取ＨＰＬＣとは異なる。カラムは、ガラス、石英またはステンレス鋼などのさまざまな材料でできた比較的単純な管またはシリンジであってもよい。媒体が残ることを防止するために各端部に設けられるカラムまたはフリットを構築するために、事前に充填されたカラムでは高分子材料が頻繁に用いられるようになっている。

クロマトグラフィ分離を実行する前に、カラムの充填の間中ずっと均一な条件が保証されるべきである。これは、通常、溶媒または緩衝剤などの好適な移動相をカラムに通すことによって提供され、このプロセスは、充填されたカラムの平衡化または調整として知られている。フラッシュクロマトグラフィは、主に高速の用途で用いられるので、平衡化ステップは、例えば移動相のわずかなカラム体積および／または高流量を利用することによって、可及的速やかに有利に実行される。

グリベル等（In J Chromatogr A 2010 Jan 22; 1217(4):459-72：「揮発性（質量分析法適合）緩衝剤を用いた超高圧液体クロマトグラフィによる薬剤の分離の際に勾配平衡時間を最小化するための好適な動作条件の選択（Selection of suitable operating conditions to minimize the gradient equilibration time in the separation of drugs by Ultra-High-Pressure Liquid Chromatography with volatile (mass spectrometry-compatible) buffers）」）は、逆相クロマトグラフィに関するものである。より具体的には、この論文では、問題がフラッシュクロマトグラフィにおける長い平衡時間に関連していることが認識され、温度変化、さまざまな流量、および平衡化に用いられる移動相へのさまざまな添加剤の調査が紹介されている。保持力のばらつきおよび特定の平衡化添加剤に関して特定の結論を引き出しているが、平衡化を左右する機構は非常に複雑なままであり、さらなる研究が必要であることも著者によって結論付けられている。

ＵＳ６，６０１，４３９（「液体クロマトグラフィ測定および液体クロマトグラフィ装置における基線不安定性を減少させる方法（Method of reducing baseline instabilities in liquid chromatography measurements and liquid chromatography apparatus）」）は、高性能クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）および基線変動によって関連付けられる問題に関し、具体的にはアミノ官能化固定相に関連する不安定性に関する。′４３９号特許には、固定相への水の吸着の変動から生じる基線変動がどのようにして温度変動に関連することが分かったかが記載されている。本特許によれば、当該問題は、高い熱容量および熱伝導性を有するさらなる固体物体または液体浴槽をカラムに連結して機器を密閉することによって低減される。

発明の概要
本発明は、クロマトグラフィカラムの平衡化に関し、具体的には流量を増加させたときに生じる問題に関する。例えば、大きな利用可能表面積を示す多孔性粒子充填剤の平衡化の間に、平衡化に関わる発熱反応によって発生する熱がクロマトグラフィカラムのポリエチレンフリットを損なう恐れがあることが分かった。

本発明者等は、一般にカラム充填剤の平衡化に関わる発熱反応中に発生する熱を管理および／または制御し、それによって充填剤またはカラムの完全性にいかなるマイナスの影響も与えることなく高流量を利用できる方法を発見した。

したがって、本発明は、例えばフラッシュクロマトグラフィにおいて総試料処理時間の高速化を可能にする新たな知見に関する。これは、勾配平衡ステップにおいて溶媒の組み合わせを用いることによって達成されることができる。

第１の局面において、本発明は、クロマトグラフィカラムを平衡化するための方法に関し、上記方法は、（ｉ）充填されたクロマトグラフィカラムを設けるステップと、（ｉｉ）加圧された移動相を上記カラムに通すステップとを備え、移動相は、少なくとも２つの液体を組み合わせることによって得られ、少なくとも２つの液体の比率は、移動相がカラムに通されるときに変更される。

一実施形態において、上記少なくとも２つの液体の変更は、移動相がカラムを通過するときに移動相において線形勾配を提供するために、一方の液体の比率を増加させることと他方の液体の比率を減少させることとを組み合わせることによって達成される。

一実施形態において、液体のうちの少なくとも１つは、酢酸エチルおよび／またはヘキサンなどの有機溶媒である。

一実施形態において、本方法で使用されるカラムは、シリカなどの無機材料で充填される。

有利な実施形態において、移動相は、５０〜２００ｍｌ／分の範囲内の流量で本発明に係るカラムに通される。

有利な実施形態において、移動相が利用可能な充填剤の表面積は、少なくとも５００ｍ^２／ｇ乾燥重量である。

しかし、当業者が理解するように、本発明の要点は、例えばカラムのフリットを損傷する熱によって引き起こされる機器に対する好ましくない影響のリスクがある場合にイソクラティック平衡ではなく勾配を使用するというものである。このような影響は、例えば上記の例以外の（ｉ）露出表面積と（ｉｉ）流量との他の組み合わせで現れる可能性があり、この場合にも本発明が適用されてもよい。別の表現で言うと、本発明は、発生した熱を制御してそれを許容可能な閾値未満に維持するために勾配平衡を使用するための方法である。

一実施形態において、本方法で使用されるカラムおよび／またはカラムフリットは、ポリプロピレンなどの高分子材料でできている。代替的な実施形態において、フリットは、ポリエチレンでできている。

第２の局面において、本発明は、充填されたクロマトグラフィカラムの平衡化の間に発生する熱を制御する方法に関し、平衡勾配を定義するためのパラメータとして、カラムのサイズおよび材料、ならびに移動相が利用可能な充填剤表面積が使用される。

有利な実施形態において、充填されたクロマトグラフィカラムは、フラッシュクロマトグラフィカラムである。

第３の局面において、本発明は、本発明に係る方法を実行するコンピュータプログラムに関する。

第４の局面において、本発明は、少なくとも１つの充填されたクロマトグラフィカラムと、試料および試薬のための容器と、容器とカラムとの間に１つ以上の液体を通過させるための管とを備えるクロマトグラフィシステムに関する。したがって、本発明に係るシステムは、より詳細に上記され、以下の詳細な説明に記載される本発明に係る方法を用いて、発生する熱を制御することができる。

一実施形態において、本発明に係るシステムは、クロマトグラフィカラム内の試料の他の成分から分離された１つ以上の標的物質の分析のための機器、好ましくは質量検出器などの質量検出（mass detection：ＭＳ）のための機器をさらに備える。代替的な実施形態において、検出器は、ＥＬＳＤまたはＵＶ検出器である。上記システムは、有利に自動化されてもよい。

本発明のさらなる実施形態、本発明の実施形態および実施例の組み合わせは、以下の詳細な説明から明らかであろう。

定義
本明細書で使用される「平衡化」という用語は、例えばカラム出口で測定されるｐＨ、伝導性およびＵＶが、適用された緩衝剤のそれぞれの値と同一である時点を達成するプロセスのためにこの分野で従来から使用されているものと同様である。

２５ｍｌ／分のデフォルト流量での、５０：５０ｖ／ｖヘプタン：酢酸エチル（％）、１％負荷、三成分混合物におけるＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ２５ｇカートリッジ（バイオタージ社）のイソクラティック平衡を示す。 ２００ｍｌ／分の流量での、５０％酢酸エチル％、１％負荷、三成分混合物におけるＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ２５ｇカートリッジ（バイオタージ社）を再び用いた、実施例１に記載されている本発明に係る勾配平衡を示す。 ５０ｍｌ／分のデフォルト流量での、５０：５０ｖ／ｖヘプタン：酢酸エチル％、１％負荷、三成分混合物におけるＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ５０ｇ（バイオタージ社）のイソクラティック平衡を示す。平衡時間は、８．０５分であった。 ２００ｍｌ／分の流量での、５０％酢酸エチル％、１％負荷、三成分混合物におけるＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ５０ｇ（バイオタージ社）を再び用いた、実施例１に記載されている本発明に係る勾配平衡を示す。

発明の詳細な説明
本発明の第１の局面において、クロマトグラフィカラムを平衡化するための方法が提供され、上記方法は、（ｉ）充填されたクロマトグラフィカラムを設けるステップと、（ｉｉ）加圧された移動相を上記カラムに通すステップとを備え、移動相は、少なくとも２つの液体を組み合わせることによって得られ、少なくとも２つの液体の比率は、移動相がカラムに通されるときに変更される。

有利な実施形態において、上記少なくとも２つの液体の変更は、移動相がカラムを通過するときに移動相において線形勾配を提供するために、一方の液体の比率を増加させることと他方の液体の比率を減少させることとを組み合わせることによって達成される。本発明者等は、より好ましい高流量でさえ許容可能な熱生成を維持するように線形勾配を調節できることを発見し、当該熱生成は、勾配がなければ、高分子材料でできたフリットなどのハードウェアの要素を損なったり、破壊または劣化させたりすることさえあるであろう。

移動相の勾配を提供するための機器および方法は、溶出ステップに商業的に利用でき、試薬容器、ポンプおよび管などの構成要素は、本発明に係る平衡勾配を提供するために当業者によって容易にセットアップおよび調節されることができる。

当業者によって理解されるように、移動相は、精製対象の試料の標的物質、使用されるクロマトグラフィ充填剤、充填剤に対する標的物質の吸着モードなどによって組成が異なる可能性があり、少なくともその後の分離に使用されるであろう濃度範囲にわたってさまざまな溶媒成分が混和性である任意のマルチ溶媒系を含み得る。一実施形態において、使用される液体は、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエンおよびヘキサンからなる群から選択される溶媒である。当業者によって理解されるように、ほとんどの場合、好適な二元液体系は満足のいく結果を提供することが見込まれるが、本発明に係る方法は、３つ以上の液体を含むように適合されてもよい。何個の液体が移動相に組み込まれるかにかかわらず、移動相を形成するために使用される液体の相対濃度は、実行される平衡化によって発生する熱が、使用されるハードウェアに対するマイナスの影響に達する値を上回らないことを確実にするように選択されるべきである。

したがって、一実施形態において、液体のうちの少なくとも１つは、酢酸エチルおよび／またはヘキサンなどの有機溶媒である。有利な実施形態において、平衡化は、酢酸エチルなどの第１の液体が０％およびヘキサンなどの第２の液体が１００％で開始される。次いで、用いられる試料の溶媒組成と同等の組成に達するまで、対応するヘキサン比率の減少に伴って、移動相において酢酸エチル比率が増加される。当該増加は、段階的であってもよく、または線形であってもよく、有利な実施形態では、勾配は線形である。

上記のように、本発明は、勾配を使用しなければ熱生成により充填剤および／またはハードウェアを損傷するであろう平衡化の間に流量を利用することを可能にする。したがって、一実施形態において、移動相は、５０〜１００ｍｌ／分の範囲内の流量などの２００ｍｌ／分までの流量でカラムに通される。当業者は、単純な試験によって最高流量または最適な流量を決定することが容易にできるであろう。

本発明に係るクロマトグラフィカラムは、時には吸着材料と表わされる任意の一般に使用されているクロマトグラフィ媒体で充填されてもよい。フラッシュクロマトグラフィのための典型的なカラムは、約１〜２０ｃｍの直径を有するカートリッジであってもよい。有利な実施形態において、カラムは、シリカ、シリカゲル、アルミナまたは珪藻土などの無機媒体で充填される。例えばフラッシュクロマトグラフィのためのシリカ充填カートリッジは、例えばバイオタージ社から市販されている。

本方法の一実施形態において、移動相が利用可能な充填剤の表面積は、少なくとも５００ｍ^２／ｇ（乾燥重量）である。好適な充填剤の一例は、ＫＰ−Ｓｉｌ（バイオタージ社）であり、これは、５００ｍ^２／ｇの標準的な表面積を有する不規則なシリカである。特定の実施形態において、移動相が利用可能な表面積は、７００〜８００ｍ^２／ｇの範囲内など、少なくとも７００ｍ^２／ｇである。本発明に係る方法とともに有利に使用されるクロマトグラフィ媒体の例示的な例は、７００ｍ^２／ｇの表面積を有するバイオタージ社のＳＮＡＰ ＵＬＴＲＡフラッシュカートリッジの充填剤である。

使用されるカラムおよび他のハードウェアは、基準値を超えて温度を上昇させると特定の熱感度を示す高分子材料などの任意の一般に使用されている材料からなっていてもよい。したがって、一実施形態において、カラムおよび／またはカラムフリットは、ポリプロピレンまたはポリエチレンなどの高分子材料でできており、少なくとも１つの要素は、限定された熱感度を有する材料でできている。使用されるカラムは、しばしば、バイオタージ社のＳＮＡＰ ＵＬＴＲＡなどのシリカ粒子で事前に充填されたカートリッジである。

本発明の第２の局面において、充填されたクロマトグラフィカラムの平衡化の間に発生する過剰な熱を制御および／または回避するための方法が提供される。本方法では、所期の平衡化に好適な液体勾配を定義するためのパラメータとして、カラムのサイズおよび材料、ならびに充填剤の粒径および利用可能な表面積が使用される。本方法を使用することによって、充填剤および／またはハードウェアにおいて予め定められた温度を超えることなく平衡化プロセスにおいて可能な限り効率的な流量を可能にする流量が決定される。したがって、本発明のこの局面は、高速平衡化を可能にすることにより特定のクロマトグラフィプロセスの総処理時間を減少させる最適なまたは最も好適な処理条件を設計するために使用され得る。

本発明の第３の局面において、本発明に係る方法を実行することができるコンピュータプログラムが提供される。

第４の局面において、本発明は、少なくとも１つの充填されたクロマトグラフィカラムと、試料および試薬のための容器と、容器とカラムとの間に１つ以上の液体を通過させるための管とを備えるクロマトグラフィシステムを提供し、上記システムは、平衡化の間に起こる発熱反応によって発生する熱を制御することができる。本システムは、本発明の第１の局面に係る方法とともに有利に使用される。

一実施形態において、本発明に係るシステムは、クロマトグラフィカラム内の試料の他の成分から分離された１つ以上の標的物質の分析のための機器、好ましくは質量検出器などの質量検出（ＭＳ）のための機器をさらに備える。代替的な実施形態において、検出器は、ＵＶ／ＶＩＳ検出器、炎イオン化検出器、赤外線検出器、またはフラッシュクロマトグラフィと組み合わせるのに適したその他の検出器である。当該システムは、有利に自動化されてもよい。一実施形態において、本発明に係るシステムは、フラッシュ実行から適切な量の材料を質量検出器に提供することによってインテリジェントサンプリングを可能にするフラッシュクロマトグラフィシステムである。

一実施形態において、当該システムは、さまざまなタイプまたはサイズのカートリッジが使用されるときにフラッシュ流量を変化させるように自動的に調節する。本発明に係る最適化された平衡化のおかげで、このようなシステムは、精製用試料のより高速な分離を提供する。

実験
本実施例は、例示の目的でのみ提供されており、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。以下または本願のその他の箇所に含まれる引例は全て、引用によって本明細書に含まれる。

材料および方法
ＳＮＡＰ／ＺＩＰ勾配平衡およびＰＤ０１７０ Ｉｓｏｌｅｒａ高性能アップグレードを以下で使用した。以下で使用される「ＣＶ」という略語は、クロマトグラフィの分野で広く使用されているように「カラム体積」を表わす。

実施例の目的は、（デフォルトよりも大きな）高流量で酢酸エチルを３０％および５０％含むイソクラティック移動相を使用する際に、１０ｇ〜３４０ｇのフォーマット範囲内のＳＮＡＰ ｕｌｔｒａカラムおよび５ｇ〜１２０ｇのフォーマット範囲内のＺＩＰ Ｓｐｈｅｒｅカラムを平衡化するときの「水和熱」の影響を打ち消す手段として勾配平衡を利用することの実現可能性を判断することであった。

実験
・標準的なＳＮＡＰおよびＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ３４０ｇ、１００ｇ、５０ｇ、２５ｇおよび１０ｇカラム（バイオタージ社）において評価を行った。

・ＺＩＰおよびＺＩＰ Ｓｐｈｅｒｅフォーマット１０ｇ、３０ｇ、４５ｇ、８０ｇ、１２０ｇ
・流量参照のための全てのフォーマットについての最大流量データ
上昇させた流量で、各構成をヘプタン：酢酸エチル７０：３０ｖ／ｖおよび５０：５０移動相の最終的な溶媒組み合わせに平衡化した。

結果：実現可能性
各々の選択されたカラム範囲上に３〜５ＣＶのＣＶ平衡化範囲を包含するように全ての評価を構築した。

勾配１
Ａ：ヘプタン Ｂ：酢酸エチル％ ＣＶ
Ａ：Ｂ−１０：３０ ２
３０を保持 ２
勾配２
Ａ：ヘプタン Ｂ：酢酸エチル％ ＣＶ
Ａ：Ｂ−１０：３０ ２．５
３０を保持 ２
勾配３
Ａ：ヘプタン Ｂ：酢酸エチル％ ＣＶ
１０ １
１０〜５０ ２
５０を保持 ２
流量表は、全てが利用可能な標準サイズのＺＩＰ、ＳＮＡＰ、ＺＩＰ Ｓｐｈｅｒｅ、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａを更新する。未修正のデフォルト平衡化指針および３４０ｇサイズに基づいて、７％の標準的な酢酸エチル濃度を使用する。

・各フォーマットについてＮ＝５。平均化された結果。
・流量は、徐々に最大まで増加した。流れは、各フォーマットタイプについての安全な登録された圧力限界を少し下回った。最大流も処理システム、この場合、Ｉｓｏｌｅｒａ処理システム２００ｍｌ／分によって要求された。

・各最大流について登録された背圧

本発明に係る勾配平衡の進展は、全てのフォーマットが高流量で高酢酸エチル濃度を利用する場合に遭遇する強力な水和熱を除去するために勾配を使用することを示すいくつかの先駆的評価に基づいていた。

実施例１−本発明に係る平衡化
本発明に係る平衡化に使用される勾配は、５０％酢酸エチル濃度：
１０〜１０％ １ＣＶ、
１０〜５０％ ２ＣＶ、
５０％を保持 ２ＣＶ、であった。

以下の表１から、平衡化のための体積が平衡時間を増大させたのに対してイソクラティックが約７５％減少したにもかかわらず、本発明に係る勾配が、５０％酢酸エチルで、定められた最大流量で全てのフォーマットの調整を可能にすると結論付けることができる。

また、当該表は、バイオタージ社のＩｓｏｌｅｒａシステムを用いてフォーマットのデフォルト流量を用いてより低い％の酢酸エチル（７％）で同一のフォーマットを調整するために要する時間を比較している。通常のイソクラティック条件下では５０％酢酸エチルで水和熱が最悪になるであろうという理由から、より低い％のイソクラティック平衡データが比較として用いられた。使用された流量は、達成可能な最大流量および各フォーマットについて以前に定められた安全な流量であった。なぜなら、これは、最悪の場合のシナリオ、すなわち平衡化のための最高流および非常に高い酢酸エチル濃度に相当するからである。

実施例２−比較
本実施例の目的は、７０／３０ヘプタン／ＥｔＯＡｃを用いてデフォルト流量でカラムを調整することに対する影響を調査することであった。

ＳＮＡＰ ＵＬＴＲＡ Ｎ＝５カラムを試験；１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、１００ｇおよび３４０ｇ
１０ｇ−デフォルト流量：１２ｍｌ／分
２５ｇ−デフォルト流量：２５ｍｌ／分
５０ｇ−デフォルト流量：５０ｍｌ／分
１００ｇ−デフォルト流量：５０ｍｌ／分
３４０ｇ−デフォルト流量：１００ｍｌ／分
結果を以下の表に示す。

本実施例は、先行技術の平衡化方法のフリット溶融の問題を浮き彫りにする。この実験では、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ３４０ｇカラムは、デフォルトの低流量（１００ｍｌ／分）では調整されることができないので懸念の主な原因であった。ここで、本発明は、より高い流量でカラムが成功裏に平衡化され得ることを示し、これは、先行技術では１０％以下の酢酸エチルなどのより低い酢酸エチル濃度でのみ可能であり、発熱およびフリット軟化のために高流量では不可能であった。

したがって、本発明に係る平衡化のための勾配の使用は、５０ｇまでのカラムではこのデフォルトの三倍までの平衡を含む流量の増加を可能にし、（３４０ｇを含む）５０ｇよりも大きなカラムではデフォルトの二倍までの平衡を含む流量の増加を可能にする。

Claims (6)

1. 充填されたクロマトグラフィカラムの平衡化の間に発生する熱を制御する方法であって、移動相における溶媒組成の比率は、移動相が前記カラムに通されるときに変更され、それによって予め定められた温度を超えることなく最適な流量が提供される、方法。
2. 前記充填されたクロマトグラフィカラムは、フラッシュクロマトグラフィカラムである、請求項１に記載の方法。
3. 自動化された請求項１または２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実行するコンピュータプログラム。
5. 少なくとも１つの充填されたクロマトグラフィカラムと、試料および試薬のための容器と、容器とカラムとの間に１つ以上の液体を通過させるための管とを備えるクロマトグラフィシステムであって、前記システムは、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いて熱を制御することができる、システム。
6. 前記クロマトグラフィカラム内の試料の他の成分から分離された１つ以上の標的物質の分析のための機器、好ましくは質量検出のための機器を備える、請求項５に記載のシステム。