JP6716241B2 - Method for detecting IgG antibody against periodontal pathogen - Google Patents
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Description
本発明は、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting IgG antibody against periodontal pathogens.
歯周病は、歯周病原菌が歯周組織に感染することによって発症する炎症性疾患である。一般に、歯周病の診断は、歯周ポケット検査、触診・出血検査、動揺度検査、Ｘ線写真検査等の結果を総合して行われているが、これらの検査手法は歯科医師等の経験・技能等に基づいて行われるため、検査結果及び診断結果に差異が生じる可能性があり、客観性に欠くという問題がある。そのため、客観的に歯周病の診断を行う手法の開発が望まれている。 Periodontal disease is an inflammatory disease that develops when periodontal pathogens infect periodontal tissues. Generally, periodontal disease is diagnosed by integrating the results of periodontal pocket examination, palpation/bleeding examination, mobility test, X-ray examination, etc.・Because it is performed based on skill, there is a possibility that the test result and the diagnosis result may be different, and there is a problem of lack of objectivity. Therefore, development of a method for objectively diagnosing periodontal disease is desired.
客観的に歯周病の診断を行う手法としては、例えば、歯周病原菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を歯周病の感染度又は重篤度の指標とする方法が報告されている（非特許文献１参照）。当該非特許文献１では、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）等の歯周病原菌抗原に対する血清中のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果、歯周病の治療後において治療前よりもＩｇＧ抗体価が減少することが報告されている。 As a method for objectively diagnosing periodontal disease, for example, a method in which an IgG antibody titer in serum against periodontal pathogens is used as an index of infection degree or severity of periodontal disease has been reported (non-patent document). Reference 1). In the non-patent document 1, IgG antibody titers in serum against periodontal pathogen antigens such as Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia are measured by an ELISA method, resulting in periodontal disease. It has been reported that the IgG antibody titer after treatment is lower than that before treatment.
しかしながら、上記非特許文献１で用いられたＥＬＩＳＡ法は、抗原の固定化、血清中のＩｇＧ抗体との一次抗体反応、及び抗ヒトＩｇＧ抗体との二次抗体反応の一連の操作を手作業で行う必要があるため、高コストかつ操作が煩雑であり、被検体から採取した血清等の生体試料について自動化された機器等により高速処理を行うことが難しいという問題がある。 However, the ELISA method used in Non-Patent Document 1 above involves manually performing a series of operations for immobilizing an antigen, a primary antibody reaction with an IgG antibody in serum, and a secondary antibody reaction with an anti-human IgG antibody. Since it needs to be performed, there is a problem that the cost is high and the operation is complicated, and it is difficult to perform high-speed processing on a biological sample such as serum collected from a subject by an automated device or the like.
このような問題点を解決するために、本発明者らは、これまでに、歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能な画期的な手法を開発している。本発明者らが開発した手法では、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離された特定の１次構造を有するポリペプチド又はその改変ポリペプチド（歯周病原菌抗原ポリペプチド）を用いることにより、多様な免疫型を有する広範囲の患者の歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能となる（特許文献１及び２参照）。 In order to solve such a problem, the present inventors have so far been able to examine periodontal disease with high accuracy and perform high-speed processing with an automated device or the like. We are developing a term method. According to the method developed by the present inventors, a polypeptide having a specific primary structure isolated from Porphyromonas gingivalis, which is a periodontal pathogen, or a modified polypeptide thereof (a periodontal pathogen antigen polypeptide) is used. ), it is possible to test periodontal disease of a wide range of patients having various immunotypes with high accuracy, and it is possible to perform high-speed processing by an automated device or the like (Patent Document 1 and 2).
本発明は上記した従来技術の現状及び問題点に鑑みてなされたものであり、自動化された機器等による高速処理が可能で、かつ簡便な操作により、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができる新規な方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional state of the art and problems, and enables high-speed processing by an automated device or the like, and is capable of detecting IgG antibodies against periodontal pathogens by a simple operation. The purpose is to provide a new method that can.
本発明者らは、上記した課題を解決すべく鋭意検討を重ねる中で、特開２０１０−０４４０８３号公報において提案されている手法を応用することにより、さらなる高速化を図ることができ、かつより簡便な操作により歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができるのではないかという着想を得るに至った。なお、当該特開２０１０−０４４０８３号公報では、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体などの測定対象物質と、抗原（アレルゲン）などの当該測定対象物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にビオチンなどのリガンドが結合された結合体と、酵素標識された抗ヒトＩｇＥ抗体などの酵素標識された第二の生理活性物質とを特定の条件下で接触させることによりこれらの複合体を形成した後、当該複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体などのリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタに滴下し、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する方法が提案されている。 The inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and by applying the method proposed in Japanese Patent Laid-Open No. 2010-044083, further speedup can be achieved, and more We came to the idea that IgG antibodies against periodontal pathogens could be detected by a simple operation. In addition, in the said Unexamined-Japanese-Patent No. 2010-044083, a measurement target substance, such as an allergen-specific IgE antibody, and a bioactive substance, such as biotin, as a 1st physiologically active substance specifically couple|bonded with the said measurement target substance, such as an antigen (allergen). After forming the complex by contacting the conjugate bound with the ligand and the enzyme-labeled second physiologically active substance such as the enzyme-labeled anti-human IgE antibody under specific conditions, A method has been proposed in which a solution containing the complex is dropped on a porous filter to which a ligand capture agent such as an anti-biotin antibody is bound, and the activity of the enzyme bound to the porous filter is measured.
本発明者らは、上記特開２０１０−０４４０８３号公報に記載の方法を応用し、健常者又は歯周病患者から採取した血清と、ビオチンが結合された歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体とを接触させることによりこれらの複合体を形成した後、当該複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体などのリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタに滴下し、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定したところ、健常者と歯周病患者との間で測定結果に明確な差が見られないという問題が生じることを見出した（下記参考例参照）。 The present inventors have applied the method described in JP 2010-044083 A, and have collected serum from a healthy person or a periodontal disease patient, a periodontopathic bacterium antigen polypeptide bound with biotin, and an enzyme label. These complexes are formed by contacting the prepared anti-human IgG antibody, and then a solution containing the complex is dropped on a porous filter to which a ligand capture agent such as an anti-biotin antibody is bound to form a porous filter. When the activity of the enzyme bound to was measured, it was found that there was a problem that there was no clear difference in the measurement results between healthy subjects and periodontitis patients (see Reference Example below).
本発明者らは、上記した問題点を解決すべく、さらに鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えて、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いることにより、健常者と歯周病患者との間で測定結果に有意差が見られるようになることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらなる研究を重ねることにより本発明を完成させるに至った。 As a result of further intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have surprisingly replaced the enzyme-labeled anti-human IgG antibody with an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. It was found that a significant difference can be seen in the measurement results between healthy subjects and periodontitis patients by using. The present inventors have completed the present invention by conducting further research based on such findings.
即ち、本発明は、代表的には以下の項に記載の主題を包含する。 That is, the present invention typically includes the subject matter described in the following sections.
項１．
被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法であって、
（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、
（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに
（３）酵素活性を測定する工程、
を含み、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが同一又は異なって配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
項２．
前記生体試料が、血液、唾液、又は歯肉溝滲出液である、上記項１に記載の方法。
項３．
前記歯周病原菌がポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である、上記項１又は２に記載の方法。
項４．
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０〜８．０である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬であって、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、試薬。
項６．
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０〜８．０である、上記項５に記載の試薬。
項７．
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬であって、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、試薬。
項８．
上記項５又は６に記載の試薬、及び上記項７に記載の試薬を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キット。
Item 1.
A method for detecting IgG antibodies against periodontal pathogens contained in a biological sample collected from a subject, comprising:
(1) By mixing a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, the living body A step of preparing a complex comprising an IgG antibody against periodontal pathogen contained in a sample, the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide,
(2) a step of contacting a solution containing the complex with a porous carrier carrying an anti-biotin antibody, and (3) a step of measuring enzyme activity,
Including,
The periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide are the same or different, and thus SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of A method that is a peptide.
Item 2.
Item 2. The method according to Item 1, wherein the biological sample is blood, saliva, or gingival crevicular fluid.
Item 3.
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the periodontal pathogen is Porphyromonas gingivalis.
Item 4.
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the pH of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is 6.0 to 8.0.
Item 5.
A reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogen, comprising a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, wherein the periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 A reagent which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from
Item 6.
Item 6. The reagent according to Item 5, wherein the pH of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is 6.0 to 8.0.
Item 7.
A reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogen, comprising a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, wherein the periodontal pathogen antigen polypeptide in the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is SEQ ID NO: 1 From the group consisting of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24. A reagent, which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected.
Item 8.
A kit for detecting an IgG antibody against periodontal pathogens, which comprises the reagent according to item 5 or 6 and the reagent according to item 7.
本発明の方法によれば、簡便な操作により、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができる。また、本発明の方法は、自動化された機器等による高速処理が可能である。さらに、本発明の方法によれば、歯周病の診断を行うにあたって、客観的なデータを提供することが可能となる。 According to the method of the present invention, an IgG antibody against periodontal pathogens can be detected by a simple operation. Further, the method of the present invention enables high-speed processing by an automated device or the like. Furthermore, according to the method of the present invention, it becomes possible to provide objective data when diagnosing periodontal disease.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法に関する。なお、以下において、本発明の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法を単に「本発明の方法」と記載する場合がある。 The present invention relates to a method for detecting IgG antibody against periodontal pathogens. In the following, the method for detecting IgG antibody against periodontal pathogens of the present invention may be simply referred to as the “method of the present invention”.
本発明の方法では、被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する。即ち、被検体から採取した生体試料を対象物とする。 In the method of the present invention, an IgG antibody against periodontal pathogens contained in a biological sample collected from a subject is detected. That is, the biological sample collected from the subject is the object.
被検体としては、ヒトのみならず、歯周病原菌の感染が起こり得る生体であれば特に制限されず、非ヒト哺乳動物であってもよい。被検体となるヒトとしては特に制限されず、健常者であるか、歯周病に罹患したヒト（歯周病患者）であるかを問わず、また、歯周病の罹患が疑われるヒトであってもよい。また、非ヒト哺乳動物としては、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が好ましい。例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。 The subject is not limited to a human, and is not particularly limited as long as it is a living body in which infection of periodontopathic bacteria can occur, and may be a non-human mammal. There are no particular restrictions on the human subject, regardless of whether it is a healthy person or a person suffering from periodontal disease (a patient with periodontal disease), and a person suspected of having periodontal disease. It may be. As the non-human mammal, mammals bred as pets, livestock, experimental animals, etc. are preferable. Examples thereof include dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, rabbits, mice, rats, camels, and llamas.
生体試料としては、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を含み得る試料であって、かつ上記した被検体から採取可能な試料であれば特に制限されない。採取の容易さ、取扱い易さ等の観点からは、生体試料としては、血液、唾液、又は歯肉溝滲出液が好ましい。血液を生体試料として用いる場合には、血漿又は血清が特に好ましい。被検体から生体試料を採取する方法としては特に制限されず、常法に従って行えばよい。また、被検体から採取した生体試料は、そのまま、後述する被検体から採取した生体試料を含む溶液として用いてもよいし、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して後述する被検体から採取した生体試料を含む溶液として用いてもよいし、また、被検体から採取した生体試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは後述する適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。さらに、血漿を生体試料として用いる場合には、ろ紙や血漿分離機等により分離された血漿であってもよい。なお、被検体から採取した生体試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。 The biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that can contain an IgG antibody against periodontal pathogens and can be collected from the subject. From the viewpoints of easy collection, easy handling, and the like, blood, saliva, or gingival crevicular fluid is preferable as the biological sample. Plasma or serum is particularly preferred when blood is used as the biological sample. The method for collecting the biological sample from the subject is not particularly limited, and may be performed according to a conventional method. Further, the biological sample collected from the subject may be used as it is as a solution containing the biological sample collected from the subject to be described later, or after being stored by freeze-drying or the like, the freeze-dried product may be used as described below. It may be used as a solution containing a biological sample collected from a subject described later by dissolving it in a solvent, or the biological sample collected from the subject may be frozen and stored as it is, or dissolved in an appropriate solvent described below. It may be frozen and stored by, for example, and then thawed before use. Furthermore, when plasma is used as the biological sample, it may be plasma separated by a filter paper or a plasma separator. The method, conditions, etc. for storing the biological sample collected from the subject are not particularly limited, and the method can be performed according to a conventional method.
本発明の方法は、（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに（３）酵素活性を測定する工程を含む。なお、以下において、上記（１）〜（３）の工程を、それぞれ「工程（１）」、「工程（２）」、及び「工程（３）」と記載する場合がある。 The method of the present invention comprises (1) mixing a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. Thereby preparing a complex comprising an IgG antibody against periodontal pathogens contained in the biological sample, the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. , (2) a step of bringing a solution containing the complex into contact with a porous carrier carrying an anti-biotin antibody, and (3) a step of measuring enzyme activity. In the following, the steps (1) to (3) may be referred to as “step (1)”, “step (2)”, and “step (3)”, respectively.
工程（１）では、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合する。 In the step (1), a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide are mixed.
被検体から採取した生体試料を含む溶液は、被検体から採取した生体試料そのものであってもよいし、被検体から採取した後、適当な溶媒に溶解させたものであってもよいし、また、被検体から採取した後、凍結乾燥等して保存してある生体試料を適当な溶媒に溶解させたものであってもよい。溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。 The solution containing the biological sample collected from the subject may be the biological sample itself collected from the subject, or may be dissolved in a suitable solvent after being collected from the subject, or Alternatively, a biological sample stored by freeze-drying or the like after being collected from the subject may be dissolved in an appropriate solvent. Examples of the solvent include physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, Good Buffer, and the like. These solvents include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood proteins or plant proteins as active ingredients, blood components of normal animals such as mouse, rabbit, goat, fetal bovine, etc., normal human serum components, etc. The protein component stabilizer, various preservatives, surfactants and the like may be included. Further, these solvents may contain an activator for an enzyme such as a salt of a metal such as zinc or magnesium.
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドは、後述する歯周病源菌抗原ポリペプチドに酵素が結合されたものである。酵素としては、後述する工程（３）において酵素活性を測定可能なものであれば特に制限されず、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。なお、歯周病原菌抗原ポリペプチドに酵素を結合させる方法としては、特に制限されず、常法によって行えばよい。 The enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide contained in the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is an enzyme bound to the periodontal pathogen antigen polypeptide described below. The enzyme is not particularly limited as long as the enzyme activity can be measured in the step (3) described later, and examples thereof include alkaline phosphatase (ALP), horseradish-derived peroxidase (HRP), β-D-galactosidase, and the like. To be The method for binding the enzyme to the periodontopathic bacterium antigen polypeptide is not particularly limited and may be a conventional method.
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。 The periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is a polypeptide isolated from Porphyromonas gingivalis which is a periodontal pathogen, or a modified polypeptide thereof. Specifically, SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. , 23 and 24, which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of: Among these, poly having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14. A peptide is preferable, a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 is more preferable, and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is particularly preferable.
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液の溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。なお、下記の実施例２において記載するように、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液は、当該溶液のｐＨ条件により、保存日数が経過するにつれて試薬ブランクの発光値が上昇する傾向がある。試薬ブランクの発光値が大幅に上昇すると、生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することが困難となる。そのため、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨは、６．０〜８．０程度の範囲とすることが好ましく、６．５〜７．５程度の範囲とすることがより好ましい。 Examples of the solvent of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide include physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, Good Buffer and the like. These solvents include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood proteins or plant proteins as active ingredients, blood components of normal animals such as mouse, rabbit, goat, fetal bovine and normal human serum components. The protein component stabilizer, various preservatives, surfactants and the like may be included. Further, these solvents may contain an activator for an enzyme such as a salt of a metal such as zinc or magnesium. As described in Example 2 below, the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide has a tendency that the luminescence value of the reagent blank increases as the number of storage days elapses depending on the pH condition of the solution. There is. If the luminescence value of the reagent blank increases significantly, it becomes difficult to detect IgG antibody against periodontal pathogens contained in the biological sample. Therefore, the pH of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is preferably in the range of about 6.0 to 8.0, and more preferably in the range of about 6.5 to 7.5. preferable.
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液に含まれるビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドは、歯周病源菌抗原ポリペプチドにビオチンが結合されたものである。歯周病原菌抗原ポリペプチドにビオチンを結合させる方法としては、特に制限されず、常法によって行えばよい。 The biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide contained in the solution containing the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is the periodontitis pathogen antigen polypeptide bound with biotin. The method for binding biotin to the periodontopathic bacterium antigen polypeptide is not particularly limited and may be carried out by a conventional method.
また、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、上記した酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。なお、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドとは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。 Further, the periodontopathogenic antigen antigen polypeptide in the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is similar to the periodontopathogenic antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide described above, Porphyromonas gingivalis ( Porphyromonas gingivalis) or a modified polypeptide thereof. Specifically, SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. , 23 and 24, which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of: Among these, poly having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14. A peptide is preferable, a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 is more preferable, and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is particularly preferable. The periodontal pathogen antigen polypeptide in the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide may be the same or different. May be
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液の溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。 Examples of the solvent of the solution containing the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide include physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, Good Buffer, and the like. These solvents include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood proteins or plant proteins as active ingredients, blood components of normal animals such as mouse, rabbit, goat, fetal bovine, etc., normal human serum components, etc. The protein component stabilizer, various preservatives, surfactants and the like may be included. Further, these solvents may contain an activator for an enzyme such as a salt of a metal such as zinc or magnesium.
上記した、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合する方法及び条件については特に制限されない。例えば、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合し、４〜５０℃の条件下、好ましくは２５℃から４５℃の条件下、さらに好ましくは３５℃から４２℃の条件下で１０秒〜３０分程度、好ましくは１分〜１５分程度、撹拌あるいは静置する方法などが挙げられる。 Regarding the method and conditions for mixing the above-mentioned solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. There is no particular limitation. For example, a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide are mixed and mixed at 4 to 50° C. Under conditions of preferably 25°C to 45°C, more preferably 35°C to 42°C for about 10 seconds to 30 minutes, preferably about 1 minute to 15 minutes, a method of stirring or leaving still, etc. Can be mentioned.
被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、抗原−抗体反応が起こる結果、生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体が形成される。具体的には、抗原−抗体反応により、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体とが結合し、かつビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体とが結合することにより、当該複合体が形成される。 By mixing a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, the antigen-antibody reaction is As a result, a complex composed of an IgG antibody against periodontal pathogen contained in the biological sample, an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is formed. Specifically, by the antigen-antibody reaction, the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the IgG antibody against the periodontal pathogen contained in the biological sample are bound, and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is labeled. And the IgG antibody against periodontal pathogens contained in the biological sample bind to each other to form the complex.
工程（２）では、上記工程（１）で調製した複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる。 In the step (2), the solution containing the complex prepared in the step (1) is brought into contact with the porous carrier supporting the anti-biotin antibody.
抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体は、多孔質担体に抗ビオチン抗体が固定化されたものである。多孔質担体としては、特に制限されず、無機化合物、ガラス、ポリエチレン等の高分子化合物、セルロース、セルロース誘導体等の多糖類などを材質とする繊維、膜などを用いることができる。中でも、ガラス繊維は、非特異的なタンパク質の吸着が少ないことから好ましい。 The anti-biotin antibody-supported porous carrier is obtained by immobilizing the anti-biotin antibody on the porous carrier. The porous carrier is not particularly limited, and it is possible to use fibers, membranes and the like made of inorganic compounds, polymer compounds such as glass and polyethylene, and polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives. Among them, glass fibers are preferable because they have less non-specific protein adsorption.
多孔質担体に抗ビオチン抗体を担持（固定化）する方法としては、特に制限されず、例えば、多孔質担体としてガラス繊維を用いる場合には、特開２０１０−０４４０８３号公報に記載の方法を適用することができる。具体的に、当該特開２０１０−０４４０８３号公報には、物理的固定化方法として、ガラス繊維の上部から、湿潤用緩衝液、抗ビオチン抗体を含む溶液、ブロッキング溶液、及び安定化剤を含む溶液を添加し、凍結乾燥することにより、ガラス繊維に抗ビオチン抗体を固定化する方法が記載されており、また、化学的固定化方法として、ガラス繊維をアミノアルキルシラン−グルタルアルデヒドで処理し、上記の物理的固定化方法と同様にして各種溶液を添加した後、凍結乾燥することにより、ガラス繊維に抗ビオチン抗体を固定化する方法が記載されている。 The method for supporting (immobilizing) the anti-biotin antibody on the porous carrier is not particularly limited. For example, when glass fiber is used as the porous carrier, the method described in JP2010-044083A is applied. can do. Specifically, in Japanese Patent Laid-Open No. 2010-044083, as a physical immobilization method, a solution containing a wetting buffer solution, an anti-biotin antibody, a blocking solution, and a stabilizer is provided from the upper part of the glass fiber. And a method of immobilizing the anti-biotin antibody on the glass fiber by freeze-drying are described, and as a chemical immobilization method, the glass fiber is treated with aminoalkylsilane-glutaraldehyde, The method of immobilizing the anti-biotin antibody on the glass fiber by adding various solutions in the same manner as in the physical immobilization method and then freeze-drying is described.
また、多孔質担体に抗ビオチン抗体を担持（固定化）する場合、抗ビオチン抗体は多孔質担体に直接固定化されていてもよいし、抗ビオチン抗体に対する抗体などのスペーサーを介して抗ビオチン抗体が固定化されていてもよい。 When the anti-biotin antibody is carried (immobilized) on the porous carrier, the anti-biotin antibody may be directly immobilized on the porous carrier, or the anti-biotin antibody may be immobilized via a spacer such as an antibody against the anti-biotin antibody. May be immobilized.
上記工程（１）で調製した複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる方法としては、特に制限されないが、例えば、複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体の上部に添加又は滴下する方法が挙げられる。この場合、複合体を含む溶液が適切に多孔質担体を通過するようにするために、多孔質担体の下部に吸収体を備えた容器を用いることが好ましい。具体的には、特開２０１０−０４４０８３号公報に記載されているような、セルロースからなる吸収体を備えた容器が例示される。 The method of bringing the solution containing the complex prepared in the step (1) into contact with the anti-biotin antibody-supporting porous carrier is not particularly limited, but, for example, the solution containing the complex is loaded with the anti-biotin antibody. A method of adding or dripping to the upper part of the prepared porous carrier can be mentioned. In this case, in order to allow the solution containing the complex to properly pass through the porous carrier, it is preferable to use a container provided with an absorber below the porous carrier. Specifically, a container provided with an absorber made of cellulose as described in JP 2010-044083 A is exemplified.
また、複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる際の条件としては特に制限されないが、例えば、４〜５０℃の条件下、好ましくは２５℃から４５℃の条件下、さらに好ましくは３５℃から４２℃の条件下で、複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体の上部に添加又は滴下した後、５秒〜３０分程度、好ましくは１０秒〜１５分程度、さらに好ましくは３０秒〜５分程度静置する方法などが挙げられる。 The conditions for bringing the solution containing the complex into contact with the anti-biotin antibody-supporting porous carrier are not particularly limited, but are, for example, 4 to 50° C., preferably 25 to 45° C. Under conditions, more preferably from 35° C. to 42° C., after adding or dropping the solution containing the complex onto the upper part of the anti-biotin antibody-supporting porous carrier, about 5 seconds to 30 minutes, preferably The method of leaving still for about 10 seconds to 15 minutes, more preferably about 30 seconds to 5 minutes, and the like can be mentioned.
複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させることで、抗体抗原反応により、複合体におけるビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド部分のビオチンと多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体とが結合し、多孔質担体上に複合体を捕捉することができる。一方、複合体を含む溶液に含まれる複合体以外の含有成分は、抗原−抗体反応による抗ビオチン抗体との結合が起こらないため、多孔質担体を通過する。 By contacting the solution containing the complex with the porous carrier carrying the anti-biotin antibody, the antibody-antigen reaction causes biotin on the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide portion in the complex and the porous carrier on the porous carrier. It can bind to the carried anti-biotin antibody and capture the complex on the porous carrier. On the other hand, the contained components other than the complex contained in the complex-containing solution pass through the porous carrier because they do not bind to the anti-biotin antibody due to the antigen-antibody reaction.
また、複合体と多孔質担体に担持された抗ビオチン抗体との結合以外の非特異的な結合又は吸着等を抑制するために、上記工程（２）に先立って、多孔質担体に対してブロッキング処理を施すことが好ましい。ブロッキング処理において使用するブロッキング液としては特に制限されず、例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどのほか、血液タンパク質または植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などを含む溶液が挙げられる。 In addition, in order to suppress non-specific binding or adsorption other than the binding between the complex and the anti-biotin antibody supported on the porous carrier, the porous carrier is blocked before the step (2). It is preferable to apply a treatment. The blocking solution used in the blocking treatment is not particularly limited, and examples thereof include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin and the like, those containing blood protein or plant protein as an active ingredient, mouse, rabbit, goat, Examples include solutions containing blood components of normal animals such as fetal bovine and serum components of normal human.
さらに、多孔質担体に非特異的に結合又は吸着等した物質などを除去するために、上記工程（２）の後、後述する工程（３）に先立って、多孔質担体の洗浄処理を施すことが好ましい。当該洗浄処理において使用する洗浄液としては、測定対象物質に未結合の標識物を洗浄する機能を実用上保持するものであれば、特に限定されないが、例えば、特許第３８４９８２３号に記載のものなどが挙げられる。この洗浄液を工程（２）後の多孔質担体に２０〜３００μＬ、好ましくは１００〜２５０μＬ、さらに好ましくは１５０〜２２０μＬ程度を一回または複数回に分けて分注すればよい。 Furthermore, in order to remove substances or the like that are non-specifically bound or adsorbed to the porous carrier, a cleaning treatment of the porous carrier is performed after the above step (2) and before the step (3) described later. Is preferred. The washing liquid used in the washing treatment is not particularly limited as long as it practically retains the function of washing the unbound labeled substance to the substance to be measured, and examples thereof include those described in Japanese Patent No. 3894823. Can be mentioned. 20 to 300 μL, preferably 100 to 250 μL, more preferably about 150 to 220 μL may be dispensed into the porous carrier after the step (2) once or a plurality of times.
工程（３）では、酵素活性を測定する。具体的には、上記工程（２）により多孔質担体に担持された抗ビオチン抗体と結合した複合体における酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド部分の酵素の酵素活性を測定する。 In step (3), the enzyme activity is measured. Specifically, the enzyme activity of the enzyme of the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide part in the complex bound to the anti-biotin antibody supported on the porous carrier is measured in the above step (2).
酵素活性の測定方法としては、特に制限されず常法に従って行うことができる。検出に利用する酵素−基質系について、酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる系などが挙げられる。酵素活性の検出に用いる基質も特に限定されない。これらは、市販品であるＣＤＰ−ＳＴＡＲ、ＣＳＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ、ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ、ＡＴＴＯＧＬＯＷなどを用いることができる。基質を含む基質液の組成は、その機能を損ねない範囲であれば特に限定されない。例えば、酵素としてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる場合には、上記工程（２）の後、前記の基質、好ましくはＣＤＰ−ＳＴＡＲやＬｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ−５等を必要濃度に調整したものを１０〜１００μＬ、好ましくは、１５〜５０μＬ、さらに好ましくは２０μＬ〜４０μＬ程度、多孔質担体に分注すれば良い。 The method for measuring the enzyme activity is not particularly limited and can be performed according to a conventional method. Regarding the enzyme-substrate system used for detection, examples of the enzyme include a system using peroxidase or alkaline phosphatase (ALP). The substrate used for detecting the enzyme activity is also not particularly limited. As these, commercially available products such as CDP-STAR, CSPD, Lumigen PPD, Lumigen, APS-5, Lumigen Lumi-Phos, Galacton-Plus, and ATTOGLOW can be used. The composition of the substrate solution containing the substrate is not particularly limited as long as its function is not impaired. For example, when alkaline phosphatase (ALP) is used as an enzyme, after the step (2), 10 to 100 μL of the substrate, preferably CDP-STAR or Lumigen APS-5, which is adjusted to the required concentration, Preferably, 15 to 50 μL, more preferably about 20 μL to 40 μL, may be dispensed into the porous carrier.
上記工程（３）により得られる測定値は、被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体の量を反映している。上記非特許文献１にも記載されているように、通常、歯周病患者では体内の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体量が増加することから、上記工程（３）により得られる測定値に基づいて、生体試料が歯周病患者由来かあるいは健常者由来かを判定することができ、また、医師、歯科医師等は被検体が歯周病に罹患しているか否かを診断することができる。さらに、体内の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体量は、歯周病の重篤度に応じても増加することから、上記工程（３）により得られる測定値に基づいて、歯科医師等は被検体における歯周病の重篤度を判定又は診断することもできる。 The measurement value obtained in the step (3) reflects the amount of IgG antibody against periodontal pathogens contained in the biological sample collected from the subject. As described in Non-Patent Document 1, since the amount of IgG antibody against periodontal pathogens in the body is usually increased in periodontal disease patients, based on the measurement value obtained by the step (3), It is possible to determine whether the biological sample is derived from a periodontal disease patient or a healthy person, and a doctor, a dentist or the like can diagnose whether or not the subject has periodontal disease. Furthermore, since the amount of IgG antibody against periodontal pathogens in the body also increases depending on the severity of periodontal disease, based on the measurement value obtained in the above step (3), the dentist, etc. The severity of periodontal disease can also be determined or diagnosed.
また、本発明は、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬を包含する。 The present invention also provides a reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogens, which contains a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a periodontal pathogen containing a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. And a reagent for detecting IgG antibody against.
上記した各試薬に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、上記した歯周病原菌抗原ポリペプチドと同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。なお、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドとは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。 The periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide contained in each of the above-mentioned reagents is similar to the periodontal pathogen antigen polypeptide described above. A polypeptide isolated from Rhomonas gingivalis or a modified polypeptide thereof. Specifically, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. , 23 and 24, which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of: Among these, poly having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14. Peptides are preferred, those with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 are more preferred, and those with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 are particularly preferred. The periodontal pathogen antigen polypeptide in the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the periodontal pathogen in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide may be the same or different. May be
上記した各試薬に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液における溶媒としては、上記と同様である。具体的には、溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。 The solvent in the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the solution containing the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide contained in each reagent described above is the same as described above. Specifically, examples of the solvent include physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, Good Buffer and the like. These solvents include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood proteins or plant proteins as active ingredients, blood components of normal animals such as mouse, rabbit, goat, fetal bovine, etc., normal human serum components, etc. The protein component stabilizer, various preservatives, surfactants and the like may be included. Further, these solvents may contain an activator for an enzyme such as a salt of a metal such as zinc or magnesium.
上記した各試薬には、必要に応じてその他の成分が含まれていてもよい。その他の成分としては、例えば、各種防腐剤や界面活性剤などが挙げられる。 Other components may be contained in each of the above-mentioned reagents, if necessary. Examples of other components include various preservatives and surfactants.
さらに、本発明は、上記した酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬、及び上記したビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キットを包含する。 Furthermore, the present invention provides a reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogens, which contains a solution containing the above-described enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing the above-mentioned biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. A kit for detecting IgG antibodies against periodontal pathogens, which contains a reagent for detecting IgG antibodies against periodontal pathogens, is included.
当該キットには、上記した試薬の他、必要に応じてその他の試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、ブロッキング液、Ｂ／Ｆ分離用の洗浄液、発光基質液などがあげられる。 In addition to the above-mentioned reagents, the kit may contain other reagents, instruments, etc., if necessary. For example, a blocking solution, a cleaning solution for B/F separation, a luminescent substrate solution, etc. may be mentioned.
以下、参考例及び実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited to the following examples.
なお、以下の参考例、並びに実施例１及び２では、小型化学発光免疫自動分析装置（商品名：ＰＯＣｕｂｅ、東洋紡社製）を用いた。なお、当該装置は、抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体を有する反応容器（以下、「反応容器」と記載する。）に、ビオチン標識された抗原又は抗体と酵素標識された抗原又は抗体と測定対象試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体を含む反応溶液を当該反応容器に滴下することにより、当該複合体におけるビオチンと当該多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との間で抗原−抗体反応させ、当該複合体を選択的に多孔質担体上に固定させた後、酵素基質を滴下して酵素活性を測定するという一連の操作を自動で行うことができる装置である。具体的には、ＰＯＣｕｂｅに添付された操作手順に従い、概ね以下の手順で行った。 In addition, in the following reference examples and Examples 1 and 2, a small chemiluminescent immuno-automatic analyzer (trade name: POCube, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. In addition, in the device, a biotin-labeled antigen or antibody and an enzyme-labeled antigen or antibody are provided in a reaction container (hereinafter, referred to as “reaction container”) having a porous carrier supporting an anti-biotin antibody. By dropping a reaction solution containing a complex with an IgG antibody against periodontal pathogen contained in the sample to be measured into the reaction container, the biotin in the complex and the anti-biotin antibody carried on the porous carrier are added. It is an apparatus capable of automatically performing a series of operations in which an antigen-antibody reaction is carried out and the complex is selectively immobilized on a porous carrier, and then an enzyme substrate is dropped to measure the enzyme activity. .. Specifically, according to the operation procedure attached to POCube, the procedure was generally as follows.
（１）液相反応
ＰＯＣｕｂｅ専用試薬カートリッジに、試薬Ｒ１（ビオチン標識された抗原又は抗体を含む溶液）：２５μＬ、試薬Ｒ２（酵素標識された抗原又は抗体）：２５μＬ、及び検体溶液：５０μＬをそれぞれ添加して混合し、４０℃、５分間の条件で抗原−抗体反応（第１反応）を行う。当該操作により、ビオチン標識された抗原又は抗体と酵素標識された抗原又は抗体と測定対象試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体が形成される。また、当該第１反応と並行して、反応容器にＰＯＣｕｂｅ専用ブロック液５０μＬを滴下し、抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体をブロッキングする。当該操作により、抗ビオチン抗体の非特異的吸着を抑制することができる。
(1) Liquid phase reaction In a reagent cartridge for exclusive use of POCube, reagent R1 (solution containing biotin-labeled antigen or antibody): 25 μL, reagent R2 (enzyme-labeled antigen or antibody): 25 μL, and sample solution: 50 μL, respectively The mixture is added and mixed, and the antigen-antibody reaction (first reaction) is performed under the conditions of 40° C. and 5 minutes. By this operation, a complex of a biotin-labeled antigen or antibody, an enzyme-labeled antigen or antibody, and an IgG antibody against periodontal pathogens contained in the sample to be measured is formed. Further, in parallel with the first reaction, 50 μL of the POCube-specific block solution is dropped into the reaction vessel to block the anti-biotin antibody-supporting porous carrier. By this operation, non-specific adsorption of anti-biotin antibody can be suppressed.
（２）固相反応
上記の第１反応後の反応溶液７０μＬを、ブロッキング後の反応容器に滴下し、４０℃、５分間の条件で抗原−抗体反応（第２反応）を行う。当該操作により、上記（１）において形成された複合体におけるビオチンと多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体とが結合する。その後、ＰＯＣｕｂｅ専用洗浄液８０μＬを反応容器に滴下し、多孔質担体の洗浄を行う。洗浄操作を２回繰り返した後、試薬Ｒ３（酵素発光基質を含む溶液）：３０μＬを反応容器に滴下する。
(2) Solid phase reaction 70 μL of the reaction solution after the first reaction is dropped into the reaction container after blocking, and an antigen-antibody reaction (second reaction) is performed under the conditions of 40° C. and 5 minutes. By this operation, biotin in the complex formed in the above (1) is bound to the anti-biotin antibody carried on the porous carrier. Then, 80 μL of the cleaning solution for POCube is dropped into the reaction container to wash the porous carrier. After repeating the washing operation twice, 30 μL of reagent R3 (solution containing enzyme luminescent substrate) is added dropwise to the reaction vessel.
（３）酵素活性の測定
４０℃、１分間の条件で、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定する。
(3) Measurement of enzyme activity The enzyme activity (luminescence intensity) on the surface of the porous carrier is measured under the condition of 40°C for 1 minute.
また、以下の参考例及び実施例では、歯周病原菌抗原ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた。 In addition, in the following Reference Examples and Examples, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was used as the periodontal pathogen bacterial antigen polypeptide.
参考例：ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体の検出
本例では、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体（ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体）に、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを結合させて、ＡＬＰ標識されたヒトＩｇＧ抗体と、ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体と、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとの複合体を形成させることにより、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体の検出を試みた。具体的には、上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ１として、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＰＯＣｕｂｅ専用Ｒ１希釈液に溶解した溶液を、試薬Ｒ２として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識された抗ヒトＩｇＧ抗体をＧｏｏｄ ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．５に調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を、試薬Ｒ３として、市販のＡＬＰ発光基質（商品名：Ｌｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を、それぞれ用いた。また、検体溶液として、歯周病患者から採取した血清（凍結血清）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用い、対照として、健常者から採取した血清（凍結血清；Ｎ群及びＩ２群の２種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用いた。また、ブランクとして、トリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液を用いた。
Reference example: Detection of human anti-Pg-IgG antibody using ALP-labeled anti-human IgG antibody In this example, human IgG antibody (human anti-Pg-IgG antibody) against periodontal pathogens contained in serum was ALP-labeled. A human IgG antibody labeled with ALP, a human anti-Pg-IgG antibody, and a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide by binding an anti-human IgG antibody and a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide. An attempt was made to detect human IgG antibodies against periodontal pathogens contained in serum by forming a complex of. Specifically, the enzyme activity (emission intensity) on the surface of the porous carrier was measured according to the procedure of (1) to (3). In this example, as the reagent R1, a solution prepared by dissolving a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide in the R1 diluent for exclusive use of POCube is used, and as the reagent R2, an alkaline phosphatase (ALP)-labeled anti-human IgG antibody is Good. A commercially available ALP luminescent substrate (trade name: Lumigen APS-5, manufactured by Lumigen) was used as a reagent R3 by dissolving a solution containing 1% BSA adjusted to pH 6.5 with Buffer as the reagent R3. As a sample solution, a serum (frozen serum) sampled from a periodontal patient was diluted 100-fold with a solution adjusted to pH 8.5 with Tris buffer, and used as a control. A solution prepared by diluting serum (two kinds of N group and I2 group) 100-fold with a solution of which pH was adjusted to 8.5 with Tris buffer was used. As a blank, a solution adjusted to pH 8.5 with Tris buffer was used.
なお、参考として、上記（１）〜（２）の操作手順において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を図１に示す。 As a reference, for periodontal pathogens contained in serum and biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, ALP-labeled anti-human IgG antibody formed in the above-mentioned procedure (1) to (2), A schematic diagram of the binding between the complex with the IgG antibody and the anti-biotin antibody supported on the porous carrier is shown in FIG.
結果を下記表１に示す。 The results are shown in Table 1 below.
上記表１から明らかなように、健常者においてシグナル値が高く、健常者と歯周病患者との間で測定結果の差は明確とはならなかった。限定的な解釈を望むものではないが、これは、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた場合には、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体だけでなく、血清中に含まれるすべてのＩｇＧ抗体との間で抗原−抗体反応が起こるため、目的とする歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体以外のＩｇＧ抗体との競合反応により、多孔質担体の孔径よりも大きなサイズの凝集物が多数形成され、当該凝集体が多孔質担体表面に残存することにより、健常者と歯周病患者との間で測定値に明確な差が確認されなかったものと考察される。 As is clear from Table 1 above, the signal value was high in healthy subjects, and the difference in measurement results between healthy subjects and periodontal disease patients was not clear. While not wishing to be limited, this is not limited to IgG antibodies against periodontal pathogens when ALP-labeled anti-human IgG antibodies are used, and all IgG antibodies contained in serum. Since an antigen-antibody reaction occurs between them, a large number of aggregates having a size larger than the pore diameter of the porous carrier are formed by a competitive reaction with an IgG antibody other than the IgG antibody against the target periodontal pathogen, and the aggregates are It is considered that due to the remaining on the surface of the porous carrier, no clear difference in the measured value was confirmed between the healthy subject and the periodontal disease patient.
実施例１：ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いたヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体の検出
本例では、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体（ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体）に、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを結合させて、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと、ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体と、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとの複合体を形成させることにより、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体の検出を試みた。具体的には、上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ２として、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えて、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＧｏｏｄ ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．５に調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を用いたこと、さらに、検体溶液として、歯周病患者から採取した血清（凍結血清；Ｐ１群、Ｐ２群、及びＰ３群の３種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用い、対照として、健常者から採取した血清（凍結血清；Ｎ群、Ｉ２群、Ｉ４群、及びＩ６群の４種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用いたこと以外は、上記参考例と同様にして行った。
Example 1: Detection of human anti-Pg-IgG antibody using ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide In this example, human IgG antibody (human anti-Pg-IgG antibody) against periodontal pathogen contained in serum was used. , An ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide are bound to form an ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, human anti-Pg-IgG antibody, and biotin-labeled An attempt was made to detect human IgG antibodies against periodontal pathogens contained in serum by forming a complex with the periodontal pathogen antigen polypeptide. Specifically, the enzyme activity (emission intensity) on the surface of the porous carrier was measured according to the procedure of (1) to (3). In this example, the reagent R2 was replaced with an ALP-labeled anti-human IgG antibody, and a solution containing 1% BSA in which the ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide was adjusted to pH 6.5 with Good Buffer. In addition, the pH of the serum (frozen serum; three types of P1, P2, and P3 groups) collected from periodontitis patients was adjusted to 8.5 with Tris buffer as a sample solution. As a control, the serum (frozen serum; four kinds of N group, I2 group, I4 group, and I6 group) collected from a healthy person was adjusted to pH 8.5 with Tris buffer, using a solution diluted 100 times with the above solution. The same procedure as in the above Reference Example was carried out except that a 100-fold diluted solution was used.
なお、参考として、上記（１）〜（２）の操作手順において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を図２に示す。 For reference, the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide formed in the above-mentioned procedure (1) to (2) and the periodontal periodontium contained in serum are included. A schematic diagram of the binding between the complex with the IgG antibody against the pathogen and the anti-biotin antibody carried on the porous carrier is shown in FIG.
結果を下記表２に示す。 The results are shown in Table 2 below.
上記表２から明らかなように、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えてＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いた場合には、健常者と歯周病患者との間で測定値に明確な差が確認された。具体的には、歯周病患者においては、測定値が健常者よりも高い測定値が観測された。以上のことから、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えてＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いることにより、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができ、被検試料が歯周病患者由来であるか、あるいは健常者由来のものであるかを判定する指標を提供することができることが分かった。 As is clear from Table 2 above, when an ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide was used instead of the ALP-labeled anti-human IgG antibody, the measured value between a healthy subject and a periodontal disease patient was measured. A clear difference was confirmed. Specifically, in patients with periodontal disease, the measured values were higher than those of healthy individuals. From the above, by using ALP-labeled periodontal pathogen bacterial antigen polypeptide in place of ALP-labeled anti-human IgG antibody, IgG antibody against periodontal pathogen can be detected and the test sample is It has been found that it is possible to provide an index for determining whether it is derived from a diseased patient or a healthy person.
実施例２：試薬の安定性の検討
上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ１として、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＰＯＣｕｂｅ専用Ｒ１希釈液に溶解した溶液を、試薬Ｒ２として、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＧｏｏｄ ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、及び７．５にそれぞれ調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を０日（調製後）、７日、１４日、２１日、２８日、４２日、及び５６日間保存したものを、試薬Ｒ３として、市販のＡＬＰ発光基質（商品名：Ｌｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を、それぞれ用いた。また、検体溶液として、トリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液（ブランク）を用いた。
Example 2: Examination of Stability of Reagents The enzyme activity (emission intensity) on the surface of the porous carrier was measured according to the procedure of (1) to (3) above. In this example, as the reagent R1, a solution prepared by dissolving a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide in POCube-dedicated R1 diluent was used as a reagent R2, and the ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide was applied to Good Buffer. Solution dissolved in a solution containing 1% BSA adjusted to pH 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, and 7.5, respectively. ), 7 days, 14 days, 21 days, 28 days, 42 days, and 56 days were stored, and a commercially available ALP luminescent substrate (trade name: Lumigen APS-5, manufactured by Lumigen) was used as reagent R3. Using. As a sample solution, a solution (blank) adjusted to pH 8.5 with Tris buffer was used.
結果を表３に示す。なお、表３における括弧内の数値は０日目の測定値に対する割合（％）を示す。 The results are shown in Table 3. In addition, the numerical value in the parenthesis in Table 3 shows the ratio (%) with respect to the measured value on the 0th day.
上記表３から明らかなように、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０及び６．２５である場合には、日数が経過するにつれて測定値（ブランク値）が大幅に上昇する傾向にあることが分かった。特に、４２日目以降では、０日目に対して測定値が６０％以上上昇することが分かった。これに対して、溶液のｐＨを６．５〜７．５の間に調整した場合には測定値の大幅な変化は認められず、測定値の変動幅を±３０％程度に抑制することができることが分かった。 As is clear from Table 3 above, when the pH of the solution containing the ALP-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is 6.0 and 6.25, the measured value (blank value) is It turns out that it tends to rise significantly. In particular, it was found that the measured value increased by 60% or more from the 0th day after the 42nd day. On the other hand, when the pH of the solution is adjusted between 6.5 and 7.5, no significant change in the measured value is observed, and the fluctuation range of the measured value can be suppressed to about ±30%. I knew I could do it.
Claims (5)
（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、
（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに
（３）酵素活性を測定する工程、
を含み、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが同一又は異なって配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．５〜７．５である、方法。 A method for detecting IgG antibodies against periodontal pathogens contained in a biological sample collected from a subject, comprising:
(1) By mixing a solution containing a biological sample collected from a subject, a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, the living body A step of preparing a complex comprising an IgG antibody against periodontal pathogen contained in a sample, the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide,
(2) a step of contacting a solution containing the complex with a porous carrier carrying an anti-biotin antibody, and (3) a step of measuring enzyme activity,
Including,
The periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide and the biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide are the same or different, and thus SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of Ri Oh peptide,
PH of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigenic polypeptide Ru der 6.5 to 7.5, methods.
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．５〜７．５である、試薬。 A reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogen, comprising a solution containing an enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide, wherein the periodontal pathogen antigen polypeptide in the enzyme-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 Ri Oh a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from,
PH of the solution containing the enzyme-labeled periodontal pathogen antigenic polypeptide Ru der 6.5 to 7.5, the reagent.
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬
を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キットであって、
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、キット。 The reagent according to claim 4 ,
A kit for detecting an IgG antibody against periodontal pathogens, which comprises a reagent for detecting an IgG antibody against periodontal pathogens, which comprises a solution containing a biotin-labeled periodontal pathogen antigen polypeptide ,
The periodontopathic antigen polypeptide in the biotin-labeled periodontopathic antigen polypeptide is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, A kit, which is a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, and 24.
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