JP6558536B2 - 単層カーボンナノチューブを含む熱産生脂肪組織造影剤 - Google Patents
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このように、単層カーボンナノチューブを利用して、細胞や組織特異的に集積させる技術のさらなる開発が期待されていた。
本発明は、〔1〕生体親和性の側鎖を有するポリマーにより被覆された単層カーボンナノチューブを含む熱産生脂肪組織造影剤に関する。
ここで、本発明の熱産生脂肪組織造影剤は、一実施の形態において、
〔2〕上記〔1〕に記載の熱産生脂肪組織造影剤であって、前記生体親和性の側鎖を有するポリマーが、リン酸エステル、コリン基、ホスホリルコリン基、若しくは、ホスホリルコリン類似基、又は、これらの組み合わせを側鎖に有するポリマーであることを特徴とする。
また、本発明の熱産生脂肪組織造影剤は、一実施の形態において、
〔3〕上記〔1〕に記載の熱産生脂肪組織造影剤であって、前記生体親和性の側鎖を有するポリマーが、PMB、PLPEG、又は、それらの組み合わせであることを特徴とする。
また、本発明の熱産生脂肪組織造影剤は、一実施の形態において、
〔4〕上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の熱産生脂肪組織造影剤であって、さらに添加剤を含むことを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、
〔5〕熱産生脂肪組織特異的なドラッグデリバリーシステム用薬剤であって、生体親和性の側鎖を有するポリマーにより被覆された単層カーボンナノチューブを含む薬剤に関する。
ここで、本発明の熱産生脂肪組織特異的なドラッグデリバリーシステム用薬剤は、一実施の形態において、
〔6〕上記〔5〕に記載のドラッグデリバリーシステム用薬剤であって、前記生体親和性の側鎖を有するポリマーが、リン酸エステル、コリン基、ホスホリルコリン基、若しくは、ホスホリルコリン類似基、又は、これらの組み合わせを側鎖に有するポリマーであることを特徴とする。
また、本発明の熱産生脂肪組織特異的なドラッグデリバリーシステム用薬剤の一実施の形態によれば、
〔7〕上記〔5〕に記載のドラッグデリバリーシステム用薬剤であって、前記生体親和性の側鎖を有するポリマーが、PMB、PLPEG、又は、それらの組み合わせであることを特徴とする。
また、本発明の熱産生脂肪組織特異的なドラッグデリバリーシステム用薬剤の一実施の形態によれば、
〔8〕上記〔5〕〜〔7〕のいずれかに記載のドラッグデリバリーシステム用薬剤であって、さらに添加剤を含む薬剤。
また、本発明の別の態様によれば、
〔9〕PMBにより表面被覆された単層カーボンナノチューブに関する。
また、本発明の別の態様によれば、
〔10〕上記〔9〕に記載の単層カーボンナノチューブを製造する方法であって、
単層カーボンナノチューブをPMB溶液中に溶解する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
ここで、「生体親和性の側鎖を有するポリマー」とは、単層カーボンナノチューブの表面に被覆されるポリマーであって、単層カーボンナノチューブに生体親和性を付与するポリマーをいう。このようなポリマーとしては、リン酸エステル、コリン基、ホスホリルコリン基、若しくは、ホスホリルコリン類似基、又は、これらの組み合わせを側鎖に有するポリマーを挙げることができる。より好ましくは、リン脂質極性基であるホスホリルコリン基又はホスホリルコリン類似基を側鎖に有するポリマーである。このようなポリマーは公知であり、特開2004−189652号公報、特開2004−275862号公報、特開2008−297488号公報、国際公開公報2009/044816号パンフレットなどに開示されている。なお、ホスホリルコリン類似基とは、ホスホリルコリン構造の側鎖がさらに他の官能基により置換されたものをいい、例としては、ホスホリルコリン基の窒素に結合するメチル基が、水酸基や他の官能基(例えば、アルキル基、カルボキシ基、メトキシ基、メトキシカルボニル基、カルボニル−メトキシポリエチレングリコール(-CO(OCH2H2)nOCH3)、-CH2CH2NHCO(OCH2CH2)nO(CH2)3NH2など)に置換されているものを挙げることができる。このようなホスホリルコリン類似基を有するポリマーとしては、例えば、市販のPLPEG(SUNBRIGHT(登録商標)、DSPE-050CNやDSPE-020PA)などを挙げることができる。
なお、PLPEGは、リン脂質とポリエチレングリコールの化合物で、脂質部分がSWCNTの表面に吸着することで、PEG基によりSWCNTに親水性が付与される。PLPEG はSWCNT分散剤として既知であり、動物体内でマクロファージによる補足を遅らせることで血中滞留時間が長くなることが知られている。なお、本発明に使用されるPLPEGは、好ましくは、N-(aminopropyl polyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl-ethanolamine, sodium salt、N-(Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sodium salt、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)], ammonium saltなどである。
このように、本発明に使用される「生体親和性の側鎖を有するポリマー」は、好ましい形態において、生体親和性とともに親水性を単層カーボンナノチューブに付与し、生体内における単層カーボンナノチューブの孤立分散性を向上させる効果を付与する。このような孤立分散性の効果は、タンパクの吸着やマクロファージによる貪食を防ぐことができると考えられる。
また、SWCNTの表面被覆にPMBを用いた場合は、PLPEGを用いた場合に比べて、生体内でのSWCNT孤立分散が維持されやすいと推察され、PMBで被覆したSWCNTはBAT、ベージュ細胞組織といった熱産生脂肪に優先的に蓄積される可能性がある。
また、上述のポリマー以外にも、ウシ血清アルブミン(BSA)やマウス血清アルブミンなどのタンパク質、DNA等で単層カーボンナノチューブを被覆することにより、分散性を向上させ、熱酸性脂肪組織へ集積させる態様も挙げることができる。このようなタンパク質やDNAの被覆は、それぞれ単独で単層カーボンナノチューブの表面上に被覆しても良いし、上述の「生体親和性の側鎖を有するポリマー」などと組み合わせて被覆することもできる。
SWCNTの発光波長は、SWCNTの構造(カイラリティ)によって変わることが知られている。そこで、異なる表面被覆剤によりそれぞれ別のカイラリティをもったSWCNTを被覆することで、BATとベージュ組織を異なる波長のSWCNT発光により区別できる。たとえば、(9,4)SWCNTをPLPEGにより被覆してPLPEG-(9,4)SWCNTを作製し、(6,5)SWCNTをPMBで被覆してPMB-(6,5)SWCNTを作製することができる。これらをマウスに静脈投与すると、BATは1120nmの発光により、ベージュ細胞は1120nmと1045nmの2色発光により区別できる。
あるいは、SWCNTを酸化あるいはアリル化することにより(アリル化については、Yanmei Piao et al., Brightening of carbon nanotube photoluminescence through the incorporation of sp3 defects, Nature Chemistry 5, 840-845 (2013)参照)、同一カイラリティでも発光波長を変化させることができる。たとえば、(9,4)SWCNTでは、酸化または4-Nitrobenzenediazonium tetrafluoroborateを用いたアリル化により、1275nmに新たな発光が現れる。そこで、(9,4)SWCNTをPLPEGにて被覆し、アリル化(9,4)SWCNTをPMBで被覆し、マウスに静脈投与すると、BATは1120nmの発光により、ベージュ細胞は1120と1275nmの2色発光により区別できる。発光波長差が大きいため、フィルター変更で簡単に分光でき、また、発光は明るいので、ビームスプリッターで2方向に分けて、同時に観測し、PC上で合成表示することも可能である。
また、本発明の造影剤又はドラッグデリバリーシステム用薬剤の投与量は、当業者であれば、適宜設定して使用することが可能である。
SWCNT(HiPco Raw (NanoIntegris))100mgをコール酸ナトリウム(SC)(500mg)と超純水(100mL)中で混合させ、超音波破砕器処理にてSWCNTバンドルを個々のSWCNTへ分離させた後、遠心分離を行い、単一分散SWCNTが含まれている上澄みを回収した。この上澄み液をゲルカラムにかけて、半導体型SWCNT、単一構造(9,4)SWCNTを分取した。半導体型SWCNTにおいては、PMB30(MPC units 30%とBMA units 70%からなるコポリマー(分子量 6.0×105)。
MPC:2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine。BMA polymers:poly(n-butyl methacrylate)、またはPLPEG(SUNBRIGHT、DSPE-050PA:N-(aminopropyl polyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl-ethanolamine)水溶液に入れ(超純水を使用)、バスタイプの超音波洗浄機を用いて10分攪拌した。その後、限外ろ過(Amicon Ultra 3k(Millipore))によりコール酸ナトリウムを除去すると同時にSWCNTを濃縮し、0.5mg/mL(SWCNT/水)のPMB-SWCNTあるいはPLPEG-SWCNT水分散液を1.5-2mL得た。(9,4)SWCNTは、PLPEG水溶液に入れ、攪拌したのちに、ろ過し、0.17mg/mLのPLPEG-(9,4)SWCNT水分散液を1.5-2mL得た。
上記「1.SWCNTの水分散液の作製」で得られたPMB-SWCNTの水分散液を0.01mLとり、水にて50倍に薄めて、光吸収スペクトル(図1a)と発光スペクトル(励起光波長720nm)(図1b)を測定した。SWCNT特有の吸収ピークと発光ピークを示した。吸収スペクトルではピーク同士の重なりは少なく、SWCNTが孤立分散またはそれに近い分散状態であることを示唆している。吸収ピークと発光ピークが複数個あるのは、カイラリティの異なる数種類のSWCNTの混合物であることに由来している。PLPEGで被覆して水に分散させた(9,4)カイラリティのSWCNTの発光スペクトルマッピング(図1c)では、単一カイラリティ(9,4)SWCNTに特有の発光ピークが励起波長730nm、発光波長1120nmにみられる。同波長励起にて、1275nmに見られるピークは酸化された(9,4)SWCNTの酸化サイトからの発光である。
SWCNTを投与しないコントロールのマウス(BALB/cAJ1-nu/nu、メス)(日本クレア株式会社)の近赤外発光写真には、マウス体内や表皮に近赤外発光するものがないため白く写るものがなかった(図2)。図2の腹側の写真に白く写っているものは腸内の食物消化物であり、餌の成分に近赤外発光するものが含まれているためである。
上記「1.SWCNTの水分散液の作製」で得られたPMB-SWCNTの0.15-0.2mL/匹をマウスに尾静脈投与した。投与直後及び1、3時間、1、9日後に近赤外カメラでマウスを撮影した写真を図3に示す。PMB-SWCNTを投与したマウスでは、PMB-SWCNTによる発光(写真では白色)が肩甲骨間部、肩部から腋窩にかけて、傍脊椎部、足の付け根(腹側から背中側にかけて連続していた)、肝臓にみられた(図3A)。また、解剖して臓器を取り出すと、脾臓も白く写っていた。各組織・臓器におけるSWCNT発光強度は、投与後時間がたつに従い弱くなった(図3B)。肩甲骨間部のBATにおけるSWCNTの発光強度を詳細に解析すると、発光強度は投与後約3時間で最大となり、その後約50時間で強度が半減した。5-10日を過ぎると、いずれの組織・臓器における発光もほとんどみられなくなった。従って、SWCNTによる熱産生脂肪組織造影は、SWCNT投与後数日間が効果的であり、長期間が経過すると見えにくくなる。発光が弱くなった原因としては、SWCNTの代謝、生体内物質の吸着、pHの低いリソソームへのSWCNT集積、SWCNTが集まってバンドル形成などが考えられる。(腹側の写真で腹部に白く写っているものは消化物であり、餌の成分に近赤外発光するものが含まれているためである。)
PMB-SWCNT尾静脈投与後3日のマウスに対して、肩甲骨間部の近赤外発光する部分を採取し、HE染色を行い、光学顕微鏡で観察した。その組織は、BATに特徴的は褐色をしており(図4a)、パラフィンブロック包埋状態においても近赤外発光をしていた(図4b)。組織をHE染色後に顕微鏡観察した結果、BAT特有の多細性脂肪滴を持つ細胞が見出された(図4c)。
PMB-SWCNT尾静脈投与後3日のマウスにたいして、腕の付け根部の近赤外発光している部分を採取した。その組織は淡褐色をしており(図5a)、パラフィンブロックに包埋状態でも近赤外発光をしていた(図5b)。組織をHE染色し観察した結果、ベージュ細胞が見出された(図5c)。
PMB-CNT尾静脈投与後3日のマウスの足の付け根部の近赤外発光している部分を採取した。その組織は淡褐色をしており(図6a)、パラフィンブロックに包埋状態でも近赤外発光をしていた(図6b)。組織をHE染色し観察した結果、ベージュ細胞が見出された(図6c)。
上記「1.SWCNTの水分散液の作製」で得られたPLPEG-SWCNTを0.15-0.2mL/匹をマウスに尾静脈投与した。投与直後及び1、3時間、1-4日後に近赤外カメラでマウスを撮影した。PLPEG-SWCNT投与後1日に撮影した写真を図7に示す。分散性のよいPLPEG-SWCNTを投与したマウスでは、投与後1日に撮影すると、肩甲骨間部、背骨頂部、肝臓が白く写っていた(図7a,b)。解剖により臓器を取り出してみると脾臓も白く写っていた。PMB-SWCNTと比べると、PLPEG-CNTで造影できるBATは限定的である。(腹側の写真で腹部に白く写っているものは消化物による。餌に近赤外発光するものが含まれていた。)
分散性の良くないPLPEG-CNTの場合は、PLPEG-CNTの肩甲骨間部への蓄積は見られなかった。PLPEG-SWCNTでは、分散性によりBAT組織への蓄積が異なることがわかる。分散が悪い場合はSWCNTが凝集してサイズが大きくなるため、マクロファージに捕獲されやすくなり、その結果、BATへ蓄積しにくくなると考えられる。
PLPEG-SWCNT投与後3日のマウスの肩甲骨間部のBATにおいて近赤外発光する部分(図8a)を採取して、採取組織の発光スペクトルを測定した(図8b)結果、(9,4)SWCNT特有の発光が1120nmに見られた。また、(9,4)SWCNTの酸化物からの発光も1275nmに見られ、酸化されたSWCNTもBATに集積することがわかった。採取した組織は、BAT特有の褐色をしており(図8c)、近赤外発光写真では白く写っていて(図8d)、図8bでの発光スペクトルと矛盾していなかった。パラフィンブロックから切片を切りだし、HE染色を行い、光学顕微鏡で観察した結果、BAT特有の多細性脂肪滴を持つ細胞が見出された(図9a)。Pb-U染色した組織をTEM観察して結果、多細性脂肪滴、およびクリステが密に発達したミトコンドリアが多数みられるなど、BATの特徴が確認された(図9b,c)。SWCNTは、血管壁の近く(図9b,c)や神経末端の近くにも見出された。
ヘアレスマウス(Hos:HR-1)(日本エスエルシ―)の成体のオスとメスに対して、PMB-CNTを上記と同条件で投与し、近赤外光発光カメラでマウスを撮影した。その結果、ヘアレスマウスのメスとオスいずれにおいても、上記「4.PMB-SWCNT投与マウスの近赤外発光撮影」のヌードマウスの場合に見られたのと同じ部位にPMB-SWCNTの集積が認められた。PMB-CNTの熱産生脂肪組織造影は、マウスの種類や雌雄の影響を受けることがないことが分かった。
Claims (4)
- PMB、PLPEG、又は、それらの組み合わせにより被覆された単層カーボンナノチューブからなる熱産生脂肪組織特異的集積剤。
- 請求項1に記載の熱産生脂肪組織特異的集積剤であって、さらに添加剤を含む熱産生脂肪組織特異的集積剤。
- 熱産生脂肪組織の造影に用いる、請求項1または2に記載の熱産生脂肪組織特異的集積剤。
- 熱産生脂肪組織特異的なドラッグデリバリーシステムに用いる、請求項1または2に記載の熱産生脂肪組織特異的集積剤。
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