JP6663605B2

JP6663605B2 - 免疫測定用キット及び免疫測定方法

Info

Publication number: JP6663605B2
Application number: JP2015186581A
Authority: JP
Inventors: 秀雄中野; 昭博森; 真悟渕; 晃代加藤
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: JP2017062145A

Description

本発明は、免疫測定用キット及び免疫測定方法に関し、特に、洗浄工程を不要とすることで、短時間で検体中の測定対象物質の有無を検出又は測定対象物質を定量することができる免疫測定用キット及び免疫測定方法に関する。

農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品、化粧品などの製品または原料における菌学的安全性は、常に保証されている必要がある。そのため、製品または原料中の菌学的分析手法を利用した菌検査・定量が日常的に行われている。また、人間や動物等の健康状態を調べるために、血液及び尿等の体液や細胞等の生体組織（以下、「生体サンプル」と記載することがある。）に含まれる種々のアレルギー物質、ウィルス、タンパク質等の検査・定量も日常的に行われている。

製品または原料に含まれる菌検査・定量、生体サンプルの検査・定量方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、イムノクロマト法等の抗原−抗体反応を利用した物質の検査・定量方法が知られている。

ＥＬＩＳＡとは、以下の手順により、検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する方法である（非特許文献１参照）。
（１）マイクロプレート上に固定した１次抗体に抗原を結合させる。
（２）緩衝液を加えて洗浄した後、酵素等により修飾されている２次抗体を抗原に結合させる。
（３）非結合の２次抗体を緩衝液で洗浄・除去後、基質を加えることで２次抗体の酵素により発色する。

また、イムノクロマト法とは、以下の手順により、検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する方法である（非特許文献２参照）。
（１）メンブラン上に滴下された検体中の測定対象物質が、金属コロイド等で標識された抗体と複合体を形成し、毛細管現象によってメンブラン上を移動する。
（２）測定対象物質が存在する時は、検出抗体によって複合体の移動が途中でトラップされ、その呈色を目視によって判断する。

Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５６１（１）３８６−３８８Ｗｏｎ−Ｂｏｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７１７（１０）１６２９−１６３７

しかしながら、ＥＬＩＳＡは、非結合の抗原や２次抗体を洗浄・除去する工程が必要であり、人手や時間がかかるという問題がある。一方、イムノクロマト法は、ＥＬＩＳＡと比較して短時間で検出が可能であるが、感度が低く、夾雑物に弱いという問題がある。

本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので、鋭意研究を行ったところ、（１）発光することができる標識成分で標識した抗体（２次抗体）から発する波長域の光を吸収する化合物を抗原―抗体反応を行う媒体中に添加すると、（２）検体中に測定対象物質が含まれない場合は、媒体中に分散している２次抗体からの発光が化合物に吸収されることで、検出機による発光の検出が抑えられること、（３）一方、検体中に測定対象物質が含まれる場合は抗原−抗体反応により測定対象物質及び２次抗体が複合体を形成し、該複合体を容器の一部に偏在させることで、検体中に測定対象物質が含まれない場合と比較して、検出機による光の検出量を多くできること、（４）そして、媒体中に分散している２次抗体からの発光は化合物に吸収されることから、２次抗体を洗浄・除去する工程が無くても検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量できることから、測定対象物質の検出・定量時間を短縮できること、を新たに見出した。

すなわち、本発明の目的は、短時間で検体中の測定対象物質を検出・定量するための免疫測定用キット及び免疫測定方法を提供することにある。

本発明は以下に示す免疫測定用キット及び免疫測定方法に関する。

（１）発光することができる標識成分で標識した抗体、及び、
前記標識成分が発する波長域の光を吸収する化合物、
を少なくとも含む免疫測定用キット。
（２）前記発光することができる標識成分が酵素である上記（１）に記載の免疫測定用キット。
（３）前記酵素がルシフェラーゼである上記（２）に記載の免疫測定用キット。
（４）前記光を吸収する化合物がブルーデキストランである上記（１）〜（３）の何れか一に記載の免疫測定用キット。
（５）検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定した容器又はビーズを含む上記（１）〜（４）の何れか一に記載の免疫測定用キット。
（６）標識成分が発する波長域の光を、近赤外波長領域の光に変換する材料で形成された変換部を含む容器、又は前記材料で形成された近赤外蛍光ガラス体を含む上記（１）〜（４）の何れか一に記載の免疫測定用キット。
（７）検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する免疫測定方法であって、
検体、前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し且つ発光することができる標識成分で標識した抗体、及び前記標識成分から発する波長域の光を吸収する化合物、を媒体中で混合する工程、
前記標識成分から発した光を測定する工程、
測定した光量から、検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する工程、
を少なくとも含む免疫測定方法。
（８）前記混合する工程が、検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定した容器で行われる上記（７）に記載の免疫測定方法。
（９）前記混合する工程が、媒体中に検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定したビーズを更に含む上記（７）に記載の免疫測定方法。
（１０）前記混合する工程の後に、遠心分離を行う工程を含む上記（７）〜（９）の何れか一に記載の免疫測定方法。

本発明の免疫測定用キット及び免疫測定方法を用いると、２次抗体の洗浄・除去が不要であることから、操作が簡単で且つ短時間で検体中の測定対象物質を検出・定量することができる。したがって、食中毒菌等に汚染された食品等を早期に発見することが可能となる。また、生体サンプルに含まれる種々のタンパク質等の検査・定量も迅速に行うことができる。

図１は、本発明の免疫測定の原理を説明する図で、図（１）は検体中に検出対象物質が含まれる場合、図１（２）は検体中に測定対象物質が含まれない場合の例を示している。図２は、実施例１及び比較例１の測定結果を表すグラフである。図３は、比較例２において、ＳＡビーズ及びＣＡビーズを用いた場合の測定結果を表すグラフである。図４（１）はブルーデキストランの吸収波長域を表し、図４（２）はタートラジンの吸収波長域を表す。図５はオレンジ色Ｌｕｃ及び緑色Ｌｕｃの発光波長域を表す図である。図６は、実施例２及び比較例３の測定結果を表すグラフである。図７は、図面代用写真で、図７（１）は実施例３で作製した台形状の蛍光ガラス、図７（２）は実施例３で作製した容器の写真である。図８は、実施例３及び比較例４の測定結果を表すグラフである。

以下に、本発明の免疫測定用キット及び免疫測定方法について詳しく説明する。図１は、本発明の免疫測定の原理を説明する図である。図１（１）は検体中に検出対象物質が含まれる場合の例を示している。本発明の免疫測定用キットは、少なくとも、発光することができる標識成分１で標識した抗体（２次抗体）２、標識成分１が発する波長域の光を吸収する化合物３を含んでいる。検体中に測定対象物質４が含まれていると、容器５の一部に固定されている測定対象物質４を特異的に認識する抗体（１次抗体）６に測定対象物質４が結合し、更に測定対象物質４に２次抗体２が結合して複合体を形成する。そして、複合体が容器５の壁面に偏在することから２次抗体２が発する光も容器壁面に偏在し、検出機７により２次抗体２が発する光を検出し易くなる。以下、本発明の免疫測定方法を「生物発光色素吸収法」と記載することがある。

一方、図１（２）は検体中に測定対象物質４が含まれない場合の例を示している。測定対象物質４が含まれない場合は、２次抗体２は、測定対象物質４と複合体を形成しないことから、化合物３を含む媒体中に分散した状態となる。２次抗体２が発する光は化合物３に吸収されるので、図１（１）と比較して検出機７により検出され難くなる。

本発明の生物発光色素吸収法では、２次抗体２が発する光を化合物３で吸収することが特徴である。そのため、測定対象物質４と２次抗体２が複合体を形成した場合でも、当該複合体が溶媒中に分散した状態であると２次抗体２が発する光を化合物３が吸収してしまい、検出感度が悪くなる。そのため、測定対象物質４と２次抗体２の複合体が可能な限り容器５の壁面に偏在し、２次抗体２が発する光が化合物３に吸収され難くすることが好ましい。図１（１）に示す例では、容器５の壁面の一部（底面）に１次抗体６を固定することで複合体を容器５の底面付近に偏在させているが、複合体を容器５の壁面の特定部分に偏在できれば、特に制限は無い。

例えば、測定対象物質４が菌体等の媒体に不溶性の物質の場合、容器５として遠心分離機に装着可能な容器を用い、菌体と２次抗体２を結合させて複合体を形成した後、遠心分離により複合体を容器５の底部に偏在させてもよい。その場合、１次抗体６を容器５に固定しなくてもよい。また、１次抗体６を容器５ではなく磁性ビーズ等に固定することで、１次抗体６−測定対象物質４−２次抗体２の複合体を、磁力等を用いて容器５の壁面に引き寄せることで偏在してもよい。更に、１次抗体６をガラスビーズ等の固体物質に固定して、１次抗体６−測定対象物質４−２次抗体２の複合体を、遠心分離機を用いて容器５の底部に偏在してもよい。

標識成分１は、２次抗体２に結合することができ、発光できる成分であれば特に制限は無い。例えば、ルシフェラーゼ（以下、「Ｌｕｃ」と記載することがある。）、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、βグルクロニダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の基質と反応することで発光する酵素；緑色蛍光タンパク質（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）等の基質が無くても発光する蛍光タンパク質；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素：量子ドット（ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ：ＱＤ）と呼ばれる半導体結晶；等が挙げられる。

標識成分１として酵素を用いる場合、当該酵素に特異的な公知の基質を用いて発光すればばよい。例えば、ホタルルシフェラーゼであれば甲虫ルシフェリン、ウミシイタケルシフェラーゼであればセレンテラジン、βガラクトシダーゼであれば１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ類、ＨＲＰであればルミノール系基質等、公知の酵素と基質の組み合わせを用いればよい。

２次抗体２は、測定対象物質４を特異的に認識できるものであれば特に制限は無い。例えば、市販されている抗体、又は、測定対象物質４を用いた公知の抗体製造方法により製造した抗体を用いればよい。標識成分１で標識した抗体（２次抗体）２は、標識成分１と抗体２が結合できれば特に制限はなく、公知の方法で結合すればよい。例えば、標識成分１をビオチン化し、２次抗体２をストレプトアビジン化し、ビオチン−ストレプトアビジン結合により両者を結合すればよい。ビオチン化、ストレプトアビジン化は、市販されている公知のキットを用いて行えばよい。

本発明の化合物３は、標識成分１が発する光の波長域を吸収できるものであれば特に制限は無い。化合物３が吸収できる光の波長域が、標識成分１が発する光の波長域と少なくとも一部が重複していることが好ましく、標識成分１が発する光のピーク波長を含んでいることがより好ましく、標識成分１が発する光の波長域を全て含んでいることが特に好ましい。

化合物３の具体例としては、ブルーデキストラン、ブロムフェノールブルー、アントシアニン等が挙げられる。例えば、ルシフェラーゼは生物種により異なるものの、ホタルルシフェラーゼは約５５６ｎｍ、ウミシイタケルシフェラーゼは約４８０ｎｍがピーク波長を有するので、化合物３としては、ルシフェラーゼの上記波長域の光を収できるブルーデキストランを選択すればよい。なお、化合物３は単独で用いることもできるが、標識成分１が発する光の波長域を単独の化合物３で吸収できない場合は、異なる吸収波長域を持つ化合物３を組み合わせて用いてもよい。

化合物３の濃度は、媒体中に遊離した２次抗体２が発する光を吸収し、検出機７に届き難くするために必要な量であればよい。媒体中の標識成分１の濃度にもよるが、例えば、ＡＢＳに換算して２以上が好ましく、２．５以上がより好ましく、３以上が特に好ましい。化合物３の濃度が薄すぎると、媒体中に遊離している２次抗体２が発する光が検出機に届くので好ましくない。一方、化合物３の濃度の上限は特になく、媒体中に溶解可能な範囲とすればよい。

本発明の生物発光色素吸収法により測定できる測定対象物質４としては、測定対象物質４を抗原として、抗原―抗体反応できるものであれば特に制限は無い。例えば、食品等に含まれる菌を検出する場合、細菌、真菌及び放線菌等が挙げられる。

細菌としては、グラム陽性細菌やグラム陰性細菌がある。グラム陽性細菌としては、腸球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス属、パエニバチルス属、乳酸桿菌属、リステリア属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属などに属する細菌等が挙げられる。グラム陰性細菌としては、シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属、ブレブンディモナス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、フゾバクテリウム属、プレボテラ属、ブランハメラ亜属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、ブルセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、レジオネラ属などに属する細菌等が挙げられる。

真菌としては、酵母、カビ（糸状菌）、キノコを挙げることができ、具体的には、カンジダ属、クリプトコックス属、ノカルジア属、アオカビ属、アルタナリア属、ロドトルラ属、アスペルギルス属、フザリウム属、サッカロミセス属、トリコスポロン属などに属する菌が挙げられる。放線菌の例としては、ストレプトマイセス属、フランキア属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アクチノマイセズ属などに属する菌が挙げられる。

本発明の方法では、ＥＬＩＳＡ等の従来の測定方法と比較して簡単且つ短時間で測定することが可能であることから、特定の病原性細菌を検出する際に特に有用である。病原性細菌の具体例としては、サルモネラ菌、リステリア菌、病原性大腸菌、Ｏ１５７等に代表される腸管出血性大腸菌、腸炎ビブリオ、チフス菌、パラチフス菌、コレラ菌、赤痢菌、セレウス菌、カンピロバクター菌、ボツリヌス菌、黄色ブドウ球菌などが挙げられる。

上記の測定対象物質４を含む検体としては、農畜産物、食品、食品添加物、飲料、医薬品、医薬部外品、化粧品、水（例えば飲料水、非飲料水及び廃水）、海水バラスト、空気、土壌、汚水、血液製剤（例えば血小板、血清、血漿、白血球分画等）等が挙げられる。

また、生体サンプルを検体とした場合の測定対象物質４としては、花粉、ダニ等のアレルギー物質；ＨＩＶ、肝炎等のウィルス；ＰＳＡ等の癌マーカー；各種タンパク質；等が挙げられる。

検体、２次抗体２、化合物３を混合するための媒体としては、従来から免疫測定で用いられている媒体であれば特に制限は無く、例えば、リン酸バッファー等が挙げられる。

容器５は、免疫測定に使用できる容器であれば特に制限は無いが、本発明では容器５を通過する光を検出する。そのため、検出感度を上げるためには標識成分１が発する光の透過性が高い透明な材料で容器を作製することが好ましい。測定対象物質４を捕捉する為の１次抗体６を容器５に固定しない場合は、エッペンドルフチューブ等、遠心分離機に装着し遠心分離できる容器が好ましい。一方、１次抗体６を用いる場合は、容器５は特に制限は無く、９６ウェルプレート等、免疫測定の分野で使用されている一般的な容器を用いればよい。

なお、本発明では、標識成分１が発する光をそのまま検出機７で検出してもよいが、標識成分１から発する光の波長域を近赤外波長領域、例えば、８５０〜１７００ｎｍ程度に変換部で変換し、当該波長域を検出できる検出機７を用いてもよい。変換部を構成する部材としては、例えば、Ｙｂイオン、Ｎｄイオン、Ｔｍイオン、Ｓｍイオン、Ｈｏイオン、Ｅｒイオン、Ｄｙイオン、Ｐｒイオン等の希土類イオンを、硼酸系ガラス、ゲルマン酸系ガラス、リン酸系ガラス、フッ化物ガラス等に添加したガラス等が挙げられる。具体的には、Ｂｉ₂Ｏ₃−Ｂ₂Ｏ₃系ガラス、Ｂｉ₂Ｏ₃−ＧｅＯ₂系ガラス、ＺｎＯ−Ｂ₂Ｏ₃系ガラス、ＣａＯ−Ｂ₂Ｏ₃系ガラス及びＣａＯ−Ｐ₂Ｏ₅系等の公知のガラスが挙げられる。

可視光の波長領域を検出する場合と異なり、標識成分１から発する光の波長領域を近赤外波長領域に変換する場合、容器５は透明である必要はない。したがって、容器５は不透明な材料で形成してもよく、容器５を作製する材料の選択範囲を広くすることができる。光の波長領域を変える場合は、上記成分で作製した近赤外蛍光ガラス体に１次抗体６を固定して、媒体中に添加すればよい。近赤外蛍光ガラス体は１次抗体６−測定対象物質４−２次抗体２と複合体を形成することから、標識成分１が発する光を近赤外蛍光ガラス体で近赤外波長領域に変換することができ、容器５を通過した近赤外波長領域の光を検出機で検出すればよい。

近赤外蛍光ガラス体を用いた場合は、容器５全体を不透明な材料で作製することができるが、容器５の一部に上記成分で作製した変換部（近赤外蛍光ガラス体）を組み込んでもよい。変換部に一次抗体６を固定しておくことで、変換部及び／又は変換部周辺の容器５を通して、近赤外波長領域の光を検出機７で検出することができる。

１次抗体６は、２次抗体２と同様、測定対象物質４を特異的に認識して結合できるものであれば特に制限は無く、市販されている抗体、又は、測定対象物質４を用いた公知の抗体製造方法により製造した抗体を用いればよい。なお、上記のとおり１次抗体６を用いることは必須ではないが、用いる場合は、容器５の壁面に公知の方法で固定すればよい。また、容器５に変え、免疫測定分野で従来より使用されている磁性ビーズ、ガラスビーズ等に固定してもよい。

検出機７は、標識成分１から発する光が可視光の場合は可視光領域の波長に感度がある検出機であれば特に制限は無く、例えば、Ｓｉ系のＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラ等が挙げられる。また、近赤外光領域に変換して検出する場合には、例えば、８５０〜１７００ｎｍ程度の波長に感度があり、且つ８５０ｎｍ以下の波長には感度がないものが好ましく、例えば、ＩｎＧａＡｓカメラ、ゲルマニウムカメラ、ビジコンカメラ等が挙げられる。また、検出機７には、標識成分１が発する波長域以外の波長域の光を除去するためのフィルターを設けることで周囲のノイズを除去し、検出感度を高めてもよい。

本発明の免疫測定方法は、必要に応じて１次抗体を固定した容器５に、検体、標識成分１で標識した２次抗体２、標識成分１が発する光の波長域の光を吸収する化合物３を媒体中で混合する工程、標識成分１から発光した光を検出機７で測定する工程を少なくとも含んでいる。なお、標識成分１が酵素の場合は、当該酵素に特異的な基質を媒体中に添加しておけばよい。また、１次抗体６を容器５に固定した場合、又は、１次抗体６を固定したビーズを容器５に入れる場合は、遠心分離工程は必要に応じて実施すればよいが、１次抗体６を用いない場合は、測定する工程の前に、遠心分離をする工程を設けることが好ましい。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

＜ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の作製＞
本発明の実施例で用いるオレンジ色Ｌｕｃと緑色Ｌｕｃを以下の手順で作製した。
１．オレンジ色Ｌｕｃ
（１）発現に用いるＬｕｃのＤＮＡ配列の決定
ＮＣＢＩのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｅ０５４４７．１）から、Ｌｕｃのアミノ酸配列を取得し、以下の２つの変異を加えた配列を設計した。
・２１７番目：Ｔｈｒ→Ｉｌｅ
なお、当該変異は耐熱性向上が目的である（“Ｋａｊｉｙａｍａｅｔａｌ．，“ＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｂｙａＳｉｎｇｌｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｔＰｏｓｉｔｉｏｎ２１７”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２，１３７９５−１３７９９、参照）。
・２５７番目：Ｔｙｒ→Ａｒｇ
なお、当該変異はＬｕｃの色を、緑からオレンジ色に変えるのが目的である（ＹｕＷａｎｇｅｔａｌ．，”ＩｍｐａｃｔｏｆＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｎｔＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｏｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＧｒｅｅｎａｎｄＯｒａｎｇｅ／ＲｅｄＥｍｉｓｓｉｏｎＩｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓｉｎＦｉｒｅｆｌｙＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”，ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＲＥＰＯＲＴ，２０１３、参照）。
次に、決定したアミノ酸配列をＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／）よって、大腸菌に発現させるのに最適なＤＮＡ配列に変換した。
次に、５’末端側にＨｉｓｔａｇ及び制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、３’末端にＸｂａＩの認識配列を付加した。

（２）ＤＮＡ配列の合成
ＩＤＴ社のＤＮＡ合成サービス（ｈｔｔｐ：／／ｒｕｏ．ｍｂｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｕｓｔｏｍ／ｃｕｓｔｏｍ＿ｇｅｎｅ．ｈｔｍｌ）により、上記（１）で配列決定したＤＮＡの合成を行った。

（３）オレンジ色Ｌｕｃ遺伝子の発現ベクターへのクローニング
制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｂａＩ（いずれもＴａｋａｒａｂｉｏ社製）により、ＬｕｃのＤＮＡ配列及び低温発現ベクターｐＣｏｌｄＩ（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社製）を処理した。次に、ＴａｋａｒａＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ２を用いて、２つのＤＮＡ断片を結合し、大腸菌ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製ＤＮＡ−９０１）に形質転換後、発生したコロニーを培養してプラスミドを抽出した。次に、シーケンス解析により狙い通り発現ベクターにＬｕｃの遺伝子が導入されているのを確認した。

（４）オレンジ色Ｌｕｃの発現、精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製（現メルクミリポア社製）、６９４５０−３ＣＮ）に、上記（３）で配列を確認したプラスミドを導入した。次に、セルを２００ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で対数増殖期まで培養し、１６℃で３０ｍｉｎ静置後、終濃度１ＭになるようにＩＰＴＧ（Ｗａｋｏ製）を加えた。更に、２４時間培養後、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使って、Ｈｉｓｔａｇ精製を行った。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、Ｌｕｃが含まれる画分を回収した。次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析することで、オレンジ色Ｌｕｃを得た。

２．緑色Ｌｕｃ
（１）緑色Ｌｕｃの配列の作製
上記「１．オレンジ色Ｌｕｃ」に記載の（３）で合成したＤＮＡをＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ法を用いて、２５７番目のＡｒｇをＴｙｒに変換した。

（２）緑色Ｌｕｃの作製
以下の２つのＰＣＲプライマーを用いて、ｐＣｏｌｄｏｒａｎｇｅＬｕｃを鋳型として、２５７番目のＡｒｇがＴｙｒに変換したプラスミドを合成した。増幅は、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ（アジレントテクノロジー社製）を用い、以下の条件で実施した。
・２５７ｔｈＲＬｕｃＹｆｏｒＱＣＦ：
ＧＧＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣ（配列番号１）
・２５７ｔｈＲＬｕｃＹｆｏｒＱＣＲ：
ＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＧＣＣ（配列番号２）
増幅条件：９５℃で２分→（９５℃で１０秒→５５℃で１５秒→７２℃で６分）×２０回→７２℃で２０分→１６℃

次に、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社製）を加えて鋳型を分解した。そして、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した後は、上記１．（４）と同様の手順で、緑色Ｌｕｃの発現、精製を行った。

［モデル系による生物発光色素吸収法の実証］
＜実施例１＞
ビオチンとストレプトアビジンは自然界で最も強固に結合することが知られており、様々な生物化学の研究において用いられている。この結合を利用して、生物発光色素吸収法のモデル系を構築し、本発明の免疫測定方法の実証を行った。
上記の手順で作製した緑色Ｌｕｃを、同人化学研究所製Ｂｉｏｔｉｎｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ−ＮＨ２を用いてビオチン化した。
次に、ＰＣＲチューブ（ＢＭ機器株式会社製ＰＣＲ−０２Ｆ２）に、
・緑色ビオチン化Ｌｕｃを１０ｎｇ、
・ビオチンと結合するストレプトアビジンが固定されたＳＡビーズ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２７０ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を６−７×１０⁶ｂｅａｄｓ、
・ブルーデキストラン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社製１７−０３６０−０１）、
・Ｌｕｃの基質が含まれている定量試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ＯｎｅＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ）を１００μＬ、
加え、更に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて合計２００μＬとすることで反応系を作製した。なお、ブルーデキストランは、反応系中の濃度が１．０ｗｔ％となるように添加した。反応系をピペッティングによって混合後、磁石上に１０秒間静置し、浜松ホトニクス社製Ｈ７３６０−０１を用いて３０秒間測定した。なお、株式会社島津製作所製紫外可視分光光度計ＵＶ２４５０を用いて混合時の反応系のＡＢＳを測定した値は、６．９８（トップピーク）であった。

＜比較例１＞
実施例１のＳＡビーズの代わりに、ネガティブコントロールとしてビオチンと結合しないＣＡビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２７０ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）を用いた以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。

図２は、実施例１及び比較例１の測定結果を表すグラフである。ＳＡビーズを用いた実施例１は、ネガティブコントロールであるＣＡビーズを用いた比較例１より、有意に高いシグナルを得ることができた。これは、比較例１ではＬｕｃの発光がブルーデキストランに吸収されたのに対して、実施例１ではビオチン−ストレプトアビジン相互作用によってビオチン化Ｌｕｃと結合したビーズが、磁石により容器底部に偏在したため、より多くのルシフェラーゼの発光が検出機により検出されたためと考えられる。

［標識成分から発光する波長域と光を吸収する化合物の関係］
＜比較例２＞
実施例１（ＳＡビーズ）のブルーデキストランに代え、ＡＢＳのピークが同じとなるようにタートラジン（Ｗａｋｏ社製２０４−００１０２）を添加（５．５４×１０^-3ｗｔ％）した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。また、比較例１（ＣＡビーズ）についても、上記と同様の手順でタートラジンに変えた実験を行った。

図３は、ＳＡビーズ及びＣＡビーズを用いた場合の測定結果を表すグラフである。化合物として実施例１及び比較例１のブルーデキストランに代え、タートラジンを用いた場合、ＳＡビーズとＣＡビーズで大きな差は無く、且つ、ｐｈｏｔｏｎｃｏｕｎｔｓ／ｓの値も実施例１及び比較例１より高かった。これは、ＣＡビーズを用いた場合、ビオチン化Ｌｕｃは遊離しているものの、タートラジンでほとんど吸収されなかった為と考えられる。なお、ＳＡビーズを用いたものの方が若干高い値が得られたが、これはＳＡビーズと結合したビオチン化Ｌｕｃが容器底部に集まっていることに起因するものと考えられる。

次に、Ｌｕｃの発光波長域と、光を吸収する化合物であるブルーデキストラン及びタートラジンの吸収波長域の関係を調べる実験を行った。

＜光を吸収する化合物の吸収波長域の測定＞
ブルーデキストラン（ＰＢＳで濃度を０．１ｗｔ％となるように調整）及びタートラジン（ＰＢＳで濃度を０．１×１０^-2ｗｔ％となるように調整）の吸収波長域を、株式会社島津製作所製紫外可視分光光度計ＵＶ２４５０を用いて測定した。図４（１）はブルーデキストランの吸収波長域を表し、図４（２）はタートラジンの吸収波長域を表す。ブルーデキストランの吸収波長域は約４５０〜７５０ｎｍで吸収のピークは６１７ｎｍ、タートラジンの吸収波長域は約３００〜５００ｎｍで吸収のピークは４２６ｎｍであった。

＜Ｌｕｃの発光波長域の測定＞
オレンジ色Ｌｕｃを含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）１００μＬ（Ｌｕｃ濃度：１０μｇ／ｍＬ）及びＯｎｅＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ１００μＬを混合し、日本分光株式会社製ＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒＦＰ−８５００を用いて発光波長域の測定を行った。緑色Ｌｕｃについても同様の手順で測定を行った。

図５はオレンジ色Ｌｕｃ及び緑色Ｌｕｃの発光波長域を表す図である。オレンジ色Ｌｕｃの発光波長域は約５００〜６５０ｎｍで発光のピークは約５７５ｎｍ、緑色Ｌｕｃの発光波長域は約４８０〜６３０ｎｍで発光のピークは約５４５ｎｍであった。上記の測定結果より、実施例１及び比較例１において、緑色Ｌｕｃの発光波長域（約４８０〜６３０ｎｍ）はブルーデキストランの吸収波長域（約４５０〜７５０ｎｍ）に含まれていた。一方、比較例２において、緑色Ｌｕｃの発光波長域（約４８０〜６３０ｎｍ）は、タートラジンの吸収波長域（約３００〜５００ｎｍ）とはほぼ異なっていた。以上の結果より、本発明の生物発光色素吸収法では、抗原−抗体反応する媒体中に加える化合物が吸収する光の波長領域が、標識成分１が発する光の波長域と少なくとも一部が重複、より好ましくは標識成分１が発する光の波長域を含むと、反応しなかった２次抗体２の標識成分１から発する光を効率的に吸収できることが明らかとなった。

［生物発光色素吸収法による菌の検出］
上記実施例１により、本発明の生物発光色素吸収法の有用性が確認できたことから、大腸菌を用いた検出を行った。

＜実施例２＞
１μｇ／ｍＬの緑色ビオチン化Ｌｕｃを２０μＬ、ストレプトアビジン化ａｎｔｉＯ１５７抗体を５μＬ、４×１０⁵ｃｅｌｌｓ（１ＯＤ６００／ｍＬ＝８×１０⁸で換算）を含む菌液５μＬ、を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに加えてピペッティングにより混合し、３０ｍｉｎローテーターで混合した。緑色ビオチン化Ｌｕｃとストレプトアビジン化ａｎｔｉＯ１５７抗体は、ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用によって結合し、抗体−Ｌｕｃ複合体となる。ストレプトアビジン化ａｎｔｉＯ１５７抗体は、ＫＰＬ社製ＡｆｆｉｎｉｔｙＰｕｒｉｆｉｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙＴｏＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ＢａｃＴｒａｃｅＡｎｔｉｂｏｄｙを、Ａｂｃａｍ社製Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｋｉｔによってストレプトアビジン化することで作製した。続いて、ＯｎｅＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ４０μＬ、ブルーデキストラン、更にＰＢＳを加え、合計２００μＬの反応系を作製した。なお、反応系中のブルーデキストランの濃度は１．６２５ｗｔ％となるように添加した。ピペッティングにより混合し、遠心分離機により２０，８１７×ｇでＦｌａｓｈｉｎｇ後、浜松ホトニクス社製Ｈ７３６０−０１を用いて３０秒間測定した。

＜比較例３＞
菌体を加えなかった以外は、実施例２と同様の手順で実験を行った。

図６は、実施例２及び比較例３の測定結果を表すグラフである。菌を添加しなかった比較例３では、シグナルが４６４ｃｏｕｎｔｓ／ｓだったのに対し、菌を添加した実施例２では、２１８９ｃｏｕｎｔｓ／ｓのシグナルを検出することができた。以上の結果から、本発明の生物発光色素吸収法を用いることで、従来のＥＬＩＳＡと異なり、結合しなかった抗原、抗体等の洗浄工程を要せず、簡単且つ短時間で検体中の測定対象物質を測定できることを確認した。

次に、生物発光色素吸収法の実施形態として、ルシフェラーゼの光を蛍光ガラスによって他の波長に変換した上で計測できるか確認を行った。
＜実施例３＞
蛍光ガラスを組み込んだ容器に、４００μｇ／ｍＬの緑色ビオチン化Ｌｕｃを１μＬ、実施例２で作製したストレプトアビジン化ａｎｔｉＯ１５７抗体を５μＬ、８×１０⁵ｃｅｌｌｓ（１ＯＤ６００／ｍＬ＝８×１０⁸で換算）を含む菌液を１０μＬ、加えてピペッティングにより撹拌し、３０ｍｉｎローテーターで混合した。続いて、ＯｎｅＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ３６μＬ、ブルーデキストラン、更にＰＢＳを加え、合計２００μＬの反応系を作製した、なお、反応系中のブルーデキストランの濃度１．８ｗｔ％となるように添加した。ピペッティングにより混合し、３，０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、浜松ホトニクス社製近赤外光電子増倍管Ｈ１０３３０Ｂ−４５を用いて３０秒間測定した。

なお、蛍光ガラスを組み込んだ容器は、次の手順で作製した。（１）先ず、４９．５ｍｏｌ％Ｂｉ₂Ｏ₃粉末（関東化学社製素材研究用試薬）、Ｂ₂Ｏ₃換算で４９．５ｍｏｌ％となる量のＨ₃ＢＯ₃粉末（ナカライテスク社製特級試薬）、１ｍｏｌ％Ｓｂ₂Ｏ₃粉末（和光純薬工業株式会社製試薬）を母体としたガラス原料、並びに、３ｍｏｌ％Ｙｂ₂Ｏ₃粉末（関東化学社製素材研究用試薬）及び１ｍｏｌ％Ｎｄ₂Ｏ₃粉末（関東化学社製素材研究用試薬）をチャック袋の中で混合し、蛍光ガラスの原料である混合粉末を調整した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気化、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた。続いて、ステンレス鋳型に溶融物（融液）を流し出して、室温（約２０℃）で空冷させて、台形状の蛍光ガラス（変換部）を作製した。図７（１）は作製した蛍光ガラスの写真である。
次に、３Ｄプリンター（ＳｔｒａｔａｓｙｓＯＢＪＥＴ３０Ｐｒｏ）を使用し、樹脂としてＯＢＪＥＴＶｅｌｏｃｌｅａｒＲＧＤ８１０（Ｓｔｒａｔａｓｙｓ社製）を用いて、図７（２）に示す形状の容器を作製した。容器の筒状部分の内径（Ｌ）は６ｍｍ、筒状部分の高さ（Ｈ）は１１ｍｍであった。次いで、作製した容器の底面の内径部分に、図７（１）に示す台形状のガラス組成物を嵌めこんだ。

＜比較例４＞
菌体を加えなかった以外は、実施例３と同様の手順で実験を行った。

図８は、実施例３及び比較例４の測定結果を表すグラフである。菌を添加しなかった比較例４では、シグナルが６０ｃｏｕｎｔｓ／ｓであったのに対し、菌を添加した実施例３では、２５３ｃｏｕｎｔｓ／ｓのシグナルを検出することができ、有意な差が見られた。以上の結果から、本発明の生物発光色素吸収法は、標識成分１からの発光を直接検出するのみでなく、標識成分１が発する光を他の波長域に変換して測定できることを確認した。

本発明の免疫測定用キット及び免疫測定方法を用いると、簡単且つ短時間で検体中の測定対象物質を検出・測定することができる。したがって、食中毒菌等に汚染された食品等の検査、医療機関等での検査・定量に有用である。

Claims

発光することができる標識成分で標識した抗体、
前記標識成分が発する波長域の光を吸収する化合物、および、
標識成分が発する波長域の光を、近赤外波長領域の光に変換する材料で形成された変換部を含む容器、又は前記材料で形成された近赤外蛍光ガラス体
を少なくとも含む免疫測定用キット。
前記発光することができる標識成分が酵素である請求項１に記載の免疫測定用キット。
前記酵素がルシフェラーゼである請求項２に記載の免疫測定用キット。
前記光を吸収する化合物がブルーデキストランである請求項１〜３の何れか一項に記載の免疫測定用キット。
検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定した容器又はビーズを含む請求項１〜４の何れか一項に記載の免疫測定用キット。
検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する免疫測定方法であって、
検体、前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し且つ発光することができる標識成分で標識した抗体、及び前記標識成分から発する波長域の光を吸収する化合物、を媒体中で混合する工程、
前記標識成分から発した光を測定する工程、
測定した光量から、検体中の測定対象物質の有無を検出、又は測定対象物質を定量する工程、
を少なくとも含み、
前記標識成分から発した光を測定する工程が、
標識成分が発する波長域の光を、近赤外波長領域の光に変換する材料で形成された変換部を含む容器、又は前記材料で形成された近赤外蛍光ガラス体を通過した光を測定する、
免疫測定方法。
前記混合する工程が、検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定した容器で行われる請求項６に記載の免疫測定方法。
前記混合する工程が、媒体中に検体中の測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定したビーズを更に含む請求項６に記載の免疫測定方法。
前記混合する工程の後に、遠心分離を行う工程を含む請求項６〜８の何れか一項に記載の免疫測定方法。