JP6575987B2 - Green algae culture method and astaxanthin production method - Google Patents
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Description
本発明は、緑藻類培養方法およびこれを用いたアスタキサンチンの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing green algae and a method for producing astaxanthin using the same.
アスタキサンチンは赤色のカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。アスタキサンチンを蓄積する緑藻類としてヘマトコッカス属に属する緑藻類が知られており、かかる藻類は、適切な光照射培養条件化で緑色の遊走細胞として生育する状態(グリーンステージ)と、光環境や栄養枯渇などのストレスにより遊走細胞がシスト細胞へと変化し、著量のアスタキサンチンを細胞内に蓄積する状態(レッドステージ)が存在することが知られている。 Astaxanthin is a kind of red carotenoid and is known to have a strong antioxidant effect. Green algae belonging to the genus Haematococcus are known as green algae that accumulate astaxanthin. Such algae grow as green migratory cells under appropriate light irradiation culture conditions (green stage), light environment, nutrient depletion, etc. It is known that there is a state (red stage) in which migratory cells change to cyst cells due to the stress of and a significant amount of astaxanthin accumulates in the cells.
近年、省エネルギーの観点から、蛍光灯に代わってLEDを使用した培養法への関心が高まってきている。例えば特許文献1には、青色LED光の連続光照射またはパルス光照射が、ヘマトコッカスによるアスタキサンチンの生産を促進することが記載されている。 In recent years, from the viewpoint of energy saving, interest in a culture method using LEDs instead of fluorescent lamps has increased. For example, Patent Document 1 describes that continuous light irradiation or pulsed light irradiation of blue LED light promotes the production of astaxanthin by hematococcus.
また、赤色LED光と青色LED光を交互に照射すること(特許文献2)や赤色LED光と青色LEDを単独または同時に照射すること(特許文献3、4)により、ヘマトコッカスの遊走細胞における生育を促進することが記載されている。 In addition, by alternately irradiating red LED light and blue LED light (Patent Document 2) or irradiating red LED light and blue LED alone or simultaneously (Patent Documents 3 and 4), growth of hematococcus in migratory cells is achieved. It is described to promote.
しかしながら、いずれの上記文献にも、赤色照明光と青色照明光を同時に照射して緑藻類のアスタキサンチン蓄積を促進する方法は開示されておらず、知られていなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、緑藻類に赤色照明光と青色照明光を同時に照射して、低消費電力で高い蓄積濃度のアスタキサンチンを製造することを目的とする。
However, none of the above-mentioned documents disclose or disclose a method for promoting astaxanthin accumulation in green algae by simultaneously irradiating red illumination light and blue illumination light.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to produce astaxanthin with low power consumption and high accumulated concentration by simultaneously irradiating green algae with red illumination light and blue illumination light.
本発明者らは、人工光の照射による緑藻類のアスタキサンチン蓄積について鋭意検討を行った。その結果、レッドステージにおいて赤色照明光及び青色照明光を同時に照射することで、低消費電力でアスタキサンチン蓄積濃度を増大できることを見出した。また赤色照明光、青色照明光の比、および光照射強度を所定の条件とすることで、アスタキサンチン蓄積濃度が顕著に増大することを見出し、本発明を完成した。
本発明は以下のとおりである。
The present inventors diligently investigated astaxanthin accumulation in green algae by irradiation with artificial light. As a result, it was found that the astaxanthin accumulation concentration can be increased with low power consumption by simultaneously irradiating red illumination light and blue illumination light on the red stage. In addition, the present inventors have found that the astaxanthin accumulation concentration is remarkably increased by setting the ratio of the red illumination light and the blue illumination light and the light irradiation intensity to predetermined conditions, thereby completing the present invention.
The present invention is as follows.
[1]本発明の緑藻類培養方法は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類のレッドステージにおいて、赤色照明光と青色照明光を同時に照射し、かつ前記赤色照明光と前記青色照明光の光合成光量子束密度の合計に対する青色照明光の光合成光量子束密度の割合が20〜80%である。
[2]上記[1]に記載の緑藻類培養方法は、前記緑藻類の培養を液体培地で行ってもよい。
[3]上記[1]または[2]のいずれかに記載の緑藻類培養方法は、前記赤色照明光および前記青色照明光の光合成光量子密度の合計が、50〜200mol/m2/sであってもよい。
[4]上記[1]〜[3]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記レッドステージが、培地中の窒素濃度が0〜10mg/Lの状態であってもよい。
[5]上記[1]〜[4]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記緑藻類が、ヘマトコッカス・プルビアリスまたはヘマトコッカス・ラクストリスであってもよい。
[6]上記[1]〜[5]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記赤色照射光の波長が570〜730nm、中心波長が645〜680nmであってもよい。
[7]上記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記青色照明光の波長が400〜515nm、中心波長が440〜460nmであってもよい。
[8]上記[1]〜[5]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記赤色照明光の光源がLEDであってもよい。
[9]上記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法は、前記青色照明光の光源がLEDであってもよい。
[10]本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の緑藻類培養方法によりアスタキサンチンを製造する。
[1] The green algae culture method of the present invention is a green algae red stage that accumulates astaxanthin, and simultaneously irradiates red illumination light and blue illumination light, and totals the photosynthetic photon flux density of the red illumination light and the blue illumination light. The ratio of the photosynthetic photon flux density of blue illumination light to is 20 to 80%.
[2] In the green algae culture method according to [1] above, the green algae may be cultured in a liquid medium.
[3] In the green algae culture method according to any one of [1] or [2] above, a total of photosynthetic light quantum density of the red illumination light and the blue illumination light is 50 to 200 mol / m 2 / s. Also good.
[4] In the green algae culture method according to any one of [1] to [3] above, the red stage may be in a state where the nitrogen concentration in the medium is 0 to 10 mg / L.
[5] In the method of culturing green algae according to any one of [1] to [4] above, the green algae may be Hematococcus prubiaris or Hematococcus lactolis.
[6] In the green algae culture method according to any one of [1] to [5], a wavelength of the red irradiation light may be 570 to 730 nm, and a center wavelength may be 645 to 680 nm.
[7] In the green algae culture method according to any one of [1] to [6], the blue illumination light may have a wavelength of 400 to 515 nm and a center wavelength of 440 to 460 nm.
[8] In the green algae culture method according to any one of [1] to [5] above, the light source of the red illumination light may be an LED.
[9] In the green algae culture method according to any one of [1] to [6], the light source of the blue illumination light may be an LED.
[10] Astaxanthin is produced by the method for culturing green algae according to any one of [1] to [9] above.
本発明によれば、緑藻類の有用物質生産において、生産性の向上及び消費電力量の削減が可能となる簡便で優れた緑藻類培養方法及びアスタキサンチンの製造方法を提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, in the production of useful substances of green algae, it is possible to provide a simple and excellent method for culturing green algae and a method for producing astaxanthin that can improve productivity and reduce power consumption.
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、本発明はそれらに限定されるものではなく、それらにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the present invention will be described. The embodiments described below are examples of typical embodiments of the present invention, and the present invention is not limited to them, and the scope of the present invention is interpreted narrowly by these embodiments. There is nothing.
本発明の緑藻類培養方法は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類のレッドステージにおいて、赤色照明光と青色照明光を同時に照射し、かつ前記赤色照明光と前記青色照明光の光合成光量子束密度の合計に対する青色照明光の割合が20〜80%であることを特徴とする。 In the green algae culture method of the present invention, in the red stage of green algae that accumulates astaxanthin, the red illumination light and the blue illumination light are simultaneously irradiated, and the blue illumination with respect to the sum of the photosynthetic photon flux density of the red illumination light and the blue illumination light The ratio of light is 20 to 80%.
(レッドステージ)
レッドステージとは、緑藻類の培養において、遊走細胞が完全にシスト細胞となった段階を示す。この段階では、著量のアスタキサンチンを細胞内に蓄積して培養液が赤色となる。レッドステージは、培地中の窒素濃度が0〜10mg/Lの状態であることが好ましい。
(Red stage)
The red stage refers to a stage where migratory cells are completely cyst cells in the culture of green algae. At this stage, a significant amount of astaxanthin accumulates in the cells and the culture becomes red. The red stage is preferably in a state where the nitrogen concentration in the medium is 0 to 10 mg / L.
レッドステージに対し、緑藻類の培養において培養液が緑色ないし褐色である状態のことをグリーンステージという。これは培地内の細胞が適切な光照射培養条件化で緑色の遊走細胞として生育する状態に該当する。
生育の過程で、光環境や栄養枯渇などのストレスにより遊走細胞がシスト細胞へと変化すると、グリーンステージからレッドステージに移行する。
In contrast to the red stage, the state in which the culture solution is green or brown in the culture of green algae is called the green stage. This corresponds to a state in which cells in the medium grow as green migratory cells under appropriate light irradiation culture conditions.
In the process of growth, when migrating cells change to cyst cells due to stress such as light environment and nutrient depletion, the stage moves from the green stage to the red stage.
グリーンステージの終盤では、緑色の細胞(遊走細胞の状態を維持している細胞)と赤色の細胞(シスト細胞へと変化した細胞)が混在し、培養液の色が褐色に変化する。本発明では、この段階もグリーンステージであると定義する。やがて遊走細胞は見られなくなり、著量のアスタキサンチンを蓄積するレッドステージに移行する。 At the end of the green stage, green cells (cells that maintain the state of migratory cells) and red cells (cells that have changed into cyst cells) coexist, and the color of the culture medium changes to brown. In the present invention, this stage is also defined as the green stage. Eventually, migratory cells are not seen, and a transition is made to the red stage, which accumulates a significant amount of astaxanthin.
本発明においては、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類のレッドステージにおいて、赤色照明光と青色照明光を同時に照射する。また、レッドステージにおける赤色照明光と青色照明光の光合成光量密度の割合を所定の値に設定することにより、アスタキサンチン蓄積濃度を増大させることができる。すなわち、少なくともレッドステージにおいて赤色照明光と青色照明光を同時に照射する培養を行えばよく、グリーンステージにおける培養方法は限定されない。グリーンステージにおける培養方法としては、太陽光による培養、蛍光灯による培養、赤色照明光と青色照明光を交互に照射する培養、赤色照明光と青色照明光を同時に照射する培養等が挙げられる。
赤色照明光と青色照明光を同時に照射する培養は、グリーンステージの段階から開始してもよいが、培地中の窒素濃度が10mg/L以下になってから開始することが好ましい。窒素濃度は市販の窒素測定キットで測定することができる。窒素は、一般の植物栽培において肥料として用いられるものであり、濃度が10mg/L以下であれば植物にとっては、栄養が枯渇しストレスを感じる。そのため、窒素濃度が10mg/L以下であれば、確実にレッドステージの緑藻類に対して、赤色照明光と青色照明光を同時に照射することができ、より生産性を高めることができる。なお、窒素濃度は、栄養等を与えなければ上昇しない。このため、一度窒素濃度を測定し、10mg/L以下であれば、レッドステージに移行したと判断して赤色照明光と青色照明光を同時に照射する培養を開始することができる。
In the present invention, red illumination light and blue illumination light are simultaneously irradiated on a red stage of a green alga that accumulates astaxanthin. Also, the astaxanthin accumulation concentration can be increased by setting the ratio of the light combined light density of the red illumination light and the blue illumination light at the red stage to a predetermined value. In other words, at least the red stage may be cultivated by simultaneously irradiating red illumination light and blue illumination light, and the culture method in the green stage is not limited. Examples of the culture method in the green stage include culture by sunlight, culture by a fluorescent lamp, culture by alternately irradiating red illumination light and blue illumination light, and culture by simultaneously irradiating red illumination light and blue illumination light.
The culture in which the red illumination light and the blue illumination light are simultaneously irradiated may be started from the stage of the green stage, but is preferably started after the nitrogen concentration in the medium becomes 10 mg / L or less. The nitrogen concentration can be measured with a commercially available nitrogen measurement kit. Nitrogen is used as a fertilizer in general plant cultivation. If the concentration is 10 mg / L or less, the plant is depleted of nutrients and feels stress. Therefore, if the nitrogen concentration is 10 mg / L or less, red stage green algae can be reliably irradiated with red illumination light and blue illumination light at the same time, and productivity can be further increased. The nitrogen concentration does not increase unless nutrition is given. For this reason, once the nitrogen concentration is measured and it is 10 mg / L or less, it can be determined that the stage has moved to the red stage, and culture in which red illumination light and blue illumination light are simultaneously irradiated can be started.
本発明の光の照射条件は、レッドステージにおいて、赤色照明光と青色照明光を同時に照射する。ここで、「同時に照射する」とは、デューティー比を100%未満として瞬間的な非照射時間を設けたり、パルス光を連続的に照射したりするような場合も含む。本発明で許容できる短時間の非照射時間は、最低でも計1時間以内を目安とし、好ましくは計30分以内である。非照射時間が当該範囲であれば、生産効率を最大限とすることができる。ただし、緑藻類の種類等により異なることがあるので、予備実験等により求めることが好ましい。 The light irradiation condition of the present invention is to irradiate red illumination light and blue illumination light simultaneously on the red stage. Here, “simultaneously irradiating” includes a case where the duty ratio is less than 100% and an instantaneous non-irradiation time is provided or pulsed light is continuously irradiated. The short non-irradiation time that can be tolerated in the present invention is at most within 1 hour as a guide, and preferably within 30 minutes. If the non-irradiation time is within this range, the production efficiency can be maximized. However, since it may vary depending on the type of green algae, etc., it is preferably obtained by preliminary experiments.
また、赤色照明光と青色照明光を同時に照射するにあたり、赤色照明光と青色照明光の光合成光量子束密度は一定でもよく、任意の時間で明暗を切り替えてもよい。例えば、強い光合成光量子束密度で赤色照明光と青色照明光を16時間同時照射するサイクル、弱い光合成光量子束密度で赤色照明光と青色照明光を8時間同時照射するサイクルを交互に実施する態様も本発明に含まれる。明暗サイクルの時間は特に限定されず、例えば10〜30時間である。 Moreover, when irradiating red illumination light and blue illumination light simultaneously, the photosynthetic-light quantum flux density of red illumination light and blue illumination light may be constant, and light / dark may be switched at arbitrary time. For example, a mode in which red illumination light and blue illumination light are simultaneously irradiated for 16 hours with a strong photosynthetic photon flux density, and a cycle in which red illumination light and blue illumination light are simultaneously irradiated for 8 hours with a weak photosynthetic photon flux density is also alternately implemented. It is included in the present invention. The time of the light / dark cycle is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 hours.
(光合成光量子束密度)
本発明においては、培養を液体培地で行うことが好ましい。液体培地であれば、培地と緑藻類の懸濁が容易で高濃度での培養が可能となる。光合成光量子密度(以下、「PPFD」と略記する)は、光照射面における値を示す。
ここで、「光照射面における値」は、PPFDを測定する機器の大きさや培養容器の形状などから、厳格に規定することが困難であるが、光照射面から限りなく近い箇所で測定した値を指す。また、培地を液体培地とする場合は、培養液の液面に限りなく近い箇所(光照射面から限りなく近い箇所)で測定した値を指す。PPFDを測定する機器としては、一般的な光量子計を用いればよい。
(Photosynthesis photon flux density)
In the present invention, the culture is preferably performed in a liquid medium. In the case of a liquid medium, the medium and green algae can be easily suspended and can be cultured at a high concentration. The photosynthetic photon density (hereinafter abbreviated as “PPFD”) indicates a value on the light irradiation surface.
Here, the “value on the light-irradiated surface” is a value measured at a location as close as possible to the light-irradiated surface, although it is difficult to strictly define it because of the size of the instrument for measuring PPFD, the shape of the culture vessel, and the like. Point to. Moreover, when making a culture medium into a liquid culture medium, the value measured in the location (location near as much as possible from a light irradiation surface) near the liquid level of a culture solution is pointed out. A general optical quantum meter may be used as a device for measuring PPFD.
レッドステージにおける赤色照明光と青色照明光のPPFDの合計に対する青色照明光の割合は、20〜80%であることが好ましく、25〜75%であることがより好ましく、25〜50%であることがさらに好ましい。当該範囲であれば、アスタキサンチンの生成速度が遅くなり過ぎず、生産性を高めることができる。また培養装置の設計上有利であり、省エネルギーでの成長を行うことができ経済的である。 The ratio of blue illumination light to the total of PPFD of red illumination light and blue illumination light on the red stage is preferably 20 to 80%, more preferably 25 to 75%, and more preferably 25 to 50%. Is more preferable. If it is the said range, the production | generation speed | rate of astaxanthin will not become slow too much, and productivity can be improved. Moreover, it is advantageous in designing the culture apparatus, and it is economical because it can grow with energy saving.
ここで、培養装置の設計上有利であるのは、以下の理由による。レッドステージにおける赤色照明光と青色照明光のPPFDの合計に対する青色照明光の割合が100%である場合でも、アスタキサンチンを蓄積することはできる。しかし、青色LEDは赤色LEDより光変換効率が低い。そのため、同一PPFDで比較した場合、青色照射光比率を低くするほど使用エネルギーを低く抑えることができる。すなわち、光照射条件が上記の範囲内とすれば、効率性を高めることができ、経済的である。 Here, the reason why the culture apparatus is advantageous is as follows. Astaxanthin can be accumulated even when the ratio of the blue illumination light to the total of the PPFD of the red illumination light and the blue illumination light in the red stage is 100%. However, blue LEDs have lower light conversion efficiency than red LEDs. Therefore, when compared with the same PPFD, the lower the blue irradiation light ratio, the lower the use energy. That is, if the light irradiation condition is within the above range, the efficiency can be improved and it is economical.
赤色照射光および青色照射光のPPFDの合計は、好ましくは50〜200μmol/m2/s、より好ましくは75〜150μmol/m2/s、さらに好ましくは75〜100μmol/m2/sである。当該範囲であれば、アスタキサンチンの生成速度が遅くなり過ぎず、かつ強光により細胞が死滅する可能性も低い。 The total of PPFD of red irradiation light and blue irradiation light is preferably 50 to 200 μmol / m 2 / s, more preferably 75 to 150 μmol / m 2 / s, and further preferably 75 to 100 μmol / m 2 / s. If it is the said range, the production | generation speed | rate of astaxanthin will not become too slow, and possibility that a cell will die by strong light is also low.
(藻類)
本発明に用いられる緑藻類は、アスタキサンチンを蓄積する緑藻類であれば特に制限なく用いることができる。例えば、ヘマトコッカス(Haematococcus)属に属する単細胞緑藻類が好ましく用いられる。
(Algae)
The green algae used in the present invention can be used without particular limitation as long as it is an algae that accumulates astaxanthin. For example, unicellular green algae belonging to the genus Haematococcus are preferably used.
好ましい緑藻類としては、ヘマトコッカス・プルビアリス(H.pluvialis)、ヘマトコッカス・ラクストリス(H.lacustris)、ヘマトコッカス・カペンシス(H.capensis)、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ(H.droebakensi)、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)などが挙げられる。
ヘマトコッカス・プルビアリス(H.pluvialis)としては、UTEX2505株、K0084株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ラクストリス(H.lacustris)としては、NIES144株、ATCC30402株、ATCC30453株、I AM C−302株、I AM C−393株、I AM C−394株、I AM C−339株、UTEX 16株、UTEX294株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・カペンシス(H.capensis)としては、UTEX LB1023株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ(H.droebakensi)としてはUTEX 55株が挙げられる。
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)としては、UTEX LB1758株などが挙げられる。
これらの中でも、ヘマトコッカス・プルビアリス、ヘマトコッカス・ラクストリスが好ましく用いられる。ヘマトコッカス・プルビアリス及びヘマトコッカス・ラクストリスは、アスタキサンチン蓄積量が多く、培養しやすいので好ましい。
Preferred green algae include Haematococcus pluvialis, H. lacustris, H. capensis, Haematococcus droebaensi, H. Examples thereof include cis (H. zimbabiensis).
Examples of Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) include the UTEX2505 strain and the K0084 strain.
As H. lacustris, NIES144 strain, ATCC30402 strain, ATCC30453 strain, IAMC-302 strain, IAMC-393 strain, IAMC-394 strain, IAMC-339 strain, UTEX 16 strains, UTEX294 strain and the like.
Examples of Haematococcus capensis (H. capensis) include UTEX LB1023 strain.
Examples of Haematococcus droebakensi (H. droebakensi) include
Examples of Hematococcus zimbabwiensis (H. zimbabwiensis) include UTEX LB1758 strain.
Among these, Haematococcus prubiaris and Hematococcus lactoris are preferably used. Haematococcus pluvialis and Haematococcus lactolis are preferable because they have a high astaxanthin accumulation amount and are easy to culture.
(波長)
本発明に用いる赤色照明光としては、波長が570〜730nmの光が挙げられ、波長が620〜730nmの光が好適に用いられる。また、645〜680nmの波長を中心波長とする赤色照明光がさらに好適に用いられ、中心波長を660nmとする赤色照明光がさらに好適である。
(wavelength)
The red illumination light used in the present invention includes light having a wavelength of 570 to 730 nm, and light having a wavelength of 620 to 730 nm is preferably used. Further, red illumination light having a center wavelength of 645 to 680 nm is more preferably used, and red illumination light having a center wavelength of 660 nm is more suitable.
本発明に用いる青色照明光としては、波長が400nm〜515nmの光が挙げられる。また、中心波長を440〜460nmとする青色照明光が好適に用いられ、中心波長を445〜450nmとする青色照明光がさらに好適である。 The blue illumination light used in the present invention includes light having a wavelength of 400 nm to 515 nm. Further, blue illumination light having a center wavelength of 440 to 460 nm is suitably used, and blue illumination light having a center wavelength of 445 to 450 nm is more preferred.
赤色照明光および青色照明光は、上記波長を中心波長として所定の波長域を有するものとすることができる。なお、中心波長とは波長スペクトルにおける極大値である。波長域としては、例えば、青色照明光であれば450±30nm、好ましくは450±20nm、さらに好ましくは450±10nmであり、赤色照明光であれば660±30nm、好ましくは660±20nm、さらに好ましくは660±10nmである。赤色照明光及び青色照明光が当該範囲内であれば、所定の色以外の波長の光が植物に照射されることを抑制することができ、照射する光をより効率的に利用することができる。すなわち、省エネルギーで効率的にアスタキサンチンを製造することができる。 The red illumination light and the blue illumination light may have a predetermined wavelength range with the above-mentioned wavelength as a center wavelength. The center wavelength is the maximum value in the wavelength spectrum. The wavelength range is, for example, 450 ± 30 nm for blue illumination light, preferably 450 ± 20 nm, more preferably 450 ± 10 nm, and 660 ± 30 nm, preferably 660 ± 20 nm for red illumination light. Is 660 ± 10 nm. If the red illumination light and the blue illumination light are within the above range, it is possible to suppress irradiation of light with a wavelength other than the predetermined color to the plant, and it is possible to more efficiently use the irradiation light. . That is, astaxanthin can be produced efficiently with energy saving.
(光源)
本発明に用いる、赤色照明光および青色照明光を照射するための光源としては、本発明の各工程を実行可能なものであればその形状や種類を問わず使用できる。
光源には、発光ダイオード(LED)やレーザーダイオード(LD)、SMDタイン光源、赤色半導体素子あるいは青色半導体素子を配列したライン光源やパネル光源等が使用でき、LEDが好ましい。LEDから照射される光は直進性が高く、かつ波長幅を狭くすることができる。そのため、緑藻類への光照射をより効率的に行うことができ、省エネルギーで効率的にアスタキサンチンを製造することができる。
(light source)
As a light source for irradiating red illumination light and blue illumination light used in the present invention, any light source can be used regardless of its shape and type as long as each step of the present invention can be performed.
As the light source, a light emitting diode (LED), a laser diode (LD), an SMD tine light source, a line light source in which red semiconductor elements or blue semiconductor elements are arranged, a panel light source, or the like can be used, and an LED is preferable. The light emitted from the LED has high straightness and the wavelength width can be narrowed. Therefore, light irradiation to green algae can be performed more efficiently, and astaxanthin can be efficiently produced with energy saving.
(照射時間)
赤色照明光と青色照明光を同時に照射する時間は、本発明の効果が奏される限り、任意に設定できるが、好ましくは3日以上、より好ましくは5〜20日、さらに好ましくは7〜15日である。
(Irradiation time)
The time for simultaneously irradiating the red illumination light and the blue illumination light can be arbitrarily set as long as the effect of the present invention is exerted, but is preferably 3 days or more, more preferably 5 to 20 days, and even more preferably 7 to 15. Day.
(培地)
緑藻類の培養に用いる液体培地としては特に制限はなく、一般に、増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩(例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など)、ビタミン類(例えば、チアミン)などを含む培地を好適に用いることができる。例えば、AF−6培地、BG−11培地、C培地、MBM培地、MDM培地、VT培地(これらの培地組成は独立行政法人国立衛生研究所ホームページの培地リストに記載されている)、などの培地およびこれらの改変培地などを用いることができる。これらの培地は緑藻類の種類や培養の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヘマトコッカス属に属する緑藻を生育させる目的では、C培地またはBG−11培地およびこれらの改変培地を用いることが好ましい。培地には、上記組成のほか、炭素源、窒素源等の成分を適宜添加してもよい。
(Culture medium)
The liquid medium used for culturing green algae is not particularly limited, and generally includes nitrogen necessary for growth, inorganic salts of trace metals (eg, phosphorus, potassium, magnesium, iron, etc.), vitamins (eg, thiamine), etc. A medium can be preferably used. For example, a medium such as AF-6 medium, BG-11 medium, C medium, MBM medium, MDM medium, VT medium (the composition of these mediums is described in the list of cultures on the National Institutes of Health website) These modified media can also be used. These media can be appropriately selected according to the type of green algae and the purpose of culture. For example, for the purpose of growing green algae belonging to the genus Haematococcus, it is preferable to use C medium or BG-11 medium and modified medium thereof. In addition to the above composition, components such as a carbon source and a nitrogen source may be appropriately added to the medium.
(培養装置)
緑藻類の培養装置としては、二酸化炭素の供給と光照射が可能な装置であれば、特に形状や大きさの制限はない。例えば、実験室で行う場合には、扁平な培養ビン、三角フラスコ、平底フラスコ、などを用いることができる。パイロットスケールや工業生産スケールで実施する場合は、ガラス製またはプラスチック製の透明容器に、外部または内部から光を照射できる装置を備えた培養槽や、金属容器内に内部から光を照射できる装置を備えた培養槽などを用いることができる。このような培養槽としては、例えば、ジャー型培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も密閉容器が好ましく用いられる。これらには必要に応じ、攪拌機を設置してもよい。
(Culture equipment)
The green algae culture device is not particularly limited in shape and size as long as it is a device capable of supplying carbon dioxide and irradiating light. For example, when performed in a laboratory, flat culture bottles, Erlenmeyer flasks, flat bottom flasks, and the like can be used. When carrying out on a pilot scale or industrial production scale, a culture vessel equipped with a device capable of irradiating light from outside or inside a glass or plastic transparent container, or a device capable of irradiating light from inside a metal container. An equipped culture tank or the like can be used. As such a culture tank, for example, a jar type culture tank, a tube type culture tank, an air dome type culture tank, a hollow cylindrical culture tank, or the like is used. In either case, a sealed container is preferably used. You may install a stirrer in these as needed.
(培養条件)
培養条件には特に制限はなく、一般に緑藻類の培養に用いられる温度、pHなどが用いられる。緑藻類の培養温度は、例えば15〜35℃の一定温度に制御することが好ましく、20〜25℃のうちの一定温度に制御することがより好ましい。培養液のpHは、4〜10に保つことが好ましく、5〜9に保つことがより好ましく、6〜8に保つことがさらに好ましい。
(Culture conditions)
There are no particular limitations on the culture conditions, and temperatures, pH, and the like generally used for culturing green algae are used. The culture temperature of green algae is preferably controlled to a constant temperature of 15 to 35 ° C, for example, and more preferably controlled to a constant temperature of 20 to 25 ° C. The pH of the culture solution is preferably maintained at 4 to 10, more preferably 5 to 9, and further preferably 6 to 8.
炭素源の供給およびpHを制御する目的で、二酸化炭素を供給することが好ましい。二酸化炭素は、通常10〜20v/v%濃度の二酸化炭素を含有する混合空気を培地中または培養槽の上部空間に供給する。例えば、0.2〜2vvmとなるように連続的に流通させることで供給される。あるいは上記混合空気で培養槽の上部空間を置換して密閉し、これを繰り返すことにより間欠的に供給してもよい。二酸化炭素の濃度は緑藻類の生育に応じて適宜濃度を変えたり、流通量を変えたりすることが好ましい。好ましい培養条件の一例としては、例えば温度20℃、pH7で、緑藻類の細胞に光が均一に照射されるように緩やかに撹拌された状態で、10〜20v/v%濃度の二酸化炭素を含有する混合空気を1vvmとなるように連続的に流通させ、緑藻類の生育に応じてpH7を維持するように適宜流通量を変えて供給しながら培養を行う。 Carbon dioxide is preferably supplied for the purpose of supplying the carbon source and controlling the pH. Carbon dioxide usually supplies mixed air containing carbon dioxide having a concentration of 10 to 20 v / v% in the medium or in the upper space of the culture tank. For example, it is supplied by continuously circulating so as to be 0.2 to 2 vvm. Or you may supply intermittently by replacing the upper space of a culture tank with the said mixed air, sealing, and repeating this. It is preferable to change the concentration of carbon dioxide as appropriate according to the growth of green algae or change the flow rate. As an example of preferable culture conditions, for example, carbon dioxide at a concentration of 10 to 20 v / v% is contained at a temperature of 20 ° C. and a pH of 7 while being gently stirred so that green algae cells are uniformly irradiated with light. The mixed air is continuously circulated so as to be 1 vvm, and culturing is performed while appropriately supplying the circulated amount so as to maintain pH 7 according to the growth of green algae.
(アスタキサンチンの製造)
以上の通りに緑藻類を培養し、アスタキサンチンを製造すると、高い蓄積濃度でアスタキサンチンを製造することができる。
(Production of astaxanthin)
When green algae are cultured as described above to produce astaxanthin, astaxanthin can be produced at a high accumulated concentration.
以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。
なお、本実施例では、ヘマトコッカス・ラクストリスNIES−144株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
Hereinafter, the effects of the present invention will be made clearer by examples. In addition, this invention is not limited to a following example, In the range which does not change the summary, it can change suitably and can implement.
In this example, the present invention will be described with reference to an example using Haematococcus lactoris NIES-144 strain, but the present invention is not limited to this example.
(実施例1)
(培地の調整)
BG−11培地の改変培地を調整した。表1に培地組成を示す。
Example 1
(Adjustment of medium)
A modified medium of BG-11 medium was prepared. Table 1 shows the medium composition.
(グリーンステージにおける培養)
1Lの三角フラスコ内の培地にヘマトコッカス・ラクストリスNIES−144株を接種した。光源に3in1LED照明(日本医科器械製、波長 赤:660nm、緑:520nm、青:445nm)を用い、光量子計(システムインスツルメンツ社製)を用いて赤:青=1:1(PPFD合計:30〜50μmol/m2/s)になるように調整し、25℃にて培養を行った。pHが6〜8になるように、1〜2v/v%濃度で二酸化炭素を含有するガスを、0.05〜0.2vvmで供給した。
(Culture on the green stage)
The medium in a 1 L Erlenmeyer flask was inoculated with Haematococcus lactoris NIES-144 strain. 3 in 1 LED illumination (wavelength red: 660 nm, green: 520 nm, blue: 445 nm) was used as a light source, and red: blue = 1: 1 (PPFD total: 30 to 30) using a photon meter (manufactured by System Instruments). 50 μmol / m 2 / s), and culture was performed at 25 ° C. A gas containing carbon dioxide at a concentration of 1 to 2 v / v% was supplied at 0.05 to 0.2 vvm so that the pH was 6 to 8.
(レッドステージにおける培養)
250mL容組織培養フラスコに上記の培養液100mLを移した。光源に3in1LED照明を用い、光量子計を用いてPPFDが培養液の照射面で赤37.5μmol/m2/s、青12.5μmol/m2/s(すなわち青色光比率25%)になるように調整し、20℃で10日間培養した。光照射は下面から、光源から2cmほど離して行った。
(Culture in red stage)
100 mL of the above culture was transferred to a 250 mL tissue culture flask. Using 3 in 1 LED illumination as the light source, using a photon meter, PPFD is red 37.5 μmol / m 2 / s and blue 12.5 μmol / m 2 / s (ie, blue light ratio 25%) on the irradiated surface of the culture solution And cultured at 20 ° C. for 10 days. The light irradiation was performed from the lower surface about 2 cm away from the light source.
なお、二酸化炭素の供給の際は、10〜20v/v%濃度で二酸化炭素を含有するガスを、滅菌フィルタを通してフラスコのヘッドスペースに通気し、十分置換させたのち、ブチルゴム栓をした。サンプリング時に開放した場合、その都度同様の手順でヘッドスペースを置換した。 In addition, when supplying carbon dioxide, a gas containing carbon dioxide at a concentration of 10 to 20 v / v% was passed through a sterilizing filter into the head space of the flask to sufficiently replace it, and then a butyl rubber stopper was attached. When opening at the time of sampling, the head space was replaced in the same procedure each time.
(窒素濃度の測定)
東亜DDK株式会社製のポータブル簡易全窒素・全リン計(TNP−10)、TNP−10ヒータ(TNP−HT)、全窒素測定試薬キット(143C191)を使用して、培地中の窒素濃度を測定した。
以下に示す実施例1〜3、比較例1〜2においては、前述の「グリーンステージにおける培養」を14日間行った後の窒素濃度が1.5mg/Lであった。このため、この時点でレッドステージに移行したと判断し、前述の「レッドステージにおける培養」を開始した。
また、実施例4〜11においては、前述の「グリーンステージにおける培養」を16日間行った後の窒素濃度が6.55mg/Lであった。このため、この時点でレッドステージに移行したと判断し、前述の「レッドステージにおける培養」を開始した。
(Measurement of nitrogen concentration)
Measure the nitrogen concentration in the culture medium using a portable simple total nitrogen and total phosphorus meter (TNP-10), TNP-10 heater (TNP-HT), and total nitrogen measuring reagent kit (143C191) manufactured by Toa DDK Co., Ltd. did.
In Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 shown below, the nitrogen concentration after performing the above-mentioned “culture on the green stage” for 14 days was 1.5 mg / L. For this reason, it was determined that the stage had shifted to the red stage at this point, and the above-described “culture on the red stage” was started.
In Examples 4 to 11, the nitrogen concentration after the above-mentioned “culture on the green stage” for 16 days was 6.55 mg / L. For this reason, it was determined that the stage had shifted to the red stage at this point, and the above-described “culture on the red stage” was started.
(総カロテノイド濃度の測定)
まず、試料を0.5mL採取し、ビーズビーター専用のジルコニアビーズ入りミクロチューブに採った。そこにアセトンを加え、細胞破砕機で破砕した。破砕後、試料を遠心分離により上清と沈殿に分け、上清(すなわち、アセトン画分)を回収した。回収したアセトン画分をアセトンで希釈し、474nmにおける吸光度を測定し、以下の式から培養液中の総カロテノイド濃度を求めた。
総カロテノイド濃度(g/L)=吸光度(474nm)×希釈倍率/210
なお、以下の実施例で使用するヘマトコッカス・ラクストリスが生産する総カロテノイドは、ほとんどがアスタキサンチンである。そのため、総カロテノイドの測定方法がアスタキサンチンの測定としても適用する。
(Measurement of total carotenoid concentration)
First, 0.5 mL of a sample was collected and placed in a micro tube containing zirconia beads exclusively for bead beaters. Acetone was added thereto and crushed with a cell crusher. After crushing, the sample was separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation, and the supernatant (ie, acetone fraction) was collected. The collected acetone fraction was diluted with acetone, the absorbance at 474 nm was measured, and the total carotenoid concentration in the culture broth was determined from the following equation.
Total carotenoid concentration (g / L) = absorbance (474 nm) × dilution ratio / 210
The total carotenoids produced by Haematococcus lactolis used in the following examples are mostly astaxanthin. Therefore, the total carotenoid measurement method is also applied as the measurement of astaxanthin.
(実施例2〜3、比較例1〜2)
実施例2〜3及び比較例1〜2としてレッドステージにおける光の照射条件を以下のように変更した。その他の条件は実施例1と同様に培養を行った。
実施例2:赤25μmol/m2/s、青25μmol/m2/s(すなわち青色光比率50%)
実施例3:赤12.5μmol/m2/s、青37.5μmol/m2/s(すなわち青色光比率75%)
比較例1:50μmol/m2/s(すなわち青色光比率0%)
比較例2:青50μmol/m2/s(すなわち青色光比率100%)
(Examples 2-3, Comparative Examples 1-2)
In Examples 2-3 and Comparative Examples 1-2, the light irradiation conditions on the red stage were changed as follows. The other conditions were the same as in Example 1.
Example 2: Red 25 μmol / m 2 / s, Blue 25 μmol / m 2 / s (ie,
Example 3: Red 12.5 μmol / m 2 / s, Blue 37.5 μmol / m 2 / s (ie, blue light ratio 75%)
Comparative Example 1: 50 μmol / m 2 / s (ie, blue light ratio 0%)
Comparative Example 2:
(実施例4〜11)
実施例4〜11としてレッドステージにおける光の照射条件を以下のように変更した。その他の条件は実施例1と同様に培養を行った。
実施例4:赤25μmol/m2/s、青25μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD50μmol/m2/s)
実施例5:赤37.5μmol/m2/s、青37.5μμmol/m2/s(すなわちtotal PPFD75μmol/m2/s)
実施例6:赤50μmol/m2/s、青50μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD100μmol/m2/s)
実施例7:赤75μmol/m2/s、青75μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD150μmol/m2/s)
実施例8:赤100μmol/m2/s、青100μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD200μmol/m2/s)
実施例9:赤5μmol/m2/s、青5μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD10μmol/m2/s)
実施例10:赤12.5μmol/m2/s、青12.5μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD25μmol/m2/s)
実施例11:赤125μmol/m2/s、青125μmol/m2/s(すなわちtotal PPFD250μmol/m2/s)
(Examples 4 to 11)
In Examples 4 to 11, the light irradiation conditions on the red stage were changed as follows. The other conditions were the same as in Example 1.
Example 4: Red 25 μmol / m 2 / s, Blue 25 μmol / m 2 / s (ie,
Example 5: Red 37.5 μmol / m 2 / s, Blue 37.5 μmol / m 2 / s (ie, total PPFD 75 μmol / m 2 / s)
Example 6:
Example 7: Red 75 μmol / m 2 / s, Blue 75 μmol / m 2 / s (
Example 8:
Example 9: Red 5 μmol / m 2 / s, Blue 5 μmol / m 2 / s (
Example 10: Red 12.5 μmol / m 2 / s, Blue 12.5 μmol / m 2 / s (ie total PPFD 25 μmol / m 2 / s)
Example 11: Red 125 μmol / m 2 / s, blue 125 μmol / m 2 / s (ie,
各種条件および結果を表2にまとめて示す。実施例1〜3、比較例1〜2の青色光比率とカロテノイド蓄積濃度の関係を図1に、実施例4〜11のtotal PPFDとカロテノイド蓄積濃度の関係を図2に示す。 Various conditions and results are summarized in Table 2. The relationship between the blue light ratio and carotenoid accumulation concentration in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 is shown in FIG. 1, and the relationship between total PPFD and carotenoid accumulation concentration in Examples 4 to 11 is shown in FIG.
青色光比率が0%では、その他の比率より総カロテノイド蓄積濃度が顕著に低かった。青色光比率25%以上では顕著な差は見られなかった。また、青色光比率が100%では、カロテノイド蓄積濃度は高いものの、消費電力あたりのカロテノイド蓄積濃度が低い値を示した。このため、青色光比率として0%、100%は好ましくないことを確認した。
また、total PPFDが大きくなるにつれ、カロテノイド蓄積濃度が高くなり、PPFD50μmol/m2/s付近で頭打ちとなった。PPFD250μmol/m2/sでは、PPFD75μmol/m2/sの時の値よりカロテノイド蓄積濃度が15%程度低い値であった。さらに、total PPFDが250μmol/m2/sの場合、消費電力あたりのカロテノイド蓄積濃度が低い値を示すことがわかった。
よって、total PPFDとして好ましい値は50〜200μmol/m2/sであることがわかった。
When the blue light ratio was 0%, the total carotenoid accumulation concentration was significantly lower than the other ratios. No significant difference was observed at a blue light ratio of 25% or more. When the blue light ratio was 100%, the carotenoid accumulation concentration was high, but the carotenoid accumulation concentration per power consumption was low. For this reason, it was confirmed that 0% and 100% were not preferable as the blue light ratio.
Further, as the total PPFD increased, the carotenoid accumulation concentration increased and reached a peak around
Accordingly, preferred values as total PPFD was found to be 50~200 μ mol / m 2 / s .
Claims (8)
前記赤色照明光および前記青色照明光の光源は、LEDである、緑藻類培養方法。 In the red stage of green algae that accumulates astaxanthin, the red illumination light and the blue illumination light are simultaneously irradiated for 3 days or more, and the photosynthesis of the blue illumination light with respect to the sum of the photosynthesis photon flux densities of the red illumination light and the blue illumination light the proportion of photon flux density is Ri 20-80% der,
The green algae culture method , wherein a light source of the red illumination light and the blue illumination light is an LED .
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