JP6611305B2

JP6611305B2 - Removal target DNA removal method, DNA cassette, and expression vector

Info

Publication number: JP6611305B2
Application number: JP2015073224A
Authority: JP
Inventors: 直記房田
Original assignee: Kanagawa University
Current assignee: Kanagawa University
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2019-11-27
Anticipated expiration: 2035-03-31
Also published as: JP2016189761A

Description

本発明は、除去標的ＤＮＡの除去方法、ＤＮＡカセット、及び発現ベクターに関する。 The present invention relates to a removal target DNA removal method, a DNA cassette, and an expression vector.

従来より、宿主細胞のゲノム中の遺伝子破壊や、遺伝挿入を行う際には、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いて、遺伝子破壊や遺伝子挿入された宿主細胞を選択する手法が用いられてる。 Conventionally, when gene disruption or gene insertion in the genome of a host cell is performed, a method of selecting a host cell into which gene disruption or gene insertion has been performed using a marker gene such as a drug resistance gene has been used.

しかしながら、マーカー遺伝子ＤＮＡは、目的の形質転換体を選択した後は不要であり、マーカー遺伝子ＤＮＡが残ることにより、形質転換体の操作の妨げとなる場合がある。そこで、形質転換体を得た後に、このマーカー遺伝子ＤＮＡを取り除くために、部位特異的組換え酵素を用いることが知られている。 However, the marker gene DNA is not required after the target transformant is selected, and the marker gene DNA may remain, which may hinder the operation of the transformant. Therefore, it is known to use a site-specific recombinase in order to remove this marker gene DNA after obtaining a transformant.

部位特異的組換え酵素は、主に、チロシン型インテグラーゼと、セリン型インテグラーゼの２種類に分類される。 Site-specific recombinant enzymes are mainly classified into two types, tyrosine-type integrase and serine-type integrase.

チロシン型インテグラーゼは、組換え反応に宿主側の因子を必要とする、必要とする認識配列が長い等の操作性が低いという問題を有する。 Tyrosine-type integrase has a problem of low operability such as requiring a factor on the host side for the recombination reaction and requiring a long recognition sequence.

これに対し、セリン型インテグラーゼは、反応に宿主側の因子を必要としない、必要とする認識配列が短い等の、操作性において優れた性質を有することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。 On the other hand, serine-type integrase is known to have excellent properties in operability such as not requiring host-side factors for the reaction and a short recognition sequence required (for example, non-patented). Reference 1).

ＰａｕｌＣ．Ｍ．Ｆｏｇｇｅｔａｌ．，“ＮｅｗＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＰｈａｇｅＩｎｔｅｇｒａｓｅｓ”，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０１４；４２６（１５）：２７０３−２７１６Paul C.L. M.M. Fogg et al. , “New Applications for Page Integrates”, Journal of Molecular Biology, 2014; 426 (15): 2703-2716.

しかしながら、セリン型インテグラーゼは、操作性に優れた性質を有する一方で、確実にＤＮＡの除去ができるかが不明であり、セリン型インテグラーゼの操作性に優れた性質を有効に発揮したＤＮＡの除去系は未だに存在しなかった。そのため、ＤＮＡの除去を確実に行うことができ、かつ、操作性に優れた方法が求められていた。 However, while serine-type integrase has excellent operability, it is unclear whether DNA can be removed with certainty, and DNA that has effectively demonstrated the excellent operability of serine-type integrase. The removal system still did not exist. Therefore, there has been a demand for a method that can reliably remove DNA and that is excellent in operability.

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、確実性が高く、かつ、操作性に優れた除去標的ＤＮＡの除去方法、このような除去標的ＤＮＡの除去方法に適したＤＮＡカセット、及び発現ベクターを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and has a high reliability and excellent operability. A method for removing a removal target DNA, a DNA cassette suitable for such a removal target DNA removal method, And it aims at providing an expression vector.

本発明者らは、宿主細胞におけるゲノムＤＮＡ中の除去標的ＤＮＡの除去に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を用いることで、確実性が高い除去標的ＤＮＡの除去を可能とし、操作性において優れることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。 The present inventors can remove the removal target DNA with high certainty by using a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 for removal of the removal target DNA in the genomic DNA in the host cell. As a result, the present invention has been completed. More specifically, the present invention provides the following.

（１） φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する、除去標的ＤＮＡの除去方法。 (1) A host cell having a region in genomic DNA that includes two recognition sequences recognized by a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences. A method for removing a removal target DNA, comprising an expression step of introducing an expression vector having DNA encoding the site-specific recombinant enzyme and expressing the site-specific recombinant enzyme in the host cell.

（２）前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、（１）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ (2) One of the two recognition sequences is the DNA according to any one of the following (a) to (c), and the other is any one of the following (d) to (f) The method for removing a removal target DNA according to (1), wherein
(A) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(C) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(D) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(E) DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions
(F) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2

（３）前記発現工程の前に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞を得る工程を更に有する、（１）又は（２）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (3) Prior to the expression step, a region containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 and a removed target DNA sandwiched between the two recognition sequences is genomic DNA. The method for removing a removal target DNA according to (1) or (2), further comprising a step of obtaining a host cell contained therein.

（４）前記宿主細胞を得る工程は、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと前記領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを前記宿主細胞に導入する工程と、
前記ターゲティングベクターの導入後に、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが前記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第１の選択工程とを含み、
前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記ターゲティングベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有し、
前記第１の選択工程は、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われる、（３）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (4) The step of obtaining the host cell includes the step of introducing into the host cell a targeting vector constructed so that the recombinant target gene DNA and the region in the genomic DNA of the host cell can be recombined;
After the introduction of the targeting vector, a first selection step of selecting a host cell in which the recombinant target gene DNA in the genomic DNA of the host cell has been recombined into the region,
The removal target DNA is a first marker gene DNA,
The targeting vector has a second marker gene DNA different from the first marker gene DNA,
The removal method of the removal target DNA according to (3), wherein the first selection step is performed using the first marker gene DNA and the second marker gene DNA as indices.

（５）前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、スクロース致死性遺伝子ＤＮＡである、（４）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (5) The removal target DNA removal method according to (4), wherein the second marker gene DNA is sucrose lethality gene DNA.

（６）前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記発現ベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第３のマーカー遺伝子ＤＮＡとを有し、
前記除去標的ＤＮＡの除去方法は、前記発現工程後に、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として、前記ゲノムＤＮＡ中における前記除去標的ＤＮＡが除去された前記宿主細胞を選択する第２の選択工程を更に有する、（１）から（５）のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (6) The removal target DNA is a first marker gene DNA,
The expression vector has the first marker gene DNA and a third marker gene DNA different from the first marker gene DNA,
In the removal target DNA removal method, after the expression step, the host cell from which the removal target DNA has been removed in the genomic DNA using the first marker gene DNA and the third marker gene DNA as an index is used. The method for removing a removal target DNA according to any one of (1) to (5), further comprising a second selection step of selecting.

（７）前記宿主細胞は、細菌細胞である、（１）から（６）のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (7) The removal target DNA removal method according to any one of (1) to (6), wherein the host cell is a bacterial cell.

（８）前記細菌細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞である、（７）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (8) The removal target DNA removal method according to (7), wherein the bacterial cell is a cell of Rubrivax gelatinosus.

（９）前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡであり、
前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡは、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡである、（７）又は（８）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。 (9) The first marker gene DNA is kanamycin resistance gene DNA,
The removal target DNA removal method according to (7) or (8), wherein the third marker gene DNA is streptomycin resistance gene DNA.

（１０） φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子ＤＮＡとを含む領域を有する、ＤＮＡカセットであって、
前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、ＤＮＡカセット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ (10) A DNA cassette having a region comprising two recognition sequences recognized by a site-specific recombinase derived from φK38-1 and a marker gene DNA sandwiched between the two recognition sequences,
Of the two recognition sequences, one is the DNA described in any of (a) to (c) below, and the other is the DNA described in any of (d) to (f) below. A DNA cassette.
(A) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(C) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(D) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(E) DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions
(F) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2

（１１）前記マーカー遺伝子ＤＮＡが、配列番号３に記載の塩基配列を有する、（１０）に記載のＤＮＡカセット。 (11) The DNA cassette according to (10), wherein the marker gene DNA has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

（１２） φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡと、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有する発現ベクター。 (12) An expression vector comprising DNA encoding a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1, a kanamycin resistance gene DNA, and a streptomycin resistance gene DNA.

本発明によれば、確実性が高く、かつ、操作性に優れた除去標的ＤＮＡの除去方法、このような除去標的ＤＮＡの除去方法に適したＤＮＡカセット、及び発現ベクターを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a removal target DNA removal method having high certainty and excellent operability, a DNA cassette suitable for such removal target DNA removal method, and an expression vector.

ｐＪＰＣＳＫφのプラスミドマップを示す図である。It is a figure which shows the plasmid map of pJP CSKphi. ａｔｔＢ及びａｔｔＰのそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。（ａ）は、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。（ｂ）は、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。It is a figure which shows the base sequence of a DNA fragment with a sticky end of each of attB and attP. (A) shows the base sequence of a DNA fragment with a sticky end of attB. (B) shows the base sequence of a DNA fragment with a sticky end of attP. ｐＪＰＣＳＫφの塩基配列のうち、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットのアタッチメントサイト周辺の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of the attachment site of an attB-KmR-attP cassette among the base sequences of pJP CSKφ. 本発明の実施例に係るターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘの作製の流れを示す図である。（ａ）は、標的遺伝子Ｘの上流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ａ」）及び下流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ｂ」）が組み込まれる前のｐＪＰＣＳＫφを示し、（ｂ）は、標的遺伝子Ｘの上流域Ａ及び下流域Ｂが組み込まれたターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘを示す。It is a figure which shows the flow of preparation of targeting vector pJP CSK (phi) X which concerns on the Example of this invention. (A) shows pJP CSKφ before incorporation of about 1 kbp upstream region (“A” in FIG. 4) and about 1 kbp downstream region (“B” in FIG. 4) of target gene X, (b) The targeting vector pJP CSKφΔX in which the upstream region A and the downstream region B of the target gene X are incorporated is shown. ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み替えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株作製の流れを示す図である。（ａ）は、ターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘを示し、（ｂ）は、２回組換え体のゲノムの組換えられた領域周辺を示す。It is a figure which shows the flow of creation of the disrupted strain of Rubrivax gelatinosus in which the target gene X in the genome has been recombined. (A) shows the targeting vector pJP CSKφΔX, and (b) shows the region around the recombined region of the genome of the twice recombinant. 本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５のプラスミドマップを示す図である。It is a figure which shows the plasmid map of expression vector phiK38Int-pJRD215 which concerns on the Example of this invention. 本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５をＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株に形質転換した後に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の塩基配列中の上流側と下流側のプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行った後のＰＣＲ産物についての、電気泳動の画像を示す図である。After transforming the expression vector phiK38Int-pJRD215 according to the example of the present invention into a target gene X-disrupted strain of Rubrivax gelatinosus, upstream and downstream of the base sequence of the site-specific recombinase derived from φK38-1 It is a figure which shows the image of the electrophoresis about the PCR product after performing colony PCR using a primer. 本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株に形質転換し、宿主細胞中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させ、該部位特異的組換え酵素により、破壊株ゲノム中の除去標的遺伝子ＤＮＡであるカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する流れを示す図である。An expression vector phiK38Int-pJRD215 according to an example of the present invention was transformed into a disrupted strain of Rubrivax gelatinosus in which a target gene X in the genome was recombined, and a site-specific recombinase derived from φK38-1 was transformed into a host cell. It is a figure which shows the flow which is made to express and the kanamycin resistance gene DNA which is the removal target gene DNA in a destruction strain genome is removed by this site-specific recombination enzyme. Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノム中の標的遺伝子Ｘの周辺のプライマーペア（標的遺伝子Ｘより上流側に位置する上流域のプライマーと、標的遺伝子Ｘより下流側に位置する下流域のプライマー）によりＰＣＲを行った後のＰＣＲ産物についての、電気泳動の画像を示す図である。（１）は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（２）は、１回組換え体についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（３）は、２回組換え体についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（４）は、発現ベクターの形質転換後のＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓについてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドである。After performing PCR with a primer pair around the target gene X (upstream primer located upstream from the target gene X and downstream primer located downstream from the target gene X) in the genome of Rubrivax gelatinosus It is a figure which shows the image of the electrophoresis about PCR product of. (1) is the band after electrophoresis of the PCR product for the wild type of Rubrivax gelatinosus, (2) is the band after electrophoresis of the PCR product for the single recombinant, (3) The band after electrophoresis of the PCR product for the recombinant twice, (4) is the band after electrophoresis of the PCR product for Rubrivax gelatinosus after transformation of the expression vector.

以下、本発明の実施形態を説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。 Hereinafter, although embodiment of this invention is described, this invention is not limited to these.

＜除去標的ＤＮＡの除去方法＞
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、宿主細胞内において部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する。本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、これにより、ＤＮＡの除去をより確実に行うことができ、かつ、操作性において優れる。 <Method for removing target DNA to be removed>
According to the removal target DNA removal method of the present invention, a region containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombinase derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences is genomed. An expression step of introducing an expression vector having a DNA encoding a site-specific recombinant enzyme into a host cell contained in the DNA and expressing the site-specific recombinant enzyme in the host cell is provided. The removal target DNA removal method of the present invention can thereby remove DNA more reliably and is excellent in operability.

［発現工程］
本発明における発現工程は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、宿主細胞内において部位特異的組換え酵素を発現させる工程である。 [Expression process]
The expression step in the present invention has a region in genomic DNA containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences. In this step, an expression vector having DNA encoding a site-specific recombinant enzyme is introduced into the host cell, and the site-specific recombinant enzyme is expressed in the host cell.

（部位特異的組換え酵素）
本発明における部位特異的組換え酵素は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素である。φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素は、例えば、配列番号４に記載された塩基配列のＤＮＡによりコードされた部位特異的組換え酵素を用いることができる。ただし、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡは、これに特に限定されず、例えば、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の機能を損なわない程度に変異・欠失等されたものを用いることができるが、例えば、配列番号４に記載された塩基配列に対して、９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズできる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。 (Site-specific recombinase)
The site-specific recombinant enzyme in the present invention is a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1. As the site-specific recombination enzyme derived from φK38-1, for example, a site-specific recombination enzyme encoded by DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 4 can be used. However, the DNA encoding the site-specific recombinase is not particularly limited to this. For example, DNA that has been mutated or deleted to such an extent that the function of the site-specific recombinase derived from φK38-1 is not impaired. For example, 90% or more (preferably 92% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 99% or more) of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 And DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the like. Examples of “stringent conditions” capable of hybridizing with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 include, for example, 40 to 70 ° C. (preferably 50 to 67 ° C., in a normal hybridization buffer). More preferably, the reaction is carried out at 60 to 65 ° C., and the washing is performed in a washing solution having a salt concentration of 15 to 300 mM (preferably 15 to 150 mM, more preferably 15 to 60 mM, still more preferably 30 to 50 mM). Is mentioned.

（認識配列）
本発明における認識配列は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される。 (Recognition sequence)
The recognition sequence in the present invention is recognized by a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1.

上記認識配列は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識されるものであり、塩基配列が短いものであり、具体的には、１５０ｂｐ以下の長さの塩基配列を有する。認識配列は、１５０ｂｐ以下であれば、特に限定されない。ここで、認識配列が短いと、コドンを揃い、プライマーを設計しやすい等、様々な操作を行いやすいため、短いものが好ましい。他方で、認識配列が短いと、操作性においては優れている一方で、部位特異的組換え酵素により認識しにくくなるため、ＤＮＡの除去効率が低くなることが予想される。しかしながら、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法によると、認識配列が短くしたとしても、確実性の高い除去が行われる。このような観点で、確実性の高い除去を行いつつ、操作性に優れることから、認識配列は短い方が好ましく、より具体的には、５０ｂｐ以下が好ましく、４０ｂｐ以下がより好ましく、３０ｂｐ以下が更に好ましく、２０ｂｐ以下が最も好ましい。 The above recognition sequence is recognized by a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1, has a short base sequence, and specifically has a base sequence having a length of 150 bp or less. The recognition sequence is not particularly limited as long as it is 150 bp or less. Here, if the recognition sequence is short, it is easy to perform various operations such as codon alignment and easy primer design. On the other hand, if the recognition sequence is short, the operability is excellent, but it is difficult to recognize by the site-specific recombinase, so that the DNA removal efficiency is expected to be low. However, according to the removal target DNA removal method of the present invention, highly reliable removal is performed even if the recognition sequence is shortened. From this point of view, the recognition sequence is preferably shorter because it is excellent in operability while performing removal with high reliability. More specifically, the recognition sequence is preferably 50 bp or less, more preferably 40 bp or less, and 30 bp or less. More preferred is 20 bp or less.

本発明における２つの認識配列の具体例としては、例えば、一方が、配列番号１に記載された配列であり、他方が配列番号２に記載された配列である場合が挙げられる。また、配列番号１の代わりに、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。また、配列番号２の代わりに、配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。配列番号１又は２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズできる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。 Specific examples of the two recognition sequences in the present invention include, for example, the case where one is the sequence described in SEQ ID NO: 1 and the other is the sequence described in SEQ ID NO: 2. Further, in place of SEQ ID NO: 1, a DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, or a base sequence described in SEQ ID NO: 1 and 90 DNA having a base sequence having a homology of at least% (preferably at least 92%, more preferably at least 95%, still more preferably at least 99%) can be used. Further, instead of SEQ ID NO: 2, DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and 90 % Or more (preferably 92% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 99% or more). Examples of “stringent conditions” capable of hybridizing with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 include, for example, 40 to 70 ° C. (preferably 50 to 67) in a normal hybridization buffer. , More preferably 60 to 65 ° C., and washing is performed in a washing solution having a salt concentration of 15 to 300 mM (preferably 15 to 150 mM, more preferably 15 to 60 mM, still more preferably 30 to 50 mM). The conditions to perform are mentioned.

特に、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法において、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを用いた場合、上記の配列番号１又は２に記載された塩基配列や、配列番号１又は２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有するＤＮＡを認識配列として用いることで、より確実にＤＮＡの除去が可能となるため、好ましい。 In particular, in the removal target DNA removal method of the present invention, when Rubrivax gelatinosus is used as a host cell, it is complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 above or the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 A DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a specific base sequence, or a DNA having 90% or more homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2, This is preferable because DNA can be removed more reliably.

（除去標的ＤＮＡ）
本発明における「除去標的ＤＮＡ」は、宿主細胞内において本発明における部位特異的組換え酵素が発現することで、該部位特異的組換え酵素により、宿主細胞のゲノムＤＮＡから除去されるＤＮＡである。 (Removal target DNA)
The “removed target DNA” in the present invention is DNA that is removed from the genomic DNA of the host cell by the site-specific recombinant enzyme when the site-specific recombinant enzyme in the present invention is expressed in the host cell. .

除去標的ＤＮＡは、特に限定されず、目的や、本発明における各工程における条件に応じて適宜選択することができるが、代表的なものとして、マーカー遺伝子ＤＮＡが挙げられる。 The target DNA to be removed is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose and the conditions in each step of the present invention. A typical example is marker gene DNA.

マーカー遺伝子ＤＮＡは、特に限定されず、目的、検出手段、後述の第２の選択工程等を考慮した上で、従来の公知のものを適宜選択することができる。マーカー遺伝子ＤＮＡとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。 The marker gene DNA is not particularly limited, and a conventionally known one can be appropriately selected in consideration of the purpose, detection means, second selection step described later, and the like. Examples of the marker gene DNA include DNAs such as drug resistance genes, fluorescent protein genes, genes of enzymes that catalyze luminescence and color reactions, and lethal genes. Examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene and the like. Examples of the fluorescent protein gene include a green fluorescent protein (GFP) gene and a red fluorescent protein gene. Examples of genes for enzymes that catalyze luminescence and color reactions include luciferase genes and β-glucuronidase genes. As the lethal gene, lethal genes of various host cells can be used, and examples thereof include a sucrose lethal gene and a colicin E1 gene.

除去標的ＤＮＡは、特に、確実性が高く、操作性に優れることから、配列番号３に記載された塩基配列を有するカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。 Since the removal target DNA has high reliability and excellent operability, it is preferable to use kanamycin resistance gene DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 3.

（宿主細胞）
本発明の発現工程における宿主細胞は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域（以下、本明細書において、「除去標的領域」ということある。）をゲノムＤＮＡ中に有する。このような宿主細胞であれば、種類は特に限定されないが、例えば、微生物細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。これらのうち、操作性に優れることから、微生物細胞を用いることが好ましい。宿主細胞は、目的に応じて適宜選択することができる。また、宿主細胞の種類に応じて、後述する第１の選択工程や、第２の選択工程の方法（例えば、培養方法、形質転換の方法、マーカー遺伝子の種類等）を、選択することができる。 (Host cell)
The host cell in the expression process of the present invention is a region containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombinase derived from φK38-1 and a removed target DNA sandwiched between the two recognition sequences (hereinafter referred to as “the recognition target DNA”). In this specification, it is referred to as “removed target region”) in genomic DNA. If it is such a host cell, a kind will not be specifically limited, For example, a microbial cell, a plant cell, an animal cell etc. can be used. Of these, microbial cells are preferably used because of their excellent operability. Host cells can be appropriately selected according to the purpose. Further, depending on the type of the host cell, a method of the first selection step or the second selection step described later (for example, a culture method, a transformation method, a marker gene type, etc.) can be selected. .

微生物細胞としては、細菌細胞、酵母、菌類の細胞等が挙げられる。これらのうち、操作性に優れることから、細菌細胞を用いることが好ましい。 Examples of the microbial cells include bacterial cells, yeasts, and fungal cells. Of these, it is preferable to use bacterial cells because of their excellent operability.

細菌細胞としては、特に限定されず、光合成細菌（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ等）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ等）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ等）、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ属（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍｔｅｐｉｄｕｍ等））、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられるが、これらのうち、光合成細菌は、特に本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に適していることから、好ましい。また、光合成細菌は、特に限定されず、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に適していることから、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属を用いることが好ましい。Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属は、特に限定されないが、認識配列として上記の配列番号１又は２に記載の塩基配列を用いた場合に、より確実にＤＮＡの除去ができることから、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。 Bacterial cells, not particularly limited, photosynthetic bacteria (Rubrivivax genus (Rubrivivax gelatinosus etc.), Rhodobacter sp (Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides and the like), Rhodococcus sp (Rhodococcus erythropolis, etc.), Chlorobaculum genus (Chlorobaculum tepidum, etc.)), Streptomyces Examples include Streptomyces genus, Mycobacterium genus, Corynebacterium genus etc., Escherichia coli (Escherichia genus), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), etc. Among these, photosynthetic bacteria are particularly methods for removing the removal target DNA of the present invention. Because it is suitable, it preferred. The photosynthetic bacterium is not particularly limited and is preferably used in the genus Rubrivivax because it is suitable for the removal target DNA removal method of the present invention. The genus Rurivivax is not particularly limited, but it is preferable to use cells of Rurivivax gelatinosus because DNA can be removed more reliably when the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is used as a recognition sequence.

酵母細胞は、特に限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等の細胞が上げられる。 Yeast cells are not particularly limited, but Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans, Yarrowia lipolytica, Kluyveromys, Kluyveromyc cells.

植物細胞としては、特に限定されないが、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの菌株Ｃ５８、ＧＶ２２６０、ＬＢＡ４４０４等が挙げられる。 Although it does not specifically limit as a plant cell, Strains C58, GV2260, LBA4404, etc. of Rhizobium radiobacter are mentioned.

動物細胞としては、特に限定されないが、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３等）、両生類細胞（アフリカツメガエル卵母細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨｉｇｈＦｉｖｅ、Ｓ２、Ｔｎ５等）等が挙げられる。 Although it does not specifically limit as an animal cell, A mammalian cell (HEK293, CHO, COS, 3T3 etc.), an amphibian cell (Xenopus oocyte etc.), an insect cell (Sf9, Sf21, High Five, S2, Tn5 etc.), etc. Is mentioned.

宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における上記領域は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを有すれものであれば、特に限定されないが、例えば、後述するＤＮＡカセットが好適である。 The above region in the genomic DNA of the host cell has two recognition sequences recognized by a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences. If it exists, it will not specifically limit, For example, the DNA cassette mentioned later is suitable.

（発現ベクター）
本発明の発現工程における発現ベクターは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有するものであれば、特に限定されない。なお、「φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクター」とは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素が、宿主細胞内において発現可能に構築されたものであり、宿主細胞内において発現可能となるように、上流側にプロモーター配列を有するものである。プロモーターは、宿主細胞内において発現できるようなものであれば、特に限定されず、宿主の種類に応じて、公知のプロモーターを用いることができる。 (Expression vector)
The expression vector in the expression step of the present invention is not particularly limited as long as it has a DNA encoding a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1. The “expression vector having a DNA encoding a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1” is constructed such that the site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 can be expressed in a host cell. It has a promoter sequence upstream so that it can be expressed in a host cell. The promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in the host cell, and a known promoter can be used depending on the type of the host.

発現ベクターの種類は、特に限定されず、宿主細胞や目的に応じて、公知の発現ベクターを用いることができる。例えば、細菌細胞用のベクターとしては、ｐＪＲＤ２１５、ｐＲＬ２５c、ｐＡＣＹＣ等に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡが発現可能に構築されたものを用いることができる。発現ベクターとしては、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いた場合、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡに加え、マーカー遺伝子ＤＮＡとして、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有することが好ましい。このように、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを含むことで、後述の第２の選択工程により発現工程後の宿主細胞を選択する際に、除去標的ＤＮＡの除去が行われた宿主細胞をより確実に選択することができ、すなわち、より確実なＤＮＡの除去が可能である。 The type of expression vector is not particularly limited, and a known expression vector can be used depending on the host cell and purpose. For example, as a vector for bacterial cells, pJRD215, pRL25c, pACYC or the like constructed by allowing DNA encoding a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 to be expressed can be used. As an expression vector, when a Rubrivax gelatinosus cell is used as a host cell, in addition to DNA encoding a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1, as a marker gene DNA, a kanamycin resistance gene DNA and a streptomycin resistance gene DNA It is preferable to have. Thus, by including the kanamycin resistance gene DNA and the streptomycin resistance gene DNA, the host in which the removal target DNA has been removed when selecting the host cell after the expression step in the second selection step described later. Cells can be selected more reliably, that is, more reliable DNA removal is possible.

（発現ベクターの宿主細胞への導入）
発現ベクターの宿主細胞への導入により、宿主細胞は形質転換される。導入方法は、宿主の種類に応じて、公知の方法を用いることができるが、例えば、接合、エレクトロポレーション法等により、導入することができる。 (Introduction of expression vector into host cell)
By introducing the expression vector into the host cell, the host cell is transformed. As the introduction method, a known method can be used depending on the type of the host, and for example, the introduction can be performed by conjugation, electroporation method or the like.

（φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現）
本発明における発現工程においては、発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内において該部位特異的組換え酵素を発現させる。発現する手段は、特に限定されず、宿主細胞の種類や、発現ベクター内の部位特異的組換え酵素のプロモーターの種類又は発現の機構に応じて、適宜選択される。例えば、ある宿主細胞内において、通常の培養条件で発現できるプロモーターを、発現ベクター内の部位特異的組換え酵素のプロモーターとして用いた場合、そのプロモーターとその宿主細胞を組み合わせて用いることにより、通常の宿主細胞の培養条件で発現させることができる。あるいは、発現誘導剤や、温度変化に応じて発現するプロモータを使用する場合、そのような条件下で培養すれば、部位特異的組換え酵素を発現させることができる。 (Expression of site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1)
In the expression step of the present invention, an expression vector is introduced into a host cell, and the site-specific recombinant enzyme is expressed in the host cell. The means for expression is not particularly limited, and is appropriately selected according to the type of host cell, the type of site-specific recombinase promoter in the expression vector, or the mechanism of expression. For example, when a promoter that can be expressed in a certain host cell under normal culture conditions is used as a site-specific recombinant enzyme promoter in an expression vector, the promoter and the host cell can be used in combination to It can be expressed under the culture conditions of the host cell. Alternatively, when an expression inducer or a promoter that is expressed in response to a temperature change is used, a site-specific recombinant enzyme can be expressed by culturing under such conditions.

このような培養の条件は、宿主細胞やプロモーターの条件に応じて、適宜変更されるが、例えば、宿主細胞として、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いた場合、ＰＹＳ培地（例えば、培地組成は、１Ｌあたり、ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のものを用いることができる（^ａＢａｓａｌＳａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎは、例えば、１ｌあたり、ＥＤＴＡ−３Ｎａ４．１２ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．１１ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２４．６５ｇ，ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ２．９４ｇ，ＮａＣｌ２３．４ｇ，Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ^ｂ１０ｍｌ（^ｂＴｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎは、例えば、５００ｍｌあたり、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ５．５８ｇ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．４４ｇ，Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ１．４６ｇ，ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１．２６ｇ，Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ１．２１ｇ，Ｈ_３ＢＯ_４１．５５ｇ，ＥＤＴＡ−３Ｎａ２０．６ｇを含むものを用いることができる）を含むものを用いることができる））により、２８〜３３℃で培養することで、発現させることができる。 The culture conditions are appropriately changed according to the conditions of the host cell and the promoter. For example, when a rivivivax gelatino cell is used as the host cell, the PYS medium (for example, the medium composition is about 1 L). , Yeast Extract 1 g, Polypeptone 5 g, Na-Succinate 5 g, Basal Salt Solution ^a 10 ml, pH 7.0 can be used ( ^a Basal Salt solution is, for example, EDTA-3Na 4 per liter. , FeSO ₄ · 7H ₂ O 1.11 g, MgSO ₄ · 7H ₂ O 24.65 g, CaCl ₂ · 2H ₂ O 2.94 g, NaCl 23.4 g, Trace element solution ^b 10 ml ( ^B Trace element solution is, for example, per 500 ml: MnSO ₄ .4H ₂ O 5.58 g, ZnSO ₄ .7H ₂ O 1.44 g, Co (NO ₃ ) ₂ .6H ₂ O 1.46 g, CuSO ₄ .5H ₂ O 1.26 g, Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O 1.21 g, H ₃ BO ₄ 1.55 g, and EDTA-3Na 20.6 g can be used). ) Can be expressed by culturing at 28 to 33 ° C.

［発現工程前の宿主細胞を得る工程］
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、発現工程の前に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域（上述の「除去標的領域」）をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞を得る工程（以下、本明細書において「宿主細胞を得る工程」ということがある。）を有してもよい。 [Step of obtaining host cell before expression step]
The removal target DNA removal method of the present invention comprises two recognition sequences recognized by a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences before the expression step. And a step of obtaining a host cell having a region containing the above (the above-mentioned “removed target region”) in the genomic DNA (hereinafter sometimes referred to as “a step of obtaining a host cell” in this specification). .

宿主細胞を得る工程は、特に限定されないが、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを宿主細胞に導入する工程と、ターゲティングベクターの導入後に、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが上記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第１の選択工程とを含むことができる。 The step of obtaining the host cell is not particularly limited, but a step of introducing a targeting vector recombined with the recombination target gene DNA and the removal target region in the genomic DNA of the host cell into the host cell, After the introduction, a first selection step of selecting a host cell in which the recombination target gene DNA in the genomic DNA of the host cell has been recombined into the region can be included.

（ターゲティングベクターを宿主細胞に導入する工程）
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法において、ターゲティングベクターを宿主細胞に導入することで、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とが組み換えられる。 (Step of introducing the targeting vector into the host cell)
In the removal target DNA removal method of the present invention, the recombination target gene DNA and the removal target region in the genomic DNA of the host cell are recombined by introducing the targeting vector into the host cell.

ターゲティングベクターは、宿主細胞に導入後に、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とが組み換え可能に構築されたものであり、除去標的領域を有するものである。ターゲティングベクターは、特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用して、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中の標的遺伝子ＤＮＡと、ターゲティングベクター中の除去標的領域とを組換え可能に構築される。相同組換え可能とするためには、例えば、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中において、標的遺伝子ＤＮＡより上流側に位置する上流域（例えば、８００〜１５００ｂｐ）、及び標的遺伝子ＤＮＡより下流側に位置する下流域（例えば、８００〜１５００ｂｐ）のそれぞれの領域と相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡを、ターゲティングベクター中の除去標的領域より上流側及び下流側にそれぞれ位置するように挿入してターゲティングベクターを構築することができる。 The targeting vector is constructed such that the recombinant target gene DNA and the removal target region in the genomic DNA of the host cell can be recombined after introduction into the host cell, and has the removal target region. Although a targeting vector is not specifically limited, For example, using homologous recombination, it constructs | assembles so that the target gene DNA in the genomic DNA of a host cell and the removal target area | region in a targeting vector can be recombined. In order to enable homologous recombination, for example, in the genomic DNA of the host cell, an upstream region (for example, 800 to 1500 bp) located upstream from the target gene DNA, and a lower region located downstream from the target gene DNA A targeting vector is constructed by inserting DNA having a base sequence having homology with each region of the basin (for example, 800 to 1500 bp) so that it is located upstream and downstream from the removed target region in the targeting vector. can do.

ターゲティングベクター中の除去標的領域は、上述のとおり、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域である。このターゲティングベクター中の除去標的領域に含まれる認識配列と、除去標的ＤＮＡは、それぞれ、上述の「発現工程」で述べたものと同様のものを用いる。特に、「除去標的ＤＮＡ」は、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞を選択するために、マーカー遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。 As described above, the removal target region in the targeting vector is a region containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences. It is. The recognition sequence contained in the removed target region in this targeting vector and the removed target DNA are the same as those described in the above “expression step”. In particular, as the “removed target DNA”, it is preferable to use a marker gene DNA in order to select a recombined host cell in the “first selection step” described later.

ターゲティングベクターの作製は、常法により行うことができるが、例えば、以下のような手順で構築することができる。まず、認識配列、及び、除去標的ＤＮＡのそれぞれのＤＮＡ断片を、ＰＣＲや化学合成、アニール等の手段を用いて作製し、その後、制限酵素処理、ライゲーション等を行うことで、除去標的領域を作製する。次いで、この除去標的領域を、ターゲティングベクターの元となるベクター（宿主細胞の種類によるが、例えば、細菌細胞を用いる場合、配列番号５や、配列番号６に記載された塩基配列を有するベクター、あるいは、ｐＪＰ５６０３，ｐＲＬ２７１等）に組み込む。このベクターを相同組換え可能なターゲティングベクターにするために、宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子ＤＮＡの上流域及び下流域をＰＣＲにより増幅し、そのＰＣＲ産物を、常法により（例えば、細菌細胞を用いる場合、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）等を用いることにより）、ターゲティングベクター中の除去標的領域の上流及び下流に組み込むことにより行う。このような方法で、ターゲティングベクターを作製することができる。 Although a targeting vector can be produced by a conventional method, for example, it can be constructed by the following procedure. First, each DNA fragment of the recognition sequence and the removal target DNA is prepared using means such as PCR, chemical synthesis, annealing, etc., and then the removal target region is prepared by performing restriction enzyme treatment, ligation, etc. To do. Next, this removal target region is used as a vector serving as a source of the targeting vector (depending on the type of host cell, for example, when bacterial cells are used, a vector having the base sequence described in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or PJP5603, pRL271, etc.). In order to make this vector a targeting vector capable of homologous recombination, the upstream region and downstream region of the target gene DNA in the genome of the host cell are amplified by PCR, and the PCR product is obtained by a conventional method (for example, bacterial cell When used, it is performed by incorporating In-Fusion (registered trademark) enzyme (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like, and upstream and downstream of the removal target region in the targeting vector. A targeting vector can be produced by such a method.

上述の、宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子ＤＮＡの上流域及び下流域が組み込まれる前の、ターゲティングベクターの元となるベクターに除去標的領域が組み込まれたベクターとしては、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）によるターゲティングベクターの作製に適していることから、除去標的領域として、後述の「ＤＮＡカセット」を含むことが好ましく、特に、除去標的領域のうち、除去標的ＤＮＡとして、配列番号３に記載された塩基配列を有するものが好ましい。このようなベクターの具体例としては、配列番号１５に記載された塩基配列を有するものが挙げられる。 As a vector in which the removal target region is incorporated in the vector that is the source of the targeting vector before the upstream region and the downstream region of the target gene DNA in the genome of the host cell are integrated, In-Fusion (registered trademark) Since it is suitable for the production of a targeting vector by an enzyme (manufactured by Takara Bio Inc.), it is preferable to include the “DNA cassette” described later as the removal target region, and in particular, as the removal target DNA, Those having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 are preferred. Specific examples of such vectors include those having the base sequence described in SEQ ID NO: 15.

ターゲティングベクターは、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するために、上記除去標的ＤＮＡとは異なる、マーカー遺伝子ＤＮＡを有することが好ましい。本明細書において、「第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ」は、マーカー遺伝子ＤＮＡである「除去標的ＤＮＡ」を指し、「第２のマーカー遺伝子ＤＮＡ」は、ターゲティングベクターが有する、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるマーカー遺伝子ＤＮＡを指す。 The targeting vector preferably has a marker gene DNA that is different from the removed target DNA in order to select the recombined host cells more reliably in the “first selection step” described later. In the present specification, “first marker gene DNA” refers to “removed target DNA” that is marker gene DNA, and “second marker gene DNA” refers to first marker gene DNA possessed by the targeting vector and Refers to different marker gene DNA.

第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるものであれば、特に限定されず、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。これらのうち、第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、致死遺伝子を用いることが好ましい。また、致死遺伝子のうち、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するために、スクロース致死性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。 The second marker gene DNA is not particularly limited as long as it is different from the first marker gene DNA. For example, drug resistance gene, fluorescent protein gene, gene of enzyme that catalyzes luminescence and color reaction, lethal gene And the like. Examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene and the like. Examples of the fluorescent protein gene include a green fluorescent protein (GFP) gene and a red fluorescent protein gene. Examples of genes for enzymes that catalyze luminescence and color reactions include luciferase genes and β-glucuronidase genes. As the lethal gene, lethal genes of various host cells can be used, and examples thereof include a sucrose lethal gene and a colicin E1 gene. Among these, it is preferable to use a lethal gene as the second marker gene DNA. Of the lethal genes, it is preferable to use sucrose lethal gene DNA in order to select the recombined host cells more reliably in the “first selection step” described later.

第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、ターゲティングベクターの元となるベクターに組み込んでもよく、あらかじめ第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有するベクターを用いてもよく、あるいは、ターゲティングベクターの作製後にこれに組み込んでもよい。 The second marker gene DNA may be incorporated into a vector serving as a source of the targeting vector, a vector having the second marker gene DNA in advance may be used, or may be incorporated into the targeting vector after preparation.

宿主細胞へのターゲティングベクターの導入は、常法により行うことができ、例えば、接合、エレクトロポレーション法等により導入することができる。 Introduction of the targeting vector into the host cell can be carried out by a conventional method, for example, by conjugation, electroporation or the like.

（第１の選択工程）
本発明における第１の選択工程は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが除去標的領域に組み換えられた宿主細胞を選択する工程である。 (First selection step)
The first selection step in the present invention is a step of selecting a host cell in which the recombinant target gene DNA in the genomic DNA of the host cell has been recombined into the removed target region.

宿主細胞の選択は、マーカー遺伝子ＤＮＡである除去標的ＤＮＡを指標として行うことができる。除去標的ＤＮＡを指標として行う選択は、マーカー遺伝子ＤＮＡの種類に応じで、常法により行うことができる。 The host cell can be selected using the removed target DNA, which is a marker gene DNA, as an index. The selection performed using the removed target DNA as an indicator can be performed by a conventional method depending on the type of the marker gene DNA.

宿主細胞の選択は、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するためには、上述のとおり、ターゲティングベクターが第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有し、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ（除去標的ＤＮＡ）及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われることが好ましい。 In selecting the host cell, in order to select the recombined host cell more reliably, as described above, the targeting vector has the second marker gene DNA, and the first marker gene DNA (removed target DNA) The second marker gene DNA is preferably used as an index.

第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標とする宿主細胞を選択する方法は、特に限定されず、マーカー遺伝子ＤＮＡや宿主細胞の種類に応じて、適宜設定することができるが、例えば、宿主細胞として細菌細胞を用い、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡとして、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡを用いた場合、以下のような手順で行うことができる。この場合において、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を、「第１の薬剤」といい、第２のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を「第２の薬剤」ということがある。 The method for selecting a host cell using the first marker gene DNA and the second marker gene DNA as an index is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the marker gene DNA and the host cell, For example, when bacterial cells are used as host cells and drug resistance gene DNA is used as the first marker gene DNA and the second marker gene DNA, the following procedure can be used. In this case, the drug related to the first marker gene DNA may be referred to as “first drug”, and the drug related to the second marker gene DNA may be referred to as “second drug”.

宿主細胞にターゲティングベクターを導入した後、第１の薬剤を含む固形培地で培養し、培地に生えてきたコロニーを得る。次に、得られたコロニーを数回継代して、組換え後のベクターを取り除いた後、いくつかのコロニーを、第１の薬剤と第２の薬剤を含む固形培地に接種して培養する。培養後、固形培地に生えてくるコロニーを選択する。これにより、ゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが除去標的領域に組み換えられた宿主細胞を選択することができる。 After introducing the targeting vector into the host cell, it is cultured in a solid medium containing the first drug to obtain colonies that have grown on the medium. Next, the obtained colonies are subcultured several times, and after the recombination vector is removed, several colonies are inoculated into a solid medium containing the first drug and the second drug and cultured. . After culturing, colonies that grow on the solid medium are selected. Thereby, a host cell in which the recombination target gene DNA in the genomic DNA has been recombined into the removed target region can be selected.

本発明の発現工程前の宿主細胞を得る工程は、得られた宿主細胞が目的とする組み換え体であるか否かを確認する工程を更に有してもよい。確認する方法は、従来の公知の方法を用いることができ、例えば、コロニーＰＣＲ及び電気泳動により確認することができる。 The step of obtaining a host cell before the expression step of the present invention may further include a step of confirming whether or not the obtained host cell is a target recombinant. As a confirmation method, a conventionally known method can be used. For example, confirmation can be performed by colony PCR and electrophoresis.

［発現工程後に宿主細胞を選択する第２の選択工程］
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、発現工程後に、ゲノムＤＮＡ中における除去標的ＤＮＡが除去された宿主細胞を選択する第２の選択工程を更に有してもよい。 [Second selection step of selecting host cells after the expression step]
The removal target DNA removal method of the present invention may further include a second selection step of selecting a host cell from which the removal target DNA in the genomic DNA has been removed after the expression step.

第２の選択工程において、除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡである。第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、上記の「宿主細胞を得る工程」と同様のものを用いることができる。 In the second selection step, the removal target DNA is the first marker gene DNA. As the first marker gene DNA, the same “step for obtaining host cells” as described above can be used.

第２の選択工程において、発現ベクターは、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを有する。本明細書において、「第３のマーカー遺伝子ＤＮＡ」とは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるマーカー遺伝子ＤＮＡを指す。なお、「第３のマーカー遺伝子ＤＮＡ」と上述の「第２のマーカー遺伝子ＤＮＡ」とは同一であってもよく、異なっていてもよい。 In the second selection step, the expression vector has a third marker gene DNA. In the present specification, the “third marker gene DNA” refers to a marker gene DNA different from the first marker gene DNA. The “third marker gene DNA” may be the same as or different from the “second marker gene DNA” described above.

第２の選択工程において、発現ベクターは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡを更に有してもよい。この場合、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡであることが好ましい。これにより、第２の選択工程において、継続して、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡによる薬剤耐性を利用することができる。第２の選択工程において、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。 In the second selection step, the expression vector may further have a first marker gene DNA. In this case, the first marker gene DNA is preferably drug resistance gene DNA. Thereby, in the 2nd selection process, the drug resistance by the 1st marker gene DNA can be utilized continuously. In the second selection step, it is preferable to use kanamycin resistance gene DNA as the first marker gene DNA.

第２の選択工程において、宿主細胞の選択は、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われる。 In the second selection step, the host cell is selected using the first marker gene DNA and the third marker gene DNA as indices.

第１のマーカー遺伝子は、特に限定されないが、上記の「宿主細胞を得る工程」で用いられた「第１のマーカー遺伝子」と同様のものを用いることができる。 The first marker gene is not particularly limited, and the same “first marker gene” used in the above “step for obtaining host cells” can be used.

第３のマーカー遺伝子は、特に限定されないが、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。 The third marker gene is not particularly limited, and examples thereof include drug resistance genes, fluorescent protein genes, enzyme genes that catalyze luminescence and color reactions, and lethal genes. Examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene and the like. Examples of the fluorescent protein gene include a green fluorescent protein (GFP) gene and a red fluorescent protein gene. Examples of genes for enzymes that catalyze luminescence and color reactions include luciferase genes and β-glucuronidase genes. As the lethal gene, lethal genes of various host cells can be used, and examples thereof include a sucrose lethal gene and a colicin E1 gene.

宿主細胞の選択する方法は、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行うことができる。その方法は、特に限定されず、例えば、宿主細胞として細菌細胞を用い、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡが、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡであった場合、発現後の宿主細胞を、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤と、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤の両方を含む固形培地で培養し、生えてきたコロニーを選択することで、選択を行うことができる。このように選択されたコロニーに含まれる宿主細胞は、ゲノム中の除去標的ＤＮＡが除去されたものである。なお、選択後の宿主細胞を、数回継代し、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を含む固形培地と、この薬剤を含まない固形培地とでそれぞれ培養し、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を含む固形培地でコロニーが生えてこないことを確認することで、発現ベクターが宿主細胞から取り除かれたことを確認することができる。 The host cell can be selected using the first marker gene DNA and the third marker gene DNA as indicators. The method is not particularly limited. For example, when a bacterial cell is used as the host cell and the first marker gene DNA and the third marker gene DNA are drug resistance gene DNA, the host cell after expression is expressed as follows: The selection can be performed by culturing in a solid medium containing both the drug relating to the first marker gene DNA and the drug relating to the third marker gene DNA, and selecting the colonies that have grown. The host cells contained in the colonies thus selected are those in which the removed target DNA in the genome has been removed. The selected host cell is subcultured several times and cultured in a solid medium containing a drug related to the third marker gene DNA and a solid medium not containing this drug, respectively, and a drug related to the third marker gene DNA It can be confirmed that the expression vector has been removed from the host cell by confirming that colonies do not grow on the solid medium containing.

特に、宿主細胞が、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞である場合は、第１マーカー遺伝子ＤＮＡとして、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用い、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡとしてストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。宿主細胞とマーカー遺伝子ＤＮＡをこのような組み合わせで用いた場合、発現工程後に、カナマイシンとストレプトマイシンとを含む固形培地で培養した後の宿主細胞のコロニーのうち、早く生えてきたもののみをピックアップすることで、より確実に、ゲノム中の除去標的ＤＮＡが除去された宿主細胞を選択することができる。また、発現ベクターを導入することで、カナマイシン耐性遺伝子が当該株のゲノムから除去されるが、この除去と入れ替わりで発現ベクター中のカナマイシン耐性遺伝子が存在するため、第２の選択工程においては継続してカナマイシン耐性を利用でき、かつ、ストレプトマイシン耐性により、発現ベクターの導入株のみを選択することが可能である。 In particular, when the host cell is a Rubrivax gelatinosus cell, it is preferable to use a kanamycin resistant gene DNA as the first marker gene DNA and a streptomycin resistant gene DNA as the third marker gene DNA. When host cells and marker gene DNA are used in such a combination, after the expression step, only the host cell colonies that have grown early in the solid medium containing kanamycin and streptomycin should be picked up. Thus, a host cell from which the removal target DNA in the genome has been removed can be selected more reliably. In addition, by introducing the expression vector, the kanamycin resistance gene is removed from the genome of the strain. However, since the kanamycin resistance gene in the expression vector is present by replacing this removal, the second selection step continues. Thus, kanamycin resistance can be used, and due to streptomycin resistance, it is possible to select only the expression vector-introduced strain.

本発明における第２の選択工程は、得られた宿主細胞のゲノムから、除去標的ＤＮＡが除去されたか否かを確認する工程を更に有してもよい。確認する方法は、従来の公知の方法を用いることができ、例えば、コロニーＰＣＲ及び電気泳動により確認することができる。 The second selection step in the present invention may further include a step of confirming whether or not the removal target DNA has been removed from the obtained host cell genome. As a confirmation method, a conventionally known method can be used. For example, confirmation can be performed by colony PCR and electrophoresis.

＜ＤＮＡカセット＞
本発明は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子ＤＮＡとを含む領域を有する、ＤＮＡカセットであって、２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、ＤＮＡカセットを包含する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ <DNA cassette>
The present invention is a DNA cassette having a region containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombinase derived from φK38-1 and a marker gene DNA sandwiched between the two recognition sequences, Of the two recognition sequences, one is the DNA described in any of (a) to (c) below, and the other is the DNA described in any of (d) to (f) below. Including a DNA cassette.
(A) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(C) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(D) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(E) DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions
(F) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2

本発明のＤＮＡカセットの用途は、特に限定されず、例えば、宿主細胞の形質転換に用いることができる。宿主細胞への形質転換は、ベクターに組み込み、そのベクターを宿主細胞に形質転換することで行うことができる。特に、本発明のＤＮＡカセットによると、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における除去標的領域として、宿主細胞への形質転換に用いることが好ましい。これにより、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、より確実にＤＮＡの除去を行うことができる。本発明のＤＮＡカセットを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における除去標的領域として用いた場合、宿主細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明のＤＮＡカセットは、特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞からのゲノム中のＤＮＡの除去に適している。 The use of the DNA cassette of the present invention is not particularly limited, and can be used, for example, for transformation of host cells. Transformation into a host cell can be performed by incorporating it into a vector and transforming the vector into a host cell. In particular, according to the DNA cassette of the present invention, the removal target region in the above-described removal target DNA removal method of the present invention is preferably used for transformation into a host cell. Thereby, the above-mentioned removal target DNA removal method of the present invention can remove DNA more reliably. When the DNA cassette of the present invention is used as a removal target region in the above-described removal target DNA removal method of the present invention, it is preferable to use a rubrivax gelatinosus cell as the host cell. That is, the DNA cassette of the present invention is particularly suitable for removing DNA in the genome from cells of Rubrivax gelatinosus.

マーカー遺伝子ＤＮＡは、特に限定されず、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における第１のマーカー遺伝子と同様のものを用いることができるが、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に用いた場合、より確実にＤＮＡの除去を行うことができることから、配列番号３に記載の塩基配列を有することで好ましい。 The marker gene DNA is not particularly limited, and the same gene as the first marker gene in the above-described removal target DNA removal method of the present invention can be used, but it was used in the removal target DNA removal method of the present invention. In this case, it is preferable to have the base sequence described in SEQ ID NO: 3 because DNA can be removed more reliably.

＜発現ベクター＞
本発明は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡと、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有する発現ベクターを包含する。 <Expression vector>
The present invention includes an expression vector having DNA encoding a site-specific recombinase derived from φK38-1, a kanamycin resistance gene DNA, and a streptomycin resistance gene DNA.

本発明の発現ベクターの用途は、特に限定されず、例えば、形質転換に用いることができる。特に、本発明の発現ベクターを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における発現ベクターとして用いた場合、より確実にＤＮＡの除去を行うことができる。発現ベクターを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に用いた場合、宿主細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明の発現ベクターは、特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞からのゲノム中のＤＮＡの除去に適している。 The use of the expression vector of the present invention is not particularly limited, and can be used for transformation, for example. In particular, when the expression vector of the present invention is used as an expression vector in the above-described removal target DNA removal method of the present invention, DNA can be more reliably removed. When the expression vector is used in the above-described removal target DNA removal method of the present invention, it is preferable that the host cell is a Rubivivax gelatinus cell. That is, the expression vector of the present invention is particularly suitable for removing DNA in the genome from cells of Rubrivax gelatinosus.

本発明の発現ベクターにおけるφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡは、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法と同様のものを用いることができる。 As the DNA encoding the site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 in the expression vector of the present invention, the same method as the above-described removal target DNA removal method of the present invention can be used.

＜ターゲティングベクターの作製＞
宿主としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを用い、宿主中のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡの組み換えを行うための、ターゲティングベクターの作製を行った。標的遺伝子ＤＮＡは、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノム中のｐｕｃＢＡ（以下、「標的遺伝子Ｘ」ということがある。）とした。ターゲティングベクターの作製は、まず、ｐＪＰＣＳＫφを作製し、以下に示すとおり手順で行った。 <Preparation of targeting vector>
Using Rubrivax gelatinosus as the host, a targeting vector was prepared for recombination of the recombinant target gene DNA in the genomic DNA in the host. The target gene DNA was pucBA (hereinafter sometimes referred to as “target gene X”) in the genome of Rubrivax gelatinosus. First, pJP CSKφ was prepared and the targeting vector was prepared according to the procedure shown below.

［ｐＪＰＣＳＫφの作製］
図１に、ｐＪＰＣＳＫφのプラスミドマップを示す。このｐＪＰＣＳＫφは、以下の手順で作製した。 [Production of pJP CSKφ]
FIG. 1 shows a plasmid map of pJP CSKφ. This pJP CSKφ was prepared by the following procedure.

（ｐＪＰＣｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢの作製）
ｐＪＰＣｍ−ＫＵ（配列番号５）に、ＳａｃＲＢ遺伝子（スクロース致死性遺伝子）ＤＮＡをライゲーションにより組み込み、ｐＪＰＣｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢ（配列番号６）を作製した。 (Preparation of pJP Cm-KU-SacRB)
SacRB gene (sucrose lethal gene) DNA was incorporated into pJP Cm-KU (SEQ ID NO: 5) by ligation to prepare pJP Cm-KU-SacRB (SEQ ID NO: 6).

（ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットの作製）
まず、ＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡを作製した。この際、ＪＰ５６０３プラスミド（ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から入手）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡから、制限酵素サイトＰｓｔＩサイト及びＳｐｈＩサイトを除去したＤＮＡ（以下、「ｐＪＰ５６０３Ｋｍ−ｍ２」ということがある。）を得た。ＰｓｔＩサイトを除去するために、フォワードプライマーとして配列番号７のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号８のプライマーを用いた。ＳｐｈＩサイトを除去するために、フォワードプライマーとして、配列番号９のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１０のプライマーを用いた。この、制限酵素サイトＰｓｔＩサイト及びＳｐｈＩサイトが除去されたＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、配列番号３に記載されたとおりである。 (Preparation of attB-KmR-attP cassette)
First, KmR (kanamycin resistance) gene DNA was prepared. At this time, PCR was performed using JP5603 plasmid (obtained from National BioResource Project (NBRP)) as a template, and DNA from which restriction enzyme site PstI site and SphI site were removed from KmR (kanamycin resistance) gene DNA (hereinafter referred to as “pJP5603 Km-”). m2 "). In order to remove the PstI site, the primer of SEQ ID NO: 7 was used as a forward primer, and the primer of SEQ ID NO: 8 was used as a reverse primer. In order to remove the SphI site, the primer of SEQ ID NO: 9 was used as the forward primer, and the primer of SEQ ID NO: 10 was used as the reverse primer. The base sequence of the KmR (kanamycin resistance) gene DNA from which the restriction enzyme site PstI site and SphI site have been removed is as described in SEQ ID NO: 3.

ｐＪＰ５６０３Ｋｍ−ｍ２を鋳型とし、フォワードプライマーとして配列番号１１のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た後に、ＣｌａＩ、ＰｓｔＩによる制限酵素処理を行った（以下、この制限酵素処理後のＤＮＡ断片を「制限酵素処理ＤＮＡ断片」ということがある。）。 PCR was performed using pJP5603 Km-m2 as a template, the primer of SEQ ID NO: 11 as the forward primer and the primer of SEQ ID NO: 12 as the reverse primer, and after obtaining a DNA fragment, restriction enzyme treatment with ClaI and PstI was performed. (Hereinafter, the DNA fragment after treatment with the restriction enzyme may be referred to as “restriction enzyme-treated DNA fragment”).

φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の認識配列であるａｔｔＢ（配列番号１）及びａｔｔＰ（配列番号２）のそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片を、オリゴＤＮＡをアニールすることで調製した。調製したそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片の配列を、図２に示す。図２中、（ａ）は、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示し、（ｂ）は、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。図２中の塩基配列の下線部は、後述する、配列番号１３のプライマー、配列番号１４のプライマーに含まれる配列である。図２に示すように、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片は、両端がそれぞれＳａｌＩ及びＣｌａＩに付着できるように設計されている。また、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片は、両端がそれぞれＰｓｔＩ及びＳａｃＩに付着できるように設計されている。なお、ａｔｔＢ及びａｔｔＰは、それぞれ、３８ｂｐのφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される認識配列（アタッチメントサイト）である。 DNA fragments with sticky ends of attB (SEQ ID NO: 1) and attP (SEQ ID NO: 2), which are recognition sequences of site-specific recombinant enzymes derived from φK38-1, were prepared by annealing oligo DNA. The sequences of the prepared DNA fragments with sticky ends are shown in FIG. In FIG. 2, (a) shows the base sequence of a DNA fragment with a sticky end of attB, and (b) shows the base sequence of a DNA fragment with a sticky end of attP. The underlined portion of the base sequence in FIG. 2 is a sequence contained in the primer of SEQ ID NO: 13 and the primer of SEQ ID NO: 14, which will be described later. As shown in FIG. 2, the DNA fragment with the sticky end of attB is designed so that both ends can be attached to SalI and ClaI, respectively. In addition, the DNA fragment with attP sticky ends is designed such that both ends can be attached to PstI and SacI, respectively. Here, attB and attP are recognition sequences (attachment sites) recognized by a site-specific recombinant enzyme derived from 38 bp φK38-1.

制限酵素処理ＤＮＡ断片と、上記のａｔｔＢ及びａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片についてライゲーションを行った。次いで、ライゲーション産物を鋳型とし、ＰＣＲを行った。フォワードプライマーとして配列番号１３のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１４のプライマーを用いた。この操作により、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットを作製した。 Ligation was performed on the restriction enzyme-treated DNA fragment and the above-described DNA fragments with attB and attP sticking ends. Subsequently, PCR was performed using the ligation product as a template. The primer of SEQ ID NO: 13 was used as the forward primer, and the primer of SEQ ID NO: 14 was used as the reverse primer. By this operation, an attB-KmR-attP cassette was prepared.

（ｐＪＰＣＳＫφの作製）
ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットについて、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩで制限酵素処理を行い、また、ｐＪＰＣｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢプラスミドのＳａｌＩサイト、ＳｐｈＩサイトに、制限酵素処理後のａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットを挿入し、ｐＪＰＣＳＫφを作製した（図１）。作製したｐＪＰＣＳＫφの塩基配列は、配列番号１５に示されたとおりである。ｐＪＰＣＳＫφの塩基配列のうち、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットのアタッチメントサイト周辺の塩基配列を、図３に示す。 (Preparation of pJP CSKφ)
The attB-KmR-attP cassette was subjected to restriction enzyme treatment with SalI and SphI, and the attB-KmR-attP cassette after restriction enzyme treatment was inserted into the SalI site and SphI site of the pJP Cm-KU-SacRB plasmid, pJP CSKφ was prepared (FIG. 1). The base sequence of the prepared pJP CSKφ is as shown in SEQ ID NO: 15. Among the base sequences of pJP CSKφ, the base sequence around the attachment site of the attB-KmR-attP cassette is shown in FIG.

［ターゲティングベクターの作製］
ＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムＤＮＡの標的遺伝子Ｘを、相同組換えにより組み替えて破壊株を作製するために、標的遺伝子Ｘより上流側に位置する約１ｋｂｐの上流域、及び、下流側に位置する約１ｋｂｐの下流域のそれぞれの領域をＰＣＲで増幅し、それぞれのＤＮＡ断片を作製した。上流域のＰＣＲには、フォワードプライマーとして配列番号１６のプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１７のプライマーを用いた。下流域のＰＣＲには、フォワードプライマーとして配列番号１８のプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１９のプライマーを用いた。得られた上流域及び下流域のそれぞれのＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ｐＪＰＣＳＫφにおけるａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットより上流側と下流側の位置に組み込み、ターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘ（配列番号２０）を作製した。ターゲティングベクターの作製の流れを、図４に示す。図４中、（ａ）は、標的遺伝子Ｘの上流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ａ」）及び下流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ｂ」）が組み込まれる前のｐＪＰＣＳＫφを示し、（ｂ）は、標的遺伝子Ｘの上流域Ａ及び下流域Ｂが組み込まれたターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘを示す。図４に示すように、ターゲティングベクターは、ｐＪＰＣＳＫφ中のａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットの上流側及び下流側に、目標遺伝子Ｘの上流域Ａと下流域Ｂとがそれぞれ組み込まれたものである。 [Preparation of targeting vector]
In order to recombine the target gene X of the genomic DNA of Rubivivax gelatinosus by homologous recombination to produce a disrupted strain, an upstream region of about 1 kbp located upstream from the target gene X and about 1 kbp located downstream Each region in the downstream region was amplified by PCR to prepare each DNA fragment. In the upstream PCR, the primer of SEQ ID NO: 16 was used as a forward primer and the primer of SEQ ID NO: 17 was used as a reverse primer. In the downstream PCR, the primer of SEQ ID NO: 18 was used as a forward primer and the primer of SEQ ID NO: 19 was used as a reverse primer. Using the In-Fusion (registered trademark) enzyme (manufactured by Takara Bio Inc.), the upstream and downstream DNA fragments thus obtained were upstream and downstream of the attB-KmR-attP cassette in pJP CSKφ. Incorporating into the position, the targeting vector pJP CSKφΔX (SEQ ID NO: 20) was prepared. The flow of production of the targeting vector is shown in FIG. In FIG. 4, (a) shows pJP CSKφ before incorporation of about 1 kbp upstream region (“A” in FIG. 4) and about 1 kbp downstream region (“B” in FIG. 4) of the target gene X, (B) shows the targeting vector pJP CSKφΔX in which the upstream region A and the downstream region B of the target gene X are incorporated. As shown in FIG. 4, the targeting vector is one in which the upstream region A and the downstream region B of the target gene X are incorporated into the upstream side and the downstream side of the attB-KmR-attP cassette in pJP CSKφ, respectively.

＜破壊株の作製＞
ターゲティングベクターを用いて、標的遺伝子Ｘが組換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株の作製を行った。破壊株の選択には、まず、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓにターゲティングベクターを大腸菌Ｓ１７−１λ ｐｉｒ株を用いた接合により形質転換した後に、カナマイシンを含む固形培地（成分：ＰＹＳ培地（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のもの））で培養し、カナマイシン耐性遺伝子を有する株を選択し、組み換え体（以下、「１回組換え体」ということがある。）を含むコロニーを得た。次に、１回組換え体を含むコロニーを、数回継代した後に、カナマイシンとスクロースを含む固形培地（成分：ＰＹＳ培地（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のもの））で培養し、生えてきたコロニーを選択することで、目的とする組換え体（以下、「２回組換え体」ということがある。）である破壊株を得た。得られた破壊株が、ゲノム中の標的遺伝子ＸとａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットとが組換えられた破壊株であるかを、コロニーＰＣＲにより確認したところ、組換えが正常に行われたことが確認された。図５に、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み替えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株作製の流れを示す。図５中、（ａ）は、ターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘを示し、（ｂ）は、２回組換え体のゲノムの組換えられた領域周辺を示す。図５に示すように、ターゲティングベクターｐＪＰＣＳＫφ△Ｘを用いることで、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型ゲノム中の標的遺伝子Ｘが、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットと組換えられた。なお、後述の図９の（２）に示すとおり、「１回組換え体」として得たコロニーについて、コロニーＰＣＲ及び電気泳動を行ったところ、実際には、コロニーに「１回組換え体」と「２回組換え体」の両方が含まれることを示すバンドが確認された。 <Production of disrupted strain>
Using a targeting vector, a disrupted strain of Rubrivax gelatinosus in which the target gene X was recombined was prepared. For selection of the disrupted strain, first, a targeting vector was transformed into Rubrivax gelatinosus by conjugation with E. coli S17-1λ pi strain, and then a solid medium containing kanamycin (component: PYS medium (Yeast Extract 1 g, Polypeptone 5 g, Na -Containing 5 g of succinate and 10 ml of basal salt solution ^a , pH 7.0)), selecting a strain having a kanamycin resistance gene, which may be referred to as a recombinant (hereinafter referred to as "one-time recombinant") .) Was obtained. Next, after colony containing a single recombinant was subcultured several times, a solid medium containing kanamycin and sucrose (component: PYS medium (Yeast Extract 1 g, Polypeptone 5 g, Na-Succinate 5 g, Basal Salt Solution ^a 10 ml) And having a pH of 7.0))), and selecting the colonies that have grown, the target recombinant (hereinafter sometimes referred to as “twice recombinant”) is destroyed. Got the stock. When it was confirmed by colony PCR whether the obtained disrupted strain was a disrupted strain in which the target gene X in the genome and the attB-KmR-attP cassette were recombined, it was confirmed that the recombination was performed normally. confirmed. FIG. 5 shows a flow of producing a disrupted strain of Rubrivax gelatinosus in which the target gene X in the genome is recombined. In FIG. 5, (a) shows the targeting vector pJP CSKφΔX, and (b) shows the region around the recombined region of the genome of the twice recombinant. As shown in FIG. 5, by using the targeting vector pJP CSKφΔX, the target gene X in the wild type genome of Rubrivax gelatinosus was recombined with the attB-KmR-attP cassette. In addition, as shown in (2) of FIG. 9 to be described later, colony PCR and electrophoresis were performed on the colony obtained as “one-time recombinant”. And a band indicating that both “recombinant twice” were included.

このように、カナマイシン耐性を利用して選択して１回組換え体を得た後に、スクロース致死性とカナマイシン耐性を利用して選択を行うことで、２回組換え体を確実に選択できることが確認された。 Thus, after obtaining a recombinant by selecting using kanamycin resistance, the recombinant can be reliably selected twice by selecting using sucrose lethality and kanamycin resistance. confirmed.

＜発現ベクターの作製＞
φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現ベクターの作製を行った。まず、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ（非営利バイオリソースセンター）から入手）にカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターをＮｄｅＩサイト及びＸｂａＩサイトに挿入した。挿入後のプラスミドに対し、ＮｄｅＩサイト及びＢａｍＨＩサイトに、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の遺伝子ＤＮＡ（配列番号４）を組み込み、発現ベクターであるｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５（配列番号２１）を作製した。ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５のプラスミドマップを、図６に示す。ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５は、カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性遺伝子ＤＮＡを有する。 <Preparation of expression vector>
An expression vector for a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 was prepared. First, the promoter of a kanamycin resistance gene was inserted into pJRD215 (obtained from ATCC (Non-Profit BioResource Center)) at the NdeI site and the XbaI site. With respect to the inserted plasmid, the gene DNA (SEQ ID NO: 4) of the site-specific recombinase derived from φK38-1 is incorporated into the NdeI site and the BamHI site to produce an expression vector, phiK38Int-pJRD215 (SEQ ID NO: 21). did. A plasmid map of phiK38Int-pJRD215 is shown in FIG. phiK38Int-pJRD215 has kanamycin (Km) resistance gene DNA and streptomycin (Sm) resistance gene DNA.

＜破壊株からのカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去＞
Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株からカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去を行うために、まず、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現ベクターであるｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を有する大腸菌（ＸＬ１ｂｌｕｅｐＤＰＴ５１）を、接合により破壊株に導入し、培地（成分：ＰＹＳ培地（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のもの））で培養して、破壊株中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させた。次いで、カナマイシンとストレプトマイシンを含むＰＹＳ（成分：（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のもの））のプレート培地（ＰＹＳＫｍ／Ｓｍプレート）にプレーティングし、早く成長したコロニーを３〜４個選択した。その後、選択したコロニーを、カナマイシンを含むＰＹＳ（成分：（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ，Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ５ｇ，ＢａｓａｌＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ^ａ１０ｍｌを含み、ｐＨ７．０のもの））のプレート培地（ＰＹＳＫｍプレート）にストリークした。各コロニーのストリークについて更に、それぞれシングルコロニーをピックアップして、コロニーＰＣＲを行い（プライマーは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の塩基配列中の上流側と下流側のプライマーを用いた）、発現ベクターをＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓに形質転換したことを確認した。コロニーＰＣＲ後の電気泳動の写真を図７に示す。図７中の（１）〜（５）は、ピックアップしたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのコロニーについてのＰＣＲ後のバンドであり、（Ｃ）は、コントロール（ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を有する大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅｐＤＰＴ５１）についてのＰＣＲ後のバンドである。なお、（Ｍ）は、マーカー（λ−ＥｃｏＴ１４Ｉ）である。図７に示すように、部位特異的組換え酵素のＤＮＡのバンドは、（１）〜（５）の全てにおいて確認されたことから、発現ベクターがＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株に確実に形質転換されたことが確認された。 <Removal of kanamycin resistance gene DNA from the disrupted strain>
In order to remove kanamycin resistance gene DNA from a disrupted strain of target gene X of Rubrivax gelatinosus, first, Escherichia coli (XL1 blue pDPT51) having phiK38Int-pJRD215, which is an expression vector of a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1. Is introduced into the disrupted strain by conjugation, and cultured in a medium (component: YY Extract 1 g, Polypeptone 5 g, Na-Succinate 5 g, Basal Salt Solution ^a 10 ml, pH 7.0). A site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 was expressed in the disrupted strain. Next, a plate medium (PYS Km / Sm plate) of PYS (containing Yeast Extract 1 g, Polypetone 5 g, Na-Succinate 5 g, Basal Salt Solution ^a 10 ml, pH 7.0) containing kanamycin and streptomycin. And 3-4 colonies that grew rapidly were selected. Subsequently, the selected colonies were plated with PYS (components: Yeast Extract 1 g, Polypeptone 5 g, Na-Succinate 5 g, Basal Salt Solution ^a 10 ml, pH 7.0) containing kanamycin. ) Streaked. Further, for each streak of each colony, a single colony was picked up and colony PCR was performed (primers were used upstream and downstream primers in the base sequence of the site-specific recombinase derived from φK38-1). It was confirmed that the expression vector was transformed into Rubrivax gelatinosus. A photograph of electrophoresis after colony PCR is shown in FIG. (1) to (5) in FIG. 7 are bands after PCR for the picked-up Rubivivax gelatinosus colonies, and (C) is after PCR for the control (E. coli XL1 blue pDPT51 having phiK38Int-pJRD215). It is a band. (M) is a marker (λ-EcoT14I). As shown in FIG. 7, since the DNA band of the site-specific recombinase was confirmed in all of (1) to (5), it was ensured that the expression vector was a target gene X-disrupted strain of Rubrivax gelatinosus. It was confirmed that it was transformed.

図８は、発現ベクターを、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株に形質転換し、宿主細胞中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させ、該部位特異的組換え酵素により、破壊株ゲノム中の除去標的遺伝子ＤＮＡであるカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する流れを示す図である。図８に示すように、発現ベクターが破壊株に形質転換されると、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素が発現して、破壊株ゲノムからカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する。 FIG. 8 shows that an expression vector is transformed into a disrupted strain of Rubrivax gelatinosus in which the target gene X in the genome is recombined, and a site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 is expressed in a host cell. It is a figure which shows the flow which removes the kanamycin resistance gene DNA which is the removal target gene DNA in a disrupted-strain genome by a typical recombination enzyme. As shown in FIG. 8, when the expression vector is transformed into a disrupted strain, φK38-1-derived site-specific recombinant enzyme is expressed, and kanamycin resistance gene DNA is removed from the disrupted strain genome.

上記コロニーＰＣＲと同時に、得られたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムを用いて、ゲノム中の標的遺伝子Ｘの周辺のプライマーペア（標的遺伝子Ｘより上流側に位置する上流域のプライマーと、標的遺伝子Ｘより下流側に位置する下流域のプライマー）によりＰＣＲを行い、バンドのサイズを確認し、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去したことを確認した。また、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型のゲノム、１回組換え体のゲノム、及び２回組換え体のゲノムについても、同様の操作を行った。そのＰＣＲ後の電気泳動の結果を、図９に示す。図９中、（１）は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型についてのバンドであり、（２）は、１回組換え体についてのバンドであり、（３）は、２回組換え体についてのバンドであり、（４）は、発現ベクターの形質転換後のＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓについてのバンドである。なお、（Ｍ）は、マーカー（λ−ＥｃｏＴ１４Ｉ）である。図９に示すように、（４）の発現ベクターの形質転換後のバンドは、（１）〜（３）より、短いバンドが得られていることは明らかであり、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株から、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡが除去されたことが確認できた。なお、上記（４）のバンドをクローニングし、シークエンス解析を行ったところ、目的とする組換えが生じ、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡが除去されたことを確認できた。 Simultaneously with the above colony PCR, using the obtained genome of Rubrivax gelatinosus, a primer pair around the target gene X in the genome (an upstream primer located upstream from the target gene X and a downstream from the target gene X PCR was performed using a primer in the downstream region located at 1), the size of the band was confirmed, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene DNA was removed. In addition, the same operation was performed for the wild-type genome of Rubrivivax gelatinosus, the genome of the single recombinant, and the genome of the double recombinant. The result of electrophoresis after the PCR is shown in FIG. In FIG. 9, (1) is a band for the wild type of Rubrivax gelatinosus, (2) is a band for a single recombinant, and (3) is a band for a double recombinant. Yes, (4) is a band for Rubrivax gelatinosus after transformation of the expression vector. (M) is a marker (λ-EcoT14I). As shown in FIG. 9, it is clear that the band after transformation of the expression vector of (4) has a shorter band than (1) to (3), and from the disrupted strain of Rubrivax gelatinosus, It was confirmed that the kanamycin resistance gene DNA was removed. The band (4) was cloned and subjected to sequence analysis. As a result, it was confirmed that the desired recombination occurred and the kanamycin resistance gene DNA was removed.

また、上記コロニーＰＣＲによる確認と同時に、ピックアップしたコロニーについて、抗生物質を含まないＰＹＳ培地の培養液にイノキュレートした。そして、上記のとおり、カナマイシン耐性遺伝子が除去されたことを確認できたコロニーの培養液を、抗生物質を含まないＰＹＳプレートにストリークした。このプレートから、シングルコロニー４個程度を更に別のＰＹＳ（抗生物質を含まない）プレートとＰＹＳＫｍプレートに接種し、レプリカを作成した。そして、ＰＹＳＫｍプレート側でコロニーが生えてこず、抗生物質を含まないＰＹＳプレートにのみコロニーが生えてくることを確認することで、ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５が破壊株から脱離したことを確認した。 Simultaneously with the confirmation by the colony PCR, the picked-up colonies were inoculated into a PYS medium culture solution containing no antibiotics. Then, as described above, the culture broth of the colonies where it was confirmed that the kanamycin resistance gene was removed was streaked on a PYS plate containing no antibiotics. From this plate, about 4 single colonies were further inoculated into another PYS (without antibiotics) plate and PYS Km plate to make replicas. Then, it was confirmed that phiK38Int-pJRD215 was detached from the disrupted strain by confirming that colonies did not grow on the PYS Km plate side and colonies grew only on the PYS plate containing no antibiotics.

以上で述べたとおり、当該破壊株のゲノム上からのカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去と、発現ベクターの脱離を確認することができた。 As described above, it was possible to confirm the removal of the kanamycin resistance gene DNA from the genome of the disrupted strain and the detachment of the expression vector.

このように、本発明のＤＮＡの除去方法によると、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を用いることで、高い確実性で、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡがゲノムＤＮＡから除去されたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株を選択することができた。特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓは、若干のストレプトマイシン耐性を有することから、早く成長したコロニーのみを選択したことにより、より確実にＤＮＡの除去が可能となったものと推測される。また、ＤＮＡの除去に用いた、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識されるａｔｔＢ及びａｔｔＰは、３８ｂｐと短いにもかかわらず、上記のとおり、確実性が高いＤＮＡの除去が可能となった。また、認識配列が３８ｂｐと短いため、コドンを揃えやすい、プライマーを設計しやすい等、様々な操作を行いやすい。これらのことから、本発明によると、確実性が高いのみならず、部位特異的組換え酵素の認識配列を短くすることができるため、操作性に優れたＤＮＡの除去が可能となることが示された。 Thus, according to the DNA removal method of the present invention, by using the site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1, the destruction of Rubrivax gelatinosus in which kanamycin resistance gene DNA has been removed from genomic DNA with high certainty. The stock could be selected. In particular, since Rubrivax gelatinosus has some streptomycin resistance, it is presumed that DNA can be removed more reliably by selecting only colonies that grew quickly. Moreover, although attB and attP recognized by the site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 used for DNA removal are as short as 38 bp, DNA with high certainty can be removed as described above. It became. In addition, since the recognition sequence is as short as 38 bp, various operations such as easy codon alignment and easy primer design are easily performed. From these facts, according to the present invention, it is shown that not only the certainty is high, but also the recognition sequence of the site-specific recombinase can be shortened, so that DNA with excellent operability can be removed. It was done.

また、認識配列が３８ｂｐのように短いと、宿主細胞中のゲノム中に、組換え部以外に、認識配列を有する可能性が高く、目的とする部分の除去を確実に組替えるのは困難である。しかし、上記２つの認識配列をＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムに組み込んで、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を反応させても、予想外なことに、目的とする部分の除去を確実に行うことができた。このことから、本発明のＤＮＡの除去方法において、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用い、認識配列として上記のａｔｔＢ及びａｔｔＰを用いる組合せが、特に適していることが示された。 In addition, when the recognition sequence is as short as 38 bp, there is a high possibility of having a recognition sequence other than the recombination site in the genome in the host cell, and it is difficult to reliably recombine the target portion. is there. However, even if the above two recognition sequences are integrated into the genome of Rubrivax gelatinosus and reacted with a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1, unexpectedly, the target portion is surely removed. I was able to. From this, it was shown that the combination using the above-mentioned attB and attP as recognition sequences was particularly suitable for the DNA removal method of the present invention using Rubrivax gelatinosus cells as host cells.

Claims

A host cell having a region in genomic DNA containing two recognition sequences recognized by a site-specific recombination enzyme derived from φK38-1 and a removal target DNA sandwiched between the two recognition sequences. introducing the expression vector comprising a DNA encoding a recombination enzyme, possess the site-specific recombinase expression is to express the process in the host cell,
Of the two recognition sequences, one is the DNA described in any of (a) to (c) below, and the other is the DNA described in any of (d) to (f) below. A method for removing a target DNA to be removed.
(A) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(C) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(D) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(E) DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions
(F) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2

Before the expression step, the genomic DNA has a region containing two recognition sequences recognized by the site-specific recombinase derived from φK38-1 and a removed target DNA sandwiched between the two recognition sequences. further comprising the step of obtaining a host cell, a method for removing the removal target DNA of claim 1.

The step of obtaining the host cell comprises the step of introducing into the host cell a targeting vector constructed so that the recombination target gene DNA and the region in the genomic DNA of the host cell can be recombined.
After the introduction of the targeting vector, a first selection step of selecting a host cell in which the recombinant target gene DNA in the genomic DNA of the host cell has been recombined into the region,
The removal target DNA is a first marker gene DNA,
The targeting vector has a second marker gene DNA different from the first marker gene DNA,
The removal method of the removal target DNA according to claim 2 , wherein the first selection step is performed using the first marker gene DNA and the second marker gene DNA as indexes.

The removal method of the removal target DNA according to claim 3 , wherein the second marker gene DNA is sucrose lethal gene DNA.

The removal target DNA is a first marker gene DNA,
The expression vector has the first marker gene DNA and a third marker gene DNA different from the first marker gene DNA,
In the removal target DNA removal method, after the expression step, the host cell from which the removal target DNA has been removed in the genomic DNA using the first marker gene DNA and the third marker gene DNA as an index is used. The removal method of the removal target DNA in any one of Claim 1 to 4 which further has the 2nd selection process to select.

The removal method of the removal target DNA according to any one of claims 1 to 5 , wherein the host cell is a bacterial cell.

The removal method of the removal target DNA of Claim 6 whose said bacterial cell is a cell of Rubrivax gelatinosus.

The first marker gene DNA is kanamycin resistance gene DNA,
The removal method of the removal target DNA according to claim 6 or 7 , wherein the third marker gene DNA is streptomycin resistance gene DNA.

a DNA cassette having a region comprising two recognition sequences recognized by a site-specific recombinase derived from φK38-1 and a marker gene DNA sandwiched between the two recognition sequences,
Of the two recognition sequences, one is the DNA described in any of (a) to (c) below, and the other is the DNA described in any of (d) to (f) below. A DNA cassette.
(A) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(B) DNA having a base sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1
(C) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1
(D) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(E) DNA having a base sequence that can hybridize with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions
(F) DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2

The DNA cassette according to claim 9 , wherein the marker gene DNA has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.