JP6623488B2 - Measurement method of glycated hemoglobin - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring glycated hemoglobin in a sample.
糖化蛋白質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、最近、臨床診断分野において、血液中の糖化蛋白質であるヘモグロビンA1c（以下HbA1c、非特許文献１）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている。このHbA1cを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる機器分析的方法（非特許文献２）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（例えば、非特許文献３）等が知られていたが、近年、酵素的測定法が開発されており、例えば、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる方法（特許文献１）が開発されている。酵素的測定法は、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なことから開発が盛んになっている。 Glycated proteins are contained in body fluids such as blood and biological samples such as hair in a living body. The concentration of glycated protein present in blood depends on the concentration of saccharides such as glucose dissolved in serum. Recently, in the field of clinical diagnosis, hemoglobin A1c (hereinafter referred to as HbA1c, The measurement of the concentration of Non-Patent Document 1) is used for diagnosis and monitoring of diabetes. As a method for measuring HbA1c, an instrumental analytical method using high performance liquid chromatography (HPLC) (Non-patent Document 2), an immunoassay method using an antigen-antibody reaction (for example, Non-Patent Document 3) and the like are known. However, in recent years, enzymatic measurement methods have been developed, for example, a method using a protease and glycated peptide oxidase (Patent Document 1). The enzymatic measurement method can be applied to a versatile automatic analyzer, and its operation is simple, and its development has been active.
酵素的測定法で用いられる糖化ペプチドオキシダーゼは、グルコースのヘミアセタールとペプチドのＮ末端のアミノ基とが反応して生成されるグルコシルアミンがアマドリ転位して生成されるケトース誘導体におけるＣ−Ｎ結合を、酸素分子の存在下で酸化的に開裂し、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド及び過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素である。 Glycated peptide oxidase used in the enzymatic assay is capable of forming a C-N bond in a ketose derivative produced by Amadori rearrangement of glucosylamine produced by a reaction between hemiacetal of glucose and an amino group at the N-terminal of the peptide. Is an enzyme that catalyzes a reaction that oxidatively cleaves in the presence of oxygen molecules to produce sugar oson (α-keto aldehyde form), peptide and hydrogen peroxide.
酵素的測定法の場合、まずHbA1cをプロテアーゼで分解し、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端からα-糖化バリルヒスチジン(以下、α−FVHと記す)を生成させる。次に、生成されたα−FVHに糖化ペプチドオキシダーゼを作用させ、生成される過酸化水素によりパーオキシダーゼの存在下でキノン系色素を生成させ、その生成量を分光光度計で比色定量する方法が知られている（特許文献１）。 In the case of the enzymatic assay, HbA1c is first decomposed with a protease to generate α-glycated valylhistidine (hereinafter referred to as α-FVH) from the N-terminal of the β chain of hemoglobin. Next, a method in which glycated peptide oxidase is caused to act on the generated α-FVH, a quinone-based dye is generated in the presence of peroxidase by the generated hydrogen peroxide, and the amount of the generated colorimetrically determined by a spectrophotometer. Is known (Patent Document 1).
しかしながら、従来知られている糖化ペプチドオキシダーゼ（例えば、特許文献２、３、４、５、非特許文献４）が作用可能な糖化ペプチドは、通常ジペプチドであって、最大でもヘキサペプチド（特許文献６、７）であり、それよりも長いアミノ酸鎖長を有する糖化ペプチドや糖化蛋白質に作用する糖化ペプチドオキシダーゼは知られていない。従って、酵素的測定方法においては、上記の通り、糖化蛋白質にプロテアーゼを作用させて、生成された糖化ペプチドに対して、糖化ペプチドオキシダーゼを作用させて、生成された過酸化水素を測定する方法しか報告されていない。
糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させ、生成された糖化ペプチドに糖化ペプチドオキシダーゼを作用させて、生成された過酸化水素を測定するこの方法は、自動分析装置等により糖化ヘモグロビンの測定以外の測定を同時に行う場合は、糖化ヘモグロビン測定試薬中のプロテアーゼが他試薬に作用し、測定値に影響を及ぼすおそれがある。However, glycated peptides to which conventionally known glycated peptide oxidases (for example,
This method of reacting a glycated hemoglobin with a protease and causing a glycated peptide oxidase to act on a generated glycated peptide and measuring the generated hydrogen peroxide is performed simultaneously with the measurement other than the measurement of the glycated hemoglobin by an automatic analyzer or the like. In this case, the protease in the reagent for measuring glycated hemoglobin may act on other reagents to affect the measured value.
本発明の目的は、糖化ヘモグロビンの測定方法において、糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させることなく、糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定する糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for measuring glycated hemoglobin, in which a glycated hemoglobin is directly oxidized without causing a protease to act on the glycated hemoglobin, and a produced substance or a consumed substance is measured. Is to do.
本発明は、以下の（１）〜（４）に関する。
（１）試料中の糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
（２）酵素を用いて糖化ヘモグロビンを直接酸化する、（１）記載の測定方法。
（３）生成された物質が過酸化水素である、（１）又は（２）記載の測定方法。
（４）糖化ヘモグロビンがHbA1cである、（１）〜（３）記載の測定方法。The present invention relates to the following (1) to (4).
(1) A method for measuring glycated hemoglobin in a sample, which comprises directly oxidizing glycated hemoglobin in the sample and measuring a produced substance or a consumed substance.
(2) The method according to (1), wherein glycated hemoglobin is directly oxidized using an enzyme.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the generated substance is hydrogen peroxide.
(4) The method according to (1) to (3), wherein the glycated hemoglobin is HbA1c.
本発明により、試料中に存在する糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定する糖化ヘモグロビンの測定方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a method for measuring glycated hemoglobin, which directly oxidizes glycated hemoglobin present in a sample to measure a produced substance or a consumed substance.
１．本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の測定方法は、糖化ヘモグロビンを直接酸化して、生成された物質又は消費された物質を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定する。本発明における糖化ヘモグロビンとしては、HbA1cが好ましい。糖化ヘモグロビンを直接酸化する方法としては、糖化ヘモグロビンを直接酸化することができる方法であればいずれでもよいが、酵素を用いて酸化する方法が好ましい。
以下、本発明の測定方法について説明する。1. Measurement method of glycated hemoglobin of the present invention The measurement method of the present invention measures glycated hemoglobin by directly oxidizing glycated hemoglobin and measuring a produced substance or a consumed substance. The glycated hemoglobin in the present invention is preferably HbA1c. As a method of directly oxidizing glycated hemoglobin, any method can be used as long as it can directly oxidize glycated hemoglobin, but a method of oxidizing with an enzyme is preferable.
Hereinafter, the measurement method of the present invention will be described.
（試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、糖化ヘモグロビンを含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましく、全血液、血球等が特に好ましい。なお、全血液には、全血液由来の血球画分に血漿が混合している試料も含まれる。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。(Sample and object to be measured)
The sample used in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample containing glycated hemoglobin.For example, whole blood, plasma, serum, blood cells, cell samples, urine, cerebrospinal fluid, sweat, tears, saliva, Biological samples such as skin, mucous membranes, and hair are exemplified. As the sample, whole blood, plasma, serum, blood cells and the like are preferable, and whole blood, blood cells and the like are particularly preferable. Note that whole blood also includes a sample in which plasma is mixed with a blood cell fraction derived from whole blood. These samples may be subjected to pretreatment such as hemolysis, separation, dilution, concentration, and purification.
ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘム蛋白質である。ヘモグロビンのα鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリンであり、β鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシンである。HbA1cは、特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されているが、ヘモグロビンはα鎖のＮ末端を含め、分子内に複数の糖化部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127）。 Hemoglobin is a heme protein having a molecular weight of 64,000 and having two types of subunits, an α chain and a β chain. The N-terminal three amino acid sequence of the α-chain of hemoglobin is valine-leucine-serine, and the N-terminal three amino acid sequence of the β-chain is valine-histidine-leucine. HbA1c is defined as one in which the N-terminal valine residue of the β-chain is glycated, but hemoglobin is known to have a plurality of glycation sites in the molecule including the N-terminal of the α-chain ( The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127).
（測定方法）
本発明の、試料中の測定すべき糖化ヘモグロビンの測定は、例えば、下記(i)〜(ii)の工程を順次行うことによって行うことができる。
(i)試料中の糖化ヘモグロビンに酵素を作用させて糖化ヘモグロビンを酸化する工程、
(ii)上記工程(i)で生成された物質、又は、消費された物質を測定する工程。(Measuring method)
The measurement of glycated hemoglobin to be measured in a sample according to the present invention can be performed, for example, by sequentially performing the following steps (i) to (ii).
(i) oxidizing glycated hemoglobin by acting an enzyme on glycated hemoglobin in the sample,
(ii) a step of measuring the substance produced in the above step (i) or the consumed substance.
工程(i)において用いられる酵素としては、糖化ヘモグロビンを直接酸化できるものであればいずれでもよいが、例えば、下記の酵素を用いることができる。
［１］配列番号3〜34のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質（それぞれ、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-21、FPOX-22、FPOX-23、FPOX-24、FPOX-25、FPOX-26、FPOX-27、FPOX-28、FPOX-29、FPOX-30、FPOX-31、FPOX-32、FPOX-33、FPOX-34、FPOX-35、FPOX-36、FPOX-37、FPOX-38、FPOX-39、FPOX-40、FPOX-41、FPOX-42、FPOX-43、FPOX-44、FPOX-45、FPOX-46と称する）、
［２］配列番号3〜34のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性という）を有する蛋白質等が挙げられる。以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を糖化ヘモグロビンオキシダーゼという。これらの糖化ヘモグロビンオキシダーゼは１種類で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。As the enzyme used in step (i), any enzyme can be used as long as it can directly oxidize glycated hemoglobin. For example, the following enzymes can be used.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 34 (FPOX-18A, FPOX-18B, FPOX-18C, FPOX-18D, FPOX-19, FPOX-20, FPOX-21, FPOX-22, FPOX-23, FPOX-24, FPOX-25, FPOX-26, FPOX-27, FPOX-28, FPOX-29, FPOX-30, FPOX-31, FPOX-32, FPOX-33, FPOX- 34, FPOX-35, FPOX-36, FPOX-37, FPOX-38, FPOX-39, FPOX-40, FPOX-41, FPOX-42, FPOX-43, FPOX-44, FPOX-45, and FPOX-46 Name),
[2] A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 34, and having an activity of directly oxidizing glycated hemoglobin (hereinafter, referred to as glycated hemoglobin oxidase activity) And the like. Hereinafter, a protein having glycated hemoglobin oxidase activity is referred to as glycated hemoglobin oxidase. These glycated hemoglobin oxidases may be used alone or in combination of two or more.
本発明の方法に用いられる蛋白質が糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有するためには、配列番号3〜34のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上、好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。 In order for the protein used in the method of the present invention to have glycated hemoglobin oxidase activity, homology with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 34 is 90% or more, preferably 94% or more, more preferably Should have a homology of 96% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。The homology of the amino acid sequence and the base sequence is determined using the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90 , 5873 (1993)] by Karlin and Altschul and FASTA [Methods Enzymol., 183 , 63 (1990)]. Can be determined. Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol., 215 , 403 (1990)]. When a base sequence is analyzed by BLASTN based on BLAST, parameters are, for example, Score = 100 and wordlength = 12. When an amino acid sequence is analyzed by BLASTX based on BLAST, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.
上記工程(i)〜(ii)は、水性媒体中で行うこともできる。水性媒体としては、本発明の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。 The above steps (i) to (ii) can also be performed in an aqueous medium. The aqueous medium is not particularly limited as long as the aqueous medium enables the measurement method of the present invention. Examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer, but a buffer is preferred. Examples of the buffer used for the buffer include a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer), a phosphate buffer, a borate buffer, and a Good's buffer.
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0 mol/Lが好ましく、0.005〜1.0 mol/Lがより好ましい。Examples of Good's buffer include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), and N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA). , Piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanes Sulfonic acid (HEPES), 3- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-hydroxy-3- Aminopropanesulfonic acid (TAPSO), piperazine-N, N'-bis (2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) (POPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] -2- Hydroxypropanesulfonic acid (HEPPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid [(H) EPPS], N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine), N , N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), N-tris (hydroxymethyl) Methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS), N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES), N-cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid (CAPSO), N-cyclohexyl-3- Aminopropanesulfonic acid (CAPS) and the like.
The concentration of the buffer is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
上記工程(i)において糖化ヘモグロビンの変性剤、又は、酸化剤を共存させてもよい。また、糖化ヘモグロビンを含む試料を予め、当該変性剤、又は、当該酸化剤で処理してもよい。変性剤としては、本発明の測定方法を可能とする変性剤であれば特に制限はなく、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。また、酸化剤としては、本発明の測定方法を可能とする酸化剤であれば特に制限はなく、例えばヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸カリウム、臭素酸カリウム等が挙げられる。 In the above step (i), a denaturing agent for glycated hemoglobin or an oxidizing agent may coexist. Further, a sample containing glycated hemoglobin may be previously treated with the denaturing agent or the oxidizing agent. The modifier is not particularly limited as long as it is a modifier that enables the measurement method of the present invention, and examples thereof include a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant. No. The oxidizing agent is not particularly limited as long as it is an oxidizing agent that enables the measurement method of the present invention, and examples thereof include potassium iodate, potassium periodate, and potassium bromate.
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜120分間、好ましくは1〜90分間、特に好ましくは1〜60分間である。 The reaction temperature of the reaction in each step is, for example, 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is 1 second to 120 minutes, preferably 1 to 90 minutes, particularly preferably 1 to 60 minutes. It is.
工程（i）において、糖化ヘモグロビンと酵素との反応により反応液中に生じる生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ヘモグロビン等が挙げられる。また、工程(i)において、糖化ヘモグロビンと酵素との反応により消費される物質としては、例えば酸素分子等が挙げられる。工程(i)において消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いた電気化学的測定法により測定される。 In step (i), examples of products generated in the reaction solution by the reaction of glycated hemoglobin and the enzyme include hydrogen peroxide, sugar oson (α-ketoaldehyde compound), hemoglobin, and the like. In the step (i), examples of the substance consumed by the reaction between the glycated hemoglobin and the enzyme include an oxygen molecule. The oxygen molecules consumed in the step (i) are measured by, for example, an electrochemical measurement method using an oxygen electrode.
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法においては、試料中の糖化ヘモグロビンに糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させて、糖化ヘモグロビンを直接酸化し、生成された過酸化水素を測定することにより試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法が好ましい。本発明の工程（i）において生成される過酸化水素は、例えば光学的手法又は電気化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法、過酸化水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。 In the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention, glycated hemoglobin in a sample is acted on by glycated hemoglobin oxidase to directly oxidize glycated hemoglobin, and the generated hydrogen peroxide is measured to measure glycated hemoglobin in the sample. Is preferred. The hydrogen peroxide generated in the step (i) of the present invention can be measured by using, for example, an optical technique or an electrochemical technique. Examples of the optical method include an absorbance method, a luminescence method, and the like. Specific examples include an optical measurement method using a hydrogen peroxide measurement reagent, an electrochemical measurement method using a hydrogen peroxide electrode, and the like.
過酸化水素測定試薬は、生成された過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光等が挙げられるが、色素が好ましい。
検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。The hydrogen peroxide measurement reagent is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance. Examples of the detectable substance include a dye and light, and a dye is preferable.
When the detectable substance is a dye, the reagent for measuring hydrogen peroxide contains an oxidative chromogen and a peroxide active substance such as peroxidase. Examples of the oxidative coloring type chromogen include an oxidative coupling type chromogen described below and a leuco type chromogen described below.
検出可能な物質が光の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸エステル等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下にて酸化発色型色原体と反応させて色素を生成させ、生成された色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。When the detectable substance is light, the reagent for measuring hydrogen peroxide includes a chemiluminescent substance. The chemiluminescent substance also includes a bioluminescent substance, and examples thereof include luminol, isoluminol, lucigenin, acridinium ester, oxalate and the like.
When a reagent containing an oxidative chromogen and a peroxidase-active substance such as peroxidase is used as the hydrogen peroxide measurement reagent, hydrogen peroxide is converted to an oxidative chromogen in the presence of the peroxide active substance. Hydrogen peroxide can be measured by reacting with the body to generate a dye and measuring the generated dye. When a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance is used, hydrogen peroxide can be measured by reacting the hydrogen peroxide with the chemiluminescent substance to generate photons, and measuring the generated photons. it can.
酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。酸化カップリング型色原体の具体例は、４−アミノアンチピリン等のカプラー、及びフェノール系又はアニリン系水素供与体等が挙げられる。カプラーと、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、酸化カップリングし、色素を生成する。 The oxidative coupling type chromogen is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase such as peroxidase to generate a dye by an oxidative coupling reaction. Specific examples of the oxidative coupling type chromogen include a coupler such as 4-aminoantipyrine and a phenol-based or aniline-based hydrogen donor. The coupler and the phenol-based or aniline-based hydrogen donor compound undergo oxidative coupling in the presence of hydrogen peroxide and a peroxide active substance to form a dye.
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フェノール系水素供与体としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
アニリン系水素供与体としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等が挙げられる。Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone.
Examples of the phenolic hydrogen donor include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid (HTIB) and the like.
As the aniline-based hydrogen donor, N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- ( 2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl -N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methyl Aniline, N, N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N Ethyl-N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- Ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy -3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-succinylethylenediamine (EMSE), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-acetylethylenediamine, N -Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -4-fluoro-3,5-dimethoxyaniline (F-DAOS), N- [2- (succini L-amino) ethyl] -2-methoxy-5-methylaniline (MASE), N-ethyl-N- [2- (succinylamino) ethyl] -2-methoxy-5-methylaniline (Et-MASE) and the like. .
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ',Ｎ'',Ｎ''−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等が挙げられる。 Leuco-type chromogens are chromogens that react with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase or other peroxidative substance to produce a dye alone. Specifically, 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (MCDP), N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (DA-64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) Phenothiazine sodium salt (DA-67), 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), N, N, N ' , N ', N ", N" -hex-3-sulfopropyl-4,4', 4 "-triami Notriphenylmethane (TPM-PS), diaminobenzidine, hydroxyphenylpropionic acid, tetramethylbenzidine, orthophenylenediamine, and the like.
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、1〜100 U/mLが好ましく、2〜50 U/mLがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10 g/Lが好ましく、0.02〜5 g/Lがより好ましい。 In the measurement of hydrogen peroxide, the concentration of the peroxide active substance is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but when using peroxidase as the peroxide active substance, 1 to 100 U / mL is preferable, 2-50 U / mL is more preferred. The concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 g / L, more preferably 0.02 to 5 g / L.
過酸化水素を過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は、過酸化水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。オキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定することもできる。 When measuring hydrogen peroxide using a hydrogen peroxide electrode, the electrode used is not particularly limited as long as it is a material that exchanges electrons with hydrogen peroxide, and examples thereof include platinum, gold, and silver. . As a measuring method, a known method such as amperometry, potentiometry, and coulometry can be used. The reaction between the oxidase or substrate and the electrode may be mediated by an electron carrier to measure the resulting oxidation or reduction current or the amount of electricity.
電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。また、オキシダーゼ反応により生成される過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させることによって得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定することができる。 Any substance having an electron transfer function can be used as the electron carrier, and examples thereof include substances such as ferrocene derivatives and quinone derivatives. Further, an oxidation or reduction current or an amount of electricity obtained by interposing an electron carrier between hydrogen peroxide generated by the oxidase reaction and an electrode can be measured.
工程（i）においては、過酸化水素と共に糖オソン（α−ケトアルデヒド体）が生成されるので、生成された糖オソン（α−ケトアルデヒド体）を測定することによっても、試料中のHbA1cを測定することができる。α−ケトアルデヒド体にグルコースオキシダーゼを作用させて生成される過酸化水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる（特開2000-333696）。 In the step (i), sugar osone (α-keto aldehyde form) is produced together with hydrogen peroxide. Therefore, by measuring the produced sugar osone (α-keto aldehyde form), HbA1c in the sample can also be measured. Can be measured. The measurement can be performed with high sensitivity by additionally measuring the hydrogen peroxide generated by the action of glucose oxidase on the α-ketoaldehyde compound (JP-A-2000-333696).
糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法
本発明の方法に用いられる蛋白質である糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法の一例を以下に示す。Method for producing glycated hemoglobin oxidase An example of a method for producing glycated hemoglobin oxidase, which is a protein used in the method of the present invention, is shown below.
（プラスミド抽出）
寄託番号FERM BP-11026として寄託されている、糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9発現大腸菌株XL1-Blue MRF'株より、市販のプラスミド抽出キットを使用して、配列番号２のアミノ酸配列で表わされる糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9の発現プラスミドpTrc-FPOX-9を抽出する。(Plasmid extraction)
A glycated peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 from a glycated peptide oxidase FPOX-9-expressing E. coli strain XL1-Blue MRF ′ strain deposited under accession number FERM BP-11026 using a commercially available plasmid extraction kit Extract the expression plasmid pTrc-FPOX-9 for the oxidase FPOX-9.
（糖化ペプチドオキシダーゼ FPOX-15発現プラスミドの作製）
pTrc-FPOX-9発現プラスミドをテンプレートDNAとして、標的アミノ酸位置に相当するコドンを、置換するアミノ酸に対応するコドンに入れ替えたプライマー対を用いたPCRにより、部位特異的にアミノ酸置換を導入し、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15の発現プラスミドpTrc-FPOX-15を造成する。(Preparation of glycated peptide oxidase FPOX-15 expression plasmid)
Using the pTrc-FPOX-9 expression plasmid as a template DNA, a site-specific amino acid substitution was introduced by PCR using a primer pair in which the codon corresponding to the target amino acid position was replaced with a codon corresponding to the amino acid to be replaced, and the sequence was sequenced. An expression plasmid pTrc-FPOX-15 for glycated peptide oxidase FPOX-15 having the amino acid sequence represented by No. 1 is constructed.
（部位特異的アミノ酸置換による糖化ヘモグロビンオキシダーゼの造成）
上記と同様の方法により、pTrc-FPOX-15に部位特異的なアミノ酸置換を導入することにより、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18A、配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18B、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18C、配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18D、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-20の各糖化ヘモグロビンオキシダーゼの発現プラスミドを造成する。
上記と同様の方法により、FPOX-19の発現プラスミドpTrc-FPOX-19に部位特異的なアミノ酸置換を導入することにより、配列番号9〜34で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-21〜46の各糖化ヘモグロビンオキシダーゼの発現プラスミドを造成する。(Construction of glycated hemoglobin oxidase by site-specific amino acid substitution)
In the same manner as described above, by introducing a site-specific amino acid substitution into pTrc-FPOX-15, FPOX-18A having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, FPOX having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 -18B, FPOX-18C having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, FPOX-18D having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, FPOX-19 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, represented by SEQ ID NO: 8 An expression plasmid for each glycated hemoglobin oxidase of FPOX-20 having an amino acid sequence to be constructed is constructed.
By introducing a site-specific amino acid substitution into the expression plasmid pTrc-FPOX-19 of FPOX-19 by the same method as described above, each of FPOX-21 to 46 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 9 to 34. A glycated hemoglobin oxidase expression plasmid is constructed.
造成した糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現プラスミドを大腸菌株に形質転換し、組換え糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現大腸菌株を作製する。組換え糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現大腸菌株を50〜100mg/L アンピシリンを含有するLuria-Bertani(以下LBと記す)培地に植菌し、37℃で振盪培養する。OD600=0.4〜0.8まで生育させた後、イソプロピル-β-チオガラクトシド(以下IPTGと記す)を終濃度0.1〜1 mmol/Lとなるように添加し、引き続き37℃、5〜24時間振盪培養する。培養後、8000 rpm、10〜30分間遠心分離することで菌体を回収する。The constructed glycated hemoglobin oxidase expression plasmid is transformed into an E. coli strain to prepare a recombinant glycated hemoglobin oxidase-expressing E. coli strain. The recombinant glycated hemoglobin oxidase-expressing Escherichia coli strain is inoculated into a Luria-Bertani (hereinafter referred to as LB) medium containing 50 to 100 mg / L ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. After growing to an OD 600 of 0.4 to 0.8, isopropyl-β-thiogalactoside (hereinafter referred to as IPTG) was added to a final concentration of 0.1 to 1 mmol / L, followed by shaking culture at 37 ° C. for 5 to 24 hours. I do. After the culture, the cells are collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 to 30 minutes.
上記で得られた菌体を緩衝液に懸濁し、1〜10分間超音波破砕し、遠心分離後に上清を分取することで酵素の粗抽出液を調製する。該粗抽出液より、酵素活性及び該酵素の持つ補酵素フラビンアデニンジヌクレオチド(以下、FADと記す)の呈する色調を指標に、硫安沈殿、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー等の手法により精製酵素を調製する。
精製酵素の濃度は、該蛋白質の補酵素であるFADに由来する波長452nmの吸光度を測定し、得られた吸光度を、活性が既知の糖化ペプチドオキシダーゼを用いて予め作成した糖化ヘモグロビンオキシダーゼ濃度と吸光度との関係を示す検量線に照らし合わせて決定する。The bacterial cells obtained above are suspended in a buffer, sonicated for 1 to 10 minutes, and the supernatant is collected after centrifugation to prepare a crude extract of the enzyme. From the crude extract, a purified enzyme is prepared by a technique such as ammonium sulfate precipitation or anion exchange column chromatography, using the enzyme activity and the color tone of the coenzyme flavin adenine dinucleotide (hereinafter referred to as FAD) possessed by the enzyme as an index. I do.
The concentration of the purified enzyme was determined by measuring the absorbance at a wavelength of 452 nm derived from FAD, which is a coenzyme of the protein, and measuring the resulting absorbance with the concentration of glycated hemoglobin oxidase prepared in advance using glycated peptide oxidase of known activity. Is determined by reference to a calibration curve showing the relationship with
（糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性測定方法）
本発明の測定方法において、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性は、例えば以下の方法で測定することができる。(Method for measuring glycated hemoglobin oxidase activity)
In the measurement method of the present invention, glycated hemoglobin oxidase activity can be measured, for example, by the following method.
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液:発色剤
24 mmol/L DA-67のジメチルホルムアミド(DMF)溶液
C液:パーオキシダーゼ溶液
1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液:基質溶液
10 g/Lヘモグロビン水溶液
E液: 変性液
5 g/Lヨウ素酸カリウム及び、50%(v/v)界面活性剤（アンヒトール20N）の水溶液
F液: 酵素液
0.5〜1.0 U/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液(Activity measurement reagent)
Solution A: 0.1 mol / L MOPS buffer (pH6.8)
Liquid B: color former
24 mmol / L DA-67 in dimethylformamide (DMF)
Solution C: Peroxidase solution
1 kU / L peroxidase 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) solution
Solution D: substrate solution
10 g / L hemoglobin aqueous solution
Solution E: Denaturing solution
5 g / L aqueous solution of potassium iodate and 50% (v / v) surfactant (Amphitol 20N)
Solution F: Enzyme solution
0.5-1.0 U / mL glycated hemoglobin oxidase 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) solution
(測定手順)
(i)D液40μLにE液4μLを混合し、37℃にて10分間インキュベートする。
(ii)A液 10mLにB液12.6μL、C液 35μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴プレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液 40μL、F液20μLを加えて混合し、全自動マイクロプレートEIA分析装置により、混合直後の溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、次いで、37℃、60〜120分間加温して酵素反応を行い、得られた溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、酵素反応前後の吸光度変化を測定する。また、D液の代わりに蒸留水を用いて同様の測定を行い、酵素反応前後の吸光度変化をブランクとし、D液を用いる測定における、酵素反応前後の吸光度変化からブランクを差し引くことにより、酵素反応における吸光度を測定し、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの活性の指標とすることができる。(Measurement procedure)
(i) Mix 4 μL of solution E with 40 μL of solution D, and incubate at 37 ° C. for 10 minutes.
(ii) To 10 mL of Solution A, 12.6 μL of Solution B and 35 μL of Solution C were added, and the resulting solution was dispensed into each well of a 96-well plate by 190 μL per sample, and then a mixed solution of Solution D and Solution 40 μL was added. Then, add and mix 20 μL of solution F, and measure the absorbance of the solution immediately after mixing at 660 nm (main wavelength) / 750 nm (sub wavelength) using a fully automatic microplate EIA analyzer, and then at 37 ° C. After heating for 120 minutes to carry out the enzyme reaction, the absorbance of the obtained solution is measured at 660 nm (main wavelength) / 750 nm (sub wavelength), and the change in absorbance before and after the enzyme reaction is measured. In addition, the same measurement was performed using distilled water in place of solution D, and the change in absorbance before and after the enzyme reaction was used as a blank, and the blank was subtracted from the change in absorbance before and after the enzyme reaction in the measurement using solution D. Can be used as an indicator of the activity of glycated hemoglobin oxidase.
上記工程(i)及び(ii)は、水性媒体中で行われても良い。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の濃度としては、例えば前述の緩衝液の濃度が挙げられる。
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜120分間、好ましくは1〜90分間、特に好ましくは1〜60分間である。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書内に組み入れられる。The above steps (i) and (ii) may be performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include the above-described aqueous medium and the like, and a buffer is preferable. Examples of the concentration of the buffer include the concentration of the buffer described above.
The reaction temperature of the reaction in each step is, for example, 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is 1 second to 120 minutes, preferably 1 to 90 minutes, particularly preferably 1 to 60 minutes. It is.
All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
リン酸二水素カリウム（和光純薬工業）、リン酸一水素カリウム（和光純薬工業）、DA-67（和光純薬工業社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡社製）、MOPS（同仁化学研究所社製）、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）、ヨウ素酸カリウム（和光純薬工業社製）、Luria-Bertani miller培地（LB培地）（ベクトンディキンソン社製）、KOD-plus-（ＤＮＡポリメラーゼ；東洋紡社製）、Dpn I（制限酵素；ニューイングランドバイオラボ社製）、Competent high DH5α（大腸菌コンピテントセル；東洋紡社製）、ヘモグロビンB-テスト ワコー（ヘモグロビン濃度測定用キット；和光純薬工業社製）。Examples are shown below, but the present invention is not limited to the following examples. In this example, reagents and enzymes from the following manufacturers were used.
Potassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries), potassium monohydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries), DA-67 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), peroxidase (manufactured by Toyobo), MOPS (Dojindo Laboratories) ), Dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), potassium iodate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), Luria-Bertani miller medium (LB medium) (manufactured by Becton Dickinson), KOD-plus- (DNA polymerase) Toyobo), Dpn I (restriction enzyme; New England Biolab), Competent high DH5α (Escherichia coli competent cell; Toyobo), hemoglobin B-test Wako (hemoglobin concentration measurement kit; Wako Pure Chemical Industries) Made).
〔実施例1〕 部位特異的アミノ酸置換導入による糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の造成
寄託番号FERM BP-11026として寄託されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9発現大腸菌株XL1-Blue MRF'株を、50mg/L アンピシリンを含有したLB培地 3mLに植菌し、37℃で終夜振盪培養した。培養液を8,000 rpm、2分間遠心分離することにより菌体を集めた。得られた菌体から、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9を発現する、配列番号36で表わされる塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-9を抽出した。Example 1 Construction of Protein Having Glycated Hemoglobin Oxidase Activity by Site-Specific Amino Acid Substitution Introduction Derived Glycation Peptide Oxidase FPOX-9 Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ Strain Deposited as Deposit No. The cells were inoculated into 3 mL of LB medium containing / L ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. The cells were collected by centrifuging the culture at 8,000 rpm for 2 minutes. From the obtained cells, using Promega's "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification", expressing the glycosylated peptide oxidase FPOX-9 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 An expression plasmid pTrc-FPOX-9 containing DNA consisting of
国際公開公報2010/041715号パンフレットに記載された方法を用いて、pTrc-FPOX-9から、配列番号35で表わされる塩基配列からなるDNAを含むpTrc-FPOX-15を作製し、これを大腸菌DH5α株に形質転換することにより、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15発現大腸菌株を作製した。当該菌株を、50mg/L アンピシリンを含有したLB培地 3 mLに植菌し、37℃で終夜振盪培養した。培養液を8,000 rpmで2分間遠心分離することにより、菌体を集めた。得られた菌体から、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用してFPOX-15発現プラスミドpTrc-FPOX-15を抽出した。 Using the method described in WO 2010/041715 pamphlet, from pTrc-FPOX-9, to produce pTrc-FPOX-15 containing DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, this is Escherichia coli DH5α By transforming the strain, an Escherichia coli strain expressing glycated peptide oxidase FPOX-15 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was prepared. The strain was inoculated into 3 mL of LB medium containing 50 mg / L ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. Cells were collected by centrifuging the culture at 8,000 rpm for 2 minutes. The FPOX-15 expression plasmid pTrc-FPOX-15 was extracted from the obtained cells using "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification" manufactured by Promega.
pTrc-FPOX-15をテンプレートDNAとし、変異の標的とするアミノ酸のコドンを、置換するアミノ酸に対応するコドンに入れ替えたプライマー、及び、東洋紡社製PCR用キットDNA polymerase「KOD-plus」を用いて、当該キットのプロトコルに基づき、以下の試薬組成及びPCR条件の下でPCRを行い、PCR産物(変異を含む発現プラスミド)を得た。なお、PCR反応においては、テンプレートDNA、フォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ、反応液中の濃度が1〜2 mg/L、0.3μmol/L及び0.3μmol/Lとなる濃度で用いた。 Using pTrc-FPOX-15 as a template DNA, a primer in which the codon of the amino acid to be mutated was replaced with a codon corresponding to the amino acid to be replaced, and Toyobo's PCR DNA polymerase `` KOD-plus '' Based on the protocol of the kit, PCR was performed under the following reagent composition and PCR conditions to obtain a PCR product (expression plasmid containing a mutation). In the PCR reaction, the template DNA, the forward primer and the reverse primer were used at a concentration of 1 to 2 mg / L, 0.3 μmol / L and 0.3 μmol / L in the reaction solution, respectively.
（試薬組成）
・反応バッファー
・テンプレートDNA 1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー 0.3 μmol/L
・リバースプライマー 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
(PCR条件)
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 10分(Reagent composition)
・ Reaction buffer ・ Template DNA 1-2 ng / μL
・ Forward primer 0.3 μmol / L
・ Reverse primer 0.3 μmol / L
・ DNTP mixture 0.2 mmol / L each
・ MgSO 4 1 mmol / L
・ DNA polymerase 0.02 U / μL
・ The volume was adjusted to 50 μL by adding sterile water.
(PCR conditions)
1. 94 ° C for 2 minutes
2. 98 ℃ 15 seconds
3. 60 ℃ 30 seconds
4. 68 ° C for 6 minutes
5. Repeat 2 to 4 (30 cycles in total)
6. 68 ° C for 10 minutes
PCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μLを添加し、37℃、1時間インキュベートすることでテンプレートDNAを分解した。当該制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて精製し、一部試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用してプラスミドを抽出し、DNAシークエンサーで配列解析することにより、目的としたアミノ酸置換が導入されたクローンを選択した。配列解析には、pTrc99aベクター（4,176-bp、ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号69、70でそれぞれ表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー及び、配列番号35で表わされる塩基配列を有するFPOX-15の塩基配列のうち530〜548番目の塩基配列である、配列番号71で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマーを使用した。 1 μL of “Restriction enzyme Dpn I” manufactured by New England Biolab was added to 50 μL of the PCR product, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour to decompose the template DNA. The PCR product treated with the restriction enzyme was purified using Promega's "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System", and a portion of the sample was used to transform E. coli competent cells "Competent high DH5α" manufactured by Toyobo. did. Colonies grown on LB agar medium containing 50 mg / L ampicillin were selected, plasmids were extracted using Promega's Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification, and sequence analysis was performed using a DNA sequencer. A clone into which the amino acid substitution described above was introduced was selected. For sequence analysis, a primer having a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 70, which reflects the nucleotide sequence immediately before or immediately after the multiple cloning site of the pTrc99a vector (4,176-bp, manufactured by GE Healthcare Bioscience) In addition, a primer having a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 71, which is the 530th to 548th nucleotide sequence in the nucleotide sequence of FPOX-15 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, was used.
上記の方法により、pTrc-FPOX-15発現プラスミドに、表１に示す各部位特異的アミノ酸置換を導入し、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを造成した。No.1〜19のそれぞれの部位特異的アミノ酸置換は、併記した配列番号で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を使用して実施した。 By the above-mentioned method, each site-specific amino acid substitution shown in Table 1 was introduced into the pTrc-FPOX-15 expression plasmid to construct glycated hemoglobin oxidase. The site-specific amino acid substitution of each of Nos. 1 to 19 was carried out using a primer pair having a DNA consisting of the base sequence represented by the SEQ ID NO.
pTrc-FPOX-15に表１のNo.1〜4の部位特異的アミノ酸置換を段階的に導入することにより、配列番号3で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Aを発現するプラスミドpTrc-FPOX-18Aを造成した。pTrc-FPOX-18Aには、配列番号37で表わされる、FPOX-18Aをコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。pTrc-FPOX-15に表１のNo.1〜3及びNo.5の部位特異的アミノ酸置換を段階的に導入することにより、配列番号4で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18B発現プラスミドpTrc-FPOX-18Bを造成した。pTrc-FPOX-18Bには、配列番号38で表わされる、FPOX-18Bをコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。pTrc-FPOX-18Bに表１のNo.6の部位特異的アミノ酸置換を導入することにより、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18C発現プラスミドpTrc-FPOX-18Cを造成した。pTrc-FPOX-18Cには、配列番号39で表わされる、FPOX-18Cをコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。pTrc-FPOX-18Bに表１のNo.7の部位特異的アミノ酸置換を導入することにより、配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18D発現プラスミドpTrc-FPOX-18Dを造成した。pTrc-FPOX-18Dには、配列番号40で表わされる、FPOX-18Dをコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。pTrc-FPOX-18Dに表１のNo.8の部位特異的アミノ酸置換を導入することにより、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19発現プラスミドpTrc-FPOX-19を造成した。pTrc-FPOX-19には、配列番号41で表わされる、FPOX-19をコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。pTrc-FPOX-19に表１のNo.9の部位特異的アミノ酸置換を導入することにより、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-20発現プラスミドpTrc-FPOX-20を造成した。pTrc-FPOX-20には、配列番号42で表わされる、FPOX-20をコードする塩基配列からなるDNAが含まれている。 By introducing stepwise site-specific amino acid substitutions of Nos. 1-4 in Table 1 into pTrc-FPOX-15, plasmid pTrc-FPOX- expressing FPOX-18A having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 18A was created. pTrc-FPOX-18A contains DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-18A represented by SEQ ID NO: 37. By introducing stepwise site-specific amino acid substitutions of Nos. 1-3 and No. 5 in Table 1 into pTrc-FPOX-15, the FPOX-18B expression plasmid pTrc- having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 was introduced. FPOX-18B was created. pTrc-FPOX-18B contains a DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-18B represented by SEQ ID NO: 38. By introducing the site-specific amino acid substitution of No. 6 in Table 1 into pTrc-FPOX-18B, an FPOX-18C expression plasmid pTrc-FPOX-18C having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 was constructed. pTrc-FPOX-18C contains a DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-18C represented by SEQ ID NO: 39. By introducing the site-specific amino acid substitution of No. 7 in Table 1 into pTrc-FPOX-18B, an FPOX-18D expression plasmid pTrc-FPOX-18D having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 was constructed. pTrc-FPOX-18D contains a DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-18D represented by SEQ ID NO: 40. By introducing the site-specific amino acid substitution of No. 8 in Table 1 into pTrc-FPOX-18D, an FPOX-19 expression plasmid pTrc-FPOX-19 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 was constructed. pTrc-FPOX-19 contains a DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-19 represented by SEQ ID NO: 41. By introducing the site-specific amino acid substitution of No. 9 in Table 1 into pTrc-FPOX-19, an FPOX-20 expression plasmid pTrc-FPOX-20 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 was constructed. pTrc-FPOX-20 contains DNA consisting of the nucleotide sequence encoding FPOX-20 represented by SEQ ID NO: 42.
さらに、pTrc-FPOX-19をテンプレートとし、表２に記載されるように、表１のNo.10〜19の部位特異的変異を組み合わせで段階的に導入、蓄積することにより、配列番号9〜34で表されるアミノ酸配列をそれぞれ有する変異体FPOX-21〜FPOX-46をコードする塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-21〜pTrc-FPOX-46の各プラスミドを造成した。 Furthermore, by using pTrc-FPOX-19 as a template and introducing and accumulating the site-specific mutations of Nos. 10 to 19 in Table 1 in combination as shown in Table 2, Each plasmid of expression plasmids pTrc-FPOX-21 to pTrc-FPOX-46 containing DNA comprising a nucleotide sequence encoding the mutant FPOX-21 to FPOX-46 having the amino acid sequence represented by 34 was constructed.
上記の32種類の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現プラスミド、すなわち、pTrc-FPOX-18A、pTrc-FPOX-18B、pTrc-FPOX-18C、pTrc-FPOX-18D、及び、pTrc-FPOX-19〜pTrc-FPOX-46の各プラスミドを大腸菌DH5α株に導入して形質転換し、形質転換体である各糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現大腸菌株を作製した。 The above 32 types of glycated hemoglobin oxidase expression plasmids, i.e., pTrc-FPOX-18A, pTrc-FPOX-18B, pTrc-FPOX-18C, pTrc-FPOX-18D, and pTrc-FPOX-19 to pTrc-FPOX-46 Were introduced into Escherichia coli DH5α strain for transformation to prepare Escherichia coli strains expressing glycated hemoglobin oxidase as transformants.
上記で得られた糖化ヘモグロビンオキシダーゼ発現大腸菌株のうち、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質発現大腸菌株を用い、国際公開第2010/041715号公報記載の糖化ペプチドオキシダーゼの発現、精製方法に従い、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを精製し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に使用した。
なお、精製糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける蛋白質濃度を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼが有するFADに基づき、以下の方法により決定した。Among the glycated hemoglobin oxidase-expressing E. coli strains obtained above, using FPOX-19, FPOX-20, FPOX-32 and FPOX-42 protein-expressing E. coli strains, glycated peptides described in WO 2010/041715 Glycated hemoglobin oxidase was purified according to oxidase expression and purification methods, and used in the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention.
The protein concentration in the purified glycated hemoglobin oxidase was determined by the following method based on the FAD of the glycated hemoglobin oxidase.
先ず、糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-CE（キッコーマン社製）を、10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)を用いて希釈し、0.7、1.4、2.8、5.6及び11.2 mg/mLの各濃度のFPOX-CE溶液を調製した。調製した各濃度のFPOX-CE溶液について、GEヘルスケア社製分光光度計「Ultrospec 2100 pro」を用いて452 nm（主波長）/600 nm（副波長）での吸光度を測定し、FPOX-CE濃度と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。次いで、試料として、前述のFPOX-CEの代わりに、精製糖化ヘモグロビンオキシダーゼを用いる以外は同様の方法により、精製蛋白質の吸光度を測定した。測定により得られた吸光度を前記の検量線に照らし合わせることにより、精製糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける蛋白質濃度を決定した。 First, glycated peptide oxidase FPOX-CE (manufactured by Kikkoman Corporation) was diluted using 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0), and the concentrations of 0.7, 1.4, 2.8, 5.6 and 11.2 mg / mL were diluted. An FPOX-CE solution was prepared. The absorbance at 452 nm (main wavelength) / 600 nm (subwavelength) of the prepared FPOX-CE solution of each concentration was measured using a spectrophotometer “Ultrospec 2100 pro” manufactured by GE Healthcare, and the FPOX-CE was measured. A calibration curve showing the relationship between concentration and absorbance was created. Next, as a sample, the absorbance of the purified protein was measured by the same method except that purified glycated hemoglobin oxidase was used instead of FPOX-CE described above. The protein concentration in the purified glycated hemoglobin oxidase was determined by comparing the absorbance obtained by the measurement with the above calibration curve.
〔実施例2〕本発明の糖化ヘモグロビン測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法とを用いる糖化ヘモグロビン測定方法との相関性
酵素として、実施例1で得られたFPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42を用いて、検体として、HPLC法（KO500法）及びヘモグロビン-SLS法によりHbA1c濃度が決定されているヒト血球由来溶血試料を用いて、以下の試薬及び測定手順により各試料に対する吸光度変化を測定した。なお、ヘモグロビン-SLS法によるヘモグロビン濃度の測定においては、ヘモグロビンB-テスト ワコー（和光純薬工業社製）を使用した。(Example 2) The glycated hemoglobin measurement method of the present invention, the correlation between the glycated hemoglobin measurement method using the HPLC method (KO500 method) and the hemoglobin-SLS method, FPOX-19 obtained in Example 1, as an enzyme, Using FPOX-20, FPOX-32 and FPOX-42, as a sample, using a human blood cell-derived hemolyzed sample whose HbA1c concentration has been determined by an HPLC method (KO500 method) and a hemoglobin-SLS method, The change in absorbance for each sample was measured by the measurement procedure. In the measurement of hemoglobin concentration by the hemoglobin-SLS method, hemoglobin B-test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液: ヒト血球由来溶血試料［ヘモグロビン濃度が10 mg/mLで、HPLC法（KO500法）とヘモグロビン-SLS法からHbA1c濃度が9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9、23.3 μmol/Lと値付けされているもの。］
E液: 5 g/L ヨウ素酸カリウム及び50%（v/v）アンヒトール20Nの水溶液
F液: 40mg/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼ(FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各変異体)の10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液(Activity measurement reagent)
Solution A: 0.1 mol / L MOPS buffer (pH6.8)
Solution B: 24 mmol / L DA-67 in DMF
Solution C: 1 kU / L peroxidase in 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) solution
Solution D: human blood cell-derived hemolyzed sample [haemoglobin concentration of 10 mg / mL, HbA1c concentration of 9.8, 11.1, 12.3, 13.3, 14.5, 15.4, 17.9, 23.3 μmol / h by HPLC method (KO500 method) and hemoglobin-SLS method What is priced as L. ]
Solution E: 5 g / L aqueous solution of potassium iodate and 50% (v / v) amphitol 20N
Solution F: 40 mg / mL glycated hemoglobin oxidase (FPOX-19, FPOX-20, FPOX-32 and FPOX-42 variants) 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) solution
(測定手順)
(i)D液40 μLにE液4 μLを混合し、37℃にて10分間インキュベートした。
(ii)A液10 mLにB液12.6 μL、C液 35 μLを添加した溶液を、1試料当たり190 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液40μL、F液20μLを加えて混合し、37℃で60分間反応させた。
全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。(Measurement procedure)
(i) 4 μL of solution E was mixed with 40 μL of solution D and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
(ii) A solution obtained by adding 12.6 μL of solution B and 35 μL of solution C to 10 mL of solution A, dispensing 190 μL per sample into each well of a 96-well microplate, and then mixing a solution of solution D and solution E 40 μL and 20 μL of the F solution were added, mixed, and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
Using a fully automatic microplate EIA analyzer (AP-96, manufactured by Kyowa Medex), absorbance Abs (before the reaction) and 660 nm after the reaction of the solution before the reaction at 660 nm (main wavelength) / 750 nm (secondary wavelength). Absorbance Abs (after the reaction) at (main wavelength) / 750 nm (sub wavelength ) was measured. The absorbance Abs ( before the reaction) was subtracted from the absorbance Abs (after the reaction) to obtain a reaction absorbance change Δ'Abs (reaction) .
HbA1c濃度が既知である２つのヒト血球由来溶血試料（ヘモグロビン濃度が10 mg/mLで、HbA1c濃度がそれぞれ9.82μmol/L、24.2μmol/Lである試料）を用いて同様の測定を行い、HbA1c濃度と反応吸光度変化Δ'Abs（反応）との間の関係を示す検量線を作成した。
各ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度変化Δ'Abs（反応）を前記の検量線に照らし合わせることにより、各ヒト血球由来溶血試料におけるHbA1c濃度を決定した。このようにして決定したHbA1c濃度を、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる対照法により決定されたHbA1c濃度と比較した。
The same measurement was performed using two human blood cell-derived hemolyzed samples having known HbA1c concentrations (samples having a hemoglobin concentration of 10 mg / mL and HbA1c concentrations of 9.82 μmol / L and 24.2 μmol / L, respectively). A calibration curve showing the relationship between the concentration and the change in reaction absorbance Δ'Abs (reaction) was created.
The HbA1c concentration in each human blood cell-derived hemolyzed sample was determined by comparing the change in reaction absorbance Δ'Abs (reaction) for each human blood cell-derived hemolyzed sample with the above calibration curve. The HbA1c concentration determined in this manner was compared with the HbA1c concentration determined by the control method using the HPLC method (KO500 method) and the hemoglobin-SLS method.
図１〜図４に示すように、本発明の測定方法により決定されたHbA1c濃度と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる対照法により決定されたHbA1c濃度との間に良好な相関性が認められた。従って、本発明の測定方法により、試料中のHbA1cを測定できることが分かった。 As shown in FIGS. 1 to 4, there is a good HbA1c concentration between the HbA1c concentration determined by the measurement method of the present invention and the HbA1c concentration determined by the control method using the HPLC method (KO500 method) and the hemoglobin-SLS method. Correlation was observed. Therefore, it was found that HbA1c in a sample can be measured by the measurement method of the present invention.
本発明により、糖尿病等の生活習慣病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定方法が提供される。 The present invention provides a method for measuring glycated hemoglobin, which is useful for diagnosing lifestyle-related diseases such as diabetes.
配列番号1−人工配列の説明：FPOX-15のアミノ酸配列
配列番号2−人工配列の説明：FPOX-9のアミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明：FPOX-18Aのアミノ酸配列
配列番号4−人工配列の説明：FPOX-18Bのアミノ酸配列
配列番号5−人工配列の説明：FPOX-18Cのアミノ酸配列
配列番号6−人工配列の説明：FPOX-18Dのアミノ酸配列
配列番号7−人工配列の説明：FPOX-19のアミノ酸配列
配列番号8−人工配列の説明：FPOX-20のアミノ酸配列
配列番号9−人工配列の説明：FPOX-21のアミノ酸配列
配列番号10−人工配列の説明：FPOX-22のアミノ酸配列
配列番号11−人工配列の説明：FPOX-23のアミノ酸配列
配列番号12−人工配列の説明：FPOX-24のアミノ酸配列
配列番号13−人工配列の説明：FPOX-25のアミノ酸配列
配列番号14−人工配列の説明：FPOX-26のアミノ酸配列
配列番号15−人工配列の説明：FPOX-27のアミノ酸配列
配列番号16−人工配列の説明：FPOX-28のアミノ酸配列
配列番号17−人工配列の説明：FPOX-29のアミノ酸配列
配列番号18−人工配列の説明：FPOX-30のアミノ酸配列
配列番号19−人工配列の説明：FPOX-31のアミノ酸配列
配列番号20−人工配列の説明：FPOX-32のアミノ酸配列
配列番号21−人工配列の説明：FPOX-33のアミノ酸配列
配列番号22−人工配列の説明：FPOX-34のアミノ酸配列
配列番号23−人工配列の説明：FPOX-35のアミノ酸配列
配列番号24−人工配列の説明：FPOX-36のアミノ酸配列
配列番号25−人工配列の説明：FPOX-37のアミノ酸配列
配列番号26−人工配列の説明：FPOX-38のアミノ酸配列
配列番号27−人工配列の説明：FPOX-39のアミノ酸配列
配列番号28−人工配列の説明：FPOX-40のアミノ酸配列
配列番号29−人工配列の説明：FPOX-41のアミノ酸配列
配列番号30−人工配列の説明：FPOX-42のアミノ酸配列
配列番号31−人工配列の説明：FPOX-43のアミノ酸配列
配列番号32−人工配列の説明：FPOX-44のアミノ酸配列
配列番号33−人工配列の説明：FPOX-45のアミノ酸配列
配列番号34−人工配列の説明：FPOX-46のアミノ酸配列
配列番号35−人工配列の説明：FPOX-15のDNA
配列番号36−人工配列の説明：FPOX-9のDNA
配列番号37−人工配列の説明：FPOX-18AのDNA
配列番号38−人工配列の説明：FPOX-18BのDNA
配列番号39−人工配列の説明：FPOX-18CのDNA
配列番号40−人工配列の説明：FPOX-18DのDNA
配列番号41−人工配列の説明：FPOX-19のDNA
配列番号42−人工配列の説明：FPOX-20のDNA
配列番号43−人工配列の説明：FPOX-21のDNA
配列番号44−人工配列の説明：FPOX-22のDNA
配列番号45−人工配列の説明：FPOX-23のDNA
配列番号46−人工配列の説明：FPOX-24のDNA
配列番号47−人工配列の説明：FPOX-25のDNA
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