JP6592637B1 - Method for detecting NAFLD or NASH or predicting risk, diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH, method for determining the progress of liver fibrosis in a subject, and diagnosis for determining the progress of liver fibrosis in a subject Medicine kit - Google Patents
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Abstract
より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たなＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ診断法を提供することを課題とする。生体試料中のアシルカルニチン総量を測定し、基準値と比較することにより、前記課題を解決することができる。It is an object of the present invention to provide a new NAFLD and NASH diagnostic method that can be implemented more simply and does not place a burden on patients and medical staff. The subject can be solved by measuring the total amount of acylcarnitine in the biological sample and comparing it with a reference value.
Description
本発明はＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法に関する。また、本発明は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キットに関する。本発明は、対象における肝線維化の進行度の判定方法、及び対象における肝線維化の進行度を判定するための診断薬キットにも関する。 The present invention relates to a method for detecting NAFLD or NASH or predicting risk. The present invention also relates to a diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH. The present invention also relates to a method for determining the progress of liver fibrosis in a subject and a diagnostic kit for determining the progress of liver fibrosis in a subject.
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）はアルコールを原因としない脂肪肝の総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と、病態がほとんど進行しない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。日本国内においては、約１０００万人がＮＡＦＬＤに、そして約１００万〜２００万人がＮＡＳＨに罹患していると推定される。 Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a general term for fatty liver that does not cause alcohol. NAFLD is classified into non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which is also the home of cirrhosis and liver cancer, and non-alcoholic fatty liver (NAFL) in which the disease state hardly progresses. In Japan, it is estimated that about 10 million people suffer from NAFLD and about 1 to 2 million people suffer from NASH.
ＮＡＳＨの確定診断には、肝組織の生検が必須とされている。肝組織の生検により、脂肪量、炎症の程度、及び線維化の進行程度を把握し、ＮＡＳＨを診断することが可能となる。しかしながら、肝組織の生検は、肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取することを含むものであり、患者及び医療従事者に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを伴うものである。したがって、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たなＮＡＳＨ診断法の開発が望まれている。 Biopsy of liver tissue is essential for a definitive diagnosis of NASH. By biopsy of liver tissue, it is possible to grasp the amount of fat, the degree of inflammation, and the degree of progression of fibrosis, and diagnose NASH. However, a biopsy of liver tissue involves the collection of a part of tissue or cells by inserting a needle into the liver, which imposes an excessive burden on patients and medical workers, as well as complications, etc. There are risks. Therefore, it is desired to develop a new NASH diagnostic method that can be carried out more easily and does not place a burden on patients and medical staff.
アシルカルニチンは、生体内において脂肪酸がミトコンドリア内膜へ運搬される場合に、脂肪酸とカルニチンが結合して生成される化合物である。より詳細には、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩの作用によりアシルＣｏＡとカルニチンからアシルカルニチンが生成される。血液及び尿などの生体試料中のアシルカルニチン分析は、新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニングにおいて分析項目とされている。 Acylcarnitine is a compound formed by combining fatty acid and carnitine when the fatty acid is transported to the inner mitochondrial membrane in vivo. More specifically, acylcarnitine is produced from acyl CoA and carnitine by the action of carnitine palmitoyltransferase I present in the outer mitochondrial membrane. Analysis of acylcarnitine in biological samples such as blood and urine is an analysis item in screening for inborn errors of metabolism in newborns.
特許文献１は、脂肪性肝疾患を診断するためのバイオマーカー及びその測定方法等を開示する。特許文献１においては、パルミトイルカルニチン又はアセチルカルニチン等の量を、他のバイオマーカーの測定値と組み合わせて使用することが前提とされており、アシルカルニチン単独の量を測定して脂肪性肝疾患を診断することは開示も示唆もされていない。 Patent Document 1 discloses a biomarker for diagnosing fatty liver disease, a measurement method thereof, and the like. In Patent Document 1, it is assumed that the amount of palmitoylcarnitine or acetylcarnitine is used in combination with the measured value of other biomarkers, and the amount of acylcarnitine alone is measured to treat fatty liver disease. Diagnosing is neither disclosed nor suggested.
本発明の目的は、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たなＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ診断法を提供することである。本発明の他の目的は、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを罹患している可能性のある対象における、患者及び医療従事者に負担をかけない新たな肝線維化の進行度の判定方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a new NAFLD and NASH diagnostic method that can be implemented more simply and does not place a burden on patients and medical staff. Another object of the present invention is to provide a new method for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject who may suffer from NAFLD and NASH, without burdening the patient and medical staff. .
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体試料中のアシルカルニチン総量を測定し、基準値と比較することで、患者及び医療従事者に負担をかけず、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの早期診断が可能であること及び肝線維化の進行度の判定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞ 対象からの生物学的試料中の、アシルカルニチン総量を測定することと
測定したアシルカルニチン総量を基準値と比較することと
を含む、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法、
＜２＞ 前記生物学的試料が、血液、血清又は血漿である、＜１＞に記載のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法、
＜３＞ 肝臓における線維化の進行度を判断する、＜１＞又は＜２＞に記載のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法、
＜４＞ 遊離カルニチン量及びアシルカルニチン総量の合計量であるカルニチン総量を測定することと
前記カルニチン総量から遊離カルニチン量を減算することにより、アシルカルニチン総量を測定することと
を含む、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法、
＜５＞ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キットであって、アシルカルニチン総量を測定するための試薬を含む診断薬キット、
＜６＞アシルカルニチン総量を測定するための前記試薬が、遊離カルニチン量を測定するための試薬とカルニチン総量を測定するための試薬との組み合わせである、＜５＞に記載の診断薬キット、
＜７＞質量分析計の内部標準液としてのアシルカルニチン組成物を含む、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キットであって、
前記アシルカルニチン組成物が、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ブチリルカルニチン、イソ吉草酸カルニチン、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン、グルタリルカルニチン、オクタノイルカルニチン、デカノイルカルニチン、ドデカノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、及びステアロイルカルニチンの少なくとも１つを含む前記診断薬キット、
＜８＞ ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象由来の生物学的試料中の、アシルカルニチン総量を測定することと
測定したアシルカルニチン総量を基準値と比較することと
を含む、対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜９＞ 遊離カルニチン量及びアシルカルニチン総量の合計量であるカルニチン総量を測定することと
前記カルニチン総量から遊離カルニチン量を減算することにより、アシルカルニチン総量を測定することと
を含む、＜８＞に記載の対象における肝線維化の進行度の判定方法、
＜１０＞ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象における肝線維化の進行度を判定するための診断薬キットであって、アシルカルニチン総量を測定するための試薬を含む診断薬キット、並びに
＜１１＞質量分析計の内部標準液としてのアシルカルニチン組成物を含む、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象における肝線維化の進行度を判定するための診断薬キットであって、
前記アシルカルニチン組成物が、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ブチリルカルニチン、イソ吉草酸カルニチン、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン、グルタリルカルニチン、オクタノイルカルニチン、デカノイルカルニチン、ドデカノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、及びステアロイルカルニチンの少なくとも１つを含む前記診断薬キット。As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor measured the total amount of acylcarnitine in a biological sample and compared it with a reference value, so that the burden on patients and medical workers was not increased, and NAFLD and NASH The inventors have found that early diagnosis is possible and that the degree of progression of liver fibrosis can be determined, and the present invention has been completed.
Specifically, the present invention is as follows.
<1> A method for detecting NAFLD or NASH or predicting risk, comprising measuring the total amount of acylcarnitine in a biological sample from a subject and comparing the total amount of acylcarnitine measured with a reference value,
<2> The method for detecting NAFLD or NASH or predicting risk according to <1>, wherein the biological sample is blood, serum or plasma.
<3> The method of detecting NAFLD or NASH or predicting risk according to <1> or <2>, wherein the degree of progression of fibrosis in the liver is determined,
<4> measuring the total amount of carnitine, which is the total amount of free carnitine and the total amount of acylcarnitine, and measuring the total amount of acylcarnitine by subtracting the amount of free carnitine from the total amount of carnitine, <1> to <3> NAFLD or NASH detection or risk prediction method according to any one of
<5> a diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH, comprising a reagent for measuring the total amount of acylcarnitine,
<6> The diagnostic kit according to <5>, wherein the reagent for measuring the total amount of acylcarnitine is a combination of a reagent for measuring the amount of free carnitine and a reagent for measuring the total amount of carnitine,
<7> A diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH comprising an acylcarnitine composition as an internal standard solution of a mass spectrometer,
The acyl carnitine composition is acetyl carnitine, propionyl carnitine, butyryl carnitine, isovaleric acid carnitine, 3-hydroxy-isovaleric acid carnitine, glutaryl carnitine, octanoyl carnitine, decanoyl carnitine, dodecanoyl carnitine, tetradecanoyl. The diagnostic kit comprising at least one of carnitine, tetradecenoylcarnitine, palmitoylcarnitine, and stearoylcarnitine;
<8> A subject comprising measuring the total amount of acylcarnitine in a biological sample derived from a subject possibly suffering from NAFLD or NASH and comparing the measured total amount of acylcarnitine with a reference value Method for determining the degree of progression of liver fibrosis in
<9> including <8> measuring the total amount of carnitine, which is the total amount of free carnitine and the total amount of acylcarnitine, and measuring the total amount of acylcarnitine by subtracting the amount of free carnitine from the total amount of carnitine. A method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the described subject,
<10> a diagnostic kit for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject who may suffer from NAFLD or NASH, comprising a reagent for measuring the total amount of acylcarnitine, <11> A diagnostic kit for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject who may suffer from NAFLD or NASH, comprising an acylcarnitine composition as an internal standard solution of a mass spectrometer. And
The acyl carnitine composition is acetyl carnitine, propionyl carnitine, butyryl carnitine, isovaleric acid carnitine, 3-hydroxy-isovaleric acid carnitine, glutaryl carnitine, octanoyl carnitine, decanoyl carnitine, dodecanoyl carnitine, tetradecanoyl. The diagnostic agent kit comprising at least one of carnitine, tetradecenoylcarnitine, palmitoylcarnitine, and stearoylcarnitine.
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的にＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの診断を行うことができる。本発明によれば、対象が肝細胞癌に進行する前に、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、肝線維化の進行度の判定を行うことができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a NAFLD and NASH can be diagnosed simply and without burdening a patient and a medical worker. According to the present invention, NAFLD and NASH can be detected before the subject progresses to hepatocellular carcinoma. According to the present invention, it is possible to easily determine the progress of liver fibrosis without imposing a burden on patients and medical staff.
［１］ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法
（対象からの生物学的試料）
本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液を挙げることができ、体液を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生体試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液であり、さらに好ましくは血液、血清又は血漿であり、さらに好ましくはＮＡＦＬＤ及び／又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象の血液、血清又は血漿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。[1] NAFLD or NASH detection or risk prediction method (biological sample from a subject)
Examples of biological samples that can be analyzed in the present invention include solid tissues and body fluids derived from living organisms (organisms), and body fluids are preferably used. The biological sample that can be analyzed in the present invention is more preferably a body fluid such as blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, tears, ear leakage, or prostate fluid, and more preferably blood, serum, or plasma. More preferably, it is blood, serum or plasma of a subject who may suffer from NAFLD and / or NASH. Living organisms or subjects include humans or animals (eg, mice, guinea pigs, rats, monkeys, dogs, cats, hamsters, horses, cows, and pigs), preferably humans.
（アシルカルニチン）
本発明において、アシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ３）３Ｎ+ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ１）ＣＨ２ＣＯＯ-
（式１中、Ｒ１は又は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）(Acylcarnitine)
In the present invention, acylcarnitine refers to a group of compounds represented by Formula 1.
Formula 1: (CH 3) 3 N + CH 2 CH (OR 1) CH 2 COO -
(In Formula 1, R 1 represents a saturated or unsaturated fatty acid residue having 2 to 30 carbon atoms, and the hydrogen atom bonded to the fatty acid residue may be substituted with an oxygen atom or a hydroxy group. )
アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３−ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書中においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。本明細書においては脂肪酸が結合していない遊離カルニチンについては、アシルカルニチンに含めないものとする。すなわち、「アシルカルニチン総量」とは、脂肪酸が結合していない遊離カルニチンの量を除外した、アシルカルニチンの合計量を示す。 Acylcarnitine is composed of acetylcarnitine, propionylcarnitine, stearoylcarnitine, oleylcarnitine, depending on the carbon chain length of the fatty acid moiety, the presence or absence and number of unsaturated bonds, substitution of oxygen atoms or hydroxy groups of hydrogen atoms bound to the carbon chain , Linoleyl carnitine, malonyl carnitine, 3-hydroxy carnitine, etc., but in the present specification they are generically described as acyl carnitine. In the present specification, free carnitine to which no fatty acid is bound is not included in acylcarnitine. That is, the “total amount of acylcarnitine” indicates the total amount of acylcarnitine excluding the amount of free carnitine to which no fatty acid is bound.
飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表１に記載のものが挙げられる。アシルカルニチンは、脂肪酸代謝異常等の先天性代謝異常スクリーニングにおいても評価項目として使用されている。先天性代謝異常スクリーニングなど臨床での評価項目に使用される主なアシルカルニチンを表２に示す。 Examples of saturated or unsaturated fatty acid residues include those listed in Table 1. Acylcarnitine is also used as an evaluation item in screening for inborn errors of metabolism such as fatty acid metabolism abnormalities. Table 2 shows the main acylcarnitines used in clinical evaluation items such as screening for inborn errors of metabolism.
（アシルカルニチン総量）
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法では、対象からの生物学的試料中のアシルカルニチン総量を測定することを含む。アシルカルニチン総量は、酵素サイクリング法等を用いて、生体試料内に存在するアシルカルニチンの量を一括して測定してもよく、又は、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計等を用いて、個々のアシルカルニチンの量を測定してそれらの量を合算してもよい。(Total amount of acylcarnitine)
The NAFLD or NASH detection or risk prediction method of the present invention includes measuring the total amount of acylcarnitine in a biological sample from a subject. The total amount of acylcarnitine may be measured by batch measurement of the amount of acylcarnitine present in the biological sample using an enzyme cycling method or the like, or individually using a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer or the like. The amount of acylcarnitine may be measured and the amount may be added up.
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法では、アシルカルニチン総量は、好ましくは、少なくともアセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）、ヘキサノイルカルニチン（Ｃ６）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）、ステアロイルカルニチン（Ｃ１８）、オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）及び３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の１７種のアシルカルニチンの量を含む。上記１７種のアシルカルニチンは、先天性代謝異常スクリーニングの評価項目として用いられているアシルカルニチンであり、疾患により脂肪酸代謝及び有機酸代謝異常が生じた場合に、特に影響を受けやすく、疾患を有する対象と健常人との間で量的な差異が発生しやすいアシルカルニチンである。先天代謝異常症の確定診断では、アシルカルニチン量を測定するために、タンデム型質量分析計を用いた診断法が必須である。しかしながら、先天代謝異常症の確定診断後の経過観察では、酵素サイクリング法による血中カルニチン２分画検査（カルニチン総量を測定し、このカルニチン総量から遊離カルニチン量を減算して総アシルカルニチン量を測定する方法）が代替法として採用されている。後述の参考例２においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して測定した上記１７種のアシルカルニチンの合計量と酵素サイクリング法を使用して測定したアシルカルニチン総量が良好な相関を示すことも実証されている。したがって、タンデム型質量分析計による上記１７種のアシルカルニチンの合計量は、アシルカルニチン総量と同視し得ると考えられる。 In the NAFLD or NASH detection or risk prediction method of the present invention, the total amount of acylcarnitine is preferably at least acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), carnitine isovalerate (C5). , 3-hydroxy-isovaleric acid carnitine (C5OH), glutarylcarnitine (C5DC), hexanoylcarnitine (C6), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), dodecanoylcarnitine (C12), tetradeca Noylcarnitine (C14), tetradecenoylcarnitine (C14: 1), palmitoylcarnitine (C16), 3-hydroxy-hexadecanoylcarnitine (C16OH), stearoylcarnitine (C18), octadecenoylcal Chin (C18: 1) and 3-hydroxy - octadecenyl octanoyl carnitine: containing an amount of 17 kinds of acylcarnitine (C18 1 OH). The 17 types of acylcarnitines are acylcarnitines used as evaluation items for inborn errors of metabolic metabolism, and are particularly susceptible to diseases when fatty acid metabolism and organic acid metabolism abnormalities occur due to diseases. Acylcarnitine is prone to quantitative differences between subjects and healthy individuals. In the definitive diagnosis of inborn errors of metabolism, a diagnostic method using a tandem mass spectrometer is essential for measuring the amount of acylcarnitine. However, in the follow-up after a definitive diagnosis of inborn errors of metabolism, blood carnitine two-fraction test by enzyme cycling method (measured total amount of carnitine and subtracted free carnitine amount from this total amount of carnitine to measure total acyl carnitine amount Method) is adopted as an alternative method. In Reference Example 2 described later, it was also demonstrated that the total amount of the 17 kinds of acylcarnitines measured using LC-MS / MS and the total amount of acylcarnitines measured using the enzyme cycling method show a good correlation. Has been. Therefore, it is considered that the total amount of the 17 kinds of acylcarnitines by the tandem mass spectrometer can be regarded as the total amount of acylcarnitines.
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法では、「アシルカルニチン総量」は、アシルカルニチン総量、すなわち、生体試料中に存在する全ての種類のアシルカルニチンの合計量と同視し得る、生体中の特定のアシルカルニチンの合計量を含む。 In the NAFLD or NASH detection or risk prediction method of the present invention, the “total amount of acylcarnitine” refers to the total amount of acylcarnitine, ie, the total amount of all types of acylcarnitines present in a biological sample. Total amount of specific acylcarnitines.
（アシルカルニチン総量の測定方法）
アシルカルニチン総量の測定は、例えばキャピラリー電気泳動−質量分析計、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、及び酵素サイクリング法等により測定することができる。これらの方法を組み合わせて使用することもできる。酵素サイクリング法を用いる場合は、汎用の自動分析装置、例えばＬＡＢＯＳＰＥＣＴ ００８（日立ハイテクノロジーズ社製）等、により測定できることから、複雑な操作を省略して低コストで迅速に測定を行うことが可能である。(Method for measuring the total amount of acylcarnitine)
The total amount of acylcarnitine can be measured by, for example, a capillary electrophoresis-mass spectrometer, a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS), an enzyme cycling method, or the like. A combination of these methods can also be used. When the enzyme cycling method is used, it can be measured with a general-purpose automatic analyzer such as LABOSPECT 008 (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation), so that complicated operations can be omitted and rapid measurement can be performed at low cost. is there.
２分画検査を行うこと、すなわち、遊離カルニチン量とアシルカルニチン総量との合計量であるカルニチン総量を測定し、このカルニチン総量から遊離カルニチン量、すなわち、脂肪酸が結合していないカルニチンの量を減算することにより、アシルカルニチン総量を測定することもできる。２分画検査は、酵素サイクリング法を用いて行うことができる。 Perform a two-fraction test, that is, measure the total amount of carnitine, which is the total amount of free carnitine and total amount of acylcarnitine, and subtract the amount of free carnitine, that is, the amount of carnitine to which no fatty acid is bound, from this total amount of carnitine By doing so, the total amount of acylcarnitine can also be measured. The two-fraction test can be performed using an enzyme cycling method.
本明細書において「液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計」又は「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により分離した分析対象成分を専用のインターフェースを介してイオン化し、生成するイオンを質量分析計（ＭＳ）で分離して特定の質量を有するイオンを解離及び／又はフラグメント化させ、それらのイオンを質量分析計で検出する装置を意味する。本明細書において「酵素サイクリング法」は、特定の化学反応を進める酵素の働きを利用して、微量物質の濃度を測定する手法を意味する。酵素サイクリング法によるアシルカルニチンの測定には、酵素としてアシルカルニチンエステラーゼ及びカルニチンデヒドロゲナーゼを使用することができ、より詳細には、遊離カルニチン量の測定にはカルニチンデヒドロゲナーゼを使用することができ、カルニチン総量の測定にはアシルカルニチンエステラーゼ及びカルニチンデヒドロゲナーゼを使用することができる。そして、補酵素としてβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋）及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を使用することができる。In the present specification, “liquid chromatograph-tandem mass spectrometer” or “LC-MS / MS” is an ion generated by ionizing an analysis target component separated by a liquid chromatograph (LC) through a dedicated interface. Is separated by a mass spectrometer (MS) to dissociate and / or fragment ions having a specific mass, and the ions are detected by the mass spectrometer. In the present specification, the “enzyme cycling method” means a technique for measuring the concentration of a trace substance by utilizing the action of an enzyme that advances a specific chemical reaction. Acyl carnitine esterase and carnitine dehydrogenase can be used as enzymes for the measurement of acylcarnitine by the enzyme cycling method, and more specifically, carnitine dehydrogenase can be used to measure the amount of free carnitine. For the measurement, acylcarnitine esterase and carnitine dehydrogenase can be used. As a coenzyme, β-thionicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (Thio-NAD + ) and β-nicotinamide adenine dinucleotide reduced form (NADH) can be used.
（基準値）
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法は、測定したアシルカルニチンの合計量を基準値と比較することを含む。本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法では、対象におけるアシルカルニチン総量が、健常人群のアシルカルニチン総量よりも高いことを指標としてＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出およびリスクの予測を行うことができる。具体的には、例えば、対象のアシルカルニチン総量の合計量が健常人群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するか、又は発症する可能性が高いと判定することができる。(Standard value)
The NAFLD or NASH detection or risk prediction method of the present invention comprises comparing the total amount of acylcarnitine measured with a reference value. In the method of detecting NAFLD or NASH or predicting risk according to the present invention, NAFLD or NASH can be detected and risk can be predicted using as an index that the total amount of acylcarnitine in the subject is higher than the total amount of acylcarnitine in the healthy subject group. Specifically, for example, when the total amount of the subject acylcarnitine is equal to or greater than the threshold for determination with a group of healthy subjects (reference value), NAFLD or NASH is detected or is likely to develop Can be determined.
数値の範囲を基準値とすることもできる。ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患しているか否かを診断する際には、予め、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患していると診断された対象、および、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨではないと診断された対象の生体試料中のアシルカルニチン総量の範囲を計測しておき、対象の生体試料中のアシルカルニチン総量が、健常な対象の生体試料中のアシルカルニチン総量の範囲に入る場合は、この対象はＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患していない可能性が高く、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している対象の生体試料中のアシルカルニチン総量の範囲に入る場合は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性が高い。 A numerical range can also be used as a reference value. When diagnosing whether or not NAFLD or NASH is affected, in a biological sample of a subject previously diagnosed as having NAFLD or NASH, and a subject diagnosed as not NAFLD or NASH If the total range of acylcarnitine is measured and the total amount of acylcarnitine in the subject biological sample falls within the range of the total amount of acylcarnitine in the healthy subject biological sample, the subject is affected by NAFLD or NASH. If it falls within the range of the total amount of acylcarnitine in the biological sample of the subject suffering from NAFLD or NASH, it is likely that the subject is suffering from NAFLD or NASH.
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。 The judgment threshold (reference value) is expected to change depending on various conditions such as the underlying disease, sex, age, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate population corresponding to the subject. The normal value range or the threshold for determination can be determined by performing statistical processing on the data obtained from the population.
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法では、アシルカルニチン総量を基準値と比較してもよく、アシルカルニチン総量と同視し得ると考えられる前記１７種のアシルカルニチン合計量を基準値と比較してもよく、前記１７種のアシルカルニチンに任意の１種以上のアシルカルニチンを加算した合計量（すなわち、１８種、１９種、又は２０種以上のアシルカルニチンの合計量）を基準値と比較してもよい。 In the NAFLD or NASH detection or risk prediction method of the present invention, the total amount of acylcarnitine may be compared with a reference value, and the total amount of the 17 kinds of acylcarnitines considered to be equated with the total amount of acylcarnitine is used as a reference value. The total amount obtained by adding one or more kinds of acylcarnitines to the 17 kinds of acylcarnitines (that is, the total amount of 18 kinds, 19 kinds, or 20 kinds of acylcarnitines) is used as a reference value. You may compare.
（ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法）
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法は、対象のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの進行度をモニタリングすることもできる。この場合、特定の時点での対象のアシルカルニチン総量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象のアシルカルニチン総量を測定し、以前の測定値と比較してアシルカルニチン総量が多ければ、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨが進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較してアシルカルニチン総量が少なければ、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨが進行していないと判断することができる。(NAFLD or NASH detection or risk prediction method)
The method for detecting NAFLD or NASH or predicting risk of the present invention can also monitor the progress of NAFLD or NASH in a subject. In this case, the total amount of the target acylcarnitine at a specific time point is used as a determination threshold (reference value). After a certain period (for example, 1, 3, 6, or 12 months), measure the total amount of acylcarnitine of this subject again, and if the total amount of acylcarnitine is large compared to the previous measured value, NAFLD or NASH progresses It can be determined that Conversely, if the total amount of acylcarnitine is small compared to the previous measurement value, it can be determined that NAFLD or NASH has not progressed.
ＮＡＦＬＤには、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ＮＡＳＨが進行した肝硬変、及びＮＡＳＨが進行した肝細胞癌が含まれる。なお、本明細書においては、用語「ＮＡＦＬＤ」及び「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含むことができるが、含まないことが好ましい。すなわち、ＮＡＦＬＤは、好ましくは、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び／又はＮＡＳＨが進行した肝硬変である。 NAFLD includes non-alcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis with advanced NASH, and hepatocellular carcinoma with advanced NASH. In the present specification, the terms “NAFLD” and “NASH” can include hepatocellular carcinoma in which NASH has progressed, but preferably do not include it. That is, NAFLD is preferably nonalcoholic fatty liver (NAFL), nonalcoholic steatohepatitis (NASH), and / or cirrhosis in which NASH has progressed.
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又はリスクの予測方法を行った後、必要に応じて、他のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出方法の患者への実施、及び／又はＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨ治療薬の患者への投与を実施してもよい。 After performing the NAFLD or NASH detection method or risk prediction method of the present invention, if necessary, other NAFLD or NASH detection methods are performed on patients and / or NAFLD or NASH therapeutic agents are administered to patients. May be implemented.
［２］ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キット
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キットは、アシルカルニチン総量を測定するための試薬を含むことができる。前記試薬は、個々のアシルカルニチンの量を測定して、それらの量を合算するための試薬であってもよく、生体試料内に存在するアシルカルニチンの量を一括して測定するための試薬であってもよい。アシルカルニチン総量を測定するための試薬は、好ましくは遊離カルニチン量を測定するための試薬とカルニチン総量を測定するための試薬との組み合わせである。遊離カルニチン量を測定するための試薬とカルニチン総量を測定するための試薬との組み合わせは、好ましくは、酵素サイクリング法を用いるための試薬である。[2] Diagnostic reagent kit for detecting NAFLD or NASH The diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH of the present invention can contain a reagent for measuring the total amount of acylcarnitine. The reagent may be a reagent for measuring the amount of individual acylcarnitines and adding them up, or a reagent for collectively measuring the amount of acylcarnitines present in a biological sample. There may be. The reagent for measuring the total amount of acylcarnitine is preferably a combination of a reagent for measuring the amount of free carnitine and a reagent for measuring the total amount of carnitine. The combination of the reagent for measuring the amount of free carnitine and the reagent for measuring the total amount of carnitine is preferably a reagent for using the enzyme cycling method.
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを検出するための診断薬キットは、質量分析計の内部標準液として、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ブチリルカルニチン、イソ吉草酸カルニチン、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン、グルタリルカルニチン、オクタノイルカルニチン、デカノイルカルニチン、ドデカノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、及びステアロイルカルニチンの少なくとも１つを含むアシルカルニチン組成物を含むことができる。アシルカルニチン組成物に含まれるアシルカルニチンは、同位体標識されていることが好ましい。同位体標識の例としては、放射性同位体による標識や、炭素、窒素、酸素、重水素などの元素による標識が挙げられるが、重水素による標識が好ましい。また、アシルカルニチンを溶解するための溶媒として、有機溶媒を挙げることができる。有機溶媒の中でも、炭素数１〜５の有機溶媒が好ましく、炭素数１〜５のアルコール及びアセトニトリルがより好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノールがさらに好ましい。本発明の診断薬キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、使用説明書などを含むこともできる。他の検査試薬としては、同時に測定されることが予定されるアミノ酸、スクシニルアセトンの検査試薬が挙げられ、具体的にはこれらの内部標準液が挙げられる。 The diagnostic kit for detecting NAFLD or NASH of the present invention comprises, as an internal standard solution of a mass spectrometer, acetylcarnitine, propionylcarnitine, butyrylcarnitine, carnitine isovalerate, carnitine 3-hydroxy-isovalerate, glutata An acylcarnitine composition comprising at least one of rilcarnitine, octanoylcarnitine, decanoylcarnitine, dodecanoylcarnitine, tetradecanoylcarnitine, tetradecenoylcarnitine, palmitoylcarnitine, and stearoylcarnitine can be included. The acylcarnitine contained in the acylcarnitine composition is preferably isotopically labeled. Examples of isotope labeling include labeling with a radioisotope and labeling with an element such as carbon, nitrogen, oxygen, deuterium, etc., but deuterium labeling is preferred. Moreover, an organic solvent can be mentioned as a solvent for melt | dissolving acyl carnitine. Among organic solvents, organic solvents having 1 to 5 carbon atoms are preferable, alcohols having 1 to 5 carbon atoms and acetonitrile are more preferable, and methanol, ethanol, and isopropanol are more preferable. In addition to the above, the diagnostic kit of the present invention can also contain other test reagents, specimen diluents, instructions for use, and the like. Other test reagents include amino acid and succinyl acetone test reagents that are scheduled to be measured at the same time, and specifically include these internal standard solutions.
［３］対象における肝線維化の進行度の判定方法
本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法では、生物学的試料中のアシルカルニチン総量に応じて、肝臓における線維化の進行度を判断することができる。本明細書において「肝線維化」とは、慢性的な肝臓の炎症により、コラーゲン線維などの線維性成分及び／又は細胞外基質を含む結合組織が肝臓に大量に増加し、組織が硬化することを意味する。本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに罹患している可能性のある対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うことができ、または、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに既に罹患している対象において、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨにより生じる肝線維化の進行度の判定を行うこともできる。アシルカルニチン、アシルカルニチン総量、及びアシルカルニチン総量の測定方法については、前述のとおりである。[3] Method for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject In the method for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject of the present invention, the degree of progression of fibrosis in the liver according to the total amount of acylcarnitine in a biological sample. Can be judged. In this specification, “liver fibrosis” means that connective tissue containing fibrous components such as collagen fibers and / or extracellular matrix is increased in the liver in large quantities due to chronic liver inflammation, and the tissue is hardened. Means. The method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject of the present invention can determine the degree of progression of liver fibrosis caused by NAFLD or NASH in a subject who may suffer from NAFLD or NASH, Alternatively, it is possible to determine the degree of progression of liver fibrosis caused by NAFLD or NASH in a subject already suffering from NAFLD or NASH. The methods for measuring acylcarnitine, acylcarnitine total amount, and acylcarnitine total amount are as described above.
（基準値）
本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法は、測定したアシルカルニチンの合計量を基準値と比較することを含む。本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法では、数値の範囲を基準値とすることができる。対象における肝線維化の進行度を判定する際には、予め、種々の肝線維化段階の対象の生体試料中のアシルカルニチン総量の範囲を計測しておき、対象の生体試料中のアシルカルニチン総量が、特定の肝線維化段階の生体試料中のアシルカルニチン総量の範囲に入る場合は、この対象はその特定の肝線維化段階である可能性が高い。
肝線維化段階の分類は、例えば、Ｆ０：線維化なし、Ｆ１：小葉中心部の線維化、Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化、Ｆ３：線維性架橋形成、Ｆ４：肝硬変、ＨＣＣ：肝細胞がんの区別に従うことができる。本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法は、対象の肝臓が上記Ｆ０〜Ｆ４のどの段階にあるかを判定することができる。ただ、上記Ｆ０〜Ｆ４の分類には限定されず、異なる分類を使用してもよい。(Standard value)
The method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject of the present invention includes comparing the total amount of acylcarnitine measured with a reference value. In the method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject of the present invention, a numerical range can be used as a reference value. When determining the progress of liver fibrosis in a subject, the range of the total amount of acylcarnitine in the biological sample of the subject at various liver fibrosis stages is measured in advance, and the total amount of acylcarnitine in the subject biological sample Is within the range of the total amount of acylcarnitine in a biological sample at a particular liver fibrosis stage, the subject is likely to be at that particular liver fibrosis stage.
The classification of liver fibrosis stages is, for example, F0: no fibrosis, F1: fibrosis in the central part of the leaflet, F2: fibrosis in the central part of the leaflet and portal vein area, F3: formation of fibrous bridge, F4: cirrhosis, HCC : Can follow the distinction of hepatocellular carcinoma. The method for determining the degree of progression of liver fibrosis in the subject of the present invention can determine at which stage F0 to F4 the subject liver is. However, the classification is not limited to the above F0 to F4, and different classifications may be used.
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。 The judgment threshold (reference value) is expected to change depending on various conditions such as the underlying disease, sex, age, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate population corresponding to the subject. The normal value range or the threshold for determination can be determined by performing statistical processing on the data obtained from the population.
本発明の対象における肝線維化の進行度の判定方法は、対象における肝線維化の進行度をモニタリングすることができる。この場合、特定の時点での対象のアシルカルニチン総量を、判定用閾値（基準値）として使用する。一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後）に再度この対象のアシルカルニチン総量を測定し、以前の測定値と比較してアシルカルニチン総量が多ければ、肝線維化が進行していると判断することができる。逆に、以前の測定値と比較してアシルカルニチン総量が同じ程度であるか又は少なければ、肝線維化が進行していないと判断することができる。 The method for determining the progress of liver fibrosis in the subject of the present invention can monitor the progress of liver fibrosis in the subject. In this case, the total amount of the target acylcarnitine at a specific time point is used as a determination threshold (reference value). After a certain period (for example, after 1, 3, 6, or 12 months), the total amount of acylcarnitine of this subject is measured again, and if the total amount of acylcarnitine is larger than the previous measured value, liver fibrosis proceeds. It can be determined that On the contrary, if the total amount of acylcarnitine is the same or less than the previous measurement value, it can be determined that liver fibrosis has not progressed.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
〔実施例１〕血清中のアシルカルニチン総量及び遊離カルニチン量の比較
液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）（積水メディカル社製）を用いて、血清中のアシルカルニチン総量及び遊離カルニチン量を測定し、肝細胞癌を有しないＮＡＦＬＤ患者（ｎ＝２２２）と肝細胞癌を有するＮＡＦＬＤ患者（ｎ＝２８）との間で比較した。[Example 1] Comparison of total amount of acylcarnitine and free carnitine in serum Using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method) and NeoSMAAT (registered trademark) (manufactured by Sekisui Medical), Serum acylcarnitine and free carnitine levels were measured and compared between NAFLD patients without hepatocellular carcinoma (n = 222) and NAFLD patients with hepatocellular carcinoma (n = 28).
１．血清サンプル
東京大学病院において、２０１１年１１月から２０１５年１２月まで、生検で証明されたＨＣＣを有する非アルコール性脂肪肝疾患患者（ＮＡＦＬＤ）２８人及び生検で証明されたＨＣＣを有しない非アルコール性脂肪肝疾患患者２２２人から採取した血清サンプル２５０検体を用いた。1. Serum samples 28 non-alcoholic fatty liver disease patients (NAFLD) with biopsy proven HCC and no biopsy proven HCC from November 2011 to December 2015 at the University of Tokyo Hospital 250 serum samples collected from 222 non-alcoholic fatty liver disease patients were used.
２．血清中のアシルカルニチン総量及び遊離カルニチン量の測定
採取した血清サンプルを、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）及びＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）を用いて測定した。ＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）には、重水素で同位体標識した、カルニチン（Ｃ０）、アセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＨ）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、及びステアロイルカルニチン（Ｃ１８）が内部標準として含まれている。測定対象物質であるそれぞれのアシルカルニチン又は遊離カルニチンのピーク面積と内部標準物質とのピーク面積の比を算出することにより、血清サンプル中に存在する測定対象物質の量及び濃度を求めることができる。2. Measurement of total amount of acylcarnitine and free carnitine in serum The collected serum samples were measured using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS method) and NeoSMAAT (registered trademark). NeoSMAAT® includes carnitine (C0), acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), carnitine isovalerate (C5), 3- Hydroxy-isovaleric acid carnitine (C5OH), glutarylcarnitine (C5DH), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), dodecanoylcarnitine (C12), tetradecanoylcarnitine (C14), tetradecenoyl Carnitine (C14: 1), palmitoylcarnitine (C16), and stearoylcarnitine (C18) are included as internal standards. By calculating the ratio of the peak area of each acylcarnitine or free carnitine that is the measurement target substance to the peak area of the internal standard substance, the amount and concentration of the measurement target substance present in the serum sample can be obtained.
ヒト血清検体１０μＬにＮｅｏＳＭＡＡＴ（登録商標）に添付の内部標準原液１０μＬを添加した。エタノール２００μＬをさらに添加して１０秒間撹拌した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）を実施し、上清をガラス製試験管に移した。窒素気流下（４０℃）で濃縮乾固した。ギ酸／アセトニトリル（０．０５：１０）１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。アセトニトリル１００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、３分）を実施し、上清をＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでアシルカルニチン量の測定を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は以下のとおりである。 10 μL of an internal standard stock solution attached to NeoSMAAT (registered trademark) was added to 10 μL of human serum specimen. An additional 200 μL of ethanol was added and stirred for 10 seconds. Centrifugation (10000 rpm, 4 ° C., 5 minutes) was performed, and the supernatant was transferred to a glass test tube. It was concentrated to dryness under a nitrogen stream (40 ° C.). 100 μL of formic acid / acetonitrile (0.05: 10) was added and stirred for 10 seconds with a vortex mixer. 100 μL of acetonitrile was added and stirred with a vortex mixer for 10 seconds. Centrifugation (2000 rpm, 4 ° C., 3 minutes) was performed, the supernatant was transferred to an HPLC vial, and the amount of acylcarnitine was measured by LC-MS / MS. The conditions of LC-MS / MS are as follows.
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）および４０００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）
＜ＬＣ条件＞
ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ａｍｉｄｅ (２．１×２５０ｍｍ, ３μｍ, ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ａ：２００ ｍｍｏｌ/Ｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ
Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：System: LC-20A series (manufactured by Shimadzu Corporation) and 4000QTRAP (manufactured by AB Sciex)
<LC conditions>
HPLC column: Inertsil Amide (2.1 × 250 mm, 3 μm, GL Sciences)
Mobile Phase A: 200 mmol / L Ammonium format
Mobile Phase B: Acetonitrile
Gradient:
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用ソフトウェアであるＡｎａｌｙｓｔ ｖｅｒ１．４．２（ＳＣＩＥＸ社製）を用いて、ピーク面積値、ピーク面積比、並びに逆回帰値及び測定値を算出した。 A peak area value, a peak area ratio, a reverse regression value, and a measured value were calculated using Analyst ver 1.4.2 (manufactured by SCIEX) which is software for LC-MS / MS.
なお、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値と重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１６ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１６ピーク面積値を算出し、Ｃ１６ＯＨピーク面積値と内部標準Ｃ１６ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ピーク面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の量は、予め濃度既知の重水素置換Ｃ１８：１ＯＨ面積値と重水素置換Ｃ１８ピーク面積値を測定しておき、換算係数として換算件数＝重水素置換Ｃ１８：１ＯＨピーク面積値／重水素置換Ｃ１８面積値を算出し、Ｃ１８：１ＯＨ面積値と内部標準Ｃ１８ピーク面積値より算出した濃度値を前記換算係数にて除して得られた換算濃度値を基にして算出した。 As for the amount of 3-hydroxy-hexadecanoylcarnitine (C16OH), a deuterium-substituted C16OH peak area value and a deuterium-substituted C16 peak area value with known concentrations were measured in advance, and the conversion number = deuterium substitution as a conversion factor. C16OH peak area value / deuterium substitution C16 peak area value is calculated, and based on the converted concentration value obtained by dividing the concentration value calculated from the C16OH peak area value and the internal standard C16 peak area value by the conversion factor. Calculated. The amount of octadecenoylcarnitine (C18: 1) is determined in advance by measuring the deuterium substitution C18: 1 area value and deuterium substitution C18 peak area value of known concentrations, and the conversion number = deuterium substitution C18 as a conversion factor. : 1 peak area value / deuterium substitution C18 area value is calculated, and the converted concentration value obtained by dividing the concentration value calculated from the C18: 1 peak area value and the internal standard C18 peak area value by the conversion factor is Based on the calculation. The amount of 3-hydroxy-octadecenoylcarnitine (C18: 1OH) is determined in advance by measuring a deuterium-substituted C18: 1OH area value and a deuterium-substituted C18 peak area value with known concentrations, and the conversion factor = Conversion obtained by calculating deuterium substitution C18: 1OH peak area value / deuterium substitution C18 area value and dividing the concentration value calculated from C18: 1OH area value and internal standard C18 peak area value by the conversion factor Calculation was based on the concentration value.
得られたアセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）、ヘキサノイルカルニチン（Ｃ６）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）、ステアロイルカルニチン（Ｃ１８）、オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）、及び３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の測定値を合算して患者ごとのアシルカルニチン総量とした。アシルカルニチン総量及び遊離カルニチン量に関して、肝細胞癌を有しないＮＡＦＬＤ患者（Ｎｏ ＨＣＣ：ｎ＝２２２）と肝細胞癌を有するＮＡＦＬＤ患者（ＨＣＣ：ｎ＝２８）とで比較したバイオリン図を図１に示す。 Obtained acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), carnitine isovalerate (C5), carnitine 3-hydroxy-isovalerate (C5OH), glutarylcarnitine (C5DC), hexa Noylcarnitine (C6), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), dodecanoylcarnitine (C12), tetradecanoylcarnitine (C14), tetradecenoylcarnitine (C14: 1), palmitoylcarnitine (C16) ), 3-hydroxy-hexadecanoylcarnitine (C16OH), stearoylcarnitine (C18), octadecenoylcarnitine (C18: 1), and 3-hydroxy-octadecenoylcarnitine (C18: 1OH). Total It was with an acyl carnitine total amount of each patient Te. FIG. 1 shows a violin diagram comparing NAFLD patients without hepatocellular carcinoma (No HCC: n = 222) and NAFLD patients with hepatocellular carcinoma (HCC: n = 28) with respect to the total amount of acylcarnitine and free carnitine. Show.
肝細胞癌を有しないＮＡＦＬＤ患者と肝細胞癌を有するＮＡＦＬＤ患者の間で、アシルカルニチン総量において、有意差が認められた（ｐ＝０．０００１）。一方で、遊離カルニチンに関しては、有意差は認められなかった（ｐ＝０．３９）。 There was a significant difference in the total amount of acylcarnitine between NAFLD patients without hepatocellular carcinoma and NAFLD patients with hepatocellular carcinoma (p = 0.0001). On the other hand, no significant difference was observed for free carnitine (p = 0.39).
〔実施例２〕他のバイオマーカーと比較したアシルカルニチン総量の有用性の検証
実施例１のアシルカルニチン総量の測定結果を用いて、アシルカルニチン総量のＮＡＳＨ関連肝細胞癌検出における有用性を他のバイオマーカーと比較した。比較対象として、腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びデス−γ−カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）を用いた。[Example 2] Verification of usefulness of total amount of acylcarnitine compared with other biomarkers Using the measurement result of total amount of acylcarnitine in Example 1, the usefulness of total amount of acylcarnitine in detection of NASH-related hepatocellular carcinoma was examined. Comparison with biomarkers. As comparison objects, tumor markers α-fetoprotein (AFP) and des-γ-carboxyprothrombin (DCP) were used.
統計解析は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ検定、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定を用いて、連続性および分類性の変化に対応する群間差異をそれぞれ試験した。血清アシルカルニチンレベル、並びに他の腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びデス−γ−カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）の予測性能を、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＲＯＣ）によって評価した。結果を図２に示す。 Statistical analysis was performed using the Wilcoxon rank sum test, Fisher's exact test, and Jonckheere-Terpstra test to test differences between groups corresponding to changes in continuity and classification. Serum acylcarnitine levels and the predictive performance of other tumor markers, α-fetoprotein (AFP) and des-γ-carboxyprothrombin (DCP), were evaluated by the area under the ROC curve (AUROC). The results are shown in FIG.
ＡＦＰのＡＵＲＯＣは０．９０であり、アシルカルニチン総量のＡＵＲＯＣは０．７２であり、ＤＣＰのＡＵＲＯＣは０．６２であった。アシルカルニチン総量のＡＵＲＯＣは、腫瘍マーカーとして用いられているＤＣＰよりも高い値を示した。したがって、アシルカルニチン総量がＮＡＳＨ関連肝細胞癌検出において、バイオマーカーとして使用できることが分かった。 AFP AUROC was 0.90, total acylcarnitine AUROC was 0.72, and DCP AUROC was 0.62. The total amount of acylcarnitine AUROC was higher than the DCP used as a tumor marker. Therefore, it was found that the total amount of acylcarnitine can be used as a biomarker in detecting NASH-related hepatocellular carcinoma.
〔実施例３〕種々の線維化進行度のＮＡＦＬＤ患者におけるアシルカルニチン総量の比較
実施例１において測定した血清サンプルを、患者の線維化の進行度に応じて以下のようにさらに細かく分類し、各進行度にカテゴライズされる血清サンプルに含まれるアシルカルニチン総量及び遊離カルニチン量を比較した。結果を図３に示す。
Ｆ０（ｎ＝３８）
Ｆ１−２（ｎ＝１２０）
Ｆ３−４（ｎ＝６４）
ＨＣＣ（ｎ＝２８）
（Ｆ０：線維化なし、Ｆ１：小葉中心部の線維化、Ｆ２：小葉中心部＋門脈域の線維化、Ｆ３：線維性架橋形成、Ｆ４：肝硬変、ＨＣＣ：肝細胞がん）[Example 3] Comparison of total amount of acylcarnitine in NAFLD patients with various degrees of fibrosis The serum samples measured in Example 1 were further classified into the following according to the degree of fibrosis of patients, The total amount of acylcarnitine and the amount of free carnitine contained in serum samples categorized according to the degree of progression were compared. The results are shown in FIG.
F0 (n = 38)
F1-2 (n = 120)
F3-4 (n = 64)
HCC (n = 28)
(F0: no fibrosis, F1: fibrosis in the central part of the leaflet, F2: fibrosis in the central part of the leaflet + portal vein area, F3: fibrous bridge formation, F4: cirrhosis, HCC: hepatocellular carcinoma)
その結果、線維化がＦ０、Ｆ１−２、Ｆ３−４、ＨＣＣと進行するにつれて、アシルカルニチン総量が多くなる傾向にあった。群間の個別の比較においても、Ｆ０群とＦ１−２群間のｐ値は０．０４１であり、Ｆ０群とＦ３−４群間のｐ値は０．０００２であり、いずれも有意差があった。遊離カルニチンに関しては、線維化が進行しても量的な変化は確認できなかった。したがって、アシルカルニチン総量を測定することにより、線維化の進行度を判定できることが分かった。 As a result, the total amount of acylcarnitine tended to increase as fibrosis progressed to F0, F1-2, F3-4, and HCC. Also in the individual comparison between the groups, the p value between the F0 group and the F1-2 group is 0.041, and the p value between the F0 group and the F3-4 group is 0.0002. there were. Regarding free carnitine, no quantitative change could be confirmed even when fibrosis progressed. Therefore, it was found that the progress of fibrosis can be determined by measuring the total amount of acylcarnitine.
〔参考例１〕線維化以外の診断基準に基づくアシルカルニチン総量の比較
実施例１において測定した血清サンプルを、日本消化器病学会ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ診療ガイドライン（２０１４年版）の８２頁のＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）に記載の患者肝臓の炎症度（Lobular inflammation）、風船様肥大（Ballooning）、及び脂肪肝（Steatosis）の各々の進行度に応じて分類し、各進行度における患者間のアシルカルニチン総量を比較した。分類基準は以下のとおりである。
炎症度：段階０：病巣なし、段階１：２００倍の視野で２箇所の病巣以下、段階２：２００倍の視野で２〜４箇所の病巣、段階３：２００倍の視野で４箇所以上の病巣、
風船様肥大：段階０：肥大なし、段階１：少数の風船様変性細胞、段階２：多数の風船様変性細胞、
脂肪肝：段階１：５〜３３％、段階２：３３〜６６％、段階３：６６％以上。
結果を図４に示す。炎症度、風船様肥大、及び脂肪肝のいずれにおいても、各段階の患者群間において、アシルカルニチン総量に有意差は確認できなかった。[Reference Example 1] Comparison of total amount of acylcarnitine based on diagnostic criteria other than fibrosis The serum sample measured in Example 1 was NAS (NAFLD Activity) on page 82 of the Japanese Society of Gastroenterology NAFLD / NASH Clinical Practice Guidelines (2014 edition). Score) is classified according to the degree of progression of patient liver inflammation (Lobular inflammation), balloon-like hypertrophy (Ballooning), and fatty liver (Steatosis), and the total amount of acylcarnitine between patients at each degree of progression Compared. The classification criteria are as follows.
Inflammation level: Stage 0: No lesion, Stage 1: 2 or less lesions with 200x field of view, Stage 2: 2 to 4 lesions with 200x field of view, Stage 3: 4 or more lesions with 200x field of view Lesion,
Balloon-like hypertrophy: Stage 0: No hypertrophy, Stage 1: A few balloon-like degenerative cells, Stage 2: Many balloon-like degenerative cells,
Fatty liver: Stage 1: 5 to 33%, Stage 2: 33 to 66%, Stage 3: 66% or more.
The results are shown in FIG. There was no significant difference in the total amount of acylcarnitine among the patient groups at each stage in any of the degree of inflammation, balloon-like hypertrophy, and fatty liver.
〔参考例２〕液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて計測したアシルカルニチン総量と酵素サイクリング法を用いて計測したアシルカルニチン総量との相関の検討
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるアシルカルニチン総量測定では、個々のアシルカルニチンの量を測定してそれらの量を合算する。一方で、酵素サイクリング法では、生体試料内に存在するアシルカルニチンの量を血中カルニチン２分画検査により測定する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる代表的なアシルカルニチン種の合計量をアシルカルニチン総量として使用できるかどうかの検討を行った。[Reference Example 2] Examination of correlation between total amount of acylcarnitine measured using liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) and total amount of acylcarnitine measured using enzyme cycling method LC-MS / In the measurement of the total amount of acylcarnitine by MS, the amount of individual acylcarnitines is measured, and these amounts are added together. On the other hand, in the enzyme cycling method, the amount of acylcarnitine present in a biological sample is measured by a blood carnitine two-fraction test. It was examined whether the total amount of representative acylcarnitine species by LC-MS / MS can be used as the total amount of acylcarnitine.
成人検体血清３６検体（日本人男性１８人、日本人女性１８人）を購入（２３検体；Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）又はボランティアから採血し（１３検体）、実験に用いた。実施例１と同じ方法で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて検体中のアセチルカルニチン（Ｃ２）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）、ブチリルカルニチン（Ｃ４）、イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５）、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン（Ｃ５ＯＨ）、グルタリルカルニチン（Ｃ５ＤＣ）、ヘキサノイルカルニチン（Ｃ６）、オクタノイルカルニチン（Ｃ８）、デカノイルカルニチン（Ｃ１０）、ドデカノイルカルニチン（Ｃ１２）、テトラデカノイルカルニチン（Ｃ１４）、テトラデセノイルカルニチン（Ｃ１４：１）、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、３−ヒドロキシ−ヘキサデカノイルカルニチン（Ｃ１６ＯＨ）、ステアロイルカルニチン（Ｃ１８）、オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１）及び３−ヒドロキシ−オクタデセノイルカルニチン（Ｃ１８：１ＯＨ）の量を測定し、測定値を合算して被験者ごとのアシルカルニチン総量とした。酵素サイクリング法によるアシルカルニチン総量に関しては、ＳＲＬ社に依頼して測定した。ＳＲＬ社は、カイノス社の測定キット（Ｔ−Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ試薬 カイノス、及びＦ−Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ試薬 カイノス）を使用してアシルカルニチン総量を測定している。カイノス社の測定キットは、酵素としてアシルカルニチンエステラーゼ及びカルニチンデヒドロゲナーゼを使用しており、そして、補酵素としてβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋）及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の２種を使用している。結果を図５に示す。36 adult serum samples (18 Japanese men and 18 Japanese women) were purchased (23 samples; Bioreclamation) or collected from volunteers (13 samples) and used for experiments. In the same manner as in Example 1, using LC-MS / MS, acetylcarnitine (C2), propionylcarnitine (C3), butyrylcarnitine (C4), carnitine isovalerate (C5), 3-hydroxy- Carnitine isovalerate (C5OH), glutarylcarnitine (C5DC), hexanoylcarnitine (C6), octanoylcarnitine (C8), decanoylcarnitine (C10), dodecanoylcarnitine (C12), tetradecanoylcarnitine (C14) Tetradecenoylcarnitine (C14: 1), palmitoylcarnitine (C16), 3-hydroxy-hexadecanoylcarnitine (C16OH), stearoylcarnitine (C18), octadecenoylcarnitine (C18: 1) and 3-hydroxy -Octadesenoi Carnitine: The amount of (C18 1 OH) was measured and the acylcarnitines total amount of each subject by summing the measured values. The total amount of acylcarnitine by the enzyme cycling method was measured by requesting SRL. SRL measures the total amount of acylcarnitine using a measurement kit (T-Carnitine reagent Kinos and F-Carnitine reagent Kinos) manufactured by Kinos. The Kinos measurement kit uses acylcarnitine esterase and carnitine dehydrogenase as enzymes, and β-thionicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (Thio-NAD + ) and β-nicotinamide adenine dinucleotide as coenzymes. Two types (reduced type (NADH)) are used. The results are shown in FIG.
図５に示すように、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて計測したアシルカルニチン総量と酵素サイクリング法を用いて計測したアシルカルニチン総量とは、良好な相関を示した。 As shown in FIG. 5, there is a good correlation between the total amount of acylcarnitine measured using a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) and the total amount of acylcarnitine measured using the enzyme cycling method. Indicated.
本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的にＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの診断を行うことができる。本発明によれば、対象が肝細胞癌に進行する前に、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを検出することができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず且つ簡易的に、対象における肝線維化の進行度の判定を行うことができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a NAFLD and NASH can be diagnosed simply and without burdening a patient and a medical worker. According to the present invention, NAFLD and NASH can be detected before the subject progresses to hepatocellular carcinoma. According to the present invention, it is possible to easily determine the degree of progression of liver fibrosis in a subject without burdening the patient and medical staff.
Claims (4)
測定したアシルカルニチン総量を基準値と比較することと
を含む、対象における肝線維化の進行度を判定するための方法。 Measuring the total amount of acylcarnitine in blood, serum, or plasma from a subject potentially suffering from NAFLD or NASH and comparing the measured total amount of acylcarnitine to a reference value. A method for determining the progression of liver fibrosis.
前記カルニチン総量から遊離カルニチン量を減算することにより、アシルカルニチン総量を測定することと
を含む、請求項１に記載の対象における肝線維化の進行度を判定するための方法。 The subject according to claim 1 , comprising measuring a total amount of carnitine which is a total amount of free carnitine and total amount of acylcarnitine, and measuring the total amount of acylcarnitine by subtracting the amount of free carnitine from the total amount of carnitine. A method for determining the degree of progression of liver fibrosis.
前記アシルカルニチン組成物が、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ブチリルカルニチン、イソ吉草酸カルニチン、３−ヒドロキシ−イソ吉草酸カルニチン、グルタリルカルニチン、オクタノイルカルニチン、デカノイルカルニチン、ドデカノイルカルニチン、テトラデカノイルカルニチン、テトラデセノイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、及びステアロイルカルニチンの少なくとも１つを含む前記診断薬キット。 A diagnostic kit for determining the degree of progression of liver fibrosis in a subject who may suffer from NAFLD or NASH, comprising an acylcarnitine composition as an internal standard solution of a mass spectrometer,
The acyl carnitine composition is acetyl carnitine, propionyl carnitine, butyryl carnitine, isovaleric acid carnitine, 3-hydroxy-isovaleric acid carnitine, glutaryl carnitine, octanoyl carnitine, decanoyl carnitine, dodecanoyl carnitine, tetradecanoyl. The diagnostic agent kit comprising at least one of carnitine, tetradecenoylcarnitine, palmitoylcarnitine, and stearoylcarnitine.
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