JP6728120B2

JP6728120B2 - 新規なバクテリオファージ

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Publication number: JP6728120B2
Application number: JP2017212477A
Authority: JP
Inventors: ジア，イン
Original assignee: アルマタ・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CA2890450A1; CN104039955A; WO2013068743A1; AU2012335397B2; WO2013068743A9; US9623058B2; JP2014533943A; EP2776559B1; EP3569701A1; AU2012335397A8; GB201119167D0; EP2776559A1; US20140322174A1; CA2890450C; AU2012335397A1; JP2018068297A; AU2017248464A1

Description

本発明は、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列の１つまたは複数の、選択される領域内に、１つまたは複数の突然変異を含む、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ突然変異体、細菌性感染症の治療における前記バクテリオファージの使用、前記バクテリオファージを含む医薬組成物、および前記バクテリオファージを含む組成物を使用して、細菌性感染症を治療するための方法に関する。

近年、ペニシリンまたはテトラサイクリンなどのような、化学物質ベースの抗生物質の形態をした抗菌剤の広範囲の使用は、抗生物質抵抗性の細菌株の、莫大な増加に至った。抗生物質抵抗性を与える突然変異またはペニシリナーゼなどのような抗生物質抵抗性酵素をコードする遺伝子は、世界中の病原細菌においてますます一般的になっている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）細菌は、たとえば、病院での他の原因のための手術の間にもたらされることが多い感染症のますます一般的になっている形態である。ＭＲＳＡ感染症は、従来の抗生物質を使用して治療するのが非常に困難である。

抗生物質による細菌性感染症の治療の代替の、あるアプローチは、バクテリオファージとして知られているウイルスに細菌を感染させることである。そのような「バクテリオファージ療法」は、２０世紀の初めに最初に開発されたが、１９４０年代の抗生物質の出現の後、西洋においてめったに使用されなかった。

バクテリオファージは、ある細菌細胞型に対して特異的である。それらは、重要な細胞内機構および細胞表面構成成分における差異のために、より複雑な生物の細胞に感染することができない。ほとんどのバクテリオファージは、尾部繊維などのような構造を有し、これは、それらが、それらの標的細菌の表面上の特異的な分子に対して結合するのを可能にする。バクテリオファージ頭部内に通常包まれるウイルスのＤＮＡまたはいくつかのバクテリオファージにおけるＲＮＡは、次いで、通常、尾部を通して、宿主細胞に導入される。偏性溶菌性ファージ（ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙｔｉｃｐｈａｇｅ）の場合には、導入されたウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡは、次に、宿主細胞の細胞内メカニズムを使用して、バクテリオファージの子孫の産生を指示する。宿主細胞は、細胞周期の終わりに、溶菌によって死滅する。

ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫは、多様なミオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科バクテリオファージファミリーのメンバーである。Ｏ’ＦｌａｈｅｒｔｙＳ．ｅｔａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００４），１８６（９）２８６２−２８７１）による論文は、１１８個の推定上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持つ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）性ファージＫのＤＮＡゲノムの配列について記載する。ファージＫは、以前に、抗ＭＲＳＡファージとして特徴付けられた。Ｏ’ＦｌａｈｅｒｔｙＳ．ｅｔａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５），７１（４）１８３６−１８４２）は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な薬剤抵抗性株に対し、ファージＫについて研究した。

国際公開第２００９／０４４１６３号パンフレットは、細菌において外因性溶菌を誘発するのに十分に高度な濃度でファージＫおよび／またはファージＰ６８を含む抗菌組成物を記載する。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）は、とりわけ病気の、高齢の、または免疫不全の患者において、全身性の感染症または膿瘍および潰瘍を引き起こし得る。それは、ますます、病院における死亡の主な原因または一因となっている。ＭＲＳＡは、いかなる明らかな疾患症状をも伴わない医者または訪問者の鼻腔中に存在し得る。しかしながら、細菌は、患者を含めて、人から人に広がり得る。したがって、細菌を死滅させることは、疾病の予防を促進する。

病院は、現在、ＭＲＳＡが伝染するのを予防するのを助けるために、アルコール性手洗い洗剤を利用している。しかしながら、そのようなアルコール性洗剤は、鼻腔の敏感な内壁または皮膚の損傷エリアに対する使用に適していないことが多い。そのため、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、特にＭＲＳＡなどのような細菌を死滅させるのに適した組成物を産生する必要性がある。

本発明の目的は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株、特にＭＲＳＡに対して有効な抗菌活性をもたらす代替のバクテリオファージを提供することである。

本発明の第１の態様によれば、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）のヌクレオチド配列に対応する、１つまたは複数の以下の
ａ）ＯＲＦ１８およびＯＲＦ１９の間の領域；ならびに／または
ｂ）ＯＲＦ４１およびＯＲＦ４２の間の領域；ならびに／または
ｃ）ＯＲＦ６８；ならびに／または
ｄ）ＯＲＦ８６／８８／９０内のオーバーラップ領域；ならびに／または
ｅ）ＯＲＦ９２；ならびに／または
ｆ）ＯＲＦ９３；ならびに／または
ｇ）ＯＲＦ９６；ならびに／または
ｈ）ＯＲＦ１００から選択される領域内に、１つまたは複数の突然変異を含むブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ突然変異体が、提供される。

本発明のさらなる態様によれば、細菌性感染症の治療において使用するための、本明細書において定義されるバクテリオファージが、提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書において定義されるバクテリオファージおよびその薬学的に許容できるキャリヤを含む医薬組成物が、提供される。

本発明のさらなる態様によれば、細菌性感染症を治療するための方法であって、感染した表面に、本明細書において定義される組成物を適用するステップを含む方法が、提供される。

図１は、実施例２における４つのファージのＤＮＡ配列の比較を示す図である（ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ、「Ｆｒｅｄ」、「Ｆｒｅｄ＊」、および「Ｆｒｅｄ＊７１０」）。図２は、バクテリオファージ「Ｆｒｅｄ」の配列決定されたＤＮＡにおいて同定されたオープンリーディングフレームを示す図である。角括弧中の番号は、等価なブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫＯＲＦを示す。

「ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ」に対する本明細書における言及は、Ｏ’ＦｌａｈｅｒｔｙＳ．ｅｔａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００４），１８６（９）２８６２−２８７１）において記載されるように、十分に特徴付けられたタイプのバクテリオファージを指す。そのような言及は、「ブドウ球菌性（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫ」または「ファージＫ」などのような、等価な用語を含む。ファージＫは、広い範囲のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）性株に対して活性を有することが見つけられたバクテリオファージである。

驚いたことに、ファージＫ誘導体の発生により、より広範な範囲の殺菌作用をもたらすことができる、野生体ファージＫゲノムに対する特定の突然変異が明らかにされたことが分かった。そのため、本発明のファージ突然変異体は、所定の細菌の種内のより広い範囲の細菌株を治療するために、単一のタイプのバクテリオファージしか使用しないという利点を提供する。

「突然変異体」に対する本明細書における言及は、野生型バクテリオファージに対して異なる遺伝子型を有するバクテリオファージを指す。そのような突然変異体はまた、表現型の差異をも、もたらし得る。

「突然変異」に対する本明細書における言及は、ゲノム配列における変化を指す。ＤＮＡ配列は、点突然変異、挿入、欠失、および重複を通してなどのように、様々な方法で変化し得る。ある塩基が他のものに置換される場合、点突然変異が起こる。たとえば、トランジション点突然変異は、プリン塩基が、異なるプリン塩基に置換される（つまり、アデニン（Ａ）が、グアニン（Ｇ）に置換されるもしくは逆もまた同様）またはピリミジン塩基が、異なるピリミジン塩基に置換される（つまり、チミン（Ｔ）が、シトシン（Ｃ）に置換されるもしくは逆もまた同様）場合のものである。他の実施例において、トランスバージョン点突然変異は、Ａが、ＴもしくはＣに置換される、Ｇが、ＴもしくはＣに置換される、Ｔが、ＡもしくはＧに置換される、またはＣが、ＡまたはＧに置換されるなどのように、プリンが、ピリミジンに置換される場合のものであるまたは逆もまた同様である。

突然変異は、自然に引き起こされ得るまたはたとえば化学物質、放射線、もしくはウイルス感染症によって誘発され得る。突然変異を誘発するための１つの方法は、ヒドロキシルアミンなどのような、突然変異誘発性の化学薬品の使用によるものである。

「ＯＲＦ」または「オープンリーディングフレーム」に対する、本明細書における言及は、同じリーディングフレームにおける、開始コドンおよび終止コドンの間のヌクレオチド配列の部分を指す。終止コドンは、翻訳を止めるためのシグナルとして作用する、ヌクレオチドの三つ組である。これは、ＤＮＡヌクレオチド配列「ＴＧＡ」、「ＴＧＧ」、および「ＴＡＧ」を含む。ファージＫは、１１８個の推定上のＯＲＦを有することが同定された。

一実施形態において、突然変異が、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列のＯＲＦ９６内に起こる。ＯＲＦ９６は、推定上の主な尾部タンパク質をコードすることが、ファージＫにおいて同定された。

さらなる実施形態において、突然変異が、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列のＣ１０５９７５Ｔ点突然変異である。

本明細書の点突然変異が、以下のアノテーションにより言及されることが認められるであろう（野生型ファージＫゲノムにおける塩基）（位置）（ファージＫ突然変異体における塩基）。たとえば、Ｃ１０５９７５Ｔは、位置１０５９７５の、野生型ファージＫゲノムにおけるシトシン塩基が、ファージＫ突然変異体において、チミン塩基と置換されたことを説明する。この突然変異は、バリン残基と置換されるアラニンをもたらす。

さらなる実施形態において、バクテリオファージが、そのうえ、１つまたは複数の以下の点突然変異を含む：野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列のＣ１８５５４Ｔ、Ｇ４０８９４Ａ、Ｇ７８１９７Ａ、Ｇ９９３８８Ｃ、Ｇ１０２１１１Ａ、Ｔ１０３７２０Ｃ、および／またはＡ１０９３２９Ｇ。

Ｃ１８５５４Ｔ突然変異は、ＯＲＦ１８およびＯＲＦ１９の間の領域内に起こり、その結果、バリンが、メチオニン残基に置換される。Ｇ４０８９４Ａ突然変異は、ＯＲＦ４１およびＯＲＦ４２の間の領域内に起こり、アミノ酸変化は、予測されない。Ｇ７８１９７Ａ突然変異は、ＯＲＦ６８内に起こり、アルギニン残基に置換されるグリシンをもたらす。Ｇ９９３８８Ｃ突然変異は、ＯＲＦ８６、ＯＲＦ８８、およびＯＲＦ９０がオーバーラップする領域内に起こり、アミノ酸変化は、予測されない。Ｇ１０２１１１Ａ突然変異は、ＯＲＦ９２内に起こり、アルギニン残基に置換されるグリシンをもたらす。Ｔ１０３７２０Ｃ突然変異は、ＯＲＦ９３内に起こり、サイレント置換をもたらす。最後に、Ａ１０９３２９Ｇは、ＯＲＦ１００内に起こり、グルタミン酸残基に置換されるリシンをもたらす。

一実施形態において、バクテリオファージが、１つまたは複数の以下の点突然変異を含む：野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列のＣ１８５５４Ｔ、Ｇ４０８９４Ａ、Ｇ７８１９７Ａ、Ｇ９９３８８Ｃ、Ｇ１０２１１１Ａ、Ｔ１０３７２０Ｃ、Ｃ１０５９７５Ｔ、およびＡ１０９３２９Ｇ。したがって、バクテリオファージは、任意の組み合わせの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのこれらの突然変異を含む。好ましい実施形態において、バクテリオファージが、以下の点突然変異を含む：野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列のＣ１８５５４Ｔ、Ｇ４０８９４Ａ、Ｇ７８１９７Ａ、Ｇ９９３８８Ｃ、Ｇ１０２１１１Ａ、Ｔ１０３７２０Ｃ、Ｃ１０５９７５Ｔ、およびＡ１０９３２９Ｇ。

一実施形態において、バクテリオファージが、そのうえ、ヌクレオチド配列内にさらなる突然変異を含む。そのような「さらなる突然変異」は、様々なタイプの突然変異、たとえば点突然変異、欠失、重複、または挿入のいずれかを含む。

一実施形態において、さらなる突然変異が、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列の位置１１６１１１に挿入を含む。

「挿入」に対する本明細書における言及は、１つまたは複数の余剰のヌクレオチド塩基が、ヌクレオチド配列の中に追加される、遺伝子の突然変異を指す。少なくとも１つのヌクレオチドのセグメントは、長さが少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または少なくとも９０００塩基などのようなヌクレオチド配列の中に追加することができる。

一実施形態において、挿入は、長さが少なくとも９０００塩基対である。さらなる実施形態において、挿入は、長さが９５４７塩基対である。

本発明のさらなる態様によれば、受入番号：ＮＣＩＭＢ４１８９４の下で委託されたバクテリオファージが、提供される（受入番号ＮＣＩＭＢ４１８９３の適したブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）宿主細胞と一緒に、２０１１年１１月３日にブダペスト条約の下で委託された、本明細書でＦｒｅｄ＊７１０として記載される黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ファージＫ＊７１０）。

本発明のさらなる態様によれば、細菌性感染症の治療において使用するためのバクテリオファージが、提供される。

バクテリオファージは、それらが自己複製し、死滅させるプロセスの本質的な部分としての、複製するその能力によって、単一のバクテリオファージだけで、何百万もの宿主細菌の集団を死滅させ得るので、細菌性感染症治療として使用するのに特に有利である。バクテリオファージは、細菌を死滅させることによって、バクテリオファージが、個体または環境から細菌を排除するまで、単純にそれら自体を複製する。バクテリオファージは、感染症が存在する限り、増加し、発生し続ける。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書において記載されるバクテリオファージおよびその薬学的に許容できるキャリヤを含む医薬組成物が、提供される。

本発明の医薬組成物は、当業者らによく知られているおよび／または市販で入手可能である手順に従って、作製されてもよい。医薬組成物は、ローション、クリーム、軟膏、パスタ、ゲル、気泡、または吸入剤の形態をしていてもよい。そのような形態は、局所外用薬に特に適している。

一実施形態において、医薬組成物が、Ｐ６８などのような補足的なバクテリオファージを含む。バクテリオファージＫおよびＰ６８のそのような組み合わせを含む医薬組成物は、国際公開第２００９／０４４１６３号パンフレットにおいて記載される手順に従って、調製されてもよい。

さらなる実施形態において、医薬組成物が、局所外用薬である。

「局所外用薬」に対する本明細書における言及は、体表面に適用することができる医薬を指す。ＭＲＳＡなどのような多くの細菌性感染症は、皮膚を介して人から人に伝染し、そのため、皮膚などのような体表面に適用することができる医薬の形態をした医薬組成物を得ることは、有利である。

局所外用薬は、物質が配置される皮膚のエリアにそれらが接着するので、特に有利である製剤を形成するために厚くしてもよく、したがって、局所的な高濃度のファージが特定のエリアに導入されるのを可能にする。製剤はまた、１つまたは複数の以下のもの：水、保存剤、活性な界面活性剤、乳化剤、酸化防止剤、または溶剤を含んでいてもよい。

一実施形態において、局所外用薬が、哺乳動物の鼻腔に対する外用薬を含む。

ＭＲＳＡなどのような、ある細菌性感染症は、鼻腔内の粘膜表面上に棲んでいることが分かった。病院によって現在使用されているアルコール性洗剤は、鼻腔の敏感な内壁または皮膚の損傷エリア上での使用に適していないことが多い。そのため、鼻腔に適用するための局所外用薬の形態をした医薬組成物を得ることは、有利である。

パラフィンおよびラノリンベースのクリームは、当技術分野においてよく知られており、鼻腔に対する産物の適用に特に有用である。ポリマーシックナーなどのような他のシックナーもまた、使用されてもよい。

医薬組成物におけるファージＫの使用は、補足的な利点を持つ。ファージＫは、細菌細胞壁中に含有される、大量のテイコ酸を介してグラム陽性細菌を認識し、結合する。ファージＫに対して抵抗性である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）突然変異体が、リビトールテイコ酸を欠くことは、１９７０年代以来、知られている（ＳｈａｗＤ．Ｒ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７０）２４５（１９）５１０１−５１０６）。細菌が鼻の細胞などのような上皮細胞に対して付着するためにテイコ酸が必要であるので、壁のテイコ酸の欠如は、上皮細胞との相互作用を低下させることが分かった（ＷｅｉｄｅｎｍａｉｅｒＣ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＭｅｄｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００８）２９８，５０５−５１３）。よって、テイコ酸が存在する場合、ファージＫは、細菌に結合するはずである。しかしながら、細菌が、細胞壁中のテイコ酸を低下させることによって、ファージＫに対して抵抗性となるように突然変異する場合、これにより、細菌が、鼻の細胞に結合する能力を低下し、そのため、ファージＫによる治療の後に残るあらゆる細菌のビルレンスを低下させるのを促進するはずである（Ｘｉａ，Ｇｕｏｑｉｎｇｅｔａｌ，ＷａｌｌＴｅｉｃｈｏｉｃＡｃｉｄ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＳｉｐｈｏｖｉｒｕｓａｎｄＭｙｏｖｉｒｕｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９３（１５），ｐ４００６−４００９，Ａｕｇｕｓｔ２０１１）。

一実施形態において、医薬組成物が、本明細書において記載されるように、細菌ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の病原体であるバクテリオファージを含む。

「病原体」に対する、本明細書における言及は、バクテリオファージが、結合し、感染することができる特定の細菌を示す。ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）は、抗生物質抵抗性を有する株を発生させた、そのため、本発明のバクテリオファージを使用することによってなどのように、抗生物質代替物によりこれらの感染症を治療する必要性がある。

ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属は、特徴的な「ブドウ状の」クラスターを形成するグラム陽性細菌を包含する。

さらなる実施形態において、バクテリオファージが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の病原体である。

さらなる実施形態において、バクテリオファージが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の病原体である。ＭＲＳＡは、メチシリンおよび他の関連する抗生物質に対して抵抗性になった黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の株である。ＭＲＳＡによる感染症は、患者が感染症に対して特に脆弱である病院およびナーシングホームにおける特定の関心事である。抗生物質の使用を制限し、抗生物質抵抗性の株の発生の抑制を支援することが医療システムの至る所で推奨されており、本発明のバクテリオファージの使用による治療は、適した代替物を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、細菌性感染症を治療するための方法であって、感染した表面に、本明細書において記載される組成物を適用するステップを含む方法が、提供される。

一実施形態において、表面が、哺乳動物の皮膚である。さらなる実施形態において、表面が、たとえば、哺乳動物の鼻腔または口腔内の粘膜または内壁である。

本発明の好ましい実施形態は、ここで、以下の実施例に関連して、単に例として記載する。

実施例１：新規なバクテリオファージの特徴づけ
ａ）Ｒｏｃｈｅ４５４ＦＬＸライブラリー調製物および３つのファージＤＮＡの配列決定
以下の３つのファージＤＮＡサンプルを、特徴づけのための研究において使用した：
「Ｆｒｅｄ」は、野生体ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫから誘導した；
「Ｆｒｅｄ＊」は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫが無効性であった株上で繁殖することができた自然突然変異体の選択によって、「Ｆｒｅｄ」から誘導した；および
「Ｆｒｅｄ＊７１０」は、「Ｆｒｅｄ＊」が無効性であった株上で繁殖するその能力によって、「Ｆｒｅｄ＊」から誘導した。

それぞれのファージについての約１０μｇのＤＮＡを得て、アルコール中に沈殿させた。

４５４ＦＬＸ配列決定のためのライブラリー生成を、メーカーの標準的なプロトコールに従って実行した（Ｒｏｃｈｅ／４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ０６４０５、ＵＳＡ）。たとえば、高分子ファージＤＮＡを、噴霧によって、サイズが４００ｂｐ〜９００ｂｐの範囲にわたるフラグメントに、無作為に剪断した。これらのフラグメントの末端部を落とし（ｅｎｄｐｏｌｉｓｈ）、エマルションＰＣＲおよび配列決定に必要とされる、それぞれのＭＩＤ（マルチプレックス識別子）を有する４５４ＡおよびＢアダプターを、ライゲーションによってフラグメントの末端部に追加した。次いで、結果として生じるフラグメントライブラリーの濃度を、蛍光測定法によって測定し、等量で混合し、Ｒｏｃｈｅ／４５４Ｔｉｔａｎｉｕｍｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して、ＧＳＦＬＸで、１／８ピコタイタープレート（ＰＴＰ）上で配列決定した。３４９．２９ヌクレオチドの平均リード長を有する合計１０５７７３の配列リード、合計３６．９Ｍｂの配列データが、得られた。

ｂ）配列のアセンブリー
次いで、個々のファージの配列リードは、デフォルト設定で、Ｒｏｃｈｅ／４５４Ｎｅｗｂｌｅｒソフトウェアを使用して、ソートし、アセンブルした（４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｆｔｗａｒｅｒｅｌｅａｓｅ２．３（０９１０２７＿１４５９））。

Ｎｅｗｂｌｅｒアセンブリーの結果を、表１に記載する。

上記に言及するものからのアセンブリーにおけるリード数の差異は、主として、短いリードおよび明確に同定することができず、よって、アセンブリーに含むことができなかったものから結果として生じる。不均一なリード分布は、非常に低い絶対濃度の決定における、方法論的な不正確さを反映する。

ｃ）Ｆｒｅｄ＊におけるギャップ閉鎖および仕上げ
個々の配列のギャップ閉鎖、編集、および比較のために、３つのファージのアセンブリーを、ＳｔａｄｅｎＰａｃｋａｇｅｓｕｉｔｅｏｆｓｏｆｔｗａｒｅに移した（ＳｔａｄｅｎＰａｃｋａｇｅ１−７−１ｂ，Ｇａｐｖ．４．１１、ＳｔａｄｅｎＲ，ＢｅａｌＫＦ，ＢｏｎｆｉｅｌｄＪＫ（２０００）“ＴｈｅＳｔａｄｅｎｐａｃｋａｇｅ，１９９８”，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１１５−１３０）。

ギャップを閉鎖し、まばらに配列決定されたストレッチのカバー度を増加させるために、合計１９２のサンガーリードを、Ｆｒｅｄ＊Ｎｅｗｂｌｅｒアセンブリーに追加した。これにより、平均カバー度が約７倍〜約１０倍に上がった（比較のために、Ｎｅｗｂｌｅｒアセンブリーの後に、Ｆｒｅｄにおけるカバー度は、２５倍となり、Ｆｒｅｄ＊７１０では１８９倍となった）。

ｄ）ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫ（受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）に対する３つのファージの編集および比較
アセンブリーは、手作業で検査し、それらがすべて、公開されるファージＫ配列と、順序正しく、同じポイントで始まるように整列させた。次いで、完成した配列は、ファージＫ配列に対しておよび互いに、個々にアライメントし、比較した。３つのＦｒｅｄのファージはすべて、ファージＫ中に存在しない９５４７ｂｐの挿入を伴う。挿入は、ファージＫ配列の位置１１６１１１で始まる。そのうえ、８つの点突然変異が、Ｆｒｅｄ＊７１０において同定された。これらの配列は、Ｆｒｅｄ＊が、Ｆｒｅｄと同一であることを示唆する。しかしながら、ファージゲノムの末端リピート配列は、決定することができなかった。比較の結果を、図１および表２に要約する。

ｅ）ＰＣＲによる点突然変異および挿入の存在についての立証
３つのＦｒｅｄファージにおける、同定された塩基置換についての存在および挿入についての実在を検証するために、プライマーは、問題となっている位置にわたるＰＣＲ産物を生成するために設計した（プライマー配列については、表３を参照されたい）。ＰＣＲ産物は、それぞれのファージＤＮＡから生成し、従来のサンガー技術によって配列決定し、また、結果として生じる配列は、ファージ配列に対してアライメントし、比較した。Ｆｒｅｄ＊７１０における８つの置換はすべて、確認され、また、他の置換は、ＰＣＲ産物において見つけられなかった。挿入の境界のそれぞれにわたるＰＣＲ産物は、３つのＦｒｅｄファージすべてについて得られ、３つのケースすべてにおける挿入の実在を示し、６つのそれぞれのＰＣＲ産物についてのサンガー配列決定によって、確認した。

ｆ）アノテーション
ＦｒｅｄおよびＦｒｅｄ＊７１０配列におけるオープンリーディングフレームは、ＧｅｎｅＭａｒｋソフトウェアを使用して同定した（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｎ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／）。それゆえ、個々のリーディングフレームを、それぞれ、ＢＬＡＳＴを使用して、ＮＣＢＩｇｅｎｂａｎｋに対して実行し、さらに、最高得点のマッチは、それぞれのＯＲＦのものであった。ほとんどの配列が、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＫと同一であるので、ほとんどのアノテーションは、ファージＫに一致する。次いで、アノテーションの結果は、ＣＬＣＢｉｏＳｅｑｕｅｎｃｅｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｃｂｉｏ．ｃｏｍ／）を使用して視覚化することができるｇｅｎｂａｎｋファイルを編集するために使用した。図２は、Ｆｒｅｄにおいて同定されたＯＲＦを示す。

Claims

野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）のヌクレオチド配列中のＣ１８５５４Ｔ、Ｇ４０８９４Ａ、Ｇ７８１９７Ａ、Ｇ９９３８８Ｃ、Ｇ１０２１１１Ａ、Ｔ１０３７２０Ｃ、Ｃ１０５９７５ＴおよびＡ１０９３２９Ｇに対応する点変異を含むブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ突然変異体。
請求項１に記載のバクテリオファージＫ突然変異体において、野生型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＫ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ１７６３２７．１）の対応するヌクレオチド配列の位置１１６１１１での挿入をさらに含むことを特徴とするバクテリオファージＫ突然変異体。
請求項２に記載のバクテリオファージＫ突然変異体において、前記挿入が、長さが少なくとも９０００塩基対である、または、前記挿入が、長さが９５４７塩基対であることを特徴とするバクテリオファージＫ突然変異体。
請求項１に記載のバクテリオファージＫ突然変異体において、受入番号：ＮＣＩＭＢ４１８９４の下で委託されたことを特徴とするバクテリオファージＫ突然変異体。
請求項１乃至４の何れか一項に記載のバクテリオファージＫ突然変異体において、細菌性感染症の治療において使用することを特徴とするバクテリオファージＫ突然変異体。
請求項１乃至４の何れか一項に記載のバクテリオファージＫ突然変異体およびその薬学的に許容できるキャリヤを含むことを特徴とする医薬組成物。
請求項６に記載の医薬組成物において、補足的なバクテリオファージを含むことを特徴とする医薬組成物。
請求項７に記載の医薬組成物において、前記補足的なバクテリオファージが、Ｐ６８であることを特徴とする医薬組成物。
請求項６乃至８の何れか一項に記載の医薬組成物において、局所外用薬であることを特徴とする医薬組成物。
請求項９に記載の医薬組成物において、前記局所外用薬が、哺乳動物の鼻腔に対する外用薬を含むことを特徴とする医薬組成物。
請求項６乃至１０の何れか一項に記載の医薬組成物において、前記バクテリオファージが、細菌ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の病原体であることを特徴とする医薬組成物。
細菌性感染症を治療するための方法に用いるための請求項６乃至１１の何れか一項に記載の医薬組成物であって、前記方法が、感染表面に前記医薬組成物を適用するステップを含むことを特徴とする医薬組成物。
請求項１２に記載の医薬組成物において、前記表面が、哺乳動物の皮膚または粘膜内壁、例えば鼻腔であることを特徴とする医薬組成物。