JP6707133B2 - 操作された核酸標的化核酸 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、現在係属中の、２０１５年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６３，２３２号の利益を主張し、この出願はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
連邦政府により支援された研究または開発に関する陳述
適用なし。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０１６年１２月２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＣＢＩ０２０−３０＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１５６ＫＢのサイズである。
技術分野
本開示は、一般的には、操作された足場形成ポリヌクレオチド配列およびそのような足場と、核酸結合タンパク質とを含む核タンパク質複合体に関する。足場ポリヌクレオチド成分をコードする核酸配列、ならびに該ポリヌクレオチド成分を含む発現カセット、ベクター、および細胞が記載される。本開示はまた、操作された足場形成核酸配列および本発明の核タンパク質複合体を作製および使用するための方法にも関する。
クラスター化調節空間ショートパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成する。ＣＲＳＩＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌において外来ＤＮＡに対する適応免疫を提供する（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は近年、５個の型および１６個のサブタイプを含む２個のクラスに再分類されている（非特許文献５を参照されたい）。この分類は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座中の全てのＣａｓ遺伝子の同定およびそれぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座中のシグナチャー遺伝子の決定に基づくものであり、最終的には、エフェクターモジュール、すなわち、干渉段階に関与するタンパク質をコードする遺伝子に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をクラス１またはクラス２のいずれかに入れる。最近、第６のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（ＶＩ型）が同定された（非特許文献６を参照されたい）。ある特定の細菌は、１より多い型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有する。
クラス１系は、マルチサブユニットのｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有するが、クラス２系は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３などの単一タンパク質、またはｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体を有する。クラス１系は、Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型系を含む。クラス２系は、ＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型系を含む。
ＩＩ型系は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、およびｃａｓ９遺伝子を有する。ｃａｓ９遺伝子は、ｃｒＲＮＡ−エフェクター複合体の機能と、ＤＮＡ標的配列切断とを組み合わせるマルチドメインタンパク質をコードする。ＩＩ型系は、３つのサブタイプ、サブタイプＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、およびＩＩ−Ｃにさらに分割される。サブタイプＩＩ−Ａは、さらなる遺伝子、ｃｓｎ２を含有する。サブタイプＩＩ−Ａ系を有する生物の例としては、限定されるものではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓが挙げられる。サブタイプＩＩ−Ｂは、ｃｓｎ２タンパク質を欠くが、ｃａｓ４タンパク質を有する。サブタイプＩＩ−Ｂ系を有する生物の例は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａである。サブタイプＩＩ−Ｃは、細菌において見出される最も一般的なＩＩ型系であり、３つのタンパク質、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ９のみを有する。サブタイプＩＩ−Ｃ系を有する生物の例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａである。
Ｖ型系は、ｃｐｆ１遺伝子ならびにｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を有する（非特許文献７を参照されたい）。ｃｐｆ１遺伝子は、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同であるＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するが、Ｃａｓ９タンパク質中に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠く、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする。Ｖ型系は、限定されるものではないが、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐｐ．，Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓを含む、いくつかの細菌において同定されている。最近では、Ｃｐｆ１もＲＮａｓｅ活性を有し、プレｃｒＲＮＡプロセシングを担うことが証明されている（非特許文献８を参照されたい）。
クラス２系では、ｃｒＲＮＡは単一タンパク質と関連し、ヌクレアーゼ活性とＲＮＡ−結合ドメインとを組み合わせることによる干渉およびｃｒＲＮＡと核酸標的配列との間の塩基対形成を達成する。
ＩＩ型系では、核酸標的配列結合は、核酸標的配列切断と同様、Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡを含む。ＩＩ型系では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＨフォールド）ドメインおよびＨＮＨ（ＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインはそれぞれ、二本鎖核酸標的配列の一方の鎖を切断する。ＩＩ型系のＣａｓ９切断活性はまた、Ｃａｓ９タンパク質によるｃｒＲＮＡと核酸標的配列の結合を容易にする二本鎖を形成するために、ｃｒＲＮＡの、ｔｒａｃｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションを必要とする。
Ｖ型系では、核酸標的配列結合は、核酸標的配列切断と同様、Ｃｐｆ１およびｃｒＲＮＡを含む。Ｖ型系では、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインは、二本鎖核酸標的配列の一方の鎖を切断し、推定ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９切断によって生成される平滑末端とは対照的である、５’バルジ部を産生する、交互構成にある二本鎖核酸標的配列の他方の鎖を切断する。
Ｖ型系のＣｐｆ１切断活性は、Ｖ型系のｃｒＲＮＡが内部二本鎖を形成するステムループ構造を有する単一のｃｒＲＮＡを使用するよりもむしろ、二本鎖を形成するためにｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションを必要としない。Ｃｐｆ１は、ステムループおよびステムループに隣接する配列、最も顕著には、核酸標的配列にハイブリダイズするスペーサー配列の５’側のヌクレオチドを認識する配列および構造特異的様式でｃｒＲＮＡに結合する。このステムループ構造は、典型的には、１５〜１９ヌクレオチド長の範囲にある。このステムループ二本鎖を破壊する置換は切断活性を無効化するが、ステムループ二本鎖を破壊しない他の置換は切断活性を無効化しない。ステムループの５’側のヌクレオチドは、非標準ワトソン−クリック塩基対、三本鎖相互作用、および逆フーグスティーン塩基対を有するステムループ構造をさらに安定化するプソイドノット構造を採用する（非特許文献９を参照されたい）。Ｖ型系では、ｃｒＲＮＡは、５’末端でステムループ構造を形成し、３’末端の配列は核酸標的配列中の配列と相補的である。
Ｖ型ｃｒＲＮＡおよび核酸標的配列の結合および切断と関連する他のタンパク質は、クラス２候補１（Ｃ２ｃ１）およびクラス２候補３（Ｃ２ｃ３）を含む。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３タンパク質は長さにおいてＣａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質と類似しており、約１，１００アミノ酸〜約１，５００アミノ酸の範囲である。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３タンパク質はまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有し、Ｃｐｆ１と類似する構造を有する。Ｃ２ｃ１タンパク質は、核酸標的配列の結合および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする点でＣａｓ９タンパク質と類似するが、５０℃の最適切断温度を有する。Ｃ２ｃ１タンパク質は、核酸標的配列の５’側であるＣｐｆ１のＰＡＭと類似する、ＡＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を標的とする（例えば、非特許文献１０を参照されたい）。
クラス２候補２（Ｃ２ｃ２）は、他のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との配列類似性を有さず、ＶＩ型系として最近同定された（非特許文献６を参照されたい）。Ｃ２ｃ２タンパク質は、２個のＨＥＰＮドメインを有し、一本鎖ＲＮＡ切断活性を示す。Ｃ２ｃ２タンパク質は、核酸標的配列の結合および切断のためにｃｒＲＮＡを必要とするが、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない点でＣｐｆ１タンパク質と類似する。また、Ｃｐｆ１と同様、Ｃ２ｃ２タンパク質のためのｃｒＲＮＡは、Ｃ２ｃ２タンパク質との結合に役立つ安定なヘアピン、またはステムループ構造を形成する。ＶＩ型系は、単一のｃｒＲＮＡを使用して、部位特異的切断を指令する単一ポリペプチドＲＮＡエンドヌクレアーゼを有する。さらに、スペーサーと相補的な標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、Ｃ２ｃ２は、配列と無関係な様式で、任意の一本鎖ＲＮＡに対して非特異的エンドヌクレアーゼ活性を示す雑多なＲＮＡエンドヌクレアーゼになる（非特許文献１１を参照されたい）。
クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関して、多数のＣａｓ９オルソログならびにその関連するポリヌクレオチド成分（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）が当業界で公知である（例えば、全ての補足データを含む、非特許文献１２；全ての補足データを含む、非特許文献１３を参照されたい）。さらに、Ｃａｓ９様合成タンパク質は、当業界で公知である（２０１４年１０月２３日に公開された、特許文献１を参照されたい）。
Ｃａｓ９は、例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質である。Ｃａｓ９は、２つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメイン）を使用して、部位特異的な様式で、ＤＮＡ標的配列を切断するようにｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡによってプログラムすることができるエンドヌクレアーゼである（２０１４年３月６日に公開された、特許文献２を参照されたい；また、非特許文献１４も参照されたい）。
典型的には、それぞれの野生型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ｃｒＲＮＡは、潜在的なＤＮＡ標的配列と相補的な領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡとの塩基対水素結合を形成して、二次構造を形成する、典型的には、少なくとも１つのステム構造を形成する第２の領域とを有する。ＤＮＡ標的配列と相補的な領域は、スペーサーである。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは、いくつかの塩基対水素結合を介して相互作用して、二次ＲＮＡ構造を形成する。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との複合体形成は、Ｃａｓ９タンパク質のコンフォメーション変化をもたらし、ＤＮＡへの結合、Ｃａｓ９タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性、およびエンドヌクレアーゼＣａｓ９によるｃｒＲＮＡ誘導性部位特異的ＤＮＡ切断を容易にする。Ｃａｓ９タンパク質／ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体が二本鎖ＤＮＡ標的配列を切断するために、ＤＮＡ標的配列は、同族ＰＡＭに隣接する。適切なスペーサー配列を有するようにｃｒＲＮＡを操作することによって、目的の遺伝子座、例えば、配列改変が望まれる遺伝子座で切断するように複合体を標的化することができる。
様々なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ならびに予測される二次構造が当業界で公知である（例えば、全ての補足データ、特に、拡張データ図１を含む非特許文献１５；全ての補足データ、特に、補足図Ｓ１１を含む非特許文献１２を参照されたい）。予測されるｔｒａｃｒＲＮＡ二次構造は、制約生成ＲＮＡフォールディングモデルに基づくものであった（非特許文献１６）。ＲＮＡ二本鎖二次構造を、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージのＲＮＡｃｏｆｏｌｄ（非特許文献１７；非特許文献１８）およびＲＮＡｈｙｂｒｉｄ（非特許文献１９）を使用して予測した。構造予測を、ＶＡＲＮＡを用いて視覚化した（非特許文献２０）。Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．らは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのためのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、バルジ領域を有さないが、複合体は、スペーサーの３’に位置するステム構造、次いで、３’の方向に別のステム構造を保持することを示している。
クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のスペーサーは、使用されるＣａｓタンパク質に応じて、ＰＡＭの５’または３’に位置する核酸標的配列にハイブリダイズすることができる。ＰＡＭは、使用されるＣａｓポリペプチドに応じて変化してもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９を使用する場合、ＰＡＭは、配列５’−ＮＲＲ−３’（式中、ＲはＡまたはＧのいずれかであってよく、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎは核酸標的結合配列によって標的化される核酸標的配列のすぐ３’側にある）を含む核酸標的配列中の配列であってもよい。ＰＡＭが、非改変Ｃａｓタンパク質のためのＰＡＭと比較して異なっていてもよいようにＣａｓタンパク質を改変することができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９を使用する場合、ＰＡＭが最早、配列５’−ＮＲＲ−３’を含まないが、その代わりに、配列５’−ＮＮＲ−３’（式中、ＲはＡまたはＧのいずれかであってよく、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎは核酸標的配列によって標的化される核酸標的配列のすぐ３’側にある）を含むように、Ｃａｓ９タンパク質を改変することができる。
他のＣａｓタンパク質は他のＰＡＭを認識し、当業者であれば、任意の特定のＣａｓタンパク質のためのＰＡＭを決定することができる。例えば、Ｃｐｆ１は、例えば、ＴＴＴＮ配列を標的化するチミンリッチなＰＡＭ部位を有する（非特許文献２１を参照されたい）。
ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、様々な生物およびモデル系におけるプログラム可能なゲノム編集のために広く使用されている（例えば、非特許文献１４；非特許文献２２；２０１４年３月６日に公開された特許文献２を参照されたい）。
ゲノム操作は、特定の核酸配列を欠失させる、挿入する、突然変異させる、または置換することによってゲノムを変化させることを含む。この変化は、遺伝子特異的または位置特異的であってもよい。ゲノム操作は、Ｃａｓタンパク質およびその同族ポリヌクレオチドなどの、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡを切断することによって、変化のための部位を生成することができる。ある特定の事例では、切断は、ＤＮＡ標的配列中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。ＤＳＢを、例えば、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端連結（ＭＭＥＪ）、または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。ＨＤＲは、修復のための鋳型の存在に依拠する。ゲノム操作の一部の例では、ドナーポリヌクレオチドまたはその一部を、切断部に挿入することができる。
米国特許出願公開第２０１４−０３１５９８５号 米国特許出願公開第２０１４−００６８７９７号
Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９〜１７１２頁（２００７） Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ． Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：４６７〜４７７頁（２０１１） Ｇａｒｎｅａｕ， Ｊ． Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４６８：６７〜７１頁（２０１０） Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ， Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５〜９２８２頁（２０１１） Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：１〜１５頁（２０１５） Ａｂｕｄａｙｙｅｈ Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３頁（２０１６） Ｚｅｔｓｃｈｅ， Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁（２０１５） Ｆｏｎｆａｒａ， Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５３２（７６００）：５１７〜５２１頁（２０１６） Ｙａｍａｎｏ， Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ １６５（４）：９４９〜９６２頁（２０１６） Ｓｈｍａｋｏｖ， Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０（３）：３８５〜３９７頁（２０１５） Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ， Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５３８（７６２４）：２７０〜２７３頁（２０１６） Ｆｏｎｆａｒａ， Ｉ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（４）：２５７７〜２５９０頁（２０１４） Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（１０）：６０９１〜６１０５頁（２０１４） Ｊｉｎｅｋ， Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１頁（２０１２） Ｒａｎ， Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２０（７５４６）：１８６〜１９１頁（２０１５） Ｚｕｋｅｒ， Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３４０６〜３４１５頁（２００３） Ｂｅｒｎｈａｒｔ， Ｓ．Ｈ．ら、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １（１）：３（２００６） Ｈｏｆａｃｋｅｒ， Ｉ．Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３１９：１０５９〜１０６６頁（２００２） ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ−ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｒｎａｈｙｂｒｉｄ／ Ｄａｒｔｙ， Ｋ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５：１９７４〜１９７５頁（２００９） Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ， Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：２５１頁（２０１５） Ｊｉｎｅｋ Ｍ．ら、ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１． ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１（２０１３）
本発明は、一般に、核酸結合タンパク質に結合することができる足場形成ポリヌクレオチド複合体を含む核酸ポリヌクレオチド組成物に関する。典型的には、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、反復エレメント１、反復エレメント２、核酸結合タンパク質結合エレメント１、核酸結合タンパク質結合エレメント２、スペーサーエレメント１（例えば、核酸標的結合配列を含む）、およびスペーサーエレメント２（例えば、核酸標的結合配列２を含む）を含む２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体である。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、核酸結合タンパク質と結合することができる。
一態様では、本発明は、第１の操作された核酸「ＮＡＳＣ−ＰＣ１」および第２の操作された核酸成分（「ＮＡＳＣ−ＰＣ２」）を含む２つ以上の操作された足場形成核酸配列（「ＮＡＳＣ」）の組成物に関する。ＮＡＳＣ−ＰＣ１は、５’から３’の方向に、核酸標的結合配列１を含むスペーサーエレメント１、反復核酸配列１を含む反復エレメント１、および核酸結合タンパク質結合エレメント１を含み、ここで、スペーサーエレメント１は、反復エレメント１に共有結合で接続され、反復エレメント１は、核酸結合タンパク質結合配列１を含む核酸結合タンパク質結合エレメント１に共有結合で接続される。第２の操作された核酸成分（「ＮＡＳＣ−ＰＣ２」）は、５’から３’の方向に、核酸標的結合配列２を含むスペーサーエレメント２、反復核酸配列２を含む反復エレメント２、および核酸結合タンパク質結合配列２を含む核酸結合タンパク質結合エレメント２を含み、ここで、スペーサーエレメント２は、反復エレメント２に共有結合で接続され、反復エレメント２は、核酸結合タンパク質結合エレメント２に共有結合で接続される。本発明の一部の実施形態では、核酸結合タンパク質結合配列１は、二本鎖核酸結合タンパク質結合配列１を含み、核酸結合タンパク質結合配列２は、二本鎖核酸結合タンパク質結合配列２を含む。反復核酸配列１と反復核酸配列２は、水素結合した塩基対を介して接続され、その接続は、ＮＡＳＣ組成物を形成する。ＮＡＳＣ組成物は、第１の核酸結合タンパク質（例えば、第１の二本鎖核酸結合タンパク質）および第２の核酸結合タンパク質（例えば、第２の二本鎖核酸結合タンパク質）に結合することができる。
ＮＡＳＣ組成物の実施形態としては、限定されるものではないが、クラス２のＣＲＩＳＰＲタンパク質である第１の二本鎖核酸結合タンパク質およびクラス２のＣＲＩＳＰＲタンパク質である第２の二本鎖核酸結合タンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、第１の二本鎖核酸結合タンパク質は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質であり、第２の二本鎖核酸結合タンパク質は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質である。他の実施形態は、第１の二本鎖核酸結合タンパク質がクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質であり、第２の二本鎖核酸結合タンパク質がクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質であるものを含む。さらなる実施形態では、第１の二本鎖核酸結合タンパク質はクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質であり、第２の二本鎖核酸結合タンパク質はクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質である。
一部の実施形態では、スペーサーエレメント１およびスペーサーエレメント２は、さらなる核酸配列を含む。例えば、スペーサーエレメント１は、核酸標的結合配列１の３’側および反復エレメント１の５’側にリンカーエレメント核酸配列をさらに含んでもよい。スペーサーエレメント２は、核酸標的結合配列１の３’側および反復エレメント１の５’側にリンカーエレメント核酸配列をさらに含んでもよい。
さらなる実施形態では、反復エレメント１および反復エレメント２は、以下のようなさらなる配列を含む。反復エレメント１は、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ｂ、リンカーエレメント核酸配列１、および反復核酸配列１ａをさらに含む。反復エレメント２は、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ａＣ、リンカーエレメント核酸配列２、および反復核酸配列１ｂＣをさらに含む。反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣは、水素結合した塩基対を介して接続される。
さらなる実施形態では、反復核酸配列１ｂおよび反復配列１ａは、以下のようなさらなる成分を含む。反復核酸配列１ｂは、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ｂ２、バルジ核酸配列１ｂ１、および反復核酸配列１ｂ１をさらに含んでもよい。反復核酸配列１ａは、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ａ２、バルジ核酸配列１ａ１、および反復核酸配列１ａ１をさらに含んでもよい。反復核酸配列１ａＣは、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ａ１Ｃ、バルジ核酸配列２ａ２、および反復核酸配列１ａ２Ｃをさらに含んでもよい。反復核酸配列１ｂＣは、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ｂ１Ｃ、バルジ核酸配列２ｂ２、および反復核酸配列１ｂ２Ｃをさらに含んでもよい。反復核酸配列１ａ１と反復核酸配列１ａ１Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ａ２と反復核酸配列１ａ２Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ｂ１と反復核酸配列１ｂ１Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ｂ２と反復核酸配列１ｂ２Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続される。
さらなる実施形態では、リンカーエレメント核酸配列１−２およびリンカーエレメントヌクレオチド配列２−２は、付加された核酸配列を含む。リンカーエレメント１−１は、５’から３’の方向に、リンカーエレメント核酸配列１−２−２、反復核酸配列１−２ａ、およびリンカーエレメント核酸配列１−２−１をさらに含んでもよい。リンカーエレメント核酸配列２−２は、５’から３’の方向に、リンカーエレメント核酸配列２−２−１、反復核酸配列１−２ａＣ、およびリンカーエレメント核酸配列２−２−２をさらに含んでもよい。反復核酸配列１−２ａと反復核酸配列１−２ａＣは、水素結合した塩基対を介して接続され、二本鎖核酸領域１−２を形成する。一部の実施形態では、二本鎖核酸領域１−２は、エフェクタータンパク質結合部位１をさらに含む。反復核酸配列１−２ａは、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａをさらに含む。反復核酸配列２は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａＣをさらに含む。エフェクター結合部位は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａとエフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａＣとの間の水素塩基対結合によって形成される。Ｃｓｙ４タンパク質結合部位は、エフェクタータンパク質結合部位の一例である。Ｃｓｙ４タンパク質または酵素的に不活性なＣｓｙ４タンパク質は、エフェクター結合部位に結合することができる。
さらなる実施形態では、反復核酸配列１は、アフィニティータグ１をさらに含み、反復核酸配列２は、アフィニティータグ２をさらに含み、アフィニティータグ１はアフィニティータグ２と接続される。
ＮＡＳＣ組成物は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡを含んでもよい。一部の実施形態では、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、またはＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む。
別の態様では、本発明は、ＮＡＳＣ組成物および１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質を含む核酸／タンパク質組成物を含む。一実施形態では、核酸タンパク質は、第１のＣａｓ９タンパク質および第２のＣａｓ９タンパク質であってもよい。例えば、第１のＣａｓ９タンパク質は、第２のＣａｓ９タンパク質と同じであり、第１のＣａｓ９タンパク質および第２のＣａｓ９タンパク質はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択される。他の実施形態では、第１のＣａｓ９タンパク質は、第２のＣａｓ９タンパク質と異なり、第１のＣａｓ９タンパク質および第２のＣａｓ９タンパク質はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択される。さらに、第１のＣａｓ９タンパク質および第２のＣａｓ９タンパク質を、それぞれ、Ｃａｓ９タンパク質／Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９タンパク質、ｄＣａｓ９タンパク質／Ｃａｓ９タンパク質、およびｄＣａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９タンパク質からなる群から選択することができる。
さらなる態様では、本発明は、ＮＡＳＣ組成物の１つまたはそれ以上の成分を含むキットに関する。一部の実施形態では、ＮＡＳＣ組成物は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２、またはＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２をコードする１つもしくはそれ以上の核酸配列、ならびにバッファーを含む。キットは、１つもしくはそれ以上のＣａｓ９タンパク質または１つもしくはそれ以上のＣａｓ９タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸配列をさらに含んでもよい。さらなる実施形態では、キットは、ＮＡＳＣ組成物と１つまたはそれ以上のＣａｓ９タンパク質とを含む核タンパク質複合体を含んでもよい。
さらなる態様では、本発明は、ＮＡＳＣ組成物の１つまたはそれ以上の成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を含む発現ベクターに関する。
さらに別の態様では、本発明は、ＮＡＳＣ組成物の１つまたはそれ以上の成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を含む組換え細胞に関する。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のように、ＮＡＳＣ組成物を使用する方法を含む。１つの方法は、ＤＮＡに結合させる方法である。この方法は、ＤＮＡポリヌクレオチド中の第１のＤＮＡ標的配列およびＤＮＡポリヌクレオチド中の第２のＤＮＡ標的配列を、ＮＡＳＣ組成物および核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、および／またはＣｐｆ１タンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物と接触させることによって、核酸／タンパク質組成物の、ＤＮＡ中の第１のＤＮＡ標的配列およびＤＮＡ中の第２のＤＮＡ標的配列への結合を容易にすることを含む。ＮＡＳＣ組成物のＮＡＳＣ−ＰＣ１スペーサーエレメントは、第１のＤＮＡ標的配列と相補的であってよく、ＮＡＳＣ組成物のＮＡＳＣ−ＰＣ２スペーサーは、第２のＤＮＡ標的配列と相補的であってよい。
本発明の別の方法は、ＤＮＡを切断する方法である。この方法は、ＤＮＡポリヌクレオチド中の第１のＤＮＡ標的配列およびＤＮＡポリヌクレオチド中の第２のＤＮＡ標的配列を、ＮＡＳＣ組成物および核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、および／またはＣｐｆ１タンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物と接触させることによって、核酸／タンパク質組成物の、第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列への結合を容易にすることを含む。結合は、第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列の切断をもたらす。ＮＡＳＣ組成物のＮＡＳＣ−ＰＣ１スペーサーエレメントは、第１のＤＮＡ標的配列と相補的であってよく、ＮＡＳＣ組成物のＮＡＳＣ−ＰＣ２スペーサーは、第２のＤＮＡ標的配列と相補的であってよい。
本発明のＮＡＳＣ組成物およびＮＡＳＣ組成物を含む核タンパク質粒子を使用する本発明のこれらの態様および他の実施形態は、本明細書の開示を考慮すれば当業者には容易に明らかとなるであろう。
図面は比例的にレンダリングされず、拡大縮小もされない。指標の位置はおおよそのものである。
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄは、デュアルガイドクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ガイドＲＮＡの例を提示する。 図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃは、シングルガイドクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連ガイドＲＮＡの例を提示する。 図３Ａおよび図３Ｂは、クラス２ Ｖ型ｃｒＲＮＡガイドＲＮＡの例を提示する。 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｉ、図４Ｊ、図４Ｋ、図４Ｌ、図４Ｍ、図４Ｎ、および図４Ｏ（この最後の図面は図４「Ｏ」であり、図４「ゼロ」ではない）は、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の一般的配置の例を示す。例示される配列は、５’から３’または３’から５’の向きにされず、極性を有さない。 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、および図５Ｉは、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｊ、図６Ｋ、図６Ｌ、および図６Ｍは、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈ、および図７Ｉは、本発明の操作された連結された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋ、図８Ｌ、図８Ｍ、および図８Ｎは、本発明の操作された連結されたスプリットネクサス（ｓｐｌｉｔ−ｎｅｘｕｓ）核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図１０は、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物の例およびエレメントを示す。 図１１は、本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体、核タンパク質複合体の形成、および２つの核酸標的配列に結合する核タンパク質複合体を示す。 図１２は、複合体のヌクレアーゼによって切断される、第１の核酸標的配列に結合し、第２の核酸標的配列に結合する本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体を示す。 図１３は、ポリヌクレオチド中の３つの核酸標的配列に結合する本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体を示す。 図１４は、第１のポリヌクレオチド中の第１の核酸標的配列に結合し、第２のポリヌクレオチド中の第２の核酸標的配列および第３の核酸標的配列に結合する本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体であって、第２および第３の核酸標的配列が複合体のヌクレアーゼによって切断される、前記複合体を示す。 図１５は、第１のポリヌクレオチド中の第１の核酸標的配列に結合し、第２のポリヌクレオチド中の第２の核酸標的配列に結合し、第３のポリヌクレオチド中の第３の核酸標的配列に結合する本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体であって、第２および第３の核酸標的配列が複合体のヌクレアーゼによって切断される、前記複合体を示す。 図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、２つの異なるタンパク質と核タンパク質複合体を形成し、第１のポリヌクレオチド中の第１の核酸標的配列および第２のポリヌクレオチド中の第２の核酸配列に結合する本発明の操作された核酸足場ポリヌクレオチド組成物を示す。結合および切断の結果の３つの組合せが示される。
参照による組み入れ
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の特許、刊行物、または特許出願があらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられると具体的かつ個別的に示されたかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。
発明の詳細な説明
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に対する参照は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含み、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」に対する参照は、１つまたはそれ以上のベクターを含む。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似する、または等価な他の方法および材料は本発明において有用であり得るが、好ましい材料および方法は本明細書に記載される。
本明細書の教示を考慮して、当業者であれば、例えば、以下の標準的な教科書によって教示されたような、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えポリヌクレオチドの従来の技術を用いることができる：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１−９３６１１３−８１−１（２０１４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第６版、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ＩＳＢＮ９７８−０−４７０−５２８１２−９（２０１０）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃ．Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ９７８−０１２４１０４９０７（２０１４）；Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｕｓｅ、第２版、Ｈ．Ｈｅｄｒｉｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０１２３８２００８２（２０１２）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｒ．Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１９３６１１３０１９（２０１３）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０１９９６３４２４８（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、ＩＳＳＮ１０６４−３７４５、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄ．Ｃ．Ｒｉｏら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０８７９６９８９１１（２０１０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１６０５５００５６０（２０１２）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３版、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０１２３８２２３９０（２０１３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｖ．Ｄａｓｈｅｋ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０８４９３９４８０５（１９９７）；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖ．Ｍ．Ｌｏｙｏｌａ−Ｖａｒｇａｓら、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１６１７７９８１７７（２０１２）；Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃ．Ｎ．Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ＩＳＢＮ９７８−０８１３８２１９５５（２０１１）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｃ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１６１７３７０２１２（２０１０）；Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｄ．Ｊ．Ｓｏｍｅｒｓら、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−１５８８２９９９７０（２００９）；Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｒ．Ｋｅｓｈａｖａｃｈａｎｄｒａｎら、Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｌａｃｋｓｗａｎ、ＩＳＢＮ９７８−８１７３７１６１６４（２００８）。
クラスター化調節空間ショートパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）および関連するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成する（例えば、Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９〜１７１２頁（２００７）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」および「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質」とは、限定されるものではないが、クラス１ Ｉ型Ｃａｓタンパク質、クラス１ ＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質、クラス１ ＩＶ型Ｃａｓタンパク質、クラス２ ＩＩ型Ｃａｓタンパク質、クラス２ Ｖ型Ｃａｓタンパク質、およびクラス２ ＶＩ型Ｃａｓタンパク質などのＣａｓタンパク質を指す。クラス２ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９オルソログによりコードされるＣａｓ９様タンパク質、Ｃａｓ９様合成タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃｐｆ１オルソログによりコードされるタンパク質、Ｃｐｆ１様合成タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、ならびにその変異体および改変体を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９などの１つもしくはそれ以上のクラス２ ＩＩ型Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などの１つもしくはそれ以上のクラス２ Ｖ型Ｃａｓタンパク質、またはＣ２ｃ２などの１つもしくはそれ以上のクラス２ ＶＩ型Ｃａｓタンパク質である。好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９などの１つまたはそれ以上のクラス２ ＩＩ型Ｃａｓタンパク質、およびＣｐｆ１などの１つまたはそれ以上のクラス２ Ｖ型Ｃａｓタンパク質である。典型的には、本発明の態様における使用のために、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上の同族ポリヌクレオチド（最も典型的には、ＲＮＡ）と相互作用して、核タンパク質複合体（最も典型的には、リボ核タンパク質複合体）を形成することができる。
本明細書で使用される「Ｃａｓ９タンパク質」とは、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に由来するＣａｓ９野生型タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質の改変体、Ｃａｓ９タンパク質の変異体、Ｃａｓ９オルソログ、およびその組合せを指す。Ｃａｓ９タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９９ＺＷ２（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ））、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｊ７ＲＵＡ５（ＣＡＳ９＿ＳＴＡＡＵ））に由来するＣａｓ９が挙げられる。Ｃａｓ９ホモログを、当業者には公知の配列類似性検索方法を使用して同定することができる。本明細書で使用される「ｄＣａｓ９」とは、ヌクレアーゼ脱活性化Ｃａｓ９タンパク質であるＣａｓ９タンパク質の変異体を指し、「触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質」、「酵素的に不活性なＣａｓ９」、「触媒的に死んだＣａｓ９」または「死んだＣａｓ９」とも呼ばれる。そのような分子は、エンドヌクレアーゼ活性の全部または一部を欠き、したがって、ＲＮＡにより誘導される様式で遺伝子を調節するために使用することができる（Ｊｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１頁（２０１２）を参照されたい）。これは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ機能を不活化する、ＲｕｖＣ−１ドメイン中のＤ１０ＡおよびＨＮＨドメイン中のＨ８４０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に対して番号付けられる）などの、触媒残基に突然変異を導入することによって達成される。当業者であれば、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたは両方の活性を低下させる他の触媒残基の突然変異を実行することもできるということが理解される。得られるｄＣａｓ９は、二本鎖ＤＮＡを切断することができないが、ガイド核酸と複合体を形成し、ＤＮＡ標的配列に結合する能力を保持する。アミノ酸位置Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａに変化を有するＣａｓ９二重突然変異体は、ヌクレアーゼとニッカーゼの両方の活性を不活化する。標的特異性は、ＰＡＭ配列へのＣａｓ９タンパク質結合によって、また、ガイドＲＮＡ（典型的には、単一ガイドＲＮＡ）のゲノム遺伝子座との相補的塩基対形成によって決定される。Ｃａｓ９は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に特徴的なシグナチャータンパク質である。
本明細書で使用される「Ｃｐｆ１タンパク質」とは、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系に由来するＣｐｆ１野生型タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質の改変体、Ｃｐｆ１タンパク質の変異体、Ｃｐｆ１オルソログ、およびその組合せを指す。本明細書で使用される「ｄＣｐｆ１」とは、ヌクレアーゼ脱活性化Ｃｐｆ１タンパク質であるＣｐｆ１タンパク質の変異体を指し、「触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質」または「酵素的に不活性なＣｐｆ１」とも呼ばれる。Ｃｐｆ１タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３（Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３＿９ＦＩＲＭ））、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６（ＣＰＦ１＿ＡＣＩＳＢ））が挙げられる。Ｃｐｆ１は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系に特徴的なシグナチャータンパク質である。Ｃｐｆ１ホモログを、当業者には公知の配列類似性検索方法を使用して同定することができる。
本明細書で使用される「核酸標的化核酸」（ＮＡＴＮＡ）とは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質）などのタンパク質を、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列に優先的に結合する（核酸標的配列を含まないポリヌクレオチドに対して）ように誘導する１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す。ＮＡＴＮＡは、リボヌクレオチド塩基（例えば、ＲＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド塩基（例えば、ＤＮＡ）、リボヌクレオチド塩基とデオキシリボヌクレオチド塩基の組合せ（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチドなど、ならびに例えば、本明細書に記載される、合成の、天然に存在する、および天然に存在しない改変骨格残基または結合を含んでもよい。核酸標的化核酸の例としては、限定されるものではないが、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ分子（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄを参照されたい）、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ（例えば、図２Ａおよび図２Ｂを参照されたい）、およびＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「デュアルガイドＲＮＡ」および「Ｃａｓ９−デュアルガイドＲＮＡ」は、典型的には、同族Ｃａｓ９タンパク質と結合することができるポリヌクレオチド成分のための２成分ＲＮＡ系を指す。図１Ａおよび図１Ｂは、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９関連デュアルガイドＲＮＡの実例を提示する。図１Ａは、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ（図１Ａ、１０１）およびＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ（図１Ａ、１０２）を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系２成分ＲＮＡを示す。図１Ｂは、二次構造を形成するＣａｓ９−ｃｒＲＮＡとＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対水素結合の形成を示す（例えば、２０１４年３月６日に公開された、米国特許出願公開第２０１４−００６８７９７号を参照されたい；また、Ｊｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜２１頁（２０１２）も参照されたい）。図１Ｂは、スペーサー配列（本明細書では核酸標的結合配列とも呼ばれる）を含むスペーサーエレメント（図１Ｂ、１０３）；下部ステムエレメント（図１Ｂ、１０４）を含む第１のステムエレメント（図１Ｂ、１０４、１０５、１０６）、非対ヌクレオチド（図１Ｂ、１０５）、および上部ステムエレメント（図１Ｂ、１０６）を含むバルジエレメント；第２のステムエレメントを含むネクサスエレメント（図１Ｂ、１０７）；第３のステムエレメントを含む第１の３’ヘアピンエレメント（図１Ｂ、１０８）；ならびに第４のステムエレメントを含む第２の３’ヘアピンエレメント（図１Ｂ、１０９）を含む、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＣａｓ９−ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡの二次構造エレメントの概観および命名を提示する。いくつかのクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系では、第１のステムエレメントは、バルジエレメントを有さない（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）。図１Ｃは、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ（図１Ｃ、１０１）およびＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ（図１Ｃ、１０２）を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ２−ＲＮＡ成分系を示す。図１Ｄは、二次構造を形成するＣａｓ９−ｃｒＲＮＡとＣａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対水素結合の形成を示す。図１Ｄは、スペーサーエレメント（図１Ｄ、１０３）；第１のステムエレメント（図１Ｄ、１１０）；第２のステムエレメントを含むネクサスエレメント（図１Ｄ、１０７）；第３のステムエレメントを含む第１の３’ヘアピンエレメント（図１Ｄ、１０８）；および第４のステムエレメントを含む第２の３’ヘアピンエレメント（図１Ｄ、１０９）の概観および命名を提示する。Ｃａｓ９−デュアルガイドＲＮＡは、同族Ｃａｓ９タンパク質と核タンパク質複合体を形成することができ、ここで、該複合体は、スペーサー配列と相補的な核酸標的配列を標的化することができる。１つまたはそれ以上の３’ヘアピンエレメント（図１Ｂ、１０８、１０９；図１Ｄ、１０８、１０９）の欠失、第１のステムエレメント（図１Ｂ、１０４、１０５、１０６；図１Ｄ、１１０）の改変、ならびに上部ステム、バルジ、および下部ステム（それぞれ、図１Ｂ、１０６、１０５、１０４）の改変を含む、Ｃａｓ９−デュアルガイドの改変が、当業界で公知である（例えば、２０１４年１０月２３日に公開された、米国特許出願公開第２０１４−０３１５９８５号；２０１５年１２月３１日に公開された、米国特許出願公開第２０１５−０３７６５８６号を参照されたい）。本明細書で使用される場合、「デュアルガイドＣａｓ９ポリヌクレオチド」とは、ｃｒＲＮＡと同じ構造エレメントを有するポリヌクレオチド（図１Ａ、１０１）およびｔｒａｃｒＲＮＡと同じ構造エレメントを有するポリヌクレオチド（図１Ａ、１０２）を有する２成分系を指す。デュアルガイドＣａｓ９ポリヌクレオチド系は、同族Ｃａｓ９タンパク質と結合することができる。
本明細書で使用される場合、「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）および「Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ」は、典型的には、系が同族Ｃａｓ９タンパク質と結合することができる、本明細書にさらに記載される１成分ＲＮＡ系を指す。
図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９関連ＲＮＡの例を示す。これらの図面は、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡが、頻繁にはテトラループを介して、Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合で連結され、塩基対水素結合を介してＲＮＡポリヌクレオチド二次構造を形成する、Ｃａｓ９シングルガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ）を例示する（例えば、２０１４年３月６日に公開された、米国特許出願公開第２０１４−００６８７９７号を参照されたい）。図２Ａは、スペーサー配列（本明細書では核酸標的化核酸配列とも呼ばれる）を含むスペーサーエレメント（図２Ａ、２０１）；下部ステムエレメント（図２Ａ、２０２）、非対ヌクレオチドを含むバルジエレメント（図２Ａ、２０５）、および上部ステムエレメント（図２Ａ、２０３）、および非対ヌクレオチドを含むループエレメント（図２Ａ、２０４）を含む第１のステムループエレメント（図２Ａ、２０２、２０５、２０３、２０４）；第２のステムループエレメントを含むネクサスエレメント（図２Ａ、２０６）；第３のステムループエレメントを含む第１の３’ヘアピンエレメント（図２Ａ、２０７）；ならびに第４のステムループエレメントを含む第３のステムエレメントを含む第２の３’ヘアピンエレメント（図２Ａ、２０８）を含む、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡの二次構造エレメントの概観および命名を提示する（例えば、Ｂｒｉｎｅｒ，Ａ．Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６（２）：３３３〜３３９頁（２０１４）の図１および図３を参照されたい）。
図２Ｂは、スペーサーエレメント（図２Ｂ、２０１）；第１のステムエレメント（図２Ｂ、２０９）および非対ヌクレオチドを含むループエレメント（図２Ｂ、２０４）（すなわち、第１のステムループエレメントは、第１のステムエレメントとループエレメントとを含む）；第２のステムループエレメントを含むネクサスエレメント（図２Ｂ、２０６）；第３のステムループエレメントを含む第１の３’ヘアピンエレメント（図２Ｂ、２０７）；ならびに第４のステムループエレメントを含む第３のステムエレメントを含む第２の３’ヘアピンエレメント（図２Ｂ、２０８）を含む、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡの二次構造エレメントの概観および命名を提示する。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡは、同族Ｃａｓ９タンパク質との核タンパク質複合体を形成することができ、ここで、該複合体は、スペーサー配列と相補的な核酸配列を標的化することができる。
限定されるものではないが、１つまたはそれ以上の３’ヘアピンエレメント（図２、２０７、２０８）の欠失、第１のステムエレメント（図１Ｂ、１０４、１０５、１０６；図１Ｄ、１１０）の改変、および上部ステム、バルジ、および下部ステム（それぞれ、図１Ｂ、１０６、１０５、１０４）の改変などの、Ｃａｓ９シングルガイドの改変が、当業界で公知である（例えば、２０１４年１０月２３日に公開された、米国特許出願公開第２０１４−０３１５９８５号；２０１５年１２月３１日に公開された、米国特許出願公開第２０１５−０３７６５８６号を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９シングルガイドポリヌクレオチド」は、ｓｇＲＮＡと同じ構造エレメントを有する１成分系を指す（図２）。シングルガイドＣａｓ９ポリヌクレオチド系は、同族Ｃａｓ９タンパク質と結合することができる。
図２Ｃは、図２Ａのより詳細な図を提示する。表１は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡと関連する核酸配列の領域を例示するために使用される一連の数字指標を提示する。表１において、「：」は、用語「含む」の等価物である。
Figure 0006707133
Figure 0006707133
本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｖ型ガイドｃｒＲＮＡ」および「Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ」は、典型的には、同族Ｃｐｆ１タンパク質と結合することができるポリヌクレオチド成分のための１成分ＲＮＡ系を指す（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ， Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁（２０１５）を参照されたい）。図３Ａは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１関連ＲＮＡ（Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ）の例、ならびにステムループエレメント（図３Ａ、３０１）および核酸標的結合配列を含むスペーサーエレメント（図３Ａ、３０２）のようなＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡの二次構造エレメントの概観および命名を提示する。ステムループエレメントは、５’から３’の方向に、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１Ｃ（図３Ａ、３０３）、ループエレメント（図３Ａ、３０４）、および相補的Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１Ｃ（図３Ａ、３０５）を含み、ここで、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１と相補的Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１Ｃは、二本鎖を形成する。図３Ｂは、ループエレメントが図３Ａのステムループエレメントから除去されたＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡの改変を提示する。図３Ｂは、５’から３’の方向に、Ｃｐｆ１−ステム核酸配列１（図３Ｂ、３０３）；相補的Ｃｐｆ１−ステム核酸配列１Ｃ（図３Ｂ、３０５）（ここで、Ｃｐｆ１−ステム核酸配列１と相補的Ｃｐｆ１−ステム核酸配列１Ｃは二本鎖を形成する）；および核酸標的結合配列を含むスペーサーエレメント（図３Ａ、３０２）を含むステムエレメント（図３Ｂ、３０１）を示す。ガイドｃｒＲＮＡは、同族Ｃｐｆ１タンパク質と核タンパク質複合体を形成することができ、ここで、該複合体は、核酸標的結合配列と相補的な核酸標的配列を標的化することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸標的結合配列」および「スペーサー核酸配列」は、ポリヌクレオチド中に核酸標的配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を指す。
「スペーサーエレメント」は、核酸標的結合配列を含む。
本明細書で使用される場合、「核酸足場」、「ＮＡＳＣ」、「ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物」、「ＮＡＳＣ組成物」および「ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物」は全て、足場形成ポリヌクレオチド複合体を指す。好ましい実施形態では、足場は、核酸結合タンパク質に結合することができる。典型的には、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体であって、（ｉ）反復エレメント１（例えば、反復核酸配列１を含む）および反復エレメント２（例えば、反復核酸配列２を含む）；（ｉｉ）核酸結合タンパク質結合エレメント１（例えば、核酸結合タンパク質結合配列１を含む）および核酸結合タンパク質結合エレメント２（例えば、核酸結合タンパク質結合配列２を含む）；ならびに（ｉｉｉ）スペーサーエレメント１（例えば、核酸標的結合配列１を含む）およびスペーサーエレメント２（例えば、核酸標的結合配列２を含む）を含む、前記複合体である。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物中、反復エレメント１は、反復エレメント２と接続される。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、核酸結合タンパク質と結合することができる。一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、２つ以上の核酸結合タンパク質（例えば、類似する構造モチーフおよび機能的モチーフを有する核酸結合タンパク質）と結合して、核タンパク質複合体を形成することができる。核酸結合タンパク質の例は、本明細書の以下で考察される。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の一部の実施形態では、第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分（例えば、反復エレメント１、核酸結合タンパク質結合エレメント１、およびスペーサーエレメント１を含むＮＡＳＣ−ＰＣ１）ならびに第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分（例えば、反復エレメント２、核酸結合タンパク質結合エレメント２、およびスペーサーエレメント２を含むＮＡＳＣ−ＰＣ２）のそれぞれは、同じ種類の核酸結合タンパク質（例えば、類似する構造モチーフおよび機能的モチーフを有する核酸結合タンパク質）と結合して、核タンパク質複合体を形成することができる。
ＮＡＳＣポリペプチド組成物の他の実施形態では、核タンパク質複合体は、核酸標的結合配列１、反復核酸配列１、反復核酸配列２、および核酸標的結合配列１を含む高分子に結合する核酸結合タンパク質によって形成される。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／核酸結合タンパク質１／核酸結合タンパク質２複合体は、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列に優先的に結合することができる（核酸標的配列を含まないポリヌクレオチドに対して）。
複数のスペーサーエレメントを含むＮＡＳＣポリヌクレオチド（ＮＡＳＣ−ＰＣ）は、一般的には、本明細書では「ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＭＴＳ」と呼ばれ、特に、スペーサーエレメントの数を参照して、「ＮＡＳＣ−ＰＣ−（スペーサーエレメントの数）ＴＳ」と呼ばれる（例えば、２個のスペーサーエレメントについては、使用される記号表示は、ＮＡＳＣ−ＰＣ−２ＴＳである）。
複数のポリヌクレオチドを含むＮＡＳＣ−ＰＣの成分は、本明細書では、ポリヌクレオチドの数を参照して、「ＮＡＳＣ−ＰＣ−（ポリヌクレオチドの数）」と呼ばれる（例えば、２個のポリヌクレオチドについては、使用される記号表示は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−１およびＮＡＳＣ−ＰＣ１−２である）。
連結されたエレメントを含むＮＡＳＣ−ＰＣポリヌクレオチド成分は、本明細書では、「ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ」と呼ばれる。スプリットネクサスポリヌクレオチドを含む特定の実施形態では、連結されたスプリットネクサスエレメントを含むＮＡＳＣポリヌクレオチド成分は、本明細書では「ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「核酸ブレース（ｂｒａｃｅ）配列」は、少なくとも２つの異なる核酸標的配列：第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の核酸標的結合配列１と相補的な核酸標的配列１、および第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の核酸標的結合配列２と相補的な核酸標的配列２を含む核酸配列である。核酸ブレース配列の例は、ＤＮＡブレース配列である。
本明細書で使用される場合、「ＮＡＳＣ−ケージ組成物（ＮＡＳＣ−ＣＣ）」は、核酸ブレース配列によって、第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物に接続され、典型的には、分子をパッケージするための内部空間を有するケージのような構造を形成する少なくとも第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む。
本明細書で使用される用語「同族」とは、典型的には、１つまたはそれ以上のＣａｓポリヌクレオチドの１つに存在する核酸標的結合配列と相補的な核酸標的配列に部位特異的に結合することができる核タンパク質複合体を形成することができる、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質）および１つまたはそれ以上のＣａｓポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９関連ＮＡＴＮＡまたはクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１関連ＮＡＴＮＡ）を指す。
本明細書で使用される用語「野生型」、「天然に存在する」および「非改変」は、自然に存在する典型的な（または最も一般的な）形態、外見、表現型、または株；例えば、それらが存在する通りであり、自然の供給源から単離することができる、典型的な形態の細胞、生物、特徴、ポリヌクレオチド、タンパク質、高分子複合体、遺伝子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはゲノムを意味する。野生型の形態、外見、表現型、または株は、意図的な改変の前の元親として役立つ。かくして、突然変異体、変異体、操作された、組換え、および改変形態は、野生型形態ではない。
本明細書で使用される用語「操作された」、「遺伝子操作された」、「組換え」、「改変された」、「天然に存在しない」、「非天然」および「非自然」は、互換的であり、意図的なヒトによる操作を示す。
本明細書で使用される場合、「中断された」、「破壊された」、および「不連続」は、例えば、ポリヌクレオチド骨格の共有結合における、連続性の破壊を意味するように互換的に使用される。例えば、不連続である第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはそれぞれ、５’末端および３’末端（５’末端−第１のポリヌクレオチド−３’末端および５’末端−第２のポリヌクレオチド−３’末端）を有する。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の５’末端は、典型的には、糖環中の５番目の炭素であり、３’末端は、典型的には、糖環中の３番目の炭素上のヒドロキシル基である。５’末端および３’末端をそれぞれ有する２つのポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドの骨格が１つの部位で破壊される場合に形成される。５’および／または３’末端を、例えば、部分（例えば、エキソヌクレアーゼの分解効果に対する耐性を提供する部分）の付加によって、共有結合的に改変することができる。
「共有結合」、「共有結合で付着した」、「共有結合した」、「共有結合で連結された」、「共有結合で接続された」および「分子結合」は、本明細書では互換的に使用され、原子間の電子対の共有を含む化学結合を指す。共有結合の例としては、限定されるものではないが、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合が挙げられる。
「非共有結合」、「非共有結合で付着した」、「非共有結合した」、「非共有結合で連結された」、「非共有相互作用」および「非共有結合で接続された」は、本明細書では互換的に使用され、電子対の共有を含まない任意の比較的弱い化学結合を指す。複数の非共有結合は、高分子のコンフォメーションを安定化し、分子間の特異的相互作用を媒介することが多い。非共有結合の例としては、限定されるものではないが、水素結合、イオン相互作用（例えば、Ｎａ+Ｃｌ-）、ファンデルワールス相互作用、および疎水結合が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「水素結合」、「水素塩基対」、「水素結合塩基対」、「水素結合した」および「水素結合した塩基対」は互換的に使用され、標準的な水素結合および非標準的な水素結合を指し、限定されるものではないが、「ワトソン−クリック水素結合塩基対」（Ｗ−Ｃ−水素結合塩基対またはＷ−Ｃ水素結合）；「フーグスティーン水素結合塩基対」（フーグスティーン水素結合）；および「ゆらぎ水素結合塩基対」（ゆらぎ水素結合）が挙げられる。逆Ｗ−Ｃ水素結合を含むＷ−Ｃ水素結合は、アデニン：チミン、グアニン：シトシン、およびウラシル：アデニンである、プリン−ピリミジン塩基対を指す。逆フーグスティーン水素結合を含むフーグスティーン水素結合は、それぞれの鎖上にある２個の核酸塩基が、主溝中で水素結合によって一緒に保持されている核酸中の塩基対のバリエーションを指す。この非Ｗ−Ｃ水素結合は、第３の鎖が二本鎖の周りに巻き付き、三本鎖らせんを形成するのを可能にすることができる。逆ゆらぎ水素結合を含むゆらぎ水素結合は、ワトソン−クリックの塩基対規則に従わないＲＮＡ分子中の２個のヌクレオチド間の対形成を指す。４つの主要なゆらぎ塩基対が存在する：グアニン：ウラシル、イノシン（ヒポキサンチン）：ウラシル、イノシン−アデニン、およびイノシン−シトシン。標準的な水素結合および非標準的な水素結合に関する規則は、当業者には公知である（例えば、Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０８７９６９７３９６（２００５）；Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０８７９６９５６１３（１９９９）；Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０８７９６９４５６２（１９９３）（例えば、Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ａｔ Ｌｅａｓｔ Ｔｗｏ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄｓ、Ｉ．Ｔｉｎｏｃｏを参照されたい）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｗ．Ｓａｅｎｇｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ、ＩＳＢＮ９７８−０−３８７−９０７６１−１（１９８８）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第１版、Ｓ．Ｎｅｉｄｌｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８−０１２３６９５０７９１（２００７）を参照されたい）。
「接続する」、「接続された」および「接続すること」は、本明細書で互換的に使用され、２つの高分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）の間の共有結合または非共有結合を指す。
本明細書で使用される場合、「相補性」とは、ある核酸配列が別の核酸配列と水素結合を形成する（例えば、標準的なワトソン−クリック塩基対形成による）能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す。２つのポリヌクレオチド配列が１００％の相補性を有する場合、その２つの配列は完全に相補的である、すなわち、第１のポリヌクレオチドの連続する残基の全部が、第２のポリヌクレオチド中の同数の連続する残基と水素結合する。
本明細書で使用される場合、「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質とポリヌクレオチドの間、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの間、またはタンパク質とタンパク質の間など）の非共有相互作用を指す。そのような非共有相互作用も、「結合」または「相互作用」と呼ばれる（例えば、第１の高分子が第２の高分子と相互作用する場合、第１の高分子は非共有的様式で第２の高分子に結合する）。結合相互作用のいくつかの部分は、配列特異的であってもよい。本明細書で使用される場合、「配列特異的結合」は、典型的には、１つまたはそれ以上のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質および／またはＣｐｆ１タンパク質）と複合体を形成して、そのタンパク質を、核酸標的結合配列（例えば、ＤＮＡ標的結合配列）を含まない第２の核酸配列（例えば、第２のＤＮＡ配列）と比較して、核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ標的配列）を含む核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）に優先的に結合させることができる１つまたはそれ以上のＮＡＳＣポリペプチド組成物を指す。ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と結合するタンパク質などの、結合相互作用の全成分が、配列特異的である必要はない。結合相互作用を、解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けることができる。「結合親和性」とは、結合相互作用の強度を指す。結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。
本明細書で使用される場合、Ｃａｓタンパク質を含む部位特異的核タンパク質複合体がポリヌクレオチド内の核酸標的配列でポリヌクレオチドに結合するか、またはそれを切断する場合、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、ポリヌクレオチドを「標的化」すると言われる。
本明細書で使用される場合、「二本鎖破壊」（ＤＳＢ）とは、切断されるＤＮＡの二本鎖断片の両方の鎖を指す。一部の例では、そのような破壊が起こる場合、一方の鎖は、ヌクレオチドが他方の鎖上のヌクレオチドに露出し、水素結合しない「付着末端」を有すると言うことができる。他の例では、両方の鎖が互いに完全に塩基対形成したままである「平滑末端」が存在してもよい。
「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーオリゴヌクレオチド」および「ドナー鋳型」は、本明細書では互換的に使用され、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）、一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ）、またはその組合せであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、挿入配列（例えば、ＤＮＡ中のＤＳＢ）にフランキングするホモロジーアームを含む。それぞれの側のホモロジーアームは、長さが変化してもよい。ドナーポリヌクレオチドの設計および構築のためのパラメータは、当業界で周知である（例えば、Ｒａｎ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８（１１）：２２８１〜２３０８頁（２０１３）；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０〜２３４頁（１９８５）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ ４４：４１９〜４２８頁（１９８６）；Ｗｕ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ３：１０５６〜１０７６頁（２００８）；Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ ３１：２５〜３３頁（１９８２）；Ｓｈｅｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２：４４１〜４５７頁（１９８６）；Ｗａｔｔ，Ｖ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８２：４７６８〜４７７２頁（１９８５）；Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｎ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２（２）：５６３〜５７５頁（１９９２）；Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４（１１）：２２５３〜２２５８頁（１９８４）；Ａｙａｒｅｓ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８３（１４）：５１９９〜５２０３頁（１９８６）；Ｌｉｓｋａｙ，Ｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５（１）：１６１〜１６７頁（１９８７）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「相同組換え修復」（ＨＤＲ）とは、例えば、ＤＮＡ中のＤＳＢの修復中に、細胞中で起こるＤＮＡ修復を指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、ＤＳＢ（例えば、ＤＮＡ標的配列内）が起こった配列を修復するためにドナーポリヌクレオチドを使用する。ドナーポリヌクレオチドは一般的に、ドナーポリヌクレオチドが修復のための好適な鋳型として働くことができるようなＤＳＢにフランキングする配列を有する必要配列相同性を有する。ＨＤＲは、例えば、ドナーポリヌクレオチドからＤＮＡ標的配列への遺伝子情報の移動をもたらす。ＨＤＲは、ドナーポリヌクレオチド配列がＤＮＡ標的配列と異なり、ドナーポリヌクレオチドの一部または全部がＤＮＡ標的配列中に組み込まれる場合、ＤＮＡ標的配列の変化（例えば、挿入、欠失、または突然変異）をもたらし得る。一部の実施形態では、全ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーが、ＤＮＡ標的配列の部位に組み込まれる。例えば、ドナーポリヌクレオチドを、ＤＮＡ標的配列中の破壊の修復のために使用することができ、その修復は、ＤＮＡ中の破壊の部位またはそのごく近くでのドナーポリヌクレオチドからの遺伝子情報（すなわち、ポリヌクレオチド配列）の移動をもたらす。したがって、新しい遺伝子情報（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を、ＤＮＡ標的配列で挿入またはコピーすることができる。
「ゲノム領域」は、核酸標的配列部位のいずれかの側に存在するか、またはあるいは、核酸標的配列部位の一部も含む、宿主細胞のゲノム中の染色体の断片である。ドナーポリヌクレオチドのホモロジーアームは、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのホモロジーアームは、核酸標的配列部位に直接フランキングするゲノム領域に対する有意な配列相同性を共有する；ホモロジーアームを、核酸標的配列部位からさらに遠いゲノム領域に対する十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。
本明細書で使用される場合、「非相同末端連結」（ＮＨＥＪ）とは、ドナーポリヌクレオチドを必要とすることなく、破壊の一方の末端の、破壊の他方の末端への直接的ライゲーションによるＤＮＡ中のＤＳＢの修復を指す。ＮＨＥＪは、修復鋳型を使用することなく、ＤＮＡを修復するために細胞が利用できるＤＮＡ修復経路である。ドナーポリヌクレオチドの非存在下でのＮＨＥＪの結果、ヌクレオチドはＤＳＢの部位に無作為に挿入または欠失されることが多い。
「マイクロホモロジー媒介末端連結」（ＭＭＥＪ）は、ＤＮＡ中のＤＳＢを修復するための経路である。ＭＭＥＪは、ＤＳＢにフランキングする欠失および連結前の破壊された末端に対して内部の微小相同配列のアラインメントを含む。ＭＭＥＪは、遺伝的に定義されており、例えば、ＣｔＩＰ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、ＤＮＡポリメラーゼシータ（Ｐｏｌθ）、ＤＮＡリガーゼ１（Ｌｉｇ１）、またはＤＮＡリガーゼ３（Ｌｉｇ３）の活性を必要とする。さらなる遺伝子成分は当業界で公知である（例えば、Ｓｆｅｉｒ，Ａ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４０：７０１〜７１４頁（２０１５）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ修復」は、細胞機構が細胞中に含まれるＤＮＡ分子に対する損傷を修復する任意のプロセスを包含する。修復される損傷は、一本鎖破壊または二本鎖破壊を含んでもよい。ＤＳＢを修復するための少なくとも３つの機構が存在する：ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、およびＭＭＥＪ。「ＤＮＡ修復」はまた、標的遺伝子座が、例えば、全てゲノム編集の形態を表す、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変される、ヒトによる操作の結果生じるＤＮＡ修復を指すように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換のプロセスを指す。
本明細書で使用される用語「調節配列」、「調節エレメント」、および「制御エレメント」は、互換的であり、発現されるポリヌクレオチド標的の上流にある（５’非コード配列）、中にある、または下流にある（３’非翻訳配列）ポリヌクレオチド配列を指す。調節配列は、例えば、転写のタイミング、転写の量もしくはレベル、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、および／または関連する構造ヌクレオチド配列の翻訳に影響する。調節配列は、活性化因子結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、転写開始部位、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、翻訳リーダー配列、転写終結配列（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリ−Ｕ配列）、翻訳終結配列、プライマー結合部位などを含んでもよい。
調節エレメントは、多くの型の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的、誘導的、および抑制的発現を指令するもの、ならびにある特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくはそれ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター、１つもしくはそれ以上のｐｏｌＩＩプロモーター、１つもしくはそれ以上のｐｏｌＩプロモーター、またはその組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを含み；例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０頁（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸リダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセリンキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましい発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。ベクターを宿主細胞中に導入することによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを産生させることができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、エクソンおよび関連する調節配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、イントロンおよび／または非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含んでもよい。
本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」とは、互いに機能的な関係に置かれたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。例えば、調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）は、調節配列がポリヌクレオチドの転写を調節する、またはそのモジュレーションに寄与する場合、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結される」。作動可能に連結された調節エレメントは、典型的には、コード配列と連続的である。しかしながら、最大で数キロベース以上、プロモーターから離れている場合、エンハンサーは機能することができる。したがって、いくつかの調節エレメントは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結することができるが、ポリヌクレオチド配列と連続的ではない。同様に、翻訳調節エレメントは、ポリヌクレオチドからのタンパク質発現のモジュレーションに寄与する。
本明細書で使用される場合、「発現」とは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または他のＲＮＡ転写物（例えば、構造もしくは足場ＲＮＡなどの、非コード）をもたらす、ＤＮＡ鋳型からのポリヌクレオチドの転写を指す。この用語はさらに、転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドを、集合的に、「遺伝子産物」と呼ぶことができる。発現は、ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する場合、真核細胞中でｍＲＮＡをスプライシングすることを含んでもよい。
本明細書で使用される用語「モジュレートする」とは、機能の分量、程度または量の変化を指す。例えば、本明細書に開示される、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）複合体は、プロモーターで、またはその近くで２つ以上の核酸標的配列に結合することによってプロモーター配列の活性をモジュレートすることができる。結合後に生じる作用に応じて、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質複合体は、プロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を誘導する、増強する、抑制する、または阻害することができる。かくして、遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子活性化と遺伝子抑制の両方を含む。
標的遺伝子の発現によって直接的または間接的に影響される任意の特徴を決定することによって、モジュレーションをアッセイすることができる。そのような特徴は、例えば、ＲＮＡもしくはタンパク質レベル、タンパク質活性、生成物レベル、遺伝子の発現、またはリポーター遺伝子の活性レベルの変化を含む。したがって、遺伝子の用語「発現をモジュレートすること」、「発現を阻害すること」、および「発現を活性化すること」は、ＮＡＳＣポリペプチド組成物／核酸結合タンパク質複合体が、遺伝子の転写を変化させる、活性化する、または阻害する能力を指してもよい。
本明細書で使用される「ベクター」および「プラスミド」は、遺伝物質を細胞中に導入するためのポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクターは、線状または環状であってもよい。ベクターは、好適な宿主細胞中でベクターの複製を行うことができる複製配列（すなわち、複製起点）を含有してもよい。好適な宿主の形質転換の際に、ベクターは、宿主ゲノムとは無関係に複製および機能するか、または宿主ゲノム中に組み込むことができる。ベクターの設計は、特に、ベクターのための意図される使用および宿主細胞に依存し、特定の使用および宿主細胞のための本発明のベクターの設計は、当業者のレベルの範囲内にある。４つの主要な型のベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。典型的には、ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、および／または選択マーカーを含む。発現ベクターは、典型的には、発現カセットを含む。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、組換え方法を使用して、または合成手段によって生成され、宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの発現を容易にするために選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含むポリヌクレオチド構築物を指す。例えば、調節配列は、宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの転写、または宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの翻訳を容易にすることができる。発現カセットを、例えば、宿主細胞のゲノム中に組み込むか、またはベクター中に存在させて、発現ベクターを形成することができる。
本明細書で使用される場合、「標的化ベクター」は、典型的には、標的遺伝子または核酸標的配列（例えば、ＤＳＢ）のエレメントにフランキングする、ｇＤＮＡと相同な、調整されたＤＮＡアームを含む組換えＤＮＡ構築物である。標的化ベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含んでもよい。標的遺伝子のエレメントを、欠失および／または挿入などの、いくつかの方法で改変することができる。欠損標的遺伝子を、機能的標的遺伝子で置き換えるか、または別の方法では、機能的遺伝子をノックアウトすることができる。場合により、標的化ベクターのドナーポリヌクレオチドは、標的遺伝子中に導入される選択マーカーを含む選択カセットを含む。標的遺伝子に隣接する、またはその中にある標的化領域（すなわち、核酸標的配列）を使用して、遺伝子発現の調節に影響させることができる。
本明細書で使用される用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は互換的であり、ポリマー形態のヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、その類似体、またはその組合せであってもよく、任意の長さのものであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の機能を実行し、任意の二次および三次構造を有してもよい。この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチドを包含する。特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対特異性を有する（例えば、Ａの類似体はＴと塩基対形成する）。ポリヌクレオチドは、１つの改変されたヌクレオチドまたは複数の改変されたヌクレオチドを含んでもよい。改変されたヌクレオチドの例としては、フッ素化されたヌクレオチド、メチル化されたヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体が挙げられる。ヌクレオチド構造を、ポリマーが集合される前または後に改変することができる。重合後、ポリヌクレオチドを、例えば、標識化成分または標的結合成分とのコンジュゲーションによって、さらに改変することができる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分を組み込んでもよい。この用語はまた、合成の、天然に存在する、および天然に存在しない改変された骨格残基または結合を含む核酸を包含し、参照ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と類似する結合特性を有する。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）ヌクレオシド、グリコール核酸、架橋核酸、およびモルホリノ構造が挙げられる。
ペプチド−核酸（ＰＮＡ）は、ポリヌクレオチドリン酸−糖骨格が可撓性偽ペプチドポリマーで置き換えられた核酸の合成相同体である。核酸塩基は、ポリマーに連結される。ＰＮＡは、ＲＮＡおよびＤＮＡの相補的配列に高い親和性および特異性でハイブリダイズする能力を有する。
ホスホロチオエート核酸では、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ポリヌクレオチドリン酸骨格中で、硫黄原子を非架橋酸素に置換する。この改変により、ヌクレオチド間結合はヌクレアーゼ分解に対して耐性になる。一部の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼ分解を阻害するためにポリヌクレオチド配列の５’または３’末端の最後の３〜５ヌクレオチドの間に導入される。オリゴヌクレオチド全体にわたるホスホロチオエート結合の配置は、同様にエンドヌクレアーゼによる分解を減少させるのに役立つ。
トレオース核酸（ＴＮＡ）は、人工遺伝子ポリマーである。ＴＮＡの骨格構造は、ホスホジエステル結合によって連結された反復トレオース糖を含む。ＴＮＡポリマーは、ヌクレアーゼ分解に対して耐性である。ＴＮＡは、二本鎖構造中での塩基対水素結合によって自己集合することができる。
結合逆位を、「リバースホスホロアミダイト」の使用によってポリヌクレオチド中に導入することができる（例えば、ｗｗｗ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｄｎａｌａｂ／ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ｌｉｎｋａｇｅｓを参照されたい）。ポリヌクレオチドの末端での３’−３’結合は、２個の５’−ＯＨ末端を有し、３’−ＯＨ末端を有さないオリゴヌクレオチドを作出することによってエキソヌクレアーゼ分解に対してポリヌクレオチドを安定化する。典型的には、そのようなポリヌクレオチドは、５’−ＯＨ位置上にホスホロアミダイト基および３’−ＯＨ位置上にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常、ＤＭＴ保護基は、５’−ＯＨ上にあり、ホスホロアミダイトは３’−ＯＨ上にある。
ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、別途指摘しない限り、従来の５’から３’の方向に表示される。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、一般的には、様々な重み付けパラメータを有するアルゴリズムを使用して、第１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較する、ヌクレオチド塩基またはアミノ酸の同一性パーセントを指す。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の配列同一性を、限定されるものではないが、ＧＥＮＢＡＮＫ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）およびＥＭＢＬ−ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．）などのサイトでワールドワイドウェブを介して入手可能な様々な方法およびコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ−ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥＲ、Ｌ−ＡＬＩＧＮなど）による配列アラインメントを使用して決定することができる。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の間の配列同一性は、一般的には、様々な方法またはコンピュータプログラムの標準的なデフォルトパラメータを使用して算出される。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の、本明細書で使用される場合の高い程度の配列同一性は、典型的には、約９０％の同一性〜１００％の同一性、例えば、約９０％の同一性またはそれ以上、好ましくは、約９５％の同一性またはそれ以上、より好ましくは、約９８％の同一性またはそれ以上である。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の、本明細書で使用される場合の中程度の配列同一性は、典型的には、約８０％の同一性〜約８５％の同一性、例えば、約８０％の同一性またはそれ以上、好ましくは、約８５％の同一性である。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の、本明細書で使用される場合の低い程度の配列同一性は、典型的には、約５０％の同一性〜７５％の同一性、例えば、約５０％の同一性、好ましくは、約６０％の同一性、より好ましくは、約７５％の同一性である。例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、アミノ酸置換を含むＣａｓ９）は、参照Ｃａｓタンパク質（例えば、野生型Ｃａｓ９）に対して、その長さにわたって低い程度の配列同一性、中程度の配列同一性、または高い程度の配列同一性を有してもよい。別の例では、ＮＡＴＮＡは、参照Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する参照野生型ポリヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ９と複合体を形成するｓｇＲＮＡ）と比較して、その長さにわたって、低い程度の配列同一性、中程度の配列同一性、または高い程度の配列同一性を有してもよい。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすること」は、水素塩基対形成によって単一の二本鎖分子（ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ）を形成するように２つの相補的な一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を組み合わせるプロセスである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、典型的には、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーションバッファーの塩濃度によって決定される；例えば、高温および低塩は、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を提供する。異なるハイブリダイゼーション条件のための塩濃度範囲および温度範囲の例は、以下の通りである：高ストリンジェンシー、約０．０１Ｍ〜約０．０５Ｍの塩、Ｔmより５℃〜１０℃低いハイブリダイゼーション温度；中ストリンジェンシー、約０．１６Ｍ〜約０．３３Ｍの塩、Ｔmより２０℃〜２９℃低いハイブリダイゼーション温度；および低ストリンジェンシー、約０．３３Ｍ〜約０．８２Ｍの塩、Ｔmより４０℃〜４８℃低いハイブリダイゼーション温度。二本鎖核酸のＴmは、当業界で周知の標準的な方法によって算出される（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｃａｓｅｙ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：１５３９〜１５５２頁（１９７７）；Ｂｏｄｋｉｎ，Ｄ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（１）：４５〜５２頁（１９８５）；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（４）：８７９〜８９４頁（１９８１）を参照されたい）。Ｔmを見積もるためのアルゴリズム予測手段も広く利用可能である。ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は、典型的には、標的配列と相補的なポリヌクレオチドが標的配列と優先的にハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、中ストリンジェンシー、好ましくは、高ストリンジェンシーのものである。
本明細書で使用される場合、「ステムエレメント」または「ステム構造」は、二本鎖領域を形成することが公知である、または予測される２つの鎖を含むポリヌクレオチド（「ステムエレメント」）を指す。「ステムループエレメント」または「ステムループ構造」は、一方の鎖の３’末端が、典型的には、一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチド配列によって第２の鎖の５’末端に共有結合したステム構造（「ステムループエレメントヌクレオチド配列」）を指す。一部の実施形態では、ループエレメントは、約３〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは、約４〜約１０ヌクレオチド長のループエレメントヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、ループエレメントヌクレオチド配列は、水素結合形成によって相互作用せずにループエレメントヌクレオチド配列内にステムエレメントを作出する非対核酸塩基の一本鎖ヌクレオチド配列である。本明細書で使用される用語「ヘアピンエレメント」も、ステムループ構造を指す。そのような構造は、当業界で周知である。塩基対は正確なものであってよい；しかしながら、当業界で公知のように、ステムエレメントは正確な塩基対を必要としない。かくして、ステムエレメントは、１つまたはそれ以上の塩基不一致または非対塩基を含んでもよい。
「リンカーエレメントヌクレオチド配列」および「リンカーヌクレオチド配列」は本明細書では互換的に使用され、第１のポリヌクレオチド配列の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に共有結合した１つまたはそれ以上の一本鎖配列を指し、典型的には、第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチド配列と接続する一本鎖核酸配列を指す。好ましい実施形態では、リンカーエレメントヌクレオチド配列は、水素結合形成によって相互作用せずにリンカーエレメントヌクレオチド配列内にステムエレメントを作出する非対核酸塩基の一本鎖ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、リンカーエレメントヌクレオチド配列は、約１〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは、約２〜約１０ヌクレオチド長である。
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、アミノ酸類似体、改変アミノ酸、ペプチド模倣体、グリシン、およびＤまたはＬ光学異性体を含む、天然および合成（非天然）アミノ酸を指す。
本明細書で使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換性であり、アミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチドは、任意の長さのものであってよい。それは分枝状または直鎖状であってもよく、それは非アミノ酸によって中断され、それは改変アミノ酸を含んでもよい。この用語はまた、例えば、アセチル化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ペグ化、ビオチン化、架橋、および／またはコンジュゲーション（例えば、標識成分もしくはリガンドとの）によって改変されたアミノ酸ポリマーを指す。ポリペプチド配列は、本明細書では、別途指摘しない限り、従来のＮ末端からＣ末端の向きに表示される。
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、分子生物学の分野の日常的な技術を使用して作製することができる（例えば、上記で考察された標準的な教科書を参照されたい）。さらに、本質的には、任意のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、商業的供給源から入手可能である。
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」は、単一のタンパク質中に一緒に天然に存在しない２つ以上のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質断片を連結することによって作出される単一のタンパク質を指す。例えば、融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質に由来する第１のドメインと、Ｃｓｙ４タンパク質に由来する第２のドメインとを含んでもよい。融合タンパク質中にそのようなドメインを含有させる改変は、改変された部位特異的ポリペプチドに対してさらなる活性を付与することができる。これらの活性は、核酸標的配列と結合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯイル化活性、脱ＳＵＭＯイル化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を含んでもよい。融合タンパク質はまた、エピトープタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）タグ、Ｍｙｃタグ）、リポータータンパク質配列（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質）、および／または核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン）を含んでもよい。融合タンパク質はまた、活性化因子ドメイン（例えば、熱ショック転写因子、ＮＦＫＢ活性化因子）またはリプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン）を含んでもよい。Ｌｕｐｏ，Ａ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４（４）：２６８〜２７８頁（２０１３）により記載されたように、ＫＲＡＢドメインは、強力な転写抑制モジュールであり、ほとんどのＣ２Ｈ２亜鉛フィンガータンパク質のアミノ末端配列中に位置する（例えば、Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９１：４５０９〜４５１３頁（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９１：４５１４〜４５１８頁（１９９４）を参照されたい）。ＫＲＡＢドメインは、典型的には、タンパク質間相互作用によってコリプレッサータンパク質および／または転写因子に結合し、ＫＲＡＢ亜鉛フィンガータンパク質（ＫＲＡＢ−ＺＦＰ）が結合する遺伝子の転写抑制を引き起こす（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｊ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０：２０６７〜２６７８頁（１９９６）を参照されたい）。一部の実施形態では、リンカー核酸配列を使用して、２つ以上のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質断片を連結する。
本明細書で使用される場合、「部分」とは、分子の一部を指す。部分は、官能基であってもよく、または複数の官能基を有する（例えば、共通の構造的側面を有する）分子の一部を記述することができる。用語「部分」および「官能基」は、典型的には互換的に使用される；しかしながら、「官能基」は、より具体的には、いくつかの共通の化学的挙動を含む分子の一部を指してもよい。「部分」は、構造的説明として使用されることが多い。一部の実施形態では、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端（例えば、第１のステムエレメント中の非天然５’末端および／または非天然３’末端）。
本明細書で使用される用語「アフィニティータグ」は、典型的には、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のポリヌクレオチド成分の結合親和性を増加させて、例えば、ＮＡＳＣ複合体の形成を容易にする１つまたはそれ以上の部分を指す。本発明の一部の実施形態は、１つまたはそれ以上のアフィニティータグを含むポリヌクレオチド配列である、「アフィニティー配列」を使用する。本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチド成分は、５’末端、３’末端に位置するか、または５’末端と３’末端の間に位置するアフィニティー配列をさらに含む。本発明の一部の実施形態は、Ｃａｓタンパク質配列（例えば、Ｃａｓ９タンパク質配列）のＮ末端に、Ｃａｓタンパク質配列のＣ末端に、Ｃａｓタンパク質配列のＮ末端とＣ末端の間に位置する位置に、またはその組合せに、１つまたはそれ以上のアフィニティータグを導入する。本発明の一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、アフィニティータグまたはアフィニティー配列を用いて改変される。様々なアフィニティータグが、２０１４年１０月２３日に公開された米国特許出願公開第２０１４−０３１５９８５号に開示されている。
本明細書で使用される場合、「架橋」は、あるポリマー鎖（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を別のものに連結する結合である。そのような結合は、共有結合またはイオン結合であってもよい。一部の実施形態では、あるポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドを架橋することによって別のポリヌクレオチドに結合することができる。他の実施形態では、ポリヌクレオチドを、ポリペプチドに架橋することができる。さらなる実施形態では、ポリペプチドをポリペプチドに架橋することができる。
本明細書で使用される用語「架橋部分」は、典型的には、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のポリヌクレオチド成分間の架橋を提供するのに好適な部分を指す。架橋部分は、アフィニティータグの別の例である。
本明細書で使用される用語「リガンド」および「リガンド結合部分」とは、ポリヌクレオチド成分の結合を容易にして、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を形成する部分を指す。リガンドおよびリガンド結合部分は、対になったアフィニティータグである。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、一般的には、生物学的細胞を指す。細胞は、生物の基本構造的、機能的および／または生物学的単位である。細胞は、１つまたはそれ以上の細胞を有する任意の生物を起源とするものであってよい。宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来細胞（例えば、作物（ダイズ、トマト、サトウダイコン、カボチャ、干し草、大麻、タバコ、オオバコ、ヤム、サツマイモ、キャッサバ、ジャガイモ、小麦、ソルガム、ダイズ、コメ、コーン、トウモロコシ、油産生性アブラナ属（例えば、油産生性ナタネおよびキャノーラ）、ワタ、サトウキビ、ヒマワリ、キビ、およびアルファルファなど）、果実、野菜、穀物、種子、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ属、ツノゴケ類、コケ類、蘚類に由来する細胞）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．ａｇａｒｄｈなど）、海藻（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞またはキノコに由来する細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）に由来する細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、または哺乳類）に由来する細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）に由来する細胞が挙げられる。さらに、細胞は、幹細胞または前駆細胞であってもよい。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」とは、自己再生の能力、すなわち、未分化状態を維持しながら、細胞分裂のいくつかの周期を経験する能力を有する細胞を指す。幹細胞は、分化全能性、多能性、マルチポテント、オリゴポテント、または分化単能性であってもよい。幹細胞は、胚性、胎児性、羊膜、成熟、または誘導多能性幹細胞であってもよい。
本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」とは、特定の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には、成熟体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の型を指す。
本明細書で使用される場合、「植物」とは、全植物、植物器官、植物組織、生殖質、種子、植物細胞、およびその子孫を指す。植物細胞としては、限定されるものではないが、種子由来細胞、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が挙げられる。植物部分としては、限定されるものではないが、根、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚、およびカルス組織）などの、分化した組織および未分化組織が挙げられる。植物組織は、植物中または植物器官、組織もしくは細胞培養物中にあってもよい。「植物器官」とは、植物の形態学的および機能的に異なる部分を構成する植物組織または組織群を指す。
本明細書で使用される「対象」とは、限定されるものではないが、ヒトならびに例えば、アカゲザル、チンパンジーおよび他のサルおよび類人猿種などの非ヒト霊長類を含む他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの農業用動物；イヌおよびネコなどの家庭用動物；ウサギ、マウス、ラットおよびモルモットなどの実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽鳥類などの、家庭用、野生、および競技用鳥類、アヒル、およびガチョウなどの鳥類などを含む、脊索動物門の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を意味するものではない。かくして、この用語は、成体、若い、および新生の個体ならびに雄性および雌性を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、対象に由来する（例えば、幹細胞、前駆細胞、または組織特異的細胞）。一部の実施形態では、対象は、非ヒト対象である。
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック生物」とは、ゲノムが遺伝的に改変された生物を指す。この用語は、子孫が遺伝子改変を有するという条件で、トランスジェニック生物の子孫（任意の世代）を含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」は、ヒトの介入によって、その天然の環境とは別に存在し、したがって、天然の生成物ではない核酸またはポリペプチドを指してもよい。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形態で存在してもよく、および／または例えば、組換え細胞などの非天然の環境中に存在してもよい。
本発明の一般的な態様では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、反復エレメント２と接続された反復エレメント１、核酸結合タンパク質結合エレメント１および核酸結合タンパク質結合エレメント２、ならびにスペーサーエレメント１およびスペーサーエレメント２を含む。
反復エレメント１および反復エレメント２は、典型的には、共有結合、非共有結合、または共有結合と非共有結合との組合せによって接続される。一部の実施形態では、反復エレメント１と反復エレメント２は、水素結合した塩基対によって接続される。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、核酸結合タンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができる。一部の実施形態では、類似する構造モチーフおよび機能的モチーフを有する２つ以上の核酸結合タンパク質を使用して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と核タンパク質複合体を形成させる。好ましい実施形態では、核酸結合タンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸結合タンパク質結合配列（「二本鎖核酸結合タンパク質」）に結合する。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／核酸結合タンパク質１／核酸結合タンパク質２複合体は、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列に優先的に結合することができる（核酸標的配列を含まないポリヌクレオチドに対して）。
図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｉ、図４Ｊ、図４Ｋ、図４Ｌ、図４Ｍ、図４Ｎ、および図４Ｏは、本発明の核酸足場の異なる型の一般例を示す。これらの図面は、足場を形成するための操作された核酸配列中の異なるエレメントの相対位置を提示する。
一部の実施形態では、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体は、以下を含む。
（ｉ）第１の末端および第２の末端を有する核酸結合タンパク質結合配列１（例えば、二本鎖核酸結合タンパク質結合配列１）を含む核酸結合タンパク質結合エレメント１、（ｉｉ）第１の末端および第２の末端を有する反復核酸配列１を含む反復エレメント１、ならびに（ｉｉｉ）核酸標的結合配列１を含むスペーサーエレメント１を含む第１の操作された核酸；ならびに
（ｉ）第１の末端および第２の末端を有する核酸結合タンパク質結合配列２（例えば、二本鎖核酸結合タンパク質結合配列２）を含む核酸結合タンパク質結合エレメント１Ｃ、（ｉｉ）第１の末端および第２の末端を有する反復核酸配列２を含む反復エレメント２、ならびに（ｉｉｉ）核酸標的結合配列２を含むスペーサーエレメント２を含む第２の操作された核酸。
反復核酸配列１と反復核酸配列１Ｃは、相補的である。反復核酸配列１Ｃは、反復核酸配列２とも呼ばれる。反復核酸配列１は、水素結合した塩基対を介して反復核酸配列１Ｃと接続される。
表２は、図４Ａ〜図４Ｏにおいて一貫して使用される一連の指標を提示する。
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図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｅ、図４Ｇ、図４Ｉ、および図４Ｋは、それぞれ、第１の操作された核酸内の領域１−１、領域１−２、および領域１−３、ならびに第２の操作された核酸内の領域２−１、領域２−２、および領域２−３の６つの異なる配置の集合に由来する一例を提示し、ここで、反復核酸配列１−１は、反復核酸配列１−１と反復核酸配列２−１との間の水素結合を介して反復核酸配列２−１と結合する。これらの図面において、第１の操作された核酸は、単一のポリヌクレオチドであり、第２の操作された核酸は、単一のポリヌクレオチドである。それぞれのポリヌクレオチドは、第１の末端および第２の末端を有する。一部の実施形態では、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である。他の実施形態では、第１の末端は３’末端であり、第２の末端は５’末端である。
図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｆ、図４Ｈ、図４Ｊ、および図４Ｌはそれぞれ、図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｅ、図４Ｇ、図４Ｉ、および図４Ｋと同じ配置を提示し、ここで、第１の操作された核酸は、水素結合によって結合した複数のポリヌクレオチド（これらの図面中では核酸配列間の複数の直線として示される）を含み、第２の操作された核酸は、水素結合を介して結合した複数のポリヌクレオチドを含む。それぞれのポリヌクレオチドは、第１の末端および第２の末端を有する。一部の実施形態では、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端であり、ここで、ポリヌクレオチド間で標準的な５’から３’の向きが維持される。他の実施形態では、第１の末端は３’末端であり、第２の末端は５’末端であり、ここで、ポリヌクレオチド間で標準的な５’から３’の向きが維持される。
図４Ｍは、３つの操作された足場形成核酸配列の複合体の例を示す。この図面において、第１、第２、および第３の操作された核酸はそれぞれ、単一のポリヌクレオチドである。第１および第２の操作された核酸は、図４Ａに提示される第１および第２の操作された核酸に対応し、第３の操作された核酸は、図４Ｇの第２の操作された核酸に対応する。
図４Ｎは、足場を形成する３つの操作された核酸配列の複合体の例を示す。この図面において、第１および第３の操作された核酸はそれぞれ、単一のポリヌクレオチドである。第２の操作された核酸は、水素結合を介して結合した複数のポリヌクレオチドを含む。第１の操作された核酸は、図４Ｃに提示される第１の操作された核酸に対応する。第２の操作された核酸は、図４Ｄに提示される第２の操作された核酸に対応する。第３の操作された核酸は、図４Ｅの第２の操作された核酸に対応する。
図４Ｏは、足場を形成する３つの操作された核酸配列の複合体の例を示す。この図面において、第１および第３の操作された核酸はそれぞれ、単一のポリヌクレオチドである。第２の操作された核酸は、水素結合を介して結合した複数のポリヌクレオチドを含む。第１の操作された核酸は、図４Ｉに提示される第１の操作された核酸に対応する。第２の操作された核酸は、図４Ｆに提示される第２の操作された核酸に対応する。第３の操作された核酸は、図４Ｋの第２の操作された核酸に対応する。
本発明は、２つ以上の操作された核酸配列の複合体から構成される様々な核酸に基づく足場を含む。好ましい実施形態では、操作された核酸配列は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ核酸標的化核酸のエレメント、例えば、２型−ｃｒＲＮＡ、２型ＣＲＩＳＰＲ−ｔｒａｃｒＲＮＡ、および２型ＣＲＩＳＰＲシングルガイドＲＮＡの配列に基づく核酸配列をコードするエレメントを含む。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ関連エレメントの例としては、限定されるものではないが、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、および図３Ｂに提示されるエレメントが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸足場は、限定されるものではないが、ゲノム編集系（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）と関連するものなどの核酸タンパク質結合配列を含む。核酸タンパク質結合配列の例としては、限定されるものではないが、以下の核酸結合タンパク質：２型ＣＲＩＳＰＲ核酸結合タンパク質（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、ｄＣｐｆ１タンパク質（触媒的に不活性）、Ｃａｓ９タンパク質、および／またはｄＣａｓ９タンパク質（触媒的に不活性））；Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質；二本鎖核酸結合タンパク質（例えば、Ｃｓｙ４タンパク質および／またはＣｓｙ４＊タンパク質（触媒的に不活性）；例えば、Ｈａｕｒｗｉｔｚ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９９７）：１３５５〜１３５８頁（２０１０）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．ら、ＲＮＡ １８（４）：６６１〜６７２頁（２０１２）；米国特許第９，１１５，３４８号を参照されたい）；一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ｐ１９ ｓｉＲＮＡ結合タンパク質）；一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、アデノウイルスＤＢＰ、超熱安定性ＳＳＢ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質））；二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＩＣＥＲ）；二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）；および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（例えば、リボヌクレアーゼＨ）；ならびにその触媒的に不活性なバージョンと結合したものが挙げられる。さらなる実施形態では、核酸足場および結合した核酸結合タンパク質は、核酸足場／核酸結合タンパク質複合体、例えば、核タンパク質複合体およびリボ核タンパク質複合体中にある。
一部の実施形態では、１−２、２−２、および／または３−２の核酸結合タンパク質結合配列はそれぞれ、例えば、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質結合配列、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質結合配列、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質結合配列である。好ましい実施形態では、核酸結合タンパク質結合配列に結合する核酸結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である。
特定の実施形態では、核酸配列１−１、核酸配列１−２、および／または核酸配列１−３はそれぞれ、標的核酸配列（例えば、スペーサーエレメント）に結合する核酸配列を含む。
本発明の第１の態様では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を含む。ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２複合体は、反復エレメント２と接続された反復エレメント１、二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメント１および二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメント２、ならびにスペーサーエレメント１およびスペーサーエレメント２を含む。ＮＡＳＣに結合することができる二本鎖核酸結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質である。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、２つのクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２はそれぞれ、２つのクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができる（例えば、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、および図５Ｇ）。
本発明の第１の態様では、反復エレメント１は反復核酸配列１を含み、反復エレメント２は反復核酸配列１Ｃを含み、核酸結合タンパク質結合エレメント１は二本鎖核酸結合タンパク質結合配列１を含み、核酸結合タンパク質結合エレメント２は二本鎖核酸結合タンパク質結合配列２を含み、スペーサーエレメント１は核酸標的結合配列１を含み、スペーサーエレメント２は核酸標的結合配列２を含む。
エレメントの配置は、典型的には以下の通りである：（ｉ）反復エレメント１は核酸結合タンパク質結合エレメント１の５’側にあり、核酸結合タンパク質結合エレメント１はスペーサーエレメント１の５’側にあり、反復エレメント２は核酸結合タンパク質結合エレメント２の５’側にあり、核酸結合タンパク質結合エレメント２はスペーサーエレメント２の５’側にある；または（ｉｉ）核酸結合タンパク質結合エレメント１は反復エレメント１の５’側にあり、反復エレメント１はスペーサーエレメント２の５’側にあり、核酸結合タンパク質結合エレメント２は反復エレメント２の５’側にあり、反復エレメント２はスペーサーエレメント２の５’側にある；または（ｉｉｉ）核酸結合タンパク質結合エレメント１はスペーサーエレメント１の５’側にあり、スペーサーエレメント１は反復エレメント１の５’側にあり、核酸結合タンパク質結合エレメント２はスペーサーエレメント２の５’側にあり、スペーサーエレメント２は反復エレメント２の５’側にある。
第１の態様の一部の実施形態では、（ｉ）核酸結合タンパク質結合エレメント１は、第１のステムエレメント核酸配列１−１および第１のステムエレメント核酸配列１−２を含み、第１のステムエレメント核酸配列１−１と第１のステムエレメント核酸配列１−２は水素結合した塩基対を介して第１のステムエレメント１を形成する、ならびに／または（ｉｉ）核酸結合タンパク質結合エレメント２は、第１のステムエレメント核酸配列２−１および第１のステムエレメント核酸配列２−２を含み、第１のステムエレメント核酸配列２−１と第１のステムエレメント核酸配列２−２は水素結合した塩基対を介して第１のステムエレメント１を形成する（例えば、図５Ｂ、図５Ｆ、図５Ｇ）。さらなる実施形態では、第１のステムエレメント核酸配列１−１と第１のステムエレメント核酸配列１−２は、ループエレメント核酸配列１によって接続されて、第１のステムループエレメント１を形成する、および／または第１のステムエレメント核酸配列２−１と第１のステムエレメント核酸配列２−２は、ループエレメント核酸配列２によって接続されて、第１のステムループエレメント２を形成する（例えば、図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ）。
さらなる実施形態では、反復核酸配列１は、反復核酸配列１と反復核酸配列１Ｃとの間の水素結合した塩基対を介して反復核酸配列１Ｃと接続される。
他の実施形態では、反復核酸配列１はアフィニティータグ１をさらに含み、反復核酸配列２はアフィニティータグ２をさらに含み、アフィニティータグ１はアフィニティータグ２と接続される。例えば、反復核酸配列１は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１をさらに含み、反復核酸配列２はエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２をさらに含み、エフェクター結合部位１は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１とエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２との間の水素塩基対結合によって形成される。エフェクター結合部位の一例は、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位である。
表３は、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、および図５Ｉにおいて一貫して使用される一連の指標を提示する。
Figure 0006707133
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図５Ａは、本発明の足場を形成する２つの操作された核酸（ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２）の例を提示する。一部の実施形態では、操作された核酸は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ核酸標的化核酸、例えば、Ｃｐｆ１核酸標的化核酸の５’末端に共有結合した反復核酸配列を含むＣｐｆ１核酸標的化核酸である。図５Ａの５００〜５０７は、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列（図５Ａ、５０４〜５０１）、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’側に位置する核酸標的結合配列１（図５Ａ、５００〜５０１）、および第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’側に位置する第１の反復配列１（図５Ａ、５０４〜５０７）を含む第１の操作された核酸を示す。図５Ａの５０８〜５１５は、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列（図５Ａ、５１４〜５１１）、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’側に位置する核酸標的結合配列２（図５Ａ、５１５〜５１４）、および第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’側に位置する第１の反復配列２（図５Ａ、５１１〜５０８）を含む第２の操作された核酸を示す。
第１の操作された核酸および第２の操作された核酸は、エフェクタータンパク質結合配列、例えば、水素結合相互作用を介する反復核酸配列１（図５Ａ、５０５〜５０６）と反復核酸配列１Ｃ（図５Ａ、５０９〜５１０）との結合によって作出される二本鎖核酸結合タンパク質結合部位（例えば、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位）などのさらなるエレメントを含んでもよい。
図５Ｂは、第１の操作された核酸のループエレメント核酸配列１（図５Ａ、５０２〜５０３）および第２の操作された核酸のループエレメント核酸配列２（図５Ａ、５１３〜５１２）が存在しない、図５Ａに示される例の改変を示す。
図５Ｃは、本発明の足場を形成する２つの操作された核酸の例（ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２）を提示する。一部の実施形態では、操作された核酸は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ核酸標的化核酸、例えば、Ｃｐｆ１核酸標的化核酸の３’末端に共有結合した反復核酸配列を含むＣｐｆ１核酸標的化核酸である。図５Ｃは、反復配列が第１の操作された核酸（図５Ｃ、５００〜５０７）の３’末端（図５Ｃ、５００）に付加され、相補的反復配列が第２の操作された核酸（図５Ｃ、５０８〜５１５）の３’末端（図５Ｃ、５１５）に付加された、操作された核酸の改変を示す。第１の操作された核酸の反復配列と、第２の核酸の相補的反復配列は、水素塩基対結合を介して相互作用する。
図５Ｄは、図５Ａに示されたＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２の改変を提示する。図５Ｄにおいて、それぞれのＣｐｆ１核酸標的化核酸の５’末端に共有結合した反復核酸配列は、リンカーエレメント核酸配列によって隔てられた２つの反復エレメントを含み、ここで、図５Ｄの２つの反復エレメントの一方のみ、Ｉが、図５Ｄの一方の反復エレメント、ＩＩと相補的であり、水素結合を形成することができる。図５Ｄは、第１の操作された核酸（図５Ｄ、５００〜５０７）の反復配列１ｂ（図５Ｄ、５０６〜５１７）が、第２の操作された核酸（図５Ｄ、５１５〜５０８）の相補的反復配列１ｂＣ（図５Ｄ、５１９〜５１０）と水素塩基対結合を形成することができ、第１の操作された核酸の反復配列１ｂと、第２の操作された核酸の相補的反復配列１ｂＣが水素塩基対結合を介して相互作用する、足場を形成する２つの操作された核酸のバージョンを示す。
図５Ｅは、図５Ｄの２つの操作された核酸の２つのセットに基づく足場を形成する４つの操作された核酸の例を提示する。この図面において、図５Ｅ、Ｉおよび図５Ｅ、ＩＩは、図５Ｄ（すなわち、図５Ｄ、Ｉ、およびＩＩ）に示された２つの操作された核酸との比較を容易にする参照点を提供する。図５Ｅは、図５Ｄに示される例の改変バージョンを示し、ここで、第１の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、Ｉ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−１）は、水素塩基対結合を介して第２の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−２）と相互作用し、第２の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＩ）は、水素塩基対結合を介して第３の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＩＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−３）と相互作用し、第３の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＩＩ）は、水素塩基対結合を介して第４の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＶ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−４）と相互作用し、第４の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、ＩＶ）は、水素塩基対結合を介して第１の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｅ、Ｉ）と相互作用する。
図５Ｆは、図５Ｄに示された例の改変バージョンを示し、ここで、ループエレメント核酸配列（図５Ｄ、５０２〜５０３および図５Ｄ、５１３〜５１２）は、第１の操作された核酸配列（図５Ｆ、ＶＩＩＩおよび図５Ｆ、Ｖ）、第２の操作された核酸配列（図５Ｇ、ＶＩ）、第３の操作された核酸配列（図５Ｇ、ＶＩ）、および第４の操作された核酸配列（図５Ｇ、ＶＩＩ）中に存在しない。
図５Ｇは、図５Ｆの２つの操作された核酸の２つのセットに基づく足場を形成する４つの操作された核酸の例を提示する。この図面において、図５Ｇ、Ｖおよび図５Ｇ、ＶＩＩＩは、図５Ｆ（すなわち、図５Ｆ、ＶおよびＶＩＩＩ）に示された２つの操作された核酸との比較を容易にする参照点を提供する。図５Ｇは、図５Ｆに示された例の改変バージョンを示し、ここで、第１の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、Ｖ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−１）は、水素塩基対結合を介して第２の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−２）と相互作用し、第２の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−２）は、水素塩基対結合を介して第３の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−３）と相互作用し、第３の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩＩ）は、水素塩基対結合を介して第４の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩＩＩ；ＮＡＳＣ−ＰＣ−４）と相互作用し、第４の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、ＶＩＩＩ）は、水素塩基対結合を介して第１の操作された核酸の反復エレメント（図５Ｇ、Ｖ）と相互作用する。
本発明の第１の態様の他の実施形態では、核タンパク質複合体を、核酸標的結合配列１、反復核酸配列１、反復核酸配列２、および核酸標的結合配列１を含む高分子に結合する核酸結合タンパク質によって形成させることができる（例えば、図５Ｈ、図５Ｉ）。
図５Ｈは、足場を形成する２つの操作された核酸のバージョンを示し、ここで、第１の操作された核酸ＩＸ（図５Ｈ、５００〜５０２；ＮＡＳＣ−ＰＣ１）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列１−１ｂ（図５Ｈ、５２０〜５０２）は、第２の操作された核酸Ｘ（図５Ｈ、５１５〜５１３；ＮＡＳＣ−ＰＣ２）の相補的クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列２−１ｂ（図５Ｈ、５１４〜５２１）と水素塩基対結合することができ、第１の操作された核酸のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列１−１ｂと、第２の操作された核酸の相補的クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列２−１ｂは、水素塩基対結合を介して相互作用する。ハーフステム配列の特定の対の間の配列特異的ハイブリダイゼーションを提供するのに十分なものであるハーフステム配列間の配列変化が可能であるが、それは、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位認識が、二次構造が維持されるという条件で、そのような配列変化に耐えるからである。
図５Ｉは、図５Ｈに示された例の改変バージョンを示し、ここで、第１の操作された核酸（図５Ｉ、ＩＸ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列は、第２の操作された核酸（図５Ｉ、Ｘ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列と相互作用し；第２の操作された核酸（図５Ｉ、Ｘ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列は、第３の操作された核酸（図５Ｉ、ＸＩ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列と相互作用し；第３の操作された核酸（図５Ｉ、ＸＩ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列は、第４の操作された核酸（図５Ｉ、ＸＩＩ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列と相互作用し；第４の操作された核酸（図５Ｉ、ＸＩＩ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列は、第１の操作された核酸（図５Ｉ、ＩＸ）のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合部位ハーフステム配列と相互作用する。
本発明の第２の態様では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、少なくともＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を含む。ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２複合体は、反復エレメント２に接続された反復エレメント１、二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメント１および二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメント２、ならびにスペーサーエレメント１およびスペーサーエレメント２を含む。本発明の実施形態は、１つまたはそれ以上のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に対応する二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメントを含むＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む。
一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、２つのクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と結合して核タンパク質複合体を形成することができる。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｋ、図６Ｌ、および図６Ｍは、典型的には、核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む本発明の操作された核酸足場のエレメントおよび例を示す。
表４は、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、および図６Ｇにおいて一貫して使用される一連の指標を提示する。
Figure 0006707133
Figure 0006707133
第１、第２および第３のエレメントはそれぞれ、例えば、エレメントの５’側、エレメントの３’側、またはエレメントの５’側とエレメントの３’側の両方に、さらなる核酸配列を含んでもよい。
第１、第２および第３のエレメントはそれぞれ、例えば、エレメントの５’側、エレメントの３’側、またはエレメントの５’側とエレメントの３’側の両方に、さらなる核酸配列を含んでもよい。
図６Ａ、６０１〜６１１は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質配列を含む第１のエレメント（図６Ａ、６０１〜６０７）、反復核酸配列を含む第２のエレメント（図６Ａ、６０８〜６０９）、および核酸配列１を含む第３のエレメント（図６Ａ、６１０〜６１１）を含む第１の操作された核酸の例を示す。反復核酸配列１内の核酸配列は、反復核酸配列１内のいずれの核酸配列とも結合せず、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に結合することができる水素結合を介してステムエレメントを形成する。
図６Ｂは、図６Ａの改変を示し、ここで、第１の操作された核酸（図６Ｂ、６０１〜６１１）は、反復核酸配列１（図６Ａ、６０８〜６０９）と、反復核酸配列１Ｃ（図６Ａ、６１９〜６２０）との間の水素塩基対結合を介して第２の操作された核酸（図６Ｂ、６１２〜６２２）と結合する。
図６Ｂに示された組成物と類似するＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質と共に使用するために構築して、核タンパク質複合体を形成させることができる。この型のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の例は、図１０Ｖに示される。
図６Ｃは、第１の操作された核酸の例を示し、ここで、第２のエレメントは、３’から５’の向きに、リンカーエレメント核酸配列１−１（図６Ｃ、６０８〜６２３）、反復核酸配列１ａ（図６Ｃ、６２３〜６２４）、リンカーエレメント核酸配列１−２（図６Ｃ、６２４〜６２５）、反復核酸配列１ｂ（図６Ｃ、６２５〜６２６）、およびリンカーエレメント核酸配列１−３（図６Ｃ、６２６〜６０９）をさらに含む。反復核酸配列１内の核酸配列は反復核酸配列１内のいずれの核酸配列とも結合せず、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に結合することができる水素結合を介してステムエレメントを形成する。
図６Ｄは、２つの操作された核酸が足場を形成する図６Ｃの改変を示し、ここで、第１の操作された核酸は、反復核酸配列１ａ（図６Ｄ、６２３〜６２４）と反復核酸配列１ａＣ（図６Ｄ、６２９〜６３０）との間の水素塩基対結合を介して、および反復核酸配列１ｂ（図６Ｄ、６２５〜６２６）と反復核酸配列１ｂＣ（図６Ｄ、６２７〜６２８）との間の水素塩基対結合を介して、第２の操作された核酸と結合する。
図６Ｅは、第１の操作された核酸の例を示し、ここで、第２のエレメントは、３’から５’の向きに、リンカーエレメント核酸配列１−１（図６Ｃ、６０８〜６２３）、反復核酸配列１ａ１（図６Ｃ、６２３〜６３１）、バルジ核酸配列（図６Ｅ、６３１〜６３２）、反復核酸配列１ａ２（図６Ｅ、６３２〜６２４）、リンカーエレメント核酸配列１−２（図６Ｃ、６２４〜６２５）、反復核酸配列１ｂ１（図６Ｄ、６２５〜６３３）、バルジ核酸配列１ｂ１（図６Ｅ、６３３〜６３４）、および反復核酸配列１ｂ２（図６Ｅ、６３４〜６２６）をさらに含む。反復核酸配列１内の核酸配列は反復核酸配列１内のいずれの核酸配列とも結合せず、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に結合することができる水素結合を介してステムエレメントを形成する。
図６Ｆは、２つの操作された核酸が足場を形成する図６Ｅの改変を示し、ここで、第１の操作された核酸は、反復核酸配列１ａ１（図６Ｆ、６２３〜６３１）と反復核酸配列１ａ１Ｃ（図６Ｆ、６３８〜６３０）との間の水素塩基対結合を介して、反復核酸配列１ａ２（図６Ｆ、６３２〜６２４）と反復核酸配列１ａ２Ｃ（図６Ｆ、６２９〜６３７）との間の水素塩基対結合を介して、反復核酸配列１ｂ１（図６Ｆ、６２５〜６３３）と反復核酸配列１ｂ１Ｃ（図６Ｆ、６３６〜６２８）との間の水素塩基対結合を介して、および反復核酸配列１ｂ２（図６Ｆ、６３４〜６２６）と反復核酸配列１ｂ２Ｃ（図６Ｆ、６２７〜６３５）との間の水素塩基対結合を介して、第２の操作された核酸と結合する。
図６Ｇは、図６Ｆに示されたＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の変化である。リンカーエレメント核酸配列１−２は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１（図６Ｇ、６４７〜６４８）の挿入によって改変され、リンカーエレメント核酸配列２−２は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列２（図６Ｇ、６４９〜６５０）の挿入によって改変される。エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１とエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２は接続して、水素結合した塩基対を介してエフェクタータンパク質結合部位を形成する。一実施形態では、エフェクタータンパク質結合部位は、Ｃｓｙ４結合部位である。酵素的に不活性な形態のＣｓｙ４タンパク質は、その部位に結合して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物構造をさらに安定化することができる。酵素的に活性な形態のＣｓｙ４タンパク質は、その部位に結合して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物構造を脱安定化する（例えば、エンドリボヌクレアーゼ活性による）ことができる（例えば、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／核酸結合タンパク質に基づくクローズドケージ構造の破壊を誘導する）。図６Ｋは、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オルソログタンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オルソログタンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を示す。図６Ｋは、ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を含むＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を示す。ＮＡＳＣ−ＰＣ１（図６Ｋ、ＩＸ）は、５’から３’の方向に、核酸標的結合配列１；反復核酸配列１ａ、反復核酸配列１ｂ、反復核酸１ｃ、および反復核酸１ｄを含むリンカー核酸配列１；ならびにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９核酸結合タンパク質結合配列１を含む。ＮＡＳＣ−ＰＣ２（図６Ｋ、Ｘ）は、５’から３’の方向に、核酸標的結合配列２；反復核酸配列１ｄＣ、反復核酸配列１ｃＣ、反復核酸１ｂＣ、および反復核酸配列１ａＣを含むリンカー核酸配列１；ならびにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９核酸結合タンパク質結合配列１を含む。ＮＡＳＣ−ＰＣ１とＮＡＳＣ−ＰＣ２は、反復核酸配列１ａ／反復核酸配列１ａＣ、反復核酸配列１ｂ／反復核酸配列１ｂＣ、反復核酸配列１ｃ／反復核酸１ｃＣ、および反復核酸配列１ｄ／反復核酸１ｄＣの間で水素結合した塩基対を介して接続して、高分子を形成する。高分子は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質（反復核酸配列１ｄ／反復核酸配列１ｄＣ領域および反復核酸配列１ｃ／反復核酸配列１ｃＣ領域のあたりで）およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質（反復核酸配列１ｂ／反復核酸配列１ｂＣ領域、反復核酸配列１ａ／反復核酸配列１ｂＣ領域のあたりで）に結合することができる。そのようなＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９オルソログタンパク質複合体の使用は、例えば、Ｃａｓ９オルソログタンパク質間のＰＡＭ変動性を考慮して利用可能な標的配列数の増加（いずれかのＣａｓ９オルソログのみを含む１つのガイド核酸／Ｃａｓ９タンパク質複合体の使用に対して）を提供する。さらに、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９オルソログタンパク質複合体は、Ｃａｓ９オルソログタンパク質間のＰＡＭ変動性を考慮して近隣の標的配列を選択する際により高い可撓性を提供することによってポリヌクレオチド領域の標的化の特異性を改善することができる（いずれかのＣａｓ９オルソログのみを含む１つのガイド核酸／Ｃａｓ９タンパク質複合体の使用に対して）。本明細書の教示を考慮して、当業者であれば、本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の異なる成分を組み合わせることにより、２つ以上の異なるＣａｓ９オルソログタンパク質のこの使用に適用することができる。
さらなる実施形態では、ＮＡＳＣ−ＰＣ１（図６Ｋ、ＩＸ）およびＮＡＳＣ−ＰＣ２（図６Ｋ、Ｘ）は、同じクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オルソログタンパク質と結合することができる（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（４）：２５７７〜２５９０頁（２０１４）を参照されたい）。この実施形態では、反復核酸配列１ｄ／反復核酸配列１ｄＣ領域、および反復核酸配列１ｃ／反復核酸配列１ｃＣ領域は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と結合することができ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と結合することもできる。反復核酸配列１ｂ／反復核酸配列１ｂＣ領域、および反復核酸配列１ａ／反復核酸配列１ａＣ領域は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と結合することができ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と結合することもできる。例えば、ＮＡＳＣ−ＰＣ１（図６Ｋ、ＩＸ）およびＮＡＳＣ−ＰＣ２（図６Ｋ、Ｘ）の反復領域はクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含有する異なる種（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｍｕｔａｎｓ）に由来するが、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９複合体を形成するために、一方のみのクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質またはＳ．ｍｕｔａｎｓクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質）が使用される。この型のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つの利点は、同じＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と共に２つのＣａｓ９タンパク質のいずれかを使用するための可撓性であり、Ｃａｓ９タンパク質はそれぞれ、異なるＰＡＭ配列を認識する。かくして、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物によって標的化することができる可能な結合部位数が増加する。
本発明の第２の態様の一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、少なくとも３つのポリヌクレオチドを含み、ここで、複合体は、反復エレメント１Ｃに接続された反復エレメント１、反復エレメント２Ｃに接続された反復エレメント２、反復エレメント３Ｃに接続された反復エレメント３、二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメント１、スペーサーエレメント１、スペーサーエレメント２、およびスペーサーエレメント３を含み、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、３つの核酸結合タンパク質に結合することができる。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸結合タンパク質である。好ましい実施形態では、核酸結合タンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。
表５は、図６Ｈおよび図６Ｉにおいて使用される一連のさらなる指標を提示する。
Figure 0006707133
図６Ｈは、３つの操作された核酸が足場を形成する図６Ｃの改変を示し、ここで、第１の操作された核酸（図６Ｈ、Ｉ）は、反復核酸配列１ｂ（図６Ｈ、６２５〜６２６）と反復核酸配列１ｂＣ（図６Ｈ、６２７〜６２８）との間の水素塩基対結合を介して第２の操作された核酸（図６Ｈ、ＩＩ）と結合し、第２の操作された核酸（図６Ｈ、ＩＩ）は、反復核酸配列２ａ（図６Ｈ、６５１〜６５２）と反復核酸配列２ａＣ（図６Ｈ、６５５〜６５６）との間の水素塩基対結合を介して第３の操作された核酸（図６Ｈ、ＩＩＩ）と結合し、第３の操作された核酸（図６Ｈ、ＩＩＩ）は、反復核酸配列１ａＣ（図６Ｈ、６５７〜６５８）と反復核酸配列１ａ（図６Ｈ、６２３〜６２４）との間の水素塩基対結合を介して第１の操作された核酸（図６Ｈ、Ｉ）と結合する。
図６Ｉは、３つの操作された核酸が図６Ｅに記載の操作された核酸を使用して足場を形成する図６Ｅの改変を示し、ここで、第１の操作された核酸（図６Ｉ、ＩＶ）は、反復配列間の水素塩基対結合を介して第２の操作された核酸（図６Ｉ、Ｖ）と結合し、第２の操作された核酸（図６Ｉ、Ｖ）は、反復配列間の水素塩基対結合を介して第３の操作された核酸（図６Ｉ、ＶＩ）と結合し、第３の操作された核酸（図６Ｉ、ＶＩ）は、反復配列間の水素塩基対結合を介して第１の操作された核酸（図６Ｉ、ＩＶ）と結合する。
図６Ｊは、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質およびクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を示す。
図６Ｊは、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質およびクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質と結合して、核タンパク質複合体を形成することができるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を示す。図６Ｊは、スペーサーエレメント１およびスペーサーエレメント２を含むＮＡＳＣ−ＰＣ１を含むＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物（ＮＡＳＣ−ＰＣ−２ＴＳ；図６Ｊ、ＶＩＩ）を示す。ＮＡＳＣ−ＰＣ−２ＴＳは、５’から３’の方向に、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９核酸標的結合配列１；反復核酸配列１ａ、反復核酸配列１ｂ、および反復核酸配列１ｃを含むリンカー核酸配列１；ならびにクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１核酸標的結合配列１を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９核酸結合タンパク質結合配列１およびクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１核酸結合タンパク質結合配列２を含む連結を含むＮＡＳＣ−ＰＣ２をさらに含む（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ；図６Ｊ、ＶＩＩＩ）。ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥは、反復核酸配列１ａＣ、反復核酸配列１ｂＣ、および反復核酸配列１ｃＣをさらに含み、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥは、水素結合した塩基対を介してＮＡＳＣ−ＰＣ−２ＴＳに接続されて、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質およびクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１タンパク質に結合することができる高分子を形成する。そのようなＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９タンパク質／Ｃｐｆ１タンパク質複合体の使用は、例えば、ＰＡＭ変動性およびＣａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質との間の標的配列の長さの差異を考慮して、利用可能な標的配列数の増加を提供する（いずれかのＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質のみを含む１つのガイド核酸／Ｃａｓタンパク質複合体の使用に対して）。さらに、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９タンパク質／Ｃｐｆ１タンパク質複合体は、ＰＡＭ変動性およびＣａｓ９タンパク質とＣｐｆ１タンパク質との間の標的配列の長さを考慮して、近隣の標的配列を選択する際により高い可撓性を提供することによって、ポリヌクレオチド領域の標的化の特異性を改善することができる（いずれかのＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質のみを含む１つのガイド核酸／Ｃａｓタンパク質複合体の使用に対して）。本明細書の教示を考慮して、当業者であれば、本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の異なる成分を組み合わせることにより２つ以上の異なるＣａｓタンパク質のこの使用を適用することができる。
他の実施形態では、対の第１の反復核酸配列は第１のアフィニティータグをさらに含み、対の第２の反復核酸配列は第２のアフィニティータグをさらに含み、第１のアフィニティータグは第２のアフィニティータグと接続される。例えば、反復核酸配列１はエフェクタータンパク質結合部位核酸配列１をさらに含み、反復核酸配列２はエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２をさらに含み、エフェクター結合部位１は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１とエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２との間の水素塩基対結合によって形成される。エフェクター結合部位の一例は、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位である。
本発明の第３の態様では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、操作された連結核酸成分（「ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＴ」）ならびに少なくともＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を含む。
本発明の第３の態様の一実施形態では、操作されたＮＡＳＣポリヌクレオチド連結エレメント（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ）は、３’から５’の方向に、核酸結合タンパク質結合エレメント１を含む第１の連結エレメント１、および反復エレメントＡ１を含む第２の連結エレメント１を含み、ここで、反復エレメントＡ１は、反復核酸配列Ａ１；核酸結合タンパク質結合エレメント２を含む第１の連結エレメント２；および反復エレメント２を含む第２の連結エレメント２を含み、反復エレメント２は、反復核酸配列Ａ２を含む。第１の連結エレメント１は第２の連結エレメント１に接続され、第２の連結エレメント１は第１の連結エレメント２に接続され、第１の連結エレメント２は第２の連結エレメント２に接続されて、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥを形成する。
第３の連結エレメント１（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ３−１）は、３’から５’の方向に、反復核酸配列Ａ１Ｃを含む反復エレメントＡ１Ｃ、および核酸標的結合配列１を含むスペーサーエレメント１を含む。第３の連結エレメント２（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ３−２）は、３’から５’の方向に、反復核酸配列Ａ２Ｃを含む反復エレメントＡ２Ｃ、および核酸標的結合配列２を含むスペーサーエレメント２を含む。反復核酸配列Ａ１は反復核酸配列Ａ１−Ｃと接続され、反復核酸配列Ａ２は反復核酸配列Ａ２−Ｃと接続されて、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥを形成する。
第１の核酸結合タンパク質は、核酸結合タンパク質結合エレメント１に結合することができ、第２の核酸結合タンパク質は、核酸結合タンパク質結合エレメント２に結合することができる。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質結合エレメントは、二本鎖核酸結合タンパク質に結合する二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメントである。
さらなる実施形態では、対の第１の反復核酸配列は、水素結合した塩基対を介して対の第２の反復核酸配列と接続される。
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈ、および図７Ｉは、本発明の操作された連結核酸足場のエレメントおよび例を示す。
表６は、図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆ、図７Ｇ、図７Ｈ、および図７Ｉにおいて一貫して使用される一連の指標を提示する。
Figure 0006707133
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第１、第２および第３のエレメントはそれぞれ、例えば、エレメントの５’側、エレメントの３’側、またはエレメントの５’側とエレメントの３’側の両方に、さらなる核酸配列を含んでもよい。
図７Ａ、７００〜７１７は、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質配列（図７Ａ、７００〜７０６）を含む第１の連結エレメント１、反復核酸配列Ａ１を含む第２の連結エレメント１（図７Ａ、７０７〜７０８）、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質配列（図７Ａ、７１０〜７１４）を含む第１の連結エレメント２（図７Ａ、７０９〜７１４）、反復核酸配列Ａ２（図７Ａ、７１５〜７１６）を含む第２の連結エレメント２（図７Ａ、７１５〜７１７）、ならびに反復核酸配列Ａ１Ｃ（図７Ａ、７１８〜７１９）および核酸標的結合配列１（図７Ａ、７２０〜７２１）を含む第３の連結エレメント１（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ３−１；図７Ａ、７１８〜７２１）、ならびに反復核酸配列Ａ２Ｃ（図７Ａ、７２２〜７２３）および核酸標的結合配列２（図７Ａ、７２４〜７２５）を含む第３の連結エレメント２（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ３−２；図７Ａ、７２２〜７２５）を含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥの例を示す。１つまたはそれ以上の反復核酸配列は、クラスＩＩ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列（例えば、Ｃａｓ９タンパク質結合配列）である。反復核酸配列Ａ１は、反復核酸配列Ａ１Ｃに接続される。一実施形態では、反復核酸配列Ａ１は、水素結合した塩基対を介して反復核酸配列に接続される。
図７Ｂは、反復核酸配列Ａ１（図７Ａ、７０７〜７０８）と反復核酸配列Ａ１Ｃ（図７Ａ、７１８〜７１９）との間の水素塩基対結合によるＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ａ、７００〜７１７）と第３の連結エレメント１（図７Ａ、７１８〜７２１）との結合、および反復核酸配列Ａ２（図７Ａ、７１５〜７１６）と反復核酸配列Ａ２Ｃ（図７Ａ、７２２〜７２３）との間の水素塩基対結合によるＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ａ、７００〜７１７）と第３の連結エレメント２（図７Ａ、７２２〜７２５）との結合による足場の形成の例を示す。
図７Ｃは、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥの改変を示し、ここで、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ａ、７００〜７１７）は、反復核酸配列Ａ１−１（図７Ｃ、７２６〜７２７）、バルジ核酸配列Ａ１−１（図７Ｃ、７２７〜７２８）、反復核酸配列Ａ１−２（図７Ｃ、７２８〜７２９）および反復核酸配列Ａ２−１（図７Ｃ、７３１〜７３２）、バルジ核酸配列Ａ２−１（図７Ｃ、７３２〜７３３）、および反復核酸配列Ａ２−２（図７Ｃ、７３３〜７３４）をさらに含む。第３の連結エレメント１（図７Ｃ、７１８〜７２１）は、反復核酸配列Ａ１−１Ｃ（図７Ｃ、７１９〜７３６）、バルジ核酸配列Ａ１−１（図７Ｃ、７３６〜７３７）、および反復核酸配列Ａ１−２Ｃ（図７Ｃ、７３７〜７４８）をさらに含む。第３の連結エレメント２（図７Ｃ、７２２〜７２５）は、反復核酸配列Ａ２−１Ｃ（図７Ｃ、７２３〜７３９）、バルジ核酸配列Ａ２−１（図７Ｃ、７３９〜７４０）、および反復核酸配列Ａ２−２Ｃ（図７Ｃ、７４０〜７４１）をさらに含む。
図７Ｄは、反復核酸配列Ａ１−１（図７Ｃ、７２６〜７２７）と反復核酸配列Ａ１−１Ｃ（図７Ｃ、７１９〜７３６）との間の水素塩基対結合による、および反復核酸配列Ａ１−２（図７Ｃ、７２８〜７２９）と反復核酸配列Ａ１−２Ｃ（図７Ｃ、７３７〜７４８）との間の水素塩基対結合によるＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ｄ、７００〜７１７）と第３の連結エレメント１（図７Ｄ、７２１〜７１８）との結合；反復核酸配列Ａ２−１（図７Ｃ、７３１〜７３２）と反復核酸配列Ａ２−１Ｃ（図７Ｃ、７２３〜７３９）との間の水素塩基対結合による、および反復核酸配列Ａ２−２（図７Ｃ、７３３〜７３４）と反復核酸配列Ａ２−２Ｃ（図７Ｃ、７４０〜７４１）との間の水素塩基対結合による操作された連結エレメント１（図７Ｄ、７００〜７１７）と、第３の連結エレメント２（図７Ｃ、７２２〜７２５）との結合による足場の形成の例を示す。
図７Ｅは、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥを含む足場を作製するための４つの操作された核酸配列から形成される複合体の例を提示する。この図面において、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥは、５’末端を３’末端に連結されて、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥを形成する、図７Ｄ、７００〜７１７に示される２コピーのＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥを含む。この図面において、図７Ｄに対する参照番号は、環状連結核酸エレメントの成分を例示するのを助けるために示される。
図７Ｆは、図７Ｄに示される例の改変の実例であり、ここで、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ｆ、７００〜７１７）は、５’末端（図７Ｆ、７００〜７４４）に共有結合で連結された第１の連結エレメント３（図７Ｆ、７１７〜７４４）をさらに含む。第２の連結エレメント３は、第１の連結エレメント３と結合する（図７Ｆ、７４３〜７４４）。
図７Ｇは、図７Ｆに記載されるＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥ（図７Ｆ、７００〜７４４）の改変の例を示し、ここで、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥは、５’末端（図７Ｆ、７００〜７４７）に共有結合で連結された第４の連結エレメント（図７Ｇ、７４４〜７４７）を含む。この図面において、領域、図７Ｇ、７４４〜７４５は、図７Ｈおよび図７Ｉ中の交差線をより明らかにするために白色の囲みとして示される。この領域はまた、リンカーエレメント核酸配列を含んでもよい。
図７Ｈ、７００〜７４７は、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥの例を示し、ここで、第２の連結エレメント１（図７Ｈ、７０７〜７０８）は、水素塩基対結合を介して第３の連結エレメント１（図７Ｈ、７４４〜７４７）と結合する。
図７Ｉは、図７Ｈに示される例の改変を示し、ここで、第３の連結エレメント１は、水素塩基対結合を介してＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥと結合して、エレメントＩＩＩ（図７Ｉ、ＩＩＩ）を形成し、第４の連結エレメントは、水素塩基対結合を介してＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥと結合して、エレメントＩＶ（図７Ｉ、ＩＶ）を形成する。
本発明の第３の態様の他の実施形態では、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＣＥは、スプリットネクサスポリヌクレオチドを含む。
図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋ、図８Ｌ、図８Ｍ、および図８Ｎは、本発明の操作された連結スプリットネクサス核酸足場のエレメントおよび例を示す。
表７は、図８Ａ〜８Ｎにおいて一貫して使用される一連の指標を提示する。
Figure 0006707133
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図８Ａは、スプリットネクサスＣａｓ９関連ポリヌクレオチドの例を示す。図２Ｂは、Ｃａｓ９関連シングルガイドポリヌクレオチドの例を提示する。図８ＡのスプリットネクサスＣａｓ９関連ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９関連シングルガイドポリヌクレオチドのネクサスエレメント（図２Ｂ、２０６）内のポリヌクレオチド骨格を分割することによって生成される。図８Ａは、水素結合相互作用を介して結合していない場合の２つの得られるスプリットネクサスポリヌクレオチドを示す。図８Ｂは、水素結合相互作用を介して結合した場合のスプリットネクサスポリヌクレオチドの概観を提示する。水素結合相互作用の領域は、図８Ｂ中で破線の囲みで示される。
図８Ｃは、スプリットネクサスＣａｓ９関連ポリヌクレオチドの別の例を示す。図２Ａは、Ｃａｓ９関連シングルガイドポリヌクレオチドの例を提示する。図８ＣのスプリットネクサスＣａｓ９関連ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９関連シングルガイドポリヌクレオチドのネクサスエレメント（図２Ａ、２０６）内のポリヌクレオチド骨格を分割することによって生成される。図８Ｃは、水素結合相互作用を介して結合していない場合の２つの得られるスプリットネクサスポリヌクレオチドを示す。図８Ｄは、水素結合相互作用を介して結合した場合のスプリットネクサスポリヌクレオチドの概観を提示する。水素結合相互作用の領域は、図８Ｄ中で破線の囲みで示される。
図８Ｅは、図８Ａに示されたスプリットネクサスＣａｓ９関連ポリヌクレオチドへの補助ポリヌクレオチドの付加を示す。この図面において、第１の補助ポリヌクレオチド（図８Ｅ、８０３〜８１７）の５’末端は、スプリットネクサスエレメントの一方の半分の３’末端（図８Ｅ、８０３）に共有結合し、第２の補助ポリヌクレオチド（図８Ｅ、８０２〜８１６）の３’末端は、スプリットネクサスエレメントの他方の半分の５’末端（図８Ｅ、８０２）に共有結合する。一部の実施形態では、ただ１つの補助ポリヌクレオチドが含まれる。他の実施形態では、同じか、または異なる長さの２つの補助ポリヌクレオチドが含まれる。図８Ｅは、水素結合相互作用を介して結合していない場合の２つのスプリットネクサスポリヌクレオチドを示す。
図８Ｆは、水素結合相互作用を介して結合した場合のスプリットネクサスポリヌクレオチドの概観を提示する。水素結合相互作用の領域は、図８Ｄ、８０３〜８０４／８０１〜８０２に破線の囲みで示される。補助ポリヌクレオチドは、エフェクタータンパク質結合配列などのさらなるエレメントを含んでもよく、例えば、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位を、水素結合相互作用を介する２つの補助ポリヌクレオチドの結合によって作出することができる（例えば、水素結合相互作用のそのような領域は、図８Ｄ、８１８〜８１９〜８０４／８１４〜８１５に破線の囲みで示される）。
図８Ｇは、図８Ｃに示されたスプリットネクサスＣａｓ９結合ポリヌクレオチドへの補助ポリヌクレオチドの付加の別の例を示す。この図面において、第１の補助ポリヌクレオチド（図８Ｇ、８０３〜８１７）の５’末端を、スプリットネクサスエレメントの一方の半分の３’末端（図８Ｅ、８０３）に共有結合させ、第２の補助ポリヌクレオチド（図８Ｇ、８０２〜８１６）の３’末端を、スプリットネクサスエレメントの他方の半分（図８Ｇ、８０２）の５’末端に共有結合させる。一部の実施形態では、ただ１つの補助ポリヌクレオチドが含有される。他の実施形態では、同じか、または異なる長さの２つの補助ポリヌクレオチドが含有される。図８Ｇは、水素結合相互作用を介して結合していない場合の２つのスプリットネクサスポリヌクレオチドを示す。図８Ｈは、水素結合相互作用を介して結合した場合のスプリットネクサスポリヌクレオチドの概観を提示する。水素結合相互作用の領域は、図８Ｈ、８０３〜８０４／８０１〜８０２に破線の囲みで示される。補助ポリヌクレオチドは、エフェクタータンパク質結合配列などのさらなるエレメントを含んでもよく、例えば、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位を、水素結合相互作用を介する２つの補助ポリヌクレオチドの結合によって作出することができる（例えば、水素結合相互作用のそのような領域は、図８Ｈ、８１８〜８１９〜８０４／８１４〜８１５に破線の囲みで示される）。
一実施形態では、本発明の第３の態様は、３’から５’の方向に、核酸結合タンパク質結合エレメント１、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−１、および反復核酸配列１−１を含む反復エレメントを含む第１の連結エレメント１（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ１−１）、ならびに核酸結合タンパク質結合エレメント２、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−１、および反復核酸配列２−１を含む反復エレメントを含む第２の連結エレメント１（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ１−２）を含む、操作されたＮＡＳＣスプリットネクサスポリヌクレオチド連結エレメント（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ）ポリヌクレオチド組成物に関する。ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ１−１とＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ１−２は接続されて、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥを形成する。第２の連結エレメント１（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ２−１）は、３’から５’の方向に、反復核酸配列１−２、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−２、および第１のステムエレメント、および核酸標的結合配列１を含むスペーサーエレメント１を含む反復エレメント１を含む。第２の連結エレメント２（ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥ２−２）は、３’から５’の方向に、反復核酸配列２−２、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２、および第１のステムエレメント、および核酸標的結合配列２を含むスペーサーエレメント２を含む反復エレメント２を含む。
反復エレメント１−１は反復エレメント１−２に接続され、反復エレメント２−１は反復エレメント２−２に接続されて、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥを形成し、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは２つの核酸結合タンパク質に結合することができる。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質結合エレメントは、二本鎖核酸結合タンパク質に結合する二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメントである。さらなる実施形態では、対の第１の反復核酸配列は、水素結合した塩基対を介して対の第２の反復核酸配列と接続される。
図８Ｉは、足場を形成する図８Ｂ、８００〜８０２に示される２コピーのスプリットネクサスポリヌクレオチドを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する。この図面において、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、補助ポリヌクレオチド（図８Ｉ、８０２〜８１６）を介して第２のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｉ、８１６〜８２１）に共有結合した第１のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｉ、８００〜８０２）である。スプリットネクサスエレメントのそれぞれの第１の半分（図８Ｉ、８０１〜８０２および８２０〜８２１）は、例えば、水素結合した塩基対を介して、そのスプリットネクサスエレメントの相補的な第２の半分（それぞれ、図８Ｉ、８０３〜８０４、および８２２〜８２３）と接続される。
図８Ｊは、足場を形成する図８Ｄ、８００〜８０２に示される２コピーのスプリットネクサスポリヌクレオチドを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する。この図面において、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、補助ポリヌクレオチド（図８Ｊ、８０２〜８１６）を介して第２のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｊ、８１６〜８２１）に共有結合した第１のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｊ、８００〜８０２）である。スプリットネクサスエレメントのそれぞれの第１の半分（図８Ｊ、８０１〜８０２および８２０〜８２１）は、例えば、水素結合した塩基対を介して、そのスプリットネクサスエレメントの相補的な第２の半分（それぞれ、図８Ｊ、８０３〜８０４、および８２２〜８２３）と接続される。
図８Ｋは、足場を形成する、それぞれ補助配列を含む、図８Ｆ、８００〜８１６に示される２コピーのスプリットネクサスポリヌクレオチドを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する。この図面において、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、補助ポリヌクレオチド（図８Ｊ、８０２〜８１６）を介して第２のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｊ、８１６〜８３５）に共有結合した第１のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｋ、８００〜８１６）である。スプリットネクサスエレメントのそれぞれの第１の半分（図８Ｋ、８０１〜８０２および８２０〜８２１）は、そのスプリットネクサスエレメントの相補的な第２の半分（それぞれ、図８Ｋ、８０３〜８０４、および８２２〜８２３）と接続され、また、補助配列（図８Ｋ、８０２〜８１５および８０３〜８１８；図８Ｋ、８２１〜８３４および８２２〜８３６）によっても接続される。この接続は、例えば、水素結合した塩基対によって作製される。
図８Ｌは、足場を形成する、それぞれ補助配列を含む、図８Ｈ、８００〜８１６に示される２コピーのスプリットネクサスポリヌクレオチドを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する。この図面において、ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、補助ポリヌクレオチド（図８Ｈ、８０２〜８１６）を介して第２のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｈ、８１６〜８３５）に共有結合した第１のスプリットネクサスポリヌクレオチド（図８Ｈ、８００〜８１６）である。スプリットネクサスエレメントのそれぞれの第１の半分（図８Ｈ、８０１〜８０２および８２０〜８２１）は、そのスプリットネクサスエレメントの相補的な第２の半分（それぞれ、図８Ｈ、８０３〜８０４、および８２２〜８２３）と接続され、また、補助配列（図８Ｈ、８０２〜８１５および８０３〜８１８；図８Ｋ、８２１〜８３４および８２２〜８３６）によっても接続される。この接続は、例えば、水素結合した塩基対によって作製される。ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの２つの成分は、この図面においてＩおよびＩＩと示される。
図８Ｍは、図８Ｌに示されるエレメントＩおよびＩＩを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する。ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥを含む。この図面において、図８Ｌ、８００〜８３５に示される、２セットのエレメントＩおよびＩＩは、５’末端から３’末端に連結されて、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥを形成する。この図面において、図８Ｌに対する参照番号は、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの成分を例示するのを助けるために示される。
図８Ｎは、第１のステムエレメント核酸配列が、ループエレメント核酸配列によって連結されないことを除いて、図８Ｌに示されるエレメントＩおよびＩＩを含むＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥの例を提示する（例えば、図８Ｌ、８０６〜８０７、８２５〜８２６を参照されたい）。ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥは、環状ＮＡＳＣ−ＰＣ−ＳＣＥを含む。
他の実施形態では、対の第１の反復核酸配列は、第１のアフィニティータグをさらに含み、対の第２の反復核酸配列は、第２のアフィニティータグをさらに含み、第１のアフィニティータグは第２のアフィニティータグと接続される。例えば、第１の反復核酸配列は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１をさらに含み、第２の反復核酸配列は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列２をさらに含む。エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１は、水素結合した塩基対によってエフェクタータンパク質結合部位核酸配列２に接続されて、エフェクタータンパク質結合部位１を形成する。エフェクター結合部位の一例は、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位である。
本発明の第４の態様では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、２つ以上の異なる核酸結合タンパク質のための核酸結合タンパク質結合エレメントの組合せを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合エレメントは、二本鎖核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）に結合する二本鎖核酸結合タンパク質結合エレメントである。本発明の第４の態様の実施形態は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を形成する、第２のＮＡＴＮＡに共有結合で接続された第１のＮＡＴＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のＮＡＴＮＡは、第２のＮＡＴＮＡに共有結合で接続されて、ＮＡＳＣ−ＰＣ成分を形成し、２つの以上のＮＡＳＣ−ＰＣ成分は共有的または非共有結合で接続されて、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を形成する。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、少なくとも２つの核酸結合タンパク質に結合することができる。非共有的接続は、ＮＡＳＣ−ＰＣ成分を、水素結合した塩基対を介して接続することを含む。
図９Ａは、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を形成するように連結された２つのＮＡＴＮＡであって、（ｉ）図５Ｄ、５００〜５０７に示された操作された核酸配列のコピー（図９Ａ、Ｉ）と、（ｉｉ）シングルガイドポリヌクレオチドの３’末端に共有結合したリンカーエレメント核酸配列をさらに含む図２Ａに示されたシングルガイドポリヌクレオチドに対応する操作された核酸配列のコピー（図９Ａ、ＩＩ）とを含み、リンカーエレメント核酸配列が図５Ｄ、５００〜５０７に示された操作された核酸配列の５’末端に共有結合されて、足場を形成する、前記ＮＡＴＮＡの例を提示する。
図９Ｂは、図９Ａに示された２セットの成分の複合体の例を提示する。この図面において、図９Ａ、ＩおよびＩＩに対する参照番号は、成分を例示するのを助けるために示される。さらに、図９Ａ、ＩＩＩは、図９Ａの複合体のコア構造と、図５Ｄに提示された複合体との比較を容易にするために提供される。
図１０は、足場を形成するいくつかの異なる操作された核酸配列の複合体を提示する。この図面において、参照番号は、足場の成分を例示するのを助けるために提供される：図１０、Ｉは、図７Ｆと比較する；図１０、ＩＩは、図６Ｈと比較する；図１０、ＩＩＩは、図８Ｌと比較し；図１０、ＩＶは、図９Ａと比較し、ここで、ＩとＩＩは、共有接続の代わりに水素結合した塩基対を介して接続され；図１０、Ｖは、図５Ｈと比較する。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分間の接続の型としては、例えば、共有的結合および非共有的結合が挙げられる。
非共有的結合の一例は、水素結合である。水素結合の型は、上記で考察されている。本発明の実施形態としては、限定されるものではないが、水素結合したヌクレオチドの対における以下の型の水素結合：Ｗ−Ｃ水素結合、逆Ｗ−Ｃ水素結合、フーグスティーン水素結合、逆フーグスティーン水素結合、ゆらぎ水素結合、逆ゆらぎ水素結合、またはその組合せが挙げられる。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分は、典型的には、特に、接続が水素結合した塩基対を介するものである場合、対になった反復エレメントが互いに接続し、対になった反復エレメント間でのみ接続（例えば、水素結合）を形成することを意図されるように設計される。２つの反復エレメントの接続を阻害するそれぞれの反復エレメント内の内部構造の形成は、典型的には回避される。さらに、反復エレメントとＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の他の領域との接続（例えば、水素結合した塩基対の形成）も回避される。
共有的結合および非共有的結合に加えて、限定されるものではないが、リガンド／リガンド結合部分対、および／または架橋などの、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分間の他の型の接続を使用することができる。リガンド／リガンド結合部分対としては、限定されるものではないが、選択された核酸配列と対応するアプタマー；および核酸二次構造／核酸二次構造に結合する低分子、イオン、またはタンパク質が挙げられる。典型的には、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第１のポリヌクレオチド成分は、リガンドを含むように適合され（例えば、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第１のポリヌクレオチド成分は、その３’末端に、選択された核酸配列を含む）、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第２のポリヌクレオチド成分は、リガンド結合部分を含むように適合される（例えば、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第２のポリヌクレオチド成分は、その５’末端に、選択された核酸配列に結合するアプタマーを含む）。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分間の接続を形成するのに有用な架橋剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤（例えば、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア）および窒素マスタード）；シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）およびその誘導体）；イオン化照射；硝酸；反応性化学物質（例えば、マロンジアルデヒド）；プソラレン（ＵＶの存在下で活性化される）；ならびにアルデヒド（例えば、アクロレインおよびクロトンアルデヒド）が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、アフィニティータグを、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の２つ以上のポリヌクレオチド成分中に導入する。例えば、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つのポリヌクレオチド成分内の核酸配列を、アフィニティー配列を含むように改変することができる。核酸結合エフェクタータンパク質およびその対応するエフェクタータンパク質結合配列は、アフィニティータグの例である。アフィニティータグを、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第１のポリヌクレオチド成分中に導入することができる。アフィニティータグは、ＭＳ２結合配列、Ｕ１Ａ結合配列、ステムループ配列（例えば、Ｃｓｙ４タンパク質結合配列、もしくはＣａｓ６タンパク質結合配列）、ｅＩＦ４Ａ結合配列、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）結合配列（例えば、Ｖａｌｔｏｎ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７（４６）：３８４２７〜３８４３２頁（２０１２）を参照されたい）、または亜鉛フィンガードメイン結合配列（例えば、Ｆｏｎｔ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６４９：４７９〜４９１頁（２０１０）；Ｉｓａｌａｎ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９（７）：６５６〜６６０頁（２００１）を参照されたい）などのアフィニティー配列であってもよい。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第２のポリヌクレオチド成分を、対応するアフィニティータグ：それぞれ、ＭＳ２コード配列、Ｕ１Ａコード配列、ステムループ結合タンパク質コード配列（例えば、Ｃｓｙ４タンパク質配列に結合する酵素的に（エンドリボヌクレアーゼ）不活性なＣｓｙ４タンパク質）、ｅＩＦ４Ａコード配列、ＴＡＬＥコード配列、または亜鉛フィンガードメインコード配列を含むように改変することができる。典型的には、配列特異的核酸結合を保持する酵素的に不活性な核酸結合タンパク質が使用される（例えば、エンドリボヌクレアーゼ不活性Ｃｓｙ４タンパク質（ｄＣｓｙ４））；しかしながら、一部の実施形態では、酵素的に活性な核酸結合タンパク質または酵素活性が変化した核酸タンパク質が使用される。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の２つを超えるポリヌクレオチド成分を、アフィニティー配列を用いて改変する場合、好ましい実施形態では、２つのアフィニティー配列は、典型的には同じではない；かくして、Ｃａｓタンパク質と結合した２つの異なるアフィニティー配列が存在する。
実施例１は、操作されたＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の例示的成分の産生を記載する。実施例１は、本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のいくつかの実施形態に対応するＮＡＳＣポリヌクレオチド成分のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの設計を記載する。表９は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分と、図面に例示される構造との相関を記載する。
実施例２は、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の産生を記載する。この実施例に記載されるＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ切断アッセイにおいて使用して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物による核酸標的配列の切断パーセンテージを評価した。実施例５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓタンパク質媒介性切断アッセイの性能を記載する。実施例３および実施例４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ切断アッセイにおける使用のための二本鎖ＤＮＡ標的配列の産生のために使用することができる方法を記載する。
実施例６は、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）を使用する真核細胞中での標的改変の検出のためのディープシーケンシング分析を提示する。
実施例９は、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）を使用する真核細胞中での標的改変の検出のための代替的な分析、Ｔ７Ｅ１アッセイを提示する。
実施例７は、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を作製するために操作することができるクラス２ ｃｒＲＮＡの同定およびスクリーニングを記載する。
実施例８は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を操作するために使用することができるクラス２ ｔｒａｃｒＲＮＡの同定およびスクリーニングを記載する。
実施例１０は、クラス２ Ｖ型ガイドｃｒＲＮＡの様々な改変の生成および試験ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の構築における使用のためのその好適性を記載する。
実施例１１は、クラス２ ＩＩ型ガイドＲＮＡの様々な改変の生成および試験ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の構築における使用のためのその好適性を記載する。
実施例１２は、ヒトｇＤＮＡ中に存在する核酸標的配列を改変し、これらの部位での切断活性および切断の特異性のレベルを測定するためのＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の使用を記載する。特定の部位での切断パーセンテージおよび／または切断特異性のレベルの測定は、所望の切断パーセンテージおよび／または特異性を有する核酸標的配列を同定するための選択肢を提供することができる。
第５の態様では、本発明は、第１の核酸結合タンパク質および第２の核酸結合タンパク質と複合体化したＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物に関する。第１の核酸結合タンパク質は１つまたはそれ以上のヌクレアーゼ活性を含んでもよく、第２の核酸結合タンパク質は１つまたはそれ以上のヌクレアーゼ活性を含んでもよい。一部の実施形態では、第１の核酸結合タンパク質は、１つもしくはそれ以上のヌクレアーゼ活性について触媒的に不活性であり、第２の核酸結合タンパク質は、１つもしくはそれ以上のヌクレアーゼ活性について触媒的に不活性であるか、または第１の核酸結合タンパク質は、１つもしくはそれ以上のヌクレアーゼ活性について触媒的に不活性であり、かつ、第２の核酸結合タンパク質は、１つもしくはそれ以上のヌクレアーゼ活性について触媒的に不活性である。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質複合体の他の実施形態では、第１の核酸結合タンパク質または第２の核酸結合タンパク質のいずれかは触媒的に不活性であり、複合体を触媒的に不活性なタンパク質を介してドナーポリヌクレオチドとさらに接続することができる。好ましい実施形態では、第１の核酸結合タンパク質および第２の核酸結合タンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質）である。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物の一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質のいずれかは、触媒的に不活性であり（ｄＣａｓ９またはｄＣｐｆ１）、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、ドナーポリヌクレオチドは、Ｃｐｆ１スペーサーエレメントと相補的なヌクレオチド配列、またはＣｐｆ１スペーサーエレメントに隣接する領域、またはスペーサーエレメントと相補的なヌクレオチド配列、またはＣａｓ９スペーサーエレメントと隣接する領域を含む。ドナーポリヌクレオチドは、スペーサーエレメント、またはスペーサーエレメントに隣接する配列と相補的なドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列間の水素結合を介して、スペーサーエレメント、またはスペーサーエレメントに隣接する領域と結合することができる。
ＲｕｖＣ−１関連ヌクレアーゼ活性、ＨＮＨ関連ヌクレアーゼ活性、ＲｕｖＣ−１関連ヌクレアーゼ活性とＨＮＨ関連ヌクレアーゼ活性の両方について酵素的に不活性であるＣａｓ９タンパク質の突然変異は、当業界で公知である。酵素的に不活性であるＣｐｆ１タンパク質の突然変異は、当業界で公知である（例えば、Ｙａｍａｔｏ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ １６５（４）：９４９〜９６２頁（２０１６）；Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ １６３：１〜１３頁（２０１５）を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ系にわたって、「ガイド生合成」（「ガイドプロセシング」とも呼ばれる）は、ＣＲＩＳＰＲアレイの転写後のガイドＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼトランケーションを含む。ガイドＲＮＡの酵素的プロセシングを、ＣａｓオペロンによりコードされるＲＮａｓｅ（例えば、クラス１ Ｉ−Ｅ型系のＣａｓ６）または内因性ＲＮａｓｅ（例えば、クラス２ ＩＩ−Ａ型系のＲＮａｓｅＩＩＩ）により実行することができる。
クラス２ Ｖ型系において、ガイド生合成は、Ｃｐｆ１タンパク質ヌクレアーゼによって実行される。Ｃｐｆ１タンパク質も、配列特異的二本鎖ＤＮＡ標的切断を担う。
Ｖ型系において、プレｃｒＲＮＡの切断は、プソイドノット二次構造から上流領域（例えば、５’方向）で起こり、（例えば、図３Ａ、３０３を参照されたい）、ガイドＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの生成をもたらす。本発明の一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質がガイドｃｒＲＮＡステムエレメントの５’を切断するのを防止することは、例えば、Ｃｐｆ１媒介性切断によるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓ９タンパク質／Ｃｐｆ１タンパク質複合体の分離を防止するのに有用である。Ｖ型プレｃｒＲＮＡの配列を、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１タンパク質によるガイドＲＮＡプロセシングを防止するために改変することができることが証明されている（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５３２（７６００）：５１７〜５２１頁（２０１６）を参照されたい）。
ガイドｃｒＲＮＡステムエレメントの５’側の配列のＣｐｆ１切断を防止するための１つの方法は、Ｃｐｆ１タンパク質によるプレｃｒＲＮＡのプロセシングを防止するためのプレｃｒＲＮＡのプソイドノットの上流の領域、またはプソイドノット内の領域中の塩基の改変（例えば、塩基突然変異、挿入、欠失、または化学的改変）によるものである。ガイドプロセシングに対するそのような改変の効果を評価するために、改変されたプレｃｒＲＮＡを、好適なバッファー中、一定の期間にわたって同族Ｃｐｆ１タンパク質の存在下でインキュベートすることができる。混合物を、プロテイナーゼＫ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）で処理して、タンパク質を除去し、混合物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、改変されたプレｃｒＲＮＡの切断が起こるかどうかを評価することができる。同族Ｃｐｆ１タンパク質の存在下でインキュベートされなかったプレｃｒＲＮＡは、陽性対照（すなわち、ガイドプロセシングの非存在に関する対照）として働くことができる。プレｃｒＲＮＡの単一の改変ではガイドプロセシングを除去するのに十分でない場合、プレｃｒＲＮＡのプロセシングの減少を示す改変の組合せを、プレｃｒＲＮＡ設計中で組み合わせて、ガイドプロセシング活性の非存在について再試験することができる。プロセシングしようとする改変されたプレｃｒＲＮＡの不能性をもたらすプレｃｒＲＮＡの改変を、プレｃｒＲＮＡスペーサーエレメントを含むＤＮＡ標的核酸の配列特異的結合および／または切断を維持するＣｐｆ１−プレｃｒＲＮＡ／Ｃｐｆ１タンパク質複合体の能力についてさらに評価することができる。
ガイドｃｒＲＮＡステムエレメントの５’側の配列のＣｐｆ１切断を防止するための第２の方法は、Ｃｐｆ１タンパク質の改変によるものである。この方法では、Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸残基を改変して、ガイドプロセシングを混乱させる。ガイドｃｒＲＮＡ／Ｃｐｆ１タンパク質複合体のＸ線結晶解析により、プソイドノットが、ウェッジドメイン（ＷＥＤ）およびＲｕｖＣドメインと呼ばれる２つのタンパク質ドメインの境界面によって結合されることが示された（Ｙａｍａｎｏ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ １６５（４）：９４９〜９６２頁（２０１６）を参照されたい）。ガイドｃｒＲＮＡおよび／またはプソイドノット構造の５’末端に結合する領域に近いＣｐｆ１のアミノ酸残基は、プレｃｒＲＮＡのエンドヌクレアーゼ触媒作用に関与する可能性が高い。アラニンスクリーニング（例えば、Ｌｅｆｅｖｒｅ，Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（２）：４４７〜４４８頁（１９９７）；Ｌｅｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５０（１）：１４０〜１４８頁（１９９６）を参照されたい）などの突然変異誘発戦略を使用して、ＷＥＤおよびＲｕｖＣドメイン、またはＣｐｆ１タンパク質内の他のドメイン内の領域を改変して、ガイドｃｒＲＮＡプロセシングを担うタンパク質中の残基を同定することができる。この方法では、アラニン突然変異を含むＣｐｆ１タンパク質を発現させ、好適なバッファー中で同族プレｃｒＲＮＡと共にインキュベートすることができる。インキュベーション後、プロテイナーゼＫを反応混合物に添加して、Ｃｐｆ１タンパク質を除去し、反応混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、改変されたプレｃｒＲＮＡの切断が起こったかどうかを評価することができる。同族Ｃｐｆ１タンパク質の存在下でインキュベートされていないプレｃｒＲＮＡは、陽性対照（すなわち、ガイドプロセシングの非存在に関する対照）として働くことができる。Ｃｐｆ１タンパク質中の単一の突然変異ではガイドプロセシングを除去するのに十分ではない場合、プレｃｒＲＮＡのプロセシングの減少を示す突然変異の組合せを、単一のＣｐｆ１タンパク質構築物中で組み合わせて、ガイドプロセシング活性の非存在について再試験することができる。Ｃｐｆ１タンパク質中の候補突然変異または突然変異の組合せを、プレｃｒＲＮＡスペーサーエレメントを含むＤＮＡ標的核酸の配列特異的結合および／または切断を維持するＣｐｆ１−プレｃｒＲＮＡ複合体の能力についてさらに評価することができる。
第６の態様では、本発明は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする核酸配列、ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする核酸配列を含む発現カセット、ベクター、および組換え細胞に関する。一部の実施形態では、そのような発現カセット、ベクター、および組換え細胞は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複合体を形成することができる１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする配列をさらに含む。
本発明のさらなる実施形態は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と複合体を形成することができる核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を含む、発現ベクターなどのベクターに関する。ベクターはまた、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカーをコードする配列を含んでもよい。さらに、核標的化配列を、例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質コード配列に付加することもできる。ベクターはまた、タンパク質タグ（例えば、ポリ−Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質タグ、生物発光タグ）をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。そのようなタンパク質タグのためのコード配列を、例えば、Ｃａｓ９タンパク質および／またはＣｐｆ１タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列に融合することができる。
発現ベクターの構築のための一般的な方法は、当業界で公知である；さらに、宿主細胞のための発現ベクターは、商業的に入手可能である。昆虫細胞形質転換および昆虫細胞中での遺伝子発現のための昆虫細胞ベクター、細菌形質転換および細菌細胞中での遺伝子発現の細菌プラスミド、酵母および他の真菌中での細胞形質転換および遺伝子発現のための酵母プラスミド、哺乳動物細胞形質転換および哺乳動物細胞または哺乳動物中での遺伝子発現のための哺乳動物ベクター、ならびに細胞形質転換および遺伝子発現のためのウイルスベクター（レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩまたはＩＩ、パルボウイルス、細網内皮症ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む）などの、適切なベクターの選択およびその構築を容易にするように設計されたいくつかの市販のソフトウェア製品およびそのようなポリヌクレオチドのクローニングを容易に可能にするための方法が存在する。例示的な植物形質転換ベクターとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するものが挙げられる（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４６（２）：３２５〜３３２頁（２００８））。また、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのプラスミドも有用であり、当業界で公知である。例えば、ＳＮＡＰＧＥＮＥ（商標）（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ；ｓｎａｐｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｆｉｌｅｓ／ｙｏｕｒ＿ｔｉｍｅ＿ｉｓ＿ｖａｌｕａｂｌｅ／）は、ベクターの広範囲な一覧、個々のベクター配列、およびベクターマップ、ならびに多くのベクターの商業的な供給源を提供する。
レンチウイルスベクターは、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複合体を形成することができる１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列の哺乳動物細胞への導入にとって有用なベクターの例である。レンチウイルスは、レトロウイルス科のメンバーであり、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、ならびにゲノム中への組込みによって安定な発現を提供することができる。レンチウイルスの安全性を増大させるために、ウイルスベクターを産生するのに必要な成分は、複数のプラスミドにわたって分割される。導入ベクターは、典型的には、複製能力がなく、さらに、組込み後にウイルスを自己不活化する、３’ＬＴＲ中の欠失を含有してもよい。典型的には、パッケージングおよびエンベローププラスミドが、導入ベクターと共に使用される。例えば、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＴａｔ遺伝子の組合せをコードしてもよい。導入プラスミドは、ウイルスＬＴＲおよびｐｓｉパッケージングシグナルを含んでもよい。エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質（その広い感染範囲のため、通常は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質、ＶＳＶ−ＧＰ）を含む。
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に基づくレンチウイルスベクターは、細胞分裂の非存在下での組込みを容易にするさらなる付属タンパク質を有する。ＨＩＶ−１ベクターは、いくつかの安全性の問題に対処するように設計されている。これらのものは、複製能力のあるウイルスの生成をもたらす組換え事象を防止するためのｉｎ ｔｒａｎｓでのウイルス遺伝子の個別発現を含む。さらに、自己不活化ベクターの開発は、近隣遺伝子のトランス活性化の可能性を軽減し、遺伝子発現を特定の細胞型に標的化するための調節エレメントの組込みを可能にする（例えば、Ｃｏｏｒａｙ，Ｓ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０７：２９〜５７頁（２０１２）を参照されたい）。
形質転換された宿主細胞（または組換え細胞）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複合体を形成することができる１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を形質転換またはトランスフェクトされた細胞または細胞の子孫である。ポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を宿主細胞中に導入する方法は、当業界で公知であり、典型的には、宿主細胞の種類に基づいて選択される。そのような方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、弾道遺伝子導入技術（例えば、遺伝子銃またはビオリスティック粒子送達系を使用する）、直接マイクロインジェクション、およびナノ粒子媒介送達が挙げられる。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複合体を形成することができる１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列の発現に対する代替手段として、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物および／または１つもしくはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を、例えば、細胞中に直接導入することができる。あるいは、１つまたはそれ以上の成分を、細胞によって発現させ、他の成分を直接導入することができる。成分を細胞中に導入するための方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、および弾道遺伝子導入技術が挙げられる。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複合体を形成することができる１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列の導入によって組換え細胞を産生するために使用することができる様々な宿主細胞が本明細書で開示される。そのような宿主細胞としては、限定されるものではないが、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、藻類細胞、または哺乳動物細胞が挙げられる。
組換え細胞を産生するために宿主細胞中にポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を導入する方法は、当業界で公知であり、典型的には、宿主細胞の種類に基づいて選択される。そのような方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、弾道遺伝子導入技術、直接マイクロインジェクション、およびナノ粒子媒介送達が挙げられる。考察を容易にするために、以下で使用される「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する任意の方法を指す。
ポリヌクレオチドを植物細胞に導入するための好ましい方法としては、微粒子ボンバードメントおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が挙げられる。あるいは、他の非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）および植物細胞に感染し、異種ポリヌクレオチドを感染した植物細胞のゲノム中に導入することができる他の原核細胞を使用することができる。他の方法としては、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、遊離ＤＮＡ取込みを増加させる花粉もしくはウイルス、および化学物質を使用する形質転換、または微粒子ボンバードメントを使用する遊離ＤＮＡ送達が挙げられる。例えば、Ｎａｒｕｓａｋａ，Ｙ．ら、Ｃｈａｐｔｅｒ ９、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ − Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ、Ｙｅｌｄａ，Ｏ．（編）、ＩＳＢＮ ９７８−９５３−５１−０１８１−９（２０１２）を参照されたい。
一部の実施形態では、宿主細胞は、一過的または非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、対象中において天然に起こるのと同様にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞、例えば、一次細胞または前駆細胞は、対象から採取される。一部の実施形態では、一次細胞または前駆細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏでのトランスフェクションの後、培養する、および／または同じ対象（自己処理）もしくは異なる対象に戻す。
本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）複合体を使用して、選択されたポリヌクレオチド配列をゲノム中のＤＮＡ標的遺伝子座に部位特異的に導入して、ｇＤＮＡの改変を生成することによって、非ヒトトランスジェニック生物を生成することができる。トランスジェニック生物は、動物または植物であってもよい。
トランスジェニック動物は、典型的には、前記系を接合体細胞中に導入することによって生成される。トランスジェニックマウスの作製を参照して記載される基本技術（Ｃｈｏ，Ａ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＨＡＰＴＥＲ．Ｕｎｉｔ−１９．１１（２００９））は、５つの基本工程を含む：第１に、好適なドナーポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の系の製造；第２に、ドナー接合体の収獲；第３に、マウス接合体への系のマイクロインジェクション；第４に、偽妊娠レシピエントマウスへのマイクロインジェクションされた接合体の埋込み；および第５に、創始マウスにおいて確立されたｇＤＮＡの改変のジェノタイピングおよび分析の実行。創始マウスは、任意の子孫に対する遺伝子改変を通過するであろう。創始マウスは、典型的には、導入遺伝子に関してヘテロ接合性である。これらのマウス間での交配は、２５％の時間、導入遺伝子に関してホモ接合性であるマウスを産生するであろう。
トランスジェニック植物を生成するための方法も周知である。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換法を使用して生成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体中に挿入された１つの導入遺伝子を含有する。単一の導入遺伝子を含有する独立分離トランスジェニック植物を、自身と性的交配（すなわち、自殖）させることによって、導入遺伝子に関してホモ接合性であるトランスジェニック植物、例えば、Ｆ１種子を産生するＦ０植物を産生することができる。Ｆ１種子を発芽させることによって形成される植物を、ホモ接合性について試験することができる。典型的な接合性アッセイとしては、限定されるものではないが、ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別する一塩基多型アッセイおよび温度増幅アッセイが挙げられる。
植物の直接形質転換のための本明細書に記載の系の使用に対する代替手段として、系を形質転換された第１の植物と、系に曝露されたことがない第２の植物とを交配させることによって、トランスジェニック植物を形成させることができる。例えば、導入遺伝子を含有する第１の植物系列を、第２の植物系列と交配させて、導入遺伝子を第２の植物系列に遺伝子移入し、かくして、第２のトランスジェニック植物系列を形成させることができる。
本発明のさらなる態様は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）との複合体を含む核タンパク質組成物を使用する方法に関する。そのような核タンパク質組成物の実施形態は、本明細書に記載される。本明細書に記載の操作された核酸配列のいくつかの使用としては、限定されるものではないが、核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列および標的核酸配列と相補的なスペーサー核酸配列を含む２つ以上の操作された核酸配列の複合体の足場の形成；ｇＤＮＡ領域の正確な編集（例えば、切出し、挿入、改変）；切断部位のごく近くへのドナーポリヌクレオチドの係留（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質を使用する切断）；ｇＤＮＡ領域の切出しと同時的な切出し部位でのドナーポリヌクレオチドの係留；例えば、ｄＣａｓ９を使用する、人工ヒストンの形成またはヘテロクロマチン構造の導入；ならびに遺伝子発現の厳密な転写制御（例えば、遺伝子の転写の遮断）が挙げられる。本明細書に記載の操作された核酸配列足場のさらなる使用としては、限定されるものではないが、核タンパク質粒子シートの使用方法および製造方法；例えば、組織工学における使用のための可撓性生物材料；ケージ薬物送達ビヒクル；ワクチン送達ビヒクル、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチン；サイズ依存性多孔膜、例えば、固定サイズの穴を有する膜の作製および使用；選択されたサイズのナノ粒子；ならびにタンパク質核酸ポリマーが挙げられる。
一実施形態では、本発明は、核酸（例えば、ＤＮＡ）中の第１の核酸標的配列および核酸配列（例えば、ＤＮＡ）中の第２の核酸標的配列と、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）とを接触させることによって、核酸配列中の第１の核酸標的配列および核酸中の第２の核酸標的配列への核タンパク質の結合を容易にすることを含む、核酸配列（例えば、ＤＮＡ）に結合させる方法を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）は、第１の核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ）と相補的である第１のスペーサーエレメントおよび第２の核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ）と相補的である第２のスペーサーエレメントを含む。一部の実施形態では、核酸標的配列は、ｇＤＮＡである。核酸標的配列に結合させるそのような方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（生化学的アッセイ）で、ｉｎ ｃｅｌｌ（培養場細胞中）で、ｅｘ ｖｉｖｏ（対象から取り出された細胞）で、またはｉｎ ｖｉｖｏ（生物中の細胞）で実行することができる。
限定されるものではないが、以下のもの：免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡプルダウンアッセイ、およびマイクロプレート捕捉および検出アッセイなどの、タンパク質−核酸相互作用を評価および／または定量するための様々な方法が当業界で公知である。これらの方法の多くを実施するための市販のキット、材料、および試薬が、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｓｉｇｎｏｓｉｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である。タンパク質−核酸相互作用を検出するための一般的手法は、ＥＭＳＡである（例えば、Ｈｅｌｌｍａｎ Ｌ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（８）：１８４９〜１８６１頁（２００７）を参照されたい）。
別の実施形態では、本発明は、核酸（例えば、ＤＮＡ）中の第１の核酸標的配列および核酸配列（例えば、ＤＮＡ）中の第２の核酸標的配列と、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）を含む核タンパク質組成物とを接触させることによって、核酸配列中の第１の核酸標的配列および核酸中の第２の核酸標的配列への核タンパク質組成物の結合を容易にすることを含む、核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を切断する方法を含む。核タンパク質組成物は、第１の核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ）と相補的である第１のスペーサーエレメントおよび第２の核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ）と相補的である第２のスペーサーエレメントを含む。結合した核タンパク質組成物の第１の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）は第１の核酸標的配列を切断し、結合した核酸／タンパク質組成物の第２の核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）は第２の核酸標的配列を切断する。一部の実施形態では、核酸標的配列は、ｇＤＮＡである。核酸標的配列に結合させるそのような方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｉｎ ｃｅｌｌで、ｅｘ ｖｉｖｏで、またはｉｎ ｖｉｖｏで実行することができる。
ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質／Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓタンパク質組成物を使用して核酸標的配列を結合させる、および結合させ、切断する方法が、図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃに例示される。図１６Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質（図１６Ａ、１６０４）およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質（図１６Ａ、１６０３）、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２組成物（図１６Ａ、１６００）（一般的には、図６Ｋに示された構造を有する）、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９スペーサーエレメント（図１６Ａ、１６０２）と相補的な第１のＤＮＡ標的結合配列を含む二本鎖核酸（図１６Ａ、１６０５）、ならびにＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２ Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９スペーサーエレメント（図１６Ａ、１６０１）と相補的な第２のＤＮＡ標的結合配列を含む二本鎖核酸（図１６Ａ、１６０７）を示す。図１６Ａ、１６０６は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭの位置を示す。図１６Ａ、１６０８は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭの位置を示す。
図１６Ａは、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２組成物（図１１Ａ、１６００；複合体１６１０）と複合体を形成する、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質（図１６Ａ、１６０４；複合体１６０９）およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質（図１６Ａ、１６０３；複合体１６１６）の形成を示す。
図１６Ａは、二本鎖ＤＮＡ標的配列（図１６Ａ、１６１１）への核タンパク質複合体の水素結合を示す。図１６Ａ、１６１１は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９スペーサーエレメント（図１６Ａ、１６０２）と相補的な第１のＤＮＡ標的結合配列を含む二本鎖核酸（図１６Ａ、１６０５）およびＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２ Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９スペーサーエレメント（図１６Ａ、１６０１）と相補的な第２のＤＮＡ標的結合配列を含む二本鎖核酸（図１６Ａ、１６０７）へのＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質／Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質組成物の結合を示す。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質が酵素的に不活性である場合、核タンパク質複合体（図１６Ａ、１６１０）を、例えば、２つのＤＮＡ配列（図１６Ａ、１６０５、１６０７）を近くに（例えば、図１６Ａ、１６０７）に持って行くために使用することができる。
図１６Ｂは、酵素的に活性なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質による図１６Ｂ、１６０５のＤＮＡの切断およびＤＮＡ（図１６Ｂ、１６０７）を切断部位（図１６Ｂ、１６１２、１６１３）の近くに維持するために酵素的に不活性なＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を使用する図１６Ｂ、１６０７のＤＮＡの係留を示す。そのような核タンパク質複合体は、ドナーポリヌクレオチド（図１６Ｂ、１６０７）を使用するＨＤＲの頻度を改善するのに役立ち得る。
図１６Ｃは、図１６Ｃ、１６０５のＤＮＡ（図１６Ｃ、１６１２、１６１３）の両方の鎖を破壊するための酵素的に活性なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質による図１６Ｃ、１６０５のＤＮＡの切断および図１６Ｃ、１６０７のＤＮＡ（図１６Ｃ、１６１４、１６１５）中の両方の鎖を破壊するための酵素的に活性なＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質による図１６Ｃ、１６０７のＤＮＡの切断を示す。そのような核タンパク質複合体を使用して、染色体再配置（例えば、転座）を容易にすることができる。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ中の第１のＤＮＡ標的配列およびＤＮＡ中の第２のＤＮＡ標的配列と、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、Ｃａｓ９タンパク質および／またはＣｐｆ１タンパク質などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）とを接触させることによって、核酸配列中の第１の核酸標的配列および核酸中の第２の核酸標的配列への核タンパク質複合体の結合を容易にすることを含む、細胞中のＤＮＡを改変する方法を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）は、第１の核酸標的配列と相補的である第１のスペーサーエレメントおよび第２の核酸標的配列（例えば、ＤＮＡ）と相補的である第２のスペーサーエレメントを含む。結合した核タンパク質複合体の第１のタンパク質は、第１のＤＮＡ標的配列を切断し、結合した核タンパク質複合体の第２のタンパク質は、第２のＤＮＡ標的配列を切断する。細胞は、第１の切断部位と第２の切断部位の両方を修復する。例示的な細胞ＤＮＡ修復経路としては、ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、およびＭＭＥＪが挙げられる。一部の実施形態では、核酸標的配列は、ｇＤＮＡである。核酸標的配列に結合させるそのような方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｃｅｌｌ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで実行することができる。接触工程は、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部が第１の切断部位と第２の切断部位の間に組み込まれる、ドナーポリヌクレオチドを存在させることをさらに含んでもよい。
別の実施形態では、本発明は、ドナーポリヌクレオチドを、細胞中の、核酸標的、典型的には、ＤＮＡ中のＤＳＢの近くに持って行く方法に関する。この方法は、ＤＮＡ中の第１のＤＮＡ標的配列およびドナーポリヌクレオチド中の第２のＤＮＡ標的配列と、第１のＤＮＡ標的と相補的な第１のＤＮＡ標的結合配列および第２のＤＮＡ標的と相補的な第２のＤＮＡ標的結合配列を有するＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のＤＮＡ結合タンパク質／第２のＤＮＡ結合タンパク質組成物（例えば、Ｃａｓ９タンパク質および／またはＣｐｆ１タンパク質などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）とを接触させることを含む。第１のＤＮＡ結合タンパク質は、触媒的に活性であり、第１のＤＮＡ標的結合配列と結合する。第２のＤＮＡ結合タンパク質は、酵素的に不活性であり、第２のＤＮＡ標的結合配列と結合する。核タンパク質複合体と、第１および第２のＤＮＡ標的配列との接触は、ＤＮＡ中の第１のＤＮＡ標的配列およびドナーポリヌクレオチド中の第２のＤＮＡ標的配列への核タンパク質複合体の結合を容易にする。核タンパク質複合体の触媒的に活性なＤＮＡ結合タンパク質は、第１のＤＮＡ標的配列を切断して、切断部位を形成する。触媒的に活性なＤＮＡ結合タンパク質および触媒的に不活性なＤＮＡ結合タンパク質は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と複合体を形成する、すなわち、それらは同じ核タンパク質複合体の一部であるため、ドナーポリヌクレオチドは、切断部位（例えば、ＤＳＢ）の近くにある。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を、ＤＮＡ中の切断部位に導入して（例えば、ＨＤＲ修復プロセスにより）、ＤＮＡの改変をもたらす。
図１２は、ドナーポリヌクレオチドを、核酸標的配列中のＤＳＢの近くに持って行くために、活性Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼドメインが活性であり、ｄＣａｓ９のエンドヌクレアーゼドメインが不活性である、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／活性Ｃａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９ Ｃａｓ９タンパク質組成物の使用を示す。図１２は、活性Ｃａｓ９タンパク質（図１２、１２１１）およびｄＣａｓ９タンパク質（図１２、１２０３）、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２組成物（図１２、１２０５；図６Ｆも参照されたい）；活性Ｃａｓ９−ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２組成物スペーサーエレメント（図１２、１２１０）と相補的な第１のＤＮＡ標的結合配列を含む二本鎖核酸（図１２、１２０６／１２０７）；ならびにｄＣａｓ９−ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２組成物スペーサーエレメント（図１２、１２０４）と相補的な第２のＤＮＡ標的結合配列を含むドナーポリヌクレオチド（図１２、１２００／１２０１）を示す。図１２は、複合体にあるＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／活性Ｃａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９タンパク質ならびにドナーポリヌクレオチド中の第１のＣａｓ９ ＰＡＭ（図１２、１２０９）の上流の第１のＤＮＡ標的配列への第１のＤＮＡ標的結合配列の水素結合および第２のＣａｓ９ ＰＡＭ（図１２、１２０２）の上流の第２の標的配列への第２のＤＮＡ標的結合配列の水素結合を示す。図１２、１２０８は、第２の二本鎖核酸（図１２、１２１３／１２１２）をもたらす、第１のＤＮＡ標的結合配列でＣａｓ９により作られた二本鎖平滑末端切断を示し、二本鎖平滑末端切断の近くにあるドナーポリヌクレオチド（図１２、１２００／１２０１）を示す。二本鎖切断のごく近くにドナーポリヌクレオチドを有する場合、ドナーポリヌクレオチド配列、またはその一部の、第１の核酸標的を含むＤＮＡ中への組込みの可能性が高くなる。
さらなる実施形態では、本発明は、細胞中で、第１の核酸標的部位、典型的にはＤＮＡを、第２の核酸標的部位、典型的にはＤＮＡの近くに持って行く方法に関する。この方法は、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列と、核酸結合タンパク質、および第２の核酸結合タンパク質と複合体にあるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体とを接触させることによって、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列への核タンパク質複合体の結合を容易にすることを含む。第１のＤＮＡ標的配列はＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第１の核酸結合配列と相補的であり、ここで、結合した第１のタンパク質は、触媒的に不活性な核酸結合タンパク質（例えば、ｄＣｐｆ１タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）である。第２のＤＮＡ標的配列はＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第２の核酸結合配列と相補的であり、ここで、結合した第２のタンパク質は、触媒的に不活性な核酸結合タンパク質（例えば、ｄＣｐｆ１タンパク質またはｄＣａｓ９タンパク質）である。第１および第２の触媒的に不活性な核酸結合タンパク質は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と複合体を形成する、すなわち、それらは同じ核酸／タンパク質組成物の一部であるため、第１の核酸標的部位は、第２の核酸標的部位の近くに持って行かれる。一部の実施形態では、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列は、別々のポリヌクレオチド（例えば、異なる染色体）上にあるか、または単一のポリヌクレオチドは、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列（例えば、同じ染色体の異なるセクション）を含む。
図１３は、単一のＤＮＡポリヌクレオチド内の３つの部位に結合する、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２のｄＣａｓ９結合タンパク質／第３のｄＣａｓ９タンパク質組成物の例を示す。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、図６Ｉにも示される。この核タンパク質複合体を、細胞中で、第１の核酸標的部位、典型的には、ＤＮＡを、第２の核酸標的部位、典型的には、ＤＮＡの近くに、第３の核酸標的部位、典型的には、ＤＮＡの近くに持って行く方法において使用することができる。この方法はまた、例えば、近くにある核酸標的部位の検出および３つの標的部位に隣接する遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの転写モジュレーションのモジュレーションに適用することもできる。図１３に示される成分の指標を、表８に提示する。
図１４は、複数のＤＮＡポリヌクレオチドの３つの部位に結合するＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２の活性なＣａｓ９結合タンパク質／第３の活性なＣａｓ９タンパク質組成物の例を示す。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、図６Ｉにも示される。この核タンパク質複合体を、例えば、細胞中で、ドナーポリヌクレオチドを、核酸標的、典型的には、ＤＮＡ中の２つのＤＳＢの近くに持って行って、ドナーポリヌクレオチドまたはドナーポリヌクレオチドの一部の、２つのＤＮＡ標的切断部位間の領域中へのＨＤＲ組込みを容易にするための方法において使用することができる。図１４に示される成分の指標を、表８に提示する。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、図６Ｉにも示される。
図１５は、３つの異なるＤＮＡポリヌクレオチド中の３つの部位に結合する、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２の活性なＣａｓ９結合タンパク質／第３の活性なＣａｓ９タンパク質組成物の例を示す。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、図６Ｉにも示される。この核タンパク質複合体を、例えば、第３のＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端への２つのＤＮＡポリヌクレオチドのライゲーション頻度を改善するための方法において使用することができる。図１５に示される成分の指標を、表８に提示する。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、図６Ｉにも示される。
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さらに別の実施形態では、本発明はまた、転写、例えば、調節エレメント配列を含む遺伝子の転写をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートする方法も含む。この方法は、少なくとも第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列と、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物（例えば、ｄＣａｓ９および／またはｄＣｐｆ１などの触媒的に不活性なクラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む）とを接触させることによって、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列への核タンパク質組成物の結合を容易にすることを含む。第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列の少なくとも一方は、調節エレメント配列を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物の第１のＤＮＡ標的結合配列は、第１の核酸標的配列と相補的である。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１の核酸結合タンパク質／第２の核酸結合タンパク質組成物の第２のＤＮＡ標的結合配列は、第２のＤＮＡ標的配列と相補的である。さらに、第１および／または第２のタンパク質は、融合タンパク質、例えば、リプレッサーもしくはアクチベータードメインに融合されたｄＣａｓ、および／またはリプレッサーもしくはアクチベータードメインに融合されたｄＣｐｆ１であってもよい。第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列への核酸／タンパク質組成物の結合は、遺伝子の転写をモジュレートする。一部の実施形態では、第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列は、調節エレメント配列を含み、第１のＤＮＡ標的配列は、プロモーターを含み、第２のＤＮＡ標的配列は、転写開始部位を含む。
図１１は、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用して、転写をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートする方法を示す。この図面において、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２のｄＣａｓ９タンパク質複合体は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物（図１１、１１０３）と、第１のｄＣａｓ９タンパク質（図１１、１１００）および第２のｄＣａｓ９タンパク質（図１１、１１０１）との結合によって形成される（図１１、１１１１、１１１０、１１０３）。複合体は、ＤＮＡポリヌクレオチド（図１１、１１０５）中の第１のＣａｓ９ ＰＡＭ（図１１、１１０８）に隣接する第１の核酸標的配列と相補的な第１のＤＮＡ標的結合配列（図１１、１１０２）および第２のＣａｓ９ ＰＡＭ（図１１、１１０９）に隣接する第２の核酸標的配列と相補的である第２のＤＮＡ標的結合配列（図１１、１１０４）を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２のｄＣａｓ９タンパク質複合体を、ＤＮＡ標的配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドと接触させることによって、第１の核酸標的配列および第２の核酸標的配列への、水素結合した塩基対（図１１、１１１２、１１１３）を介する核タンパク質組成物の結合を容易にする。第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列の少なくとも一方は、調節エレメント配列を含む。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２のｄＣａｓ９タンパク質組成物の第１のＤＮＡ標的結合配列は、第１の核酸標的配列と相補的である。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／第１のｄＣａｓ９タンパク質／第２のｄＣａｓ９タンパク質組成物の第２のＤＮＡ標的結合配列は、第２のＤＮＡ標的配列と相補的である。
本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用して、複合体構造に自己集合する核酸／タンパク質高分子を設計することができる。そのような高分子は、限定されるものではないが、薬物送達、核酸／タンパク質ナノ材料の設計、ならびにナノチューブおよびクローズドケージ構造などのナノ構造の形成を含む、ナノバイオテクノロジーにおける多くの使用を有する。実施例１３は、ＮＡＳＣクローズドケージ組成物（ＮＡＳＣ−ＣＣ）の形成のための本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の使用を示す。ＮＡＳＣ−ＣＣを、低分子のパッケージングのために使用することができる。実施例１４は、ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質複合体の特徴付けのために使用して、適切な集合を検証し、集合したＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質複合体のサイズおよび容量を評価することができる方法を記載する。実施例１３および実施例１４に記載されるＮＡＳＣ−ＣＣは、図６Ｌに示される。図６Ａに示されるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物に対応する２つのＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物（実施例ではＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックスと呼ばれる）を、二本鎖ＤＮＡブレース核酸配列を使用して接続することができる。二本鎖ＤＮＡブレース核酸配列は、第１のＤＮＡ標的配列および第２のＤＮＡ標的配列を含んでもよい。実施例１３に記載されるように、第１のＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス／ｄＣａｓ９タンパク質核タンパク質複合体は、ブレース核酸配列の第１のＤＮＡ標的配列に特異的に結合するＤＮＡ標的結合配列を含むため、ＮＡＳＣ−ＣＣは自己集合する。ＤＮＡ標的結合配列を含む第２のＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス／ｄＣａｓ９タンパク質は、ブレース核酸配列の第２のＤＮＡ標的配列に特異的に結合して、クローズドケージ構造を形成するであろう。図６Ｍは、核タンパク質ケージを形成する６つのＣａｓ９タンパク質が結合したＮＡＳＣ−ＣＣを示す。
限定されるものではないが、ワクチン（例えば、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、および核酸ワクチン）；モノクローナル抗体；抗生物質；低分子薬物；がん治療剤；組換えタンパク質、バイオ医薬品などの様々な分子が、分子の送達を容易にするためのＮＡＳＣ−ＣＣポリヌクレオチド組成物への組込みのための候補である。そのような分子は、本明細書では「ペイロード」とも呼ばれる。
標的タンパク質と核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）との融合物を使用して、ＮＡＳＣ−ＣＣポリヌクレオチド組成物の組織、臓器、または細胞型標的化送達を達成することができる。例えば、特定の腫瘍に特異的なランドスケープファージペプチドを、親和性選択によって取得し、特定の腫瘍に特異的な精製ペプチドをＣａｓ９タンパク質に融合することができる。次いで、Ｃａｓ９融合タンパク質を使用して、ＮＡＳＣ−ＣＣポリヌクレオチド組成物を集合させて、腫瘍標的化ナノ担体を取得することができる。特定の腫瘍に特異的なファージペプチドの産生は、Ｊａｙａｎｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１）：８３頁（２００９）によって記載されている。
細胞へのＮＡＳＣ−ＣＣの送達の代替的な様式を、ＮＡＳＣ−ＣＣ ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質（「ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓ」）成分と、様々なリガンドまたは化学的薬剤との連結、パッケージング、または結合により達成することができる。パッケージング技術は、自己集合性リポソーム、ミセル、デンドリマー、ナノスフェア、またはナノカプセル中でのＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓのパッケージングを含む。
分子および高分子構造へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＰＥＧ化）の共有的および非共有的結合が、細胞への標的送達のためのペイロードのパッケージングのために使用されており、当業者であれば、本明細書の教示を考慮して、ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓの封入のために適合化させることができる。さらに、タンパク質のＰＥＧ化は、組織、細胞、およびオルガネラへの高分子の送達のための広く実行されている形態のコンジュゲーション化学である。ＰＥＧ化された構造を、細胞の取込みを容易にする部分（例えば、葉酸部分）の分子結合を用いてさらに改変することができる。これらの部分の選択は、ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓの指向性送達のために標的化された細胞のユニークな特性および封入されるペイロード（すなわち、細胞外マトリックス、受容体、または抗体組成物）に依拠する。これらの部分を、ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓ、ＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤、またはＮＡＳＣ−ＣＣ／ＣａｓとＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤の両方に結合させることができる。使用することができる部分としては、限定されるものではないが、抗体、リガンド、トランスフェリン、糖タンパク質、アプタマー、細胞浸透ペプチド、マトリックスメタロプロテアーゼ切断性ペプチド、インテグリン、タンパク質形質導入ドメイン、エピトープ、細胞接着分子、および当業界で公知の他の化合物が挙げられる（例えば、Ｓｔｅｉｃｈｅｎ，Ｓ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ４８（３）：４１６〜２７頁（２０１３）；Ｄａｓｈｐａｎｄｅ，Ｐ．ら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．８（９）：１５０９〜２８頁（２０１３）を参照されたい）。
ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓ封入剤のトリガー放出を、ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓ組成物中への、またはＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤内への異なる化学部分または配列モチーフの組込みによって容易にすることができる。ＮＡＳＣ−ＣＣ／ＣａｓまたはＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤への生分解性ポリマー組成物（例えば、改変されたＰＥＧ組成物）の結合は、細胞取込みの際にＮＡＳＣ−ＣＣ／ＣａｓまたはＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤の破壊を可能にすることができる。操作された感受性部位（すなわち、タンパク質分解感受性ペプチド配列、ｐＨ感受性コポリマー、レドックス感受性連結など）または操作された感受性部位の組合せを使用して、ＮＡＳＣ−ＣＣ封入剤の放出を容易にすることができる。ＮＡＳＣ−ＣＣと、ＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤との不安定な連結、例えばｐＨ感受性連結を使用して、高いｐＨ環境（例えば、細胞内液胞）中のＮＡＳＣ−ＣＣおよびＮＡＳＣ−ＣＣパッケージング剤からの解離を促進することができる。ＮＡＳＣ−ＣＣ／Ｃａｓ複合体を、特定のオルガネラへのペイロードの送達のためのオルガネラ特異的エピトープ（すなわち、核局在化シグナル）を用いてさらに改変することができる。
当業者であれば、本明細書の教示を考慮して、様々な異なるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用して、様々なナノ構造を形成させることができる。
本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質組成物の成分のいずれか、または上記のような、そのような成分をコードする核酸配列を、場合により、１つまたはそれ以上の試薬を含むキット中に含有させることができる。一部の実施形態では、キットは、１つもしくはそれ以上の別々の組成物として、または場合により、成分の適合性が許容する混合物として、キットの要素を保持する１つまたはそれ以上の容器を含むパッケージを含む。一部の実施形態では、キットはまた、バッファー、緩衝剤、塩、滅菌水性溶液、および／または保存剤も含む。例示的なキットは、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上の成分および場合により、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９タンパク質などの、１つまたはそれ以上の同族核酸結合タンパク質；ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の１つまたはそれ以上の成分をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列、および場合により、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を含む。
さらに、キットは、本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核タンパク質複合体の成分またはそのような成分をコードする核酸配列を使用するための指示書をさらに含んでもよい。本発明のキットに含まれる指示書を、包装材料に固定するか、または添付文書として含有させることができる。指示書は、典型的には、書かれた、または印刷された材料であるが、それらはそのようなものに限定されない。そのような指示書を保存し、それらをエンドユーザーに連絡することができる任意の媒体が、本発明によって企図される。そのような媒体としては、限定されるものではないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、ＲＦタグなどが挙げられる。指示書は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
本発明の別の態様は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物または本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物を作製または製造する方法に関する。一実施形態では、作製または製造方法は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のポリヌクレオチド成分を化学的に合成することを含む。一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物は、ＲＮＡ塩基を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を使用して、ＤＮＡ鋳型から生成することができる。
一部の実施形態では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物成分を、部分（例えば、リガンド部分、リガンド結合部分、アフィニティータグ、エキソヌクレアーゼ耐性部分）によって改変することができる。ポリヌクレオチド成分を、例えば、ポリヌクレオチド成分の５’末端配列および／または３’末端配列に接続することができる。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物は、検出可能なシグナルを提供することができる部分を含む、検出可能な標識をさらに含んでもよい。検出可能な標識の例としては、限定されるものではないが、酵素、放射性アイソトープ、特異的結合対のメンバー、フルオロフォア（ＦＡＭ）、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、好適なフルオロフォア（増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、「Ｓｐｉｎａｃｈ」）を一緒に含むＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、量子ドット、抗体などが挙げられる。多数かつ様々な好適な検出可能な標識が当業者には周知である。
本明細書に記載されるような、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物またはＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物の使用によって改変された細胞を、例えば、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化された医薬組成物として使用することができる。例示的な賦形剤としては、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤などが挙げられる。医薬組成物は、操作されたＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質組成物の、生物への投与を容易にすることができる。医薬組成物を、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経口、エアロゾル、非経口、眼内、および肺投与などの、様々な形態および経路によって治療有効量で投与することができる。
本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物および核タンパク質複合体を使用して、いくつかの利点を得ることができ、限定されるものではないが、以下のものを含む：
・核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物および単一の核タンパク質複合体を使用して複数の標的核酸配列への結合を標的化するＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用するオフターゲット結合の、同様に標的化された個々のＮＡＴＮＡ／核酸結合タンパク質複合体（例えば、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体）の使用と比較した減少；
・ドナーポリヌクレオチドを、二本鎖核酸中の切断部の近くに持って行くための、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の使用による、ドナーポリヌクレオチドの係留；
・核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用して、２つの別々のポリヌクレオチド（例えば、２つの異なる染色体）または単一のポリヌクレオチドの２つの領域（例えば、単一の染色体の２つの領域）を、互いの近くに持って行くこと；
・標的遺伝子に作動可能に連結された複数の調節配列への、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の結合による、標的遺伝子の転写モジュレーション；
・２つの別々のポリヌクレオチド（例えば、ｔｒａｎｓ作用調節エレメント）または単一のポリヌクレオチドの２つの領域（例えば、ｃｉｓ作用調節エレメント）を、互いに近くに持って行くための、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の結合による、標的遺伝子の転写モジュレーション；
・ドナーポリヌクレオチドも核酸／タンパク質組成物に係留される実施形態を含む、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用した複数の標的核酸配列の同時的標的化；
・例えば、低分子の医薬製剤のための、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む生物学的ナノ構造の形成；
・所定のサイズおよび形状を有する、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を用いるナノスケール構造の構築；ならびに
・所定の複合体構造に自己集合する、核酸結合タンパク質（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質）を含む核酸／タンパク質組成物およびＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含む核酸／タンパク質成分の設計。
本明細書で企図される様々な実施形態は、限定されるものではないが、以下の１つまたはそれ以上を含む。実施形態は、参照を容易にするために番号付けられる。
本発明の実施形態は、限定されるものではないが、以下を含む。
１．第１の末端および第２の末端を有する第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列を含む第１のエレメント１−反復核酸配列１を含む第２のエレメント１（ここで、反復核酸配列１は、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の第１の末端の近くにある）−核酸配列１を含む第３のエレメント１を含む第１の操作された核酸；ならびに第１の末端および第２の末端を有する第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列を含む第１のエレメント２−反復核酸配列１Ｃを含む第２のエレメント２（ここで、反復核酸配列１Ｃは、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の第１の末端の近くにある）−および核酸配列２を含む第３のエレメント２を含む第２の操作された核酸を含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１と反復核酸配列１Ｃとの間の水素結合を介して反復核酸配列１Ｃと結合する、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
２．第１の操作された核酸が、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列をさらに含む第１のエレメント１（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）−５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１をさらに含む第２のエレメント１（ここで、反復核酸配列１の３’末端は、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）−および５’末端および３’末端を有する、核酸配列１をさらに含む第３のエレメント１（ここで、核酸配列１の５’末端は、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置する）を含み；第２の操作された核酸が、第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列をさらに含む第１のエレメント２（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）−５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１Ｃをさらに含む第２のエレメント２（ここで、反復核酸配列１Ｃの３’末端は、第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）−および５’末端および３’末端を有する、核酸配列２をさらに含む第３のエレメント２（ここで、核酸配列２の５’末端は、第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置する）を含む、実施形態１に記載の複合体。
３．第１の操作された核酸が、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列をさらに含む第１のエレメント１（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）−５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１をさらに含む第２のエレメント１（ここで、反復核酸配列１の３’末端は、第１の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）−および５’末端および３’末端を有する、核酸配列１をさらに含む第３のエレメント１（ここで、核酸配列１の３’末端は、反復核酸配列１の５’末端の５’側に位置する）を含み；第２の操作された核酸が、第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列をさらに含む第１のエレメント２（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）−５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１Ｃをさらに含む第２のエレメント２（ここで、反復核酸配列１Ｃの３’末端は、第２の二本鎖核酸結合タンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）−および５’末端および３’末端を有する、核酸配列２をさらに含む第３のエレメント２（ここで、核酸配列２の３’末端は、反復核酸配列１Ｃの５’末端の５’側に位置する）を含む、実施形態１に記載の複合体。
４．第１の末端および第２の末端を有する、第１の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント１−反復核酸配列１を含む第２のエレメント１（ここで、反復核酸配列１は、第１の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の第１の末端の近くにある）−および核酸配列１を含む第３のエレメント１を含む第１の操作された核酸配列；ならびに第１の末端および第２の末端を有する、第２の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント２−反復核酸配列１Ｃを含む第２のエレメント２（ここで、反復核酸配列２は、第２の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の第１の末端の近くにある）−および核酸配列２を含む第３のエレメント２を含む第２の操作された核酸配列を含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１と反復核酸配列１Ｃとの間の水素結合を介して反復核酸配列１Ｃと結合する、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
５．第１の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列が、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列であり、第１の末端が５’末端であり、第２の末端が３’末端であり、反復核酸配列１が５’末端および３’末端を有し、反復核酸配列１の３’末端が、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、核酸配列１が５’末端および３’末端を有し、核酸配列１の５’末端が、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置し；第２の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列が、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列であり、第１の末端が５’末端であり、第２の末端が３’末端であり、反復核酸配列２が５’末端および３’末端を有し、反復核酸配列２の３’末端が、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、核酸配列２が５’末端および３’末端を有し、核酸配列２の５’末端が、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置する、実施形態４に記載の複合体。
６．反復核酸配列１が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列１−１、反復核酸配列１ａ、リンカーエレメント核酸配列１−２、反復核酸配列１ｂ、およびリンカーエレメント核酸配列１−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−３をさらに含み；反復核酸配列２が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列２−１、反復核酸配列１ｂＣ、リンカーエレメント核酸配列２−２、反復核酸配列２ａ、およびリンカーエレメント核酸配列２−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列２ａ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−３をさらに含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣとの間の水素結合を介して反復核酸配列２と結合する、実施形態５に記載の複合体。
７．第３の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント３（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列３を含む第２のエレメント３（ここで、反復核酸配列３の３’末端は、第３の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、反復核酸結合配列３は、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列３−１、反復核酸配列２ａＣ、リンカーエレメント核酸配列３−２、反復核酸配列３ａ、およびリンカーエレメント核酸配列３−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列２ａＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列３ａ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−３をさらに含む）；ならびに５’末端および３’末端を有する、核酸配列３を含む第３のエレメント３（ここで、核酸配列３の５’末端は、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置する）を含む第３の操作された核酸；ならびに第４の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント４（ここで、第１の末端は５’末端であり、第２の末端は３’末端である）、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列４を含む第２のエレメント４（ここで、反復核酸配列３の３’末端は、第４の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、反復核酸結合配列４は、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列４−１、反復核酸配列３ａＣ、リンカーエレメント核酸配列４−２、反復核酸配列１ａＣ、およびリンカーエレメント核酸配列４−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列４−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列３ａＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列４−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａＣ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列４−３をさらに含む）；ならびに５’末端および３’末端を有する、核酸配列４をさらに含む第３のエレメント４（ここで、核酸配列４の５’末端は、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の３’末端の３’側に位置する）を含む第４の操作された核酸をさらに含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣとの間の水素結合を介して反復核酸配列２と結合し、反復核酸配列１が、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣとの間の水素結合を介して反復核酸配列４と結合し、反復核酸配列２が、反復核酸配列２ａと反復核酸配列２ａＣとの間の水素結合を介して反復核酸配列３と結合し、および反復核酸配列３が、反復核酸配列３ａと反復核酸配列３ａＣとの間の水素結合を介して反復核酸配列４と結合する、実施形態６に記載の複合体。
８．反復核酸配列１および反復核酸配列２が、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１をさらに含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が、反復核酸配列１と反復核酸配列２との間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態４〜７のいずれか１つに記載の複合体。
９．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位である、実施形態８に記載の複合体。
１０．第１の操作された核酸および第２の操作された核酸がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態４〜９のいずれか１つに記載の複合体。
１１．第１の操作された核酸、第２の操作された核酸、第３の操作された核酸、および第４の操作された核酸がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態７に記載の複合体。
１２．第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列および第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃｐｆ１タンパク質結合配列である、実施形態５〜１１のいずれか１つに記載の複合体。
１３．第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列、第３の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列、および第４の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃｐｆ１タンパク質結合配列である、実施形態７または１１に記載の複合体。
１４．（ｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２がスペーサー核酸配列２をさらに含む、および（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的である、実施形態５、６、７、８、９、または１０のいずれか１つに記載の複合体。
１５．標的核酸配列１および標的核酸配列２がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態１４に記載の複合体。
１６．（ｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２がスペーサー核酸配列２をさらに含み、核酸配列３がスペーサー核酸配列３をさらに含み、核酸配列４がスペーサー核酸配列４をさらに含む、および（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的であり、スペーサー核酸配列３が標的核酸配列３と相補的であり、スペーサー核酸配列４が標的核酸配列４と相補的である、実施形態７、１１、または１３のいずれか１つに記載の複合体。
１７．標的核酸配列１、標的核酸配列２、標的核酸配列３、および標的核酸配列４がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態１６に記載の複合体。
１８．複合体が、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃｐｆ１タンパク質および触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
１９．複合体が、第１の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第２の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第３の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第３のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第４の核酸結合クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第４のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第２のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第３のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第４のクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃｐｆ１タンパク質および触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質からなる群から選択される、実施形態７、１１、１３、または１６のいずれか１つに記載の２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
２０．第１の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列であり、第１の末端が５’末端であり、第２の末端が３’末端であり、反復核酸配列１が５’末端および３’末端を有し、反復核酸配列１の３’末端が第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、核酸配列１が５’末端および３’末端を有し、核酸配列１の３’末端が反復核酸配列１の５’末端の５’側に位置し；第２の核酸結合クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列であり、第１の末端が５’末端であり、第２の末端が３’末端であり、反復核酸配列１Ｃが５’末端および３’末端を有し、反復核酸配列１Ｃの３’末端が第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、核酸配列２が５’末端および３’末端を有し、核酸配列２の３’末端が反復核酸配列１Ｃの５’末端の５’側に位置する、実施形態４に記載の複合体。
２１．反復核酸配列１が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列１−１、反復核酸配列１ａ、リンカーエレメント核酸配列１−２、反復核酸配列１ｂ、およびリンカーエレメント核酸配列１−２、反復核酸配列１ｂ、およびリンカーエレメント核酸配列１−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ、および５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−３をさらに含み；反復核酸配列２が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列２−３、反復核酸配列１ｂＣ、リンカーエレメント核酸配列２−２、反復核酸配列１ａＣ、およびリンカーエレメント核酸配列２−１で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂＣ、および５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−３をさらに含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣとの間の水素結合を介して、および反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣとの間の水素結合を介して、反復核酸配列２と結合する、実施形態２０に記載の複合体。
２２．反復核酸配列１ａが、以下の３’から５’の順序：反復核酸配列１ａ１、バルジ核酸配列１ａ１、および反復核酸配列１ａ２で配置された、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ１、５’末端および３’末端を有する、バルジ核酸配列１ａ１、ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ２をさらに含み；反復核酸配列１ｂが、以下の３’から５’の順序：反復核酸配列１ｂ１、バルジ核酸配列１ｂ１、および反復核酸配列１ｂ２で配置された、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ１、５’末端および３’末端を有する、バルジ核酸配列１ｂ１、ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ２をさらに含み；反復核酸配列１ｂＣが、以下の３’から５’の順序：反復核酸配列１ｂ２Ｃ、バルジ核酸配列２ｂ２、および反復核酸配列１ｂ１Ｃで配置された、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ２Ｃ、５’末端および３’末端を有する、バルジ核酸配列２ｂ２、ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ１Ｃをさらに含み；反復核酸配列１ａＣが、以下の３’から５’の順序：反復核酸配列１ａ２Ｃ、バルジ核酸配列２ａ２、および反復核酸配列１ａ１Ｃで配置された、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ２Ｃ、５’末端および３’末端を有する、バルジ核酸配列２ａ２、ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ１Ｃをさらに含み；ここで、反復核酸配列１が、反復核酸配列１ａ１と反復核酸配列１ａ１Ｃ、反復核酸配列１ａ２と反復核酸配列１ａ２Ｃ、反復核酸配列１ｂ１と反復核酸配列１ｂ１Ｃ、反復核酸配列１ｂ２と反復核酸配列１ｂ２Ｃの間の水素結合を介して反復核酸配列２と結合する、実施形態２１に記載の複合体。
２３．反復核酸配列１および反復核酸配列２が、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１を含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が、反復核酸配列１と反復核酸配列２の間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態２０、２１、または２２のいずれか１つに記載の複合体。
２４．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１がＣｓｙ４タンパク質結合部位である、実施形態２３に記載の複合体。
２５．第１の操作された核酸および第２の操作された核酸がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態２０〜２４のいずれか１つに記載の複合体。
２６．第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質結合配列である、実施形態２０〜２５のいずれか１つに記載の複合体。
２７．（ｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２がスペーサー核酸配列２をさらに含み；（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的である、実施形態２０〜２６のいずれか１つに記載の複合体。
２８．標的核酸配列１および標的核酸配列２がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態２７に記載の複合体。
２９．複合体が、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質および触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、実施形態２０〜２８のいずれか１つに記載の２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
３０．５’末端および３’末端を有する、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１を含む、第１のＣＲＩＳＰＲエレメント１（ここで、反復核酸配列１の３’末端は第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、反復核酸配列１は、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列１−１、反復核酸配列１ａ、リンカーエレメント核酸配列１−２、反復核酸配列１ｂ、およびリンカーエレメント核酸配列１−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列１−３をさらに含む）；ならびに５’末端および３’末端を有する、核酸配列１をさらに含む第２のＣＲＩＳＰＲエレメント１（ここで、（ｉ）核酸配列１の３’末端は、反復核酸配列１の５’末端の５’側に位置する、および（ｉｉ）核酸配列１は、スペーサー核酸配列１を含む）を含む第１の操作された核酸；５’末端および３’末端を有する、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列２を含む、第１のＣＲＩＳＰＲエレメント２（ここで、反復核酸配列２の３’末端は第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、反復核酸配列２は、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列２−３、反復核酸配列１ｂＣ、リンカーエレメント核酸配列２−４、反復核酸配列２ａ、およびリンカーエレメント核酸配列２−５で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−３、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ｂＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−４、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列２ａ、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列２−５をさらに含む）；５’末端および３’末端を有する、核酸配列２を含む第２のＣＲＩＳＰＲエレメント２（ここで、（ｉ）核酸配列１の３’末端は、反復核酸配列２の５’末端の５’側に位置する、および（ｉｉ）核酸配列２は、スペーサー核酸配列２を含む）を含む第２の操作された核酸；５’末端および３’末端を有する、第３の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列ならびに５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列３を含む、第１のＣＲＩＳＰＲエレメント３（ここで、反復核酸配列３の３’末端は第３の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、反復核酸配列３は、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列３−１、反復核酸配列２ａＣ、リンカーエレメント核酸配列３−２、反復核酸配列１ａＣ−１、およびリンカーエレメント核酸配列３−３で配置された、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−１、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列２ａＣ、５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−２、５’末端および３’末端を有する、反復核酸配列１ａＣ−１、ならびに５’末端および３’末端を有する、リンカーエレメント核酸配列３−３をさらに含む）；５’末端および３’末端を有する、核酸配列３を含む第２のＣＲＩＳＰＲエレメント３（ここで、（ｉ）核酸配列３の３’末端は、反復核酸配列３の５’末端の５’側に位置する、および（ｉｉ）核酸配列３は、スペーサー核酸配列３を含む）を含む第３の操作された核酸を含み；反復核酸配列１ａが、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣ−１の間の水素結合を介して反復核酸配列１ａＣ−１と結合し、反復核酸配列１ｂが、反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣの間の水素結合を介して反復核酸配列１ｂＣと結合し、および反復核酸配列２ａが、反復核酸配列２ａと反復核酸配列２ａＣの間の水素結合を介して反復核酸配列２ａＣと結合する、足場を形成する３つ以上の操作された核酸配列の複合体。
３１．反復核酸配列１および反復核酸配列２が二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１を含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が、反復核酸配列１と反復核酸配列２の間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態３０に記載の複合体。
３２．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１がＣｓｙ４タンパク質結合部位である、実施形態３１に記載の複合体。
３３．第１の操作された核酸、第２の操作された核酸、および第３の操作された核酸がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態３０、３１、または３２のいずれか１つに記載の複合体。
３４．第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列、および第３の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質結合配列である、実施形態３０〜３３のいずれか１つに記載の複合体。
３５．（ｉ）核酸配列１が、スペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２が、スペーサー核酸配列２をさらに含み、核酸配列３が、スペーサー核酸配列３をさらに含み；（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的であり、スペーサー核酸配列３が標的核酸配列３と相補的である、実施形態３０〜３４のいずれか１つに記載の複合体。
３６．標的核酸配列１、標的核酸配列２、および標的核酸配列３がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態３５に記載の複合体。
３７．複合体が、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第３の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第３のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、および第３のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質および触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、実施形態３０〜３６のいずれか１つに記載の足場を形成する３つ以上の操作された核酸配列の複合体。
３８．５’末端および３’末端を有する、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１の連結エレメント１、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１を含む第２の連結エレメント１（ここで、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列は、反復核酸配列Ａ１の３’末端の３’側に位置する）、５’末端および３’末端を有する、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１の連結エレメント２、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２を含む第２の連結エレメント２（ここで、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列は、反復核酸配列Ａ２の３’末端の３’側に位置し、第１の連結エレメント１の５’末端は、第１の連結エレメント２の３’末端に共有結合して、操作された連結核酸１を形成する）；５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１Ｃならびに５’末端および３’末端を有する核酸配列１を含む５’末端および３’末端を有する第３の連結エレメント１（ここで、核酸配列１は反復核酸配列Ａ１Ｃの５’末端の５’側に位置し、（ｉ）反復核酸配列Ａ１Ｃは、反復核酸配列Ａ１と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ１Ｃは、反復核酸配列Ａ１Ｃと反復核酸配列Ａ１の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ１と結合する）；ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２Ｃならびに５’末端および３’末端を有する核酸配列２を含む５’末端および３’末端を有する第３の連結エレメント２（ここで、核酸配列２は反復核酸配列Ａ２Ｃの５’末端の５’側に位置し、（ｉ）反復核酸配列Ａ２Ｃは、反復核酸配列Ａ２と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ２Ｃは、反復核酸配列Ａ２と結合し、（ｉｉｉ）反復核酸配列Ａ２Ｃは、反復核酸配列Ａ２Ｃと反復核酸配列Ａ２の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ２と結合する）を含む、５’末端および３’末端を有する操作された連結核酸１を含む、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
３９．反復核酸配列Ａ１が、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ１−１（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ１−１の３’末端は、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、リンカーエレメント核酸配列Ａ１−１は、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１−１、ならびに５’末端および３’末端を有するバルジ核酸配列Ａ１−１を含み、バルジ核酸配列Ａ１−１の３’末端は、反復核酸配列Ａ１−１の５’末端に隣接する）、ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１−２を含む、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ１−２（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ１−２の３’末端は、リンカーエレメント核酸Ａ１−１の５’末端の５’側に位置する）をさらに含み；反復核酸配列Ａ２が、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ２−１（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ２−１の３’末端は、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置し、リンカーエレメント核酸配列Ａ２−１は、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２−１、ならびに５’末端および３’末端を有するバルジ核酸配列Ａ２−１を含み、バルジ核酸配列Ａ２−１の３’末端は、反復核酸配列Ａ２−１の５’末端に隣接する）、ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２−２を含む、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ２−２（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ２−２の３’末端は、リンカーエレメント核酸Ａ２−１の５’末端の５’側に位置する）をさらに含み；第３の連結エレメント１であって、反復核酸配列Ａ１Ｃが、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１−１Ｃ（ここで、反復核酸配列Ａ１−１Ｃの５’末端は、核酸配列１の３’末端の３’側に位置する）ならびに５’末端および３’末端を有するバルジ核酸配列Ａ１−１Ｃ（ここで、バルジ核酸配列Ａ１−１Ｃの５’末端は、反復核酸配列Ａ１−１Ｃの３’末端の３’側に位置する）を含むリンカーエレメント核酸配列Ａ１−１Ｃ（ここで、（ｉ）反復核酸配列Ａ１−１Ｃは、反復核酸配列Ａ１−１と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ１−１Ｃは、反復核酸配列Ａ１−１Ｃと反復核酸配列Ａ１−１の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ１−１と結合する）ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ１−２Ｃを含む、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ１−２Ｃ（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ１−２Ｃの５’末端は、リンカーエレメント核酸配列Ａ１−１Ｃの３’末端の３’側に位置し、（ｉ）反復核酸配列Ａ１−２Ｃは、反復核酸配列Ａ１−２と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ１−２Ｃは、反復核酸配列Ａ１−２Ｃと反復核酸配列Ａ１−２の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ１−２と結合する）をさらに含み；反復核酸配列Ａ２Ｃが、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２−１Ｃ（ここで、反復核酸配列Ａ２−１Ｃの５’末端は、核酸配列２の３’末端の３’側に位置する）ならびに５’末端および３’末端を有するバルジ核酸配列Ａ２−１Ｃ（ここで、バルジ核酸配列Ａ２−１Ｃの５’末端は、反復核酸配列Ａ２−１Ｃの３’末端の３’側に位置する）を含むリンカーエレメント核酸配列Ａ２−１Ｃ（ここで、（ｉ）反復核酸配列Ａ２−１Ｃは、反復核酸配列Ａ２−１と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ２−１Ｃは、反復核酸配列Ａ２−１Ｃと反復核酸配列Ａ２−１の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ２−１と結合する）ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列Ａ２−２Ｃを含む、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列Ａ２−２Ｃ（ここで、リンカーエレメント核酸配列Ａ２−２Ｃの５’末端は、リンカーエレメント核酸配列Ａ２−１Ｃの３’末端の３’側に位置し、（ｉ）反復核酸配列Ａ２−２Ｃは、反復核酸配列Ａ２−２と相補的であり、（ｉｉ）反復核酸配列Ａ２−２Ｃは、反復核酸配列Ａ２−２Ｃと反復核酸配列Ａ２−２の間の水素結合を介して反復核酸配列Ａ２−２と結合する）をさらに含む、実施形態３８に記載の複合体。
４０．反復核酸配列Ａ１および反復核酸配列Ａ１Ｃが二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１をさらに含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が、反復核酸配列Ａ１と反復核酸配列Ａ１Ｃの間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態３８または３９に記載の複合体。
４１．反復核酸配列Ａ２および反復核酸配列Ａ２Ｃが二本鎖核酸結合タンパク質結合部位２をさらに含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位２が、反復核酸配列Ａ２と反復核酸配列Ａ２Ｃの間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態３８〜４０のいずれか１つに記載の複合体。
４２．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１がＣｓｙ４タンパク質結合部位である、実施形態４０または４１に記載の複合体。
４３．操作された連結核酸１、第３の連結エレメント１、および第３の連結エレメント２がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態３８〜４２のいずれか１つに記載の複合体。
４４．第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質結合配列である、実施形態３８〜４３のいずれか１つに記載の複合体。
４５．（ｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２がスペーサー核酸配列２をさらに含む、および（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的である、実施形態３８〜４４のいずれか１つに記載の複合体。
４６．標的核酸配列１および標的核酸配列２がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態４５に記載の複合体。
４７．複合体が、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質および触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、実施形態３８〜４６のいずれか１つに記載の２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
４８．第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列ならびに５’末端および３’末端を有するスプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−１を含む、５’末端および３’末端を有する第１のスプリットネクサスエレメント１（ここで、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−１の３’末端の３’側に位置する）ならびに第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列ならびに５’末端および３’末端を有するスプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−１を含む、５’末端および３’末端を有する第１のスプリットネクサスエレメント２（ここで、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−１の３’末端の３’側に位置する）ならびに５’末端および３’末端を有する補助ポリヌクレオチド１−１（ここで、第１のスプリットネクサスエレメント１の５’末端は、補助ポリヌクレオチド１−１の３’末端に共有結合し、補助ポリヌクレオチド１−１の５’末端は、第１のスプリットネクサスエレメント２の３’末端に共有結合して、連結スプリットネクサスエレメントを形成する）；５’末端および３’末端を有する核酸配列１ならびに５’末端および３’末端を有する第１のステムエレメント核酸配列１−１（ここで、核酸配列１の３’末端は、第１のステムエレメント核酸配列１−１の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有するループエレメント核酸配列１（ここで、第１のステムエレメント核酸配列１−１の３’末端は、ループエレメント核酸配列１の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有する第１のステムエレメント核酸配列１−２（ここで、ループエレメント核酸配列１の３’末端は、第１のステムエレメント核酸配列１−２の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有する接続核酸配列１（ここで、第１のステムエレメント核酸配列１−２の３’末端は、接続核酸配列１の５’末端に共有結合する）ならびにスプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−２（ここで、接続核酸配列１の３’末端は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−２の５’末端に共有結合する）を含む、５’末端および３’末端を有する第２のスプリットネクサスエレメント１（ここで、（ｉ）第１のステムエレメント核酸配列１−１および第１のステムエレメント核酸配列１−２は、第１のステムエレメント核酸配列１−１と第１のステムエレメント核酸配列１−２の間の水素塩基対結合によって第１のステムエレメント１を形成する、ならびに（ｉｉ）スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−１およびスプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−２は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−１とスプリットネクサスステムエレメント核酸配列１−２の間の水素塩基対結合によってスプリットネクサスステムエレメント１を形成する）；ならびに５’末端および３’末端を有する核酸配列２ならびに５’末端および３’末端を有する第１のステムエレメント核酸配列２−１（ここで、核酸配列２の３’末端は、第１のステムエレメント核酸配列２−１の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有するループエレメント核酸配列２（ここで、第１のステムエレメント核酸配列２−１の３’末端は、ループエレメント核酸配列２の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有する第１のステムエレメント核酸配列２−２（ここで、ループエレメント核酸配列２の３’末端は、第１のステムエレメント核酸配列２−２の５’末端に共有結合する）、５’末端および３’末端を有する接続核酸配列２（ここで、第１のステムエレメント核酸配列２−２の３’末端は、接続核酸配列２の５’末端に共有結合する）ならびにスプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２（ここで、接続核酸配列１の３’末端は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２の５’末端に共有結合する）を含む、５’末端および３’末端を有する第２のスプリットネクサスエレメント２（ここで、（ｉ）第１のステムエレメント核酸配列２−１および第１のステムエレメント核酸配列２−２は、第１のステムエレメント核酸配列２−１と第１のステムエレメント核酸配列２−２の間の水素塩基対結合によって第１のステムエレメント２を形成する、ならびに（ｉｉ）スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−１およびスプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２は、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−１とスプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２の間の水素塩基対結合によってスプリットネクサスステムエレメント２を形成する）を含む、５’末端および３’末端を有する操作された連結スプリットネクサス核酸１を含む、２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
４９．第１のステムエレメント１が、５’から３’の方向に、下部ステムエレメント核酸配列１−１、バルジエレメント核酸配列１−１、上部ステムエレメント核酸配列１−１、ループエレメント核酸配列１、上部ステムエレメント核酸配列１−２、バルジエレメント核酸配列１−２、および下部ステムエレメント核酸配列１−２をさらに含み、上部ステムエレメント核酸配列１−１および上部ステムエレメント核酸配列１−２が、上部ステムエレメントヌクレオチド配列１−１と上部ステムエレメントヌクレオチド配列１−２の間の水素塩基対結合によって上部ステムエレメント１を形成し、下部ステムエレメント核酸配列１−１および下部ステムエレメント核酸配列１−２が、下部ステムエレメント核酸配列１−１と下部ステムエレメントヌクレオチド配列１−２の間の水素塩基対結合によって下部ステムエレメント１を形成する、実施形態４８に記載の複合体。
５０．第１のステムエレメント２が、５’から３’の方向に、下部ステムエレメント核酸配列２−１、バルジエレメント核酸配列２−１、上部ステムエレメント核酸配列２−１、ループエレメント核酸配列２、上部ステムエレメント核酸配列２−２、バルジエレメント核酸配列２−２、および下部ステムエレメント核酸配列２−２をさらに含み、上部ステムエレメント核酸配列２−１および上部ステムエレメント核酸配列２−２が、上部ステムエレメントヌクレオチド配列２−１と上部ステムエレメントヌクレオチド配列２−２の間の水素塩基対結合によって上部ステムエレメント２を形成し、下部ステムエレメント核酸配列２−１および下部ステムエレメント核酸配列２−２が、下部ステムエレメント核酸配列２−１と下部ステムエレメントヌクレオチド配列２−２の間の水素塩基対結合によって下部ステムエレメント２を形成する、実施形態４８または４９に記載の複合体。
５１．第２のスプリットネクサスエレメント１が、５’末端および３’末端を有する補助ポリヌクレオチド１−２をさらに含み、ここで、補助ポリヌクレオチド１−２の５’末端がスプリットネクサスステムエレメント核酸１−２の３’末端の３’側にあり、補助ポリヌクレオチド１−２が水素塩基対結合によって補助ポリヌクレオチド１−１と結合する、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載の複合体。
５２．補助ポリヌクレオチド１−１および補助ポリヌクレオチド１−２が、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１をさらに含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１が補助ポリヌクレオチド１−１と補助ポリヌクレオチド１−２の間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態５１に記載の複合体。
５３．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位１がＣｓｙ４タンパク質結合部位１である、実施形態５２に記載の複合体。
５４．第２のスプリットネクサスエレメント２が、５’末端および３’末端を有する補助ポリヌクレオチド２−２をさらに含み、ここで、補助ポリヌクレオチド２−２の５’末端が、スプリットネクサスステムエレメント核酸配列２−２の３’末端の３’側にあり、第１のスプリットネクサスエレメント２が、５’末端および３’末端を有する補助ポリヌクレオチド２−１をさらに含み、ここで、（ｉ）第１のスプリットネクサスエレメント２の５’末端が補助ポリヌクレオチド２−１の３’末端に共有結合し、（ｉｉ）補助ポリヌクレオチド２−２が水素塩基対結合によって補助ポリヌクレオチド２−１と結合する、実施形態４８〜５３のいずれか１つに記載の複合体。
５５．補助ポリヌクレオチド２−１および補助ポリヌクレオチド２−２が、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位２をさらに含み、二本鎖核酸結合タンパク質結合部位２が補助ポリヌクレオチド２−１と補助ポリヌクレオチド２−２の間の水素塩基対結合によって形成される、実施形態５４に記載の複合体。
５６．二本鎖核酸結合タンパク質結合部位２がＣｙｓ４タンパク質結合部位２である、実施形態５５に記載の複合体。
５７．操作された連結スプリットネクサス核酸１、第３の連結エレメント１、および第３の連結エレメント２がそれぞれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せを含む、実施形態４８〜５６のいずれか１つに記載の複合体。
５８．第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質結合配列である、実施形態４８〜５７のいずれか１つに記載の複合体。
５９．（ｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１をさらに含み、核酸配列２がスペーサー核酸配列２をさらに含む、および（ｉｉ）スペーサー核酸配列１が標的核酸配列１と相補的であり、スペーサー核酸配列２が標的核酸配列２と相補的である、実施形態４８〜５８のいずれか１つに記載の複合体。
６０．標的核酸配列１および標的核酸配列２がそれぞれ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される核酸配列である、実施形態５９に記載の複合体。
６１．複合体が、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列に結合した第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をさらに含み、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質および触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、実施形態４８〜６０のいずれか１つに記載の２つ以上の操作された足場形成核酸配列の複合体。
６２．５’末端および３’末端を有する第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント１ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１を含む第２のエレメント１（ここで、反復核酸配列１の３’末端は、第１の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）を含み、反復核酸配列１が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列１−１、反復核酸配列１ａ、リンカーエレメント核酸配列１−２、反復核酸配列１ｂ、およびリンカーエレメント核酸配列１−３で配置された、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列１−１、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１ａ、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列１−２、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１ｂ、ならびに５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列１−３をさらに含み；反復核酸配列１内の核酸配列が、反復核酸配列１内の任意の核酸配列と結合せず、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質に結合することができる水素結合を介してステムエレメントを形成する、第１の操作された核酸を含む、操作された核酸足場。
６３．５’末端および３’末端を有する核酸配列１を含む第３のエレメント１をさらに含み、（ｉ）核酸配列１の３’末端が反復核酸配列１の５’末端に共有結合し、（ｉｉ）核酸配列１がスペーサー核酸配列１を含む、実施形態６２に記載の操作された核酸足場。
６４．５’末端および３’末端を有する第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列を含む第１のエレメント２ならびに５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１Ｃを含む第２のエレメント２（ここで、反復核酸配列１Ｃの３’末端は、第２の核酸結合クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合配列の５’末端の５’側に位置する）を含み、反復核酸配列２が、以下の３’から５’の順序：リンカーエレメント核酸配列２−３、反復核酸配列１ｂＣ、リンカーエレメント核酸配列２−２、反復核酸配列１ａＣ、およびリンカーエレメント核酸配列２−１で配置された、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列２−１、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１ｂＣ、５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列２−２、５’末端および３’末端を有する反復核酸配列１ａＣ、ならびに５’末端および３’末端を有するリンカーエレメント核酸配列２−３をさらに含み；反復核酸配列１が、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣの間の水素結合を介して、および反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣの間の水素結合を介して、反復核酸配列２と結合する、第２の操作された核酸をさらに含む、実施形態６２または６３に記載の操作された核酸足場。
６５．５’末端および３’末端を有する、核酸配列２を含む第３のエレメント２をさらに含み、（ｉ）核酸配列２の３’末端が反復核酸配列１Ｃの５’末端に共有結合し、（ｉｉ）核酸配列２がスペーサー核酸配列２を含む、実施形態６４に記載の操作された核酸足場。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態がほんの一例として提供されることが当業者には明らかであろう。上記の説明および以下の実施例から、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を確認し、それを様々な使用および条件に適合させるために、本発明の変化、置換、変更、および改変を行うことができる。そのような変化、置換、変更、および改変も、本開示の範囲内にあることが意図される。
〔実施例〕
本発明の態様を、以下の実施例に例示する。使用される数（例えば、量、濃度、パーセント変化など）に関して正確性を確保するための努力が為されたが、ある程度の実験誤差および偏差が説明されるべきである。別途指摘しない限り、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるか、または大気圧の近くである。これらの実施例はほんの例示によって与えられるものであり、本発明者らが本発明の様々な態様と見なすものの範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの設計
本実施例は、本明細書に記載のＮＡＳＣのいくつかの実施形態のためのＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の設計の説明を提供する。
表９は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分と図面に示される構造との相関を記載する。「結合するＣａｓタンパク質」の列は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を使用することができるＣａｓタンパク質を列挙する。別途指摘しない限り、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、配列番号１００またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｄＣａｓ９タンパク質（配列番号１０１））である。Ｃｐｆ１タンパク質は、別途指摘しない限り、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１タンパク質（ｄＣｐｆ、配列番号１０５）である。
ポリヌクレオチド成分間でハイブリダイズする配列に下線を付す。核酸標的結合配列は、一連の２０個のＮ（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）によって示される。当業者であれば、核酸標的結合配列を操作することができる。
Figure 0006707133
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Figure 0006707133
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本明細書の指針に従って、当業者であれば、異なる同族Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１０３）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質（配列番号５６）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（配列番号９９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｄＣａｓ９（配列番号１０２）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１タンパク質（配列番号１０６）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄＣａｐｆ１タンパク質（配列番号１０７）またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃｐｆ１（配列番号１０４））のためのＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を設計することができる（例えば、本明細書に記載の他のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分に基づく）。
ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の産生
本実施例は、図６Ｇに示されるような、ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分ＮＡＳＣ−ＰＣ１（表９、一般標的配列、配列番号８３）およびＮＡＳＣ−ＰＣ２（表９、一般標的配列、配列番号８４）の産生を記載する。本実施例に記載のｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を、Ｃａｓ切断アッセイにおいて使用した（実施例５）。
ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１の第１のステムエレメント核酸配列と、第１のステムエレメント核酸配列と相補的なＮＡＳＣ−ＰＣ２の第１のステムエレメント核酸配列との間の安定な二次構造の形成を妨げ得る、各ＮＡＳＣ−ＰＣ内の二次構造の形成を制限するための異なる第１のステムエレメント核酸配列（図６Ｅ、６０８〜６０９および６１９〜６２０に示される）を含んでいた。
それぞれ、異なる上部および下部ステム核酸配列（それぞれ、図２Ｃ、２２１〜２２２／２２７〜２２８および２２３〜２２４／２２５〜２２６に示される）を含む、２つのｓｇＲＮＡ骨格を使用した（ｓｇＲＮＡ−１およびｓｇＲＮＡ−２）；バルジ配列は同じであった。
それぞれ２０ヌクレオチド長の、４つの核酸標的結合配列を選択した。４つの核酸標的結合配列のうちの１つを、ｓｇＲＮＡ−１およびｓｇＲＮＡ−２骨格の５’末端、ならびにＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２の５’末端に含有させた。４つの二本鎖ＤＮＡ標的配列は以下の通りであった：標的１（ＡＡＶＳＴ１）は、ヒトＡＡＶＳ−１標的配列に対応していた。標的２（ＶＴ２）、標的３（ＶＴ３）および標的４（ＶＴ４）は、ベクター配列（配列番号２０）中に存在するＤＮＡ標的配列であった。
ＤＮＡ配列の５’末端にＴ７プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ鋳型から、Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって、ＲＮＡ成分を産生した。
それぞれのｓｇＲＮＡ、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、およびＮＡＳＣ−ＰＣ２のための二本鎖ＤＮＡ鋳型を、それぞれのｓｇＲＮＡ、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、およびＮＡＳＣ−ＰＣ２に対応するＤＮＡ配列を含有する３’重複オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって集合させた。オリゴヌクレオチドプライマーを、表１０に提示する。
Figure 0006707133
ＤＮＡプライマーは、それぞれ２ｎＭの濃度で存在していた。一方のＤＮＡプライマーはＴ７プロモーター（配列番号１）に対応し、他方はＲＮＡ配列（配列番号２）の３’末端に対応しており、増幅反応を誘導するために６４０ｎＭの濃度で使用した。ＰＣＲ反応を、製造業者の指示書に従って、Ｑ５ホットスタート高忠実度２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して実行した。ＰＣＲ集合反応を、以下の温度サイクリング条件：９８℃で２分；９８℃で２０秒、５２．５℃で２０秒、７２℃で２０秒の２サイクル；次いで、９８℃で２０秒、５７℃で２０秒、７２℃で２０秒の３２サイクル；および７２℃で２分間の最終伸長を使用して実行した。ＤＮＡ産物の品質を、アガロースゲル電気泳動（１．５％、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によってＰＣＲ反応後に評価した。
それぞれのｓｇＲＮＡ、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、およびＮＡＳＣ−ＰＣ２のための０．２５〜０．５μｇのＤＮＡ鋳型を、３７℃で約１６時間、Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用する転写のための鋳型として使用した。転写反応物を、ＤＮａｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で処理して、ＧｅｎｅＪｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して精製した。ＲＮＡの収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量した。転写されたＲＮＡの品質を、アガロースゲル電気泳動（２％、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）によってチェックした。ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の配列を、表１１に示す。
Figure 0006707133
Figure 0006707133
Figure 0006707133
当業者であれば、本明細書の教示を考慮して、ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の産生のためのこの方法を、他のｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣポリヌクレオチド成分の産生に適用することができる。
二本鎖ＤＮＡ標的配列のプラスミド中へのクローニングによる切断アッセイにおける使用のための二本鎖ＤＮＡ標的配列の産生
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓタンパク質切断アッセイにおける使用のための二本鎖ＤＮＡ標的配列を、二本鎖核酸標的配列（例えば、ＡＡＶＳ−１標的配列）の、クローニングベクター骨格へのライゲーションにより産生した。各ベクターを、二本鎖ＤＮＡ標的配列の産生のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の好適な株に形質転換した。
ヒトアデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ−１）に対応する２５ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ標的配列を、５’末端の４７ヌクレオチドの無作為化核酸配列および３’末端の５３ヌクレオチドの無作為化核酸配列と共にｉｎ ｓｉｌｉｃｏで付加した。Ｅｌｅｃｔｒａ（商標）ベクターシステム（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）と適合するフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡ標的配列の５’末端および３’末端に組み込み、２３７ｂｐの一本鎖ＤＮＡ配列を産生した。２３７ｂｐの一本鎖ＤＮＡの核酸配列（「ＤＮＡクローニング断片」）、ならびにフォワードおよびリバース増幅オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列を、合成のために商業的製造者に提供した。これらの一本鎖ＤＮＡ配列を、表１２に示す。
Figure 0006707133
一本鎖ＤＮＡクローニング断片を、ＰＣＲにより増幅して、Ｅｌｅｃｔｒａ（商標）ベクターシステム（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）と共に使用するための二本鎖ＤＮＡを生成した。ＰＣＲ反応混合物は、以下の通りであった：総量２５μＬ中の０．５ユニットのＫＡＰＡ ＨｉＦｉホットスタート ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）、１×反応バッファー、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭフォワードプライマー（配列番号２１）、２００ｎＭリバースプライマー（配列番号２２）、および８０ｎＭのＤＮＡクローニング断片（配列番号１９）。ＤＮＡクローニング断片を、以下の条件：９５℃で４分、９８℃で２０秒、６０℃で２０秒、および７２℃で３０秒の３０サイクル、次いで、７２℃で５分の最終伸長を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｓｐｉｎ Ｓｍａｒｔ（商標）ＰＣＲ精製チューブ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）を使用して精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量した。
二本鎖ＤＮＡクローニング断片を、製造業者のクローニングプロトコールを使用して、市販の「ｐＤ４４１−ＳＲ：Ｔ５−ｓＲＢＳ−ＯＲＦ，Ｅｃｏｌｉ−Ｅｌｅｃ Ｄ」ベクター（Ｅｌｅｃｔｒａ（商標）細菌ＤＮＡベクター（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ））中にクローニングした。以下のクローニング反応混合物を製造した：最終容量２０μＬ中の、ＰＣＲ増幅されたクローニング断片２０ｎｇ、細菌ＤＮＡベクター２０ｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒａ（商標）バッファーミックス（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）２μｌ、およびＥｌｅｃｔｒａ（商標）酵素ミックス（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）１μｌ。次いで、クローニング反応混合物を簡単にボルテックスし、ベンチトップ遠心分離機を使用する遠心分離にかけ、室温で２０分間インキュベートした。
インキュベーション後、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｍａｃｈ１（商標）Ｔ１Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）化学コンピテント大腸菌細胞１μＬを、クローニング反応混合物２μＬと混合して、形質転換混合物を形成させ、氷中で３０分間インキュベートした。形質転換混合物を、４２℃で３０秒間、熱ショックにかけ、氷中で２分間インキュベートした。室温のＳ．Ｏ．Ｃ．培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）２５０μＬを形質転換混合物に添加し、混合物を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞混合物５０μＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に拡散し、細菌コロニー形成のためにプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
５個の細菌コロニーを拾い、５０μｇ／ｍＬカナマイシン培養培地を添加したＬＢ ５ｍＬを含有する別々の１５ｍＬの培養チューブに移し、チューブを振盪しながら８時間インキュベートした。細胞を、４０００ＲＰＭで１５分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地を吸引し、抗生物質を含まないＬＢ培養培地２００μＬ中に細胞を再懸濁した。ＤＮＡベクターを、製造業者の指示書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して５個の細菌コロニーの各々の細菌から抽出した。ＤＮＡベクターの収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量した。それぞれのＤＮＡベクター２５０ｎｇを、Ｓａｎｇｅｒ法により配列決定して、配列番号１９に対応するＤＮＡクローニング断片の組込みを検証した。ＡＡＶＳ−１標的配列を含む、完全なＤＮＡベクター配列を、配列番号２０として提供する。
ＤＮＡクローニング断片を含むＤＮＡベクターを含有すると同定された細菌クローンを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン培養培地を添加したＬＢ １００ｍＬ中で培養し、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。細胞を、４０００ＲＰＭで１５分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地を吸引し、ＤＮＡベクターを、製造業者の指示書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製した。ＤＮＡベクターの収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量した。
ＡｓｃＩ ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを用いる環状ベクターの線状化によってＣａｓ切断アッセイにおいて使用されるＤＮＡベクターを製造した。環状ＤＮＡベクターを線状化するために、以下の反応混合物を集合させた：最終容量５０μＬ中の、環状ＤＮＡベクター１μｇあたりＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１ユニット、および１×ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。反応混合物を、３７℃で１時間インキュベートし、８０℃で２０分間のインキュベーションによって反応を停止させた。線状ＤＮＡベクターを、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）を使用して精製した。線状ＤＮＡベクターの収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量した。
他の好適なクローニング方法およびＤＮＡベクターを、本質的には本実施例に記載の方法に従って、二本鎖ＤＮＡ標的配列の組込みのために使用することができる。ＤＮＡベクターの線状化が望ましくない、または必要ではない場合、環状ＤＮＡベクターをＣａｓ切断アッセイにおいて使用することができる。
ＰＣＲを使用する切断アッセイにおける使用のための二本鎖ＤＮＡ標的配列の産生
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓタンパク質切断アッセイにおける使用のための二本鎖ＤＮＡ標的配列を、ゲノムヒトＤＮＡに由来する選択された核酸標的配列のＰＣＲ増幅を使用して産生することができる。
アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ−１）を含むゲノムヒトＤＮＡを、ヒト細胞株Ｋ５６２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からフェノール−クロロホルム抽出によって製造することができる。ＰＣＲ反応を、製造業者の指示書に従って、Ｑ５ホットスタート高忠実度２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて実行することができる。最終容量２５μｌ中の２０ｎｇ／μＬのｇＤＮＡを使用して、以下の条件下：９８℃で２分、９８℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒の３５サイクル、および７２℃で２分の最終伸長で選択された核酸標的配列を増幅することができる。ＰＣＲ産物を、Ｓｐｉｎ Ｓｍａｒｔ（商標）ＰＣＲ精製チューブ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｒｌｄ、ＮＪ）を使用して精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量することができる。
ｇＤＮＡからのＡＡＶＳ−１ ＤＮＡ標的配列の増幅のために使用することができるフォワードおよびリバースプライマーの例を、表１３に提示する。
Figure 0006707133
ＡＡＶＳ−１ ＤＮＡ標的配列を、配列番号２３および配列番号２４を使用して増幅させて、４９５ｂｐの二本鎖ＡＡＶＳ−１ ＤＮＡ標的配列を産生することができる。
他の好適な二本鎖ＤＮＡ標的配列を、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを選択することにより、本質的には同じ方法を使用して取得することができる。任意の生物（例えば、植物、細菌、酵母、藻類など）に由来するｇＤＮＡを、ヒト細胞に由来するＤＮＡの代わりに使用することができる。さらに、ＤＮＡ標的配列を、ｇＤＮＡ以外のポリヌクレオチド（例えば、ベクターおよびゲル単離されたＤＮＡ断片）からＰＣＲによって増幅することができる。
Ｃａｓ切断アッセイ
本実施例は、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物による核酸標的配列の切断パーセンテージを評価するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物およびＣａｓ９タンパク質の使用を示す。
ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１の第１のステムエレメント核酸配列と、ＮＡＳＣ−ＰＣ１の第１のステムエレメント核酸配列と相補的なＮＡＳＣ−ＰＣ２の第１のステムエレメント核酸配列との間の水素結合形成を介する安定な二次構造の形成を妨げ得る、各ＮＡＳＣ−ＰＣ内の二次構造の形成を制限するための異なる第１のステムエレメント核酸配列を含んでいた。
本実施例において使用されるＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の一般成分は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１（表９、一般標的配列、配列番号８３）およびＮＡＳＣ−ＰＣ２（表９、一般標的配列、配列番号８４）であった。このＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２対の一般構造を、図６Ｇに示す。
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質と、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質とのリボ核タンパク質複合体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａｓ９切断アッセイにおいて使用して、ＤＮＡベクター上の対応する二本鎖ＤＮＡ標的配列と比較した各複合体の切断パーセントを評価した。
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質と、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９とのリボ核タンパク質複合体は、実施例２、表１１に記載されたｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２構築物を使用した。標的１（ＡＡＶＳＴ１）は、ヒトＡＡＶＳ−１標的配列に対応していた。標的２（ＶＴ２）、標的３（ＶＴ３）および標的４（ＶＴ４）は、ベクター配列（配列番号２０）中に存在するＤＮＡ標的配列であった。単一のｓｇＲＮＡまたは単一のＮＡＳＣポリヌクレオチド成分のみを用いる切断反応では、線状化されたベクターを使用した。２つのｓｇＲＮＡまたはＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２成分を用いる切断反応では、環状ベクターを使用した。ｓｇＲＮＡによる線状プラスミドの切断は、２つのＤＮＡ断片をもたらし、２つのｓｇＲＮＡまたはＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２成分による環状プラスミドの切断は、２つのＤＮＡ標的断片をもたらした。二本鎖ＤＮＡ標的配列のサイズおよび予測される切断断片のサイズを、表１４に提示する。
Figure 0006707133
ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２成分を、好適な作用濃度に希釈した。ｓｇＲＮＡおよびＮＡＳＣ−ＰＣ成分を、５０ｎＭの最終濃度で別々のチューブに分配した。ｓｇＲＮＡとＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２成分の対を、各成分につき５０ｎＭの最終濃度で別々のチューブに分配した。全てのＲＮＡを９５℃で２分間インキュベートし、サーモサイクラーから取り出し、室温に平衡化させた。切断反応において使用したｓｇＲＮＡとＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２成分との組合せを、表１５に提示する。
Figure 0006707133
それぞれのｓｇＲＮＡ反応混合物成分およびＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２反応混合物成分を、Ｃａｓ９反応混合物に添加した。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質を、大腸菌中で組換え的に発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学切断アッセイにおける使用のために精製した。Ｃａｓ９反応混合物は、反応バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および５％グリセリン、ｐＨ７．４）中の２００ｎＭの最終濃度に希釈されたＣａｓ９タンパク質を含んでいた。それぞれのＣａｓ９反応混合物を、３７℃で１０分間インキュベートした。それぞれのＣａｓ９反応混合物中での切断を、５ｎＭの最終濃度へのＤＮＡ標的ベクターの添加によって開始させた。それぞれのＣａｓ９反応混合物を混合し、簡単に遠心分離し、３７℃で１５分間インキュベートした。０．２μｇ／μＬおよび０．４４ｍｇ／μＬのＲＮａｓｅ Ａ溶液（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の最終濃度でプロテイナーゼＫ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）をそれぞれのＣａｓ９反応混合物に添加することにより、切断反応を終結させた。
次いで、それぞれのＣａｓ９反応混合物を、３７℃で２５分間および５５℃で２５分間インキュベートした。それぞれのＣａｓ９反応混合物を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）システムおよびＤＮＦ−４７４−０５０００高感度ＮＧＳ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用して切断活性について評価した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムからのデータは、それぞれの切断断片の濃度およびそれぞれのＣａｓ９反応混合物の切断後に残存するＤＮＡ標的ベータの濃度を提供した。それぞれのＣａｓ９反応混合物について、切断断片の和を、切断断片と、切断後に残存するＤＮＡ標的ベクターとの両方の和で除算することによって、切断パーセントを算出した。
表１６は、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質と、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９とのリボ核タンパク質複合体のそれぞれに関する切断データを提示する。
Figure 0006707133
表１６に例示されたデータは、反応物１８、２０、２２、および２４（表１６）のそれぞれのＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質複合体が、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質複合体の２つの核酸標的結合配列に対応する２つのＤＮＡ標的配列のＣａｓタンパク質媒介性部位特異的切断を容易にしたことを示すものである。さらに、それぞれのＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質複合体による部位特異的切断のパーセントは、２つのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体による同じ２つのＤＮＡ標的配列の部位特異的切断と本質的に等価であり、ここで、１つのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、第１のＤＮＡ標的配列での切断を標的化し、第２のｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、第２のＤＮＡ標的配列での切断を標的化した（反応物１７と１８；１９と２０；２１と２２；および２３と２４の切断パーセントを比較されたい）。表１６に例示されたデータはまた、結合したＣａｓ９タンパク質による部位特異的切断を標的化するために、それぞれのＮＡＳＣ−ＰＣ１が相補的ＮＡＳＣ−ＰＣ２と対形成することが必要であったこと（表１６、反応物９〜１６を参照されたい）；すなわち、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の個々のポリヌクレオチド成分は、Ｃａｓタンパク質媒介性部位特異的切断を支援することができなかったことを示すものである。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、本実施例に記載の生化学切断アッセイを、他のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物および同族Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質）を用いて実行することができる。
真核細胞中での標的配列改変の検出のためのディープシーケンシング分析
本実施例は、選択された二本鎖ＤＮＡ標的配列に対する、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物／Ｃａｓタンパク質複合体を使用する細胞中での切断パーセントを評価および比較するためのディープシーケンシング分析の使用を示す。
Ａ．ゲノム標的配列選択
２つの標的核酸配列を、ヒトゲノム中のエクソン領域（例えば、Ｘ線修復交差補完５（ＸＲＣＣ５）遺伝子配列）から選択することができる。ＰＡＭ配列の５’に隣接する長さ２０ヌクレオチドの核酸配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭ５’−ＮＧＧ）、例えば、表１７に例示されるＸＲＣＣ５標的ＤＮＡ配列を選択することができる。
Figure 0006707133
Ｂ．ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の構築
ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を含むＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用することができる。ＸＲＣＣ５Ｔ１に対応する核酸標的結合配列を、ＮＡＳＣ−ＰＣ１の５’末端に組み込み、ＸＲＣＣ５Ｔ３に対応する核酸標的結合配列を、ＮＡＳＣ−ＰＣ２の５’末端に組み込むことができる。陽性対照として、ＸＲＣＣ５Ｔ１に対応する核酸標的結合配列を、ｓｇＲＮＡの５’末端に組み込み、ＸＲＣＣ５Ｔ３に対応する核酸標的結合配列を、ｓｇＲＮＡの５’末端に組み込むことができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、およびｓｇＲＮＡを、実施例２に記載のように産生することができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、およびｓｇＲＮＡの配列の例を、表１８に与える。
Figure 0006707133
Ｃ．ＮＡＳＣ／Ｃａｓ９タンパク質核タンパク質複合体の形成
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を、２つの核局在化配列（ＮＬＳ）を用いてＣ末端タグ付けし、大腸菌中で組換え発現させ、クロマトグラフィー法を使用して精製することができる。８０ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質：１２０ｐｍｏｌのＮＡＳＣ−ＰＣ１：１２０ｐｍｏｌのＮＡＳＣ−ＰＣ２の濃度で、リボ核タンパク質複合体を形成させることができる。対照ｓｇＲＮＡ成分を、同様の様式でＣａｓ９タンパク質とのリボ核タンパク質複合体中に個々に集合させることができる。Ｃａｓ９タンパク質との集合の前に、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、およびｓｇＲＮＡを、最終容量２Ｌ中の所望の濃度（１２０ｐｍｏｌ）に希釈し、９５℃で２分間インキュベートし、サーモサイクラーから取り出し、室温に平衡化させることができる。Ｃａｓ９タンパク質を、最終容量３μＬで結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および５％グリセリン、ｐＨ７．４）中の適切な濃度に希釈し、それぞれ２μＬのＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、およびｓｇＲＮＡと混合した後、３７℃で３０分間インキュベートすることができる。
Ｄ．ＮＡＳＣ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を使用する細胞トランスフェクション
リボ核タンパク質複合体を、製造業者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）９６ウェルのシャトルシステム（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）中にトランスフェクトすることができる。リボ核タンパク質複合体を、ウェルが培養培地中にＨＥＫ２９３細胞を含有する、９６ウェルプレートの個々のウェル中に５μＬの最終容量で分注することができる。細胞培養培地を、プレートのウェルから取り出し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて細胞を剥離させることができる。懸濁したＨＥＫ２９３細胞を、２００×ｇで３分間の遠心分離によってペレット化することができる。ＴｒｙｐＬＥ試薬を吸引し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム非含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することができる。細胞を、２００Ｘｇで３分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳを吸引し、細胞ペレットを、カルシウムおよびマグネシウム非含有ＰＢＳ １０ｍＬ中に再懸濁することができる。
細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ自動細胞計数装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して計数することができる。２．２×１０7個の細胞を１．５ｍｌのマイクロ遠心管に移し、ペレット化させることができる。ＰＢＳを吸引し、細胞を１×１０7個の細胞／ｍＬの密度となるようにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＳＦ溶液（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）中に再懸濁することができる。細胞懸濁液２０μＬを、リボ核タンパク質複合体５μＬを含有するそれぞれ個々のウェルに添加し、各ウェルから全量を９６ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）プレート（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）のウェルに移すことができる。プレートを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）上にロードし、９６−ＣＭ−１３０ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用して、細胞をヌクレオフェクトすることができる。ヌクレオフェクション後、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）７０μＬを各ウェルに添加した後、細胞懸濁液５０μＬを、予め温めたＤＭＥＭ完全培養培地１５０μＬを含有する９６ウェル細胞培養プレートに移すことができる。次いで、プレートを組織培養インキュベータに移し、５％ＣＯ2中、３７℃で４８時間維持することができる。
Ｅ．ディープシーケンシングのための二本鎖ＤＮＡ標的配列の生成
ウェルあたり５０μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用するリボ核タンパク質複合体のトランスフェクションの４８時間後にＨＥＫ２９３細胞からｇＤＮＡを単離した後、３７℃で１０分間、６５℃で６分間、および９５℃で３分間インキュベートして、反応を停止させることができる。単離されたｇＤＮＡを、滅菌水５０μＬで希釈し、試料を−８０℃で保存することができる。
単離されたｇＤＮＡを使用して、最終容量１０μＬ中の１×濃度のＱ５ホットスタート高忠実度２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、それぞれ０．５μＭのプライマー、ｇＤＮＡ ３．７５μＬを使用して第１のＰＣＲを実行し、９８℃で１分、９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒の３５サイクル、および７２℃で２分の最終伸長で増幅することができる。ＸＲＣＣ５＿Ｔ１領域（例えば、配列番号４７および配列番号４８）またはＸＲＣＣ５＿Ｔ３（配列番号４９および配列番号５０）のいずれかを増幅するようにプライマーを設計することができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９ヌクレオフェクトされた試料およびｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヌクレオフェクトされた試料から調製されたｇＤＮＡを、両方のプライマー対を用いて別々に増幅させて、リボ核タンパク質による各標的部位の編集を評価することができる。各ＰＣＲ反応物を、水中で１：１００に希釈することができる。
「バーコード」ＰＣＲを、各試料についてユニークな指標プライマーを使用して設定して、多重配列決定を容易にすることができる。そのようなプライマー対の例を、表１９に示す。
Figure 0006707133
バーコードＰＣＲを、最終容量１０μＬ中の、１×濃度のＱ５ホットスタート高忠実度２×マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、それぞれ０．５μＭのプライマー（表１９）、１：１００に希釈した第１のＰＣＲ １μＬを使用して実行し、９８℃で１分、９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒の１２サイクル、および７２℃で２分の最終伸長で増幅することができる。
Ｆ．ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ
全てのバーコードＰＣＲ反応物をプールし、配列決定のためのアンプリコンのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｃｌｅａｎｕｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）のために単一のマイクロ遠心管に移すことができる（「アンプリコンライブラリー」）。
各チューブに、０．９×容量のＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを添加し、混合し、室温で１０分間インキュベートすることができる。マイクロ遠心管を、溶液が透明になるまで磁気チューブスタンド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）上に置くことができる。上清を除去および廃棄し、残留ビーズを１容量の８５％エタノールで洗浄し、室温で３０秒間インキュベートすることができる。インキュベーション後、エタノールを吸引し、ビーズを室温で１０分間、空気乾燥させることができる。各マイクロ遠心管を磁気スタンドから取り出し、０．２５×容量のＱｉａｇｅｎ ＥＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をビーズに添加し、激しく混合し、室温で２分間インキュベートすることができる。各マイクロ遠心管を磁石に戻し、溶液が透明になるまでインキュベートした後、精製されたアンプリコンを含有する上清を清潔なマイクロ遠心管に分注することができる。精製されたアンプリコンライブラリーを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量し、ライブラリーの品質を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｄ、ＩＡ）およびＤＮＦ−９１０二本鎖ＤＮＡ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｄ、ＩＡ）を使用して分析することができる。
Ｇ．ディープシーケンシングの設定
プールしたアンプリコンライブラリーを、定量された値およびアンプリコンの平均サイズから算出された４ｎＭ濃度に対して正規化することができる。アンプリコンライブラリーを、２回の１５１サイクルのペアエンドラン＋２回の８サイクルのインデックスリードを含む３００サイクルについてＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いるＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上で分析することができる。
Ｈ．ディープシーケンシングのデータ分析
シーケンシングデータ中の生成物の同一性を、バーコードＰＣＲ中のアンプリコン上で適合させたインデックスバーコード配列に基づいて決定することができる。例えば、以下のタスク：
・Ｂｏｗｔｉｅ（ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）ソフトウェアを使用して、リードをヒトゲノム（構造ＧＲＣｈ３８／３８）に対して整列させることができる
・整列されたリードを、予想される野生型遺伝子座領域（例えば、ＸＲＣＣ５＿Ｔ１またはＸＲＣＣ５＿Ｔ３）と比較することができる
・標的遺伝子座のいかなる部分とも整列しない遺伝子座配列およびリードを廃棄することができる
・野生型標的遺伝子座配列に一致するリードを集計することができる
・インデル（塩基の挿入または欠失）を有するリードを、インデル型によって分類し、集計することができる
・全インデルリードを、野生型リードとインデルリードの和で除算して、突然変異リードのパーセントを得ることができる
を実行するコンピュータスクリプトを使用して、ＭｉＳｅｑデータを処理することができる。
ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質リボ核タンパク質複合体およびｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質リボ核タンパク質複合体によって標的化される領域でのインデル配列の同定により、ヒト細胞株の配列特異的標的化を決定することができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２試料中での編集を、ｓｇＲＮＡ対照の編集効率と比較することができる。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、ゲノム配列の細胞中での編集を、他のＣａｓタンパク質およびその同族ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を用いて実行することができる。
ｃｒＲＮＡの同定およびスクリーニング
本実施例では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系を有する種のｃｒＲＮＡを同定することができる方法が記載される。ここで提供される方法は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．ら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：７２６〜７３７頁（２０１３）から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はない。
Ａ．クラス２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含有する種の同定
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、様々な種のゲノムの検索を行って、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃａｓ９様タンパク質、Ｃｐｆ１様タンパク質など）を同定することができる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系は、種を横断する高い配列多様性を示すが、クラス２ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオルソログは保存されたドメイン、例えば、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび／またはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する。一次ＢＬＡＳＴの結果を、同定されたドメインについてフィルタリングし、不完全な、またはトランケートされた配列を廃棄し、クラス２ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオルソログを有する種を同定することができる。
クラス２ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼオルソログをある種において同定することができる場合、Ｃａｓタンパク質オルソログコード配列（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質）に隣接する配列を他のＣａｓタンパク質および結合した反復−スペーサーアレイについて探査して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座に属する全ての配列を同定することができる。これを、他の公知のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座とのアラインメントによって行うことができる。
ヌクレアーゼオルソログのためのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列をその種について同定することができたら、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの予測スクリーニングを使用して、ｃｒＲＮＡ配列を抽出することができる。ｃｒＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ反復アレイ内に含まれ、外来スペーサー配列によって空間が置かれたそのホールマーク反復配列によって同定することができる。
Ｂ．ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの製造
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定された個々のｃｒＲＮＡを含有する推定ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を使用してさらに検証することができる。
推定ｃｒＲＮＡを含むと同定された種に由来する細胞を、商業的貯蔵所（例えば、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｕｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から調達することができる。
細胞を対数中期まで増殖させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して総ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）で処理することができる。
総ＲＮＡ １０μｇを、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ除去キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、残存するＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアンドコンセントレーター（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して精製することができる。
次いで、製造業者の指示書に従って、ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ライブラリーを製造することができる。これにより、アダプター配列を有するｃＤＮＡが得られる。
得られるｃＤＮＡライブラリーを、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して配列決定することができる。
Ｃ．配列決定データのプロセシング
ｃＤＮＡライブラリーの配列決定リードを、例えば、以下の方法を使用してプロセシングすることができる。
アダプター配列を、ｃｕｔａｄａｐｔ１．１（ｐｙｐｉ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｙｐｉ／ｃｕｔａｄａｐｔ／１．１）を使用して除去し、約１５ｎｔを、リードの３’末端からトリミングして、リード品質を改善することができる。
Ｂｏｗｔｉｅ２（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｂｏｗｔｉｅ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を使用して、リードを対応する種（すなわち、推定ｃｒＲＮＡが同定された種）のゲノムと整列させることができる。
Ｂｏｗｔｉｅ２によって生成されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ（ＳＡＭ）ファイルを、その後の配列決定分析工程のために、ＳＡＭＴｏｏｌｓ（ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してＢｉｎａｒｙ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ（ＢＡＭ）ファイルに変換することができる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対するリードカバーマッピングを、ＢｅｄＴｏｏｌｓ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）を使用してＢＡＭファイルから算出することができる。
前工程で生成されたＢＥＤファイルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ；ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／）中にロードして、配列決定リードパイルアップを可視化することができる。リードパイルアップを使用して、転写される推定ｃｒＲＮＡ配列の５’および３’末端を同定することができる。
ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、推定ｃｒＲＮＡエレメント配列がｉｎ ｖｉｖｏで活発に転写されることを検証することができる。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびＲＮＡ−ｓｅｑスクリーンの比較からの確認されたヒットを、本明細書に概略される方法（例えば、実施例２、３、および５）を使用して、二本鎖ＤＮＡ標的核酸配列のクラス２ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ切断を支援する機能的能力について検証することができる。クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、二本鎖ＤＮＡ標的配列のＣｐｆ１ヌクレアーゼ切断を容易にするためにｃｒＲＮＡのみを必要とするが、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、二本鎖ＤＮＡ標的配列のＣａｓ９ヌクレアーゼ切断を容易にするためにｃｒＲＮＡと同族ｔｒａｃｒＲＮＡとを必要とすることが当業界で公知である。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、Ｃａｓ９タンパク質と結合したｃｒＲＮＡ配列の同定を実行することができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡの同定およびスクリーニング
本実施例は、例えば、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を有する種のｔｒａｃｒＲＮＡを同定することができる方法を示す。これは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．ら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：７２６〜７３７頁（２０１３）から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はない。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＩＩ型系を含有する種の同定
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、様々な種のゲノムの検索を行って、Ｃａｓ９タンパク質を同定することができる。クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、種を横断する高い配列多様性を示すが、Ｃａｓ９オルソログは、中央のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびスプリットＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅドメインの保存されたドメイン構造を示す。一次ＢＬＡＳＴの結果を、同定されたドメインについてフィルタリングし、不完全な、またはトランケートされた配列を廃棄し、Ｃａｓ９オルソログを同定することができる。
Ｃａｓ９オルソログをある種において同定することができる場合、Ｃａｓ９オルソログコード配列に隣接する配列を他のＣａｓタンパク質およびＣａｓに結合した反復−スペーサーアレイについて探査して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座に属する全ての配列を同定することができる。密接に関連する種が類似するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座構造（例えば、Ｃａｓタンパク質組成、サイズ、向き、アレイの位置、ｔｒａｃｒＲＮＡの位置など）を示すという知識を用いて、これを、他の公知のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座とのアラインメントによって行うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは、典型的にはクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座内に含まれ、反復−スペーサーアレイ中の反復エレメントに対するその配列相補性によって容易に同定することができる。反復エレメントと相補的なｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ抗反復配列と呼ばれる。
Ｃａｓ９オルソログに対応するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座の配列をある種について同定したら、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの予測スクリーニングを使用して、ｔｒａｃｒ抗反復配列を抽出して、Ｃａｓ結合ｔｒａｃｒＲＮＡを同定することができる。推定抗反復を、例えば、以下のようにスクリーニングすることができる。
反復配列が既知の種に由来する場合、反復配列を、ＣＲＩＳＰＲｄｂデータベース（ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／）中で同定し、それから回収することができる。反復配列が既知の種に由来するものではない場合、反復配列を、上記の種についてクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座を使用して、ＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒソフトウェア（ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／Ｓｅｒｖｅｒ）を用いて予測することができる。
その種について同定された反復配列を使用して、抗反復配列のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座を探査することができる（例えば、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムなどを使用する）。検索は、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子座の遺伝子間領域に限定される。
同定されたｔｒａｃｒ抗反復領域を、同定された反復配列との相補性について検証することができる。
推定抗反復領域を、Ｒｈｏ独立転写ターミネーターの存在について推定抗反復領域の５’および３’領域中で探査することができる（ＴｒａｎｓＴｅｒｍ ＨＰ、ｔｒａｎｓｔｅｒｍ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ／）。
抗反復エレメントとＲｈｏ独立転写ターミネーターとを含む同定された配列を組み合わせることにより、配列を、所与の種の推定ｔｒａｃｒＲＮＡであると決定することができる。
Ｂ．ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの製造
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定された、推定ｔｒａｃｒＲＮＡを、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を使用してさらに検証することができる。
推定ｔｒａｃｒＲＮＡを含む種に由来する細胞を、商業的貯蔵所（例えば、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｕｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から調達することができる。
細胞を対数中期まで増殖させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して総ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）で処理することができる。
総ＲＮＡ １０μｇを、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ除去キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して処理し、残存するＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアンドコンセントレーター（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して精製することができる。
製造業者の指示書に従って、ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ライブラリーを製造することができる。これにより、アダプター配列を有するｃＤＮＡが得られる。
得られるｃＤＮＡライブラリーを、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して配列決定することができる。
Ｃ．配列決定データのプロセシング
ｃＤＮＡライブラリーの配列決定リードを、例えば、以下の方法を使用してプロセシングすることができる。
アダプター配列を、ｃｕｔａｄａｐｔ１．１（ｐｙｐｉ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｙｐｉ／ｃｕｔａｄａｐｔ／１．１）を使用して除去し、約１５ｎｔを、リードの３’末端からトリミングして、リード品質を改善することができる。
Ｂｏｗｔｉｅ２（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ−ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｂｏｗｔｉｅ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を使用して、リードを、対応する種（すなわち、推定ｃｒＲＮＡが同定された種）のゲノムと整列させることができる。
Ｂｏｗｔｉｅ２によって生成されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ（ＳＡＭ）ファイルを、その後の配列決定分析工程のために、ＳＡＭＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してＢｉｎａｒｙ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ（ＢＡＭ）ファイルに変換することができる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に対するリードカバーマッピングを、ＢｅｄＴｏｏｌｓ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）を使用してＢＡＭファイルから算出することができる。
前工程で生成されたＢＥＤファイルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ；ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ／）中にロードして、配列決定リードパイルアップを可視化することができる。リードパイルアップを使用して、転写される推定ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’および３’末端を同定することができる。
ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、推定ｔｒａｃｒＲＮＡエレメント配列がｉｎ ｖｉｖｏで活発に転写されることを検証することができる。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびＲＮＡ−ｓｅｑスクリーンの比較からの確認されたヒットを、本明細書に概略される方法（例えば、実施例２、３、および５）を使用して、二本鎖ＤＮＡ標的配列のＣａｓ９媒介性切断を支援する、同定されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列およびその同族ｃｒＲＮＡの機能的能力について検証することができる。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、Ｃａｓ９タンパク質と関連するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の同定を達成することができる。
真核細胞中での標的配列改変の検出のためのＴ７Ｅ１アッセイ
本実施例は、選択された二本鎖ＤＮＡ標的配列と比較した、ＮＡＳＣ／Ｃａｓ９タンパク質複合体（例えば、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２／Ｃａｓ９タンパク質複合体）のｉｎ ｖｉｖｏでの切断パーセントを評価および比較するためのＴ７Ｅ１アッセイの使用を示す。
Ａ．Ｃａｓポリヌクレオチド成分を使用する細胞のトランスフェクション
ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）９６ウェルのシャトルシステム（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）および以下のプロトコールを使用して、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９）中にトランスフェクトすることができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１およびＮＡＳＣ−ＰＣ２を、適切な濃度（例えば、１２０ｐｍｏｌ）に個々に希釈し、一緒に混合し、９５℃で２分間インキュベートし、サーモサイクラーから取り出し、室温に平衡化させて、９６ウェルプレート中、最終容量５μＬで分注することができる。培養培地をＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９細胞から吸引し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム非含有ＰＢＳで１回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の添加によってトリプシン処理した後、３７℃で３〜５分間インキュベートすることができる。トリプシン処理された細胞を、穏やかにピペットを上下させて単一細胞懸濁液を形成させ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を含有し、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＤＭＥＭ培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から構成されるＤＭＥＭ完全培養培地に添加することができる。
細胞を、２００Ｘｇで３分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地を吸引し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁することができる。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ自動細胞計数装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して計数することができる。２．２×１０7個の細胞を、１．５ｍｌのマイクロ遠心管に移し、ペレット化させることができる。ＰＢＳを吸引し、細胞を、１×１０7細胞／ｍＬの密度でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＳＦ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）溶液中に再懸濁することができる。細胞懸濁液２０μＬを、ＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２ ５μＬを含有する個々のウェルに添加し、全容量を９６ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）プレート（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）のウェルに移すことができる。プレートをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルのＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）上に載せ、細胞を、９６−ＣＭ−１３０ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用してヌクレオフェクトすることができる。ヌクレオフェクション後、ＤＭＥＭ完全培養培地７０μＬを各ウェルに添加し、細胞懸濁液５０μＬを、予め温めたＤＭＥＭ完全培養培地１５０μＬを含有するコラーゲン被覆９６ウェル細胞培養プレートに移すことができる。プレートを、組織培養インキュベータに移し、５％ＣＯ2中、３７℃で４８時間維持することができる。
Ｂ．Ｔ７Ｅ１アッセイのための二本鎖ＤＮＡ標的配列の生成
ｇＤＮＡを、ウェルあたり５０μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＮＡＳＣ−ＰＣ１／ＮＡＳＣ−ＰＣ２をトランスフェクトした後、３７℃で１０分間、６５℃で６分間および９５℃で３分間インキュベートして反応を停止させた４８時間後にＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９細胞から単離することができる。ｇＤＮＡを、水１５０μＬで希釈し、試料を−８０℃で保存することができる。
Ｔ７Ｅ１のためのＤＮＡを、単離されたｇＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ標的配列（例えば、ＸＲＣＣ５＿Ｔ１およびＸＲＣＣ５＿Ｔ３）のＰＣＲ増幅によって生成することができる。ＰＣＲ反応を、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉホットスタートポリメラーゼと共に鋳型としてｇＤＮＡ ８μＬを使用して設定することができ、それは、総量２５μＬ中に、０．５Ｕのポリメラーゼ、１×反応バッファー、０．４ｍＭのｄＮＴＰならびに二本鎖ＤＮＡ標的配列（例えば、配列番号４７／配列番号４８および配列番号４９／配列番号５０）の１つに対する３００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーを含有する。ＤＮＡ標的配列を、以下の条件：９５℃で５分、９８℃で２０秒、７０℃で２０秒、−２℃／サイクル、７２℃で３０秒の４サイクル、次いで、９８℃で１５秒、６２℃で２０秒、７２℃で２０秒の３０サイクル、および７２℃で１分の最終伸長を使用して増幅することができる。
Ｃ．Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイのためのＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡ標的配列を、９５℃で１０分間変性させた後、サーマルサイクラー中、−０．５℃／秒で２５℃まで冷却することによって再アニーリングさせることができる。再アニーリングしたＤＮＡを、総量１５μＬ中、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中のＴ７エンドヌクレアーゼＩ ０．５μＬと共に、３７℃で２５分間インキュベートすることができる。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）およびＤＮＦ−９１０二本鎖ＤＮＡ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用してＴ７Ｅ１反応を分析することができる。Ｆｒａｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムは、それぞれの切断断片の濃度および切断後に残存する二本鎖ＤＮＡ標的配列の濃度を提供する。
二本鎖ＤＮＡ標的配列の切断パーセンテージを、以下の式：
Figure 0006707133
 を使用して、それぞれの切断断片および切断が起こった後に残存する二本鎖ＤＮＡ標的配列の濃度から算出することができる。
式１において、断片１および断片２の濃度は、二本鎖ＤＮＡ標的配列のＣａｓ９切断断片の濃度に対応し、親は、切断が起こった後に残存する二本鎖ＤＮＡ標的配列に対応する。
真核細胞中での標的配列改変の検出のためのＴ７Ｅ１アッセイは、本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物が複数の二本鎖ＤＮＡ標的配列のＣａｓ９媒介性部位特異的ｉｎ ｖｉｖｏ切断を容易にすることを証明するためのデータを提供する。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と同じＤＮＡ標的結合配列を有するｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドもアッセイに含有させて、構築物間のＣａｓ媒介性部位特異的切断パーセンテージを比較することができる。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、本実施例に記載のＴ７Ｅ１アッセイを、他のＣａｓタンパク質およびその同族ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を用いて実行することができる。
クラス２ Ｖ型Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ骨格における改変の許容部位の探査
本実施例は、クラス２ Ｖ型ガイドｃｒＲＮＡの様々な改変の生成および試験ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド成分を構築する際に使用するためのその好適性を記載する。以下に記載される方法は、Ｂｒｉｎｅｒ，Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６（２）：３３３〜３３９頁（２０１４）から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はない。
本実施例では、改変をｃｒＲＮＡ骨格中に導入し、改変されたｃｒＲＮＡを、同族Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを用いて試験して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分のための結合を操作することができるＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ骨格中の領域または位置の同定を容易にすることができる。
クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１）に由来するｃｒＲＮＡを、操作のために選択することができる。ｃｒＲＮＡ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで改変して、１つまたはそれ以上の塩基置換、欠失、または挿入を、以下の領域：プソイドノットの５’側の核酸配列、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１、プソイドノットループ（ループエレメント核酸配列）、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１Ｃ、またはスペーサーエレメントのうちの１つまたはそれ以上から選択される領域中の核酸配列中に導入することができる。
ｃｒＲＮＡ配列を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで改変して、以下のもの：プソイドノットの５’側の核酸配列、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１、プソイドノットループ（ループエレメント核酸配列）、Ｃｐｆ１−ステムＲＮＡ配列１Ｃ、またはスペーサーエレメントから選択される１つまたはそれ以上の領域中のホスホジエステル骨格中に１つまたはそれ以上の破壊を導入することができる。
また、塩基改変を使用して、任意のｃｒＲＮＡ領域の水素塩基対相互作用中に不一致を導入するか、または２つの塩基の置換によって代替的な水素塩基対相互作用を導入する塩基対突然変異を導入することもでき、ここで、代替的な水素塩基対相互作用は、元の水素塩基対相互作用と異なる（例えば、元の水素塩基対相互作用は、ワトソン−クリックの塩基対であり、２つの塩基の置換は、逆フーグスティーン塩基対を形成する）。塩基の置換を使用して、ｃｒＲＮＡ骨格内（例えば、プソイドノットループ配列内）に水素塩基対相互作用を導入することもできる。
ｃｒＲＮＡの領域を独立に操作して、ｃｒＲＮＡ骨格中に二次構造エレメントを導入することができる。そのような二次構造エレメントとしては、限定されるものではないが、以下のもの：ステムループエレメント、ステムエレメント、プソイドノット、およびリボザイムが挙げられる。さらに、ｃｒＲＮＡガイドＲＮＡ骨格を改変して、ｃｒＲＮＡの５’末端、３’末端、または内部にある欠失により、ｃｒＲＮＡ骨格の部分を欠失させることができる。代替的な骨格構造を導入することもできる。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたｃｒＲＮＡ配列を、合成のために商業的製造業者に提供することができる。
改変されたｃｒＲＮＡを、改変されたｃｒＲＮＡを生じたｃｒＲＮＡへの、同族Ｃｐｆ１タンパク質により媒介される二本鎖ＤＮＡ標的配列の切断を支援するその能力について評価することができる。二本鎖ＤＮＡ標的配列の増幅および生化学切断アッセイを、それぞれ、実施例４および実施例５に記載のものと類似する様式で実行することができる。ＤＮＡ標的配列の、その同族Ｃｐｆ１タンパク質を用いる切断を媒介することができる改変されたｃｒＲＮＡを、実施例６に記載の方法を使用して細胞中の活性について検証することができる。
本明細書および実施例の指針に従って、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの改変（例えば、様々な配列の導入もしくは欠失、および／または二次構造改変の導入もしくは欠失）を使用して、挿入または結合のための位置を探査して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の作製を容易にすることができる。当業者であれば、本明細書の教示を考慮して、他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１タンパク質および他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡを用いて本実施例を実行することができる。
クラス２ ＩＩ型Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ骨格における改変の許容部位の探査
本実施例は、クラス２ ＩＩ型ガイドＲＮＡの様々な改変の生成および試験ならびにＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を構築する際に使用するためのその好適性を記載する。
本実施例では、改変を、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（例えば、デュアルガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ）のＲＮＡ骨格中に導入して、様々な核酸配列の操作または結合のための位置を同定することができる。以下に記載される方法は、Ｂｒｉｎｅｒ，Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６（２）：３３３〜３３９頁（２０１４）から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はない。
クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（集合的に、「Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ」と呼ばれる）を、操作のために選択することができる。
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ配列を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで改変して、以下のもの：核酸標的結合配列、下部ステム核酸配列、バルジ核酸配列、上部ステム核酸配列、第１のステムループエレメント核酸配列、ネクサス核酸配列、連結核酸配列、および／または３’ヘアピンの１つまたはそれ以上から選択される領域中に、１つまたはそれ以上の塩基置換、欠失、または挿入を導入することができる。Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで改変して、以下のもの：核酸標的結合配列、下部ステム核酸配列、バルジ核酸配列、上部ステム核酸配列、第１のステムループエレメント核酸配列、ネクサス核酸配列、連結核酸配列、および３’ヘアピンから選択される１つまたはそれ以上の領域中のホスホジエステル骨格中に１つまたはそれ以上の破壊を導入することができる。
塩基改変を使用して、任意のＣａｓ９ガイドＲＮＡ領域の水素塩基対相互作用中に不一致を導入することができる。塩基対突然変異を使用して、２つの塩基の置換によって代替的な水素塩基対相互作用を導入することもでき、ここで、代替的な水素塩基対相互作用は、元の水素塩基対相互作用と異なる（例えば、元の水素塩基対相互作用は、ワトソン−クリックの塩基対であり、２つの塩基の置換は、逆フーグスティーン塩基対を形成する）。塩基の置換を使用して、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ骨格内（例えば、バルジ配列内）に水素塩基対相互作用を導入することもできる。
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの領域を独立に操作して、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ骨格中に二次構造エレメントを導入することができる。そのような二次構造エレメントとしては、限定されるものではないが、以下のもの：ステムループエレメント、ステムエレメント、プソイドノット、およびリボザイムが挙げられる。さらに、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ骨格を改変して、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端、および／または内部にある欠失により、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ骨格の部分を欠失させることができる。代替的な骨格構造を導入することもできる。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓガイドＲＮＡ配列を、合成のために商業的製造業者に提供することができる。
改変されたクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを、改変されたＣａｓ９ガイドＲＮＡを生じたＣａｓ９ガイドＲＮＡへの、同族Ｃａｓ９タンパク質により媒介される二本鎖ＤＮＡ標的配列の切断を支援する能力について評価することができる。二本鎖ＤＮＡ標的配列の増幅および生化学切断アッセイを、それぞれ、実施例４および実施例５に記載のものと類似する様式で実行することができる。ＤＮＡ標的配列の、その同族Ｃａｓ９タンパク質を用いる切断を媒介することができる改変されたＣａｓ９ガイドＲＮＡを、実施例６に記載の方法を使用して細胞中の活性について検証することができる。
本明細書および実施例の指針に従って、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの改変（例えば、様々な配列の導入もしくは欠失、および／または二次構造改変の導入もしくは欠失）を使用して、挿入または結合のための位置を探査して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の作製を容易にすることができる。当業者であれば、本明細書の教示を考慮して、他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９タンパク質および他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを用いて本実施例を実行することができる。
ＤＮＡ標的結合配列を含むＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物のスクリーニング
本実施例は、ヒトｇＤＮＡ中に存在するＤＮＡ標的配列を改変し、これらの部位での切断活性のレベルを測定するための本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の使用を示す。
標的部位（ＤＮＡ標的配列）を、最初にｇＤＮＡから選択することができる。ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の個々の成分を、選択された配列を標的化するように設計することができる。アッセイ（例えば、実施例５に記載のもの）を実行して、ＤＮＡ標的配列切断のレベルを決定することができる。
以下の工程の全てがスクリーニング毎に必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はなく、スクリーニングを他の実験とカップリングさせるか、またはより大きな実験の部分を形成させることができる。
Ａ．ｇＤＮＡからのＤＮＡ標的領域（ＤＮＡ標的配列）の選択
Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃａｐｆ１）のためのＰＡＭ配列（すなわち、ＮＧＧ、ＴＴＮなど）を、選択されたゲノム領域内で同定することができる。
ＰＡＭ配列の５’側に隣接する１つもしくはそれ以上のＣａｓ９ ＤＮＡ標的配列（２０ヌクレオチド長）を同定および選択するか、またはＰＡＭ配列の３’側に隣接する１つもしくはそれ以上のＣｐｆ１ ＤＮＡ標的配列（２０〜２４ヌクレオチド長）を同定および選択することができる。
核酸標的配列の選択のための基準としては、限定されるものではないが、以下のもの：ゲノム中の他の領域との相同性、Ｇ−Ｃ含量パーセント、融点、スペーサー内のホモポリマーの存在、２つの配列間の距離、および当業者には公知の他の基準が挙げられる。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用することを望む場合、ＤＮＡ標的結合配列を、５’末端に組み込むことができる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用することを望む場合、ＤＮＡ標的結合配列を、３’末端に組み込むことができる。商業的製造業者は、典型的には、提供された配列に基づいてＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を合成する。あるいは、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって実施例２に記載のように産生することができる。
本明細書に記載のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を、同族クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ）、または同族クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの両方と共に使用して、ＮＡＳＣ／Ｃａｓタンパク質複合体を形成させることができる。
Ｂ．切断パーセンテージおよび特異性の決定
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と関連するｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断パーセンテージおよび特異性（例えば、オフターゲット結合の量）を、例えば、実施例５に記載の切断アッセイを使用して決定し、以下のように比較することができる。
（１）ＮＡＳＣのために単一の対のＤＮＡ標的配列のみを同定または選択することができる場合、それぞれのＤＮＡ標的配列の切断パーセンテージおよび特異性を決定することができる。そう望む場合、限定されるものではないが、ＮＡＳＣを改変すること；またはエフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列を導入してＮＡＳＣ、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分、もしくはＣａｓタンパク質を改変すること；またはリガンド／リガンド結合部分を導入して、ＮＡＳＣポリヌクレオチドもしくはＣａｓタンパク質を改変することを含む方法を使用するさらなる実験において、切断パーセンテージおよび／または特異性を変化させることができる。
（２）ＮＡＳＣのために複数の対のＤＮＡ標的配列を同定または選択することができる場合、切断アッセイから得られる切断パーセンテージのデータおよび部位特異性のデータを、標的結合配列を含む異なるＤＮＡ間で比較して、所望の切断パーセンテージおよび特異性を有するＤＮＡ標的配列を同定することができる。切断パーセンテージのデータおよび特異性のデータは、様々な用途のための塩基選択に関する基準を提供する。例えば、一部の状況では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の活性が、最も重要な因子であり得る。他の状況では、切断部位の特異性が、切断パーセンテージよりも相対的により重要であり得る。そう望む場合、限定されるものではないが、ＮＡＳＣを改変すること；またはエフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列を導入してＮＡＳＣ、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分、もしくはＣａｓタンパク質を改変すること；またはリガンド／リガンド結合部分を導入して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分もしくはＣａｓタンパク質を改変することを含む方法を使用するさらなる実験において、切断パーセンテージおよび／または特異性を変化させることができる。
あるいは、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析に加えて、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物と関連する細胞中での切断パーセンテージおよび特異性を、例えば、実施例６に記載の方法を使用して取得し、以下のように比較することができる。
（１）ＮＡＳＣのために単一の対のＤＮＡ標的配列のみを同定または選択することができる場合、それぞれのＤＮＡ標的配列の切断パーセンテージおよび特異性を決定することができる。そう望む場合、限定されるものではないが、ＮＡＳＣを改変すること；またはエフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列を導入してＮＡＳＣ、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分、もしくはＣａｓタンパク質を改変すること；またはリガンド／リガンド結合部分を導入して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分もしくはＣａｓタンパク質を改変することを含む方法を使用するさらなる実験において、切断パーセンテージおよび／または特異性を変化させることができる。
（２）ＮＡＳＣのために複数の対のＤＮＡ標的配列を同定または選択することができる場合、切断アッセイから得られる切断パーセンテージのデータおよび部位特異性のデータを、標的結合配列を含む異なるＤＮＡ間で比較して、所望の切断パーセンテージおよび特異性を有するＤＮＡ標的配列を同定することができる。切断パーセンテージのデータおよび特異性のデータは、様々な用途のための塩基選択に関する基準を提供する。例えば、一部の状況では、ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の活性が、最も重要な因子であり得る。他の状況では、切断部位の特異性が、切断パーセンテージよりも相対的により重要であり得る。そう望む場合、限定されるものではないが、ＮＡＳＣを改変すること；またはエフェクタータンパク質／エフェクタータンパク質結合配列を導入してＮＡＳＣ、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分、もしくはＣａｓタンパク質を改変すること；またはリガンド／リガンド結合部分を導入して、ＮＡＳＣポリヌクレオチド成分もしくはＣａｓタンパク質を改変することを含む方法を使用するさらなる実験において、切断パーセンテージおよび／または特異性を変化させることができる。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、本実施例に記載されたスクリーニングを、同族クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９タンパク質、同族クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１タンパク質、または同族クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９タンパク質と同族クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１タンパク質の両方と共に使用するための他のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を用いて実行することができる。
ＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を含むリボ核タンパク質クローズドケージ複合体の操作
本実施例は、低分子のパッケージングのためのＮＡＳＣ−ＣＣクローズドケージ複合体の形成のための本発明のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の使用を示す。
ＮＡＳＣ−ＣＣを、例えば、それぞれ、図６Ｈ（図６Ｈ、Ｉ、ＮＡＳＣ−ＰＣ１；図６Ｈ、ＩＩ、ＮＡＳＣ−ＰＣ２；および図６Ｈ、ＩＩＩ、ＮＡＳＣ−ＰＣ−３）に示される一般構造を有する、第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物および第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を使用して操作することができる。第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物および第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物を、３つの二本鎖ＤＮＡ配列と組み合わせて使用することができる。それぞれの二本鎖ＤＮＡ配列（「二本鎖ＤＮＡブレース配列」）は、第１のＤＮＡ標的配列が第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第１の核酸結合配列と相補的であり、第２のＤＮＡ標的配列が第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物の第２の核酸結合配列と相補的である、２つのユニークなＤＮＡ標的配列を含んでもよい。
ＮＡＳＣ−ＣＣおよび結合したＣａｓタンパク質を使用して、分子のパッケージングにとって好適なクローズドケージ複合体を作出することができる。ＮＡＳＣ−ＣＣ成分の設計を変更するか、または異なる長さのＤＮＡ標的配列を結合させることにより、ケージのサイズを変化させることができる。
Ａ．ＮＡＳＣ−ＣＣ成分の設計
図６Ａに示されるものと構造が類似する、ＮＡＳＣ−ＰＣ１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３を含む第１のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物（本実施例では、「ＮＡＳＣ−トリプレックス１」と呼ばれる）を操作することができる（本実施例では、「ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス１」、「ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス１」、および「ＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス１」と呼ばれる）。第１の２０ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列を、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス１、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス１のそれぞれの５’末端（例えば、図６Ａ、６１０〜６１１を参照されたい）に付加することができる。ＤＮＡ標的配列は、典型的には、ＮＡＳＣ−ＣＣを導入しようとする生物（例えば、ヒトｇＤＮＡまたは植物ｇＤＮＡ）中の天然のＤＮＡ配列に対する相同性を有さない、または限定された相同性を有するように選択される。
図６Ａに示されるものと構造が類似する、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス２、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス２、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス２を含む第２のＮＡＳＣポリヌクレオチド組成物（本実施例では、「ＮＡＳＣ−トリプレックス２」と呼ばれる）を操作することができる。第２の２０ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列を、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス２、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス２、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス２のそれぞれの５’末端（例えば、図６Ａ、６１０〜６１１を参照されたい）に付加することができる。ＤＮＡ標的配列は、典型的には、ＮＡＳＣ−ＣＣを導入しようとする生物（例えば、ヒトｇＤＮＡまたは植物ｇＤＮＡ）中の天然のＤＮＡ配列に対する相同性を有さない、または限定された相同性を有するように選択される。さらに、２０ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列は、ＮＡＳＣ−トリプレックス１で操作されるＤＮＡ標的配列と異なる（すなわち、相補的ではない）べきである。
ＮＡＳＣ−トリプレックス１およびＮＡＳＣ−トリプレックス２の例示的成分を、表２０に提示する。この表において、「標的配列」の列は、対応するＮＡＳＣポリヌクレオチド成分中の核酸標的結合配列と相補的である２０ｂｐのＤＮＡ標的配列を示す。
Figure 0006707133
Figure 0006707133
二本鎖ＤＮＡブレース配列を、５’から３’の方向に、５’末端の２０ヌクレオチドのランダム配列、標的配列１、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＰＡＭ配列５’−ＮＮＮＡＣＡ−３’（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドである）、５０ヌクレオチドのランダム配列、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＰＡＭ配列の逆相補体、標的配列２の逆相補体、および３’末端の２０ヌクレオチドのランダム配列を含むように操作することができる。二本鎖ＤＮＡブレース配列は、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス１とＮＡＳＣ−ＰＣ１−ＴＲＰ２の両方に結合した場合、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質によって標的化可能であり、２つのＮＡＳＣを互いに近くに持って行くであろう。二本鎖ＤＮＡブレース配列の配列を、二本鎖ＤＮＡの合成のために商業的製造業者に提供することができる。あるいは、二本鎖ＤＮＡブレース配列の配列を、実施例２に提示された二本鎖ＤＮＡ鋳型の構築と同様、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して構築することができる。
二本鎖ＤＮＡブレース配列の例示的配列を、表２１に示す。
Figure 0006707133
Ｂ．Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質の操作および産生
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１６８；配列番号１０３）Ｃａｓ９アミノ酸配列を、アミノ酸８位のアスパラギン酸からアラニンに（Ｄ８Ａ）および５５９位のヒスチジンからアラニンに（Ｄ８Ａ／Ｈ５５９Ａ）突然変異させて、ヌクレアーゼ不活性型のＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質；配列番号５６）を生成することができる。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質は、依然としてＮＡＳＣ−トリプレックス１に結合することができる。３つのＣ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質は、ＮＡＳＣ−トリプレックス１に結合し、ＮＡＳＣ−トリプレックス１に、核酸標的結合配列と相補的な標的配列に結合するよう指令することができる。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質を、２つの核局在化配列（ＮＬＳ）でＣ末端タグ付けし、大腸菌中で組換え発現させ、クロマトグラフィー法を使用して精製することができる。
Ｃ．ＮＡＳＣ−ＣＣの形成
ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス１、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス１（表２０）を等モル濃度で混合し、９５℃で２分間インキュベートし、サーマルサイクラー中、−０．５℃／秒で２５℃まで冷却することによってアニーリングさせた後、混合物を室温まで平衡化させることにより、ＮＡＳＣ−トリプレックス１を形成させることができる。ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス２、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス２、およびＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス２（表２０）を等モル濃度で混合し、９５℃で２分間インキュベートし、サーマルサイクラー中、−０．５℃／秒で２５℃まで冷却することによってアニーリングさせた後、混合物を室温まで平衡化させることにより、ＮＡＳＣ−トリプレックス２を形成させることができる。
結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および５％グリセリン、ｐＨ７．４）中、過剰濃度のＣ．ｊｅｊｕｎｉ ｄＣａｓ９タンパク質の存在下でＮＡＳＣ−トリプレックス１を混合し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、リボ核タンパク質クローズドケージ複合体を形成させることができる。二本鎖ＤＮＡブレース配列を、ＮＡＳＣ−トリプレックス１／ｄＣａｓ９タンパク質複合体を含む混合物に限界濃度で添加し、３７℃で２０分間インキュベートすることができる。ＮＡＳＣ−トリプレックス２を、等しい濃度のＮＡＳＣ−トリプレックス１でＮＡＳＣ−トリプレックス１／ｄＣａｓ９タンパク質／二本鎖ＤＮＡブレース配列の混合物に添加することができる。混合物を３７℃で１時間インキュベートすることができる。ＮＡＳＣ−トリプレックス１／ｄＣａｓ９タンパク質／二本鎖ＤＮＡブレース配列／ＮＡＳＣ−トリプレックス２／ｄＣａｓ９タンパク質クローズドケージ複合体を、長期保存のために−８０℃で凍結することができる。
図６Ｌは、明確にするためにＣａｓタンパク質を省略した、基礎となる核酸足場構造（ＮＡＳＣ−ＣＣ）の例を示す。ＮＡＳＣ−トリプレックス１およびＮＡＳＣ−トリプレックス２は、この図面では、図６Ｇに示される構造に対応する構造である。この図面中の破線は、ＮＡＳＣ−トリプレックス１とＮＡＳＣ−トリプレックス２との間の二本鎖ＤＮＡブレース配列によって作出される接続の種類を示す。図６Ｍは、ｄＣａｓ９タンパク質タンパク質と複合体化したＮＡＳＣ−ＣＣを示す。ｄＣａｓ９タンパク質タンパク質は、この図面では灰色の丸で表される。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、他のＮＡＳＣ−ＣＣリボ核タンパク質クローズドケージ複合体（例えば、本明細書に記載の様々な組合せのＮＡＳＣ組成物を含む）の形成を、他のＮＡＳＣ組成物および同族Ｃａｓタンパク質を用いて実行することができる。
ＮＡＳＣリボ核タンパク質クローズドケージ複合体の構造分析
以下の実施例は、適切な集合を検証し、集合したＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質複合体のサイズおよび体積を評価するためのＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質クローズドケージ複合体の特徴付けを記載する。以下に記載される方法は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，
Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６（４）：１１１３〜１１１９頁（２００８）およびＬａｐｉｎａｉｔｅ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５０２（７４７２）：５１９〜５２３頁（２０１３）から適合される。以下の工程の全てがスクリーニングに必要ではなく、工程の順序も提示される通りである必要はない。
Ａ．ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質複合体の電気泳動移動度シフトアッセイ
ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓタンパク質複合体を、実施例１３に記載のように製剤化し、放射標識された二本鎖ＤＮＡブレース配列を使用することができるように改変することができる。以下の反応混合物：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の存在下の二本鎖ＤＮＡブレース配列、γ−（32Ｐ）ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および１Ｘ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファーを製造することによって、二本鎖ＤＮＡブレース配列を放射標識することができる。反応混合物をインキュベートした後、６５℃で２０分間、熱不活化することができる。放射標識されたＤＮＡを、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して精製することができる。
あるいは、１つまたはそれ以上のＮＡＳＣ−ＣＣ成分を、同様の様式で放射標識することができる。
放射標識されたＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体を１０μＬ容量に分配し、１Ｘ Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡバッファー（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ、９０ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）および５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する８％の天然ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により、４℃で分解することができる。続いて、ゲルを乾燥し、ＰＭＩ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して画像化することができる。ＮＡＳＣ−ＣＣの個々のポリヌクレオチド成分（例えば、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス１、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス１、ＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス１、ＮＡＳＣ−ＰＣ１−トリプレックス２、ＮＡＳＣ−ＰＣ２−トリプレックス２、ＮＡＳＣ−ＰＣ３−トリプレックス２、二本鎖ＤＮＡブレース配列、および／またはｄＣａｓ９タンパク質と複合体化した個々の成分）を、比較のための対照として使用して、完全に形成されたＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体の電気泳動移動度シフトを同定することができる。
Ｂ．ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体の小角Ｘ線散乱
実施例１３に記載されたＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および５％グリセリン、ｐＨ７．４のバッファー中、４℃で透析することができる。ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体の透析された製造物を、最終容量４０μＬ中、１ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの濃度系列を使用して９６ウェルプレートのウェル中に分注することができる。
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）測定値を、Ｍａｒ１６５ＣＣＤ検出器を有するＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＢｉｏｌｏｇＹ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＩＢＹＬＳ）ビーム線を使用して、Ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｙ、ＣＡ）などのサービス提供者で収集することができる。０．５秒〜１０秒の露出時間範囲および１．５メートル〜５メートルの検出器距離を用いる複数のフレームでデータを収集することができる。試料に対する最小限の放射線障害ならびに最適なシグナルノイズ比について、最適な収集条件を評価することができる。同様に、ビーム線のキロ電子ボルト（ｋｅＶ）エネルギーを、７ｋｅＶ〜１５ｋｅＶの範囲で調整することができる。バッファーのみの対照を、バックグラウンドとして使用し、測定値から差し引くことができる。
データのプロセシングおよび分析を、標準的なビーム線ソフトウェアおよびＰＲＩＭＵＳ（Ｋｏｎａｒｅｖ，Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ３６：１２７７〜１２８２頁（２００３））を使用して実行することができる。データモデリングを、オープンソースソフトウェアスイート（例えば、ＡＴＳＡＳ ２．７．２、Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ４５：３４２〜３５０頁（２０１２））などの、ＳＡＸＳ分析プログラムを使用して実行することができる。異なるヌクレオチド結合状態（例えば、ｓｇＲＮＡのみ、ｓｇＲＮＡ＋標的鎖、ｓｇＲＮＡ＋標的および非標的鎖）、ならびに構造（例えば、ヌクレアーゼ、タンパク質、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）にあるＣａｓ９タンパク質およびシングルガイドＲＮＡの原子座標が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）またはＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＥＭＤＢ、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｅ／ｅｍｄｂ／）から利用可能である。これらの原子座標を使用して、ＳＡＸＳデータと組み合わせたモデリングにより、ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体の内部体積、孔径、およびクローズドケージサイズを算出することができる。
ＮＡＳＣ−ＣＣ／ｄＣａｓ９タンパク質複合体を改変して、生体分子、タンパク質、または他のペイロードのパッケージングおよび送達に必要とされる内部体積、孔径、またはクローズドケージサイズを増加または減少させることができる。そのような改変は、限定されるものではないが、第１のステムエレメント核酸配列（図６Ａ、６０８〜６０９；図６Ｈ、６２３〜６２４／６５８〜６５７、６２６〜６２５／６２７〜６２８、６５２〜６５１／６５５〜６４６）、および／または二本鎖ＤＮＡブレース配列（表２１）の延伸または短縮を含んでもよい。
当業者であれば、本明細書および実施例の指針に従って、内部体積、孔径、およびクローズドケージサイズを含む、ＮＡＳＣＣ−ＣＣ／Ｃａｓタンパク質複合体の構造的特徴の分析を実行することができる。
当業者には明らかであるように、上記実施形態の様々な改変および変更を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。そのような改変および変更は、本発明の範囲内にある。

Claims (15)

  1. ２つ以上の操作された足場形成核酸配列（「ＮＡＳＣ」）の組成物であって、
    ５’から３’の方向に、
    核酸標的結合配列１を含むスペーサーエレメント１、
    反復核酸配列１を含む反復エレメント１、および
    二本鎖核酸結合タンパク質結合配列１を含む核酸結合タンパク質結合エレメント１
    を含む第１の操作された核酸成分（「ＮＡＳＣ−ＰＣ１」）であって、
    該スペーサーエレメント１は、該反復エレメント１と共有結合で接続され、該反復エレメント１は、該核酸結合タンパク質結合エレメント１と共有結合で接続される、ＮＡＳＣ−ＰＣ１と、
    ５’から３’の方向に、
    核酸標的結合配列２を含むスペーサーエレメント２、
    反復核酸配列１Ｃを含む反復エレメント２、および
    二本鎖核酸結合タンパク質結合配列２を含む核酸結合タンパク質結合エレメント２
    を含む第２の操作された核酸成分（「ＮＡＳＣ−ＰＣ２」）であって、
    該スペーサーエレメント２は、該反復エレメント２と共有結合で接続され、該反復エレメント２は、該核酸結合タンパク質結合エレメント２と共有結合で接続される、ＮＡＳＣ−ＰＣ２と
    を含み、
    ここで、該反復核酸配列１と該反復核酸配列１Ｃとの間に、水素結合した塩基対を介した接続が存在し、該接続は、ＮＡＳＣ組成物を形成し、該ＮＡＳＣ組成物は、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質とに結合することができる、前記ＮＡＳＣ組成物。
  2. 第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、同じクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質であるか、または、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、オーソロガスなクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載のＮＡＳＣ組成物。
  3. スペーサーエレメント１は、核酸標的結合配列１の３’側および反復エレメント１の５’側にリンカーエレメント核酸配列をさらに含み；そして、
    スペーサーエレメント２は、核酸標的結合配列２の３’側および反復エレメント２の５’側にリンカーエレメント核酸配列をさらに含む、請求項１または２に記載のＮＡＳＣ組成物。
  4. 反復核酸配列１は、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ｂ、リンカーエレメント核酸配列１−２、および反復核酸配列１ａをさらに含み；そして、
    反復核酸配列１Ｃは、５’から３’の方向に、反復核酸配列１ａＣ、リンカーエレメント核酸配列２−２、および反復核酸配列１ｂＣをさらに含み；
    ここで、反復核酸配列１ｂと反復核酸配列１ｂＣは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ａと反復核酸配列１ａＣは、水素結合した塩基対を介して接続される、請求項３に記載のＮＡＳＣ組成物。
  5. 反復核酸配列１ｂは、５’から３’の方向に、
    反復核酸配列１ｂ２、
    バルジ核酸配列１ｂ１、および
    反復核酸配列１ｂ１
    をさらに含み；
    反復核酸配列１ａは、５’から３’の方向に、
    反復核酸配列１ａ２、
    バルジ核酸配列１ａ１、および
    反復核酸配列１ａ１
    をさらに含み；
    反復核酸配列１ａＣは、５’から３’の方向に、
    反復核酸配列１ａ１Ｃ、
    バルジ核酸配列２ａ２、および
    反復核酸配列１ａ２Ｃ
    をさらに含み；
    反復核酸配列１ｂＣは、５’から３’の方向に、
    反復核酸配列１ｂ１Ｃ、
    バルジ核酸配列２ｂ２、および
    反復核酸配列１ｂ２Ｃ
    をさらに含み；
    ここで、反復核酸配列１ａ１と反復核酸配列１ａ１Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ａ２と反復核酸配列１ａ２Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、反復核酸配列１ｂ１と反復核酸配列１ｂ１Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続され、そして反復核酸配列１ｂ２と反復核酸配列１ｂ２Ｃは、水素結合した塩基対を介して接続される、請求項４に記載のＮＡＳＣ組成物。
  6. リンカーエレメント核酸配列１−２は、５’から３’の方向に、
    リンカーエレメント核酸配列１−２−２、
    反復核酸配列１−２ａ、および
    リンカーエレメント核酸配列１−２−１
    をさらに含み；
    リンカーエレメント核酸配列２−２は、５’から３’の方向に、
    リンカーエレメント核酸配列２−２−１、
    反復核酸配列１−２ａＣ、および
    リンカーエレメント核酸配列２−２−２
    をさらに含み；
    ここで、反復核酸配列１−２ａと反復核酸配列１−２ａＣは、水素結合した塩基対を介して接続され、二本鎖核酸領域１−２を形成する、請求項５に記載のＮＡＳＣ組成物。
  7. 二本鎖核酸領域１−２は、エフェクタータンパク質結合部位をさらに含み；
    反復核酸配列１−２ａは、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａをさらに含み；
    反復核酸配列１−２ａＣは、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａＣをさらに含み；
    ここで、エフェクター結合部位は、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａと、エフェクタータンパク質結合部位核酸配列１−２ａＣとの間の水素塩基対結合によって形成され、そして、任意に、エフェクタータンパク質結合部位は、Ｃｓｙ４タンパク質結合部位である、請求項６に記載のＮＡＳＣ組成物。
  8. 反復核酸配列１は、アフィニティータグ１をさらに含み；そして、
    反復核酸配列１Ｃは、アフィニティータグ２をさらに含み；
    ここで、アフィニティータグ１は、アフィニティータグ２と接続される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物。
  9. ＮＡＳＣ−ＰＣ１は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、及び／又は、ＮＡＳＣ−ＰＣ２は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物。
  10. ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物。
  11. 核酸／タンパク質組成物であって、
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物；ならびに
    第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質
    を含む、前記核酸／タンパク質組成物。
  12. 第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、第２のクラス２ ＩＩ
    型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と同じであり、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択されるか、または、
    第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質と異なり、第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９タンパク質からなる群から選択される、
    請求項１１に記載の核酸／タンパク質組成物。
  13. 第１のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質および第２のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、それぞれ、Ｃａｓ９タンパク質／Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９タンパク質、ｄＣａｓ９タンパク質／Ｃａｓ９タンパク質、およびｄＣａｓ９タンパク質／ｄＣａｓ９タンパク質からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の核酸／タンパク質組成物。
  14. キットであって、
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物、または請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＡＳＣ組成物をコードする１つもしくはそれ以上の核酸配列；および
    バッファー
    を含む、前記キット。
  15. １つもしくはそれ以上のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質または１つもしくはそれ以上のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸配列、または
    ＮＡＳＣ組成物と、１つまたはそれ以上のクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質とを含む核タンパク質複合体
    をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3371310B1 (en) 2015-12-04 2019-05-01 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids
KR102458395B1 (ko) 2016-06-02 2022-10-25 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 사용한, 표적화된 게놈 변형의 개선
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
US11584955B2 (en) * 2017-07-14 2023-02-21 Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited Application of Cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit
WO2019041296A1 (zh) * 2017-09-01 2019-03-07 上海科技大学 一种碱基编辑系统及方法
AU2018329745A1 (en) * 2017-09-11 2020-04-16 The Regents Of The University Of California Antibody-mediated delivery of Cas9 to mammalian cells
US20210093679A1 (en) 2018-02-05 2021-04-01 Novome Biotechnologies, Inc. Engineered gut microbes and uses thereof
CN111699254A (zh) 2018-02-08 2020-09-22 齐默尔根公司 使用crispr在棒状杆菌属中进行基因组编辑
JP2021523745A (ja) 2018-05-16 2021-09-09 シンテゴ コーポレイション ガイドｒｎａ設計および使用のための方法およびシステム
WO2020032711A1 (ko) * 2018-08-09 2020-02-13 (주)지플러스 생명과학 신규한 crispr 연관 단백질 및 이의 용도
CN109517722B (zh) * 2018-09-28 2022-04-01 德拜至臻医学科技(杭州)有限公司 一种捕获特定微量细胞的装置及其制作和使用方法
JP2022520139A (ja) 2018-10-12 2022-03-29 セラダプティブ インク β－リン酸三カルシウム結合配列を含むポリペプチドとその使用
WO2020176389A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Caribou Biosciences, Inc. Plasmids for gene editing
CA3160186A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
US20230203115A1 (en) * 2020-03-06 2023-06-29 Theradaptive, Inc. Therapeutic compositions comprising graft materials and beta-tcp binding peptides and uses thereof
IL308806A (en) 2021-06-01 2024-01-01 Arbor Biotechnologies Inc Gene editing systems including nuclease crisper and their uses
CN114540325B (zh) * 2022-01-17 2022-12-09 广州医科大学 靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用
CN116377104B (zh) * 2022-11-14 2024-01-12 海南省农业科学院蔬菜研究所 一种快菜高温胁迫内参基因及其引物及应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
ES2590343T3 (es) 2010-05-10 2016-11-21 The Regents Of The University Of California Composiciones de endorribonucleasas y métodos de uso de las mismas
CN103945794A (zh) * 2011-09-01 2014-07-23 Hip创新科技有限责任公司 内衬股骨杯
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP4289948A3 (en) 2012-05-25 2024-04-17 The Regents of the University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
US9688971B2 (en) 2012-06-15 2017-06-27 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease and methods of use thereof
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
JP6517143B2 (ja) * 2012-10-23 2019-05-22 ツールゲン インコーポレイテッド 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
PL2921557T3 (pl) 2012-12-12 2017-03-31 Broad Inst Inc Projektowanie systemów, sposoby i optymalizowane kompozycje kierujące do manipulacji sekwencją
ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP3620534B1 (en) * 2013-03-14 2021-10-13 Caribou Biosciences, Inc. Crispr-cas compositions of nucleic acid-targeting nucleic acids
EP3375877A1 (en) 2013-11-18 2018-09-19 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas system materials and methods
WO2015089364A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US20150376586A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
SG10201804715WA (en) * 2015-01-28 2018-07-30 Pioneer Hi Bred Int Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
US9580727B1 (en) * 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
EP3371310B1 (en) * 2015-12-04 2019-05-01 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids

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