JP6664685B2 - 抗がん剤 - Google Patents
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Description
本発明は、抗がん剤に関し、がんの予防剤および／または治療剤に関する。より詳しくは、新規メカニズムによるがん幹細胞性抑制および／またはがん細胞増殖抑制によるがんの予防剤および／または治療剤に関する。さらに本発明は、がんの予防剤および／または治療剤の新規スクリーニング方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１８−２７６０３号優先権を請求する。
臨床におけるがんは、がん細胞のみならず、その周囲の間質と混在して成立する。がん−間質相互作用は、がん細胞の増殖、浸潤、転移に深くかかわっていると考えられる。例えば血管内皮細胞や線維芽細胞、免疫細胞などをがん組織を構成する間質とし、それらとがん細胞との相互作用についても研究が進められている（川田ら, Drug Delivery System, 18-4, (2003)、石井ら, 顕微鏡, Vol.43, 104-8 (2008)）。しかしながら、がん−間質相互作用は、がんの発症臓器により異なり、解明されていない事項も多い。
正常乳腺組織は、主たる機能を発揮する上皮組織が脂肪細胞に取り囲まれた特徴的な構造を持つ。乳がんにおいても、腫瘍は周囲を脂肪細胞を含む間質に取り囲まれている。実験的にも、正常乳腺組織および乳がんの発生には、乳腺の脂肪組織の存在が必須であることが明らかになっている。
脂肪組織は、様々なアディポカインを分泌しており、アディプシン（adipsin、補体Ｄ因子）も脂肪組織から分泌されるアディポカインの一種である。アディプシンは、補体結合反応に関わる酵素として主として細菌感染に対する免疫反応の惹起に関わる。補体結合反応に伴い、アディプシンの作用を介して産生されるC3aは、免疫細胞の誘因、血管内皮細胞や上皮細胞の増殖、血小板の活性化にも関与する。そして卵巣がんや悪性黒色腫など一部のがんでは、C3aはがんの増殖を促進する作用があることが報告されている（非特許文献１：Frontiers in Immunology, 26 May 2015, doi: 10.3389/fimmu.2015.00257）。また、C3a受容体（C3aR）アンタゴニストによるがん細胞の増殖抑制効果を確認した報告がある（特許文献１：米国特許8940299）。しかしながら、特許文献１では補体成分であるC3aやC5aについての言及や、これらの受容体アンタゴニストについての記載はあるものの、補体カスケード反応におけるアディプシンの記載を含め、アディプシンに係る記載は一切ない。
がん幹細胞（cancer stem cell：CSC）仮説が示すがん幹細胞は、腫瘍組織中に存在する特に高い腫瘍原性をもつがん細胞であり、それらは自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力をもつことが示されている。体内のほとんど全ての臓器や組織で自己複製能・多分化能を有する組織幹細胞の存在が同定されており、それらは組織の形成および維持に重要な働きをしている。一方、がん幹細胞は1997年、急性骨髄性白血病においてはじめて同定され、その後乳がんをはじめとした固形がんでも同様にがん幹細胞が発見されたとの報告がある。例えば、乳がん組織中に含まれるがん幹細胞は少量（通常5％以下）であるが、特に腫瘍形成能が高いがん細胞といえる（非特許文献２：Annual Review of Medicine, Vol. 58: 267-284, Volume publication date 18 February 2007）。乳がん幹細胞は、乳がんの形成、進展、再発および転移のもととなることから、それを標的とした治療法の開発が望まれている。しかしながら、がん幹細胞に対して有効な治療方法は報告されていない。
がん幹細胞を標的とした治療法を確立することで再発、転移のリスクの少ないがん治療へとつながることが期待される。現在では、正常組織幹細胞の濃縮、分離方法を応用してがん幹細胞研究が進められており、白血病の研究においては、白血病幹細胞を標的とした治療法の探索・マウスモデルでの治療等の検討が進められている。しかし、固形がんにおいては、分離、濃縮方法の確立もまだ不十分であり、がん幹細胞研究はまだまだこれからの研究領域である。
Frontiers in Immunology, 2015, doi: 10.3389/fimmu.2015.00257
Annual Review of Medicine, Vol. 58: 267-284, Volume publication date 18 February 2007
本発明は、新規メカニズムに基づく作用を有する抗がん剤を提供することを課題とする。また、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する新規抗がん剤を提供することを課題とする。さらには、新規抗がん剤のスクリーニング方法を提供する事を課題とする。
抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤による。本発明者らは、上記課題を解決するために、腫瘍と間質との関係に着目し、乳がん手術検体中の脂肪組織より間質の一種である脂肪組織由来幹細胞（adipose-derived stem cell：以下、「ADSC」ともいう）を分離培養することができた。さら鋭意研究を重ね、分泌サイトカインの解析を行った結果、アディポカインのうち特にアディプシン作用とがんとの関係を初めて確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤。
２．抗がん剤が、がんの転移予防、再発予防および／または治療効果を有する、前項１に記載の抗がん剤。
３．抗がん剤が、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する、前項１または２に記載の抗がん剤。
４．がんが、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞との相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項３に記載の抗がん剤。
５．がんが、アディプシンとの相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項３に記載の抗がん剤。
６．がんが、乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、腎がん、胆管がん、食道がん、咽頭がん、胆道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、骨軟部腫瘍から選択される１種または複数種である、前項１〜５のいずれかに記載の抗がん剤。
７．アディプシン存在下でがん細胞を培養した系に、候補物質を添加して培養し、がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する候補物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
８．アディプシン存在下でがん細胞を培養する系が、培養液にアディプシンを添加してがん細胞を培養する系、あるいは脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞とがん細胞を共培養する系である、前項７に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
９．がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を、がん細胞のコロニー数および／またはコロニーの大きさで測定することを特徴とする、前項７または８に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
１０．がん細胞が乳がん細胞、大腸がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肝臓がん細胞、肺がん細胞、腎がん細胞、胆管がん細胞、食道がん細胞、咽頭がん細胞、胆道がん細胞、膀胱がん細胞、血液がん細胞、リンパ腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、甲状腺がん細胞、骨軟部腫瘍細胞から選択されるいずれかである、前項７〜９のいずれかに記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
１１．アディプシンと候補物質を相互作用させ、アディプシンの作用を阻害する物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
１２．アディプシンと候補物質を相互作用させる系が、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞の培養系に候補物質を添加する系である、前項１１に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
Ａ．抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤または医薬組成物を用いることによる、がんの予防方法および／または治療方法。
Ｂ．がんの予防が、がんの転移予防および／または再発予防である、前項Ａに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｃ．がんの予防および／または治療が、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用による、前項ＡまたはＢに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｄ．がんが、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞との相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項Ｃに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｅ．がんが、アディプシンとの相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項Ｃに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｆ．がんが、乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、腎がん、胆管がん、食道がん、咽頭がん、胆道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、骨軟部腫瘍から選択される１種または複数種である、前項Ａ〜Ｅのいずれかに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
１．抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤。
２．抗がん剤が、がんの転移予防、再発予防および／または治療効果を有する、前項１に記載の抗がん剤。
３．抗がん剤が、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する、前項１または２に記載の抗がん剤。
４．がんが、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞との相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項３に記載の抗がん剤。
５．がんが、アディプシンとの相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項３に記載の抗がん剤。
６．がんが、乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、腎がん、胆管がん、食道がん、咽頭がん、胆道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、骨軟部腫瘍から選択される１種または複数種である、前項１〜５のいずれかに記載の抗がん剤。
７．アディプシン存在下でがん細胞を培養した系に、候補物質を添加して培養し、がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する候補物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
８．アディプシン存在下でがん細胞を培養する系が、培養液にアディプシンを添加してがん細胞を培養する系、あるいは脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞とがん細胞を共培養する系である、前項７に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
９．がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を、がん細胞のコロニー数および／またはコロニーの大きさで測定することを特徴とする、前項７または８に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
１０．がん細胞が乳がん細胞、大腸がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肝臓がん細胞、肺がん細胞、腎がん細胞、胆管がん細胞、食道がん細胞、咽頭がん細胞、胆道がん細胞、膀胱がん細胞、血液がん細胞、リンパ腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、甲状腺がん細胞、骨軟部腫瘍細胞から選択されるいずれかである、前項７〜９のいずれかに記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
１１．アディプシンと候補物質を相互作用させ、アディプシンの作用を阻害する物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
１２．アディプシンと候補物質を相互作用させる系が、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞の培養系に候補物質を添加する系である、前項１１に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
Ａ．抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤または医薬組成物を用いることによる、がんの予防方法および／または治療方法。
Ｂ．がんの予防が、がんの転移予防および／または再発予防である、前項Ａに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｃ．がんの予防および／または治療が、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用による、前項ＡまたはＢに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｄ．がんが、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞との相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項Ｃに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｅ．がんが、アディプシンとの相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんである、前項Ｃに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
Ｆ．がんが、乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、腎がん、胆管がん、食道がん、咽頭がん、胆道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、骨軟部腫瘍から選択される１種または複数種である、前項Ａ〜Ｅのいずれかに記載のがんの予防方法および／または治療方法。
本発明の抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤によれば、がん幹細胞性を抑制し、がん細胞の増殖を抑制する効果を有する。従来、がん幹細胞性を抑制する方法は、種々検討されているものの十分な効果が得られたとはいえず、本発明の抗がん剤は非常に有用である。また、アディプシンを抑制することによる抗腫瘍作用は新規メカニズムであるため、係る作用メカニズムに着目して新規抗がん剤をスクリーニングすることができる。これにより、がん幹細胞性を抑制可能な、より優れた抗がん剤を得ることができる。
本発明は、腫瘍と脂肪細胞および／または脂肪組織幹細胞との関係に着目し、脂肪細胞および／または脂肪組織幹細胞より分泌されるアディプシンの作用に着目した新規作用メカニズムを有する抗がん剤に関する。さらに本発明は、新規作用メカニズムに着目した抗がん剤の新規スクリーニング方法に関する。本発明では、後述する参考例において、倫理委員会の許可を得て手術検体より乳がん細胞と正常乳腺脂肪組織を分取し、乳腺脂肪組織より脂肪組織由来幹細胞（ADSC）を分離培養して分泌サイトカインの解析を行ったことで、アディプシンの作用とがんやがん幹細胞との関係を初めて見出し、本発明を完成した。
腫瘍の形成および進展には、微小環境である間質に含まれる細胞、例えば腫瘍関連線維芽細胞、浸潤性炎症細胞、血管内皮細胞、リンパ球および神経細胞を含む様々な細胞が関連している。間質細胞の１種である脂肪組織由来細胞は、乳房などのいくつかの組織において重要な細胞であるにもかかわらず、腫瘍微小環境の成分としてはあまり知られていない。なお、本明細書において「腫瘍」とは、ヒトや動物に発生し、自立性を有する過剰な新生細胞群であれば特に限定されるものではなく、悪性腫瘍および良性腫瘍を含む概念で用いられる。また、本明細書において「がん」とは、悪性腫瘍のうち上皮性悪性腫瘍に限らず、非上皮性悪性腫瘍すなわち肉腫をも含む概念で用いられる。
本発明の、抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤において、アディプシンは特に限定されないが、特にがん幹細胞性の亢進やがん細胞増殖等に影響を及ぼすアディプシンをいう。このようなアディプシンとして、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞由来のアディプシンが挙げられる。アディプシンは細菌感染などに対する自然免疫反応（補体結合反応）に関わる物質として同定され、例えば脂肪細胞で作られ、血液を介して全身に広がることで、自然免疫に深くかかわることが公知である。
本発明の、抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤は、がんの予防剤および／または治療剤に関し、例えばがんの転移予防、再発予防および／または治療効果を有する。本発明の抗がん剤は、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する事も特徴とする。本明細書において「がん幹細胞（CSC）」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質をもった細胞をいう。本明細書において「がん幹細胞性」とは、腫瘍細胞やがん幹細胞において、特に高い腫瘍原性を有する、自己複製能を有する、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する等のいずれかの性質をいう。がんの多くは、外科的手術による他、化学療法、放射線療法で治療されるが、完全に腫瘍細胞を排除することは極めて困難である。がんの発生・再発・転移の原因として近年提唱されているのが、がん幹細胞仮説である。がん幹細胞仮説では、腫瘍組織中にも、正常組織と同様に幹細胞が存在し、それらは自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力をもつことが示され、再発・転移の原因とも考えられている。がん幹細胞を標的とした治療法を確立することで再発、転移のリスクの少ないがん治療へとつながることが期待されるが、その存在比率が低く、がん幹細胞の性状解析は非常に困難である。特に白血病幹細胞の研究においては、がん幹細胞を標的とした治療法の探索・マウスモデルでの治療の段階まで研究が進められているが、固形がんにおいては、分離、濃縮方法の確立もまだ不十分であった。
本発明の、抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤に適用可能ながんは、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞（以下、「脂肪細胞等」ともいう。）との相互作用により、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に影響を受けるがんである。相互作用は、直接的相互作用であってもよいし、間接的な相互作用であってもよい。直接的な相互作用とは、がん細胞やがん幹細胞の近傍に位置する脂肪細胞等と直接的に相互作用を有することを意味し、間接的な相互作用とは、がん細胞やがん幹細胞の近傍には位置しない脂肪細胞等から分泌されるアディプシンなどが、例えば血管やその他の間質を介して、がん細胞やがん幹細胞と相互作用することを意味する。
本発明の、抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤に適用可能ながんの種類は特に限定されないが、間質より分泌されるアディプシンと関連するがんであればよい。具体的には、例えば乳がん（Breast cancer）、大腸がん（Colon cancer）、子宮がん（Uterine cancer）、胃がん（Stomach cancer）、膵臓がん（Pancreatic cancer）、肝臓がん（Liver cancer）、肺がん（Lung cancer）、腎がん（Kidney cancer）、胆管がん（Biliary canal cancer）、食道がん（Esophageal cancer）、咽頭がん（Pharyngeal cancer）、胆道がん（Biliary tract cancer）、膀胱がん（Bladder cancer）、血液がん（Blood cancer）、リンパ腫（Lymphoma）、卵巣がん（Ovarian cancer）、前立腺がん（Prostate cancer）、甲状腺がん（Thyroid cancer）、骨軟部腫瘍（Bone and soft tissue tumor）などが挙げられる。好適には乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がんおよび腎がんが挙げられ、最も好適には、乳がん、大腸がんおよび子宮がんが挙げられる。
本発明の抗がん剤は、抗アディプシン作用を有するのであれば、高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。高分子化合物の例としては、例えばタンパク質、核酸物質が挙げられ、具体的には抗体、抗体断片、ペプチド、siRNAもしくはshRNAなどが挙げられる。低分子化合物の例としては、特に限定されない。また、低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。例えばアディプシンの発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、またはアディプシンに対する抗体が挙げられる。アディプシンは、例えばGenBankアクセッション番号、NP_001304264.1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質であり、mRNA配列はGenBankアクセッション番号、NM_001317335.1に示される塩基配列を含む。siRNAおよびshRNAは、RNA干渉と呼ばれるメカニズムにより、特定のmRNAを標的として、その翻訳を阻止することが知られている。
本発明の、抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤は、がんの予防剤および／または治療剤として使用することができ、がんの転移予防、再発予防および／または治療効果を有する。従って、本発明の抗がん剤は、がんと診断されたのちに投与可能なことは言及するまでもないが、例えば術後や他の抗がん剤で処置した後に、治療およびがん再発予防を目的とした更なる処置にも適用することができる。本発明の抗がん剤は、単独または他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。
本発明の抗がん剤または医薬組成物には、本発明の抗がん剤および他の有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。上記の抗がん剤に用いられる薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。本発明の抗がん剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜1mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、１ヶ月、複数ヶ月等に投与することが可能である。本発明は、本発明の抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤または医薬組成物を用いることによる、がんの予防方法および／または治療方法にも及ぶ。
本発明の抗がん剤または医薬組成物は、局所投与または全身投与することができる。投与形態は特に限定されないが、例えば乳がん治療の場合には、患部若しくは患部の近辺に注射または注入により投与することができる。非経口投与用の製剤は、滅菌した水性の、または非水性の溶液、懸濁液や乳濁液などを含んでいてもよい。非水性希釈剤の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油および有機エステル組成物、例えば、エチルオレエートなどが挙げられる。水性担体には、水、アルコール性水性溶液、乳濁液、懸濁液、食塩水および緩衝化媒体などのいずれが含まれていてもよい。非経口的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、塩化ナトリウム、リンゲル乳酸および結合油などのいずれが含まれていてもよい。静脈内担体には、例えば、液体用補充物、栄養および電解質（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などのいずれが含まれていてもよい。本発明の抗悪性腫瘍剤はさらに、保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物化合物、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどのいずれなどが含まれていてもよい。
本発明は、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、あるいはアディプシンを強発現した細胞と関連するがんに対して予防および／または治療効果を有する抗がん剤のスクリーニング方法にも及ぶ。スクリーニング方法の１の態様として、アディプシン存在下でがん細胞を培養した系に、候補物質を添加して培養し、がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する候補物質を選別する方法が挙げられる。スクリーニング方法の他の１態様では、アディプシンと候補物質を相互作用させ、アディプシンの作用を阻害する物質を選別する方法が挙げられる。
スクリーニング方法の１の態様である、アディプシン存在下でがん細胞を培養する系で抗がん剤をスクリーニングする方法において、「アディプシン存在下でがん細胞を培養する」とは、培養液にアディプシンを添加してがん細胞を培養する、あるいは脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞の培養系でがん細胞を共培養するのが好適である。上記スクリーニングにおいて、がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を指標とすることができる。がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用は、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法により確認することができる。例えば、がん細胞のコロニー数および／またはコロニーの大きさで測定し、確認する方法、アルデヒド脱水素酵素活性の測定、がん幹細胞マーカー遺伝子あるいはタンパク質の発現量の解析などが挙げられる。特に好適には、がん細胞のコロニー数および／またはコロニーの大きさで測定し、確認することができる。
スクリーニング方法の他の１態様である、アディプシンと候補物質を相互作用させ、アディプシンの作用を阻害する物質を選別し、抗がん剤をスクリーニングする方法において、「アディプシンと候補物質を相互作用させ」とは、アディプシンを含む溶液に候補物質を添加する、あるいは脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞の培養系に候補物質を添加するのが好適である。アディプシンと候補物質の相互作用は、補体C3aまたはBa因子の産生量のELISA法（固相酵素免疫検定法）等により解析することができる。
上記、アディプシンと関連するがん、例えば脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、および脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞から選択される１種または複数種の細胞より分泌されるアディプシンにより、がん幹細胞性の亢進および／またはがん細胞増殖に関わるがんに対して予防および／または治療効果を有する抗がん剤のスクリーニング方法に供される候補物質としては、高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。高分子化合物の例としては、特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸物質が挙げられ、具体的には抗体、抗体断片、ペプチド、例えばアディプシンの発現を阻害するsiRNAまたはshRNAなどが挙げられる。低分子化合物の例としては、特に限定されない。また、低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。
本発明の理解を助けるために、以下に参考例および実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。なお、本実施例に記載の試験は、神戸大学内規定に従い倫理委員会の許可を得て実施した。
（参考例１）乳がん細胞の培養
本参考例では、乳がん患者より採取した細胞の培養について示す。乳がん患者より腫瘍組織を採取し、Imamuraら（Oncol Rep 2015; 33: 1837-43）に記載の方法に従い、細分化した腫瘍組織をマトリゲルと混合して免疫不全マウスの乳腺組織に移植し、ヒト乳がん異種移植マウス腫瘍（patient-derived tumor xenograft: 以下「PDX腫瘍」ともいう）を形成させた。得られたPDX腫瘍にレンチウイルスを感染させて緑色蛍光色素ZsGreen遺伝子を導入したのちに再度PDX腫瘍を形成させた。PDX腫瘍を再び解離し、セルソーター（FACS AriaTM III cell sorter，BD）を用いてZsGreen発現PDX細胞を回収した。次いで、細胞を別の免疫不全マウスに継代して、ZsGreen発現PDX細胞（KUB06-ZsGreen、以下「KUB06-PDX細胞」ともいう）を樹立した。本参考例および以下の実施例に記載の免疫不全マウスは、市販の６〜８週齢の重度複合免疫不全マウス（NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J)） または超免疫不全マウス（NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)）を用いた。
本参考例では、乳がん患者より採取した細胞の培養について示す。乳がん患者より腫瘍組織を採取し、Imamuraら（Oncol Rep 2015; 33: 1837-43）に記載の方法に従い、細分化した腫瘍組織をマトリゲルと混合して免疫不全マウスの乳腺組織に移植し、ヒト乳がん異種移植マウス腫瘍（patient-derived tumor xenograft: 以下「PDX腫瘍」ともいう）を形成させた。得られたPDX腫瘍にレンチウイルスを感染させて緑色蛍光色素ZsGreen遺伝子を導入したのちに再度PDX腫瘍を形成させた。PDX腫瘍を再び解離し、セルソーター（FACS AriaTM III cell sorter，BD）を用いてZsGreen発現PDX細胞を回収した。次いで、細胞を別の免疫不全マウスに継代して、ZsGreen発現PDX細胞（KUB06-ZsGreen、以下「KUB06-PDX細胞」ともいう）を樹立した。本参考例および以下の実施例に記載の免疫不全マウスは、市販の６〜８週齢の重度複合免疫不全マウス（NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J)） または超免疫不全マウス（NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)）を用いた。
（参考例２）PDX腫瘍細胞とヒト脂肪組織由来幹細胞（ADSC）の共培養
（１）ヒトADSCの分離培養
乳がん患者の手術検体の切除断端近傍にある正常乳腺脂肪組織を採取し、そこからADSCを分離培養した。ADSCは、脂肪を含めた複数の臓器に分化する能力を有する。ADSCは、Zhaoら（Exp Ther Med 2013; 6: 937-42）およびZukら（Tissue Eng 2001; 7: 211-28）に示す方法に基づいて作製した。採取した脂肪組織を裁断し、1 mg/mlのコラゲナーゼI（Worthington Biochemical）および1％のDNaseI（Sigma）を含む199培地（Thermo-Fisher）内で３７℃1時間振盪培養した。細胞を遠心分離により収集し、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）に再懸濁して培養した。
（１）ヒトADSCの分離培養
乳がん患者の手術検体の切除断端近傍にある正常乳腺脂肪組織を採取し、そこからADSCを分離培養した。ADSCは、脂肪を含めた複数の臓器に分化する能力を有する。ADSCは、Zhaoら（Exp Ther Med 2013; 6: 937-42）およびZukら（Tissue Eng 2001; 7: 211-28）に示す方法に基づいて作製した。採取した脂肪組織を裁断し、1 mg/mlのコラゲナーゼI（Worthington Biochemical）および1％のDNaseI（Sigma）を含む199培地（Thermo-Fisher）内で３７℃1時間振盪培養した。細胞を遠心分離により収集し、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）に再懸濁して培養した。
（２）PDX腫瘍細胞とADSCの共培養
参考例１で作製したKUB06-PDX細胞（5×104 cells/well）と上記ADSC（1×104 cells/well）を混合し、３次元培養プレートディッシュ（NanoCulture 96-well plate, 低接着, micro-honeycomb pattern，JSR Life Sciences）に加え、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）にて培養した。培地は2日ごとに交換した。
参考例１で作製したKUB06-PDX細胞（5×104 cells/well）と上記ADSC（1×104 cells/well）を混合し、３次元培養プレートディッシュ（NanoCulture 96-well plate, 低接着, micro-honeycomb pattern，JSR Life Sciences）に加え、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）にて培養した。培地は2日ごとに交換した。
（参考例３）ADSCとの共培養による乳がん細胞の増殖亢進
本参考例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）をADSCと共培養したときのがん細胞の増殖について確認した。それぞれ異なる患者背景を有する９名の乳がん患者の正常乳腺脂肪組織から、参考例２（１）の方法により各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）を作製した。KUB06-PDX細胞と各患者由来ADSCを、参考例２（２）の方法により３７℃で７−１４日間共培養した。対照（−）として、ADSCを加えない系でKUB06-PDX細胞を培養した。
本参考例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）をADSCと共培養したときのがん細胞の増殖について確認した。それぞれ異なる患者背景を有する９名の乳がん患者の正常乳腺脂肪組織から、参考例２（１）の方法により各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）を作製した。KUB06-PDX細胞と各患者由来ADSCを、参考例２（２）の方法により３７℃で７−１４日間共培養した。対照（−）として、ADSCを加えない系でKUB06-PDX細胞を培養した。
その結果、各ADSCと共培養したKUB06-PDX細胞のスフェロイドは、対照と比べコロニー数および大きさが増大していることが確認された（図１Ａ、Ｂ）。コロニー数はコロニーの直径が100μmを超えるコロニーについて計測した（図１Ｂ）。この結果より、いずれの患者由来かに関わらず、ADSCと共培養した方が、対照と比しがん細胞のコロニー形成能と増殖が亢進することが確認された。
（参考例４）ADSC培養上清に分泌されるアディポカイン
本参考例では、参考例３の結果に基づき、ADSC培養上清に分泌されるアディポカインについて確認した。
（１）分泌サイトカインの確認
参考例３のADSC（KUF06）培養上清にどのようなサイトカインが分泌されているかをサイトカインアレイを用いて網羅的に確認した。ADSC（KUF06）を、参考例２（１）の方法により３日間培養したのち、培養上清を４℃で300g×10分間遠心分離して回収した。Proteome Profiler Human XL Cytokine Array Kit（R＆D Systems）を用いてヒトサイトカインの発現プロフィールを確認した。これにより、各種アディポカインがADSC（KUF06）培養上清に分泌されていることが確認された（図２Ａ）。図２Ａにおいて、DMEMは培養液のみでの測定結果を示した。
本参考例では、参考例３の結果に基づき、ADSC培養上清に分泌されるアディポカインについて確認した。
（１）分泌サイトカインの確認
参考例３のADSC（KUF06）培養上清にどのようなサイトカインが分泌されているかをサイトカインアレイを用いて網羅的に確認した。ADSC（KUF06）を、参考例２（１）の方法により３日間培養したのち、培養上清を４℃で300g×10分間遠心分離して回収した。Proteome Profiler Human XL Cytokine Array Kit（R＆D Systems）を用いてヒトサイトカインの発現プロフィールを確認した。これにより、各種アディポカインがADSC（KUF06）培養上清に分泌されていることが確認された（図２Ａ）。図２Ａにおいて、DMEMは培養液のみでの測定結果を示した。
（２）各ADSC培養上清におけるアディプシンの確認
上記の結果の各種アディポカインのうちアディプシンに着目し、各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）のアディプシン発現量を測定した。アディプシン発現量はアディプシンmRNA半定量的リアルタイムPCR法により測定した。mRNA発現量はPPARGにより標準化した。測定には、以下の配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。その結果、各患者のADSCごとにアディプシンのmRNA発現量の差は認められたが、何れのADSCにおいてもアディプシンの発現が確認された（図２Ｂ）。
上記の結果の各種アディポカインのうちアディプシンに着目し、各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）のアディプシン発現量を測定した。アディプシン発現量はアディプシンmRNA半定量的リアルタイムPCR法により測定した。mRNA発現量はPPARGにより標準化した。測定には、以下の配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。その結果、各患者のADSCごとにアディプシンのmRNA発現量の差は認められたが、何れのADSCにおいてもアディプシンの発現が確認された（図２Ｂ）。
各遺伝子測定のためのプライマー
・Adipsin Forward：GGAGCAGTGGGTGCTGAG（配列番号１）
Reverse：AGCTGTAGCAGCAGGAGGTC（配列番号２）
・PPARG Forward：GAGCCCAAGTTTGAGTTTGC（配列番号３）
Reverse：CTGTGAGGACTCAGGGTGGT（配列番号４）
・Adipsin Forward：GGAGCAGTGGGTGCTGAG（配列番号１）
Reverse：AGCTGTAGCAGCAGGAGGTC（配列番号２）
・PPARG Forward：GAGCCCAAGTTTGAGTTTGC（配列番号３）
Reverse：CTGTGAGGACTCAGGGTGGT（配列番号４）
（参考例５）各ADSC培養上清におけるC3aの確認
本参考例では、アディプシンを介した反応により補体C3から生成するC3aの作用について確認した（図３参照）。
（１）各ADSC培養上清に分泌されるC3aの確認
参考例３と同手法により、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）または各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）の培養上清中のC3a量を確認した。培養上清中のC3a量はC3a EISA kit（BD）を用い、Amersham Imager 600（GE Healthcare）により測定した。その結果、各ADSCはC3aを培養上清中に生成するが、KUB06-PDX細胞単独培養の場合ではC3aは殆ど生成されないことが確認された（図４Ａ）。
本参考例では、アディプシンを介した反応により補体C3から生成するC3aの作用について確認した（図３参照）。
（１）各ADSC培養上清に分泌されるC3aの確認
参考例３と同手法により、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）または各ADSC（KUF01, KUF02, KUF03, KUF06, KUF07, KUF11, KUF15, KUF16, KUF17）の培養上清中のC3a量を確認した。培養上清中のC3a量はC3a EISA kit（BD）を用い、Amersham Imager 600（GE Healthcare）により測定した。その結果、各ADSCはC3aを培養上清中に生成するが、KUB06-PDX細胞単独培養の場合ではC3aは殆ど生成されないことが確認された（図４Ａ）。
（２）C3a受容体抑制剤であるSB290157によるがん細胞の増殖抑制
PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）と各ADSC（KUF06, KUF16, KUF17）を共培養し、C3a受容体抑制剤であるSB290157（1μM，Sigma）を含む系と含まない系（−）でのKUB06-PDX細胞の増殖を確認した。KUB06-PDX細胞の増殖は、参考例３と同手法のコロニー計測に従い確認した。その結果、KUB06-PDX細胞と各ADSCとの共培養において、SB290157を含む系で有意にコロニー数が低い値を示し、SB290157によるがん細胞増殖抑制作用が確認された。一方、KUB06-PDX細胞単独培養の場合はSB290157の有無にかかわらず、いずれも低いコロニー数であった（図４Ｂ）。
PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）と各ADSC（KUF06, KUF16, KUF17）を共培養し、C3a受容体抑制剤であるSB290157（1μM，Sigma）を含む系と含まない系（−）でのKUB06-PDX細胞の増殖を確認した。KUB06-PDX細胞の増殖は、参考例３と同手法のコロニー計測に従い確認した。その結果、KUB06-PDX細胞と各ADSCとの共培養において、SB290157を含む系で有意にコロニー数が低い値を示し、SB290157によるがん細胞増殖抑制作用が確認された。一方、KUB06-PDX細胞単独培養の場合はSB290157の有無にかかわらず、いずれも低いコロニー数であった（図４Ｂ）。
（実施例１）アディプシン発現抑制による乳がん幹細胞関連遺伝子の発現抑制作用の確認
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とアディプシンを発現抑制したADSC（KUF06siAdipsin）との共培養において、培養上清でのがん幹細胞に特徴的な遺伝子の発現の変化を確認した。配列番号５および６に示す塩基配列からなるアディプシンに対するsiRNA（Hs_CFD_1747、Hs_CFD_1750，Sigma）をADSC（KUF06）にトランスフェクションしてアディプシンの発現を抑制した。対照としてsiNCをADSC（KUF06）に同様にトランスフェクションした。各siRNAでトランスフェクションしたADSC（KUF06）を、以下「KUF06siAdipsin」または「KUF06siNC」ともいう。
・Adipsin siRNA #1 (Hs_CFD_1747):CUGCUACAGCUGUCGGAGATT（配列番号５）
・Adipsin siRNA #2 (Hs_CFD_1750):CCUCCAAGCGCCUGUACGATT（配列番号６）
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とアディプシンを発現抑制したADSC（KUF06siAdipsin）との共培養において、培養上清でのがん幹細胞に特徴的な遺伝子の発現の変化を確認した。配列番号５および６に示す塩基配列からなるアディプシンに対するsiRNA（Hs_CFD_1747、Hs_CFD_1750，Sigma）をADSC（KUF06）にトランスフェクションしてアディプシンの発現を抑制した。対照としてsiNCをADSC（KUF06）に同様にトランスフェクションした。各siRNAでトランスフェクションしたADSC（KUF06）を、以下「KUF06siAdipsin」または「KUF06siNC」ともいう。
・Adipsin siRNA #1 (Hs_CFD_1747):CUGCUACAGCUGUCGGAGATT（配列番号５）
・Adipsin siRNA #2 (Hs_CFD_1750):CCUCCAAGCGCCUGUACGATT（配列番号６）
（１）KUF06siAdipsinとの共培養によるPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）におけるがん幹細胞に特徴的な各種遺伝子の発現の変化
KUF06siAdipsinと共培養したPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）において、がん幹細胞に特徴的な遺伝子（CD44、CXCR4、SUG、SNAIL、ZEB1およびBMI1）の発現量の変化を確認した。各遺伝子の発現量は、mRNA半定量的リアルタイムPCR法により測定した。各mRNA発現量はGAPDHにより標準化した。測定には、以下の配列番号７〜２０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
KUF06siAdipsinと共培養したPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）において、がん幹細胞に特徴的な遺伝子（CD44、CXCR4、SUG、SNAIL、ZEB1およびBMI1）の発現量の変化を確認した。各遺伝子の発現量は、mRNA半定量的リアルタイムPCR法により測定した。各mRNA発現量はGAPDHにより標準化した。測定には、以下の配列番号７〜２０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
各遺伝子測定のためのプライマー
・GAPDH Forward：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG（配列番号７）
Reverse：AGGGGCCATCCACAGTCTTC（配列番号８）
・CD44 Forward：AAAGGAGCAGCACTTCAGGA（配列番号９）
Reverse：TGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC（配列番号１０）
・CXCR4 Forward：AATCTTCCTGCCCACCATCTA（配列番号１１）
Reverse：AGCCTGTACTTGTCCGTCAT（配列番号１２）
・SLUG Forward：CCTTTTTCTTGCCCTCACTGC（配列番号１３）
Reverse：GGCTTCGGAGTGAAGAAATGC（配列番号１４）
・SNAIL Forward：CGAGCTGCAGGACTCTAAT（配列番号１５）
Reverse：CCACTGTCCTCATCTGACA（配列番号１６）
・ZEB1 Forward：GCACCTGAAGAGGACCAGAG（配列番号１７）
Reverse：TGCATCTGGTGTTCCATTTT（配列番号１８）
・BMI1 Forward：GTCCAAGTTCACAAGACCAGACC（配列番号１９）
Reverse：ACAGTCATTGCTGCTGGGCATCG（配列番号２０）
・C3aR Forward：GGGTGGTGGCTTTTGTGATG（配列番号２１）
Reverse：CAGCAGGAAACCCACCACTA（配列番号２２）
・GAPDH Forward：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG（配列番号７）
Reverse：AGGGGCCATCCACAGTCTTC（配列番号８）
・CD44 Forward：AAAGGAGCAGCACTTCAGGA（配列番号９）
Reverse：TGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC（配列番号１０）
・CXCR4 Forward：AATCTTCCTGCCCACCATCTA（配列番号１１）
Reverse：AGCCTGTACTTGTCCGTCAT（配列番号１２）
・SLUG Forward：CCTTTTTCTTGCCCTCACTGC（配列番号１３）
Reverse：GGCTTCGGAGTGAAGAAATGC（配列番号１４）
・SNAIL Forward：CGAGCTGCAGGACTCTAAT（配列番号１５）
Reverse：CCACTGTCCTCATCTGACA（配列番号１６）
・ZEB1 Forward：GCACCTGAAGAGGACCAGAG（配列番号１７）
Reverse：TGCATCTGGTGTTCCATTTT（配列番号１８）
・BMI1 Forward：GTCCAAGTTCACAAGACCAGACC（配列番号１９）
Reverse：ACAGTCATTGCTGCTGGGCATCG（配列番号２０）
・C3aR Forward：GGGTGGTGGCTTTTGTGATG（配列番号２１）
Reverse：CAGCAGGAAACCCACCACTA（配列番号２２）
その結果、KUF06siAdipsinの共培養によりPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）における、CD44、CXCR4、SUG、SNAILおよびZEB1の各遺伝子の発現が低下することを確認した（図５Ａ）。特にCD44およびCXCR4において、強い発現低下が確認された。
２）KUF06siAdipsinと共培養したKUB06-PDX細胞でのCD44発現レベルの解析
KUF06siAdipsinと共培養したPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とをAccutase（Corning）で分離し、正常マウスIgG（1：100，Wako）でブロッキングしたのちに、アロフィコシアニン（APC）結合抗ヒトCD44（1：100、クローン：BJ18，Biolegend）およびDAPIで染色した。KUB06-PDX細胞のCD44発現強度を、SH800細胞ソーター（Sony Biotechnology）を用いて解析した。その結果、KUF06siAdipsinとの共培養により、KUF06siNCとの共培養に比べ、CD44高発現KUB06-PDX細胞の割合が33.4％から22.8％へと低下したことを確認した（図５Ｂ）。以上により、脂肪組織におけるアディプシンの発現を抑制することで、乳がん幹細胞性を抑制できると考えられた。
KUF06siAdipsinと共培養したPDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とをAccutase（Corning）で分離し、正常マウスIgG（1：100，Wako）でブロッキングしたのちに、アロフィコシアニン（APC）結合抗ヒトCD44（1：100、クローン：BJ18，Biolegend）およびDAPIで染色した。KUB06-PDX細胞のCD44発現強度を、SH800細胞ソーター（Sony Biotechnology）を用いて解析した。その結果、KUF06siAdipsinとの共培養により、KUF06siNCとの共培養に比べ、CD44高発現KUB06-PDX細胞の割合が33.4％から22.8％へと低下したことを確認した（図５Ｂ）。以上により、脂肪組織におけるアディプシンの発現を抑制することで、乳がん幹細胞性を抑制できると考えられた。
（実施例２）共培養したKUB06-PDX細胞でのコロニーの解析
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とAdipsin shRNAを用いてアディプシンの発現を抑制したADSC（KUF06shAdipsin）との共培養系において、参考例３と同手法によりコロニーの数および大きさを確認した。アディプシンに対するshRNA（TRCN0000057208，Sigma）を発現するレンチウイルスをADSC（KUF06）に感染させて、アディプシンの発現を抑制した（以下「KUF06shAdipsin」）。対照としてshNCを発現するレンチウイルスを用いた（以下「KUF06shNC」）。PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）単独での培養系についても確認した。
・Adipsin shRNA（TRCN0000057208）：CCGGCGCGACTCCATCTCTACAAATCTCG- AGATTTGTAGAGATGGAGTCGCGTTTTTG （配列番号２３）
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とAdipsin shRNAを用いてアディプシンの発現を抑制したADSC（KUF06shAdipsin）との共培養系において、参考例３と同手法によりコロニーの数および大きさを確認した。アディプシンに対するshRNA（TRCN0000057208，Sigma）を発現するレンチウイルスをADSC（KUF06）に感染させて、アディプシンの発現を抑制した（以下「KUF06shAdipsin」）。対照としてshNCを発現するレンチウイルスを用いた（以下「KUF06shNC」）。PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）単独での培養系についても確認した。
・Adipsin shRNA（TRCN0000057208）：CCGGCGCGACTCCATCTCTACAAATCTCG- AGATTTGTAGAGATGGAGTCGCGTTTTTG （配列番号２３）
その結果、KUF06shAdipsinとの共培養によりKUB06-PDX細胞のコロニー数およびコロニー径の減少が確認された（図６）。以上により、アディプシンの発現を抑制することで、乳がん幹細胞性を抑制できると考えられた。
（実施例３）アディプシン発現抑制による乳がん腫瘍増殖に及ぼす効果
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とKUF06shAdipsinとを共移植したときの乳がん腫瘍増殖に及ぼす効果を確認した。
本実施例では、PDX腫瘍（KUB06-PDX細胞）とKUF06shAdipsinとを共移植したときの乳がん腫瘍増殖に及ぼす効果を確認した。
１）5×105個のKUB06-PDX細胞と5×105個のADSC（KUF06）をMatrigel（BD Biosciences）に懸濁し、メスの重度複合免疫不全マウス（NOD-SCIDマウス）の乳腺脂肪領域に共移植したときの乳がん腫瘍増殖に及ぼす効果をまず確認した。その結果、KUB06-PDX細胞単独の場合は移植後３５日目において腫瘍の増大が確認されたのに対し、KUB06-PDX細胞とADSCを共移植した場合は、移植後７日目より腫瘍の増大が確認された（図７Ａ）。このことより、KUB06-PDX細胞をADSCと共移植することで、腫瘍の増大速度が増加して乳がん細胞の生着までにかかる期間が短縮されたと考えられた。
２）3×105個のKUB06-PDX細胞と3×104個のADSC（KUF06shNC、またはKUF06shAdipsin）をMatrigel（BD Biosciences）に懸濁し、メスの超免疫不全マウス（NSGマウス）に共移植したときの乳がん腫瘍増殖に及ぼす効果を確認した。その結果、KUB06-PDX細胞とKUF06shNCとの共移植と比較して、KUF06shAdipsinとの共移植では腫瘍の増大が抑制された（図７Ｂ）。
以上により、ADSCのアディプシン発現を抑制することで、vivoにおいてもADSCが有する乳がん細胞増殖促進作用を抑制できると考えられた。
（参考例６）大腸がん細胞とADSCとの共培養による大腸がん細胞の増殖亢進
本参考例では、大腸がん細胞としてヒト結腸腺癌由来HCT116細胞を用いた。
本参考例では、大腸がん細胞としてヒト結腸腺癌由来HCT116細胞を用いた。
ヒトADSCは、参考例２と同手法により大腸がん患者の手術検体の切除断端近傍にある腸間膜脂肪組織を採取し、そこからADSCを分離培養した。ADSCは、Zhaoら（Exp Ther Med 2013; 6: 937-42）およびZukら（Tissue Eng 2001; 7: 211-28）に示す方法に基づいて作製した。採取した脂肪組織を裁断し、1 mg/mlのコラゲナーゼI（Worthington Biochemical）および1％のDNaseI（Sigma）を含む199培地（Thermo-Fisher）内で３７℃1時間振盪培養した。細胞を遠心分離により収集し、10％ウシ胎児血清（FBS）、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12、Gibco）に再懸濁して培養した。
HCT116細胞（1×104 cells/well）と上記ADSC（1×103 cells/well）を100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）に混合し、３次元培養プレート（Corning 3474 96-well plate, 超低接着、平底）にて培養した。培地は2日ごとに交換した。対照（−）として、ADSCを混合しないHCT116細胞（1×104 cells/well）のみを同様に３次元培養プレートを用いて培養した。
ADSCと共培養したHCT116細胞のスフェロイドは、対照と比べコロニー数および大きさが増大していることが確認された（図８Ａ）。コロニー数は、コロニーの直径が100μmを超えるコロニーについて計測した（図８Ｂ）。この結果より、ヒト結腸腺癌由来HCT116細胞はADSCと共培養した方が、対照（−）と比べてがん細胞のコロニー形成能と増殖が亢進することが確認された。
（参考例７）子宮がん細胞とADSCとの共培養による子宮がん細胞の増殖亢進
本参考例では、子宮がん細胞としてヒト子宮内膜腺癌由来Ishikawa細胞を用いた。
本参考例では、子宮がん細胞としてヒト子宮内膜腺癌由来Ishikawa細胞を用いた。
ヒトADSCは、参考例７と同手法の取り扱いにより、腹部腸間膜脂肪組織より樹立して培養した。
Ishikawa細胞（1×104 cells/well）と上記ADSC（5×103 cells/well）を100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12，Gibco）に混合し、３次元培養プレート（Corning 3474 96-well plate, 超低接着、平底）にて培養した。培地は2日ごとに交換した。対照（−）として、ADSCを混合しないIshikawa細胞（1×104 cells/well）のみを同様に３次元培養プレートを用いて培養した。
ADSCと共培養したIshikawa細胞のスフェロイドは、対照と比べコロニー数および大きさが増大していることが確認された（図９Ａ）。コロニー数はコロニーの直径が100μmを超えるコロニーについて計測した（図９Ｂ）。この結果より、ヒト子宮内膜腺癌由来Ishikawa細胞はADSCと共培養した方が、対照（−）と比べてがん細胞のコロニー形成能と増殖が亢進することが確認された。
がんの多くは、外科的手術による他、化学療法、放射線療法で治療されるが、完全に腫瘍細胞を排除することは極めて困難である。がん幹細胞は、腫瘍組織中に存在し、それらは自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力をもつことが示され、さらにはがんの再発・転移の原因とも考えられている。がん幹細胞を標的とした治療法を確立することで再発、転移のリスクの少ないがん治療へとつながることが期待されるが、その存在比率が低く、がん幹細胞の性状解析は非常に困難である。特に白血病幹細胞の研究においては、がん幹細胞を標的とした治療法の探索・マウスモデルでの治療の段階まで研究が進められているが、固形がんにおいては、分離、濃縮方法の確立もまだ不十分であった。
本発明の抗アディプシン作用を有する物質を有効成分とする抗がん剤によれば、がん幹細胞性を抑制し、がん細胞の増殖を抑制する効果を有する。従来、がん幹細胞性を抑制する方法は見出されていなかったため、本発明の抗がん剤は非常に有用である。また、アディプシンを抑制することによる抗腫瘍作用は新規メカニズムであるため、係る作用メカニズムに着目した新規抗がん剤をスクリーニングすることができる。これにより、がん幹細胞性を抑制可能な、より優れた抗がん剤を得ることができる。
Claims (10)
- 抗アディプシン作用を有するアディプシンに対する抗体又は阻害核酸を有効成分とする抗がん剤。
- 抗がん剤が、がんの転移予防、再発予防および／または治療効果を有する、請求項１に記載の抗がん剤。
- 抗がん剤が、がん幹細胞性の抑制および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する、請求項１または２に記載の抗がん剤。
- がんが、乳がん、大腸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、腎がん、胆管がん、食道がん、咽頭がん、胆道がん、膀胱がん、血液がん、リンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、骨軟部腫瘍から選択される１種または複数種である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤。
- アディプシン存在下でがん細胞を培養した系に、候補物質を添加して培養し、がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を有する候補物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
- アディプシン存在下でがん細胞を培養する系が、培養液にアディプシンを添加してがん細胞を培養する系、あるいは脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞とがん細胞を共培養する系である、請求項５に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
- がん幹細胞性の抑制作用および／またはがん細胞増殖抑制作用を、がん細胞のコロニー数および／またはコロニーの大きさで測定することを特徴とする、請求項５または６に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
- がん細胞が、乳がん細胞、大腸がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肝臓がん細胞、肺がん細胞、腎がん細胞、胆管がん細胞、食道がん細胞、咽頭がん細胞、胆道がん細胞、膀胱がん細胞、血液がん細胞、リンパ腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、甲状腺がん細胞、骨軟部腫瘍細胞から選択されるいずれかである、請求項５〜７のいずれかに記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
- アディプシンと候補物質を相互作用させ、アディプシンの作用を阻害する物質を選別することを特徴とする、抗がん剤のスクリーニング方法。
- アディプシンと候補物質を相互作用させる系が、脂肪細胞、脂肪組織幹細胞、脂肪組織幹細胞から分化誘導された細胞、およびアディプシンを強発現した細胞から選択されるいずれか１種または複数種の細胞の培養系に候補物質を添加する系である、請求項９に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
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