JP6664129B2 - Method for screening for preventive and / or therapeutic agent for muscular atrophy - Google Patents
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Description
本発明は、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a prophylactic and / or therapeutic agent for muscular atrophy.
筋萎縮は、加齢、不動、無重力、長期の臥床、長期あるいは大量のステロイド治療、癌によるカヘキシー、栄養飢餓、四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂を治療するための固定などの、様々な要因で起こることが知られている。
筋萎縮のうち、加齢による進行性の筋萎縮(筋力の低下を伴うこともある)は、サルコペニアと呼ばれている。サルコペニアは、高齢者に、寝たきり、転倒、不動や認知症などの有害事象を引き起こし、この有害事象により更にサルコペニアが進行するという悪循環をもたらすことが知られている。
そのため、筋萎縮を予防及び治療することで、高齢者においては活動性を維持し、日常生活動作レベルを確保し、更には、上述の有害事象を防止することが期待されている。
筋萎縮の予防及び治療に関しては、ミオスタチン(Myostatin)を標的とすることの有用性が示されている(非特許文献1及び2)。
Muscle atrophy can occur in a variety of ways, including aging, immobility, weightlessness, prolonged bed rest, prolonged or high dose steroid treatment, cancer cachexia, nutrient starvation, fixation to treat limb fractures and muscle, tendon and ligament ruptures. It is known to occur due to various factors.
Of muscle atrophy, progressive muscular atrophy due to aging (sometimes accompanied by a decrease in muscle strength) is called sarcopenia. Sarcopenia is known to cause adverse events such as bedridden, falling, immobility and dementia in elderly people, and this adverse event causes a vicious cycle in which sarcopenia further progresses.
Therefore, by preventing and treating muscle atrophy, it is expected that elderly people will maintain their activities, secure the level of daily activities, and prevent the above-mentioned adverse events.
With respect to the prevention and treatment of muscular atrophy, the utility of targeting myostatin has been shown (Non-Patent Documents 1 and 2).
しかしながら、これまでに筋萎縮を予防又は治療する薬は開発されていない。 However, no drug for preventing or treating muscle atrophy has been developed so far.
本発明者は、筋萎縮について鋭意研究を行なったところ、筋萎縮を発症した動物の筋肉細胞中においてSmad2及びSmad3の量が上昇していたこと、及び、斯かる上昇がミオスタチンから独立した様式で起きていたことを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。 The present inventors have conducted intensive studies on muscle atrophy and found that the amount of Smad2 and Smad3 was increased in muscle cells of animals that developed muscle atrophy, and that such increase was independent of myostatin. I found what was happening. The present invention has been made based on these findings.
すなわち、本発明は、下記に関するものである。
1.筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤のスクリーニング方法であって、
以下の工程(1)〜(3):
(1)試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
(2)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量及び/又は活性を測定する工程、及び、
(3)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇を抑制する試験物質、及び/又は、該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の活性を抑制する試験物質を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
2.工程(1)の筋肉細胞が骨格筋細胞である、前記1に記載のスクリーニング方法。
3.Smad2がリン酸化Smad2である、及び/又は、Smad3がリン酸化Smad3である、前記1又は2に記載のスクリーニング方法。
4.工程(2)において、Smad2及び/又はSmad3の量を測定し、工程(3)において、筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇を抑制する試験物質を選択する、前記1〜3のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
5.工程(2)において、Smad2及び/又はSmad3の量を、ウェスタンブロッティングにて測定する、前記1〜4のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
6.工程(2)において、筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の活性を測定し、工程(3)において、筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の活性を抑制する試験物質を選択する、前記1〜3のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
7.筋萎縮がサルコペニアである、前記1〜6のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
8.筋萎縮がスポーツ外傷の治療より生じた筋萎縮である、前記1〜6のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
9.前記1〜8のいずれか1項に記載のスクリーニング方法を行なうためのキットであって、筋肉細胞中のSmad2及び/又はSmad3の量又は活性を測定するための試薬を含むことを特徴とするキット。
That is, the present invention relates to the following.
1. A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscular atrophy,
The following steps (1) to (3):
(1) contacting a test substance with a muscle cell;
(2) measuring the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell, and
(3) a step of selecting a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell and / or a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell. , Screening method.
2. 2. The screening method according to the above 1, wherein the muscle cells in the step (1) are skeletal muscle cells.
3. 3. The screening method according to 1 or 2, wherein Smad2 is phosphorylated Smad2 and / or Smad3 is phosphorylated Smad3.
4. In step (2), the amount of Smad2 and / or Smad3 is measured, and in step (3), a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected. The screening method according to any one of the preceding claims.
5. The screening method according to any one of the above items 1 to 4, wherein in step (2), the amounts of Smad2 and / or Smad3 are measured by Western blotting.
6. In step (2), the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is measured, and in step (3), a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected. 4. The screening method according to any one of 3.
7. 7. The screening method according to any one of 1 to 6, wherein the muscle atrophy is sarcopenia.
8. 7. The screening method according to any one of the above items 1 to 6, wherein the muscle atrophy is muscle atrophy resulting from treatment for sports injury.
9. A kit for performing the screening method according to any one of the above items 1 to 8, comprising a reagent for measuring the amount or activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells. .
本発明は、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤をスクリーニングする手段を提供する。したがって、本発明を用いることにより、筋萎縮を予防及び/又は治療するための医薬品を開発することが可能になる。 The present invention provides a means for screening for a prophylactic and / or therapeutic agent for muscular atrophy. Therefore, by using the present invention, it becomes possible to develop a medicament for preventing and / or treating muscle atrophy.
以下、本発明に斯かる、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤のスクリーニング方法を詳細に説明する。本発明のスクリーニング方法は、
以下の工程(1)〜(3):
(1)試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
(2)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量及び/又は活性を測定する工程、及び、
(3)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇を抑制する試験物質、及び/又は、該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の活性を抑制する試験物質を選択する工程
を含んでいる。
Hereinafter, the method for screening for a prophylactic and / or therapeutic agent for muscular atrophy according to the present invention will be described in detail. The screening method of the present invention comprises:
The following steps (1) to (3):
(1) contacting a test substance with a muscle cell;
(2) measuring the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell, and
(3) a step of selecting a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell and / or a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell. In.
筋萎縮の予防剤及び治療剤のスクリーニング
「筋萎縮」とは、安静状態が長く続くことによって筋肉が体積減少を起こし、萎縮した状態をいう。
筋萎縮の原因としては、加齢、不動、無重力、長期の臥床、長期あるいは大量のステロイド治療、癌によるカヘキシー、栄養飢餓、四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂を治療するための固定等が挙げられる。前述の四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂には、スポーツ外傷により生じたものが含まれる。
筋萎縮のうち、加齢により発症する進行性の筋萎縮はサルコペニアと呼ばれている。本発明は、サルコペニアの予防剤及び/又は治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
また、本発明は、スポーツ外傷の治療(四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂の固定)により生じた筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤のスクリーニングにも好適に用いることができる。
筋萎縮は主に骨格筋で発症する。筋萎縮は、あらゆる部位の骨格筋で発症しうるが、腓腹筋や大腿筋で発症しやすく、発症による影響も大きい。
筋萎縮は、筋肉を有するあらゆる動物で起こりうるが、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
「筋萎縮の予防剤」には、筋萎縮の発症を阻害する剤の他、筋萎縮の発症を遅延させる剤等が含まれる。
「筋萎縮の治療剤」には、筋萎縮の症状を改善又は緩和する剤の他、発症した筋萎縮の進行を遅延させる剤等が含まれる。
「スクリーニング」とは、上述の筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤を、試験物質(候補物質)の中から選択することをいう。
Screening of preventive and therapeutic agents for muscle atrophy "Muscular atrophy" refers to a state in which muscles undergo volume reduction due to prolonged rest and atrophy.
Causes of muscle atrophy include aging, immobility, weightlessness, prolonged bed rest, prolonged or heavy steroid treatment, cachexia due to cancer, nutrition starvation, fixation for treating limb fractures and ruptures of muscles, tendons and ligaments, etc. Is mentioned. The aforementioned limb fractures and ruptures of muscles, tendons and ligaments include those caused by sports trauma.
Among muscle atrophy, progressive muscle atrophy that develops with aging is called sarcopenia. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used for screening a prophylactic and / or therapeutic agent for sarcopenia.
Further, the present invention can also be suitably used for screening for a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy caused by treatment of sports injury (fixation of fractures of limbs and rupture of muscles, tendons and ligaments).
Muscle atrophy mainly affects skeletal muscle. Muscle atrophy can occur in skeletal muscles at any site, but is likely to occur in gastrocnemius muscles and thigh muscles, and is greatly affected by the onset.
Although muscle atrophy can occur in any animal having muscle, the present invention can be suitably used for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy in mammals, particularly humans.
The "prophylactic agent for muscle atrophy" includes an agent that inhibits the onset of muscle atrophy, an agent that delays the onset of muscle atrophy, and the like.
The "agent for treating muscle atrophy" includes an agent for improving or alleviating the symptoms of muscle atrophy, and an agent for delaying the progress of the developed muscle atrophy.
“Screening” refers to selecting a preventive and / or therapeutic agent for muscular atrophy from among test substances (candidate substances).
工程(1)
工程(1)では、試験物質と筋肉細胞とを接触させる。
筋肉細胞としては、あらゆる動物由来のものを使用できるが、哺乳動物(例えば、マウスやヒト)由来の筋肉細胞を用いることが好ましい。
筋肉細胞としては、筋萎縮を発症しうる筋肉に由来する細胞を特に制限なく用いることができる。筋肉細胞の具体例としては、骨格筋細胞、心筋細胞、血管や腸管の平滑筋細胞等が挙げられる。筋肉細胞としては、骨格筋細胞が好ましい。
骨格筋細胞が由来する部位は特に限定されないが、筋萎縮が発症しやすい腓腹筋や大腿筋に由来する骨格筋細胞が好ましい。
筋肉細胞は、筋萎縮を発症している筋肉組織から採取した細胞であってもよく、筋萎縮を発症していない筋肉組織から採取した細胞であってもよい。
また、筋肉細胞は、採取した細胞自体であってもよく、プライマリー細胞であってもよく、株化された細胞であってもよい。また、筋肉細胞は、間葉系幹細胞から誘導した筋肉細胞であってもよく、iPS細胞やES細胞から誘導した筋肉細胞であってもよい。
Step (1)
In step (1), the test substance is brought into contact with muscle cells.
As the muscle cells, those derived from any animal can be used, but it is preferable to use muscle cells derived from mammals (eg, mouse and human).
As a muscle cell, a cell derived from a muscle that can cause muscle atrophy can be used without particular limitation. Specific examples of muscle cells include skeletal muscle cells, cardiomyocytes, smooth muscle cells of blood vessels and intestinal tract, and the like. Skeletal muscle cells are preferred as muscle cells.
The site from which the skeletal muscle cells are derived is not particularly limited, but skeletal muscle cells derived from the gastrocnemius muscle or the thigh muscle where muscle atrophy is likely to occur are preferred.
The muscle cells may be cells collected from muscle tissue that has developed muscle atrophy, or may be cells collected from muscle tissue that has not developed muscle atrophy.
The muscle cells may be the collected cells themselves, primary cells, or established cells. Further, the muscle cells may be muscle cells derived from mesenchymal stem cells, or may be muscle cells derived from iPS cells or ES cells.
試験物質と筋肉細胞とを接触させる手段としては、医薬品候補物質のスクリーニング方法で一般的に用いられている手段を特に制限なく用いることができる。例えば、試験物質を筋肉細胞の培養液へ添加することで、試験物質と筋肉細胞とを接触させることができる。
試験物質と接触させた後の筋肉細胞は、その生存を維持できる任意の条件下でインキュベートしてもよい。インキュベート条件は、筋肉細胞の培養条件として知られているものを特に制限なく用いることができる。
As a means for bringing a test substance into contact with a muscle cell, a means generally used in a screening method for a drug candidate substance can be used without any particular limitation. For example, by adding a test substance to a culture solution of muscle cells, the test substance can be brought into contact with the muscle cells.
After contact with the test substance, the muscle cells may be incubated under any conditions that maintain their survival. As the incubation conditions, those known as culture conditions for muscle cells can be used without particular limitation.
工程(2)
工程(2)では、試験物質と接触させた筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量及び/又は活性を測定する。
「Smad2」及び「Smad3」は、いずれも、ミオスタチン、IGF−1やTGF−βといったサイトカインによる細胞内シグナル伝達に関与することが知られているタンパク質性転写因子である。なお、Smad2のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号「NM_001003652」でGenBankに登録されている。また、Smad3のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号「NM_001145102」でGenBankに登録されている。
Step (2)
In step (2), the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells that have been contacted with the test substance are measured.
“Smad2” and “Smad3” are both proteinaceous transcription factors known to be involved in intracellular signal transduction by cytokines such as myostatin, IGF-1 and TGF-β. The amino acid sequence of Smad2 is registered in GenBank under the accession number “NM_001003652”, for example. The amino acid sequence of Smad3 is registered in GenBank under the accession number “NM_001145102”, for example.
ここで、ミオスタチンと、Smad2及びSmad3とは、健常者における筋肉の異化メカニズムにおいて下記の役割を果たしていることが知られている。
(1)ミオスタチンが筋肉細胞表面のレセプターActRIIBに結合して、ActRIIBの細胞内ドメインをリン酸化する。
(2)リン酸化されたActRIIBが、別の細胞表面レセプターActRIBをリン酸化し、更にActRIBとの会合体を形成する。
(3)前記の会合体が、Smad2及びSmad3をリン酸化する。
(4)リン酸化されたSmad2及びSmad3が、Smad4と会合体(Smad2とSmad4との会合体、Smad3とSmad4との会合体や、Smad2とSmad3とSmad4との会合体)を形成する。
(5)前記の会合体が筋肉細胞の核内へ移行して、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子(Atrogin-1及びMuRF-1)の発現を促進する。
ところで、後述の実施例で示されるように、筋萎縮を発症している筋肉細胞では、Smad2及びSmad3の量がミオスタチンからは独立した様式で上昇している。
したがって、本発明のスクリーニング方法は、ミオスタチンを標的とする筋萎縮治療剤とは異なる機序で作用する医薬品の開発に用いることができる。
Here, it is known that myostatin and Smad2 and Smad3 play the following roles in the muscle catabolism mechanism in healthy subjects.
(1) Myostatin binds to the receptor ActRIIB on the muscle cell surface and phosphorylates the intracellular domain of ActRIIB.
(2) The phosphorylated ActRIIB phosphorylates another cell surface receptor ActRIB, and further forms an aggregate with ActRIB.
(3) The above aggregate phosphorylates Smad2 and Smad3.
(4) The phosphorylated Smad2 and Smad3 form an association with Smad4 (an association between Smad2 and Smad4, an association between Smad3 and Smad4, and an association between Smad2, Smad3 and Smad4).
(5) The aggregate is translocated into the nucleus of a muscle cell to promote the expression of genes (Atrogin-1 and MuRF-1) involved in the degradation of muscle-constituting proteins.
By the way, as shown in Examples described later, in muscle cells that have developed muscle atrophy, the amounts of Smad2 and Smad3 are increased in a manner independent of myostatin.
Therefore, the screening method of the present invention can be used for the development of a drug that acts by a different mechanism from a therapeutic agent for muscular atrophy targeting myostatin.
工程(2)では、Smad2又はSmad3のいずれか一方の量及び/又は活性を測定すればよいが、Smad3の量及び/又は活性を測定することが好ましい。
また、Smad2とSmad3の両方の量及び/又は活性を測定してもよい。
また、工程(2)では、Smad2及び/又はSmad3(以下、「Smad2/3」ともいう)の量のみを測定してもよく、活性のみを測定してもよく、量と活性の双方を測定してもよい。
In step (2), the amount and / or activity of either Smad2 or Smad3 may be measured, but the amount and / or activity of Smad3 is preferably measured.
In addition, the amounts and / or activities of both Smad2 and Smad3 may be measured.
In the step (2), only the amount of Smad2 and / or Smad3 (hereinafter, also referred to as “Smad2 / 3”) may be measured, only the activity may be measured, or both the amount and the activity may be measured. May be.
工程(2)で測定する「量」とは、筋肉細胞内のSmad2/3の量、すなわち、Smad2/3のタンパク質としての量をいう。
Smad2/3の量は、リン酸化されたSmad2/3の量として測定してもよい。
The “amount” measured in step (2) refers to the amount of Smad2 / 3 in muscle cells, that is, the amount of Smad2 / 3 as a protein.
The amount of Smad2 / 3 may be measured as the amount of phosphorylated Smad2 / 3.
Smad2/3の量は、当該技術分野で一般的に用いられている細胞内タンパク質の定量方法を特に制限なく用いて測定することができる。
例えば、Smad2/3のタンパク質としての量を直接測定してもよく、当該タンパク質量に対応するSmad2/3のmRNA量を指標に測定してもよい。
Smad2/3のタンパク質としての量は、例えば、Smad2/3に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングやELISA等を使用して測定することができる。
Smad2/3のmRNA量は、例えば、リアルタイムPCRや、リポーター遺伝子アッセイ等を使用して測定することができる。リポーター遺伝子アッセイは、例えば、Smad2/3をコードする遺伝子の下流にリポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ遺伝子)を組み込むことにより、行なうことができる。
The amount of Smad2 / 3 can be measured using a method for quantifying an intracellular protein generally used in the art without any particular limitation.
For example, the amount of Smad2 / 3 as a protein may be directly measured, or the amount of Smad2 / 3 mRNA corresponding to the amount of the protein may be measured as an index.
The amount of Smad2 / 3 as a protein can be measured, for example, using Western blotting or ELISA using an antibody specific to Smad2 / 3.
The amount of Smad2 / 3 mRNA can be measured using, for example, real-time PCR, a reporter gene assay, or the like. The reporter gene assay can be performed, for example, by incorporating a reporter gene (eg, luciferase gene) downstream of the gene encoding Smad2 / 3.
Smad2/3の活性とは、Smad2/3の転写因子としての活性(タンパク質−タンパク質相互作用活性)をいう。具体的には、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子(Atrogin-1及びMuRF-1)の発現を指標に、Smad2/3の活性を測定することができる。
Smad2/3の活性は、当該技術分野で一般的に用いられている転写活性の定量方法を特に制限なく用いて測定することができる。具体例としては、リポーターアッセイ法やリアルタイムPCR法等が挙げられる。
The activity of Smad2 / 3 refers to the activity of Smad2 / 3 as a transcription factor (protein-protein interaction activity). Specifically, the activity of Smad2 / 3 can be measured using the expression of genes (Atrogin-1 and MuRF-1) related to the degradation of proteins constituting muscle as an index.
The activity of Smad2 / 3 can be measured using a transcription activity quantification method generally used in the art without any particular limitation. Specific examples include a reporter assay method and a real-time PCR method.
工程(3)
工程(3)では、工程(2)の測定結果に基づき、筋肉細胞内のSmad2/3の量の上昇を抑制する試験物質、及び/又は、該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の活性を抑制する試験物質を、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤として選択する。
工程(2)の測定結果と比較される対象(対照)は、工程(1)で用いた試験物質と接触させていない筋肉細胞のSmad2/3の量及び/又は活性であってもよく、工程(1)で用いた試験物質とは異なる物質(例えば、Smad2/3の活性を低下させることが知られている公知物質(例えば、SIS3(Smad3 Inhibitor))と接触させた筋肉細胞のSmad2/3の活性であってもよい。
「Smad2/3の量の上昇を抑制する」とは、「Smad2/3の量を変化させない」ことと、「筋肉細胞内のSmad2/3の量を低下させる」こととをいう。
工程(1)で使用した試験物質が、筋肉細胞内のSmad2/3の量を変化させなかった場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防するための医薬品(例えば、Smad2/3の量を筋萎縮発症量(発症レベル)未満に維持する医薬品)や、筋萎縮を治療するための医薬品(例えば、筋萎縮の進行を遅延させる医薬品)の候補となる。
工程(1)で使用した試験物質が、筋肉細胞内のSmad2/3の量を低下させた場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防及び/又は治療するための医薬品(例えば、Smad2/3のレベルを筋萎縮発症量(発症レベル)未満へと低減する医薬品)の候補となる。
工程(1)で使用した試験物質が、筋肉細胞内のSmad2/3の活性を抑制した(低下させた)場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防及び/又は治療するための医薬品(例えば、Smad2/3の活性を筋萎縮が発症する活性(発症レベル)未満へと低減する医薬品)の候補となる。
Step (3)
In step (3), based on the measurement result in step (2), a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 / 3 in muscle cells and / or the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells is determined. The test substance to be suppressed is selected as an agent for preventing and / or treating muscle atrophy.
The subject (control) to be compared with the measurement result in step (2) may be the amount and / or activity of Smad2 / 3 of the muscle cells not contacted with the test substance used in step (1). Smad2 / 3 of muscle cells contacted with a substance different from the test substance used in (1) (for example, a known substance known to reduce the activity of Smad2 / 3 (for example, SIS3 (Smad3 Inhibitor)) Activity.
"Suppressing an increase in the amount of Smad2 / 3" means "do not change the amount of Smad2 / 3" and "reduce the amount of Smad2 / 3 in muscle cells".
When the test substance used in the step (1) does not change the amount of Smad2 / 3 in the muscle cells, the test substance is a drug for preventing muscle atrophy (for example, the amount of Smad2 / 3 is not It is a candidate for a drug that maintains less than the amount of onset of atrophy (onset level) or a drug for treating muscle atrophy (for example, a drug that delays the progress of muscle atrophy).
When the test substance used in step (1) reduces the amount of Smad2 / 3 in muscle cells, the test substance is used as a medicament for preventing and / or treating muscle atrophy (for example, Smad2 / 3). It is a candidate for a drug that reduces the level to less than the amount of muscle atrophy (onset level).
When the test substance used in the step (1) suppresses (reduces) the activity of Smad2 / 3 in muscle cells, the test substance is a drug for preventing and / or treating muscle atrophy (for example, Drugs that reduce the activity of Smad2 / 3 to less than the activity (onset level) at which muscular atrophy develops.
更に本発明は、上述のスクリーニング方法を行うためのキットに関する。本発明のキットは、筋肉細胞中のSmad2/3の量又は活性を測定するための試薬を含む。
上記の試薬としては、筋肉細胞中のSmad2/3の量又は活性を測定するために当該技術分野で一般的に用いられているものを特に制限なく用いることができる。例えば、Smad2/3の量をリアルタイムPCRにより測定する場合には、Smad2/3のプライマーが試薬として挙げられる。Smad2/3の量をウェスタンブロッティングやELISAにより測定する場合には、Smad2/3に対する特異的抗体が試薬として挙げられる。
また、本発明のキットは、前述の試薬の他、測定手段に固有の試薬、例えば、ウェスタンブロッティングやELISAでは固相ブロッキング剤等を含むことができる。
更に、本発明のキットは、本発明のスクリーニング方法を実施する手順を記載した説明書(指示書)を含んでいてもよい。
The present invention further relates to a kit for performing the above-described screening method. The kit of the present invention includes a reagent for measuring the amount or activity of Smad2 / 3 in muscle cells.
As the above reagent, those generally used in the art for measuring the amount or activity of Smad2 / 3 in muscle cells can be used without particular limitation. For example, when the amount of Smad2 / 3 is measured by real-time PCR, a primer of Smad2 / 3 is mentioned as a reagent. When the amount of Smad2 / 3 is measured by Western blotting or ELISA, a specific antibody against Smad2 / 3 is mentioned as a reagent.
In addition, the kit of the present invention can contain, in addition to the above-mentioned reagents, reagents specific to the measurement means, for example, a solid phase blocking agent in Western blotting or ELISA.
Further, the kit of the present invention may include an instruction (instruction) describing a procedure for performing the screening method of the present invention.
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Next, the effects of the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例1:筋萎縮とSmad2及びSmad3との関係Example 1: Relationship between muscle atrophy and Smad2 and Smad3
(1)8週齢のC57/BL6野生型マウスに、坐骨神経切断側(denerve)と非切断側(control)とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋(腓腹筋)は安静状態となった。坐骨神経切断側と非切断側とを作成したマウス5匹を実験に使用した。
切断処置1週間後に腓腹筋の重量を測定した。坐骨神経切断側の筋肉重量は0.817±0.055g/マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.057g/マウス体重であった。非切断側の筋肉重量を1とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図1に示す。
図1に示されるように、座骨神経切断側で有意な筋肉重量の減少が見られた。
(1) The sciatic nerve cut side (denerve) and the non-cut side (control) were created in 8-week-old C57 / BL6 wild-type mice. By the sciatic nerve transection, the skeletal muscle (gastrocnemius) on the sciatic nerve transected side was in a resting state. Five mice that had a cut side and a non-cut side of the sciatic nerve were used for the experiment.
One week after the amputation, the weight of the gastrocnemius muscle was measured. The muscle weight on the cut side of the sciatic nerve was 0.817 ± 0.055 g / mouse weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.057 g / mouse weight. The relative muscle weight on the sciatic nerve cut side when the muscle weight on the non-cut side is 1 is shown in FIG.
As shown in FIG. 1, a significant decrease in muscle weight was seen on the sciatic nerve transection side.
(2)上記(1)で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織(坐骨神経切断側及び非切断側)からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1(いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子)の発現をリアルタイムPCRにより測定した。筋肉細胞において発現が高く、当該技術分野で内部比較コントロールとして一般的に用いられているbeta-actinの発現を、本実施例でも内部比較コントロールとして用いた。
非切断側の各遺伝子の発現量を1とした場合の、坐骨神経切断側の各遺伝子の相対発現量を図2に示す。図2(a)はAtrogin-1に関する結果を示し、図2(b)はMuRF-1に関する結果を示す。
図2に示されるように、座骨神経切断側では、Atrogin-1及びMuRF-1の発現が有意に上昇していた。Atrogin-1及びMuRF-1は、いずれも筋肉を構成するタンパク質の分解に関わるので、その過剰発現は筋萎縮につながるものである。
(1)及び(2)の結果は、マウスの坐骨神経切断側では、坐骨神経切断に起因する筋肉の安静状態により、筋萎縮が生じたことを示している。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue of the gastrocnemius muscle (cut side and non-cut side of the sciatic nerve) of the mouse treated in (1) above, reverse transcribed, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both of which The expression of a gene involved in the degradation of a protein to be converted was measured by real-time PCR. The expression of beta-actin, which has high expression in muscle cells and is commonly used in the art as an internal control, was also used as an internal control in this example.
The relative expression level of each gene on the sciatic nerve cut side when the expression level of each gene on the non-cut side is 1 is shown in FIG. FIG. 2 (a) shows the results for Atrogin-1 and FIG. 2 (b) shows the results for MuRF-1.
As shown in FIG. 2, the expression of Atrogin-1 and MuRF-1 was significantly increased on the sciatic nerve transection side. Since Atrogin-1 and MuRF-1 are both involved in the degradation of proteins constituting muscle, their overexpression leads to muscle atrophy.
The results of (1) and (2) indicate that muscle atrophy occurred on the sciatic nerve transection side of the mouse due to the resting state of the muscle due to the sciatic nerve transection.
(3)上記(1)で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織(坐骨神経切断側(Den)及び非切断側(Cont))から、細胞溶解緩衝液(RIPA buffer)を用いて細胞溶解物(lysate)を回収した。細胞溶解物におけるリン酸化Smad2及びリン酸化Smad3 の量と、非リン酸化Smad2及び非リン酸化Smad3 の量とを、ウェスタンブロッティングにより比較した。リン酸化Smad2の検出には、リン酸化Smad2に対する抗体(pSmad2/ #3101, Cell Signaling)を使用し、リン酸化Smad3の検出には、リン酸化Smad3に対する抗体(pSmad3/ #9520, Cell Signaling)を使用した。また、Smad2及びSmad3の検出には、Smad2及びSmad3に対する抗体(#3102, Cell Signaling)を使用した。
同内容の実験を2組(#1, #2)で施行した。
結果を図3に示す。なお、beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
図3に示されるように、坐骨神経切断側(すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉)において、Smad2及びSmad3の発現の増加(タンパク質としての量の増加)が認められた。また、リン酸化Smad2及びSmad3についても、坐骨神経切断側で発現の増加が認められた。
(3) Cell lysate (lysate) was obtained from the muscle tissue of the gastrocnemius muscle of the mouse treated in (1) above (the sciatic nerve cut side (Den) and the non-cut side (Cont)) using a cell lysis buffer (RIPA buffer). ) Was recovered. The amount of phosphorylated Smad2 and phosphorylated Smad3 in the cell lysate was compared with the amount of non-phosphorylated Smad2 and non-phosphorylated Smad3 by Western blotting. An antibody to phosphorylated Smad2 (pSmad2 / # 3101, Cell Signaling) is used to detect phosphorylated Smad2, and an antibody to phosphorylated Smad3 (pSmad3 / # 9520, Cell Signaling) is used to detect phosphorylated Smad3 did. For detection of Smad2 and Smad3, an antibody against Smad2 and Smad3 (# 3102, Cell Signaling) was used.
The same experiment was performed in two sets (# 1, # 2).
The results are shown in FIG. The expression of beta-actin was used as an internal control.
As shown in FIG. 3, increased expression (increase in the amount of protein) of Smad2 and Smad3 was observed on the cut side of the sciatic nerve (that is, the muscle undergoing muscular atrophy). Also, increased expression of phosphorylated Smad2 and Smad3 was observed on the sciatic nerve transection side.
これらの実験結果は、筋萎縮を起こしている筋肉組織から得られた筋肉細胞においてSmad2及びSmad3の量及び活性が上昇していることを示している。
したがって、筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇の抑制及び/又はSmad2及び/又はSmad3の活性の抑制の有無を指標として、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤をスクリーニングすることができる。
These experimental results indicate that the amount and activity of Smad2 and Smad3 are increased in muscle cells obtained from muscle tissue undergoing muscle atrophy.
Therefore, it is possible to screen for a prophylactic and / or therapeutic agent for muscular atrophy using as an index whether suppression of an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells and / or suppression of the activity of Smad2 and / or Smad3. it can.
実施例2:筋萎縮におけるSmad2及びSmad3とミオスタチンとの関係
(1)8週齢のミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス (Mstn cKO, Mx Cre/Mstnflox/flox)(5匹)と、コントロールマウス(control, Mstnflox/flox)(5匹)に、polyIpolyCを投与した。なお、polyIpolyCは、Creの発現誘導からミオスタチンを欠損させるために投与した。
投与から3週間後に、各マウスに坐骨神経切断側(denerve)と非切断側(control)とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋は安静状態となった。
切断処置1週間後に、腓腹筋の重量を測定した。ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスについて、坐骨神経切断側の筋肉重量は0.774±0.068g/マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.063g/マウス体重であった。コントロールマウスについて、坐骨神経切断側の筋肉重量は0.756±0.069g/マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.1g/マウス体重であった。各マウスについて、非切断側の筋肉重量を1とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図4に示す。
図4に示されるように、座骨神経切断側における筋肉重量の有意な減少がミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス及びコントロールマウスの双方において見られた。
Example 2: Relationship between Smad2 and Smad3 and myostatin in muscle atrophy (1) Myostatin conditional knockout mouse (Mstn cKO, Mx Cre / Mstn flox / flox ) (5 mice) and control mouse (control, 8 weeks old) Mstn flox / flox ) (5 animals) was administered with polyIpolyC. In addition, polyIpolyC was administered to delete myostatin from induction of Cre expression.
Three weeks after the administration, a cut side (denerve) and a non-cut side (control) of the sciatic nerve were prepared for each mouse. By the sciatic nerve transection, the skeletal muscle on the sciatic nerve transected side was in a resting state.
One week after the amputation treatment, the weight of the gastrocnemius muscle was measured. For the myostatin conditional knockout mouse, the muscle weight on the cut side of the sciatic nerve was 0.774 ± 0.068 g / mouse weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.063 g / mouse weight. For the control mouse, the muscle weight on the cut side of the sciatic nerve was 0.756 ± 0.069 g / mouse weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.1 g / mouse weight. FIG. 4 shows the relative muscle weight on the cut side of the sciatic nerve when the muscle weight on the non-cut side is 1 for each mouse.
As shown in FIG. 4, a significant decrease in muscle weight at the sciatic nerve transection side was seen in both myostatin conditional knockout mice and control mice.
(2)上記(1)で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織(坐骨神経切断側及び非切断側)からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1(いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子)の発現をリアルタイムPCRにより測定した。beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
各マウスについて、非切断側の各遺伝子の発現量を1とした場合の、坐骨神経切断側の各遺伝子の相対発現量を図5に示す。
図5に示されるように、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス及びコントロールマウスの双方において、座骨神経切断側では、Atrogin-1及びMuRF-1(いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子)の発現が有意に上昇していた。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue of the gastrocnemius muscle (cut side and non-cut side of the sciatic nerve) of the mouse treated in (1) above, reverse transcribed, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both of which The expression of a gene involved in the degradation of a protein to be converted was measured by real-time PCR. beta-actin expression was used as an internal comparison control.
FIG. 5 shows the relative expression level of each gene on the cut side of the sciatic nerve when the expression level of each gene on the non-cut side is 1 for each mouse.
As shown in FIG. 5, in both the myostatin conditional knockout mouse and the control mouse, the expression of Atrogin-1 and MuRF-1 (both genes involved in the degradation of proteins constituting muscle) were observed on the sciatic nerve transection side. Was significantly increased.
(3)上記(1)で処置したミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスの腓腹筋の筋肉組織(坐骨神経切断側及び非切断側)から、細胞溶解緩衝液(RIPA buffer)を用いて細胞溶解物(lysate)を回収した。細胞溶解物におけるSmad2及びSmad3の量を、Smad2及びSmad3に対する抗体(#3102, Cell Signaling)を用い、ウェスタンブロッティングにより比較した。
結果を図6に示す。なお、beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
図6に示されるように、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスの坐骨神経切断側(すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉)において、Smad2及びSmad3の発現の増加(タンパク質としての量の増加)が認められた。
(1)〜(3)の結果は、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス(すなわち、ミオスタチンを発現できないマウス)の坐骨神経切断側(すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉)において、Smad2及びSmad3の発現の増加が起きたことを示している。これは、筋萎縮におけるSmad2及びSmad3のタンパク質の量レベルでの増加は、ミオスタチンに依存しないことを示している。
(3) A cell lysate (lysate) was prepared from the muscle tissue of the gastrocnemius muscle (cut side and non-cut side of the sciatic nerve) of the myostatin conditional knockout mouse treated in the above (1) using a cell lysis buffer (RIPA buffer). Collected. The amounts of Smad2 and Smad3 in the cell lysates were compared by western blotting using antibodies to Smad2 and Smad3 (# 3102, Cell Signaling).
FIG. 6 shows the results. The expression of beta-actin was used as an internal control.
As shown in FIG. 6, increased expression (increase in protein amount) of Smad2 and Smad3 was observed on the cut side of the sciatic nerve of the myostatin conditional knockout mouse (ie, the muscle undergoing muscular atrophy). .
The results of (1) to (3) indicate that the expression of Smad2 and Smad3 was increased in the sciatic nerve transection side (that is, the muscle undergoing muscular atrophy) of the myostatin conditional knockout mouse (that is, the mouse that cannot express myostatin). Indicates that the event has occurred. This indicates that the increase in the levels of Smad2 and Smad3 proteins in muscle atrophy is not dependent on myostatin.
実施例3:筋萎縮とSmad3との関係Example 3: Relationship between muscle atrophy and Smad3
(1)8週齢のC57/BL6野生型マウス(WT)(5匹)、Smad3ノックアウトマウス(Smad3 KO)(5匹)、並びに、Smad2及びSmad3ダブルノックアウトマウス(DKO)(5匹)のそれぞれに、坐骨神経切断側(denerve)と非切断側(control)とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋は安静状態となった。
切断処置1週間後に、腓腹筋の重量を測定した。
野生型マウス(WT)について、非切断側の筋肉重量を1とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は0.779であった。
Smad3ノックアウトマウス(Smad3 KO)について、非切断側の筋肉重量を1とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は0.89であった。
Smad2及びSmad3ダブルノックアウトマウス(DKO)について、非切断側の筋肉重量を1とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は1.033であった。
非切断側の筋肉重量を1とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図7に示す。
図7に示されるように、Smad3の発現が抑制されていないマウス(WT)では、座骨神経切断側で有意な筋肉重量の減少が見られた。一方、Smad3の発現を抑制したマウス(Smad3 KO及びDKO)では、座骨神経切断側における統計学的に有意な筋肉重量の減少は見られなかった。
(1) 8-week-old C57 / BL6 wild-type mice (WT) (5 mice), Smad3 knockout mice (Smad3 KO) (5 mice), and Smad2 and Smad3 double knockout mice (DKO) (5 mice) Next, the sciatic nerve cut side (denerve) and the non-cut side (control) were created. By the sciatic nerve transection, the skeletal muscle on the sciatic nerve transected side was in a resting state.
One week after the amputation treatment, the weight of the gastrocnemius muscle was measured.
With respect to the wild-type mouse (WT), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side when the muscle weight on the non-cut side was 1 was 0.779.
For the Smad3 knockout mouse (Smad3 KO), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side was 0.89, where the non-cut side muscle weight was set to 1.
With respect to the Smad2 and Smad3 double knockout mice (DKO), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side when the muscle weight on the non-cut side was 1 was 1.033.
FIG. 7 shows the relative muscle weight on the cut side of the sciatic nerve when the muscle weight on the non-cut side is set to 1.
As shown in FIG. 7, in the mouse (WT) in which the expression of Smad3 was not suppressed, a significant decrease in muscle weight was observed on the sciatic nerve transection side. On the other hand, in the mice in which the expression of Smad3 was suppressed (Smad3 KO and DKO), no statistically significant decrease in muscle weight was observed at the sciatic nerve transection side.
(2)上記(1)で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織(坐骨神経切断側及び非切断側)からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1(いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子)の発現をリアルタイムPCRにより測定した。beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
非切断側(control)の各遺伝子の発現量を1とした場合の、坐骨神経切断側(denerve)の各遺伝子の相対発現量を図8に示す。
図8に示されるように、Smad3の発現が抑制されていないマウス(WT)では、座骨神経切断側において、Atrogin-1及びMuRF-1(いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子)の発現が有意に上昇していた。一方、Smad3の発現を抑制したマウス(Smad3 KO及びDKO)では、座骨神経切断側における統計学的に有意なAtrogin-1及びMuRF-1の上昇は見られなかった。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue of the gastrocnemius muscle (cut side and non-cut side of the sciatic nerve) of the mouse treated in (1) above, reverse transcribed, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both of which The expression of a gene involved in the degradation of a protein to be converted was measured by real-time PCR. beta-actin expression was used as an internal comparison control.
The relative expression level of each gene on the sciatic nerve cut side (denerve) when the expression level of each gene on the non-cut side (control) is 1 is shown in FIG.
As shown in FIG. 8, in the mouse (WT) in which the expression of Smad3 is not suppressed, Atrogin-1 and MuRF-1 (both genes involved in the degradation of proteins constituting muscle) were observed on the cut side of the sciatic nerve. Was significantly increased. On the other hand, in mice in which Smad3 expression was suppressed (Smad3 KO and DKO), no statistically significant increase in Atrogin-1 and MuRF-1 was observed on the cut side of the sciatic nerve.
上記(1)の結果は、筋萎縮にSmad3の量及び活性が関与していることを示している。上記(2)の結果は、筋萎縮つながるAtrogin-1及びMuRF-1の発現量増加に、Smad3の活性が関与していることを示している。
したがって、Smad3の量の上昇の抑制又はSmad3の活性抑制の有無を指標として、筋萎縮の予防剤及び/又は治療剤をスクリーニングすることができる。
The results of the above (1) indicate that the amount and activity of Smad3 are involved in muscle atrophy. The results of the above (2) indicate that the activity of Smad3 is involved in increasing the expression levels of Atrogin-1 and MuRF-1, which lead to muscle atrophy.
Therefore, a preventive and / or therapeutic agent for muscular atrophy can be screened using the presence or absence of suppression of an increase in the amount of Smad3 or suppression of Smad3 activity as an index.
本発明は、筋萎縮を予防又は治療するための医薬品の開発に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for the development of a medicament for preventing or treating muscle atrophy.
Claims (8)
以下の工程(1)〜(3):
(1)試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
(2)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量を測定する工程、及び、
(3)該筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇を抑制する試験物質を選択する工程
を含み、
該予防剤及び治療剤がミオスタチンを標的としない、スクリーニング方法。 A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscular atrophy,
The following steps (1) to (3):
(1) contacting a test substance with a muscle cell;
(2) measuring the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell; and
(3) looking contains the step of selecting the inhibiting test Substance elevated amounts of Smad2 and / or Smad3 in the muscle intracellular,
A screening method , wherein the prophylactic and therapeutic agents do not target myostatin .
工程(3)において、筋肉細胞内のSmad2及び/又はSmad3の量の上昇を抑制する試験物質を選択する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。 In step (2), the amount of Smad2 and / or Smad3 is measured,
The screening method according to any one of claims 1 to 3, wherein in step (3), a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell is selected.
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