JP6534138B2 - Sorghum desiccation control gene and method of controlling squeeze characteristics of plant using the same - Google Patents
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Description
本発明はソルガム乾汁性制御遺伝子とその利用に関する。 The present invention relates to a sorghum dry control gene and its use.
バイオ燃料はバイオマスの持つエネルギーを利用した燃料であり、石油のような枯渇性資源を代替し得る非枯渇性資源として注目されている。 Biofuels are fuels that use energy possessed by biomass, and are attracting attention as non-depletable resources that can replace depletable resources such as petroleum.
そのようなバイオ燃料の資源となる候補作物としてソルガムが注目されている。ソルガムは大型のイネ科の植物であり、サトウキビと同じように葉肋と茎に糖を蓄積する性質があり、サトウキビに比べてはるかに生育が早い。よってソルガムを生長させ、その茎を搾汁し、その汁に含まれる糖を発酵させることにより、効率良くバイオエタノールを生産することが期待されている。 Sorghum has attracted attention as a candidate crop for such biofuel resources. Sorghum is a large gramineous plant, and like sugarcane, has the property of accumulating sugars in leaf axils and stems, and grows much faster than sugarcane. Therefore, it is expected that bioethanol can be efficiently produced by growing sorghum, squeezing the stem, and fermenting the sugar contained in the juice.
ソルガムからバイオエタノールの原料を効率よく得るためには、ソルガムが、茎の髄が高糖度液で満たされた汁性の形質を有することが必要である。ソルガムは同一種内に汁性品質と乾性品質の両方の形質を持つ非常にまれな作物である。ソルガムの乾汁性という形質は100年近く前に報告され、この形質が単一遺伝子により決定される対立遺伝子であることが知られていた。さらにソルガムの乾汁性は単一の遺伝子により支配されており、汁性が劣性であることも知られていた（非特許文献1：Hilson, 1916）。しかしソルガムの乾汁性を支配する遺伝子はこれまで同定されていなかった。かつ、全ゲノム配列の中でどの部分が該品種の汁性に関与しているかについては全く判っていなかった。 In order to efficiently obtain the raw material of bioethanol from sorghum, it is necessary for sorghum to have a juicy trait in which the pulp of the stem is filled with a high sugar solution. Sorghum is a very rare crop with traits of both juice quality and dryness quality within the same species. The dry nature of sorghum was reported nearly 100 years ago and was known to be an allele determined by a single gene. Furthermore, it was also known that the dryness of sorghum is controlled by a single gene, and that it is recessive (Non-patent Document 1: Hilson, 1916). However, the gene that controls the sorghum desiccation has not been identified so far. Also, it was not known at all which part of the whole genome sequence is involved in the nature of the cultivar.
本発明の解決すべき課題はバイオエタノール生産に資するために、その原料となるソルガムの乾汁性を支配する遺伝子を提供すること、更にその遺伝子を利用して汁性の搾汁特性を有する植物を作出することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide a gene which controls the dry property of sorghum, which is the raw material, to contribute to bioethanol production, and a plant having juice squeeze characteristics utilizing the gene. To create
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、優性形質であるD遺伝子がソルガムの茎の乾汁性制御に不可欠な遺伝子であることを見出した。野生型D遺伝子はソルガム品種に乾性の搾汁特性を付与する。一方、本発明者らは汁性を有するソルガム品種はD遺伝子に劣性の変異を有していることを見出した。そのような劣性遺伝子（以下でd遺伝子と称する）はソルガム品種に汁性の搾汁特性を付与する。ソルガムのd遺伝子は変異を有することにより正常なタンパク質の発現が阻害され、よって汁性の形質を示すと考えられる。 The inventors of the present invention have made intensive efforts to solve the above problems, and as a result, they have found that the dominant trait, the D gene, is an essential gene for controlling the dryness of sorghum stalk. The wild-type D gene confers sorghum cultivars with a dry juicing property. On the other hand, the present inventors found that a sorghum variety having a degradant has a recessive mutation in the D gene. Such recessive genes (hereinafter referred to as d genes) confer sorghum cultivars with judicial juicing characteristics. The mutation of the sorghum d gene inhibits the expression of normal protein, and thus is considered to exhibit a characteristic trait.
本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様1］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2（のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質、
の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様2］
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害することを特徴とする、態様1に記載の汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様3］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、態様1の（a）〜（c）に記載したタンパク質、の機能を阻害することを特徴とする、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法。
［態様4］
態様2の（a）〜（g）に記載した核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の機能を阻害することを特徴とする、態様3記載の方法。
［態様5］
植物が、イネ科植物（好ましくは、ソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択される植物、さらに好ましくはソルガム）である、態様1〜4のいずれか1に記載の方法。
［態様6］
SEQ ID NO: 1において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換である、態様2または態様4に記載の方法。
［態様7］
SEQ ID NO: 2において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸番号39のアミノ酸置換、アミノ酸番号149〜152のアミノ酸欠失、アミノ酸番号180のアミノ酸置換、アミノ酸番号208と209の間のアミノ酸付加、アミノ酸番号256と257の間のアミノ酸欠失、アミノ酸番号278のアミノ酸置換、アミノ酸番号278と279の間のアミノ酸付加、アミノ酸番号281と282の間のアミノ酸欠失である、態様1〜4のいずれかに記載の方法。
［態様8］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異が導入され、乾性の搾汁特性を付与する機能が喪失された、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物。
［態様9］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質。
［態様10］
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸。
［態様11］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸が導入され、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物。
［態様12］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸を植物に導入する工程を含む、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様13］
態様10記載の核酸を植物に導入することを特徴とする、植物に乾性の搾汁特性を付与する方法。
［態様14］
植物においてSEQ ID NO: 1の塩基番号塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカー。
［態様15］
植物においてSEQ ID NO: 1の塩基番号塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含むマーカーの有無を調べることを含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカーを検出し、検出されたマーカーが、変異を含むことにより上記の塩基配列の一部分がタンパク質に翻訳されない場合には該植物は汁性の搾汁特性を有すると判定し、上記変異を含まない場合には乾性の搾汁特性を有すると判定する工程を含む、植物の乾汁性を判定する方法。
Preferred Aspects of the Invention The present invention preferably includes the following aspects.
[Aspect 1]
A protein having dry squeeze characteristics, which imparts the dry squeeze characteristics to the plant, which comprises the following (a) to (c):
(A) A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants, or (c) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
Any of the proteins,
A method of producing a transformed plant having juice property, characterized by inhibiting the function of
[Aspect 2]
(A) to (g) below;
(A) a nucleic acid encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeezing property,
(C) A nucleic acid which comprises an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
(D) a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(E) A nucleic acid encoding a protein comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 1 and which imparts a dry squeezing property to plants.
(F) A nucleic acid which comprises a base sequence having at least 83% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
(G) A protein consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and encoding a protein that imparts a dry squeezing property to plants Nucleic acid,
In a nucleic acid selected from the group consisting of: a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frameshift mutation, and a null mutation, thereby giving the function of imparting a dry squeezing property to plants of the protein A method of producing a transformed plant having juice characteristics according to aspect 1, characterized by inhibiting.
[Aspect 3]
In a plant having a dry squeezing property, the protein is characterized in that it inhibits the function of the protein described in (a) to (c) of aspect 1, which is a protein that imparts the dry squeezing property to the plant. A method of imparting a borage character to the plant.
[Aspect 4]
In the nucleic acids described in (a) to (g) of aspect 2, inhibiting the function of the protein by introducing a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frame shift mutation, and a null mutation. The method according to aspect 3, characterized in that
[Aspect 5]
Aspect 4 described in any one of Aspects 1 to 4, wherein the plant is a gramineous plant (preferably a plant selected from the group consisting of sorghum, corn, switchgrass, millet, brachipodium, rice, more preferably sorghum) the method of.
[Aspect 6]
The site at which a mutation is introduced in SEQ ID NO: 1 is a base deletion or base substitution of base number 115 of SEQ ID NO: 1, a base deletion of base numbers 3690 to 3701, a base substitution of base number 3783, a base number Base addition between 3869 and 3870, base substitution of base No. 3979, base deletion of base Nos. 4012 to 4015, base substitution of base No. 4069, base substitution of base No. 4076, base addition between base Nos. 4079 and 4080 The method according to aspect 2 or aspect 4, which is a base deletion of base numbers 4086 to 4088, a base substitution of base number 4093.
[Aspect 7]
The site at which a mutation is introduced in SEQ ID NO: 2 is the amino acid substitution of amino acid No. 39 of SEQ ID NO: 2, the amino acid deletion of amino acid Nos. 149 to 152, the amino acid substitution of amino acid No. 180, amino acid nos. Amino acid addition between: amino acid number 256 and 257; amino acid substitution between amino acid number 278; amino acid addition between amino acid numbers 278 and 279; amino acid deletion between amino acid numbers 281 and 282; The method in any one of 1-4.
[Aspect 8]
In the nucleic acid according to (a) to (g) of aspect 2, a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frameshift mutation, and a null mutation is introduced, and the function of imparting dry squeeze characteristics is lost. Transformed plant having a characteristic of juicing juice.
[Aspect 9]
A protein having dry squeeze characteristics, which imparts the dry squeeze characteristics to the plant, which comprises the following (a) to (c):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants, or (c) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which confers dry squeeze characteristics on plants
Any of the proteins.
[Aspect 10]
(A) to (g) below;
(A) a nucleic acid encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeezing property,
(C) A nucleic acid which comprises an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
(D) a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(E) A nucleic acid encoding a protein comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 1 and which imparts a dry squeezing property to plants.
(F) A nucleic acid which comprises a base sequence having at least 83% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
(G) A protein consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and encoding a protein that imparts a dry squeezing property to plants Nucleic acid,
A nucleic acid selected from the group consisting of
[Aspect 11]
A transformed plant having introduced therein the nucleic acid according to (a) to (g) of aspect 2 and having a dry squeeze characteristic.
[Aspect 12]
A method for producing a transformed plant having a dry squeeze characteristic, comprising the step of introducing the nucleic acid according to (a) to (g) according to aspect 2 into a plant.
[Aspect 13]
A method for imparting a dry juicing property to a plant, comprising introducing the nucleic acid according to aspect 10 into the plant.
[Aspect 14]
Base deletion or substitution of the base number base number 115 of SEQ ID NO: 1, base deletion of the base number 3690-3701, base substitution of the base number 3783, base addition between the base numbers 3869 and 3870, base in plants Base substitution of No. 3979, base deletion of base Nos. 4012 to 4015, base substitution of base No. 4069, base substitution of base No. 4076, base addition between base Nos. 4079 and 4080, base deletion of base Nos. 4086 to 4088 A marker for determining the dryness of a plant, which comprises the base sequence shown by base substitution of base number 4093.
[Aspect 15]
Base deletion or substitution of the base number base number 115 of SEQ ID NO: 1, base deletion of the base number 3690-3701, base substitution of the base number 3783, base addition between the base numbers 3869 and 3870, base in plants Base substitution of No. 3979, base deletion of base Nos. 4012 to 4015, base substitution of base No. 4069, base substitution of base No. 4076, base addition between base Nos. 4079 and 4080, base deletion of base Nos. 4086 to 4088 And detecting a marker for determining the desiccation of a plant, which comprises determining the presence or absence of a marker containing a base sequence represented by base substitution of base No. 4093, and the detected marker contains a mutation Determining that the plant has juice squeeze characteristics if a portion of the nucleotide sequence of S is not translated into a protein, and determining it has dry squeeze characteristics if it does not contain the mutation How to determine the desiccation of plants.
本発明により、ソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネなどのイネ科植物の乾汁性に関与するD遺伝子が提供された。D遺伝子を操作することにより、バイオマス特性に優れたイネ科植物（例えば、ソルガムなど）の品種を作製することが可能である。更にイネ科植物に対して組み換え技術を用いて本遺伝子の機能を制御することによって、バイオエタノール生産効率に重要な形質である搾汁特性を飛躍的に増大させることができる可能性もある。即ち野生型D遺伝子にD遺伝子により規定されるタンパク質を欠失させるような変異を導入することにより、植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を喪失させ、結果として植物に汁性の形質特性を付与すること、並びに、汁性の形質転換植物を作製することができる。更にソルガムの乾汁性に関与するD遺伝子の部分配列を、植物の乾汁性を判定するためのマーカーとして使用することもできる。 The present invention provides a D gene involved in the dryness of gramineous plants such as sorghum, corn, switchgrass, millet, brachipodium, rice and the like. By manipulating the D gene, it is possible to produce varieties of grasses (eg, sorghum etc.) excellent in biomass characteristics. Furthermore, by controlling the function of this gene using recombinant technology for grasses, it may be possible to dramatically increase squeeze characteristics, which is a trait important for bioethanol production efficiency. That is, by introducing a mutation that causes deletion of the protein defined by the D gene to the wild-type D gene, the function of imparting the dry squeezing property to the plant is lost, and as a result, the trait property of the plant becomes juicy. As well as producing transgenic plants. Furthermore, the partial sequence of the D gene involved in the sorghum desiccation can also be used as a marker for determining the desiccatability of plants.
（1）野生型D遺伝子およびDタンパク質について
本発明において、D遺伝子によりコードされるタンパク質（Dタンパク質という）は、ソルガムの乾汁性を制御する因子である。ソルガム品種千斤白は、野生型のD遺伝子のゲノムDNA配列を有しており、この塩基配列をSEQ ID NO: 1として示し、そしてSEQ ID NO: 1のコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列として示す。そして、本発明において、前記野生型D遺伝子は、ソルガムに乾性の形質を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、この形質は優性形質であることが明らかになった。
(1) Wild-type D gene and D protein In the present invention, the protein encoded by the D gene (referred to as D protein) is a factor that controls the dryness of sorghum. The sorghum variety Chitobi has the genomic DNA sequence of the wild-type D gene, the nucleotide sequence of which is shown as SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded by the coding region of SEQ ID NO: 1, The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is shown. And in the present invention, the wild-type D gene is a gene encoding a protein that imparts a dry trait to sorghum, and it has been revealed that this trait is a dominant trait.
一方、D遺伝子に変異が生じ、D遺伝子により規定されたタンパク質（すなわち、Dタンパク質）が、ソルガムを初めとしたイネ科植物に対して乾性の搾汁特性を付与することができなくなった場合に、その変異型の遺伝子のことをd遺伝子と呼ぶ。この場合、d遺伝子となった結果として、植物に対して汁性の搾汁特性を付与することとなるという特徴を有する。 On the other hand, when a mutation occurs in the D gene, and the protein defined by the D gene (that is, the D protein) can not impart dry squeeze characteristics to grasses including Sorghum. The mutant gene is called d gene. In this case, as a result of becoming d gene, it has a feature that it becomes to give juice property of juice to the plant.
本発明のD遺伝子により特定されるタンパク質（Dタンパク質）は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質（野生型Dタンパク質）だけではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与することができるその変異体タンパク質もまた含む概念である。 The protein (D protein) specified by the D gene of the present invention can impart not only the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (wild type D protein) but also the dry squeeze characteristics to plants The concept is that the mutant protein is also included.
本発明において、植物に対して乾性の搾汁特性を付与する特徴を有するタンパク質（以下において、Dタンパク質という）という場合、以下の（a）〜（c）のタンパク質：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質、
のいずれかのタンパク質として定義される。
In the present invention, when referring to a protein having a characteristic of imparting a dry squeezing property to plants (hereinafter referred to as D protein), the following proteins (a) to (c):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants, or (c) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which confers dry squeeze characteristics on plants
A protein selected from the group consisting of
Defined as any protein of
本明細書において乾性とはソルガムまたは他の植物において茎と中肋が水浸状の表現型を示さないことを意味し、汁性とはソルガムまたは他の植物において茎と中肋が水浸状の表現型を示すことを意味する。図1に、ソルガム乾性個体の葉の中肋（a：乾性、b：汁性）と茎縦断面（c：乾性、d：汁性）を示す。 In the present specification, dryness means that the stem and mid bud do not show a watery phenotype in sorghum or other plants, and juice means that the stem and mid bud are submerged in sorghum or other plants Is meant to indicate the phenotype of FIG. 1 shows the medium scale (a: dry, b: juice) and the stem longitudinal section (c: dry, d: juice) of the leaves of the sorghum-dried individual.
本発明のD遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からなるDタンパク質は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列で示されるもの（前述のタンパク質（a））に限定されるものではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与する限りにおいてその変異体（前述のタンパク質（b）またはタンパク質（c））もまた包含する。以下にSEQ ID NO: ２のアミノ酸配列の変異体タンパク質（前述のタンパク質（b）またはタンパク質（c））について詳細に説明をする。 The D protein consisting of the amino acid sequence encoded by the D gene of the present invention is not limited to the one represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (the above-mentioned protein (a)), and The variants thereof (the aforementioned protein (b) or protein (c)) are also included as long as they impart juice properties. The variant protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (the aforementioned protein (b) or protein (c)) is described in detail below.
本発明において、SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と同様に、植物に対して乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の変異体タンパク質として包含される（タンパク質（b））。ここで複数個とは2〜10個、好ましくは2〜9個、2〜7個、2〜5個、2〜3個を意味する。 In the present invention, a protein consisting of an amino acid sequence comprising one or more amino acid deletions, substitutions and / or additions in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, which is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Similarly, a protein having the property of imparting dry squeezing properties to plants is included as a variant protein of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (protein (b)). Here, plural means 2 to 10, preferably 2 to 9, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 3.
本発明において、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上、より好ましくは99.3％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と同様に、植物に対して乾性特性を付与する性質を有するタンパク質もまた、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の変異体タンパク質として包含される（タンパク質（c））。 In the present invention, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is at least 80% or more, preferably 85% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more Preferably, it is a protein consisting of an amino acid sequence having 99.3% or more sequence identity, which, like the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, also has the property of imparting a drying property to plants. It is included as a variant protein of the amino acid sequence of NO: 2 (protein (c)).
タンパク質（c）の態様において、2つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。あるいは、2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. およびWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）より入手可能なGAPコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定することができる。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）Henikoff, S. およびHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、blosum62；（2）12のギャップ加重；（3）4のギャップ長加重；および（4）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。 In the embodiment of protein (c), the percent identity of two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculations. Alternatively, the percent identity of the two protein sequences is based on the algorithm of Needleman, SB and Wunsch, CD (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970), and the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) It can be determined by comparing sequence information using the more available GAP computer program. Preferred default parameters for the GAP program include: (1) scoring matrix as described in Henikoff, S. and Henikoff, JG (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992) , Blosum 62; (2) gap weight of 12; (3) gap length weight of 4; and (4) no penalty for end gap.
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いることができる。同一性のパーセントは、例えばAltschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているBLASTプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（NCBI）、あるいはDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから利用することが可能である。BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、2つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス製）などのプログラム、または、FASTAアルゴリズムなどを用いて決定することができる。その際、検索はデフォルト値を用いることができる。 Other programs of sequence comparison that are used by those skilled in the art can also be used. Percent identity can be determined relative to sequence information using, for example, the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997). The program can be used on the Internet from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website. The various conditions (parameters) for identity search by the BLAST program are described in detail on the same site, and some settings can be changed as appropriate, but the search is usually performed using default values. Alternatively, the percent identity between two amino acid sequences can be determined using a program such as genetic information processing software GENETYX Ver. 7 (manufactured by Genetics) or the FASTA algorithm or the like. The search can then use default values.
また、本発明のD遺伝子は、SEQ ID NO: １の塩基配列（核酸（d））またはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列（核酸（a））で示されるものに限定されるものではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与するその変異体タンパク質をコードするその他の塩基配列も包含する概念である。以下にSEQ ID NO: １の塩基配列の変異体について詳細に説明をする。 In addition, the D gene of the present invention is represented by the nucleotide sequence (nucleic acid (a)) encoding a protein consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (nucleic acid (d)) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 The concept is not limited to the above, and is a concept encompassing other base sequences encoding the mutant protein which imparts a dry squeezing property to plants. Hereinafter, variants of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 will be described in detail.
前述した通り、本発明のDタンパク質は、タンパク質（a）〜（c）として定義することができる。これらのタンパク質に基づいて、本発明のD遺伝子には、タンパク質（a）〜（c）に対応するものとして、以下の（a）〜（c）の核酸：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
のいずれかの核酸が含まれる。
As mentioned above, the D protein of the present invention can be defined as proteins (a) to (c). Based on these proteins, the D gene of the present invention corresponds to the proteins (a) to (c) by the following nucleic acids (a) to (c):
(A) a nucleic acid encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeezing property,
(C) A nucleic acid which comprises an amino acid sequence having at least 75% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
The nucleic acid of any of
タンパク質をコードする核酸において、核酸上に記録されている塩基配列情報は、周知のコドン規則に基づいてアミノ酸の配列情報に変換されるが、その際に、64種類のコドン情報に対して20種類のアミノ酸情報または終止コドン情報のいずれかを割り当てることになるため、縮重コドンが生じる。したがって、核酸の塩基配列中に縮重コドン間での変更が含まれていても、本発明の核酸（a）〜（c）の態様に含まれると理解される。例えば、核酸（a）の場合、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列をコードする核酸としてSEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸が存在するが、このSEQ ID NO: 1の塩基配列に対して、上述した縮重のコドン変化に基づく塩基置換が含まれていたとしても、結果としてSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列をコードすることになる場合には、その様な核酸もまた核酸（a）に含まれる。 In a nucleic acid encoding a protein, the base sequence information recorded on the nucleic acid is converted into amino acid sequence information based on the well-known codon rules, in which case 20 types of 64 types of codon information are obtained. Degenerate codons arise because it will assign either amino acid information or stop codon information. Therefore, even if the base sequence of the nucleic acid includes changes between degenerate codons, it is understood to be included in the embodiments of the nucleic acids (a) to (c) of the present invention. For example, in the case of the nucleic acid (a), there is a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a nucleic acid encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 against the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Such a nucleic acid is also a nucleic acid (a) if it results in coding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, even if a base substitution based on degenerate codon changes as described above is included. include.
核酸（b）および（c）において、核酸が規定するタンパク質（b）および（c）に関して、それぞれの態様における「1または複数個のアミノ酸」の定義、そして「配列同一性」の定義、に付いては、前述した通りである。 In the nucleic acids (b) and (c), with respect to the proteins (b) and (c) defined by the nucleic acid, the definition of “one or more amino acids” in each embodiment and the definition of “sequence identity” Is as described above.
本発明においてはまた、前述した通り、本発明のD遺伝子という場合、その一態様として、SEQ ID NO: 1の塩基配列（核酸（d））が含まれ、そしてこの核酸（d）に基づいて得られるD遺伝子の変異体もまた、含まれる。したがって、本発明のD遺伝子には、以下の（d）〜（g）の核酸：
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
のいずれかの核酸もまた含まれる。以下にSEQ ID NO: 1の塩基配列の変異体（核酸（e）〜（g））について詳細に説明をする。
In the present invention, as described above, when referring to the D gene of the present invention, the base sequence of SEQ ID NO: 1 (nucleic acid (d)) is included as one embodiment thereof, and based on this nucleic acid (d) Variants of the resulting D gene are also included. Therefore, in the D gene of the present invention, the following nucleic acids (d) to (g):
(D) a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(E) A nucleic acid encoding a protein comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 1 and which imparts a dry squeezing property to plants.
(F) A nucleic acid which comprises a base sequence having at least 83% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
(G) A nucleic acid which comprises a base sequence which hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
The nucleic acid of any of is also included. The variants (nucleic acids (e) to (g)) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are described in detail below.
SEQ ID NO: 1で示される塩基配列において、1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: １の塩基配列と同様に、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（e））。ここで複数個とは2〜10個、好ましくは2〜9個、2〜7個、2〜5個、2〜3個を意味する。 A nucleic acid consisting of a nucleotide sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and similarly to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, A nucleic acid encoding a protein having a property of imparting a dry squeezing property to plants is also encompassed in the mutant of the D gene of the present invention (nucleic acid (e)). Here, plural means 2 to 10, preferably 2 to 9, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 3.
またSEQ ID NO: 1の塩基配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上、より好ましくは99.3％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: １の塩基配列と同様に、植物に乾性特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（f））。 In addition, the base sequence of SEQ ID NO: 1 and at least 80%, preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, more preferably 99.3 A nucleic acid consisting of a nucleotide sequence having% or more of sequence identity, which, like the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, has a property of imparting a dry property to plants, is also a nucleic acid of the present invention Included in variants of the D gene (nucleic acid (f)).
2つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（GCG；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン10.0プログラム「GAP」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「GAP」プログラムの使用により、2つの核酸配列の比較の他に、2つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「GAP」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）ヌクレオチドについての（同一物について1、および非同一物について0の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのGCG実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、353-358頁、1979により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（2）アミノ酸の各ギャップについて30のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の1のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて50のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の3のペナルティ；（3）エンドギャップへのノーペナルティ：および（4）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なBLASTNプログラム、バージョン2.2.7、またはUW-BLAST2.0アルゴリズムが使用可能である。UW-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（A）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（B）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはE-スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいE-スコア閾値の数値は0.5であるか、または好ましさが増える順に、0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、10-5、10-10、10-15、10-20、10-25、10-30、10-40、10-50、10-75、または10-100である。 The percent identity of the two nucleic acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation, or more preferably, the comparison is made by comparing the sequence information using a computer program. A representative, preferred computer program is the Wisconsin package of the Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI), version 10.0 program "GAP" (Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387). By using this "GAP" program, in addition to the comparison of two nucleic acid sequences, the comparison of two amino acid sequences and the comparison of a nucleic acid sequence with an amino acid sequence can be performed. Here, preferred default parameters for the "GAP" program include: (1) GCG runs of unary comparison matrices (including 1 for identical and 0 for non-identical) for nucleotides; Schwartz and Dayhoff, "Atlas of Polypeptide Sequence and Structure", National Biomedical Research Foundation, 353-358, 1979, Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res., 14 as described by 1979. Weighted amino acid comparison matrix of 6745, 1986; or other comparable comparison matrix; (2) a penalty of 30 for each gap of amino acids and an additional penalty of 1 for each symbol in each gap; or each gap of nucleotide sequences 50 penalties for and an additional 3 penalties for each symbol in each gap; (3) end gap NO Penalty: No maximum penalty to and (4) a long gap, are included. Other sequence comparison programs used by those skilled in the art are available, for example, by the US National Library of Medicine website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html The BLASTN program, version 2.2.7, or the UW-BLAST 2.0 algorithm can be used. Standard default parameter settings for UW-BLAST 2.0 are described at the following Internet site: http://blast.wustl.edu. In addition, the BLAST algorithm uses the BLOSUM 62 amino acid scoring matrix and the selection parameters that can be used are: (A) Segments of query sequences with low compositional complexity (Wootton and Federhen's SEG program (Computers) and Chemistry, 1993); Wootton and Federhen, 1996 "Analysis of compositionally biased regions in sequence databases", see also Methods Enzymol., 266: 544-71. Or include a filter to mask a segment consisting of short-periodic internal repeats (as determined by the XNU program of Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), and (B) adapting to the database sequence Statistical significance threshold to report, or E-score (Karlin and Altschul, 1 According to the statistical model of 990), simply the expected probability of a match found by chance; this match is not reported if the statistical significance difference due to a match is greater than the E-score threshold); preferred E-score The threshold value is 0.5 or in order of increasing preference: 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 10 -5 , 10 -10 , 10 -15 , 10 -20 , 10 -25 , 10 It is -30 , 10 -40 , 10 -50 , 10 -75 or 10 -100 .
また、SEQ ID NO: 1で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: 1の塩基配列と同様に、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（g））。 In addition, a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence hybridizing under stringent conditions, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Similarly, a nucleic acid encoding a protein having the property of imparting a dry squeezing property to plants is also encompassed in the mutant of the D gene of the present invention (nucleic acid (g)).
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。 Here, "under stringent conditions" means to hybridize under highly stringent conditions .
この節において説明をした本発明のD遺伝子は、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質（すなわち、Dタンパク質）をコードするものであることが明らかになった。その一方で、植物に乾性の搾汁特性を付与するDタンパク質の機能を阻害することにより、植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害し、結果として植物に対して汁性の搾汁特性を付与することができることを示した。この様なDタンパク質の機能を阻害する手段の詳細に付いては後述するが、その一例として、本発明のD遺伝子をコードする核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異を導入することにより、乾性の搾汁特性を付与する機能を喪失させ、結果として植物に汁性の搾重特性を付与することができる。この様な、Dタンパク質が本来有している機能を喪失させるようなD遺伝子の変異体を、以下においてd遺伝子と呼ぶこととした。このd遺伝子は、解析の結果、劣性の形質を示すものであることが明らかになった。植物の汁性、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異については、下記（2）の「d遺伝子について」の項で定義を記載する。 The D gene of the present invention described in this section was found to encode a protein having a property of imparting a dry squeezing property to plants (ie, D protein). On the other hand, by inhibiting the function of D protein which imparts dry squeezing properties to plants, it inhibits the function of imparting dry squeezing properties to plants, and as a result, squeezed squeeze on plants It showed that the characteristic can be given. Details of the means for inhibiting the function of such D protein will be described later, and one example thereof is a group consisting of a stop codon mutation, a frame shift mutation and a null mutation in a nucleic acid encoding the D gene of the present invention. By introducing a mutation selected from the above, the function of imparting a dry squeezing property can be lost, and as a result, the plant can be provided with a squeezed squeezing property. Such a variant of the D gene that causes the D protein to lose its inherent function is hereinafter referred to as the d gene. As a result of analysis, it was revealed that this d gene is a recessive trait. The plant juice, stop codon mutation, frame shift mutation, and null mutation are described in the section (2), "About d gene" below.
（2）d遺伝子について
d遺伝子は上記（1）で述べたD遺伝子に変異が導入され、その結果として植物が汁性の搾汁特性の形質を有することとなる遺伝子である。このd遺伝子は、植物細胞中でヘテロで存在する場合には、乾性の汁性特性を示し、一方、ホモで存在する場合にのみ汁性の搾汁特性を示すことが明らかになった。このことから、d遺伝子は、劣性形質の遺伝子であり、D遺伝子の機能欠失変異体であることが明らかになった。
(2) About d gene
The d gene is a gene in which a mutation is introduced into the D gene described in the above (1), and as a result, the plant has a trait of juice property. It was found that the d gene exhibits a dry juice character when it is present in a plant cell heterozygous, while showing a juice squeeze character only when it is present homo. From this, it was revealed that the d gene is a recessive trait gene and a functionally deleted mutant of the D gene.
上記のような機能欠失変異は、例えば、D遺伝子のオープンリーディングフレーム内において生じた、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異を例として挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、その変異の結果として植物が汁性の搾汁特性の形質を有することとなる限り種々の変異を包含するものである。配列表のSEQ ID NO: 1の塩基配列で示されるD遺伝子にこのような変異が導入されたd遺伝子を有する植物では、d遺伝子が発現されることにより、D遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害されていることを特徴とする。そしてd遺伝子によって作製されたD遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害された植物は、汁性の搾汁特性を有する。よって下記（3）と（4）にも記載するように、D遺伝子にこのような変異を導入することにより、その結果として植物が汁性の搾汁特性を有することとなる。 The functional deletion mutation as described above can be exemplified by, for example, a mutation generated in the open reading frame of the D gene, which is selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frame shift mutation and a null mutation. However, the present invention is not limited thereto, and includes various mutations as long as the plant results in the trait of juice property as a result of the mutation. In plants having a d gene in which such a mutation has been introduced into the D gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the d gene is expressed to inhibit the function of the protein based on the D gene. It is characterized by being. And the plant in which the function of the protein based on the D gene created by the d gene is inhibited has juice-like squeeze characteristics. Therefore, as described in the following (3) and (4), by introducing such a mutation into the D gene, as a result, the plant will have juice-like squeeze characteristics.
本明細書において「D遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害された」とは、D遺伝子に変異が導入されることにより、D遺伝子がコードするタンパク質が機能欠失を生じるか、または正常に発現することができないことを意味する。 In the present specification, "the function of a protein based on D gene is inhibited" means that a mutation is introduced into D gene so that a protein encoded by D gene causes functional loss or is normally expressed. It means that you can not do it.
本明細書において「ストップコドン変異」とは、遺伝子を規定するDNAに対して1または数個の塩基が挿入されることにより、挿入された部位のアミノ酸のコドンを終止コドンにするような塩基配列の変異を意味する。 As used herein, the term "stop codon mutation" refers to a nucleotide sequence that causes the codon of the amino acid at the inserted site to be a stop codon by inserting one or several bases into the DNA defining the gene. Means a mutation of
本明細書において「フレームシフト」とは、DNAに1個または数個（3の倍数ではない）の塩基の挿入や欠失が起こった結果、トリプレットのリーディングフレーム（読み枠）がずれてしまい、結果としてその挿入または欠失が生じた場所以降で野生型とは異なるアミノ酸配列を規定したり停止コドンが挿入されたりするような塩基配列の変異を意味する。 In the present specification, "frame shift" means that the reading frame of a triplet is shifted as a result of insertion or deletion of one or several (not a multiple of 3) bases in DNA. As a result, it means a mutation of a nucleotide sequence that defines an amino acid sequence different from that of wild-type or inserts a stop codon after the site where the insertion or deletion has occurred.
本明細書において「ヌル変異」とは、欠失や塩基置換などにより、全アミノ酸配列が発現されなくなるなど、機能を持つ遺伝子発現産物が作れなくなるような塩基配列の変異を意味する。 As used herein, the term "null mutation" refers to a mutation of a nucleotide sequence such that a gene expression product having a function can not be produced, such as deletion of the entire amino acid sequence due to deletion or base substitution.
（3）D遺伝子およびd遺伝子の配列解析
下記の実施例で詳細に述べるが、乾性品種である千斤白のD遺伝子オルソログと、汁性品種である那系MS3BのD遺伝子オルソログにつきマッピングを行い、D遺伝子の候補領域を絞り込んだ。候補領域を18.99 kbに絞り込み、当該領域の塩基配列を公開されているソルガムのデータベース（汁性品種：BTX623の全塩基配列）から検索したところ、BTX623の全塩基配列中のこの領域にはSorbic.006G147400遺伝子のみが存在していた。よってSorbic.006G147400遺伝子が、汁性品種BTX623の乾汁性制御遺伝子であると判明した。
(3) Sequence analysis of D gene and d gene As will be described in detail in the following examples, mapping is performed for the D gene ortholog of the dry cultivar, Chitobi, and the D gene ortholog of the naive MS3B, which is the juicy cultivar, The candidate regions of D gene were narrowed down. The candidate region was narrowed to 18.99 kb, and the nucleotide sequence of the region was searched from the published sorghum database (juice cultivar: whole nucleotide sequence of BTX 623), and this region in the entire nucleotide sequence of BTX 623 contains Sorbic. Only the 006G147400 gene was present. Therefore, it was revealed that the Sorbic. 006 G 147 400 gene is a dry control gene of the juicy variety BTX 623.
Sorbic.006G147400遺伝子のゲノムDNA配列をSEQ ID NO: 3に示す。BTX623は汁性品種であるために、Sorbic.006G147400遺伝子は変異を有する変異型遺伝子である。SEQ ID NO: 3のコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列に示す（この変異型遺伝子のことをd遺伝子と呼ぶ）。 The genomic DNA sequence of the Sorbic. 006 G 147 400 gene is shown in SEQ ID NO: 3. Because BTX 623 is a succulent variety, the Sorbic. 006 G 147 400 gene is a mutated gene having a mutation. The amino acid sequence encoded by the coding region of SEQ ID NO: 3 is shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (this mutant gene is called d gene).
SEQ ID NO: 3の塩基配列は、4つのエキソンを含む。SEQ ID NO: 3において、塩基番号1から塩基番号93が第1エキソンであり、塩基番号133から塩基番号169が第2エキソンであり、塩基番号1547から塩基番号1812が第3エキソンであり、塩基番号1960から塩基番号2436が第4エキソンである。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 contains 4 exons. In SEQ ID NO: 3, base number 1 to base number 93 is the first exon, base number 133 to base number 169 is the second exon, and base number 1547 to base number 1812 is the third exon, base Base numbers 1960 to 2436 are the fourth exon.
これらの変異型遺伝子に対して、野生型遺伝子の解析を行ったところ、乾性品種である千斤白において対応する遺伝子が見出され、これの配列解析の結果、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列と、そのヌクレオチド配列によりコードされるSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列により特定される野生型遺伝子（これをD遺伝子と呼ぶ）が得られた。 When these wild type genes were analyzed for these mutant genes, the corresponding genes were found in the dry variety Chitobi White, and as a result of the sequence analysis, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and A wild-type gene (referred to as a D gene) identified by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoded by the nucleotide sequence was obtained.
SEQ ID NO: 1の塩基配列は、3つのエキソンを含む。SEQ ID NO: 1において、塩基番号1から塩基番号169が第1エキソンであり、塩基番号1573から塩基番号1838が第2エキソンであり、塩基番号3680から塩基番号4156が第3エキソンである。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 contains three exons. In SEQ ID NO: 1, base number 1 to base number 169 is the first exon, base number 1573 to base number 1838 is the second exon, and base number 3680 to base number 4156 is the third exon.
本発明者らは既存のソルガム品種において、乾汁性表現型と遺伝子型の間の関連性について解析を行った。その他の汁性品種においてもオルソログ遺伝子の解析を行ったところ、同じ遺伝子に変異が生じていた。上記で述べたSorbic.006G147400遺伝子の4つのエキソンに基づいて、それらの変異は以下の（A）から（F）に分類される。即ちそれらの変異は、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、である（表1を参照）。 The present inventors analyzed the relationship between the dryness phenotype and the genotype in existing sorghum varieties. Analysis of the orthologous gene in other succulent varieties also resulted in mutations in the same gene. Based on the four exons of the Sorbic. 006 G 147 400 gene mentioned above, those mutations are classified as (A) to (F) below. That is, these mutations are (A) the first, second and third exon deletion types in which the first, second and third exons can not be amplified, and (B) the first and second exon deletion types in which the first and second exons can not be amplified. ) The third exon deletion type in which the third exon can not be amplified, the fourth exon 12 bp deletion type in which 12 bp of the fourth exon is deleted (D), and the stop codon mutation occurs in the first and second exons (E) The first and second exon stop codon types, and (F) a type that shows an ectopic character but no mutation is found in exons (see Table 1).
それらは既存または天然の品種において見られるD遺伝子の変異の例であり、本発明の好適な態様である。しかし本発明のD遺伝子はそれらの既存または天然の品種に存在するものに限定されるものではなく、そのような変異を模倣するように育種した形質転換植物に由来するものも本発明のD遺伝子に含まれる。 They are examples of mutations of D gene found in existing or natural varieties, and are a preferred embodiment of the present invention. However, the D gene of the present invention is not limited to those existing in their existing or natural varieties, and those derived from transformed plants which have been bred to mimic such mutations are also D genes of the present invention. include.
（4）汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法
本発明は、乾性の搾汁特性を有する植物において、乾性の搾汁特性を付与する核酸がコードする野生型タンパク質（即ちD遺伝子がコードするタンパク質）の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法である。
(4) Method of Producing a Transformed Plant Having Juice-Positive Characteristics of the Present Invention In the present invention, a wild-type protein encoded by a nucleic acid conferring the characteristics of dry juice-out in a plant having the characteristics of dry juice-out (ie D It is a method of producing a transformed plant having juice property characterized by inhibiting the function of a gene encoded protein).
ソルガムの形質転換にはパーティクルガン法（萩尾、農業生物資源研究所研究報告、1999、第13号、p68-70）およびアグロバクテリウム法 (Gurel et al. 2009, Plant Cell Reports, 28, 429) を用いることが出来る。ソルガム、トウモロコシ、イネの形質転換については、当業者は公知の方法を用いて形質転換体を得ることができる（田部井豊編、形質転換プロトコール（植物編）化学同人発行）。 For the transformation of sorghum, particle gun method (Kagio, Agro-Bioresources Research Report 1999, No. 13, p 68-70) and Agrobacterium method (Gurel et al. 2009, Plant Cell Reports, 28, 429) Can be used. For transformation of sorghum, corn and rice, those skilled in the art can obtain transformants using known methods (Editing of Tabei Yutaka, Transformation Protocol (Plant Edition) Chemical Doujin).
より具体的には、配列表のSEQ ID NO: 1の塩基配列で示されるD遺伝子に変異を導入して変異型遺伝子であるd遺伝子として、D遺伝子がコードする野生型タンパク質の機能を阻害することにより、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法である。 More specifically, a mutation is introduced into the D gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing to inhibit the function of the wild-type protein encoded by the D gene as a mutant gene d gene. Thus, it is a method of producing a transformed plant having juice property of juice.
上記変異は、限定されるものではないが、好ましくはストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択される変異である。 The mutation is preferably, but not limited to, a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frame shift mutation, and a null mutation.
上記変異は更に好ましくは、野生型D遺伝子の3つのエキソンと比較して、変異型d遺伝子の4つのエキソンに基づいて、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できなない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、なる群から選択された変異である。 The above mutations are more preferably based on four exons of the mutant d gene as compared to the three exons of the wild type D gene: (A) the first, second and third exons can not be amplified; 3 exon deletion type, (B) 1st and 2 exon deletion types in which the 1st and 2 exons can not be amplified, (C) 3rd exon deletion type in which the 3rd exon can not be amplified, and (D) 12 bp of the 4th exon A deletion type 4 exon 12 that lacks (E) a stop codon mutation that occurs in the first and second exons, and a stop codon mutation that causes a stop codon (F) Is a mutation selected from the group consisting of:
ここで使用される植物は好ましくはソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択されるが、それらに限定されるものではない。 The plant used here is preferably selected from the group consisting of sorghum, corn, switchgrass, millet, brachypodium, rice, but is not limited thereto.
D遺伝子に上記の変異を導入する方法の一例として、部位特異的変異導入法を挙げることができる。部位特異的変異導入法は、本技術分野において一般的に使用されている遺伝子変異の導入手段であり、それに使用するためのキットなども市販されている。更に植物の細胞に放射線を照射することにより突然変異を誘発し、目的とする変異が生じたものを選択することも考えられる。しかし本発明で変異を導入する方法は、それらの方法に限定されるものではない。 A site-directed mutagenesis method can be mentioned as an example of the method of introduce | transducing said mutation into D gene. Site-directed mutagenesis is a means for introducing gene mutations generally used in the art, and kits for use therewith are also commercially available. Furthermore, it is also conceivable to induce mutations by irradiating plant cells with radiation, and to select those in which the desired mutation has occurred. However, the method of introducing a mutation in the present invention is not limited to those methods.
（5）植物に汁性の搾汁特性を付与する方法
本発明は、乾性の搾汁特性を有する植物において、乾性の搾汁特性を付与する核酸がコードするタンパク質（即ちD遺伝子がコードするタンパク質）の機能を阻害することを特徴とする、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法である。より具体的には、配列表のSEQ ID NO: １に示されるD遺伝子に変異を導入することによりD遺伝子がコードするタンパク質の機能を阻害することにより、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法である。
(5) Method for imparting juice property of plant to the present invention The present invention relates to a protein encoded by a nucleic acid imparting the property of dry juice (that is, a protein encoded by the D gene) in a plant having dry property of juice A method for imparting a squeezed juice characteristic to a plant characterized by inhibiting the function of More specifically, by introducing a mutation into the D gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the plant is characterized by having a juice property of septic by inhibiting the function of the protein encoded by the D gene. How to
上記変異は好ましくは、それらに限定されるものではないが、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異である。 The mutation is preferably, but not limited to, a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frame shift mutation, and a null mutation.
上記変異は更に好ましくは、野生型D遺伝子の3つのエキソンと比較して、変異型d遺伝子の4つのエキソンに基づいて、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、なる群から選択された変異である。 The above mutations are more preferably based on four exons of the mutant d gene as compared to the three exons of the wild type D gene: (A) the first, second and third exons can not be amplified; 3 exon deletion type, (B) 1st and 2 exon deletion types where the 1st and 2 exons can not amplify, (C) 3rd exon deletion type where the 3rd exon can not amplify, and (D) 12 bp of the 4th exon deletion The 4th exon 12 bp deletion type, the 1st and 2nd exon stop codon type in which the stop codon mutation occurs in the 1st and 2nd exons (E) and the (F) nascent character but the mutation in the exon And the mutation selected from the group consisting of
ここで使用される植物はそれらに限定されるものではないが、好ましくはソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択される。変異を導入する手段は、上記（4）で述べたものを使用することができる。 The plants used herein are not limited thereto, but are preferably selected from the group consisting of sorghum, corn, switchgrass, millet, brachipodium, rice. As a means for introducing a mutation, those described in (4) above can be used.
（6）植物の乾汁性を判定するためのマーカー
SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換の塩基配列からなる、本発明のD遺伝子の塩基配列の一部分は、植物の乾汁性を判定するためのマーカーとして有用である。即ち本発明は、SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換の塩基配列を含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカーである。
(6) Markers for determining the dryness of plants
SEQ ID NO: 1, base deletion 115 of base number 115 or base deletion, base deletion of base number 3690-3701, base substitution of base number 3783, base addition between base numbers 3869 and 3870, base number 3979 Substitution, base deletion of base Nos. 4012 to 4015, base substitution of base No. 4069, base substitution of base No. 4076, base addition between base Nos. 4079 and 4080, base deletion of base Nos. 4086 to 4088, base No. 4093 A part of the base sequence of the D gene of the present invention, which consists of the base sequence of base substitution, is useful as a marker for determining the dryness of plants. That is, the present invention relates to base deletion or base substitution of base No. 115 of SEQ ID NO: 1, base deletion of base Nos. 3690 to 3701, base substitution of base No. 3783, base addition between base Nos. 3869 and 3870, Base substitution of base No. 3979, base deletion of base Nos. 4012 to 4015, base substitution of base No. 4069, base substitution of base No. 4076, base addition between base Nos. 4079 and 4080, base missing of base Nos. 4086 to 4088 It is a marker for determining the desiccation property of plants, which contains the base sequence of base substitution of base number 4093.
そのような目的で使用される本発明のDNAマーカーは、好ましくは配列表のSEQ ID NO: 1で示される塩基配列の15から100塩基を含むものであり、更に好ましくはその塩基配列の20〜80塩基を含むものであり、更に好ましくはその塩基配列の30〜50塩基を含むものである。またそれらのDNAマーカーがコードするアミノ酸配列を、ペプチドマーカーとして使用することもできる。しかし本発明の乾汁性のマーカーは、それらに限定されるものではない。 The DNA marker of the present invention used for such purpose preferably comprises 15 to 100 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and more preferably 20 to 20 of the base sequence. It preferably contains 80 bases, more preferably 30 to 50 bases of the base sequence. The amino acid sequences encoded by those DNA markers can also be used as peptide markers. However, the marker of the present invention is not limited to them.
具体的な遺伝子マーカーとして、それらに限定されるものではないが、塩基配列の長さの差を利用したIndelマーカーとSNPを利用したマーカーを使用することができる。Indelマーカーには、リピート配列の長さの差を利用したSSRマーカーや、3 bp欠失の検出を利用したマーカーなどが含まれる。一方SNPを利用したマーカーには、CAPSマーカー、dCAPSマーカー、イントロン内の変異を検出するアリルスペシフィックマーカーなどが含まれる。 Specific gene markers include, but are not limited to, Indel markers utilizing differences in the length of base sequences and markers utilizing SNPs. Indel markers include SSR markers using differences in length of repeat sequences, markers using detection of 3 bp deletion, and the like. On the other hand, markers utilizing SNPs include CAPS markers, dCAPS markers, allyl specific markers for detecting mutations in introns, and the like.
更に具体的な遺伝子マーカーとして、下記の実施例においてSorbic.006G147400遺伝子のマッピングに使用した遺伝子マーカーである領域を増幅するためのプライマー（SEQ ID NO: 5〜22）、または下記の実施例において作成したSNPマーカーまたはIndelマーカーである領域を増幅するためのプライマー（SEQ ID NO: 23〜38）を使用することにより、これらの領域を好適なマーカーとして使用することができる。上記に掲げた以外のマーカーも、Sorbic.006G147400遺伝子前後の配列における乾性および汁性品種間に検出された多型を利用することで作出は可能であるが、育種上の利用であればSorbic.006G147400遺伝子前後数Mb以内にマーカーを設定することが望ましい。PCRをベースとしたマーカーの場合は、各プライマーあたり18-27 bpが一般的である(参考文献中のPrimer3の初期設定値)。また、Sorbic.006G147400遺伝子の極近傍に農業形質に関わる遺伝子が明らかとなった場合は、その遺伝子との連鎖を断ち切る必要があることから、上記に掲げたマーカーの中でSorbic.006G147400遺伝子に比較的近い領域にあるものを選択することが有効である。 Furthermore, as a more specific gene marker, a primer (SEQ ID NO: 5 to 22) for amplifying a region that is a gene marker used for mapping the Sorbic. 006 G 147 400 gene in the following example, or prepared in the following example These regions can be used as suitable markers by using primers (SEQ ID NO: 23 to 38) for amplifying the regions that are the SNP markers or Indel markers. Markers other than those listed above can also be produced by using polymorphisms detected between the dry and juice cultivars in the sequence around the Sorbic. 006 G 147 400 gene, but if they are used for breeding, Sorbic. It is desirable to set a marker within several Mb around 006G147400 gene. In the case of PCR based markers, 18-27 bp per primer is common (Primer 3 default in reference). In addition, when it becomes necessary to break the linkage with the gene if the gene related to the agronomic traits becomes clear in the very near vicinity of the Sorbic. 006 G 147 400 gene, it is necessary to compare with the Sorbic. 006 G 147 400 gene among the markers listed above. It is effective to select one that is in the near target area.
（7）植物の乾汁性を判定する方法
上記（6）で述べたマーカーを用いて、植物の乾汁性を判定することができる。即ち本発明は、植物において上記（6）で述べた核酸マーカーまたはペプチドマーカーの有無を調べることを含み、該マーカーを検出し、検出されたマーカーが、変異を含みことにより上記の塩基配列の一部分がタンパク質に翻訳されない場合には該植物は汁性の搾汁特性を有すると判定し、上記変異を含まない場合には乾性の搾汁特性を有すると判定する工程を含む、植物の乾汁性を判定する方法である。かかる方法は搾汁特性に優れた品種の選抜および育種において多いに役立つと思われる。
(7) Method of Determining the Dryness of a Plant The dryability of a plant can be determined using the marker described in (6) above. That is, the present invention includes examining the presence or absence of the nucleic acid marker or peptide marker described in the above (6) in a plant, wherein the marker is detected, and the detected marker includes a mutation to a part of the above nucleotide sequence. A process of determining the plant as having juice property if the protein is not translated into protein, and determining having the dry property if it does not contain the mutation, Is a method of determining Such methods are likely to be of great use in the selection and breeding of varieties with superior juicing properties.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily make modifications and changes to the present invention based on the description of the present specification, and these are included in the technical scope of the present invention.
実施例1：高精度連鎖解析によるソルガム乾汁性制御遺伝子Dのマッピング
本実施例においては、ソルガムゲノム上における乾汁性を支配する遺伝子Dの座乗位置を決定するために、汁性品種「那系MS3B」と乾性品種「千斤白」を用いたバルクマッピングおよびラフマッピングを行った。
Example 1: Mapping of sorghum desiccation control gene D by high precision linkage analysis In this example, in order to determine the locus position of the gene D which controls desiccation on the sorghum genome, a judicial variety " We performed bulk mapping and rough mapping using “Nashi MS3B” and the dry cultivar “Senjo white”.
具体的には、那系MS3Bと千斤白を交配しF2集団を得た。約200個体のF2集団から汁性形質を示す54個体を、上述のソルガム茎切断による判定方法により選抜した。ソルガムの汁性形質は、葉の中肋の色によって判別することもある程度は可能であり、簡便な選抜方法として育種現場で利用されているが、実際に茎を切断し茎断面が水浸状になっていることを確認する本判定法を用いることにより、より正確に汁性形質か乾性形質かを判別することができる。この切断による判定方法を採用したことにより、後述するように100年近く同定されることのなかったD遺伝子およびｄ遺伝子を同定することにつながった。 Specifically, by crossing那系MS3B and thousand pounds white to obtain an F 2 population. From the approximately 200 F 2 populations, 54 individuals exhibiting a succulent trait were selected by the above-mentioned determination method by sorghum stem cutting. The sorghum juice character can be determined to a certain extent by the color of the middle leaf of the leaf, and is used at breeding sites as a simple selection method, but the stem is actually cut and the cross section of the stem is submerged It is possible to more accurately determine whether it is a juicy trait or a dry trait by using this determination method of confirming that the Adoption of this determination method by truncation led to identification of D genes and d genes that have not been identified for nearly 100 years as described later.
上記判別方法により汁性形質を示すことが明確になった54個体について、複数のマーカー（非特許文献2）を用いたバルクマッピングを行った。ソルガムの染色体10組について、F2集団のうち汁性形質を示した各個体について、各マーカー（非特許文献2）において汁性ソルガム那系MS3Bの遺伝子型と、乾性ソルガム千斤白の遺伝子型のどちらであるかを判定した。そのうえで共通して那系MS3Bの遺伝子型を示す領域を絞り込んだ。この方法により、おおまかな汁性形質遺伝子座の領域を絞り込んだ。 Bulk mapping using a plurality of markers (Non-Patent Document 2) was performed on 54 individuals that were clearly shown to exhibit a sexual character by the above discrimination method. In each marker (non-patent document 2), each individual (in non-patent document 2) shows the genotype of the sorghum sorghum lineage MS3B and the genotype of the dry sorghum sorghum white for each individual that showed a solitary trait in the F 2 population for 10 sets of sorghum chromosomes. It was determined which one. On that basis, we narrowed down the region showing the genotype of Na-MS3B in common. By this method, the region of the rough juice locus was narrowed down.
続いて、約1000個体のF2集団を用いたラフマッピングを行った。各染色体に6〜7個となるようにマーカーを作製および選択し、F2集団全ての個体を用いて、乾汁性形質と那系MS3B遺伝子型に共通する領域を調査することにより、目的遺伝子候補領域をさらに狭めた。具体的には、那系MS3Bと千斤白の遺伝子型と乾汁性の表現型が一致するゲノム領域を調査するため、ソルガムのSimple Sequence Repeat（SSR）マーカーおよび遺伝子内の多型情報を利用した遺伝子マーカー（非特許文献2）を作成した。それらの配列をSEQ ID NO: 5〜22に示す。その結果、これらのマーカーを用いてマッピングを行った結果、SB25453_re1およびSB25460に挟まれた185 kbにD遺伝子の候補領域を絞り込んだ（図２）。 Subsequently, rough mapping was performed using approximately 1000 F 2 populations. Markers are prepared and selected to be 6 to 7 for each chromosome, and the target gene is examined by using the individuals of all the F 2 populations to investigate the region common to the dry trait and the Nashi MS3B genotype. The candidate area has been narrowed further. Specifically, we used simple sequence repeat (SSR) markers of sorghum and polymorphism information within genes to investigate genomic regions where the genotypes of Na-MS3B and Chishaku-haku and the dry-type phenotype coincided. The gene marker (nonpatent literature 2) was created. Their sequences are shown in SEQ ID NO: 5-22. As a result, as a result of mapping using these markers, the candidate region of D gene was narrowed down to 185 kb sandwiched between SB25453_re1 and SB25460 (FIG. 2).
マッピングにあたって利用した手法を以下に示す。汁性品種那系MS3Bと乾性品種千斤白、またはこれらのF2集団からそれぞれDNAを抽出した。DNA抽出は葉片を用いたCTAB法（Murray et al. 1980）を用いて行った。SSRマーカーおよび遺伝子マーカーは、KAPA Taq（日本ジェネティクス社）およびGo-Taq（プロメガ株式会社）を用いて表1のPCR条件に従って増幅を行い、3％のアガロ−スゲルを用いた電気泳動により多型を検出した。 The method used for mapping is shown below. DNA was extracted from each of the cultivar Nashi MS3B and the cultivar Cicada white, or their F 2 populations. DNA extraction was performed using the CTAB method (Murray et al. 1980) using leaf pieces. SSR markers and gene markers were amplified according to the PCR conditions in Table 1 using KAPA Taq (Japan Genetics) and Go-Taq (Promega Co., Ltd.), and were amplified by electrophoresis using 3% agarose gel. Detected the type.
乾性品種千斤白と汁性品種那系MS3BのBACライブラリーを作製した。具体的には、ソルガムの成葉および幼植物から核を抽出して制限酵素HindIIIで消化後、BACベクター（pIndigo BAC5）に結合して大腸菌DH10Bに導入する方法を用いた。その結果、千斤白では平均インサート長175 kb（全47311クローン）、那系MS3Bでは平均インサート長191 kb （全45095クローン）からなるライブラリーを構築できた。このライブラリーは、ソルガムのゲノムサイズを800 Mbと想定したときに、それぞれ10.3倍および10.8倍を示した。 We prepared BAC library of dry cultivar Chiyoda white and juice cultivar MS3B. Specifically, a nucleus was extracted from adult leaves and seedlings of sorghum, digested with the restriction enzyme HindIII, and then ligated to a BAC vector (pIndigo BAC5) to introduce it into E. coli DH10B. As a result, it was possible to construct a library consisting of an average insert length of 175 kb (total 47,311 clones) for Chikaji white, and an average insert length of 191 kb (total 45095 clones) for Na MS3B. This library showed 10.3-fold and 10.8-fold, respectively, assuming that the genome size of sorghum is 800 Mb.
それぞれのBACライブラリーから候補遺伝子領域を含むBACクローンを、前述した185 kb内に絞り込まれた領域に図2の各マーカー（SB24653、Sb6g022620、Sb06g022670、Sb06g022730、SB25460）を作製した。これらのマーカーの配列を検出するためのプライマー配列を、SEQ ID NO: 5〜22に示す。これらのマーカーを用いて、千斤白のBACライブラリーから2クローン（Senkinnshiro_0085105、Senkinshiro_0113N08）、那系MS3BのBACライブラリーから1クローン（Nakei-MS3B_0049G23）を選抜し（図2）、3クローン全ての全塩基配列を決定した。それらの塩基配列情報からSNP（CTPP法、非特許文献3）マーカーおよびIndelマーカーを作製した。これらのマーカー配列を検出するためのプライマー配列を、SEQ ID NO: 23〜38に示す。それによってさらに、アガロース電気泳動ならびにフラグメント解析（非特許文献２）を用いて多型を検出し、F2集団1925個体からなる精密マッピングによって候補領域をCTPP-053とIndel-120117-1に挟まれた18.99 kbの領域に絞りこんだ（図3）。当該領域の塩基配列を、公開されているソルガムのゲノムデータベース（汁性品種：BTX623の全塩基配列）（Phytozome：Joint Genome Institute、University of California Regents： Sbicolor_v2.1, http://www.phytozome.net/sorghum.php）のBLASTによる検索（http://www.phytozome.net/search.php?show=blast）をしたところ、この領域には、Sobic.006G147400遺伝子のみが存在すると推定されていた（図3）。この結果から、Sobic.006G147400が乾汁性を支配する遺伝子であると予想された。Sobic.006G147400遺伝子は汁性品種であるBTX623由来であるので、劣性であるd遺伝子である。以下においてd遺伝子の野生型遺伝子をD遺伝子と呼ぶ。 Each marker (SB24653, Sb6g022620, Sb06g022670, Sb06g022730, SB25460) of FIG. 2 was produced in the area | region which narrowed down the BAC clone containing a candidate gene area | region from each BAC library into 185 kb mentioned above. Primer sequences for detecting the sequences of these markers are shown in SEQ ID NOs: 5-22. Using these markers, 2 clones (Senkinnshiro _0085105, Senkinshiro _0113N08) were selected from the Chikara White BAC library, and one clone (Nakei-MS3B_0049G23) was selected from the BAC library of the Naka MS3 B (Fig. 2), and all three clones were all selected. The nucleotide sequence was determined. The SNP (CTPP method, nonpatent literature 3) marker and Indel marker were produced from those base sequence information. Primer sequences for detecting these marker sequences are shown in SEQ ID NOs: 23-38. Thereby further using agarose electrophoresis and fragments analysis (Non-Patent Document 2) detecting the polymorphism, by precision mapping consisting F 2 population 1925 individuals sandwiched candidate region CTPP-053 and Indel-120117-1 The region is narrowed to 18.99 kb (Figure 3). The nucleotide sequence of the relevant region is described in the published sorghum genome database (Drug breed: whole nucleotide sequence of BTX 623) (Phytozome: Joint Genome Institute, University of California Regents: Sbicolor_v2.1, http: //www.phytozome. When BLAST search (http://www.phytozome.net/search.php?show=blast) of net / sorghum.php) was performed, it was presumed that only the Sobic.006G147400 gene was present in this region (Figure 3). From this result, it was predicted that Sobic. 006 G 147 400 is a gene that controls the dryness. The Sobic. 006 G 147 400 gene is a recessive d gene because it is derived from the cultivar BTX 623. The wild-type gene of the d gene is hereinafter referred to as the D gene.
実施例2：D遺伝子候補遺伝子に対応する他の植物種遺伝子について
全ゲノム配列解読済植物（アラビドプシス、アワ、イネ、スイッチグラス、ソルガム、トウモロコシ、ブラキポディウム、ポプラ）の配列情報を含む配列データベース（Joint Genome Institute、University of California Regents： http://www.phytozome.net/search.php?show=blast）から、ソルガムD遺伝子のアミノ酸配列と相同性の高い遺伝子（e-value 50以下）をBLASTにより抽出した。抽出した遺伝子群のアミノ酸配列情報をもとにClustalw（非特許文献6）を用いてアライメントを行い、得られた情報に基づきMega5（非特許文献7）によって分子系統樹を作成した。その結果、ソルガムのD遺伝子は、ゲノム上に多数存在するNAC superfamilyに分類される転写因子をコードする遺伝子であることが推定された（図5）。D遺伝子が存在する系統樹上のクレード（分岐群）には、アラビドプシスやポプラといった双子葉植物でみられる類似遺伝子がほとんどみられず、D遺伝子に相当する機能を持つ遺伝子は単子葉植物に特異的に存在する遺伝子である可能性が示唆された。ソルガムのD遺伝子と類似度が高くオルソログ（相同分子種）と考えられる各植物種の相当遺伝子の類似度の順は、1．トウモロコシ、2．アワ、3．スイッチグラス、4．イネおよびブラキポディウム、5．アラビドプシスおよびポプラとなった。これは、各植物の近縁度と一致する傾向にあった。NAC superfamilyモチーフは、ソルガムD遺伝子のアミノ酸配列で1〜180番目のアミノ酸に相当していた（図5）。
Example 2: Sequence database including sequence information of whole genome sequence decoded plants (arabidopsis, foxtail millet, rice, switchgrass, sorghum, corn, brachipodium, poplar) for other plant species genes corresponding to D gene candidate genes From the Joint Genome Institute, University of California Regents: http://www.phytozome.net/search.php?show=blast), BLAST a gene (e-value 50 or less) highly homologous to the amino acid sequence of the sorghum D gene Extracted by Alignment was performed using Clustalw (Non-patent Document 6) based on the amino acid sequence information of the extracted gene group, and a molecular phylogenetic tree was created according to Mega 5 (Non-patent document 7) based on the obtained information. As a result, it was estimated that the sorghum D gene is a gene encoding a transcription factor classified into the NAC super family which is abundantly present on the genome (FIG. 5). The clade on the phylogenetic tree where the D gene exists (branch group) hardly shows similar genes found in dicotyledonous plants such as Arabidopsis and poplar, and a gene having a function corresponding to the D gene is unique to monocotyledonous plants It is suggested that the gene may be present in The order of similarity of corresponding genes of each plant species considered to be orthologs (homologous species) is high because of high similarity to the sorghum D gene. Corn, 2. Our company, 3. Switch glass, 4. Rice and brachipodium, 5. It became arabidopsis and poplar. This tended to coincide with the relative degree of each plant. The NAC superfamily motif corresponded to the 1st to 180th amino acids in the amino acid sequence of the sorghum D gene (FIG. 5).
（D遺伝子と対応する他植物の遺伝子の遺伝子構造）
公開されているソルガムゲノム配列情報（汁性品種：BTX623）では、Sobic.006G147400は、4つのエキソンを持つ遺伝子構造であると推定されている（Sbicolor_v2.1, http://www.phytozome.net/sorghum.php）。一方、同じイネ科作物であるイネのオルソログ（LOC_Os04g43560.1）およびトウモロコシのオルソログ（GRMZM2G081930_T01）は3つのエキソンからなる構造を示していた（図4）。ここで、Sobic.006G147400の第1エキソンと第2エキソンの間にもソルガムのゲノムデータベースによるRNA-Seq法（非特許文献8）解析結果よりRNA断片が観察された。ここでいうRNA-Seqは、ソルガムデータベースに掲載されている、転写産物の推定情報である。
(Gene structure of gene of other plant corresponding to D gene)
In the published sorghum genome sequence information (juvenile cultivar: BTX623), Sobic. 006 G 147 400 is presumed to be a gene structure having four exons (Sbicolor_v2.1, http: // www. Phytozome. Net /sorghum.php). On the other hand, the ortholog of rice (LOC_Os04g43560.1) and the ortholog of corn (GRMZM2G081930_T01), which are the same gramineous crops, showed a structure consisting of three exons (FIG. 4). Here, an RNA fragment was also observed between the first and second exons of Sobic. 006 G 147 400 according to the analysis result of the RNA-Seq method (Non-Patent Document 8) according to the genome database of Sorghum. The RNA-Seq referred to here is presumed information of a transcript listed in the sorghum database.
汁性ソルガム品種BTX623のSobic.006G147400遺伝子のアミノ酸配列、汁性ソルガム品種那系MS3BのSobic.006G147400遺伝子および乾性ソルガム品種千斤白のD遺伝子のアミノ酸配列と、他の植物の類似遺伝子であるアラビドプシス、アワ、イネ、スイッチグラス、ソルガム、トウモロコシ、ブラキポディウム、ポプラのアミノ酸配列との比較を行った結果、汁性形質を有さないいずれの植物においても、この汁性ソルガム品種BTX623の推定イントロン領域は、本来転写されアミノ酸に翻訳されている領域と考えられた（図4）。また、BTX623の推定イントロン領域を含む1〜180番目の約180個のアミノ酸残基はNAM superfamilyモチーフと予想される領域であり、植物間でアミノ酸配列が保存されている領域と考えられた。汁性品種である那系MS3BとBTX623は、開始コドンから115番目のシトシンがチミンに置き換わることでstopコドンが生じている（図5、下記の表2）ことから、機能を失ったタンパク質が生じている可能性が高い。 Amino acid sequence of Sobic. 006 G 147 400 gene of juice sorghum cultivar BTX 623, Sobic 006 G 147 400 gene of juice sorghum cultivar Na line MS 3 B and amino acid sequence of D gene of dry sorghum cultivar Chiyoda white and arabidopsis which are similar genes of other plants, Comparison of the amino acid sequences of millet, rice, switchgrass, sorghum, maize, brachipodium and poplar showed that the putative intron region of the juice sorghum variety BTX 623 is the same for any plant without juice traits. It was considered to be a region originally transcribed and translated into amino acids (FIG. 4). In addition, about 180 amino acid residues at positions 1 to 180 including the putative intron region of BTX623 was a region predicted to be the NAM superfamily motif, and it was considered to be a region where the amino acid sequence is conserved among plants. Juice series 那 MS3B and BTX 623 have a stop codon generated by replacing cytosine at position 115 from the start codon with thymine (Fig. 5, Table 2 below), resulting in a protein that has lost function. There is a high possibility of
実施例3：遺伝子発現
ソルガムゲノム情報からSobic.006G147400の配列情報を取得し、3’-UTR側の497 bpを増幅するプライマーセット（SEQ ID NO: 47（TCCCACAGGGATGGACTGGCTGA）（Sobic.006G147400-3’endF）およびSEQ ID NO:48（TGGATTGGAGAGGTGCACTCTTA）（Sobic.006G147400-3’UTRR））を作成し、RT-PCRにより遺伝子発現を解析した。RT-PCRは、非特許文献4の方法に準じて行った。具体的には、サンプルについては、千斤白の3個体からサンプリングした植物片を混ぜて1サンプルとし、別途那系MS3Bの3個体からサンプリングした植物片を混ぜて1サンプルとして、それぞれからRNAを抽出した。RNAの定量は、機械誤差を排除するために同一サンプルを三回測定した値の平均値を利用した。その結果、乾性品種千斤白および汁性品種那系MS3BのいずれともD遺伝子候補遺伝子の転写産物は発芽から2週後には観察され、その後発芽から4週後にも変わらず発現していることが明らかとなった（図6）。
Example 3: The primer set (SEQ ID NO: 47 (TCCCACAGGGATGGACTGGCTGA) (Sobic. 006 G 147 400-3 'endF) which acquires sequence information of Sobic. 006 G 147 400 from gene expression sorghum genome information and amplifies 497 bp on the 3'-UTR side. And SEQ ID NO: 48 (TGGATTGGAGAGGTGCACTCTTA) (Sobic. 006 G 147 400-3′UTRR)) were generated, and gene expression was analyzed by RT-PCR. RT-PCR was performed according to the method of Non-Patent Document 4. Specifically, regarding samples, plant fragments sampled from three individuals of Chikara White are mixed to make one sample, and plant fragments sampled separately from three individuals of Na-MS3B are mixed separately to extract RNA from each as one sample did. For quantification of RNA, an average value of values obtained by measuring the same sample three times was used to eliminate machine error. As a result, it was revealed that the transcript of the candidate D gene was observed two weeks after germination and was still expressed four weeks after germination for both of the dry cultivar Chiyoda-white and the juvenile cultivar MSA3B. It became (Figure 6).
また、植物の器官ごとの発現を調査した結果、調べた器官全て（葉身、茎、穂および根）で遺伝子発現が検出された（図7）。これらのことから、候補遺伝子は配列の変異に関わらず遺伝子発現レベルでは変化が無く、植物体の多くの部位で発現していることが明らかとなった。 In addition, as a result of examining the expression of each plant organ, gene expression was detected in all the examined organs (leaf, stem, ear and root) (FIG. 7). From these facts, it became clear that the candidate gene was not changed at the gene expression level regardless of the mutation of the sequence, and was expressed at many sites of the plant body.
一方で、葉身内の発現部位を中肋とそれ以外の部位に分けて候補遺伝子の発現を調査した結果、候補遺伝子の中肋部位における発現量はそれ以外の部位の10倍以上であることが明らかとなった（図8）。この結果は、中肋部位で乾汁性形質が強く観察される結果と一致している。 On the other hand, as a result of investigating the expression of the candidate gene by dividing the expression site in the leaf blade into moderate and other sites, the expression amount of the candidate gene at the moderate site is at least 10 times that of other sites It became clear (Figure 8). This result is consistent with the result of strong observation of the dry character trait at the midspoon site.
更にレーザーマイクロダイセクションなどによるイネ根における遺伝子の発現時期および領域データベースを用いて、D遺伝子のイネオルソログの発現を調べた結果、D遺伝子のイネオルソログは生育盛期および皮層で強く発現していることが明らかとなった（RiceXproデータベース；http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/RXP_4001/index.php）。これは、ソルガムにおける乾汁性の表現型が現れる時期や領域と一致していた。D遺伝子は、配列からNAM superfamilyのドメインを持つNAC転写因子遺伝子であると予想されたことから、維管束における細胞分化に関わると推察された（図5）。 Furthermore, as a result of examining the expression of the rice ortholog of the D gene using the gene expression time and region database in the rice root by laser microdissection etc., the rice ortholog of the D gene is strongly expressed in the growth stage and the cortex. It became clear (RiceXpro database; http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/RXP_4001/index.php). This coincided with the time and area where the dry phenotype in sorghum appeared. Since the D gene was predicted to be a NAC transcription factor gene having a domain of the NAM super family from the sequence, it was speculated to be involved in cell differentiation in vascular bundles (FIG. 5).
実施例4：推定D遺伝子のアリル解析
候補遺伝子の配列と表現型の関係を明らかにするために、世界から収集した乾性品種57品種および汁性38品種の候補遺伝子の配列調査を行った（表2）。
Example 4: Allyl Analysis of Putative D Gene In order to clarify the relationship between the sequence and the phenotype of candidate genes, the sequence survey was conducted on 57 dry cultivars and 38 delicacy candidate cultivars collected from the world (Table 2).
ソルガムの乾性品種である千斤白の推定D遺伝子ゲノム領域は、3つのエキソンから構成されている（SEQ ID NO: 1）。一方、汁性品種であるBTX623に由来する推定d遺伝子（Sorbic.006G147400遺伝子）のゲノム領域は、4つのエキソンから構成されている（SEQ ID NO: 3）。 The putative D gene genome region of Sichum, a dry variety of sorghum, is composed of three exons (SEQ ID NO: 1). On the other hand, the genomic region of a putative d gene (Sorbic. 006 G 147 400 gene) derived from the B. victic cultivar BTX623 is composed of four exons (SEQ ID NO: 3).
この変異遺伝子である推定d遺伝子のゲノム領域のそれぞれのエキソンを、以下の配列を有するプライマーを使用して解析することができる：
・Exon1およびExon2の配列解析用プライマー：
SEQ ID NO:39（GCCCGCCTCTCCTGCAGGCTTCC）（79_sorchr6_250-s）；および
SEQ ID NO:40（TGGGAGATG(G)GAGATAAGAAAC）（107_sorchr6_232-as）；
・Exon3の配列解析用プライマー：
SEQ ID NO:41（GCATGTCAGACGCGGCGAAGCTG）（269_sorchr6_1564-s）；および
SEQ ID NO:42（GGTACGGTACCTTTGGTGGCGT）（270_sorchr6_1827-as）；
・Exon4の配列解析用プライマー
SEQ ID NO:43（GTTCCAGAAGCGGAAAGACAGCGA）（83_sorchr6_2560-s）；および
SEQ ID NO:44（GTAATCTAACCTCACGCTAAGTACC）（28_sorchr6_3180-as）；
・Exon4の配列解析用プライマー
SEQ ID NO:45（GCGTGCAGGAGGACTGGGTGCT 271_sorchr6_3671-s
SEQ ID NO:46（AGTCCATCCCTGTGGGAACCC）272_sorchr6_4130-as；
The respective exons of the genomic region of this mutant gene, the putative d gene, can be analyzed using primers having the following sequence:
-Primer for sequence analysis of Exon1 and Exon2:
SEQ ID NO: 39 (GCC CCGCCTCTCC TGCAGGCTTCC) (79_sorchr6_250-s); and
SEQ ID NO: 40 (TGGGAGATG (G) GAGATAAGAAAC) (107_sorchr6_232-as);
-Primer for sequence analysis of Exon 3:
SEQ ID NO: 41 (GCATGTCAGACGCGGCGAAGCTG) (269_sorchr6_1564-s); and
SEQ ID NO: 42 (GGTACGGTACCTTTGGTGGCGT) (270_sorchr6_1827-as);
-Primer for sequence analysis of Exon 4
SEQ ID NO: 43 (GTTCCAGAAGCGGAAAGACAGCGA) (83_sorchr6_2560-s); and
SEQ ID NO: 44 (GTAATCTAACTCCACGCTAAGTACC) (28_sorchr6_3180-as);
-Primer for sequence analysis of Exon 4
SEQ ID NO: 45 (GCGTGCAGGAGGACTGGGTGCT 271_sorchr6_3671-s
SEQ ID NO: 46 (AGTC TCC CT GTGGGA ACCC) 272_sorchr6_4130-as;
さらに、エキソン1＋2の塩基配列における115番目塩基の塩基置換（C/T）を識別するためのマーカーとして、
（i）那系MS3B型アリル（T）を増幅するプライマーセット（SEQ ID NO:49（CCAACGAGCGCGCCGAGT）とSEQ ID NO:50（TGCACACAACAACCATGAGCAGGA））を用いてPCRを行うことにより、那系MS3B型アリル（T）を含む領域の増幅が可能となり、198 bpの長さのPCR産物が増幅される；
（ii）一方、千斤白型アリル（C）を増幅するプライマーセット（SEQ ID NO: 51（CAACGAGCGCGCCGAGCA）とSEQ ID NO: 52（ACCGGCCGAGCTAGTACTAATGA））を用いてPCRを行うことにより、千斤白型アリル（C）を含む領域の増幅が可能となり、394 bpの長さのPCR産物が増幅される。
Furthermore, as a marker for identifying base substitution (C / T) of the 115th base in the base sequence of exon 1 +2,
(I) By performing PCR using a primer set (SEQ ID NO: 49 (CCAACGAGCGCGCCGAGT) and SEQ ID NO: 50 (TGCACACAAACAACCATGAGCAGGA)) for amplifying Na-MS3B type allyl (T), Na-MS3B type allyl ( T) allows for the amplification of the region containing and a PCR product of 198 bp in length is amplified;
(Ii) On the other hand, by performing PCR using a primer set (SEQ ID NO: 51 (CAACGAGCGCGCCGGAGCA) and SEQ ID NO: 52 (ACCGGCCGAGCTAGTACTAATGA)) for amplifying Chitobi white type allyl (C), Chitobi white type allele ( Amplification of the region containing C) is possible, and a PCR product of 394 bp in length is amplified.
実際には、調査を行うサンプルに対して、上記の2種類のプライマーセットで個別にPCRを行う。サンプルの遺伝子型がT/Tの場合は（i）の198 bpの長さのPCR産物のみのバンドが、C/Cの場合は（ii）の394 bpの長さのPCR産物のみのバンドが、C/T（ヘテロ）の場合は（i）の198 bpの長さのPCR産物と（ii）の394 bpの長さのPCR産物との両者のバンドが、それぞれ検出される。PCR条件は表1に示す通りであるが、アニーリング温度55℃以外の条件を変えても比較的頑健に検出が可能である。 In practice, PCR is performed individually on the samples to be examined with the two primer sets described above. When the genotype of the sample is T / T, the band for only the 198 bp long PCR product of (i) is the band for C / C, the band for only the 394 bp long PCR product of (ii) In the case of C / T (hetero), bands of both the 198 bp long PCR product of (i) and the 394 bp long PCR product of (ii) are respectively detected. The PCR conditions are as shown in Table 1. However, even if the conditions other than the annealing temperature of 55 ° C. are changed, relatively stable detection is possible.
その結果、乾性品種57品種ではいずれも乾性品種千斤白と同一の配列を示していた（代表として千斤白の情報のみ表2に記載する）。汁性品種は、第1、第2、第3エキソン欠損型が18品種（アリルタイプA）、第1、第2エキソン欠損型が１品種（アリルタイプB）、第3エキソン欠損型が1品種（アリルタイプC）、第4エキソン12 bp欠損型が3品種（アリルタイプD）、那系MS3B、BTX623でみられる第1、第2エキソンストップコドン型が12品種 （アリルタイプE）に分類された。また、汁性形質を示すもののエキソンに変異が見られない乾性型エキソン型品種が3品種（アリルタイプF）見られた。アリルタイプAからEまでは、D遺伝子が機能欠損していることが推定された。アリルタイプＦについては不明であるが、何らかの理由で遺伝子発現していないことが推定された。よってアリルタイプAからEの配列であることが検出できれば、汁性の表現型となることが言える。 As a result, all of the 57 cultivars showed the same sequence as that of the dry cultivar, Chiyotei white (as a representative, only the information on chiiye white is described in Table 2). The first, second and third exon deletion types are 18 varieties (allyl type A), the first and second exon deletion types are one variety (allyl type B), and the third exon deletion type is one variety. (Allyl type C), the 4th exon 12 bp deletion type is classified into 3 types (allyl type D), and the 1st and 2nd exon stop codon types seen in Nashin MS3B and BTX623 are classified into 12 types (allyl type E) The In addition, there were three dry-type exonic cultivars (allyl type F) in which the mutation had not been found in the exons of those showing the eugenic character. From alleles A to E, it was estimated that the D gene is deficient in function. Although it is unknown about allyl type F, it was presumed that gene expression was not performed for some reason. Therefore, if it can be detected that it is a sequence of allyl type A to E, it can be said that it becomes a juicy phenotype.
配列表フリーテキスト：
SEQ ID NO: 1：千斤白のD遺伝子のゲノムDNAの塩基配列
SEQ ID NO: 2：千斤白のD遺伝子がコードするアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3：Sobic.006G147400のゲノムDNAの塩基配列
SEQ ID NO: 4：Sobic.006G147400のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5：Forward Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 6：Reverse Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 7：Forward Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 8：Reverse Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 9：Forward Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 10：Reverse Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 11：Forward Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 12：Reverse Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 13：Forward Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 14：Reverse Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 15：Forward Primer for amplifying Sb06g022620 region.
SEQ ID NO: 16：Reverse Primer for amplifying Sb06g022620 region.
SEQ ID NO: 17：Forward Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 18：Reverse Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 19：Forward Primer for amplifying Sb06g022730 region.
SEQ ID NO: 20：Reverse Primer for amplifying Sb06g022730 region.
SEQ ID NO: 21：Forward Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 22：Reverse Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 23：Forward Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 24：Reverse Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 25：Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 26：Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 27：Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 28：Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 29：Forward Primer for amplifying InDel-120117-2 region.
SEQ ID NO: 30：Reverse Primer for amplifying InDel-120117-2 region.
SEQ ID NO: 31：Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 32：Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 33：Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 34：Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 35：Forward Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 36：Reverse Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 37：Forward Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 38：Reverse Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 39：Primer for analyzing Exon1 and Exon 2 (79_sorchr6_250-s).
SEQ ID NO: 40：Primer for analyzing Exon1 and Exon 2 (107_sorchr6_232-as).
SEQ ID NO: 41：Primer for analyzing Exon3 (269_sorchr6_1564-s).
SEQ ID NO: 42：Primer for analyzing Exon3 (270_sorchr6_1827-as).
SEQ ID NO: 43：Primer for analyzing Exon4 (83_sorchr6_2560-s).
SEQ ID NO: 44：Primer for analyzing Exon4 (28_sorchr6_3180-as).
SEQ ID NO: 45：Primer for analyzing Exon4 (271_sorchr6_3671-s).
SEQ ID NO: 46：Primer for analyzing Exon4 (272_sorchr6_4130-as).
SEQ ID NO: 47：Primer for RT-PCR (Sobic.006G147400-3’endF)
SEQ ID NO: 48：Primer for RT-PCR (Sobic.006G147400-3’UTRR)
SEQ ID NO: 49：Forward Primer for identifying MS3B Exon1+2_115SNP (MS3B_Exon1&2_115-F).
SEQ ID NO: 50：Reverse Primer for identifying MS3B Exon1+2_115SNP (MS3B_Exon1&2_115-R).
SEQ ID NO: 51：Forward Primer for identifying Senkin Exon1+2_115SNP (Senkin_Exon1&2_115-F).
SEQ ID NO: 52：Reverse Primer for identifying Senkin Exon1+2_115SNP (Senkin_Exon1&2_115-R).
Sequence Table Free Text:
SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence of genomic DNA of D gene
SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence encoded by D gene
SEQ ID NO: 3: Nucleotide sequence of Sobic. 006 G 147 400 genomic DNA
SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of Sobic. 006 G 147 400
SEQ ID NO: 5: Forward Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 6: Reverse Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 7: Forward Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 8: Reverse Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 9: Forward Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 10: Reverse Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 11: Forward Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 12: Reverse Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 13: Forward Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 14: Reverse Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 15: Forward Primer for amplifying Sb06g 022620 region.
SEQ ID NO: 16: Reverse Primer for amplifying Sb06g 022620 region.
SEQ ID NO: 17: Forward Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 18: Reverse Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 19: Forward Primer for amplifying Sb06g 022730 region.
SEQ ID NO: 20: Reverse Primer for amplifying Sb06g 022730 region.
SEQ ID NO: 21: Forward Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 22: Reverse Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 23: Forward Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 24: Reverse Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 25: Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B) region.
SEQ ID NO: 26: Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B) region.
SEQ ID NO: 27: Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro) region.
SEQ ID NO: 28: Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro) region.
SEQ ID NO: 29: Forward Primer for amplifying InDel-121172 region.
SEQ ID NO: 30: Reverse Primer for amplifying InDel-121172 region.
SEQ ID NO: 31: Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B) region.
SEQ ID NO: 32: Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B) region.
SEQ ID NO: 33: Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro) region.
SEQ ID NO: 34: Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro) region.
SEQ ID NO: 35: Forward Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 36: Reverse Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 37: Forward Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 38: Reverse Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 39: Primer for analyzing Exon 1 and Exon 2 (79_sorchr6_250-s).
SEQ ID NO: 40: Primer for analyzing Exon 1 and Exon 2 (107_sorchr6_232-as).
SEQ ID NO: 41: Primer for analyzing Exon 3 (269_sorchr6_1564-s).
SEQ ID NO: 42: Primer for analyzing Exon 3 (270_sorchr6_1827-as).
SEQ ID NO: 43: Primer for analyzing Exon 4 (83_sorchr6_2560-s).
SEQ ID NO: 44: Primer for analyzing Exon 4 (28_sorchr6_3180-as).
SEQ ID NO: 45: Primer for analyzing Exon 4 (271_sorchr6_3671-s).
SEQ ID NO: 46: Primer for analyzing Exon 4 (272_sorchr6_4130-as).
SEQ ID NO: 47: Primer for RT-PCR (Sobic. 006 G 147 400-3 'end F)
SEQ ID NO: 48: Primer for RT-PCR (Sobic. 006 G147400-3 'UTRR)
SEQ ID NO: 49: Forward Primer for identifying MS3B Exon 1 + 2_ 115 SNP (MS 3 B _ Exon 1 & 2 _ 115-F).
SEQ ID NO: 50: Reverse Primer for identifying MS3B Exon1 + 2_115 SNP (MS3B_Exon1 & 2_115-R).
SEQ ID NO: 51: Forward Primer for identifying Senkin Exon 1 + 2_ 115 SNP (Senkin_Exon 1 & 2_ 115-F).
SEQ ID NO: 52: Reverse Primer for identifying Senkin Exon 1 + 2_ 115 SNP (Senkin_Exon 1 & 2_ 115-R).
Claims (15)
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質、
の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。 A protein having dry squeeze characteristics, which imparts the dry squeeze characteristics to the plant, which comprises the following (a) to (c):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants, or (c) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90 % or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants
Any of the proteins,
A method of producing a transformed plant having juice property, characterized by inhibiting the function of
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害することを特徴とする、請求項1に記載の汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。 (A) to (g) below;
(A) a nucleic acid encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence wherein one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeeze characteristic
(C) A nucleic acid which comprises an amino acid sequence having at least 90 % or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
(D) a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(E) A nucleic acid encoding a protein comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 1 and which imparts a dry squeezing property to plants.
(F) A nucleic acid which comprises a base sequence having at least 90 % or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
(G) A protein consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and encoding a protein that imparts a dry squeezing property to plants Nucleic acid,
In a nucleic acid selected from the group consisting of: a mutation selected from the group consisting of a stop codon mutation, a frameshift mutation, and a null mutation, thereby giving the function of imparting a dry squeezing property to plants of the protein A method of producing a transgenic plant having juice-like squeeze characteristics according to claim 1, characterized by inhibiting.
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質。 A protein having dry squeeze characteristics, which imparts the dry squeeze characteristics to the plant, which comprises the following (a) to (c):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which imparts a dry squeezing property to plants, or (c) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90 % or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which confers dry squeeze characteristics on plants
Any of the proteins.
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸。 (A) to (g) below;
(A) a nucleic acid encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence wherein one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 2 and which confers on the plant a dry squeeze characteristic
(C) A nucleic acid which comprises an amino acid sequence having at least 90 % or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and which encodes a protein which confers on the plant a dry squeeze characteristic,
(D) a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
(E) A nucleic acid encoding a protein comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted and / or added in SEQ ID NO: 1 and which imparts a dry squeezing property to plants.
(F) A nucleic acid which comprises a base sequence having at least 90 % or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and which encodes a protein which imparts a dry squeezing property to plants.
(G) A protein consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and encoding a protein that imparts a dry squeezing property to plants Nucleic acid,
A nucleic acid selected from the group consisting of
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