JP2017053763A - Screening method of preventive and/or therapeutic agent of amyotrophy - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening method for a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy.
筋萎縮は、加齢、不動、無重力、長期の臥床、長期あるいは大量のステロイド治療、癌によるカヘキシー、栄養飢餓、四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂を治療するための固定などの、様々な要因で起こることが知られている。
筋萎縮のうち、加齢による進行性の筋萎縮（筋力の低下を伴うこともある）は、サルコペニアと呼ばれている。サルコペニアは、高齢者に、寝たきり、転倒、不動や認知症などの有害事象を引き起こし、この有害事象により更にサルコペニアが進行するという悪循環をもたらすことが知られている。
そのため、筋萎縮を予防及び治療することで、高齢者においては活動性を維持し、日常生活動作レベルを確保し、更には、上述の有害事象を防止することが期待されている。
筋萎縮の予防及び治療に関しては、ミオスタチン（Myostatin）を標的とすることの有用性が示されている（非特許文献１及び２）。
Muscle atrophy can vary from aging, immobility, weightlessness, long-term bedridden, long-term or high-dose steroid therapy, cancer hexiness, nutrient starvation, fixation to treat limb fractures and muscle, tendon and ligament rupture. It is known to happen due to various factors.
Among muscular atrophy, progressive muscular atrophy due to aging (sometimes accompanied by a decrease in muscle strength) is called sarcopenia. It is known that sarcopenia causes adverse events such as bedridden, falls, immobility, and dementia in the elderly, and this adverse event further causes a vicious circle in which sarcopenia progresses.
Therefore, by preventing and treating muscle atrophy, it is expected to maintain activity in the elderly, to ensure daily living action levels, and to prevent the above-mentioned adverse events.
Regarding the prevention and treatment of muscle atrophy, the usefulness of targeting myostatin has been shown (Non-patent Documents 1 and 2).
しかしながら、これまでに筋萎縮を予防又は治療する薬は開発されていない。 However, no drug has been developed so far to prevent or treat muscle atrophy.
本発明者は、筋萎縮について鋭意研究を行なったところ、筋萎縮を発症した動物の筋肉細胞中においてＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３の量が上昇していたこと、及び、斯かる上昇がミオスタチンから独立した様式で起きていたことを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。 The present inventor conducted extensive research on muscle atrophy, and found that the amount of Smad2 and Smad3 was increased in the muscle cells of animals that developed muscle atrophy, and that such increase was independent of myostatin. I found what was happening. The present invention has been made based on these findings.
すなわち、本発明は、下記に関するものである。
１．筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法であって、
以下の工程（１）〜（３）：
（１）試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
（２）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量及び／又は活性を測定する工程、及び、
（３）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇を抑制する試験物質、及び／又は、該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
２．工程（１）の筋肉細胞が骨格筋細胞である、前記１に記載のスクリーニング方法。
３．Ｓｍａｄ２がリン酸化Ｓｍａｄ２である、及び／又は、Ｓｍａｄ３がリン酸化Ｓｍａｄ３である、前記１又は２に記載のスクリーニング方法。
４．工程（２）において、Ｓｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量を測定し、工程（３）において、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇を抑制する試験物質を選択する、前記１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
５．工程（２）において、Ｓｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量を、ウェスタンブロッティングにて測定する、前記１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
６．工程（２）において、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を測定し、工程（３）において、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を選択する、前記１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
７．筋萎縮がサルコペニアである、前記１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
８．筋萎縮がスポーツ外傷の治療より生じた筋萎縮である、前記１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
９．前記１〜８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を行なうためのキットであって、筋肉細胞中のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量又は活性を測定するための試薬を含むことを特徴とするキット。
That is, the present invention relates to the following.
1. A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy,
The following steps (1) to (3):
(1) a step of bringing a test substance into contact with a muscle cell;
(2) measuring the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells; and
(3) including a step of selecting a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell and / or a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell. , Screening method.
2. 2. The screening method according to 1 above, wherein the muscle cells in step (1) are skeletal muscle cells.
3. 3. The screening method according to 1 or 2 above, wherein Smad2 is phosphorylated Smad2, and / or Smad3 is phosphorylated Smad3.
4). In step (2), the amount of Smad2 and / or Smad3 is measured, and in step (3), a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected. The screening method according to any one of the above.
5). 5. The screening method according to any one of 1 to 4, wherein in the step (2), the amount of Smad2 and / or Smad3 is measured by Western blotting.
6). In the step (2), the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is measured, and in the step (3), a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected. 4. The screening method according to any one of 3.
7). The screening method according to any one of 1 to 6, wherein the muscle atrophy is sarcopenia.
8). The screening method according to any one of 1 to 6, wherein the muscle atrophy is a muscle atrophy caused by treatment of sports injury.
9. 9. A kit for performing the screening method according to any one of 1 to 8 above, comprising a reagent for measuring the amount or activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells. .
本発明は、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤をスクリーニングする手段を提供する。したがって、本発明を用いることにより、筋萎縮を予防及び／又は治療するための医薬品を開発することが可能になる。 The present invention provides a means for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy. Therefore, by using the present invention, it becomes possible to develop a medicine for preventing and / or treating muscle atrophy.
以下、本発明に斯かる、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法を詳細に説明する。本発明のスクリーニング方法は、
以下の工程（１）〜（３）：
（１）試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
（２）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量及び／又は活性を測定する工程、及び、
（３）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇を抑制する試験物質、及び／又は、該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を選択する工程
を含んでいる。
Hereinafter, a screening method for a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy according to the present invention will be described in detail. The screening method of the present invention comprises:
The following steps (1) to (3):
(1) a step of bringing a test substance into contact with a muscle cell;
(2) measuring the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells; and
(3) including a step of selecting a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell and / or a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell. It is out.
筋萎縮の予防剤及び治療剤のスクリーニング
「筋萎縮」とは、安静状態が長く続くことによって筋肉が体積減少を起こし、萎縮した状態をいう。
筋萎縮の原因としては、加齢、不動、無重力、長期の臥床、長期あるいは大量のステロイド治療、癌によるカヘキシー、栄養飢餓、四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂を治療するための固定等が挙げられる。前述の四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂には、スポーツ外傷により生じたものが含まれる。
筋萎縮のうち、加齢により発症する進行性の筋萎縮はサルコペニアと呼ばれている。本発明は、サルコペニアの予防剤及び／又は治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
また、本発明は、スポーツ外傷の治療（四肢の骨折や筋、腱及び靭帯の断裂の固定）により生じた筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニングにも好適に用いることができる。
筋萎縮は主に骨格筋で発症する。筋萎縮は、あらゆる部位の骨格筋で発症しうるが、腓腹筋や大腿筋で発症しやすく、発症による影響も大きい。
筋萎縮は、筋肉を有するあらゆる動物で起こりうるが、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
「筋萎縮の予防剤」には、筋萎縮の発症を阻害する剤の他、筋萎縮の発症を遅延させる剤等が含まれる。
「筋萎縮の治療剤」には、筋萎縮の症状を改善又は緩和する剤の他、発症した筋萎縮の進行を遅延させる剤等が含まれる。
「スクリーニング」とは、上述の筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤を、試験物質（候補物質）の中から選択することをいう。
Screening for preventive and therapeutic agents for muscular atrophy “Muscle atrophy” refers to a state in which muscles have undergone volume reduction due to prolonged resting, resulting in atrophy.
Causes of muscle atrophy include aging, immobility, weightlessness, long-term bedridden, long-term or high-dose steroid therapy, cancer hexiness, nutrient starvation, fractures of limbs and fixation to treat muscles, tendons and ligaments, etc. Is mentioned. The above-mentioned fractures of limbs and tears of muscles, tendons and ligaments include those caused by sports trauma.
Among muscle atrophy, progressive muscle atrophy that develops with aging is called sarcopenia. The present invention can be suitably used for screening prophylactic and / or therapeutic agents for sarcopenia.
The present invention can also be suitably used for screening for a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy caused by treatment of sports injury (fixation of fractures of limbs and muscle, tendon and ligament tears).
Muscle atrophy occurs primarily in skeletal muscle. Muscular atrophy can occur in skeletal muscles at any site, but it is likely to occur in gastrocnemius and thigh muscles, and is greatly affected by the onset.
Although muscle atrophy can occur in any animal having muscles, the present invention can be suitably used for screening for preventive and / or therapeutic agents for muscle atrophy in mammals, particularly humans.
The “prophylaxis agent for muscle atrophy” includes agents that delay the onset of muscle atrophy in addition to agents that inhibit the onset of muscle atrophy.
“Therapeutic agent for muscle atrophy” includes an agent for delaying the progress of onset muscle atrophy, in addition to an agent for improving or alleviating the symptoms of muscle atrophy.
“Screening” means selecting the above-mentioned preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy from test substances (candidate substances).
工程（１）
工程（１）では、試験物質と筋肉細胞とを接触させる。
筋肉細胞としては、あらゆる動物由来のものを使用できるが、哺乳動物（例えば、マウスやヒト）由来の筋肉細胞を用いることが好ましい。
筋肉細胞としては、筋萎縮を発症しうる筋肉に由来する細胞を特に制限なく用いることができる。筋肉細胞の具体例としては、骨格筋細胞、心筋細胞、血管や腸管の平滑筋細胞等が挙げられる。筋肉細胞としては、骨格筋細胞が好ましい。
骨格筋細胞が由来する部位は特に限定されないが、筋萎縮が発症しやすい腓腹筋や大腿筋に由来する骨格筋細胞が好ましい。
筋肉細胞は、筋萎縮を発症している筋肉組織から採取した細胞であってもよく、筋萎縮を発症していない筋肉組織から採取した細胞であってもよい。
また、筋肉細胞は、採取した細胞自体であってもよく、プライマリー細胞であってもよく、株化された細胞であってもよい。また、筋肉細胞は、間葉系幹細胞から誘導した筋肉細胞であってもよく、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から誘導した筋肉細胞であってもよい。
Process (1)
In step (1), the test substance is brought into contact with muscle cells.
As the muscle cells, those derived from any animal can be used, but it is preferable to use muscle cells derived from mammals (for example, mouse and human).
As the muscle cell, a cell derived from muscle that can develop muscle atrophy can be used without particular limitation. Specific examples of muscle cells include skeletal muscle cells, cardiomyocytes, blood vessels and intestinal smooth muscle cells, and the like. As a muscle cell, a skeletal muscle cell is preferable.
The site from which skeletal muscle cells are derived is not particularly limited, but skeletal muscle cells derived from gastrocnemius and thigh muscles that tend to develop muscle atrophy are preferred.
The muscle cell may be a cell collected from muscle tissue that has developed muscle atrophy, or may be a cell collected from muscle tissue that has not developed muscle atrophy.
The muscle cell may be a collected cell itself, a primary cell, or a cell line established. The muscle cells may be muscle cells derived from mesenchymal stem cells, or may be muscle cells derived from iPS cells or ES cells.
試験物質と筋肉細胞とを接触させる手段としては、医薬品候補物質のスクリーニング方法で一般的に用いられている手段を特に制限なく用いることができる。例えば、試験物質を筋肉細胞の培養液へ添加することで、試験物質と筋肉細胞とを接触させることができる。
試験物質と接触させた後の筋肉細胞は、その生存を維持できる任意の条件下でインキュベートしてもよい。インキュベート条件は、筋肉細胞の培養条件として知られているものを特に制限なく用いることができる。
As means for bringing the test substance into contact with muscle cells, means generally used in the screening method for drug candidate substances can be used without particular limitation. For example, the test substance can be brought into contact with the muscle cell by adding the test substance to the culture solution of the muscle cell.
The muscle cells after contact with the test substance may be incubated under any conditions that can maintain their survival. As incubation conditions, those known as muscle cell culture conditions can be used without particular limitation.
工程（２）
工程（２）では、試験物質と接触させた筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量及び／又は活性を測定する。
「Ｓｍａｄ２」及び「Ｓｍａｄ３」は、いずれも、ミオスタチン、ＩＧＦ−１やＴＧＦ−βといったサイトカインによる細胞内シグナル伝達に関与することが知られているタンパク質性転写因子である。なお、Ｓｍａｄ２のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号「NM_001003652」でGenBankに登録されている。また、Ｓｍａｄ３のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号「NM_001145102」でGenBankに登録されている。
Process (2)
In step (2), the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell contacted with the test substance is measured.
“Smad2” and “Smad3” are both proteinaceous transcription factors known to be involved in intracellular signal transduction by cytokines such as myostatin, IGF-1 and TGF-β. The amino acid sequence of Smad2 is registered in GenBank with, for example, the accession number “NM_001003652”. Further, the amino acid sequence of Smad3 is registered in GenBank, for example, with an accession number “NM — 001145102”.
ここで、ミオスタチンと、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３とは、健常者における筋肉の異化メカニズムにおいて下記の役割を果たしていることが知られている。
（１）ミオスタチンが筋肉細胞表面のレセプターActRIIBに結合して、ActRIIBの細胞内ドメインをリン酸化する。
（２）リン酸化されたActRIIBが、別の細胞表面レセプターActRIBをリン酸化し、更にActRIBとの会合体を形成する。
（３）前記の会合体が、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化する。
（４）リン酸化されたＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３が、Ｓｍａｄ４と会合体（Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ４との会合体、Ｓｍａｄ３とＳｍａｄ４との会合体や、Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ３とＳｍａｄ４との会合体）を形成する。
（５）前記の会合体が筋肉細胞の核内へ移行して、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子（Atrogin-1及びMuRF-1）の発現を促進する。
ところで、後述の実施例で示されるように、筋萎縮を発症している筋肉細胞では、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の量がミオスタチンからは独立した様式で上昇している。
したがって、本発明のスクリーニング方法は、ミオスタチンを標的とする筋萎縮治療剤とは異なる機序で作用する医薬品の開発に用いることができる。
Here, it is known that myostatin and Smad2 and Smad3 play the following roles in the mechanism of muscle catabolism in healthy individuals.
(1) Myostatin binds to the muscle cell surface receptor ActRIIB and phosphorylates the intracellular domain of ActRIIB.
(2) Phosphorylated ActRIIB phosphorylates another cell surface receptor ActRIB and further forms an aggregate with ActRIB.
(3) The aggregates phosphorylate Smad2 and Smad3.
(4) Phosphorylated Smad2 and Smad3 form an association with Smad4 (an association between Smad2 and Smad4, an association between Smad3 and Smad4, or an association between Smad2, Smad3 and Smad4).
(5) The aggregate moves into the nucleus of muscle cells and promotes the expression of genes (Atrogin-1 and MuRF-1) involved in the degradation of the proteins constituting the muscle.
By the way, as shown in the Examples described later, in the muscle cells developing muscle atrophy, the amounts of Smad2 and Smad3 are increased in a manner independent of myostatin.
Therefore, the screening method of the present invention can be used for the development of a pharmaceutical agent that acts by a mechanism different from that of a muscle atrophy therapeutic agent that targets myostatin.
工程（２）では、Ｓｍａｄ２又はＳｍａｄ３のいずれか一方の量及び／又は活性を測定すればよいが、Ｓｍａｄ３の量及び／又は活性を測定することが好ましい。
また、Ｓｍａｄ２とＳｍａｄ３の両方の量及び／又は活性を測定してもよい。
また、工程（２）では、Ｓｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３（以下、「Ｓｍａｄ２／３」ともいう）の量のみを測定してもよく、活性のみを測定してもよく、量と活性の双方を測定してもよい。
In step (2), the amount and / or activity of either Smad2 or Smad3 may be measured, but the amount and / or activity of Smad3 is preferably measured.
Moreover, you may measure the quantity and / or activity of both Smad2 and Smad3.
In step (2), only the amount of Smad2 and / or Smad3 (hereinafter also referred to as “Smad2 / 3”) may be measured, or only the activity may be measured, and both the amount and activity are measured. May be.
工程（２）で測定する「量」とは、筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の量、すなわち、Ｓｍａｄ２／３のタンパク質としての量をいう。
Ｓｍａｄ２／３の量は、リン酸化されたＳｍａｄ２／３の量として測定してもよい。
The “amount” measured in the step (2) refers to the amount of Smad2 / 3 in muscle cells, that is, the amount of Smad2 / 3 as a protein.
The amount of Smad2 / 3 may be measured as the amount of phosphorylated Smad2 / 3.
Ｓｍａｄ２／３の量は、当該技術分野で一般的に用いられている細胞内タンパク質の定量方法を特に制限なく用いて測定することができる。
例えば、Ｓｍａｄ２／３のタンパク質としての量を直接測定してもよく、当該タンパク質量に対応するＳｍａｄ２／３のｍＲＮＡ量を指標に測定してもよい。
Ｓｍａｄ２／３のタンパク質としての量は、例えば、Ｓｍａｄ２／３に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ等を使用して測定することができる。
Ｓｍａｄ２／３のｍＲＮＡ量は、例えば、リアルタイムＰＣＲや、リポーター遺伝子アッセイ等を使用して測定することができる。リポーター遺伝子アッセイは、例えば、Ｓｍａｄ２／３をコードする遺伝子の下流にリポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を組み込むことにより、行なうことができる。
The amount of Smad2 / 3 can be measured using a method for quantifying intracellular proteins generally used in the art without particular limitation.
For example, the amount of Smad2 / 3 as a protein may be directly measured, or the amount of Smad2 / 3 mRNA corresponding to the amount of the protein may be measured as an index.
The amount of Smad2 / 3 as a protein can be measured using, for example, Western blotting or ELISA using an antibody specific to Smad2 / 3.
The amount of Smad2 / 3 mRNA can be measured using, for example, real-time PCR, reporter gene assay, or the like. The reporter gene assay can be performed, for example, by incorporating a reporter gene (for example, a luciferase gene) downstream of a gene encoding Smad2 / 3.
Ｓｍａｄ２／３の活性とは、Ｓｍａｄ２／３の転写因子としての活性（タンパク質−タンパク質相互作用活性）をいう。具体的には、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子（Atrogin-1及びMuRF-1）の発現を指標に、Ｓｍａｄ２／３の活性を測定することができる。
Ｓｍａｄ２／３の活性は、当該技術分野で一般的に用いられている転写活性の定量方法を特に制限なく用いて測定することができる。具体例としては、リポーターアッセイ法やリアルタイムPCR法等が挙げられる。
The activity of Smad2 / 3 refers to the activity of Smad2 / 3 as a transcription factor (protein-protein interaction activity). Specifically, the activity of Smad2 / 3 can be measured using the expression of genes (Atrogin-1 and MuRF-1) involved in the degradation of the protein constituting the muscle as an index.
The activity of Smad2 / 3 can be measured using a method for quantifying transcriptional activity generally used in the art without particular limitation. Specific examples include a reporter assay method and a real-time PCR method.
工程（３）
工程（３）では、工程（２）の測定結果に基づき、筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の量の上昇を抑制する試験物質、及び／又は、該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤として選択する。
工程（２）の測定結果と比較される対象（対照）は、工程（１）で用いた試験物質と接触させていない筋肉細胞のＳｍａｄ２／３の量及び／又は活性であってもよく、工程（１）で用いた試験物質とは異なる物質（例えば、Ｓｍａｄ２／３の活性を低下させることが知られている公知物質（例えば、ＳＩＳ３（Smad3 Inhibitor））と接触させた筋肉細胞のＳｍａｄ２／３の活性であってもよい。
「Ｓｍａｄ２／３の量の上昇を抑制する」とは、「Ｓｍａｄ２／３の量を変化させない」ことと、「筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の量を低下させる」こととをいう。
工程（１）で使用した試験物質が、筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の量を変化させなかった場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防するための医薬品（例えば、Ｓｍａｄ２／３の量を筋萎縮発症量（発症レベル）未満に維持する医薬品）や、筋萎縮を治療するための医薬品（例えば、筋萎縮の進行を遅延させる医薬品）の候補となる。
工程（１）で使用した試験物質が、筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の量を低下させた場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防及び／又は治療するための医薬品（例えば、Ｓｍａｄ２／３のレベルを筋萎縮発症量（発症レベル）未満へと低減する医薬品）の候補となる。
工程（１）で使用した試験物質が、筋肉細胞内のＳｍａｄ２／３の活性を抑制した（低下させた）場合、当該試験物質は、筋萎縮を予防及び／又は治療するための医薬品（例えば、Ｓｍａｄ２／３の活性を筋萎縮が発症する活性（発症レベル）未満へと低減する医薬品）の候補となる。
Step (3)
In step (3), based on the measurement result of step (2), the test substance that suppresses the increase in the amount of Smad2 / 3 in muscle cells and / or the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells is measured. The test substance to be suppressed is selected as a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy.
The target (control) to be compared with the measurement result of step (2) may be the amount and / or activity of Smad2 / 3 of muscle cells not contacted with the test substance used in step (1). Smad2 / 3 of muscle cells brought into contact with a substance different from the test substance used in (1) (for example, a known substance known to decrease the activity of Smad2 / 3 (for example, SIS3 (Smad3 Inhibitor)) May be active.
“Suppressing an increase in the amount of Smad2 / 3” means “not changing the amount of Smad2 / 3” and “decreasing the amount of Smad2 / 3 in muscle cells”.
When the test substance used in the step (1) does not change the amount of Smad2 / 3 in muscle cells, the test substance is used as a drug for preventing muscle atrophy (for example, the amount of Smad2 / 3 Candidates for drugs that are maintained below the amount of onset of atrophy (onset level) and drugs for treating muscle atrophy (for example, drugs that delay the progression of muscle atrophy).
When the test substance used in step (1) reduces the amount of Smad2 / 3 in muscle cells, the test substance is a pharmaceutical product for preventing and / or treating muscle atrophy (for example, Smad2 / 3 Candidates for pharmaceuticals that reduce the level to less than the onset of muscle wasting (onset level).
When the test substance used in the step (1) suppresses (reduces) the activity of Smad2 / 3 in muscle cells, the test substance is a pharmaceutical product for preventing and / or treating muscle atrophy (for example, It is a candidate for a drug that reduces the activity of Smad2 / 3 to less than the activity (onset level) at which muscle atrophy develops.
更に本発明は、上述のスクリーニング方法を行うためのキットに関する。本発明のキットは、筋肉細胞中のＳｍａｄ２／３の量又は活性を測定するための試薬を含む。
上記の試薬としては、筋肉細胞中のＳｍａｄ２／３の量又は活性を測定するために当該技術分野で一般的に用いられているものを特に制限なく用いることができる。例えば、Ｓｍａｄ２／３の量をリアルタイムＰＣＲにより測定する場合には、Ｓｍａｄ２／３のプライマーが試薬として挙げられる。Ｓｍａｄ２／３の量をウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡにより測定する場合には、Ｓｍａｄ２／３に対する特異的抗体が試薬として挙げられる。
また、本発明のキットは、前述の試薬の他、測定手段に固有の試薬、例えば、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡでは固相ブロッキング剤等を含むことができる。
更に、本発明のキットは、本発明のスクリーニング方法を実施する手順を記載した説明書（指示書）を含んでいてもよい。
Furthermore, this invention relates to the kit for performing the above-mentioned screening method. The kit of the present invention includes a reagent for measuring the amount or activity of Smad2 / 3 in muscle cells.
As said reagent, what is generally used in the said technical field in order to measure the quantity or activity of Smad2 / 3 in a muscle cell can be used without a restriction | limiting in particular. For example, when the amount of Smad2 / 3 is measured by real-time PCR, a primer for Smad2 / 3 can be used as a reagent. When the amount of Smad2 / 3 is measured by Western blotting or ELISA, a specific antibody against Smad2 / 3 can be used as a reagent.
Moreover, the kit of this invention can contain the reagent intrinsic | native to a measurement means other than the above-mentioned reagent, for example, a solid-phase blocking agent etc. in a western blotting or ELISA.
Furthermore, the kit of the present invention may contain instructions (instructions) describing procedures for performing the screening method of the present invention.
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Next, the effects of the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１：筋萎縮とＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３との関係Example 1: Relationship between muscle atrophy and Smad2 and Smad3
（１）８週齢のC57/BL6野生型マウスに、坐骨神経切断側（denerve）と非切断側（control）とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋（腓腹筋）は安静状態となった。坐骨神経切断側と非切断側とを作成したマウス５匹を実験に使用した。
切断処置１週間後に腓腹筋の重量を測定した。坐骨神経切断側の筋肉重量は0.817±0.055ｇ／マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.057ｇ／マウス体重であった。非切断側の筋肉重量を１とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図１に示す。
図１に示されるように、座骨神経切断側で有意な筋肉重量の減少が見られた。
(1) An 8-week-old C57 / BL6 wild-type mouse was prepared with a sciatic nerve cutting side (denerve) and a non-cutting side (control). By sciatic nerve cutting, the skeletal muscle (gastrocnemius) on the sciatic nerve cutting side became resting. Five mice with sciatic nerve cut side and non-cut side were used in the experiment.
The weight of the gastrocnemius was measured one week after the cutting procedure. The muscle weight on the sciatic nerve cut side was 0.817 ± 0.055 g / mouse body weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.057 g / mouse body weight. FIG. 1 shows the relative muscle weight on the sciatic nerve cutting side when the muscle weight on the non-cutting side is 1.
As shown in FIG. 1, a significant decrease in muscle weight was observed on the sciatic nerve cut side.
（２）上記（１）で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織（坐骨神経切断側及び非切断側）からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1（いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子）の発現をリアルタイムＰＣＲにより測定した。筋肉細胞において発現が高く、当該技術分野で内部比較コントロールとして一般的に用いられているbeta-actinの発現を、本実施例でも内部比較コントロールとして用いた。
非切断側の各遺伝子の発現量を１とした場合の、坐骨神経切断側の各遺伝子の相対発現量を図２に示す。図２（ａ）はAtrogin-1に関する結果を示し、図２（ｂ）はMuRF-1に関する結果を示す。
図２に示されるように、座骨神経切断側では、Atrogin-1及びMuRF-1の発現が有意に上昇していた。Atrogin-1及びMuRF-1は、いずれも筋肉を構成するタンパク質の分解に関わるので、その過剰発現は筋萎縮につながるものである。
（１）及び（２）の結果は、マウスの坐骨神経切断側では、坐骨神経切断に起因する筋肉の安静状態により、筋萎縮が生じたことを示している。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue (sciatic nerve cut side and non-cut side) of the gastrocnemius muscle of the mouse treated in (1) above, followed by reverse transcription, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both constituting the muscle) The expression of genes involved in the degradation of the protein to be determined was measured by real-time PCR. The expression of beta-actin, which is highly expressed in muscle cells and is generally used as an internal comparison control in this technical field, was also used as an internal comparison control in this example.
FIG. 2 shows the relative expression level of each gene on the sciatic nerve cutting side when the expression level of each gene on the non-cutting side is 1. FIG. 2 (a) shows the results for Atrogin-1, and FIG. 2 (b) shows the results for MuRF-1.
As shown in FIG. 2, the expression of Atrogin-1 and MuRF-1 was significantly increased on the sciatic nerve cut side. Since Atrogin-1 and MuRF-1 are both involved in the degradation of the proteins that make up the muscle, their overexpression leads to muscle atrophy.
The results of (1) and (2) indicate that muscle atrophy occurred on the sciatic nerve cut side of the mouse due to the resting state of the muscle caused by the sciatic nerve cut.
（３）上記（１）で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織（坐骨神経切断側（Den）及び非切断側（Cont））から、細胞溶解緩衝液（RIPA buffer）を用いて細胞溶解物（lysate）を回収した。細胞溶解物におけるリン酸化Smad2及びリン酸化Smad3 の量と、非リン酸化Smad2及び非リン酸化Smad3 の量とを、ウェスタンブロッティングにより比較した。リン酸化Ｓｍａｄ２の検出には、リン酸化Ｓｍａｄ２に対する抗体（pSmad2/ #3101, Cell Signaling）を使用し、リン酸化Ｓｍａｄ３の検出には、リン酸化Ｓｍａｄ３に対する抗体（pSmad3/ #9520, Cell Signaling）を使用した。また、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の検出には、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３に対する抗体（#3102, Cell Signaling）を使用した。
同内容の実験を２組（#1, #2）で施行した。
結果を図３に示す。なお、beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
図３に示されるように、坐骨神経切断側（すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉）において、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の発現の増加（タンパク質としての量の増加）が認められた。また、リン酸化Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３についても、坐骨神経切断側で発現の増加が認められた。
(3) From the muscle tissue of the gastrocnemius muscle of the mouse treated in the above (1) (sciatic nerve cut side (Den) and non-cut side (Cont)), a cell lysate (lysate) using a cell lysis buffer (RIPA buffer) ) Was recovered. The amount of phosphorylated Smad2 and phosphorylated Smad3 in the cell lysate was compared with the amount of non-phosphorylated Smad2 and non-phosphorylated Smad3 by Western blotting. An antibody against phosphorylated Smad2 (pSmad2 / # 3101, Cell Signaling) is used to detect phosphorylated Smad2, and an antibody against phosphorylated Smad3 (pSmad3 / # 9520, Cell Signaling) is used to detect phosphorylated Smad3 did. For detection of Smad2 and Smad3, antibodies against Smad2 and Smad3 (# 3102, Cell Signaling) were used.
Two experiments (# 1, # 2) were conducted with the same content.
The results are shown in FIG. The expression of beta-actin was used as an internal comparison control.
As shown in FIG. 3, increased expression of Smad2 and Smad3 (increased amount as protein) was observed on the sciatic nerve cut side (that is, muscle undergoing muscular atrophy). In addition, phosphorylated Smad2 and Smad3 were also found to increase in expression on the sciatic nerve cut side.
これらの実験結果は、筋萎縮を起こしている筋肉組織から得られた筋肉細胞においてＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３の量及び活性が上昇していることを示している。
したがって、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇の抑制及び／又はＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性の抑制の有無を指標として、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤をスクリーニングすることができる。
These experimental results indicate that the amount and activity of Smad2 and Smad3 are increased in muscle cells obtained from muscle tissue undergoing muscle atrophy.
Therefore, screening for a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy using as an index the suppression of the increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells and / or the suppression of the activity of Smad2 and / or Smad3. it can.
実施例２：筋萎縮におけるＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３とミオスタチンとの関係
（１）８週齢のミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス (Mstn cKO, Mx Cre/Mstnflox/flox)（５匹）と、コントロールマウス（control, Mstnflox/flox）（５匹）に、polyIpolyCを投与した。なお、polyIpolyCは、Creの発現誘導からミオスタチンを欠損させるために投与した。
投与から３週間後に、各マウスに坐骨神経切断側（denerve）と非切断側（control）とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋は安静状態となった。
切断処置１週間後に、腓腹筋の重量を測定した。ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスについて、坐骨神経切断側の筋肉重量は0.774±0.068ｇ／マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.063ｇ／マウス体重であった。コントロールマウスについて、坐骨神経切断側の筋肉重量は0.756±0.069ｇ／マウス体重であり、非切断側の筋肉重量は1±0.1ｇ／マウス体重であった。各マウスについて、非切断側の筋肉重量を１とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図４に示す。
図４に示されるように、座骨神経切断側における筋肉重量の有意な減少がミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス及びコントロールマウスの双方において見られた。
Example 2: Relationship between Smad2 and Smad3 and myostatin in muscle atrophy (1) 8-week-old myostatin conditional knockout mice (Mstn cKO, Mx Cre / Mstn flox / flox ) (5 mice) and control mice (control, Mstn flox / flox ) (5 mice) was administered with polyIpolyC. PolyIpolyC was administered to delete myostatin from the induction of Cre expression.
Three weeks after the administration, a sciatic nerve cut side (denerve) and a non-cut side (control) were prepared for each mouse. By sciatic nerve cutting, the skeletal muscle on the sciatic nerve cutting side became resting.
One week after the cutting procedure, the weight of the gastrocnemius was measured. For the myostatin conditional knockout mice, the muscle weight on the sciatic nerve cut side was 0.774 ± 0.068 g / mouse body weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.063 g / mouse body weight. For the control mice, the muscle weight on the sciatic nerve cut side was 0.756 ± 0.069 g / mouse body weight, and the muscle weight on the non-cut side was 1 ± 0.1 g / mouse body weight. For each mouse, the relative muscle weight on the sciatic nerve cutting side when the muscle weight on the non-cutting side is 1 is shown in FIG.
As shown in FIG. 4, a significant decrease in muscle weight on the sciatic nerve transection side was seen in both myostatin conditional knockout mice and control mice.
（２）上記（１）で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織（坐骨神経切断側及び非切断側）からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1（いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子）の発現をリアルタイムＰＣＲにより測定した。beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
各マウスについて、非切断側の各遺伝子の発現量を１とした場合の、坐骨神経切断側の各遺伝子の相対発現量を図５に示す。
図５に示されるように、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス及びコントロールマウスの双方において、座骨神経切断側では、Atrogin-1及びMuRF-1（いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子）の発現が有意に上昇していた。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue (sciatic nerve cut side and non-cut side) of the gastrocnemius muscle of the mouse treated in (1) above, followed by reverse transcription, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both constituting the muscle) The expression of genes involved in the degradation of the protein to be determined was measured by real-time PCR. Beta-actin expression was used as an internal comparison control.
FIG. 5 shows the relative expression level of each gene on the sciatic nerve cutting side when the expression level of each gene on the non-cutting side is 1 for each mouse.
As shown in FIG. 5, in both myostatin conditional knockout mice and control mice, expression of Atrogin-1 and MuRF-1 (both genes involved in the degradation of the proteins constituting the muscle) on the sciatic nerve cutting side Was significantly increased.
（３）上記（１）で処置したミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスの腓腹筋の筋肉組織（坐骨神経切断側及び非切断側）から、細胞溶解緩衝液（RIPA buffer）を用いて細胞溶解物（lysate）を回収した。細胞溶解物におけるSmad2及びSmad3の量を、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３に対する抗体(#3102, Cell Signaling)を用い、ウェスタンブロッティングにより比較した。
結果を図６に示す。なお、beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
図６に示されるように、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウスの坐骨神経切断側（すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉）において、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の発現の増加（タンパク質としての量の増加）が認められた。
（１）〜（３）の結果は、ミオスタチンコンディショナルノックアウトマウス（すなわち、ミオスタチンを発現できないマウス）の坐骨神経切断側（すなわち、筋萎縮を起こしている筋肉）において、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の発現の増加が起きたことを示している。これは、筋萎縮におけるＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のタンパク質の量レベルでの増加は、ミオスタチンに依存しないことを示している。
(3) Cell lysate (lysate) from the gastrocnemius muscle tissue (sciatic nerve cut side and non-cut side) of the myostatin conditional knockout mouse treated in (1) above using a cell lysis buffer (RIPA buffer) It was collected. The amounts of Smad2 and Smad3 in the cell lysates were compared by Western blotting using antibodies against Smad2 and Smad3 (# 3102, Cell Signaling).
The results are shown in FIG. The expression of beta-actin was used as an internal comparison control.
As shown in FIG. 6, increased expression of Smad2 and Smad3 (increased amount as protein) was observed on the sciatic nerve cut side of the myostatin conditional knockout mouse (that is, muscle undergoing muscular atrophy). .
The results of (1) to (3) show an increase in the expression of Smad2 and Smad3 on the sciatic nerve cut side (that is, the muscle undergoing muscular atrophy) of the myostatin conditional knockout mouse (that is, the mouse that cannot express myostatin). Shows that happened. This indicates that the increase in protein level of Smad2 and Smad3 in muscle atrophy is independent of myostatin.
実施例３：筋萎縮とＳｍａｄ３との関係Example 3: Relationship between muscle atrophy and Smad3
（１）８週齢のC57/BL6野生型マウス（WT）（５匹）、Ｓｍａｄ３ノックアウトマウス（Smad3 KO）（５匹）、並びに、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３ダブルノックアウトマウス（DKO）（５匹）のそれぞれに、坐骨神経切断側（denerve）と非切断側（control）とを作成した。坐骨神経切断により、坐骨神経切断側の骨格筋は安静状態となった。
切断処置１週間後に、腓腹筋の重量を測定した。
野生型マウス（WT）について、非切断側の筋肉重量を１とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は0.779であった。
Ｓｍａｄ３ノックアウトマウス（Smad3 KO）について、非切断側の筋肉重量を１とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は0.89であった。
Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３ダブルノックアウトマウス（DKO）について、非切断側の筋肉重量を１とした場合の坐骨神経切断側の相対筋肉重量は1.033であった。
非切断側の筋肉重量を１とした場合の、坐骨神経切断側の相対筋肉重量を図７に示す。
図７に示されるように、Ｓｍａｄ３の発現が抑制されていないマウス（WT）では、座骨神経切断側で有意な筋肉重量の減少が見られた。一方、Ｓｍａｄ３の発現を抑制したマウス（Smad3 KO及びDKO）では、座骨神経切断側における統計学的に有意な筋肉重量の減少は見られなかった。
(1) 8-week-old C57 / BL6 wild type mice (WT) (5 mice), Smad3 knockout mice (Smad3 KO) (5 mice), and Smad2 and Smad3 double knockout mice (DKO) (5 mice), respectively In addition, a sciatic nerve cutting side (denerve) and a non-cutting side (control) were prepared. By sciatic nerve cutting, the skeletal muscle on the sciatic nerve cutting side became resting.
One week after the cutting procedure, the weight of the gastrocnemius was measured.
For the wild-type mouse (WT), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side was 0.779 when the muscle weight on the non-cut side was 1.
With respect to the Smad3 knockout mouse (Smad3 KO), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side when the muscle weight on the non-cut side was 1 was 0.89.
For the Smad2 and Smad3 double knockout mice (DKO), the relative muscle weight on the sciatic nerve cut side when the muscle weight on the non-cut side was 1 was 1.033.
FIG. 7 shows the relative muscle weight on the sciatic nerve cutting side when the muscle weight on the non-cutting side is 1.
As shown in FIG. 7, in the mouse (WT) in which the expression of Smad3 was not suppressed, a significant decrease in muscle weight was observed on the sciatic nerve cut side. On the other hand, in mice (Smad3 KO and DKO) in which the expression of Smad3 was suppressed, no statistically significant decrease in muscle weight was observed on the sciatic nerve cut side.
（２）上記（１）で処置したマウスの腓腹筋の筋肉組織（坐骨神経切断側及び非切断側）からRNAを抽出し逆転写した後、Atrogin-1及びMuRF-1（いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子）の発現をリアルタイムＰＣＲにより測定した。beta-actinの発現を内部比較コントロールとして用いた。
非切断側（control）の各遺伝子の発現量を１とした場合の、坐骨神経切断側（denerve）の各遺伝子の相対発現量を図８に示す。
図８に示されるように、Ｓｍａｄ３の発現が抑制されていないマウス（WT）では、座骨神経切断側において、Atrogin-1及びMuRF-1（いずれも、筋肉を構成するタンパク質の分解に関わる遺伝子）の発現が有意に上昇していた。一方、Ｓｍａｄ３の発現を抑制したマウス（Smad3 KO及びDKO）では、座骨神経切断側における統計学的に有意なAtrogin-1及びMuRF-1の上昇は見られなかった。
(2) RNA was extracted from the muscle tissue (sciatic nerve cut side and non-cut side) of the gastrocnemius muscle of the mouse treated in (1) above, followed by reverse transcription, and then Atrogin-1 and MuRF-1 (both constituting the muscle) The expression of genes involved in the degradation of the protein to be determined was measured by real-time PCR. Beta-actin expression was used as an internal comparison control.
FIG. 8 shows the relative expression level of each gene on the sciatic nerve cutting side (denerve) when the expression level of each gene on the non-cutting side (control) is 1.
As shown in FIG. 8, in the mouse (WT) in which the expression of Smad3 is not suppressed, Atrogin-1 and MuRF-1 (both genes involved in the degradation of the protein constituting the muscle) on the sciatic nerve cutting side The expression of was significantly increased. On the other hand, in the mice (Smad3 KO and DKO) in which the expression of Smad3 was suppressed, no statistically significant increase in Atrogin-1 and MuRF-1 was observed on the sciatic nerve cut side.
上記（１）の結果は、筋萎縮にＳｍａｄ３の量及び活性が関与していることを示している。上記（２）の結果は、筋萎縮つながるAtrogin-1及びMuRF-1の発現量増加に、Ｓｍａｄ３の活性が関与していることを示している。
したがって、Ｓｍａｄ３の量の上昇の抑制又はＳｍａｄ３の活性抑制の有無を指標として、筋萎縮の予防剤及び／又は治療剤をスクリーニングすることができる。
The result of (1) above shows that the amount and activity of Smad3 are involved in muscle atrophy. The result of (2) above shows that the activity of Smad3 is involved in increasing the expression levels of Atrogin-1 and MuRF-1 that lead to muscle atrophy.
Therefore, a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy can be screened using as an index the suppression of the increase in the amount of Smad3 or the suppression of the activity of Smad3.
本発明は、筋萎縮を予防又は治療するための医薬品の開発に利用することができる。 The present invention can be used for the development of a medicament for preventing or treating muscle atrophy.
Claims (9)
以下の工程（１）〜（３）：
（１）試験物質と筋肉細胞とを接触させる工程、
（２）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量及び／又は活性を測定する工程、及び、
（３）該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇を抑制する試験物質、及び／又は、該筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。 A method for screening a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy,
The following steps (1) to (3):
(1) a step of bringing a test substance into contact with a muscle cell;
(2) measuring the amount and / or activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cells; and
(3) including a step of selecting a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell and / or a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in the muscle cell. , Screening method.
工程（３）において、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の量の上昇を抑制する試験物質を選択する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。 In step (2), the amount of Smad2 and / or Smad3 is measured,
The screening method according to any one of claims 1 to 3, wherein a test substance that suppresses an increase in the amount of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected in step (3).
工程（３）において、筋肉細胞内のＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の活性を抑制する試験物質を選択する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。 In step (2), the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is measured,
The screening method according to any one of claims 1 to 3, wherein in the step (3), a test substance that suppresses the activity of Smad2 and / or Smad3 in muscle cells is selected.
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