JP6656635B2

JP6656635B2 - ソノポレーション用超音波送信装置

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Publication number: JP6656635B2
Application number: JP2015093764A
Authority: JP
Inventors: 丸山　一雄; 一雄丸山; 鈴木　亮; 亮鈴木; 大樹小俣; 望月　剛; 剛望月
Original assignee: Teikyo Univ
Current assignee: Teikyo Univ
Priority date: 2015-05-01
Filing date: 2015-05-01
Publication date: 2020-03-04
Anticipated expiration: 2035-05-01
Also published as: JP2016208887A

Description

本発明は、ソノポレーションを発生させるための超音波を送信するソノポレーション用超音波送信装置に関する。

従来、医療あるいは植物の品種改良などを目的として、生体細胞内に様々な導入物質（例えば、遺伝子、薬剤、あるいはタンパク質などの活性化物質）を導入することが行われている。生体細胞内に導入物質を導入する方法としては様々な方法が提案されているが、それらの中で、比較的に容易に、かつ安全に実施できるという理由で、超音波を用いる方法であるソノポレーションが注目されている。

人工的に作製されターゲット生体組織周囲に注入されたバブル（マイクロバブル）、あるいは、キャビテーション現象によりターゲット生体組織周囲において誘発されたバブルに対して超音波が送信されると、当該バブルにおいて体積振動が生じる。バブルに送信する超音波の音圧（振幅）をある程度大きくすると、バブルの体積振動量が限界を超え、バブルが圧壊する。バブルが圧壊すると、その周囲の１方向に向かって衝撃波あるいはマイクロストリームと呼ばれる液体の急激な流れが生じる。これら衝撃波又はマイクロストリームがバブル近傍に位置する生体細胞の細胞壁又は細胞膜に微細な孔を生じさせる。細胞の外殻に生じた孔から細胞周囲又はバブル内に存在していた導入物質が細胞内へ導入される。以上の一連の現象がソノポレーションと呼ばれている。

バブルに対する超音波の送信条件に応じて、生体細胞内への導入物質の導入効率（導入物質の効果が発現した生体細胞の割合）が変動することが知れられている。例えば、特許文献１には、生体細胞への導入物質の導入効率を向上させるために、送信休止期間を交えて超音波を送信することが開示されている。また、非特許文献１には、送信停止期間を交えて超音波を送信することで、送信停止期間を設けなかった場合に比べ、導入効率及び細胞生存率が向上することが開示されている。具体的には、非特許文献１には、３０秒間超音波を連続送信し、その後３００秒間送信停止し、その後再度３０秒間連続送信するシーケンスが開示されている。

特開２００８−１７８５９０号公報

Dong-Ping Guo, et al. "Ultrasound-targeted microbubble destruction improves the low density lipoprotein receptor gene expression in HepG2 cells." Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.343, pp.470-474, 2006

バブルに対して超音波を送信すれば、当該バブル近傍に位置する生体細胞にも超音波が照射されることになる。バブルを圧壊し得る程の音圧を有する超音波は、生体細胞に対して少なからずの音響エネルギ（これは超音波の音圧の２乗値を送信時間積分した値に比例する）を与える。生体細胞は超音波から大きな音響エネルギを受けることによってダメージを受け得る。生体細胞は、このようなダメージにより死滅することさえあると考えられる。

ソノポレーション実施後において、生体細胞が引き続き生存し、かつ、生体細胞が目的の働きを達成できることが重要である。ソノポレーションの実施により生体細胞が損傷を受けて正常な働きを失ったり、あるいは活動を止めてしまったりしてはソノポレーションを実施する意味がない。したがって、ソノポレーションの実施にあたっては、生体細胞へ与えるダメージを低減させながら、生体細胞内へ導入物質を導入することが重要になる。

本発明の目的は、ソノポレーションの実施にあたり、生体細胞へ与えるダメージを低減させることにある。あるいは、本発明の目的は、ソノポレーションの実施にあたり、生体細胞へ与えるダメージを低減させつつ、生体細胞内への導入物質の導入効率を向上させることにある。

本発明に係る超音波送信装置は、ターゲット生体細胞の周囲に存在するバブルに対してソノポレーション用の超音波を送信する超音波発生部と、前記超音波を規定する送信シーケンスを生成するシーケンス生成部と、を備え、前記送信シーケンスは、時間軸方向に並んだ複数の送信期間、及び、隣り合う２つの前記送信期間の間の期間であって前記超音波の送信を停止させる停止期間を含み、前記各送信期間は、前記時間軸方向に並んだ複数のパルス波期間、及び、隣り合う２つのパルス波期間の間の期間であって前記超音波の送信を小休止させる小休止期間を含み、前記各パルス波期間において前記バブルに対して前記超音波が送信され、周波数に対する体積振動量を表す前記バブルの振動応答特性において、前記体積振動量が最大振動量を示す共振周波数より低い周波数領域における単位周波数当たりの前記体積振動量の変化量よりも、前記共振周波数より高い周波数領域における単位周波数当たりの前記体積振動量の変化量が大きいことに応じて、前記超音波が有する前記超音波の中心周波数を中心とする周波数帯における信号成分の前記バブルの振動への寄与量が大きくなるように、前記超音波の中心周波数が、前記バブルの前記共振周波数の近傍の周波数であって、前記バブルの前記共振周波数よりも低い周波数に設定される、ことを特徴とする。望ましくは、前記停止期間は前記小休止期間よりも長い期間である。

上記構成によれば、巨視的に見ると、送信期間においてソノポレーション用の超音波が送信され、その後の停止期間において超音波の送信が停止され、次の送信期間において再度超音波が送信されるというシーケンスが形成される。個々の送信期間内を微視的に見ると、送信期間全部において連続してソノポレーション用の超音波が送信されるわけではなく、パルス波期間においてのみ超音波が送信され、小休止期間においては超音波の送信が停止される。つまり、送信期間内において間欠的に超音波が送信されることになる。

超音波は、ある程度の音圧を有していればバブルを圧壊することができる。ソノポレーション用の超音波がバブルを圧壊し得る程度の音圧を有していることを前提とすれば、バブルの圧壊は確率現象であり、圧壊に至るまでの超音波の送信期間はバブルによって区々である。しかし、ある一定の期間超音波を連続送信すれば、十分な確率においてバブルを圧壊できる。つまり、バブルを圧壊させるには当該一定の期間のみ連続して超音波を送信すれば足り、それ以上の連続送信は生体細胞に余分なダメージを与えることになり得る。したがって、本送信シーケンスにおいては、送信期間においてソノポレーション用の超音波を間欠的に送信させる、つまり超音波を連続送信する時間を短くすることで、音響エネルギを時間的に集約し、バブルを十分に圧壊させつつ、生体細胞へ与えるダメージを低減させている。

望ましくは、前記パルス波期間は、複数のバブルが凝集したクラウドを形成するための、前記クラウドを形成し得る音圧を有するクラウド形成用超音波が送信されるクラウド形成期間、及び、前記クラウド形成期間に後続する期間であって、前記クラウドに含まれる複数のバブルを圧壊させるための、前記クラウド形成用超音波の音圧よりも大きい音圧であって、前記クラウドに含まれる複数のバブルを圧壊し得る音圧を有するクラウド圧壊用超音波を送信するクラウド圧壊期間を含む。

例えばバブルを圧壊させない程度の音圧の超音波がバブルに送信されると、バブルは圧壊しないまでも体積振動する。これによりバブルから超音波が放出される。複数のバブルが放出した複数の超音波が互いに干渉し合うことにより、複数のバブル間には、secondary Bjerknes forceと呼ばれる引力あるいは斥力が生じる。このsecondary Bjerknes forceにより、複数のバブルは凝集しクラウドと呼ばれる複数のバブルの凝集体が形成される。

パルス波期間のうち、クラウド形成期間においてクラウド形成用超音波をバブルに送信することで、複数のバブルを凝集させてクラウドを形成させる。その後、クラウド圧壊期間においてクラウド圧壊用超音波を送信することにより、形成されたクラウドに含まれる複数のバブルを一気に圧壊する。クラウドに含まれる複数のバブルを一気に圧壊させることで、個々のバブルが単独で圧壊するときよりも、より強い衝撃波、あるいはより強いマイクロストリームを生じさせることができる。これにより、細胞膜により大きな孔を開けることができ、導入効率を向上させることができる。上記処理をパルス波期間内において実行することで、生体細胞へ与えるダメージを低減させつつ、導入効率を向上させることができる。

望ましくは、前記クラウド圧壊用超音波は、前記クラウドの共振周波数に基づいて設定される周波数を有する。

形成されたクラウドに含まれる複数のバブルをより好適に圧壊させるためには、クラウドに含まれる複数のバブルをより大きく振動させる必要がある。クラウドはバブルの凝集体であるため、バブル単体に比して体積が大きくなっている。このために、クラウドの共振周波数はバブル単体の共振周波数よりも低くなる。したがって、形成されたクラウドの共振周波数に基づいてクラウド圧壊用超音波の周波数を定めることで、クラウドに含まれる複数のマイクロバブルをより好適に振動させて圧壊させることができる。

本発明によれば、ソノポレーションの実施にあたり、生体細胞へ与えるダメージを低減させることができる。あるいは、本発明によれば、ソノポレーションの実施にあたり、生体細胞へ与えるダメージを低減させつつ、生体細胞内への導入物質の導入効率を向上させることができる。

本実施形態に係る超音波送信装置の構成概略図である。容器にマイクロバブルが注入され、マイクロバブルに対して超音波が送信される様子を示す概念図である。ソノポレーションの様子を示す概念図である。送信シーケンス全体を示す図である。送信シーケンスのうち、送信期間の詳細を示す図である。異なる音圧の超音波が有する音響エネルギの比較を示す図である。超音波の周波数特性とマイクロバブルの振動応答特性の関係を示すグラフである。クラウド形成期間及びクラウド圧壊期間におけるパルス波の第１の例を示す図である。クラウド形成期間及びクラウド圧壊期間におけるパルス波の第２の例を示す図である。

以下、本実施形態に係る超音波送信装置について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

図１には、本実施形態に係るソノポレーション用超音波送信装置１０の構成概略図が示されている。

超音波発生器１２は、電圧が加えられると歪みを生じる圧電素子を含んで構成される。圧電素子は、送信回路１４から供給される電圧信号であるパルス波により振動させられ、それにより超音波１８を生じさせる。超音波発生器１２は、送信回路１４からのパルス波の特性（電圧、周波数など）に応じた特性の超音波１８を生じさせる。

後述のように、超音波発生器１２が生じさせた超音波１８は、例えばシャーレなどの容器２０内に収容されているターゲット生体組織においてソノポレーションを生じさせるために、容器２０に対して送信される。つまり、超音波１８はソノポレーション用超音波である。なお、本実施形態においては、ソノポレーション用超音波送信装置１０は、in vitroにおいてソノポレーションを生じさせるが、本実施形態はin vivoにおいても適用可能であり、それが本技術の究極的な目的である。

送信回路１４は、超音波発生器１２を駆動するためのパルス波を生成して超音波発生器１２に供給するものであり、発振回路２２、及び増幅回路２４を含んで構成されている。

発振回路２２は、超音波発生器１２を駆動するためのパルス波を生成する。パルス波は、例えば所定の周波数を有する正弦波あるいは方形波などである。発振回路２２は、制御部１６から送られる制御信号に従ったタイミングでパルス波を出力あるいは停止する。制御部１６によるタイミング制御により、パルス波が出力される期間とパルス波の出力が停止する期間とが組み合わされた送信シーケンスが生成される。

制御部１６から送られる制御信号は、発振回路２２から出力されるパルス波の周波数を指示する信号を含んでいる。この場合は、発振回路２２は、制御部１６からの制御信号が示すタイミングにおいて、制御信号が示す周波数に出力するパルス波の周波数を切り替える。これにより、送信シーケンス内の所望のタイミングにおいてパルス波の周波数が変更される。なお、この周波数切替は後に説明する変形例において用いられる。

増幅回路２４は、例えば増幅回路などであり、発振回路２２が出力したパルス波の電圧振幅の変更を行う。増幅回路２４は制御部１６からの制御信号が示す電圧振幅へパルス波の電圧振幅を変更する。また、制御部１６からの制御信号が示すタイミングにおいてパルス波の電圧振幅を変更する。これにより、送信シーケンス内の所望のタイミングにおいてパルス波の電圧振幅が変更される。この電圧振幅切替も後に説明する変形例において用いられる。

発振回路２２において生成されたパルス波は超音波発生器１２に出力される。図１においては発振回路２２から出力されるパルス波は増幅回路２４を介して超音波発生器１２に供給されているが、発振回路２２からのパルス波は、増幅回路２４をバイパスして超音波発生器１２へ供給されてもよい。これらパルス波の供給経路の制御も制御部１６により行われる。送信シーケンスの詳細については後述する。

制御部１６は、例えばＣＰＵやマイクロチップなどで構成され、上述の通り、発振回路２２及び増幅回路２４に対して、これらを制御する制御信号を送信する。制御部１６は、記憶部（図１において不図示）に記憶されたプログラムに基づいて上記各回路に対して制御信号を送信する。

図２（ａ）は、容器２０にマイクロバブル群２８が注入される様子を示している。図示の例において、容器２０には、ターゲット生体組織である１又は複数の生体細胞が培地上に収容されている。容器２０にはピペット２６によりマイクロバブル群２８が注入される。マイクロバブル群２８に含まれる各マイクロバブルは、例えば直径０．５μｍ〜１０μｍ程度の気泡である。また、マイクロバブル群２８と共に、ターゲット生体組織の生体細胞内へ導入したい導入物質も注入される。本実施形態では、導入物質として薬剤を用いる。

容器２０内におけるマイクロバブル群２８の濃度が高い程、それらが生体細胞の近傍に位置する確率も必然的に高くなる。そのため、超音波１８の送信によるマイクロバブルの圧壊によって細胞膜に孔が開く確率が上昇し、薬剤の導入効率が上昇する。しかし、過度にマイクロバブル群２８の濃度を高めると、生体細胞近傍に位置するマイクロバブル群２８に超音波が到達するまでに、超音波が他のマイクロバブル群２８において反射あるいは減衰してしまい、生体細胞近傍に位置するマイクロバブル群２８に十分な音圧の超音波が到達できない可能性が高くなる。これにより生体細胞近傍のマイクロバブル群２８を圧壊できない可能性が高くなり、導入効率が低下する。したがって、容器２０内におけるマイクロバブル群２８の濃度は適切な値に調整される。本実施形態では、容器２０内のマイクロバブル群２８の濃度を１０〜２００μｇ／ｍｌとしている。

マイクロバブル群２８及び薬剤が容器２０に注入された後に、図２（ｂ）に示すように、ソノポレーション用超音波送信装置１０によりソノポレーション用の超音波１８が容器２０に向けて送信される。つまり、マイクロバブル群２８に対して超音波１８が送信される。これにより、容器２０内においてソノポレーションを生じさせる。

図３に、ソノポレーションの様子を示す概念図が示されている。それは説明のための模式図に過ぎないものである。図３には、細胞核４０ａ及び細胞膜４０ｂを有する生体細胞４０と、その近傍に位置するマイクロバブル群２８及び薬効物質群４２が示されている。容器２０内にマイクロバブル群２８及び薬剤が注入されると、図３（ａ）に示すように、マイクロバブル群２８及び薬効物質群４２は生体細胞４０の近傍にも分布する。その状態においてソノポレーション用超音波送信装置１０から超音波１８が送信されると、超音波１８は生体細胞４０近傍に位置するマイクロバブル（例えばマイクロバブル２８ａ）に到達する。すると、マイクロバブル２８ａは体積振動を起こし、やがて圧壊する。マイクロバブル２８ａが圧壊すると、マイクロバブル２８ａから１方向に向けて衝撃波あるいはマイクロストリームが発生する。当該衝撃波などは、生体細胞４０へ向けて（図３（ａ）中の矢印の方向へ向けて）生じる場合があり、その場合において当該衝撃波などによって細胞膜４０ｂに孔４４が開けられる。そうすると、図３（ｂ）に示すように、生体細胞４０の近傍に位置する薬効物質４２ａは、孔４４を通って生体細胞４０内へ取り込まれる。そして、生体細胞４０内へ取り込まれた薬効物質４２ａが細胞核４０ａと反応すると、当該生体細胞４０において薬効が生じることになる。なお、細胞膜４０ｂに空いた孔は、生体細胞４０が正常に機能している限りにおいて、生体細胞４０の自己修復力により塞がれる。

以下、図１を参照しつつ図４〜図１０を用いて、送信回路１４及び制御部１６の協働により生成される送信シーケンスについて説明する。上述のように、超音波発生器１２から送信される超音波１８は、超音波発生器１２を駆動するパルス波に応じたものとなる。すなわち、超音波１８の送信及び停止のタイミングはパルス波の出力及び停止のタイミングと同期し、超音波１８の音圧はパルス波の電圧振幅に応じたものとなり、また超音波１８の周波数はパルス波の周波数に応じたものとなる。したがって、以下においては、主に送信回路１４から超音波発生器１２へ送信される電圧信号としての送信シーケンスについて説明するが、それは超音波発生器１２から送信される超音波の送信シーケンスと同視できる。

図４は、ターゲット生体組織においてソノポレーションを生じさせるための１セットの送信シーケンス全体が示されている。図４において、横軸は時間軸を示し、縦軸は電圧を示す。図４に示される通り、送信シーケンスは、パルス波を含む期間である送信期間Ｔ_Ｂ、及びパルス波を含まない期間、つまり超音波１８の送信が停止される期間である停止期間Ｔ_Ｒを含んでいる。送信期間Ｔ_Ｂと停止期間Ｔ_Ｒは時間軸において交互に並んでおり、２つの送信期間Ｔ_Ｂの間に停止期間Ｔ_Ｒが配置される形となっている。本実施形態では、送信シーケンスは送信期間Ｔ_Ｂを３つ含み、各送信期間Ｔ_Ｂの間に２つの停止期間Ｔ_Ｒが設けられている。

送信期間Ｔ_Ｂ及び停止期間Ｔ_Ｒの時間長は、数秒〜十数秒程度の比較的長い時間が設定される。本実施形態では、送信期間Ｔ_Ｂと停止期間Ｔ_Ｒの時間長は共に１０秒に設定されている。したがって、送信シーケンス１セットの時間長Ｔ_Ａは５０秒となっている。送信期間Ｔ_Ｂ及び停止期間Ｔ_Ｒの時間長はそれ以外の値が設定されてもよい。また、送信期間Ｔ_Ｂ及び停止期間Ｔ_Ｒの時間長が同じである必要はなく、互いに異なる値が設定されてもよい。また、各送信期間Ｔ_Ｂの時間長を互いに異なる値としてもよく、各停止期間Ｔ_Ｒを互いに異なる値としてもよい。

本送信シーケンスによれば、ソノポレーション用超音波送信装置１０は、ある一定期間超音波１８を送信した後、数秒〜数十秒の比較的長い期間超音波１８の送信を停止し、その後超音波１８の送信を再開する。これにより、薬剤の導入効率が向上することが実験で確認されている。その理由として、考えうるに、停止期間Ｔ_Ｒの間に生体細胞が自己修復することで死滅細胞の量が低減すること、あるいは、超音波１８が送信されたことに起因してターゲット生体組織においてマイクロバブル群２８の空間的分布に偏りが生じた場合に、停止期間Ｔ_Ｒにおいて各マイクロバブルが移動してマイクロバブル群２８の空間的な分布が一様になる、つまり生体細胞近傍にマイクロバブルが位置する可能性が高くなることが挙げられる。

次に、送信期間Ｔ_Ｂの詳細を説明する。図５は、１つの送信期間Ｔ_Ｂの詳細を示す図である。図５においても、横軸は時間軸を示し、縦軸は電圧を示す。送信期間Ｔ_Ｂは、パルス波が送信される期間、つまり超音波１８が送信される期間である複数のパルス波期間Ｔ_１、及びパルス波を含まない期間、つまり超音波１８の送信が小休止される期間である複数の小休止期間Ｔ_２を含んで構成されている。パルス波期間Ｔ_１と小休止期間Ｔ_２は時間軸において交互に並んでおり、２つのパルス波期間Ｔ_１の間に小休止期間Ｔ_２が配置される形となっている。したがって、本送信シーケンスにおいては、送信期間Ｔ_Ｂの間において連続して超音波１８が送信されるわけではなく、送信期間Ｔ_Ｂ内においても、小休止を交えながら、つまり間欠的に超音波が送信される。これにより、マイクロバブルを好適に圧壊させつつ、生体細胞に与えるダメージを低減させている。以下、このことについて図６を用いて説明する。

図６（ａ）には、パルス波期間Ｔ_１及び小休止期間Ｔ_２における超音波１８の波形が示されている。図６において、横軸は時間軸を示し、縦軸は超音波の音圧を示す。図６（ａ）に示されている音圧Ｐ_ｔは、ソノポレーション誘発の閾値、つまりマイクロバブルを圧壊するのに最低限必要な音圧とする。

超音波１８により生体細胞へ与えるダメージを低減させる１つの方法としては、超音波１８によって生体細胞へ与えられる音響エネルギを低減させればよい。音響エネルギＥは、超音波の音響エネルギ密度Ｅ_ｄと超音波の送信時間ｔを乗じて求められる。つまり、音響エネルギＥは、
で与えられる。音響エネルギ密度Ｅ_ｄは、ある特定の面を１秒間に通過するエネルギ量を示すものであり、
で与えられる。式２において、Ｐは超音波の音圧、ρは音響伝搬媒質の密度、ｃは音速を示す。

式１及び式２から、生体細胞が超音波１８から受ける音響エネルギは、超音波１８の音圧の２乗値及び送信時間に比例することが分かる。つまり、生体細胞へ与える音響エネルギを低減させるには、超音波１８の音圧をできるだけ小さくし、その送信時間をできるだけ短くすればよい。

まず、超音波１８の音圧に関して説明する。超音波１８はマイクロバブルを圧壊させるために送信されるものであるので、その音圧はマイクロバブルを圧壊し得る程度の音圧が必要である。つまり、その音圧を少なくともＰ_ｔ以上とする必要がある。そこで、超音波１８の音圧をＰ_ｔ以上の音圧であってできるだけ小さい音圧とすれば、マイクロバブルを好適に圧壊しつつ、生体細胞へ与えるダメージを低減することができる。本実施形態では、誤差などを考慮し、超音波１８の音圧を音圧Ｐ_ｔよりも少しだけ大きい音圧Ｐ_ｐとしている。

次に、超音波１８の送信時間に関して説明する。上述の通り、生体細胞へ与えるダメージを低減させるには、超音波１８の送信時間をできるだけ短くすればよい。ここで、超音波１８の送信時間をどの程度まで短くできるのかが問題となる。超音波１８の音圧がＰ_ｔ以上であれば、マイクロバブルの圧壊は確率現象となる。すなわち、超音波１８を短時間連続送信しただけで圧壊するマイクロバブルもあれば、圧壊まで長時間の連続送信を要するマイクロバブルもある。このため、超音波をより長い時間連続送信すれば、つまりパルス波期間Ｔ_１を長くすれば、マイクロバブルの圧壊の可能性が高くなり、すなわち圧壊されるマイクロバブルの量が増大する。これにより薬剤の導入効率が上昇する。一方、上述のようにパルス波期間Ｔ_１を長くすれば、それだけ超音波１８の送信時間が長くなり、生体細胞が受ける音響エネルギが増大する。つまり、薬剤の導入効率と生体細胞が受けるダメージ量はトレードオフの関係にあり、パルス波期間Ｔ_１は両者のバランスを考慮して設定される。

超音波１８の連続送信時間を数十ミリ秒程度、より詳しくは５０ミリ秒程度とすることで、十分な導入効率が得られることが認められた。したがって、本実施形態では、超音波１８の連続送信時間、つまりパルス波送信期間を５０ミリとし、超音波１８のそれ以上の連続送信を停止させるために各パルス波期間に後続して小休止期間を設けた。本実施形態では、小休止期間を４５０ミリ秒としている。これにより、超音波１８の送信時間が低減され、送信期間Ｔ_Ｂにおいて生体細胞が超音波１８から受ける音響エネルギが低減される。つまり、生体細胞が超音波１８から受けるダメージが低減される。

本実施形態はパルス波期間Ｔ_１を５０ミリ秒とし、小休止期間Ｔ_２を４５０ミリ秒とした。つまり、送信期間Ｔ_Ｂにおける送信デューティ比を１０パーセントとしたが、パルス波期間Ｔ_１の時間長あるいは送信期間Ｔ_Ｂにおける送信デューティ比は、薬剤の導入効率と生体細胞が受けるダメージ量とを考慮して適宜設定されて良い。なお、実験の結果により、送信期間Ｔ_Ｂにおける送信デューティ比は、０．１パーセントから５０パーセントの間が適切であるとの知見が得られた。

図６（ａ）には、パルス波期間Ｔ_１を５０ミリ秒とし、小休止期間を４５０ミリ秒としたときに、パルス波期間Ｔ_１と小休止期間Ｔ_２の１セット分の期間において、超音波１８が生体細胞へ与える音響エネルギＥ_１が示されている。Ｅ_１は、上述の通り超音波１８の音圧Ｐ_ｐの２乗値及び超音波１８の送信時間であるＴ_１の時間長に比例する値となる。図６（ａ）に示されている通り、本実施形態においては、Ｔ_１とＴ_２の１セット期間における送信デューティ比が１０パーセントとなっているから、生体細胞が超音波１８から受ける音響エネルギＥ_１は、Ｔ_１とＴ_２の１セット期間ずっと連続して音圧Ｐ_ｐの超音波１８が送信された場合に比べ１０分の１となる。これは、図６（ｂ）に示される通り、音圧Ｐ_ｐのルート１０分の１の音圧Ｐ_ｃにおいてＴ_１とＴ_２の１セット期間の間ずっと超音波が送信された場合の音響エネルギＥ_２と同等量のエネルギである。

パルス波期間Ｔ_１において送信されるパルス波の周波数はマイクロバブルの共振周波数に基づいて設定される。これにより、超音波１８の送信によってマイクロバブルをより大きく体積振動させることができ、好適に、つまり超音波１８の音圧を不要に上げることなくマイクロバブルを圧壊できる。ここで、マイクロバブルをより好適に体積振動させるために、パルス波の周波数はマイクロバブルの共振周波数よりも少し低い値に設定される。これについて、以下図７を用いて説明する。

図７は、超音波の周波数特性５０とマイクロバブルの振動応答特性５２の関係を示すグラフである。図７のグラフの横軸は周波数を表しており、縦軸は、超音波の周波数特性５０に対しては信号強度、マイクロバブルの振動応答特性５２に対しては体積振動量を表している。図７において示されているマイクロバブルの振動応答特性５２は、マイクロバブルを圧壊し得る程度の比較的大きい音圧の超音波が送信された場合における振動応答特性である。

図７（ａ）又は図７（ｂ）に示される通り、超音波の周波数特性５０は、中心周波数（これはパルス波の周波数とほぼ一致する）ｆ_ｃにおいて最大信号強度を示し、その前後の周波数においては、中心周波数から離れる程信号強度が低くなっている。超音波の周波数特性５０は、中心周波数を中心に対称性を有している。一方、マイクロバブルの振動応答特性５２は、マイクロバブルの共振周波数ｆ_ｒにおいて最大振動量を示すが、その前後の周波数における特性は非対称の特性を有している。より詳しくは、共振周波数ｆ_ｒより低い周波数領域においては、周波数が共振周波数ｆ_ｒから低くなるに従って比較的なだらかに体積振動量が減少していくが、共振周波数ｆ_ｒより高い周波数領域においては、周波数が共振周波数ｆ_ｒから高くなるに従って、低周波領域よりも急激に体積振動量が減少する。

以上の通りであるから、図７（ａ）に示すように、超音波１８の中心周波数（パルス波の周波数）ｆ_ｃとマイクロバブルの共振周波数ｆ_ｒを一致させると、超音波１８が有する周波数成分のうちの最も高い周波数領域が、マイクロバブルの振動応答特性が非常に低い周波数領域にはみ出してしまい、超音波１８が有する周波数成分の一部がマイクロバブルの振動に寄与し得なくなる。本実施形態においては、図７（ｂ）に示すように、超音波１８の中心周波数（つまりパルス波の周波数）ｆ_ｃをマイクロバブルの共振周波数ｆ_ｒよりも少し低い値に設定している。これにより、超音波１８が有する各周波数成分のより広い範囲の周波数の成分が活用され、より好適にマイクロバブルを振動させることができる。

以上、本実施形態によれば、送信回路１４から超音波発生器１２へ供給される送信シーケンスは、比較的長い時間間隔で繰り返す送信期間Ｔ_Ｂと停止期間Ｔ_Ｒを含み、さらに、その送信期間Ｔ_Ｂは、比較的短い時間間隔で繰り返すパルス波期間Ｔ_１と小休止期間Ｔ_２を含んでいる。つまり、送信期間Ｔ_Ｂの間においても超音波１８が間欠送信される。これにより、生体細胞内への薬剤の十分な導入効率が得られる程度にマイクロバブルを圧壊しつつ、生体細胞へ与える音響エネルギを低減させ、生体細胞へ与えるダメージを低減させている。

以下、本実施形態の変形例について説明する。以下の変形例は、上述した基本実施形態と比して超音波の送信シーケンスが異なるのみであるため、送信シーケンス以外の説明については省略する。変形例の送信シーケンスは、まず複数のマイクロバブルを圧壊させずに振動させ、それにより複数のマイクロバブル間に生じるsecondary Bjerknes forceにより複数のマイクロバブルを凝集させてクラウドを形成し、その後クラウドに含まれる複数のマイクロバブルを一気に圧壊させるものである。

図８には、パルス波期間Ｔ_１に送信されるパルス波の変形例が示されている。変形例においては、パルス波期間Ｔ_１は、クラウド形成用超音波を送信するクラウド形成期間Ｔ_１ａ及びクラウド圧壊用超音波を送信するクラウド圧壊期間Ｔ_１ｂを含んでいる。

クラウド形成用超音波は、複数のマイクロバブルを圧壊せずにそれらを振動させる必要があるため、その音圧はＰ_ｔ（図６（ａ）参照）未満に設定される。したがって、クラウド形成期間Ｔ_１ａにおけるパルス波の電圧振幅Ｖ_ｓはＶ_ｔよりも小さい値が設定される。ここで、電圧振幅Ｖ_ｔは、音圧Ｐ_ｔを生じさせる電圧振幅である。クラウド形成用超音波の周波数は、マイクロバブルをより振動させるために、マイクロバブルの共振周波数に基づいて設定される。クラウド形成期間Ｔ_１ａの時間長は、マイクロバブルの濃度等に応じて、複数のマイクロバブルが振動して凝集するのに十分な値が設定される。

クラウド圧壊用超音波は、クラウドに含まれる複数のマイクロバブルを圧壊する必要があるため、その音圧はＰ_ｔ以上に設定される。したがって、クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂにおけるパルス波の電圧振幅Ｖ_ｐはＶ_ｔ以上の値が設定される。本実施形態では、誤差などを考慮しつつ生体細胞に与える音響エネルギを低減させる観点から、クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂにおけるパルス波の電圧振幅は、Ｖ_ｔよりも少しだけ大きいＶ_ｐに設定される。クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂの時間長は、クラウドに含まれる複数のマイクロバブルを圧壊するのに十分な値が設定される。

なお、図８の例においては、クラウド形成期間Ｔ_１ａに引き続いてクラウド圧壊期間Ｔ_１ｂが設けられているが、両期間の間に多少の間隔が開いていてもよい。ただし、当該間隔があまりに長い場合には形成したクラウドが崩れてしまう虞があるため、当該間隔はできるだけ短い方が好ましい。

図８に示された送信シーケンスによれば、クラウド形成期間Ｔ_１ａにおいてマイクロバブルにクラウド形成用超音波が送信され、これにより複数のマイクロバブルは振動し、secondary Bjerknes forceにより複数のマイクロバブルの凝集体であるクラウドが形成される。そして、クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂにおいて送信されるクラウド圧壊用超音波により、クラウドに含まれる複数のマイクロバブルを一気に圧壊させる。これにより、個々のマイクロバブルが単独で圧壊するときよりも、圧壊による衝撃波などをより強くすることができる。したがって、生体細胞へより大きな孔を開けることが可能になり、薬剤の導入効率が向上される。

変形例においても、各パルス波期間Ｔ_１に後続して小休止期間Ｔ_２が設けられている。つまり、変形例においても生体細胞へ与えるダメージは低減されており、その上で薬剤の導入効率をより向上させている。

図９には、パルス波期間Ｔ_１に送信されるパルス波の他の変形例が示されている。図９の例は、図８の例同様パルス波期間Ｔ_１は、クラウド形成期間Ｔ_１ａ及びクラウド圧壊期間Ｔ_１ｂを含んでいるが、図８の例に比してクラウド圧壊期間Ｔ_１ｂに送信されるパルス波の周波数が異なる。

クラウドはマイクロバブルの凝集体であり、マイクロバブル単体よりも体積が大きくなることから、クラウドの共振周波数はマイクロバブル単体の共振周波数よりも低くなる。したがって、クラウド（に含まれる複数のマイクロバブル）をより好適に圧壊させるために、クラウド圧壊期間においてクラウドの共振周波数に基づいた周波数の超音波が送信されるのが好ましい。

図９の例において、クラウド形成期間Ｔ_１ａにおけるパルス波の周波数ｆ_１ａは、マイクロバブルの共振周波数に基づいて設定されているのに対し、クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂにおけるパルス波の周波数ｆ_１ｂは、クラウドの共振周波数に基づいて設定される。クラウドの共振周波数はマイクロバブル単体の共振周波数よりも低いから、ｆ_１ｂはｆ_１ａよりも小さい値が設定される。

図９の例によれば、クラウド圧壊期間Ｔ_１ｂに送信されるクラウド圧壊用超音波の周波数ｆ_１ｂがクラウドの共振周波数に基づいて設定されるから、クラウド圧壊用超音波の送信によってクラウドに含まれる複数のマイクロバブルをより好適に振動させ圧壊させることができる。

なお、図９の例においては、クラウド形成期間Ｔ_１ａとクラウド圧壊期間Ｔ_１ｂ間において、パルス波の電圧振幅と周波数の両方を変更していたが、周波数のみを変更するようにしてもよい。この場合、例えば、クラウド形成用超音波の音圧をＰｔ以上（図６（ａ）参照）とし、その周波数をマイクロバブルの共振周波数からずらした周波数とすることでマイクロバブルの体積振動量を抑え、マイクロバブルを圧壊させずに体積振動させてクラウドを形成させる。そして、クラウド圧壊用超音波は、クラウド形成用超音波の音圧を維持したまま、その周波数をクラウドの共振周波数近傍に変更することで、クラウドを大きく振動させ圧壊させるという態様を採用し得る。

１０ソノポレーション用超音波送信装置、１２超音波発生器、１４送信回路、１６制御部、１８超音波、２０容器、２２発振回路、２４増幅回路、２６ピペット、２８マイクロバブル群、２８ａマイクロバブル、４０生体細胞、４０ａ細胞核、４０ｂ細胞膜、４２薬効物質群、４２ａ薬効物質、４４孔、５０超音波の周波数特性、５２バブルの振動応答特性。

Claims

ターゲット生体細胞の周囲に存在するバブルに対してソノポレーション用の超音波を送信する超音波発生部と、
前記超音波を規定する送信シーケンスを生成するシーケンス生成部と、
を備え、
前記送信シーケンスは、時間軸方向に並んだ複数の送信期間、及び、隣り合う２つの前記送信期間の間の期間であって前記超音波の送信を停止させる停止期間を含み、
前記各送信期間は、前記時間軸方向に並んだ複数のパルス波期間、及び、隣り合う２つのパルス波期間の間の期間であって前記超音波の送信を小休止させる小休止期間を含み、
前記各パルス波期間において前記バブルに対して前記超音波が送信され、
周波数に対する体積振動量を表す前記バブルの振動応答特性において、前記体積振動量が最大振動量を示す共振周波数より低い周波数領域における単位周波数当たりの前記体積振動量の変化量よりも、前記共振周波数より高い周波数領域における単位周波数当たりの前記体積振動量の変化量が大きいことに応じて、前記超音波が有する前記超音波の中心周波数を中心とする周波数帯における信号成分の前記バブルの振動への寄与量が大きくなるように、前記超音波の中心周波数が、前記バブルの前記共振周波数の近傍の周波数であって、前記バブルの前記共振周波数よりも低い周波数に設定される、
ことを特徴とするソノポレーション用超音波送信装置。
前記停止期間は前記小休止期間よりも長い期間である、
ことを特徴とする、請求項１に記載のソノポレーション用超音波送信装置。
前記パルス波期間は、複数のバブルが凝集したクラウドを形成するための、前記クラウドを形成し得る音圧を有するクラウド形成用超音波が送信されるクラウド形成期間、及び、前記クラウド形成期間に後続する期間であって、前記クラウドに含まれる複数のバブルを圧壊させるための、前記クラウド形成用超音波の音圧よりも大きい音圧であって、前記クラウドに含まれる複数のバブルを圧壊し得る音圧を有するクラウド圧壊用超音波を送信するクラウド圧壊期間を含む、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のソノポレーション用超音波送信装置。
前記クラウド圧壊用超音波は、前記クラウドの共振周波数に基づいて設定される周波数を有する、
ことを特徴とする、請求項３に記載のソノポレーション用超音波送信装置。