JP6685551B2 - 軟骨組織修復方法 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程(1)〜(3)を含む、軟骨組織修復用組成物の作製方法:
(1)インターロイキン−6シグナル刺激剤を含む培地中で、間葉系幹細胞を培養する工程、
(2)工程(1)で得た細胞を繊維スキャフォールドの存在下で培養する工程、
(3)工程(2)で得た細胞及び繊維スキャフォールドを単離する工程。
[2]インターロイキン−6シグナル刺激剤が、可溶性インターロイキン−6受容体である、[1]に記載の方法。
[3]工程(1)の培地中の可溶性インターロイキン−6受容体の濃度が10 ng/mL〜1000 ng/mLである、[2]に記載の方法。
[4]工程(1)における培養期間が6時間以上である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]繊維スキャフォールドを構成するファイバーが生分解性ポリマーである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]繊維スキャフォールドが不織布である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の方法。
[8]工程(2)における培養期間が6時間以上である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9][1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法により得られる、軟骨組織修復用組成物。
[10]硝子軟骨組織修復用組成物である、[9]に記載の軟骨組織修復用組成物。
[11]治療上有効量の、[9]又は[10]に記載の軟骨組織修復用組成物を、哺乳動物の、軟骨組織修復を必要とする部位に移植する工程を含む、軟骨損傷の治療方法。
[12]哺乳動物がヒトである、[11]記載の方法。
本発明は、以下の工程(1)〜(3)を含む、軟骨組織修復用組成物の作製方法:
(1)インターロイキン−6シグナル刺激剤を含む培地中で、間葉系幹細胞を培養する工程;
(2)工程(1)で得た細胞を繊維スキャフォールドの存在下で培養する工程;及び
(3)工程(2)で得た細胞及び繊維スキャフォールドを単離する工程
を提供する。本明細書中、上記軟骨組織修復用組成物の作製方法を「本発明の作製方法」とも称し、本発明の作製方法により作製される軟骨組織修復用組成物を「本発明組成物」とも称する。
本発明の作製方法工程(1)では、間葉系幹細胞をインターロイキン−6シグナル刺激剤と一定期間接触させることにより、軟骨細胞分化へ方向付けされた細胞を得ることができる。
本明細書中、間葉系幹細胞(MSC)とは、多分化能(multipotency)及び自己複製能力を有し、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全てに分化が可能な細胞を意味し、間葉系幹細胞様細胞、間葉系前駆細胞等と呼ばれる細胞も包含する意味で用いられる。本発明において用いられるMSCは、細胞表面マーカーCD166陽性、CD105陽性、CD44陽性、CD29陽性、CD34陰性、CD45陰性であることが好ましい。
また、MSCは、市販のものを用いることもでき、例えば、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンク、ロンザジャパン株式会社等から入手することもできる。
例えば、本発明組成物を、ヒトにおける軟骨損傷の治療に使用する場合、移植片拒絶及び/又はGvHDを予防するという観点から、MSCは、患者本人の細胞であるか、あるいは患者のHLA型と同一又は実質的に同一であるHLA型を有する他人から採取されることが好ましい。本明細書中使用される「実質的に同一であるHLA型」とは、ドナーのHLA型が、免疫抑制剤等の使用を伴う患者に移植した場合に、ドナーのMSCに由来する軟骨細胞が生着可能である程度に、患者のものと一致することを意味する。例えば、主たるHLA(HLA-A、HLA-B及びHLA-DRの主要な3遺伝子座、あるいはさらにHLA-Cwを含む4遺伝子座)が同一であるHLA型等が挙げられる。
本明細書中、「インターロイキン−6シグナル刺激剤」とは、インターロイキン−6(IL-6)が結合したインターロイキン−6受容体(IL-6R)の、gp130(glycoprotein 130)への会合により媒介されるシグナル伝達を活性化する物質を意味する。本発明において用いられるIL-6シグナル刺激剤は、可溶性IL-6R、又は可溶性IL-6RとIL-6との組み合わせであり、好ましくは可溶性IL-6Rである。
工程(1)で用いられる培地は、IL-6を含まなくてもよい。理論になんら拘束されるものではないが、IL-6は培養に付されるMSC自体が産生することが推測される。
例えば、IL-6シグナル刺激剤として可溶性IL-6Rを用いる場合、培地中の可溶性IL-6Rの濃度は、10 ng/mL〜1000 ng/mL、好ましくは25 ng/mL〜500 ng/mL、より好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mL、さらに好ましくは80 ng/mL〜120ng/mLである。
例えば、IL-6シグナル刺激剤として可溶性IL-6RとIL-6との組み合わせを用いる場合、培地中の可溶性IL-6Rの濃度は、10 ng/mL〜1000 ng/mL、好ましくは25ng/mL〜500 ng/mL、より好ましくは50 ng/mL〜200 ng/mL、さらに好ましくは80 ng/mL〜120ng/mLであり、培地中のIL-6の濃度は、10 ng/mL〜1000 ng/mL、好ましくは25ng/mL〜500ng/mL、より好ましくは50 ng/mL〜200ng/mL、さらに好ましくは80 ng/mL〜120ng/mLである。
工程(1)において使用する培地は、市販の間葉系幹細胞培養用の培地を用いてもよい。市販の間葉系幹細胞培養用培地の例としては、TheraPEAKTM Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSCGM-CDTM)(ロンザジャパン株式会社)、MSCBM-CDTM 間葉系幹細胞基本培地(ロンザジャパン株式会社)、StemXVivoTM 間葉系幹細胞培地(R&D Systems Inc.)、MSC NutriStem(登録商標)ヒト間葉系幹細胞用ゼノフリー培地(Biological Industries Ltd)等が挙げられる。
工程(1)において使用する培地は、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、IL-1β及びIL-17等の、MSCの軟骨細胞への分化を阻害する物質を含まないことが好ましい。
MSCの軟骨細胞への分化の方向付けが損なわれない限り限定されるものではないが、培養器をコートするECMとしては、ファィブロネクチン、コラーゲン等が挙げられ、ファイブロネクチンが好ましい。
工程(2)において、工程(1)で得た細胞を、繊維スキャフォールドと一定時間接触させることにより、軟骨組織修復用組成物を得ることができる。
本明細書中、繊維スキャフォールドとは、数平均による単繊維直径が1nm以上100μm未満であるファイバーが集合した物を指す。
所望の効果を得られ、かつ生体への移植に適したものである限り特に限定されるものではないが、本発明において使用する繊維スキャフォールドを構成するファイバーは、生分解性のものが好ましい。
生分解性のファイバーとしては、ポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)ファイバー、ポリグリコール酸(PGA)ファイバー、ポリL乳酸(PLLA)ファイバー、ポリD乳酸(PDLA)ポリマー、ポリカプロラクトン(PCL)ファイバー、L-乳酸/ε-カプロラクトン共重合体(LCL)ファイバー、ポリ-p-ジオキサノン(PDO)ファイバー、ポリブチレンサクシネート(PBS)ファイバー等の合成ファイバー、並びにコラーゲン、ゼラチン、キトサン等の天然ファイバーが挙げられる。合成ファイバーは、原料となるポリマーに高電圧を加えることにより紡糸する方法(エレクトロスピニング法:Doshi, J. and Reneker, D. H. (1995) Journal of Electrostatics 35 (2-3): 151-160等)、複合溶融紡糸法又はメルトブロー法などの公知の方法により、作製することができる。
本発明に用いる繊維スキャフォールドを構成するファイバーは、所望の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、好ましくは上記合成ファイバーであり、より好ましくはポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)ファイバー、さらに好ましくはポリ乳酸とグリコール酸の組成比(モル比)が1:1であるファイバーである。
本発明に用いる繊維スキャフォールドを構成するファイバーの平均繊維径は、所望の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、通常1 nm〜100 μm、好ましくは1 nm〜50μm、より好ましくは5 nm〜20μm、さらに好ましくは500 nm〜15μm、さらにより好ましくは800 nm〜10 μmである。
本発明に用いる繊維スキャフォールドの形状は、所望の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、移植する際の操作の簡便性の観点から、シート状の形態(例えば紙、不織布、織物の形態等)を呈することが好ましく、より好ましくは紙、不織布又は織物の形態、さらに好ましくは不織布の形態を呈する。
本発明に用いる繊維スキャフォールドの形状がシート状である場合、その厚さは所望の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、通常1 μm〜 10 mmであり、好ましくは10 μm〜 1 mmであり、より好ましくは、30 μm〜200 μmである。
工程(3)において、工程(2)で得た細胞及び繊維スキャフォールドを単離することにより、本発明組成物を得ることができる。
細胞及び繊維スキャフォールドは、通常、培養器と接着していないため、滅菌されたピンセット等を用いて、培養器から容易に取り出すことができる。
本発明組成物中の培地の持ち込みを減少させるため、細胞及び繊維スキャフォールドを、キムワイプ等に接触させて、培地を取り除くこともできる。
さらに、本発明は、上記の本発明の作製方法によって得られる、軟骨組織修復用組成物を提供する。
本発明組成物は、適切な容器中に封入されていてもよい。
本発明は、哺乳動物の、軟骨組織修復を必要とする部位に、治療上有効量の本発明組成物を移植する工程を含む、軟骨損傷の治療方法を提供する。
本明細書中使用される「治療上有効量」とは、対象に投与される時、所望の治療効果(例、硝子軟骨を形成する等)をもたらす活性成分の量を意味する。治療上有効量は、一度に投与(移植)されてもよく、複数回に分けて投与(移植)されてもよい。移植の適用回数は疾患に応じて医療従事者、ガイドラインに従って決定される。また複数回移植を行う場合、インターバルは特に限定されないが、数日〜数週間の期間を置いても良い。
ヒト間葉系幹細胞は、ロンザジャパン株式会社から入手した骨髄由来ヒト間葉系幹細胞を用いた。MSCは、細胞培養用プレート(TC DISH 100x20 SI、nunc)を用い、5% CO2/37 ℃の条件で維持培養した。培地にはMSC増殖培地(ロンザジャパン株式会社)にペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加したものを用いた。
トリプシン-EDTA処理により、MSCを培養器から剥離させシングルセルレベルに分散させた。上記培地(対照培地)、又は上記培地に可溶性インターロイキン6受容体(カタログ番号:200-06R、PEPRO TECH, INCより購入)100 ng/mLを加えた培地(IL-6R培地)中に、分散させたMSCを1×105個ずつ播種し、オーバーナイトで培養した。培養は、24-wellの細胞培養用プレート(MULTIDISH 24 WELLS、nunc)を用い、5% CO2/37 ℃の条件で培養した。
培養後、0.01% トリプシン-EDTA処理を行い、遠心分離操作により細胞を回収した。
実施例2:間葉系幹細胞及び微細繊維系素材繊維スキャフォールドの培養
繊維スキャフォールドとして、乳酸とグリコール酸の組成比が1:1である、ポリ乳酸グリコール(PLGA)シート(帝人ファーマ株式会社より購入;分子量IV 1.0、大きさ50 mm× 50 mm、厚さ 84.4±17.4μm、繊維径4.80±0.47 μm、嵩密度(304 kg/m3))を用いた。
1cm×1cmの大きさのシート状の繊維スキャフォールド(PLGAシート)を、24-wellの細胞培養用プレート(MULTIDISH 24 WELLS、nunc)に置き、実施例1で得た細胞、又はIL-6R刺激していないMSCを、1wellあたり1 x105〜3x105個播種した。
培地にはMSC増殖培地(ロンザジャパン株式会社)にペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地を用い、5% CO2/37 ℃の条件で24時間培養した。培養後、オートクレーブにより滅菌したピンセットを用いて培養器から、繊維スキャフォールド及び細胞を含む組成物を単離した。単離した組成物を、キムワイプと接触させ、培地を除去した。
実施例3:間葉系幹細胞及び繊維スキャフォールドを含む組成物の、関節への投与
5週齢の雌ラットは、日本チャールスリバー株式会社から購入した。組成物の投与7日前及び14日前に、0.25 mL complete Freund’s adjuvant(CFA)及び0.5 mg メチル化BSA(mBSA)のエマルジョンをラットの下腹部に注射し、関節炎を誘導した。
ラットの両側の膝関節に刃(メス)で切れ目を入れ、関節腔をハサミで開き空洞をつくった。一辺が1cmの正方形である、実施例2で得た細胞及び繊維スキャフォールドを含む組成物を、ピンセットで二回折り返し適切な大きさにした後、ピンセットを用いて関節腔に移植し、即座に絹縫合糸で関節腔を閉じた。もう一方の膝関節には、陰性対照として、MSCを含まない、一辺が1cmの正方形である繊維スキャフォールド、又はIL-6シグナル刺激していないMSC及び繊維スキャフォールドを含む組成物を移植した。
移植の30日後に、ラットの関節におけるヒトアグリカンの発現を抗体染色により検証した。
結果を図2に示す。
実施例4:IL-6シグナル刺激剤存在下での間葉系幹細胞の培養
IL-6R培地中でMSCを、3時間、24時間又は7日間培養した。培養は、培養時間が異なることを除いては、実施例1と同様に行った。得られた細胞を、実施例2と同様に繊維スキャフォールドと共培養し、細胞及び繊維スキャフォールドを含む組成物を得た。該組成物を実施例3と同様に、関節炎を有するラットの関節へ投与した。移植30日後に膝関節のサフラニンO染色により硝子軟骨組織の再生を検証した。結果を図3(D)〜(F)に示す。
また、実施例3と同様にCFA及びmBSAにより関節炎を誘導したが、何も移植しなかったラット(CFA及びmBSAの初回投与から44日後)(AIA)についても、膝関節のサフラニンO染色を行った(図3(B))。さらに、正常ラット(Wild-type)についても、膝関節のサフラニンO染色を行った(図3(A))。
MSC増殖培地(ロンザジャパン株式会社)にペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミン、100 ng/mL IL-6(カタログ番号:200-06、PEPRO TECH, INCより購入)を含む培地(IL-6培地)中でMSCを、24時間培養した。培養は、可溶性IL-6Rの代わりにIL-6を用いること及び、培養時間を除いては、実施例1と同様に行った。得られた細胞を、実施例2と同様に繊維スキャフォールドと共培養し、細胞及び繊維スキャフォールドを含む組成物を得た。該組成物を実施例3と同様に、関節炎を有するラットの関節へ投与し、30日後にサフラニンO染色により硝子軟骨組織の再生を検証した。結果を図3(C)に示す。
IL-6培地中でMSCを培養した場合には、硝子軟骨組織の再生は観察されなかった。
Claims (10)
- 以下の工程(1)〜(3)を含む、軟骨組織修復用組成物の作製方法:
(1)インターロイキン−6シグナル刺激剤を含む培地中で、間葉系幹細胞を6時間以上48時間以内の培養時間で培養する工程、
(2)工程(1)で得た細胞を繊維スキャフォールドの存在下で培養する工程、
(3)工程(2)で得た細胞及び繊維スキャフォールドを単離する工程
であって、該組成物が、投与された部位に軟骨組織を局所的に形成するための組成物である、方法。 - インターロイキン−6シグナル刺激剤が、可溶性インターロイキン−6受容体である、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)の培地中の可溶性インターロイキン−6受容体の濃度が10 ng/mL〜1000 ng/mLである、請求項2に記載の方法。
- 工程(1)における培養期間が8時間以上24時間以内である、請求項1〜3のいずれか一項に記載
の方法。 - 間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 繊維スキャフォールドを構成するファイバーが生分解性ポリマーである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 繊維スキャフォールドが不織布である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)における培養期間が6時間以上である、請求項1〜7のいずれか一項に記載
の方法。 - 軟骨組織修復用組成物が軟骨損傷の治療剤である、請求項1〜8いずれか一項に記載の方法。
- 軟骨損傷がヒトの軟骨損傷である、請求項9記載の方法。
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