JP6591036B2 - Ｈｐ１の機能に着目した抗癌剤のスクリーニング方法及び評価系 - Google Patents

Ｈｐ１の機能に着目した抗癌剤のスクリーニング方法及び評価系 Download PDF

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Description

本発明は、染色体不安定性を評価する方法、この評価方法を用いて抗癌剤をスクリーニングする方法、及び染色体不安定性を評価するための抗体に関する。
細胞分裂において、染色体の分配過程は、多細胞生物の恒常性を維持するための最も基本的な生命現象の一つである。すなわち、個体の発生や次世代に遺伝情報を正確に伝えるためには、細胞分裂の過程において複製した染色体を正確にかつ過不足なく分配することが必須である。
異常な染色体分配により生じる染色体数の過不足は、悪性形質の獲得をもたらすと考えられている。すなわち、多くの癌細胞では、細胞分裂のたびに染色体が多くなったり少なくなったりする「染色体不安定性」という形質が観察され、その結果、染色体数が元の細胞と変異している異数性が見られる。異数性は癌遺伝子のコピー数の増加や癌抑制遺伝子のコピー数の減少につながる。そのため、染色体不安定性の形質の獲得と細胞の悪性化形質の獲得とは深く関連していると考えられている（非特許文献１）。
さらに、染色体不安定性が癌細胞の多様化を引き起こし、癌には様々な染色体の異常をもった細胞が増えてしまい、そのことが癌の治療を難しくしている。このような、癌を構成する細胞の多様化は、進行した癌の共通した特徴であることから、染色体の安定化または染色体不安定化細胞の排除が、癌の治療につながると考えられている。そこで、染色体の不安定性に着目した抗癌治療によって進行した癌に広く奏効する薬ができることが期待されている。しかし、こうした臨床的な期待にもかかわらず、染色体不安定性の発生メカニズムは、まだよく分かっていない。
細胞分裂は細胞周期の中の非常に短い時間にすぎないが、その短い時間の中でダイナミックかつ正確に染色体の分配が制御されている。したがって、細胞分裂は極めて精密にかつ適時に各過程が制御されていなければならい。分子レベルでは、プロテインキナーゼ、ホスファターゼの競合をベースとした一連のタンパク質リン酸化によって制御されており、なかでも生物学的に普遍的なプロテインキナーゼであるＡｕｒｏｒａ Ｂの研究が進んでいる（非特許文献２、３）。Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性の低下は、誤った動原体に結合した微小管の結合解除という必須の細胞機能を損ない、染色体分配の異常を引き起こすことが示唆されており、染色体分配異常の発生に深くかかわっていると予測されている（非特許文献４）。
セリン・スレオニン・キナーゼであるＡｕｒｏｒａキナーゼには、ヒト細胞においては３種類（Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ｂ、Ｃ）が存在し、Ｃ末端のキナーゼドメインに高い相同性を持っている。このうちＡｕｒｏｒａ Ｂは、ＩＮＣＥＮＰ（Inner Centromere Protein）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎ／Ｄａｓｒａと染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex、ＣＰＣ）を構成している。ＣＰＣは、細胞分裂の時期によって異なる局在を示し、微小管と動原体との結合を感知し、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性を調節し、微小管と染色体の誤った接続を修正したり、染色体分配から細胞分裂まで一連の過程を制御していることが明らかとなっている。特に、前述の通り、微小管と動原体の結合は、正確な染色体分体の鍵となる過程であり、癌の染色体不安定性との関連性が注目されている。
Ａｕｒｏｒａ ＢはＣＰＣの構成要素であり、上記のように癌の染色体不安定性に関わっていると考えられている。また、Ａｕｒｏｒａ Ｂは、多くのがん細胞において高発現が認められ，その高発現は予後の不良と関連している。そのため、Ａｕｒｏｒａキナーゼの阻害剤は新しい抗癌剤の候補として注目を集めている（特許文献１〜３）。Ａｕｒｏｒａキナーゼの阻害剤は、細胞分裂期のみに作用すると考えられることから、細胞分裂をひたすら繰り返す癌細胞に選択的に作用するので、分裂することが稀な正常組織の細胞傷害は低いと考えられる。実際に、Ａｕｒｏｒａキナーゼの阻害剤として開発されたＭＮＬ８２３７（alisertib）、ＶＸ−６８０等、新規抗癌剤として臨床試験が開始された化合物も存在する（特許文献４、５）。しかしながらその薬効は十分とは言えない。その原因として、これらの阻害化合物は、ＡｕｒｏｒａキナーゼのＡＴＰ結合部位に対して拮抗的に結合する阻害剤であることから、開発当初の予想とは異なりＡｕｒｏｒａキナーゼ以外の他のキナーゼのＡＴＰ結合部位にも結合し、阻害する可能性があることが指摘されている。
特表２０１０−５２３５３４号公報 特表２０１５−５２０２２２号公報 国際公開第２０１４／１１２１４４号 国際公開第２００８／０６３５２５号 国際公開第２００８／０１３８０７号
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制御不能になって増殖を続けるのが癌細胞の特徴であることから、細胞増殖のコントロールが効かなくなった癌細胞の染色体不安定性に着目した化学療法を実現することができれば、進行した癌に広く奏功することが期待される。つまり、「染色体不安定性」の原因を明らかにして、不安定化細胞の抑制又は不安定化細胞に致死を導き、癌の多様性を排除しようという治療アプローチである。しかしながら、染色体不安定性の分子的機構についての理解は乏しく、有効な分子標的薬を作る手段が今までにはなかった。
本発明は、癌細胞と正常細胞の細胞分裂の違いを明確にして、癌細胞の細胞分裂を特異的に標的にし得る抗癌剤をスクリーニングする方法、及びそのための系を提供することを課題とする。
本発明者らは、分裂期特異的なＣＰＣの動的構造解析を行う過程で、ＨＰ１（heterochromatin protein 1）のＣＰＣへの結合が、染色体の分配に重要な役割を担っていることを突き止めた。本発明は、これに基づいてＨＰ１とＣＰＣとの相互作用あるいはその変動を検出することによって、癌細胞におけるＡｕｒｏｒａ Ｂの機能を評価し、そこに脆弱性をもつ癌細胞の細胞分裂を選択的に標的とする抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。また、ＨＰ１のリン酸化を介して、Ａｕｒｏｒａ Ｂの機能を定量的・定性的に評価することができるＨＰ１αの９２位のセリンのリン酸化を特異的に検出する抗体を提供する。当該抗体は染色体不安定性の評価系に広く用いることができる。
本発明は癌細胞の染色体不安定化に着目し、また染色体分配の制御因子であるＡｕｒｏｒａ Ｂの発現程度にかかわらず、Ａｕｒｏｒａ Ｂの機能を指標とした抗癌剤のスクリーニング法を提供する。本発明は以下の評価方法、スクリーニング方法、及び抗体に関する。
（１）ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化を指標としてＡｕｒｏｒａ Ｂ活性を判定することを特徴とする染色体不安定性評価方法。
（２）（１）記載の染色体不安定性評価方法であって、前記ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化は、ＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化であることを特徴とする評価方法。
（３）（２）記載の染色体不安定性評価方法であって、前記ＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化は、抗体によって検出するものであることを特徴とする評価方法。
（４）抗癌剤のスクリーニング方法であって、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの相互作用又は結合の変動を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
（５）（４）記載の抗癌剤のスクリーニング方法であって、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの相互作用又は結合の変動を指標として化合物を選択する第一工程と、選択した化合物を細胞分裂時の染色体分配の正確度をイメージングで計測する第二工程とを有することを特徴とするスクリーニング方法。
（６）（４）又は（５）記載の抗癌剤のスクリーニング方法であっ前記ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合の変動の指標がＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化であることを特徴とするスクリーニング方法。
（７）（６）記載の抗癌剤のスクリーニング方法であって、前記ＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化は、抗体によって検出するものであることを特徴とするスクリーニング方法。
（８）（４）記載の抗癌剤のスクリーニング方法であって、前記結合の変動がイン・ビトロ解析によるＨＰ１と１２１位〜２７０位の配列を含むＩＮＣＥＮＰとの結合の変動であることを特徴とするスクリーニング方法。
（９）（８）記載の抗癌剤のスクリーニング方法であって、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの前記結合の変動をバインディングアッセイ又はアルファアッセイにより解析することを特徴とするスクリーニング方法。
（１０）ＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化を特異的に認識する抗体、又はその機能的断片。
（１１）ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化を検出することにより、Ａｕｒｏｒａ Ｂ活性及び／又は染色体不安定性を判定することを特徴とするＨＰ１αの９２番目のセリン及び／又はＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化を特異的に認識する抗体の利用方法。
（１２）前記ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化の検出が、イムノブロット法、免疫沈降法、免疫染色法の少なくともいずれか１つによるものであることを特徴とする（１１）記載の利用方法。
脆弱化した染色体分配機能に分子標的薬でピンポイントに負荷をかけるという治療薬は今までに開発されていない。従来の分子標的薬は、疾患の発症に関与する亢進した機能（Gain of function）を抑える治療薬である。すなわち、癌の発症に関与するドライバー遺伝子を同定し、これに対する阻害薬をスクリーニングして得られたものである。一方、本発明のスクリーニング方法によれば、細胞の喪失した機能（Loss of function）に関与する分子を標的とする治療薬を得ることができる。細胞の喪失した機能を標的とするという分子標的薬の開発は今までにはない全く新しいコンセプトに基づくものである。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、染色体の不安定性に対して作用するという従来にはない新しいコンセプトで得られる抗癌剤であり、ドライバー遺伝子変異への感受性・依存性が低下したり、細胞増殖因子のシグナルが多様化して、従来の薬剤に不応な細胞にも作用し得るから、癌の種類を選ばず、広範な種類の癌、また、薬剤耐性となった癌にも作用し得る。
ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合量を示す。図１ＡはＣＰＣの免疫沈降実験に用いた抗ＩＮＣＥＮＰ抗体の特異性を示す図。図１Ｂは、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、及びＨＰ１のサブタイプ（α、β、γ）とＩＮＣＥＮＰの結合を示す図。図１ＣはＨＰ１サブタイプをｓｉＲＮＡによりそれぞれ発現抑制し、ＩＮＣＥＮＰとの結合を解析した図。図１Ｄは、ＨＰ１各サブタイプのＣＰＣへの結合の定量的な解析結果を示す図。 ＨＰ１各サブタイプのＩＮＣＥＮＰへの結合を示す図。図２Ａは正常細胞株ＲＰＥ１細胞（ヒト網膜色素上皮細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞）でのＩＮＣＥＮＰへのＨＰ１の結合を示す図。図２Ｂは、ＨＰ１各サブタイプ、及びＩＮＣＮＥＮＰのセントロメアへの局在を示す図。 悪性形質転換の有無によるＭ期のＨＰ１各サブタイプのＣＰＣへの結合量の違いを示す。図３Ａ、Ｂは、種々の正常細胞株と種々の癌細胞株でのＩＮＣＥＮＰに結合しているＨＰ１サブタイプの量を示す図。癌細胞では、ＩＮＣＥＮＰに結合するＨＰ１の量がいずれも減少していることを示している。 ＨＰ１のＣＰＣにおける機能を示す。図４ＡはＨＰ１を発現抑制させることによるＣＰＣの複合体形成への影響を示す図。図４Ｂ〜ＤはＨＰ１の発現を抑制させることによるＡｕｒｏｒａ Ｂの基質（Ｈ３、Ｈｅｃ1、Ｄｓｎ1）に対するリン酸化への影響を示す図。ＨＰ１のＲＮＡｉまたはＡｕｒｏｒａ Ｂ阻害剤（ＺＭ）によってＡｕｒｏｒａ Ｂによるリン酸化が抑制される。 ＨＰ１のＳｅｒ９２のリン酸化を特異的に認識する抗体（抗ＨＰ１α−ｐＳ９２）の反応性の解析結果を示す。図５ＡはＨＰ１αの９２位のセリンの周辺の領域を模式的に示す図。９２位がセリンの場合にはＡｕｒｏｒａ Ｂによってリン酸化されるが、アラニンに置換された変異体Ｓ９２Ａはリン酸化されない。図５Ｂ、Ｃ、Ｄは抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体の特異性を検討した図。図５Ｂは、細胞分裂間期、ＨＰ１のｓｉＲＮＡによる発現抑制、Ａｕｒｏｒａ Ｂ阻害剤ＺＭでＡｕｒｏｒａ Ｂのリン酸化を阻害すると、ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体が反応しないことを示す。図５Ｃは抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体の特異性を示す図。抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、ＧＦＰ−ＨＰ１αと内在性ＨＰ１αには反応するが、９２位のセリンをアラニンに換えたＧＦＰ-ＨＰ１αＳ９２Ａ変異体には反応しない。図５Ｄは抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体が分裂中期のＨＰ１αを検出することを示す図。図５Ｅは抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体によりセントロメアに局在するＨＰ１αが検出されることを示す図。図５Ｆ、５Ｇは抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体によりＣＰＣを構成するタンパク質が効率よく免疫沈降されてくることを示す図。図５ＨはＨＰ１αのリン酸化とＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化の相関を示す図。抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体を用いてＣＰＣを免疫沈降すると、ＩＮＣＥＮＰ特異抗体を用いて免疫沈降したＣＰＣに比べて、ＨＰ１結合量が多いことを示す（左側）。またＨＰ１結合量が多いＣＰＣの方がＡｕｒｏｒａ Ｂ活性が高いことを示す（右側）。 ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合は、Ａｕｒｏｒａ Ｂのキナーゼ活性を増強・維持する、つまりＨＰ１はＡｕｒｏｒａ Ｂのアロステリック活性化因子であることを示す。図６ＡはＨＰ１に結合しないＩＮＣＥＮＰ変異体の模式的構造（図６Ａ左）、及びその発現を示す図（図６Ａ右）。図６ＢはＨＰ１に結合しないＩＮＣＥＮＰ変異体の発現によりＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ活性が抑制されることを示す図。図６Ｃ、６ＤはＨＰ１存在下、非存在下でのＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ活性を示す図。図６Ｅは、ＩＮＣＥＮＰに結合しないＨＰ１変異体ではＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ活性の増強は起きないことを示す図。図６Ｆはリン酸化型ＨＰ１が結合しているＣＰＣ構成タンパク質のリン酸化を解析した図。図６Ｇは、ＨＰ１αの添加によってＡｕｒｏｒａ Ｂの酵素反応速度が上昇すること示した図。図６ＨはＨＰ１がＩＮＣＥＮＰと結合することによりＡｕｒｏｒａ Ｂの基質への親和性が高くなっていることを示す図。 動原体におけるＡｕｒｏｒａ Ｂ基質であるＨｅｃ１のリン酸化には、ＨＰ１によるＣＰＣのアロステリックな調節が不可欠であることを示す。図７ＡはＨＰ１に結合しないＩＮＣＥＮＰ変異体発現細胞では、Ｈｅｃ１のリン酸化が抑えられることを示す。図７Ａで用いたＨＰ１に結合しないＩＮＣＥＮＰ変異体は、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性が低いために二次的にセントロメアへの局在量が低下する。そこで、セントロメアにおけるＣＰＣ量が減少したことによる影響を検討するため、図７Ｂでは、ＣＰＣを強制的にセントロメアに局在させるＣＢ−ＩＮＣＥＮＰ−ＥＧＦＰを用いて同様の解析をした。その結果、Ｈｅｃ１のリン酸化が同様に抑制されたことから、ＨＰ１のアロステリックな活性化が一義的に重要であることが示された。 正常細胞と癌細胞でのＡｕｒｏｒａ Ｂの活性の違いを示す。図８Ａは形質転換していない細胞と癌細胞とでＡｕｒｏｒａ Ｂの基質のリン酸化の違いを示す図。図８Ｂ、ＣはＡｕｒｏｒａ Ｂの基質であるＤｓｎ１のリン酸化の細胞種による違いを示す図。図８ＤはＲＰＥ１細胞、ＨｅＬａ細胞において、ＩＮＣＥＮＰ変異体を用い、内在性ＩＮＣＥＮＰも枯渇させた状態でＡｕｒｏｒａ Ｂの基質のリン酸化の変化を示す図。 正常細胞においてＨＰ１のＣＰＣへの結合が正確な染色体分離に必要であることを示す。図９Ａは正常細胞、癌細胞、それぞれに由来する細胞株において、細胞が野生型あるいはＨＰ１に結合しないＩＮＣＥＮＰ変異体を発現したときに発生する染色体分配エラーの変化を示す。図９ＢはＨＰ１を過剰発現させ、染色体分配エラーを解析した図。図９Ｃは正常細胞と癌細胞でのＨＰ１のＣＰＣへの結合、Ａｕｒｏｒａ Ｂ活性を模式的に示す。癌細胞では正常細胞に比べて、正確な染色体分離に必要な量（閾値）のＨＰ１がＣＰＣに結合しないため、Ａｕｒｏｒａ Ｂのキナーゼ活性が不足し、染色体分離のミスの頻度が増大する。図９ＤはＲＰＥ細胞において悪性形質転換によりＩＮＣＥＮＰへのＨＰ１の結合が減少することを示す図。
本発明者らは、細胞分裂に伴う染色体の分配を詳細に解析した結果、Ａｕｒｏｒａ Ｂが適正に機能して、染色体分配の正確性を保障するためにはＨＰ１がＣＰＣに結合することによるアロステリックな効果が不可欠であることを見出し、本発明を完成した。本発明者らにより分子レベルで解明された癌細胞と正常細胞の分裂の違いを利用して、抗癌剤をスクリーニングすることができる。
また、本発明の染色体不安定性の評価方法によって、ＨＰ１α、γのリン酸化を指標として、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化を評価することができる。したがって、単にＡｕｒｏｒａ Ｂの量的な違いのみに注目して得られた従来の抗癌剤とは異なり、広範な癌細胞に特異的に作用する抗癌剤を得られる可能性がある。特に、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）によって選択されたヒット化合物をさらにライブ・イメージング解析によって解析し、癌細胞特異的に染色体分配異常を増幅して細胞死を誘導する化合物であるかを判断できる。これにより、癌細胞に特異的な化合物を選択することが可能となる。
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、ＨＰ１とＣＰＣとの相互作用、結合の変動に影響を与えることのできる化合物を探索し得る方法であれば、どのような方法を用いてもよい。ここで、結合の変動とは、量的な変化だけではなく、ＨＰ１のリン酸化の程度、ＩＮＣＥＮＰとの結合量、局在の変化など質的な変化を指す。例えば、ＨＰ１が直接結合するＩＮＣＥＮＰとの相互作用に影響を与える化合物をＨＴＳにより探索することができる。ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰが結合する領域はすでに解析されていることから、その領域を用いた大腸菌の発現系、培養細胞の発現系を利用することができる。本発明者らは、すでにバインディングアッセイ、アルファアッセイによりＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合を解析可能な系を構築していることから、これを利用して化合物のスクリーニングを行うことができる。
また、染色体不安定性を獲得した癌細胞では、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰとの結合が低下しているのに対し、染色体が安定で二倍体を維持している培養細胞では、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰとの結合が高い傾向があることが明らかとなった。したがって、これら２種類の培養細胞に対して、作用の異なる化合物をスクリーニングすることも可能である。
さらに、癌細胞においては、内在性のＨＰ１量及びＡｕｒｏｒａ Ｂの発現量によって化合物の作用が異なる可能性がある。そこで、ＨＴＳで得られた化合物は、細胞の分裂像の観察による染色体分離ミスの頻度を計測するという細胞レベルでの評価検討を行うことで、候補化合物を絞り込むことができる。
本発明者らは、ＨＰ１がＣＰＣに結合することがＡｕｒｏｒａ Ｂを十分に活性化するのに必要であることを見出した。さらに、当該活性化が生じている際にＣＰＣに結合しているＨＰ１αは、９２番目のセリン残基がリン酸化していることを明らかにした。このリン酸化を特異的に認識する抗体（ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体）は、細胞内でのＡｕｒｏｒａ Ｂの働きを評価するツールにもなり得る。ＨＰ１αの分裂期におけるＣＰＣへの結合やＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化はＨＰ１αのリン酸化と相関することから、この抗体を用いることによって、単にＨＰ１αのリン酸化だけではなく、ＣＰＣ、Ａｕｒｏｒａ Ｂの機能を評価することができる。
具体的には、得られた候補化合物で培養細胞を処理した後、Ｍ期におけるＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化をＨＰ１αのリン酸化を特異的に認識する抗体で検出し解析を行えばよい。さらに、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化に対して効果のあった化合物で、癌細胞と正常二倍体細胞とを処理し、細胞増殖曲線、死細胞の割合変化により薬効を評価すればよい。また、癌細胞が特異的に感受性を示した化合物については、化合物処理後の細胞分裂像をライブ・イメージングにより観察し、致死性の染色体分配異常の発生の有無を調べる等、細胞増殖が抑えられた原因を確認することができる。本発明でいうライブ・イメージングとは、染色体分配の状況を可視的に計測できる方法であれば手法を問わないが、例えば、染色体を蛍光体で標識した細胞を作製し、その細胞分裂像のタイムラプス画像を４Ｄ共焦点倒立型蛍光顕微鏡装置を用いて自動的に取得して、網羅的に染色体動態を解析する方法が挙げられる。
このスクリーニング方法は、染色体分配異常を起こす癌細胞の機能を修正するのではなく、ＨＰ１-ＣＰＣ結合不全に基づく染色体分配異常という特性を獲得した癌細胞の異常をさらに増悪させることによって致死的な方向に導き、結果として癌細胞を根絶するという本発明者らの新規知見から導き出された機序に基づくものである。したがって、十分なＨＰ１-ＣＰＣ結合により染色体分配異常を起こさない正常細胞には影響は少ないと期待され、これにより、癌細胞の細胞分裂を特異的に標的とする化合物を得ることができる。
従来は、癌細胞に過剰に発現する因子を阻害的に抑止することで抗癌活性を得ることを狙った抗癌剤が多く、この場合、当該因子が癌細胞よりも少ない発現量で細胞機能を維持する正常細胞にも傷害を引き起こし、重大な副作用（具体的な臨床像では、白血球減少、脱毛、嘔吐、全身倦怠など）が問題になる場合が多かった。しかし、本発明の機序に基づいて選択された染色体不安定化の増幅化合物によれば、癌細胞で特徴的に低下している機能である細胞分裂異常にさらに負荷をかけて、癌細胞を死滅させることができる。この場合、高レベルで維持されている正常細胞の機能に対する悪影響は軽微であると期待でき、従来の抗癌剤に比べて副作用の軽微な化合物を見出すことにつながることが期待される。
一方、ＨＰ１には、α、β、γの３つのサブタイプがあるが、ＨＰ１γも細胞分裂時にＡｕｒｏｒａ Ｂによってリン酸化を受ける部位があることが判明している。ＨＰ１αの９２位のセリン周辺のアミノ酸配列の相同性から、ＨＰ１γはＳｅｒ８３がリン酸化部位であると考えられる。したがって、ＨＰ１γのセリンのリン酸化を特異的に認識する抗体も、ＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化を認識する抗体同様に使用することができる。ＨＰ１γの８３位のセリンのリン酸化を特異的に認識する抗体は、本発明で記載している方法、あるいは公知の方法に基づいて作製することができる。
本発明では、上記のＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化を認識する抗体として、ウサギを免疫して得られたポリクローナル抗体を用いているが、当該部位のリン酸化を認識するものであればどのような抗体を用いてもよい。すなわち、本発明の抗体としてはＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化を認識するモノクローナル抗体や、抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片は、ペプシン、又はパパインなどの酵素によって消化する等公知の方法によって得ることができる。
以下にＨＰ１の作用について詳しく説明しながら、本発明について詳述する。まず、使用した試薬、方法等について概略を記載する。
（１）抗体
本発明において、作製した抗体は以下の通りである。ＩＮＣＥＮＰ抗体はウサギに合成ペプチドＣ+ＤＬＥＤＩＦＫＫＳＫＰＲＹＨＫＲＴＳＳ（配列番号１、アミノ酸８７６〜８９４位）を免疫することにより作製し、抗原に対してアフィニティ精製して用いた。ＨＰ１αの９２位のセリンのリン酸化を特異的に検出する抗体は、合成ペプチドＣ+ＮＫＲＫ（ｐＳ）ＮＦＳＮＳ（配列番号２、アミノ酸８８〜９７位）をウサギに免疫することによって作製した。得られた抗体はリン酸化ペプチド、非リン酸化ペプチドのカラムを用い、アフィニティ精製して用いた。また、市販の抗体については、順次記載する。
（２）細胞培養
ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞株）、ＲＰＥ１（網膜色素上皮細胞株）、ＴＩＧ−３（胎児肺由来細胞株）、Ｕ２ＯＳ（骨肉腫細胞株）、ＨＴ−１０８０（線維肉腫細胞株）、Ａ５４９（肺胞基底上皮腺癌細胞株）、ＢＪ（線維芽細胞株）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（膵癌細胞株）、ＨＣＴ１１６（結腸腺癌細胞株）、ＤＬＤ−１細胞（結腸腺癌細胞株）はＤＭＥ培地、Ｈ５２２（肺腺癌細胞株）、ＰＫ４５Ｈ細胞（膵癌細胞株）はＲＰＭＩ−１６４０、ＬｏＶｏ細胞（大腸癌細胞株）はＨａｍＦ１２にそれぞれ１０％ ＦＣＳ、０．２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
（３）ＲＮＡｉ
ｓｉＲＮＡの標的配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）は以下のとおりである。
ＩＮＣＥＮＰ（ＯＲＦ）：5’-CAGUGUAGAGAAGCUGGCUACAGUG-3’(配列番号３)
ＨＰ１α（５’ＵＴＲ）：5’-CCUUAGUCUUUCAGGUGGAACGGUG-3’(配列番号４)
ＨＰ１α（ＯＲＦ）：5’-UAACAAGAGGAAAUCCAAUUUCUCA-3’ （配列番号５）
ＨＰ１β（ＯＲＦ）：5’-GGAUAAGUGUUUCAAGGCAACCUUU-3’ （配列番号６）
ＨＰ１γ（ＯＲＦ）：5’-UCUUAACUCUCAGAAAGCUGGCAAA-3’ （配列番号７）
また、ｓｉＲＮＡの導入は、ＲＮＡｉ ＭＡＸ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により、抗生物質を添加していない培地を用いて行った。コントロールは、Ｈ２Ｏのみを添加したものを用いた。細胞株ＨｅＬａ、ＨＴ−１０８０、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１に対しては５０ｎＭ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｕ２ＯＳ、ＲＰＥ１、ＴＩＧ−３には２０ｎＭ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
（４）イムノブロット法
細胞は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮａＦ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μＭオカダ酸に、タンパク質分解酵素阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ製）を加えた免疫沈降緩衝液に溶解して用いた。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファー後、一次抗体はＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ製）、二次抗体はＨＲＰ標識抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用い、ルミノール及びクマル酸（Ｓｉｇｍａ製）により化学発光させて解析した。ＣｈｅｍＤｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ製）で画像を取得し、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ製）で解析を行った。
（５）免疫沈降法
分裂期の細胞は、上記免疫沈降緩衝液に１Ｕ／μｌ ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製）を加え、４℃で３０分間静置した。４℃で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をさらに遠心し、上清を免疫沈降に用いた。プロテインＡ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ製）に抗体を結合させ、細胞抽出液と反応させて免疫沈降を行った。免疫沈降した試料のイムノブロットには、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識Ｍｏｕｓｅ ＴｒｕｅＢｌｏｔ ＵＬＴＲＡ、又はＲａｂｂｉｔ ＴｒｕｅＢｌｏｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いた。
（６）免疫染色法
細胞は、カバーグラスの上で培養し、４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＨＥＭ緩衝液（６０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）又はＰＢＳで室温にて固定した。０．２〜１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む上記緩衝液で処理し、３％ ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキングを行った。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）により作動するＣｏｏｌＳＮＡＰ ＨＱカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ製）を装備したＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＭ１ ｍｉａｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ製）で画像を取得した。蛍光強度の解析はＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって行った。
（７）インビトロ・キナーゼアッセイ
キナーゼアッセイは、キナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０μＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．５）に０．２ｍＣｉ／ｍｌ[γ-３２Ｐ]ＡＴＰに基質を添加して行った。基質はＧＳＴ‐Ｈｅｃ１（１−８０）、又は組換えヒストンＨ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｓ製）を用いた。２０ｎＭ ＩＮＣＥＮＰ、１２０ｎＭ ＧＳＴ‐Ａｕｒｏｒａ Ｂに１μＭ ＨＰ１の存在下、又は非存在下で３０℃２０分反応させ、Ｌａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒにより反応を停止した。リン酸化はＴｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）、及び液体シンチレーションカウンターにより解析した。
なお、以下、特に断らない限りは、上記方法及び当分野の標準的な方法により解析を行った。
１．ＣＰＣに結合するＨＰ１の量
ＨＰ１は、ＩＮＣＥＮＰに結合することによって、ＣＰＣに結合することは知られていたが、ＣＰＣの機能に対するその相互作用の意義は不明であった（非特許文献５、６）。蛍光顕微鏡観察の結果から、ＨＰ１がＣＰＣと同様に有糸分裂時にセントロメアに局在することが明らかとなった。そこで、ＣＰＣとＨＰ１の相互作用を免疫沈降によって解析した（図１）。
図１Ａは、分裂同調していないＨｅＬａ細胞（Asynchronous）、Ｍ期の細胞、ＩＮＣＥＮＰ ｓｉＲＮＡを導入後４８時間後のＭ期のＨｅＬａ細胞から得た抽出物をＩＮＣＥＮＰに特異的な抗体（P240、Cell Signaling Technology製）を用いてイムノブロット法により解析したものである。ＲＮＡｉによってＩＮＣＥＮＰの量が減少すること、また、Ｍ期のＩＮＣＥＮＰはリン酸化を受けているため、同調していないＨｅＬａ細胞のＩＮＣＥＮＰと比較して移動度が遅いことが示された。
次に、ＨＰ１のサブタイプによりＩＮＣＥＮＰに対する結合が異なるか解析を行った（図１Ｂ）。ＨＰ１には、α、β、γの３種のサブタイプが存在する。Ｍ期のＨｅＬａ細胞抽出物をＩＮＣＥＮＰ抗体、あるいはコントロールＩｇＧによって免疫沈降し、ＣＰＣを構成するＩＮＣＥＮＰ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ（clone 6、BD Bioscience製）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（71G4B7E、Cell Signaling Technology製）に対する抗体と、ＨＰ１α抗体（clone 15.19s2、Millipore製）、ＨＰ１β抗体（clone 1MOD-1A9、Millipore製）、ＨＰ１γ抗体（clone 2MOD-1G6、Millipore製）を用いてイムノブロット法により解析した。Ｍ期のＣＰＣにはＨＰ１αだけではなく、β、γもＩＮＣＥＮＰに結合していることが明らかとなった。
さらに、ＨｅＬａ細胞においてＲＮＡｉによりＨＰ１の各サブタイプのＨＰ１の発現を抑制し、上記と同様にＭ期の細胞抽出物をＩＮＣＥＮＰ抗体、コントロールＩｇＧで免疫沈降し、ＨＰ１の各サブタイプの抗体を用いてイムノブロット法により解析した。ＨＰ１の各サブタイプをＲＮＡｉにより発現抑制させると、その代わりに他のサブタイプのＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合が増加することが明らかとなった（図１Ｃ）。
また、精製したリコンビナントＨＰ１サブタイプタンパク質を用いて定量的な解析を行ったところ、Ｍ期のＨｅＬａ細胞ではＣＰＣの約１０％がＨＰ１と結合していることが明らかとなった（図１Ｄ）。
２．悪性形質転換の有無によるＭ期のＨＰ１各サブタイプのＣＰＣへの結合量の違い
Ａｕｒｏｒａ Ｂを介した染色体の分配エラーを低下させる機能は、形質転換していない二倍体細胞である網膜色素細胞株ＲＰＥ１では、ＨｅＬａ細胞に比べてより安定に機能することが報告されている（非特許文献７）。そこで、ＨＰ１のＣＰＣへの結合と分裂エラーとが相関するか、この２種の細胞株を用いて解析を行った。
Ｍ期のＲＰＥ１細胞、ＨｅＬａ細胞の抽出物をＩＮＣＥＮＰ抗体によって免疫沈降し、ＣＰＣを構成するＩＮＣＥＮＰ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎに対する抗体（Novus Biologicals製）とＨＰ１の各サブタイプに対する抗体を用いて、イムノブロット法により解析した。図２Ａ下のヒストグラムは、ＩＮＣＥＮＰと共沈してくる各ＨＰ１サブタイプの量をＲＰＥ１細胞での値を１．０として表示したものである。その結果、２つの細胞間でＨＰ１各サブタイプの発現に大きな差は見られなかったにもかかわらず、ＣＰＣに結合しているＨＰ１の量は、ＲＰＥ１細胞の方がＨｅＬａ細胞の２〜４倍多いことが明らかとなった。すなわち、ＨＰ１とＣＰＣとの結合は、ＨＰ１の発現量に依存しているわけではないことが示された。
さらに、ＣＰＣに結合しているＨＰ１の量が、セントロメアに局在するＨＰ１の量と相関するかを蛍光顕微鏡により解析した（図２Ｂ）。ＲＰＥ１細胞、ＨｅＬａ細胞のＭ期の細胞をＨＰ１α（MAB3584、Chemicon製）、β、γ、及びＩＮＣＥＮＰ抗体で共染色し解析した。ＨＰ１α、β、γ抗体による染色強度をＩＮＣＥＮＰ抗体での染色強度によって正規化し、ヒストグラムとして表示した（図２Ｂ下）。ヒストグラムは、４つの細胞で１４０以上のセントロメアを解析した結果を示している。ＨｅＬａ細胞におけるセントロメアに局在するＨＰ１の蛍光強度は、ＲＰＥ１細胞と比較して明らかに低下していることが示された。
３．種々の癌細胞でのＨＰ１のＣＰＣへの結合
次に、ＣＰＣに結合しているＨＰ１量を種々の癌細胞を用いて解析した。正常細胞、癌細胞由来の細胞株を用いて、ＣＰＣに結合しているＨＰ１α、β、γの量を解析した。ヒト由来の形質転換していない細胞株として、ＢＪ（線維芽細胞株）、ＴＩＧ−３（胎児肺由来細胞株）、ＲＰＥ１（網膜色素上皮細胞株）、癌細胞株として、Ａ５４９（肺胞基底上皮腺癌細胞株）、Ｈ５２２（肺腺癌細胞株）、ＨｅＬａ（子宮頸癌細胞株）、ＨＴ−１０８０（線維肉腫細胞株）、ＬｏＶｏ（大腸癌細胞株）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（膵癌細胞株）、ＰＫ４５Ｈ（膵癌細胞株）、Ｕ２ＯＳ（骨肉腫細胞株）から細胞抽出液を調整し、抗ＩＮＣＥＮＰ抗体で免疫沈降を行い、共沈してくるＩＮＣＥＮＰ、ＡｕｒｏｒａＢ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎ、ＨＰ１の各サブタイプの量を検討した。結果を図３Ａに示す。ヒストグラムは、図２Ａと同様に、ＩＮＣＥＮＰと共沈してくる各ＨＰ１サブタイプの量をＲＰＥ１細胞での値を１．０として表示したものである。
ＩＮＣＥＮＰ抗体によって共沈してくるタンパク質の量は、ＣＰＣを構築するサブユニットであるＩＮＣＥＮＰ、ＡｕｒｏｒａＢ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎについては、形質転換していない細胞、癌細胞を問わずほぼ一定であった。これに対し、ＣＰＣに結合しているＨＰ１の各サブタイプの量は、すべての癌細胞で形質転換していない細胞に比べて著しく少なくなっている。
さらに、染色体の分配異常が比較的少ないことが知られているＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１（いずれもヒト結腸腺癌細胞株）を用いて同様の解析を行った（図３Ｂ）。ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合は、染色体の分配異常が比較的少ないＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１でも、染色体不安定性を示す他の癌細胞株と同様に低下していることが明らかとなった。したがって、ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの十分な量の結合が染色体分配異常を抑制するためには必要であることが示唆された。
このことは、ＨＰ１とＣＰＣの相互作用に影響を与える物質を得ることができれば、広範な癌に対して奏効する医薬となる可能性を意味している。すなわち、染色体不安定性が生じている癌細胞は、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰとの結合が低下していることから、その結合をさらに低下させることができれば、染色体不安定性を増強し、癌細胞のアポトーシス誘導、分裂停止を誘導できる可能性がある。なお、染色体の分配異常が生じる率は、ＲＰＥ１細胞株で５％以下、染色体が不安定であるとされるＨＴ-１０８０では３０％程度、染色体分配の異常が比較的少ないとされるＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１細胞株では８％程度であった。
４．ＨＰ１のＣＰＣにおける機能
ＨＰ１のＣＰＣへの結合の機能的重要性を解析するために、すべてのサブタイプのＨＰ１をＲＮＡｉにより枯渇させ、ＣＰＣの複合体形成を解析した（図４Ａ）。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ＩＮＣＥＮＰ抗体、又はコントロールＩｇＧで免疫沈降し、ＣＰＣを構成するＩＮＣＥＮＰ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＨＰ１の各サブタイプをイムノブロット法により解析した。その結果、すべてのサブタイプのＨＰ１の発現を抑制しても、ＣＰＣの複合体形成はほとんど影響を受けないことが明らかとなった。
次に、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化を基質のリン酸化の程度によって解析した。ＨｅＬａ細胞にＨＰ１のすべてのサブタイプのｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、すべてのＨＰ１を発現抑制させた。また、ＨｅＬａ細胞をＡｕｒｏｒａ Ｂ阻害剤であるＺＭ４４７４３９（ＺＭ、Tocris製）を低濃度（０．４μＭ）、または高濃度（２．０μＭ）で処理し解析した。細胞を固定した後、ヒストンＨ３の１０位のセリンのリン酸化を認識する抗体（Ｈ３−ｐＳ１０、6G3、Cell Signaling Technology製）（図４Ｂ）、Ｈｅｃ１の４４位のセリンのリン酸化を認識する抗体（Ｈｅｃ１-ｐＳ４４、非特許文献８）、Ｈｅｃ１抗体（9G3.23、Novus Biologicals製）（図４Ｃ）、Ｄｓｎ１の１００位のセリンのリン酸化を認識する抗体（Ｄｓｎ-ｐＳ１００、非特許文献９）（図４Ｄ）を用い、蛍光顕微鏡によって解析を行った。リン酸化Ｈｅｃ１、及びＤｓｎ１はリン酸化の状態が区別しにくかったので、蛍光強度をＨｅｃ１に対して正規化しヒストグラムとして表示している。各サンプルについて１０細胞から１５０以上の動原体を解析してヒストグラムとして表示している。
Ａｕｒｏｒａ Ｂの基質として知られているヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（図４Ｂ）及びＣＥＮＰ-Ａ（Ｓｅｒ７）（図示せず。）はほとんどＨＰ１の枯渇による影響を受けなかったが、動原体に存在するＡｕｒｏｒａ Ｂの基質であるＨｅｃ１（Ｎｄｃ８０複合体）、Ｄｓｎ１（Ｍｉｓ１２複合体）は著しくリン酸化が抑制されていた（図４Ｃ、Ｄ）。
低濃度のＺＭ４４７４３９処理が、Ｈｅｃ１及びＤｓｎ１のリン酸化に対してＨＰ１の枯渇と同様の抑制効果を与えることから、ＨＰ１の枯渇によってＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化が抑制されていることが示唆された。
５．ＨＰ１αの９２位のセリンのリン酸化を認識する抗体（抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体）の特異性、及びＨＰ１のＣＰＣへの結合とＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ活性との相関
次にＡｕｒｏｒａ Ｂの活性がＨＰ１によって影響を受けるか解析を行った。ＨＰ１の９２位のＳｅｒのリン酸化を特異的に検出する抗体（以下、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体と記載する。）を解析に用いた。
抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、ヒトＨＰ１αの配列をもとに合成ペプチドＣ+ＮＫＲＫ（ｐＳ）ＮＦＳＮＳをウサギに免疫することによって作製した。図５Ａは、ＨＰ１αの分裂期にリン酸化される９２位のセリン残基を含む領域を模式的に示している。この領域はＨＰ１αのヒンジ領域にあり、種間で保存されている（図５Ａ左パネル）。また、９２位のセリンをアラニンに置換したＳ９２Ａ変異体は、Ａｕｒｏｒａ Ｂによるリン酸化を著しく阻害する（図５Ａ右パネル）。また、ここでは示さないが、ＨＰ１γにも相同の領域である８３位に、Ａｕｒｏｒａ Ｂによってリン酸化されるセリンが存在する。ＨＰ１γの８３位のセリンもＨＰ１αの９２位のセリンと同等の意義を持つものと考えられる。
抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体の特異性、及びこの抗体を免疫沈降、イムノブロット法、細胞染色に用いた場合に、感度良くリン酸化されたＨＰ１αを検出できることを以下に示す。ＲＮＡｉによってＨＰ１αの発現を抑制させ、あるいはＡｕｒｏｒａ Ｂ阻害剤によってＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化を抑制した細胞をチミジン処理、あるいはノコダゾール処理により有糸分裂の間期、あるいは中期に同調した細胞から抽出物を得て解析に用いた。解析は、ＨＰ１α抗体、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体を用いてイムノブロット法により行った（図５Ｂ）。ＨＰ１α抗体は、ＲＮＡｉでその発現を抑制した場合を除き、間期、中期、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性の有無にかかわらず、ＨＰ１αを検出しているのに対し、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体を用いたブロットでは、Ａｕｒｏｒａ Ｂが活性化している中期の細胞においてのみバンドが検出された。すなわち、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体はＨＰ１αのリン酸化を特異的に検出できるだけではなく、ＨＰ１αの９２位のリン酸化を指標にＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化を特異的に検出することができることを示している。
また、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、ＨＰ１αの９２位のリン酸化に特異的であり、９２位のセリンをアラニンに置換した変異体を認識することはない。野生型ＨＰ１αとＧＦＰタンパク質の融合体ＧＦＰ-ＨＰ１αＷＴ（ＷＴ）、９２位のセリンをアラニンに置換したＨＰ１αとＧＦＰタンパク質の融合体ＧＦＰ-ＨＰ１αＳ９２Ａ（Ｓ９２Ａ）をＨｅＬａ細胞に導入し、分裂中期の細胞の抽出物をイムノブロット法により解析した（図５Ｃ）。
分裂中期であっても９２位のセリンをアラニンに置換した変異体はリン酸化を受けないことから、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、９２位のセリンをアラニンに置換した変異体を認識することはない。すなわち、リン酸化されたＨＰ１αのみを特異的に検出することを示している。
また、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、免疫染色に用いても感度良くリン酸化型のＨＰ１αを検出することが示された（図５Ｄ、Ｅ）。間期、分裂中期、ｓｉＲＮＡによってＨＰ１αの発現を抑制した分裂中期の細胞、ＺＭ４４７４３９によりＡｕｒｏｒａ Ｂの活性を抑制した分裂中期の細胞を抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体により免疫染色を行った（図５Ｄ）。コントロールとして示した分裂中期の細胞のみ染色が確認され、間期の細胞、ＨＰ１αの発現を抑制した細胞や、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化を抑制した細胞ではリン酸化されたＨＰ１αは検出されなかった。
さらに、リン酸化型ＨＰ１αはセントロメアにのみ局在することを免疫染色により示した（図５Ｅ）。９２位のセリンがリン酸化されたＨＰ１αは、Ａｕｒｏｒａ Ｂと同様にセントロメアに局在することが免疫染色により明らかとなった。
また、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体を用いて免疫沈降を行うと、ＣＰＣを構成するＩＮＣＥＮＰ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎ、他のＨＰ１サブタイプが共沈してくることが示された（図５Ｆ、Ｇ）。抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体を用いて免疫沈降を行うと、ＩＮＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降を行った場合同様、ＣＰＣを構成するＡｕｒｏｒａ Ｂ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｏｒｅａｌｉｎが共沈してくる。一方、ＨＰ１αで免疫沈降した場合には、共沈してくるこれらＣＰＣを構成するタンパク質の量は著しく少ない（図５Ｆ）。また、ＲＮＡｉによって、ＨＰ１α、ＩＮＣＥＮＰの発現を抑制すると、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体によって共沈してくるＣＰＣ構成タンパク質の量は著しく減少する（図５Ｇ）。
以上示したように、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体は、９２位のセリンのリン酸化を特異的に認識し、イムノブロット法、細胞染色、免疫沈降など種々の解析に用いることができる（図５Ｂ〜Ｇ）。特記すべきことは、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体が捉えるＨＰ１αは、ＣＰＣと結合しているものを選択的に認識するので、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化、特にＣＰＣがセントロメアに局在する際の活性化を感度良く検出することができることである。すなわち、リン酸化ＨＰ１αは簡便にＡｕｒｏｒａ Ｂの活性を反映する非常に良いツールとして活用することができる。
次に、ＨＰ１のＣＰＣへの結合が、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化に必要であることを示す。抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体、ＩＮＣＥＮＰ抗体を用いて免疫沈降を行い、ＣＰＣを構成するタンパク質、ＨＰ１の各サブタイプについてイムノブロット法により解析を行った（図５Ｈ左パネル）。抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体で免疫沈降した場合もＩＮＣＥＮＰで免疫沈降した場合と同様、ＣＰＣを構成するタンパク質が共沈されていた。さらに、Ａｕｒｏｒａ Ｂのキナーゼ活性は、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体で免疫沈降した分画の方が、ＩＮＣＥＮＰ抗体で免疫沈降した分画に比べて著しく高い活性を有することが示された（図５Ｈ右パネル）。この結果は、ＨＰ１のＣＰＣへの結合がＡｕｒｏｒａ Ｂの活性に必要であることを示唆する。また、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体、ＩＮＣＥＮＰ抗体、どちらの抗体で免疫沈降した分画のキナーゼ活性もＡｕｒｏｒａ Ｂの阻害剤であるＺＭ４４７４３９の添加によって阻害されることから、抗ＨＰ１α−ｐＳ９２抗体によって免疫沈降された分画のキナーゼ活性はＡｕｒｏｒａ Ｂによるものであることが確認された。
６．ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合とＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化
野生型ＩＮＣＥＮＰ（ＷＴ）、あるいはＨＰ１結合領域を欠失しているＩＮＣＥＮＰ変異体（ΔＨＰ）、及びＩＮＣＥＮＰのＨＰ１結合領域であるＰｘＶｘＩの３アミノ酸残基をアラニンに置換した３Ａ変異体（３Ａ、非特許文献６）を培養細胞で安定して発現する形質転換細胞を構築した（図６Ａ）。これら細胞株を用いてＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合がＡｕｒｏｒａ Ｂ活性に与える影響を解析した。ＩＮＣＥＮＰ変異体を発現している細胞では、ＩＮＣＥＮＰ（ｍｙｃ）と共沈してくるＨＰ１は著しく少なく（図６Ｂ中央パネル）、また、ＧＳＴ-Ｈｅｃ１を基質としてＡｕｒｏｒａ Ｂのキナーゼアッセイを行うと野生型のＩＮＣＥＮＰを発現している細胞と比較して、有意にＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ活性が抑制されている（図６Ｂ右パネル）。
ＩＮＣＥＮＰ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、ＨＰ１αの組換えタンパク質を用いて、インビトロ・キナーゼアッセイを行った（図６Ｃ）。ＨＰ１存在下ではＡｕｒｏｒａ Ｂが高い活性を示すのに対し、ＨＰ１非存在下では著しく活性が抑制されていることが明らかとなった。さらに、ＨＰ１αだけではなく、ＨＰ１β、γも同様にＡｕｒｏｒａ Ｂに対して高い活性を付与することが示された（図６Ｄ）。しかしながら、二量体を形成することができず、ＩＮＣＥＮＰに結合することができないＨＰ１変異体Ｉ１６５Ｅ（非特許文献１０）は、Ａｕｒｏｒａ Ｂを活性化する作用がない（図６Ｅ）。したがって、ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの物理的な結合が、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化に必要であり、ＨＰ１はＡｕｒｏｒａ Ｂに対してアロステリックな効果をもつことが示された。
ＨＰ１に結合している分画と、結合していない分画についてＣＰＣを構成する各タンパク質のリン酸化の程度を解析した（図６Ｆ）。タンパク質のリン酸化の解析は、３０μＭ Ｐｈｏｓｔａｇ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＮＡＲＤ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）、６０μＭ ＭｎＣｌ２を含むＰｈｏｓｔａｇ-ＳＤＳ-ＰＡＧＥによった。ＩＮＣＥＮＰによるＡｕｒｏｒａ Ｂのアロステリックな活性化は、リン酸化を介して行われることが知られている。しかし、Ａｕｒｏｒａ ＢやＩＮＣＥＮＰのリン酸化には差が見られなかったことから、ＨＰ１による活性の増強効果は従来から知られているものとは異なる機構によると考えられる。
そこで、Ａｕｒｏｒａ Ｂの酵素速度論的解析を行った結果（図６Ｇ）、ＨＰ１αはＡｕｒｏｒａ Ｂが単位時間あたりに基質をリン酸化する反応速度を著しく増大させることが明らかとなった。さらに、ＧＳＴプルダウンアッセイにより、ＧＳＴ-Ａｕｒｏｒａ Ｂと結合するタンパク質の解析を行ったところ、ＨＰ１がＩＮＣＥＮＰと結合できる条件では、ＧＳＴ-Ａｕｒｏｒａ Ｂと結合するＨｅｃ１の量が増加したことから、Ａｕｒｏｒａ Ｂの基質に対する親和性が高くなることが明らかとなった。図６Ｈに示すように、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性は、ＨＰ１α存在下に対し、ＨＰ１α非存在下、あるいは、ＩＮＣＥＮＰに結合することができないＨＰ１変異体Ｉ１６５Ｅ存在下では有意に低下している。したがって、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性化には、ＨＰ１αのＩＮＣＥＮＰへの結合が必要である。
以上の結果は、ＨＰ１がＩＮＣＥＮＰを介してＣＰＣに結合することが、Ａｕｒｏｒａ Ｂにアロステリックな活性化をもたらすこと、また、その活性化は酵素反応速度を高めるという、酵素の基本的機能を上昇させるものであることを示している。
ＨＰ１が細胞内でもＣＰＣのアロステリックな調節を行っていることを証明するために、ＨＰ１の有無によってＡｕｒｏｒａ Ｂの基質のリン酸化の変化を解析した。野生型ＩＮＣＥＮＰ（ＷＴ）、又はＨＰ１結合部位を欠失しているＩＮＣＥＮＰ（ΔＨＰ変異体）を安定的に発現しているＨｅＬａ細胞を用い、内在性のＩＮＣＥＮＰはＲＮＡｉにより抑制し、Ａｕｒｏｒａ Ｂの基質となるＨｅｃ１のリン酸化を抗Ｈｅｃ１−ｐＳ４４抗体を用いて免疫染色により解析した。相対的な蛍光強度は、Ｈｅｃ１で正規化してヒストグラムに表した。図７Ａに示すように、ΔＨＰ変異体を発現させ、さらに内在性のＩＮＣＥＮＰの発現を抑制している細胞では、Ｈｅｃ１のリン酸化レベルの顕著な低下が観察された。
さらに、内在性のＩＮＣＥＮＰの代わりに、ＣＢ-ＩＮＣＥＮＰ-ＥＧＦＰ（ＩＮＣＥＮＰ、ＣＥＮＰ-Ｂ、ＥＧＦＰの融合タンパク質）を発現させ、セントロメアにＣＰＣを局在させ、ＨＰ１によるリン酸化のレベルが変わるか解析した。ＣＰＣがセントロメアに局在しているのにもかかわらず、ΔＨＰ変異体によってＣＰＣにＨＰ１が結合していない状態では、Ａｕｒｏｒａ Ｂが介在する基質のリン酸化は増加しないことが示された（図７Ｂ）。
ＨＰ１のＣＰＣへの結合がＡｕｒｏｒａ Ｂの活性化には必要であることが示されたことから、癌細胞ではＡｕｒｏｒａ Ｂの活性が二倍体よりも低いのではないかと考えた。ＲＰＥ１、ＨＴ−１０８０、Ｕ２ＯＳ細胞を用い、ＩＮＣＥＮＰによる免疫沈降、及びＡｕｒｏｒａ Ｂのインビトロ・キナーゼアッセイを行った。癌細胞であるＨＴ−１０８０、Ｕ２ＯＳ細胞では、ＣＰＣに結合したＨＰ１の量が少なく、Ａｕｒｏｒａ Ｂの活性も形質転換していないＲＰＥ１細胞よりも低かった（図８Ａ）。
癌細胞と二倍体細胞株でのＡｕｒｏｒａ Ｂ活性の違いが動原体の基質のリン酸化に影響するか否かを、形質転換していないＲＰＥ１、ＴＩＧ-３細胞と、癌細胞であるＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ細胞を用い、免疫染色により解析した。動原体に存在するＡｕｒｏｒａ Ｂの基質であるＤｓｎ１のリン酸化（図８Ｂ）、Ｄｓｎ１の局在（図８Ｃ）を免疫染色により解析した。相対的な蛍光強度はＨｅｃ１の蛍光強度に対して求め、ヒストグラムとして表示している。有糸分裂前中期におけるリン酸化Ｄｓｎ１の量は癌細胞においては、形質転換していない細胞に対して、顕著に低いレベルであった。
形質転換していない細胞と癌細胞との間のＡｕｒｏｒａ Ｂが介在するリン酸化の違いが、ＨＰ１がＣＰＣに結合する量に起因するのであれば、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合を阻害する条件では、形質転換していない細胞においては、癌細胞に比較してより大きな違いが見られるものと仮定した。野生型ＩＮＣＥＮＰ（ＷＴ）、変異体ＩＮＣＥＮＰ（ΔＨＰ）を発現しているＨｅＬａ細胞、あるいはＲＰＥ１細胞で、内因性ＩＮＣＥＮＰをＲＮＡｉにより枯渇させ、リン酸化型のＤｓｎ１の量を免疫染色で解析を行った（図８Ｄ）。その結果、ΔＨＰ変異体を発現させ、かつ内因性のＩＮＣＥＮＰをＲＮＡｉにより発現抑制したＲＰＥ１細胞では、ＨｅＬａ細胞に比べより大きな変化が観察された。
７．ＨＰ１のＣＰＣへの結合の正確な細胞分裂への影響
次に、ＨＰ１のＣＰＣへの結合が、正確な細胞分裂に影響を与えるか解析を行った（図９Ａ）。種々の細胞に野生型、又はΔＨＰ変異体を発現させ、さらに内在性のＩＮＣＥＮＰをＲＮＡｉにより枯渇させた。形質転換していないＲＰＥ１、ＴＩＧ-３細胞株では、ΔＨＰ変異体を発現させ、内在性のＩＮＣＥＮＰを枯渇させると、染色体の分配エラーが増加した。これに対し、癌細胞株ではＨＰ１のＣＰＣへの結合が細胞分裂の安定性に何ら影響を与えなかった。おそらく、癌細胞ではＣＰＣに結合しているＨＰ１の量が既に低下しているので、さらに低下することによる影響はみられないものと考えられる。
ＨＰ１αを過剰に発現させた系でＩＮＣＥＮＰに結合したＨＰ１の量を解析した（図９Ｂ）。ＧＦＰ-ＨＰ１αをＨｅＬａ細胞で過剰発現させ、ＩＮＣＥＮＰで免疫沈降を行った。過剰発現されたＨＰ１はＣＰＣに組み込まれていたにもかかわらず、代償的に、内因性のＨＰ１の解離を引き起こしていた。そのため、ＨＰ１発現量を高めても、分配エラーを抑止することはできなかった。癌細胞では正常細胞に比べて、正確な染色体分離に必要な量のＨＰ１がＣＰＣへ結合していない。そのため、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼの活性が十分に起こらず、染色体分離エラーの頻度が増加するものと考えられる（図９Ｃ）。
さらに、ＲＰＥ１細胞を形質転換させたＲＰＥ１−６７ＲのＩＮＣＥＮＰに対する結合を免疫沈降により解析した（図９Ｄ）。その結果、ＲＰＥ１細胞を形質転換させることによって、ＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合の減少が観察された。すなわち、形質転換とＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合は強い相関があることを示唆している。
以上、示してきたように、調べたすべての癌細胞ではＨＰ１のＩＮＣＥＮＰへの結合が低下していた。さらに、ＨＰ１はＡｕｒｏｒａ Ｂの基質に対する結合親和性を高め、Ａｕｒｏｒａ Ｂ活性を維持・増強することによって、アロステリックな効果をもたらしていることが明らかとなった。
８．抗癌剤のスクリーニング方法
上記結果は、癌細胞ではＩＮＣＥＮＰとＨＰ１の結合が低下し、Ａｕｒｏｒａ Ｂが適正に機能していないことを示している。したがって、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰを介したＣＰＣの相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングすることによって、染色体の不安定性に影響を与える化合物を得ることができる。癌細胞でＡｕｒａｒｏ Ｂの機能をさらに低下させる化合物は、癌細胞の染色体不安定性がさらに増すように作用し、癌細胞の細胞分裂を阻害し、死滅させることができると考えられる。癌細胞で見られるＡｕｒｏｒａ Ｂの脆弱性を利用するような抗癌剤は、癌細胞のみを標的とし得る新しいコンセプトの抗癌剤となる可能性がある。
このような化合物をスクリーニングする方法としては、ＩＮＣＥＮＰとＨＰ１がイン・ビトロで結合する系を構築し、結合に影響を与えるような化合物のスクリーニングを行えばよい。ＩＮＣＥＮＰとＨＰ１の結合に影響を与えるような化合物は公知のどのような方法を用いてもよいが、ここではバインディングアッセイとアルファアッセイを用いる系について説明する。
野生型ＨＰ１αとＩＮＣＥＮＰ１２１−２７０位の領域（配列番号８、ＩＮＣＥＮＰ ＷＴ）をバインディングアッセイに用いた。ＩＮＣＥＮＰの１２１−２７０位の領域にはＨＰ１の結合に必要なモチーフＰｘＶｘＩが含まれている。この領域のモチーフとして重要な３つのアミノ酸をアラニンに置換した変異体（配列番号９、ＩＮＣＥＮＰ ３Ａ）をコントロールとして用い、等温滴定型カロリメトリーにより解離定数を求めた。等温滴定型カロリメトリー測定装置は、例えばＭｉｃｒｏＣａｌ ｉＴＣ２０００システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）など、どのような装置でもよく常法により測定を行えばよい。
Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴタグを上記ペプチドに付与し、等温滴定型カロリメトリーを用い解離定数を測定した。結果を表１に示す。なお、解離定数は５回の実験の平均値から算出している。ＩＮＣＥＮＰ ＷＴは、解離定数０．１０２μＭという高い親和性でＨＰ１αに結合する。すなわち、ＩＮＣＥＮＰとＨＰ１との結合を非常に感度良く検出することができる系が構築されていることを示している。また、ＨＰ１との結合モチーフに変異を導入したＩＮＣＥＮＰ ３Ａ変異体はＨＰ１とは結合せず、特異的な結合であることを示している。
このバインディングアッセイの系に候補化合物を添加すればＩＮＣＥＮＰとＨＰ１との結合に影響を与える化合物をスクリーニングすることができる。さらに、より高感度で操作の容易なアルファアッセイによりＨＰ１とＩＮＣＥＮＰとの結合の解析を行う系も構築した。Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴタグを捕捉可能なアクセプタービーズ、ドナービーズを用い、常法により蛍光シグナルを検出することにより、ＨＰ１αとＩＮＣＥＮＰとの相互作用を測定した。その結果、ＨｉｓあるいはＧＳＴタグをＨＰ１αとＩＮＣＥＮＰの１６０−２１０位領域（配列番号１０）に付与し、上記アクセプタービーズ、ドナービーズを用いたアルファアッセイにより結合を高感度で検出することができた。したがって、バインディングアッセイ、あるいはアルファアッセイを用いたＨＴＳを行い、ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合に影響を及ぼす化合物をスクリーニングすることができる。
上述のように、第一工程として、ＩＮＣＥＮＰとＨＰ１の結合をイン・ビトロ解析を用いたＨＴＳにより行い、化合物を選択し、第二工程でライブ・イメージング等により細胞分裂を観察し染色体分配精度を評価することによって、さらに候補化合物を絞り込み、本発明のコンセプトに合致した化合物を選択することができる。ライブ・イメージングで染色体分配を解析することにより、癌細胞に特異的に作用する化合物であるかを評価することができる。
加えて、ＨＰ１の９２位のセリンのリン酸化を特異的に検出する抗体は、直接的にはＨＰ１のリン酸化を検出するものではあるが、それだけではなく、Ａｕｒｏｒａ Ｂの機能を特異的に反映するものであることから、本発明のスクリーニングに加えて、研究ツールとしても利用価値の高いものである。

Claims (7)

  1. ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化を指標としてＡｕｒｏｒａ Ｂ活性を判定することを特徴とする染色体不安定性評価方法。
  2. 請求項１記載の染色体不安定性評価方法であって、
    前記ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化は、
    ヒトＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はヒトＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化であることを特徴とする評価方法。
  3. 請求項２記載の染色体不安定性評価方法であって、
    前記ヒトＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はヒトＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化は、抗体によって検出するものであることを特徴とする評価方法。
  4. 染色体不安定性を評価して抗癌剤をスクリーニングする方法であって、
    ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合の変動を指標とし、
    前記ＨＰ１とＩＮＣＥＮＰの結合の変動の指標がヒトＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はヒトＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化であり、
    染色体不安定性が増す化合物を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
  5. 請求項４記載の抗癌剤のスクリーニング方法であって、
    前記ヒトＨＰ１αの９２番目のセリンのリン酸化及び／又はヒトＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化は、抗体によって検出するものであることを特徴とするスクリーニング方法。
  6. ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化を検出することにより、
    Ａｕｒｏｒａ Ｂ活性及び／又は染色体不安定性を判定することを特徴とするヒトＨＰ１αの９２番目のセリン及び／又はヒトＨＰ１γの８３番目のセリンのリン酸化を特異的に認識する抗体の利用方法。
  7. 前記ＨＰ１α及び／又はＨＰ１γのリン酸化の検出が、
    イムノブロット法、免疫沈降法、免疫染色法の少なくともいずれか１つによるものであることを特徴とする請求項６記載の利用方法。
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