JP6526946B2 - 生物学的単位のサブグループの選択的解放 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的単位の不均質なグループ中に含まれる生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを実体（ｅｎｔｉｔｙ）から個々に解放する方法、対象の疾患を前記の対象から得られた生物学的単位のサブグループを検出することにより検出する方法、および生物学的単位のグループから生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する方法に関する。

細胞生物学の分析に関する現代の技法は、細胞の均質な集団からなる試料を調製する、または単一の細胞もしくは小さい粒子を検出もしくは単離する増大する必要性を作り出してきた。ゲノムおよびプロテオミクスの研究、遺伝子クローニング、幹細胞研究、ならびに細胞に基づくスクリーニングは、全てその後の分析のために単一の細胞または小さい均質な生物学的試料を得る高められた能力から利益を得るであろう。これらの試料には、ＤＮＡまたはＲＮＡのような様々な分子ならびに細胞または生物が含まれる。

混合された集団から細胞を選択する場合では、所望の特徴を有する個々の細胞は所望の亜集団の同定および単離の後に分析しなければならない。哺乳類細胞に関する標準的な選別法は、細胞が単一細胞懸濁液中で分散していることを必要とし、天然にこの様式で増殖する造血細胞で最もうまくいく。これらの方法は、飛び抜けて一般的な細胞表現型である接着細胞には適用可能性がより低い。

接着細胞は、典型的にはそれらを増殖表面上に蒔き、次いでそれらを顕微鏡を用いて探すことにより分析される。目的の細胞を混合された細胞の集団から分離するための伝統的な選別技法は、典型的には細胞の健康に有害である接着細胞のそれらの増殖表面からの酵素的もしくは機械的解放を必要とし、または限界希釈もしくは遺伝子操作された選択的環境への耐性に基づく選択のための拡張されたプロトコルを含む。

下流の分析に適した未損傷の細胞または粒子を提供する、不均質な集団の単一の細胞もしくは粒子または少数の細胞もしくは粒子を単離するための効率的な方法はまだ見付かっていない。

一般的記載
本発明は、下流の分析および診断に適した単一の細胞または粒子を単離するための新規の方法を提供する。

生物学的単位の不均質なグループ中に含まれる生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを実体から個々に解放する方法が提供される。その方法は、前記の生物学的単位のサブグループを含む前記の生物学的単位のグループを前記の実体にリンカーを介して結合させることを含む。結合の後、前記の実体上の前記の１個以上のメンバーの位置を決定する。一度その位置が決定されたら、局所的な物理的パルスを前記の１個以上のメンバーに適用する。その局所的な物理的パルスは、リンカーを解離させることにより、その実体からその１個以上のメンバーを個々に解放する。

さらに、対象から得られた生物学的単位のサブグループを検出することにより、対象の疾患を検出する方法が提供され、ここで前記の生物学的単位のサブグループはその疾患を示すものである。その方法は少なくとも１個の生物学的単位のサブグループを含む生物学的単位の不均質なグループを提供することを含み、その生物学的単位のグループは対象から得られ、そしてその生物学的単位のグループのそれぞれのメンバーは実体、好ましくは固体支持体にリンカーを介して結合している。その生物学的単位のサブグループの実体上の位置を決定する。次いで、前記の１個以上のメンバーに局所的な物理的パルスを適用する。その局所的な物理的パルスは、リンカーを解離させることにより、その実体からその１個以上のメンバーを個々に解放する。次いでその生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを回収する。その生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを回収することにより、その生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する。次いでその回収された１個以上のメンバーをその疾患を示す少なくとも１種類のマーカーの存在に関して分析する。

生物学的単位のグループから生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する方法が開示される。その方法は以下を含む：
少なくとも１個の生物学的単位のサブグループを含む生物学的単位の不均質なグループを提供し、その生物学的単位のグループのそれぞれのメンバーは実体、好ましくは固体支持体にリンカーを介して結合しており；そして
前記の生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーの位置を決定し；
前記の１個以上のメンバーに局所的な物理的パルスを適用し、ここで前記の局所的な物理的パルスは、前記のリンカーを解離させることにより、前記の実体から前記の１個以上のメンバーを個々に解放し；
解放された生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する
ことを含む。

詳細な記載
生物学的単位の不均質なグループ中に含まれる生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを実体から個々に解放する方法が記述される。その方法は以下を含む：前記の生物学的単位のサブグループを含む前記の生物学的単位のグループを前記の実体にリンカーを介して結合させ；前記の１個以上のメンバーの前記の実体上の位置を決定し；前記の１個以上のメンバーに局所的な物理的パルスを適用し、ここで前記の局所的な物理的パルスは、前記のリンカーを解離させることにより、前記の実体から前記の１個以上のメンバーを個々に解放する。

用語“個々に解放する”は、あるサブグループの１個以上のメンバーを、別のサブグループの他のメンバーを解放することなく解放することができることを意味する。１態様において、あるサブグループの単一のメンバーを、このサブグループまたは他のサブグループの他のメンバーを一切解放することなく個々に解放することができる。

“実体”は、それに生物学的単位のサブグループが結合している物体を指す。１態様において、その実体は結合支持体である。１態様において、その結合支持体は固体支持体である。固体支持体の態様は、下記でさらに記述されるであろう。

用語“生物学的単位のサブグループのメンバー”は、そのサブグループの個々の部分に関する。その生物学的単位が細胞である１態様において、メンバーは単一の細胞であってよい。その生物学的単位がウイルス粒子である１態様において、メンバーは単一のウイルス粒子であってよい。その生物学的単位が高分子である１態様において、メンバーは高分子のサブグループに属する単一の高分子であってもよい。既に列挙された態様の他に、生物学的単位は細胞の一部、細胞小器官、細胞構成要素、例えばタンパク質、核酸、受容体、マーカー、代謝産物等であってもよい。前記の生物学的単位のいずれか１つのメンバーが適宜引き出される（ｄｅｒｉｖｅｄ）であろう。

用語“生物学的単位の不均質なグループ”は、全てのメンバーが同一であるわけではないグループに関する。グループの１個以上のメンバーはそのグループにおける他のメンバーと少なくとも１つの特徴において異なる。同一であるサブグループの１個以上のメンバーは、対象の均質なサブグループと呼ばれる。例えば、生物学的単位の不均質なグループは細胞であってよく、そのグループは異なる細胞型、例えば異なる表面マーカーを発現している細胞を含んでいてよい。そのような表面マーカーは、１態様において、癌細胞のような細胞の特定の亜型を特性付ける。

上記で記述したように、生物学的単位のサブグループを含む生物学的単位のグループを実体にリンカーを介して結合させる。リンカーは、その生物学的単位のグループのメンバーおよびその生物学的単位のグループのメンバーが結合している実体を結合させることができる構造である。従って、リンカーはメンバーおよび実体の間の連結を形成し、従ってそのメンバーがその実体に結合していることを可能にする。さらに、そのリンカーは、物理的パルスが適用された時にそれが解離して多数の部分になることができるように形成されている。次いでこれがメンバーをその実体から解放することを可能にする。リンカーの具体的な態様は下記でさらに記述される。

１態様において、生物学的単位は遠心分離を用いて実体上に固定される。遠心分離は、細胞に損傷を引き起こすことなく細胞がより迅速にその実体と接触することを可能にするのに十分である速度で実施される。１態様において、その細胞はその実体と直接接触している。別の態様において、その細胞はその実体に付着したリンカーと接触している。この方法の利点は、その細胞をより迅速に固定することができることである。この方法を実施するための典型的な装置が本明細書において記述されている。

上記の方法において、その１個以上のメンバーの位置が決定される。その１個以上のメンバーの位置の決定は、当業者に既知のあらゆる適切な手段により行うことができる。１態様において、その位置の決定は、顕微鏡、走査型顕微鏡または光学式走査装置を用いた観察により実施される。１態様において、その１個以上のメンバーはその生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーに特異的に結合する蛍光色素により可視化され、光学式蛍光顕微鏡を用いて位置を突き止めることができる。１態様において、その顕微鏡は、自動画像処理を用いて１個以上のメンバーの位置をその１個以上のメンバーの染色またはそれらの形状等に基づいて自動的に見付けるカメラおよび走査または位置決めステージを有する自動顕微鏡である。次いでその１個以上のメンバーの位置を定める座標リストが、その１個以上のメンバーを解放するための物理的パルスを位置付けるために制御単位に伝達される。別の態様において、その顕微鏡は手動顕微鏡である。操作者はその生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを選択する。その生物学的単位のサブグループの選択された１個以上のメンバーの座標リストが、その１個以上のメンバーを解放するための物理的パルスを位置付けるために制御単位に伝達される。

一度その生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーの位置が決定されたら、局所的な物理的パルスを解放されるべき１個以上のメンバーに適用する。こうして、その局所的なパルスを正確に適用することができる。１態様において、その局所的なパルスは生物学的単位のサブグループの単一のメンバーに適用される。これは、その生物学的単位のサブグループのそれぞれのメンバーを個々にまたはまとめてのどちらかで解放および回収することができる利点を有する。

１態様において、その物理的パルスは光子光源、熱源および配合（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）から選択される。配合は光または熱源の他の手段、例えば空間光通信、ファイバー光学、機械的配合（ｍｅｃｈａｎｉｃ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）との組み合わせである。具体的な態様は、集束光源、光ファイバーと連結した（ｆｉｂｅｒ ｃｏｕｐｌｅｄ）光源、それぞれの交差において発光素子によるアドレス指定できる画素を有するマトリックスからなる配列された光源；またはそれぞれの交差において抵抗加熱素子によるアドレス指定できる画素を有するマトリックスからなる配列された熱源である。

１態様において、その光子光源はレーザー、ＬＥＤ、ガス放電灯、金属蒸気灯、または他の種類の熱もしくは非熱光源から選択される。レーザーの波長は可視または不可視であってよい。光源の波長は紫外、可視光または赤外の範囲であってよい。ＬＥＤは高出力ＬＥＤであってよい。そのＬＥＤまたは高出力ＬＥＤは可視、不可視または紫外であってよい。

１態様において、その熱源は赤外レーザー、赤外ＬＥＤまたは高出力ＬＥＤまたは抵抗加熱器から選択される。
その配合は、１態様において、集束光源、光ファイバーと連結した光源、配列された光源、発光のためのアドレス指定できる画素を有するマトリックスまたは発熱のためのアドレス指定できるパッドを有するマトリックスから選択されてよい。

その局所的な物理的パルスはその生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを個々に解放し、それはそのリンカーを解離させる、従って前記のメンバーがその実体から分離することを可能にすることにより解放されるべきである。次いで解放されたメンバーを回収することができる。

本明細書で記述される方法はいくつかの利点を有する。生物学的単位、例えば細胞を、それらをその実体から解放する前に分析、操作および処理することができる。その方法はその実体への結合が非特異的であることを可能にし、すなわち全てのメンバーをそれらが属するサブグループとは無関係に結合させることができる。これは異なるサブグループのメンバーを順次位置を突き止め、解放し、そして回収することを可能にし、すなわち、第１ラウンドにおいて特徴１により特性付けられるサブグループ１の１個以上のメンバーの位置を突き止め、解放し、そして回収する。その後、結合した生物学的単位を有する同じ実体を用いて特徴２により特性付けられるサブグループ２の１個以上のメンバーの位置を突き止め、解放し、そして回収することができる、等。残っている細胞をさらに操作および観察し、その操作の後、またはさらなる特徴に基づいて、生物学的単位のサブグループのメンバーの新しいセットを観察、選択、解放および回収することができる。

本明細書において記述される方法を用いて、単一の生物学的単位、例えば１態様において細胞を選択、解放、および回収することが可能である。多数の細胞または細胞の一グループを選択、解放、および回収することも可能である。

本明細書で記述される方法の特別な利点は、そのリンカー分子の解離のための物理的パルスを局所化することができるため、メンバーを顕微鏡、走査型顕微鏡または光学式走査装置を用いて観察し、個々に選択して脱離させることができることである。

メンバー（単数または複数）の回収は、正確な位置の突き止めおよび分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）のため、そして物理的パルスの適用の短い時間により、高い純度を提供するはずである。

回収は、例えば流動、重力、光ピンセット、機械的な力もしくは磁力、マイクロピペッターまたはマニピュレーターを用いた細胞の下流の分析のための収集体積中への収集を含んでいてよい。そのような装置は当業者には既知である。

本方法を用いて、無駄になる面積が低減された物理的パルスの正確な局所化により、その実体上の生物学的単位の高い充填密度を達成することが可能である。
その生物学的単位の全部の結合に関して同じリンカー分子が用いられるため、そのメンバーが属するサブグループとは無関係に高い収率を得ることができる。

本方法の１つの特別な利点は、メンバーを解放するための穏やかな方法により高い細胞完全性を得ることができることである。生物学的単位に損傷を引き起こし得る引っかきまたは高い力は適用されない。その生物学的単位の生理的環境は、メンバーの処理および回収の間変化しないままである。これはその回収された生物学的単位の完全性を保持する。さらなる利点は、生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを、特に多数の細胞を解放しなければならない場合に、他の機械的方法を用いるよりもはるかに速く回収することができることである。

本明細書で記述される方法により回収された１個以上のメンバーは、複雑な洗浄手順または追加の取り扱いを必要とせずに下流の分析に直接供給することができる。その生物学的単位の完全性に影響を及ぼす可能性のある周囲の液体の混入もなくすことができる。

光パルスの代わりに熱パルスが用いられる場合、利点は解放および回収するべき生物学的単位の１個以上のメンバーの位置を突き止めるために用いることができる蛍光色素の光学特性との干渉がないことである。加えて、熱パルスが用いられる場合、光学検査の間にその生物学的単位の結合との干渉がない。

１態様において、生物学的単位の１個以上のメンバーを解放するために光パルスおよび試薬の組み合わせを用いることができる。これはその実体への結合に影響を及ぼすことのないその試薬の非存在下でのそのメンバーの光学検査を可能にするであろう。次いで、生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーの解放がその試薬の存在下で起こるであろう。１態様において、その試薬は光酸発生剤である。

本発明によれば、その生物学的単位はその実体にリンカーを介して結合している。そのリンカーは、（ｉ）その生物学的単位をその実体に結合させることができ、そして（ｉｉ）その生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを物理的パルスにより解放することができるあらゆる適切なドメインであってよい。そのリンカーの選択は、（ｉ）生物学的単位のタイプ、（ｉｉ）実体、および（ｉｉｉ）生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを解放するために用いられる物理的パルスに依存するであろう。当業者は、化学化合物、核酸、タンパク質、細胞、細胞小器官または他の生物学的単位を実体に連結するための様々なスキームを知っているであろう。そのリンカーはその実体に共有結合的に、または非共有結合的に結合していてよい。その実体の表面への連結は、本明細書で開示されるように成し遂げることができる。その生物学的単位を結合させるために用いられるリンカーは構造的に同一であってよく、または異なっていてよい。１つの具体的な態様において、そのリンカーは同一である。

そのリンカーは、その生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを解放するために用いられる物理的パルスに応じて定められてよい。そのリンカーは以下を含んでよい：
（ｉ）光源から生成される物理的パルスによる解放のための光子切断可能部分；
（ｉｉ）熱源から生成される物理的パルスによる解放のための熱的切断可能部分；
（ｉｉｉ）電荷により活性化することができるリンカーの部分、および光により活性化された際に電荷を生成して次いでそれがそのリンカーを活性化する光感受性試薬。この態様において、光パルスにより誘発される脱離はその試薬が添加される前には起こらない。

１態様において、そのリンカーは部分ａおよび部分ｂを含み、ここで部分ａは生物学的単位のグループが実体に結合している間は部分ｂに結合しており、且つ部分ａは局所的な物理的パルスが適用された時に部分ｂから解離する。従って、部分ａおよび部分ｂはそのリンカー分子中に含まれる結合パートナーである。部分ａおよび部分ｂの性質ならびにそれらの結合の機序に応じて、部分ａは特定のタイプの物理的パルスにより部分ｂから解離する。１態様において、部分ａは物理的パルスにより生成される熱により部分ｂから解離する。１態様において、部分ａはその結合したメンバーの位置における５０℃までの温度において部分ｂから解離する。この態様の利点は、解放される生物学的単位のメンバーが損傷を受けないことである。これは特に、その生物学的単位が生きた細胞である場合に当てはまる。１態様において、前記の部分ａは光子に誘導される立体構造変化により部分ｂから解離する。

１態様において、解放される１個以上のメンバーは解放後に回収される。次いでその回収された１個以上のメンバーに対して特定の処理または分析を行うことができる。実体から解放された１個以上のメンバーを回収した後、さらなる１個以上のメンバーをその実体から解放する。そのさらなる１個以上のメンバーは同じサブグループに属していてよく、またはそれらはその実体にリンカーを介して結合している生物学的単位の異なるサブグループに属していてよい。

１態様において、その生物学的単位のグループは細胞のサブグループを含む細胞の不均質なグループである。その細胞の１個以上のメンバーはその細胞の別の１個以上のメンバーと少なくとも１つの特徴において異なる。従って、細胞の１個のサブグループも細胞の別のサブグループと少なくとも１つの特徴において異なる。１態様において、細胞のサブグループは１個以上のメンバーを含み、ここでその１個以上のメンバーは稀な細胞である。稀な細胞は、細胞の不均質なグループ内で低い頻度で存在する細胞である。細胞の不均質なグループ内の稀な細胞の比率は最大で５％である。１つの具体的な態様において、その比率は１％である。さらなる具体的な態様において、その比率は最大で０．１％である。さらなる具体的な態様において、その比率は最大で０．０１％である。その方法は個々の細胞の同定および細胞の不均質なグループからのこれらの個々の細胞の解放、続いて回収およびさらなる分析を可能にするため、その方法は稀な細胞を同定および回収するために特に有用である。稀な細胞は癌細胞であってよい。１態様において、稀な細胞は循環している腫瘍細胞であってよい。別の態様において、稀な細胞は患者の血液中の循環している腫瘍微小塞栓であってよい。本方法を用いて稀な腫瘍細胞を同定することにより、腫瘍自体が標準的な手段により検出可能になる前に、腫瘍を検出することが可能であり、患者を非常に早期に処置し、従って生存を向上させることができる。加えて、この方法を用いることにより、療法の進行を監視することもできる。さらに、腫瘍細胞のタイプを分析することができる。

１態様において、細胞のグループにおいて、細胞の均質なサブグループの全細胞に対する比率は最大で５０％、特に５〜５０％の範囲、特に１０％〜３０％の範囲である。この方法は、細胞のより大きな亜集団、例えば特定のタイプの細胞、例えば特定の血球を検出するために用いることができる。

その方法の１態様において、その細胞のサブグループは疾患を示すものである。１態様において、その疾患は癌である。１態様において、そのサブグループは１タイプの細胞からなる。

癌細胞は特定のマーカーにより特性付けられる。言及することができる例は：特に癌遺伝子および癌抑制遺伝子、例えばｐ５３、ｒａｓファミリーの遺伝子ｅｒｂ−Ｂ２、ｃ−ｍｙｃ、ｍｄｍ２、ｃ−ｆｏｓ、ＤＰＣ４、ＦＡＰ、ｎｍ２３、ＲＥＴ、ＷＴ１等、ＬＯＨ類、例えばｐ５３に関して、ＤＣＣ、ＡＰＣ、Ｒｂ等、ならびに遺伝性腫瘍においてＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２も、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＷＴ１等のマイクロサテライト不安定性；また、腫瘍性ＲＮＡ、例えばＣＥＡ、サイトケラチン類、例えばＣＫ２０、ＢＣＬ−２、ＭＵＣ１、特にその腫瘍特異的スプライス変種、ＭＡＧＥ３、Ｍｕｃ１８、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＢＡ４６、Ｍａｇｅ−１等、または他には形態形成ＲＮＡ、例えばマスピン、ｈＣＧ、ＧＩＰ、モチリン、ｈＴＧ、ＳＣＣＡ−１、ＡＲ、ＥＲ、ＰＲ、様々なホルモン類等；さらに、特に転移プロフィールに影響を及ぼすＲＮＡおよびタンパク質、すなわち血管新生、運動性、接着およびマトリックス分解に関わる発現分子、例えばｂＦＧＦ、ｂＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ類、例えばＶＥＧＦ−Ｒ１もしくはＶＥＧＦ−Ｒ２、Ｅ−カドヘリン、インテグリン類、セレクチン類、ＭＭＰ類、ＴＩＭＰ類、ＳＦ、ＳＦ−Ｒ等、細胞周期プロフィールまたは増殖プロフィールに影響を及ぼすＲＮＡおよびタンパク質、例えばサイクリン類（例えばサイクリンＤ、ＥおよびＢの発現比率）、Ｋｉ６７、ｐ１２０、ｐ２１、ＰＣＮＡ等、またはアポトーシスプロフィールに影響を及ぼすＲＮＡおよびタンパク質、例えばＦＡＳ（Ｌ＋Ｒ）、ＴＮＦ（Ｌ＋Ｒ）、パーフォリン、グランザイムＢ、ＢＡＸ、ｂｃｌ−２、カスパーゼ３等である。

別の疾患を標的とすることもできる。
あるいは、その細胞の亜集団は１つの細胞型からなる。その細胞は、例えば心血管細胞もしくは血管細胞もしくは炎症プロセスにより放出される血管細胞、または胎児細胞、例えば母体血液中の胎児細胞、幹細胞（癌性幹細胞）、微小残存病変を示す細胞、癌細胞（例えば白血病細胞）、白血球であってよい。この状況において、その方法は遺伝子型判定、診断、予後、監視処置等のために用いられてよい。

本方法の１態様において、そのリンカーはオリゴヌクレオチドからなり、ここで部分ａは第１のオリゴヌクレオチドであり、部分ｂは第２のオリゴヌクレオチドであり、それは部分的に第１のオリゴヌクレオチドの配列に相補的である。

１態様において、そのリンカーの部分ｂはタグｂを含み、ここで前記の実体は前記のタグｂに関する結合パートナー（ｂｐｂ）でコートされている。従って、そのリンカーの部分ｂはその実体上の結合パートナーｂｐｂに結合してそのリンカーおよびその生物学的単位を固定することができる。１態様において、そのタグｂはビオチンであり、その結合パートナーｂｐｂはアビジンである。そのリンカーの部分ｂをその実体に結合させるために用いることができるさらなる結合パートナー対は当業者には周知である。

前記のリンカーの１態様において、そのリンカーはそのサブグループのメンバーに結合することができる細胞結合部分を含む。この細胞結合部分は、そのメンバーに非特異的に結合するべきである。これは、生物学的単位の特定のサブグループの選択がないことを確実にする。その細胞結合部分は、部分ａが部分ｂから解離する際に部分ｂから解離する。従って、その細胞結合部分はそのリンカーの部分ａと会合している。１態様において、そのリンカーの細胞結合部分はそのリンカーの部分ａと共有結合的に会合している。そのような態様の例を図２ｂ）において示す。別の態様において、その細胞結合部分は部分ａと非共有結合により会合している。１つの特定の態様において、その細胞結合部分はタグｃを含み、部分ａはタグａを含む。この態様において、タグｃおよびタグａは結合パートナーｂｐａの非競合的結合が可能である。そのような態様の例を図２ａ）において示す。ｂｐａおよびｂｐｂは同じタイプの結合パートナーであってよい。しかし、１態様において、部分ａおよびｃのタグは部分ｂのタグと異なっている。この態様において、部分ａおよび部分ｃのタグに関する結合パートナーｂｐａは部分ｂのタグの結合パートナーｂｐｂと異なっている。

１つのさらなる態様において、そのリンカーは、部分ａの結合パートナーに非競合的様式で結合することができるタグを含む細胞リンカーを含む。その細胞リンカーはさらに生物学的単位に結合することができる生物学的単位結合部分を含む。

従って、１つの特定の態様において、そのリンカーは図３において示されるように設計されている。
そのリンカーの解離可能な部分は、本明細書で記述されるように部分ａおよび部分ｂである。

そのリンカー中のタグとして用いることができるいくつかの親和性タグが現在既知である。これらは通常それらの大きさに従って３つのクラスに分けられる：小さいタグは最大で１２アミノ酸を有し、中程度の大きさのタグは最大で６０アミノ酸を有し、大きいタグは６０より多いアミノ酸を有する。小さいタグにはＡｒｇタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、Ｖ５−ペプチドタグ、ｃ−Ｍｙｃタグが含まれ、中程度の大きさのタグにはＳタグ、ＨＡＴタグ、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ペプチドおよび一部のセルロース結合ドメインが含まれる。後者は１８９アミノ酸に至るまでを含有する可能性があり、従ってＧＳＴおよびＭＢＰタグのように大きな親和性タグとみなされる。

可能性のあるタグおよび結合パートナー対には、ビオチン−アビジンまたはストレプトアビジンが含まれるが、それらに限定されない。さらなる例示的なタグおよびタグ結合パートナーの対には、以下の対が含まれる：
６×Ｈｉｓ／ヘキサＨｉｓ抗体
５×Ｈｉｓ／ペンタＨｉｓ抗体
ＲＧＳＨＨＨＨ／ＲＨＳ−Ｈｉｓ抗体
４×Ｈｉｓ／テトラＨｉｓ抗体
ＧＳＴタグ／ＧＳＴタグ抗体
Ｓｔｒｅｐタグ／ストレプトアビジン
ビオチン／ストレプトアビジン
ＧＳＴタグ／ＧＳＴ抗体
Ｆｌａｇタグ（例えばＤＹＫＤＨＫまたはＤＹＫＤＤＤ）／Ｆｌａｇタグ抗体
さらに、ハプテンおよびそれぞれの抗体を用いることができる。ハプテンは多くの分子生物学の適用において用いられる高い免疫原性を有する小分子である。一般的なハプテンにはジゴキシゲニンＤＮＰ（ジニトロフェノール）、ビオチン、およびフルオレセインが含まれる。

本発明はさらに、対象から得られた生物学的単位のサブグループを単離および分析することにより、対象の疾患を検出する方法に関する。その方法は少なくとも１個の生物学的単位のサブグループを含む生物学的単位の不均質なグループを提供することを含み、その生物学的単位のグループは対象から得られ、そしてその生物学的単位のグループのそれぞれのメンバーは実体、好ましくは固体支持体にリンカーを介して結合している。さらに、その方法はその生物学的単位のサブグループの位置を決定することを含む。一度位置が決定されたら、その方法は局所的な物理的パルスを前記の１個以上のメンバーに適用することを含み、ここで前記の局所的な物理的パルスは、前記のリンカーを解離させることにより、前記の実体から前記の１個以上のメンバーを個々に解放する。その実体から解放された生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを回収し、それにより前記の生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する。その回収された生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーをその疾患を示す少なくとも１種類のマーカーに関して分析する。そのようなマーカーの例が本明細書において記述されている。

１つの特定の態様において、その疾患は癌である。しかし、その疾患は少なくともその疾患の早期における稀な細胞の存在により特性付けられる別の疾患であってもよい。
その生物学的単位のグループは対象から様々な方法で得ることができる。それらは試料の形態で得ることができる。“試料”は、生物学的単位のサブグループを含有することが疑われるある量の物質を意味する。本明細書で用いられる際、その用語には標本（例えば生検または医学標本）または培養物（例えば微生物培養物）が含まれる。試料は流体、固体（例えば便）または組織であってよい。試料には患者から採取された物質が含まれてよく、それには培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、痰、精液、針穿刺吸引液等が含まれるが、それらに限定されない。ヒトの試料または組織試料または患者の試料または患者の細胞もしくは組織の試料もしくは標本に関して、それぞれは対象または患者の組織から得られる類似の、または生物学的または生化学的化合物の収集を意味する。その組織試料の源は、固形組織、ならびに新鮮な、凍結された、および／または保存された器官もしくは組織試料もしくは生検もしくは吸引液；血液もしくは血液成分；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹水、もしくは間質液；またはその対象の妊娠もしくは発育におけるあらゆる時点からの細胞であってよい。その組織試料は、自然には天然の組織と混ざり合っていない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等を含有していてよい。その生物学的単位は、例えば細胞またはその一部、細胞構成要素、例えば特定のタンパク質、核酸、受容体、マーカー、代謝産物等、組織または器官の一部等であってよい。

その試料は、例えばその対象から体液試料を引き出すことにより得ることができる。血漿は血液から調製することができる。白血球または他の細胞性血液構成要素、例えばリンパ球は、対象から引き出された血液から単離することができる。

上記の方法は、対象の疾患を、その疾患を示す生物学的単位のサブグループを検出することにより検出する方法に関する。一般に、体の生物学的単位はその体の疾患を示していることが知られている。本明細書において多数の例が与えられている。従って、これらの単位（例えば特定の細胞、タンパク質、核酸、小分子化合物等）の検出は、その疾患を示している。

その対象は哺乳類、より具体的にはヒトまたは動物であってよい。
生物学的単位がリンカーを介して結合している固体支持体から解離され、解離後に回収される生物学的単位のサブグループは、それが疾患を示しているかどうか決定するために、さらに処理することができる。１態様において、生物学的単位の下位構成要素（ｓｕｂ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を単離することができる。例として、その生物学的単位が細胞である場合、その細胞のサブグループの構成要素、例えば核酸またはタンパク質またはホルモンまたは他の分子を、それらがその疾患を示しているかどうか決定するために、当業者に周知の方法、例えば免疫アッセイ、ＰＣＲまたは他の増幅法、例えばＴＭＡ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ等、質量分析等によりさらに分析することができる。

１態様において、回収され、それにより単離された生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを、その疾患を示す少なくとも１種類のマーカーに関して分析する。そのようなマーカーはその疾患において上方制御もしくは下方制御されることが知られている核酸であってよく、またはそれらはその生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバー中に含まれるタンパク質もしくは他の構成要素であってよい。

本発明のさらなる観点において、生物学的単位の群から生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離する方法が提供される。その方法は生物学的単位の少なくとも１個のサブグループを含む生物学的単位の不均質な群を提供することを含み、その生物学的単位の群のそれぞれのメンバーは実体、好ましくは固体支持体にリンカーを介して結合している。それはさらに、前記の生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーの位置を決定することを含む。位置の決定の後、それは前記の１個以上のメンバーに局所的な物理的パルスを適用することを含み、ここで前記の局所的な物理的パルスは、前記のリンカーを解離させることにより、前記の実体から前記の１個以上のメンバーを個々に解放し、続いて解放された生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを単離することを含む。

その方法のさらなる特定の態様は本明細書において定義された通りである。
用語“単離すること”は、本明細書で用いられる際、その単離された１個以上のメンバーがそれにより残っている細胞から分離されることを意味する。本発明の特定の態様において、対象のサブグループを対象の群から単離する方法は、さらに上記で本発明に従う固体支持体から対象のサブグループを特異的に解放する方法の文脈において記述されたように定義される。当業者に既知であるような追加の単離工程を追加してよい。

本明細書で記述される方法を実施することができる装置も開示される。そのような装置は、少なくとも１個の透明なプレートにより作り出される、ある幅およびある長さを有する浅い空洞を含む。１態様において、そのプレートはガラスプレートである。その装置の空洞の深さは一定であってよく、またはそれは可動性のカバーにより調節されてよい。１態様において、その透明なプレートの大きさは必要とされる表面に応じて選択される。別の態様において、その大きさは規格化されたフットプリント、例えば標準的な顕微鏡用スライドガラスの、またはＳＢＳ規格のマルチウェルプレートのフットプリントである。その空洞の深さは数１０マイクロメートルから数ミリメートルまでの範囲であることができる。１態様において、その深さは１０μｍ〜１ｍｍである。より具体的な態様において、その深さは５０μｍ〜１ｍｍである。さらなる具体的な態様において、その深さは５０μｍより大きい深さ〜１ｍｍ未満の深さである。より具体的な態様において、その深さは約１００μｍである。この深さの利点は、細胞のリンカーへの結合が、最適化された細胞分布の均一性および最適化された沈降時間および最適化された消費量と一緒に最適化されることである。これは細胞を同定するための染色に必要な試薬の量を最適化するために特に有用である。１態様において、その深さは調節可能である。これは、それを具体的な適用に基づいて選択することができるという利点を有する。

１態様において、その装置にはさらに入口および出口においてそのプレートの幅にわたる１個以上の流路が含まれる。これらの流路は、均一な流動プロフィールおよび気泡を封入することのないその空洞の充填を可能にする。その均一な流動プロフィールはその細胞の染色および洗浄を増強する。

その空洞、透明なプレートおよび流路は、側壁ならびに上壁および下壁を有し、２個以上の流体の出入口が存在する（液体、染色液、試薬およびエマルジョンまたは細胞懸濁液をその流路の中に入れ、その空洞を表面に沿って通してそのモジュールから出すための、空洞のそれぞれの側における少なくとも１個の流路）モジュール中に封入されていてよい。これらの出入口の異なる形式、例えばそれを通してその流体を針または接続管を用いてピペット操作することができる開いた出入口（ｏｐｅｎ ｐｏｒｔｓ）、隔壁を選択してよい。充填に関して、遠心分離、ピペット操作またはポンプを用いることができる。遠心分離に関して、入口接続口は遠心分離プロセスが開始される前に最初にピペット操作された量を収容するための十分な容量を有している必要がある。光学的に透明なプレートは、生物学的単位のサブグループの同定のために光学式走査装置または顕微鏡対物レンズによりアクセスすることができる。

別の態様において、そのチャンバーのカバーは機械的アクセスのために取り外すことができる。
以下の限定的でない実施例は、本発明の特定の態様を説明する。

図１は実体（２）にリンカー（３）を介して結合した細胞（１）の概略図を示す。 図２は、支持体（２）に付着した細胞に物理的な局所的パルスを適用するための配合（２４、２４ａ）のアレイ（２０）を示す。そのアレイ（２０）は、導電線（２２）および交差（２３）を温度パルスに関して抵抗加熱素子（２４）または光パルスに関してそれぞれの交差（２３）に位置する光素子（２４ａ）を共に含んでいてよい。接触パッド（２５）は使用者または必要とされる電力を適用するためにコンピューター制御された電源に接続されている。 図３ａ）およびｂ）は、細胞（１）および実体（２）に結合したリンカー（３）の２つの異なる態様を示す。図３ａ）におけるリンカー（３）は、タグｂ（９）を有する部分ｂ（８）を含む。タグｂ（９）は結合パートナーｂｐｂ（１０）と会合している。結合パートナーｂｐｂ（１０）は実体（２）に付着している。リンカー（３）はさらに部分ｂ（８）と会合している部分ａ（７）を含む。部分ａ（７）はタグａ（１２）を含む。タグａ（１２）は結合パートナーｂｐａ（１４）に結合している。細胞（１）に結合している細胞結合部分（１１）はタグｃ（１３）を含む。タグｃ（１３）は結合パートナーａ（１４）にも結合している。図３ｂ）はリンカー（３）の別の態様を示す。部分ｂ（８）は結合パートナーｂｐｂ（１０）に結合しているタグｂ（９）を含む。結合パートナーｂｐｂ（１０）は実体（２）に結合している。部分ｂ（８）は部分ａ（７）と会合している。部分ａ（７）は細胞（１）に結合している細胞結合部分（１１）を含む。 図４は、図３ａ）において示した例示的な態様に関する部分ａおよび部分ｂの解離のプロセスを示す。同じ原理が図３ｂ）の例示的な態様に適用される。図４ａ）は、細胞（１）および実体（２）に結合した図３ａ）の同じリンカー（３）を示す。熱（１５）が部分ａ（７）およびｂ（８）に適用される。これは結果として図４ｂ）において示したリンカー（３）の部分ａ（７）および部分ｂ（８）の解離をもたらす。結果として、細胞（１ａ）は実体（２）から解放される。 図５において、部分ａ（７）および部分ｂ（８）は光源（１６）からの光パルス（３６）により解離し、結果として細胞（１ａ）の脱離がもたらされる。 図６は、物理的パルス（３６）による細胞（１）の個々の脱離の概略図を示す。ａ）物理的パルス（３６）が集束光源（１６）を用いて細胞（１）上に適用される。ｂ）細胞（１ａ）が選択的且つ個々に解放され、次いでそれを液体（１８）の流動（１７）により回収することができる。 図７は、光パルス（３６）の後に選択的に解放された、または脱離した細胞（１ａ）がピペット操作機器（１９）を用いて取り出され（図７ａ）、それが新しい表面または容器（２ａ）上に分配されるべき脱離した細胞（１ａ）を含む吸引された液体（１８ａ）の分配を可能にする（図７ｂ）態様を示す。次いでその脱離した細胞（１ａ）を、例えば検査されるべき疾患に特異的な少なくとも１種類のマーカーがその脱離した細胞（１ａ）中に存在するかどうかを決定することにより、さらに分析することができる。 図８ａは、磁気粒子（２６）が部分ａ（７）と会合しており、脱離した細胞（１ａ）と一緒に脱離する態様を示す。次いで解放された、または脱離した細胞（１ａ）を磁石（２７）を用いて回収することができる（図８ｂ）。 図９は、ソケット（３１）、顕微鏡用スライドガラス（３２）および液体（１８）を取り入れる（ｔａｋｉｎｇ ｕｐ）ための区画（３３）、液体（１８）を区画（３３）に入れるための入口（３４）および液体（１８）を区画（３３）から取り出すための出口（３５）を含むフロースルーチャンバー（３０）の態様である。それぞれの区画（３３）は、液体（１８）が入口（３４）および出口（３５）のみを通って流れることができることを確実にするための密封装置（２１）により囲まれている。 図１０は遠心分離チャンバー（４０）の態様である。その遠心分離チャンバー（４０）は生物学的単位（１）を実体（２）上に固定するのに適している。その実体（２）は、図１において示されるように、生物学的単位（１）が付着するリンカー（３）を含んでいてよい。そのチャンバー（４０）は流体入口（４１）を含む。液体（１８）を流体入口（４１）を通してそのチャンバー（４０）に入れることができる。そのチャンバー（４０）はさらに均一な流動分布のための流路（４２）を含む。液体（１８）はその流体入口（４１）から均一な流動分布のための流路（４２）を通って流れる。そのチャンバー（４０）は主要チャンバー（４３）を含む。生物学的単位（１）、例えば細胞（１）は、細胞（１）を含む液体（１８）が流体入口（４１）に入ることを可能にし、そしてそれが均一な流動分布のための流路（４２）を通って主要チャンバー（４３）へと流れることを可能にすることにより、主要チャンバー（４３）に入れることができる。そのチャンバー（４３）はさらに、台座の役目を果たすより透明度の低いプレート（４４）および本体を形成する上部の台（ｍｏｕｎｔ）（４５）を含む。この設計の利点は、細胞（１）を含む流体（１８）が均等に流れて主要チャンバー（４３）に入ることができることである。そのより透明度の低いプレート（４４）は、細胞（１）を固定するための支持体（２）の役目を果たすことができる。１つの具体的な態様において、主要チャンバー（４３）の深さは１０マイクロメートルから５ミリメートルまでの範囲である。より具体的な態様において、主要チャンバー（４３）の深さは５０マイクロメートル〜１５０マイクロメートルである。主要チャンバー（４３）の深さの最も具体的な態様は１００マイクロメートルである。これにより、細胞の分布は最適である。開示されたチャンバーは、気泡のない再現性のある完全に均一な充填が確実になる利点を有する。 図１１はチャンバー（４０）の分解立体図を示す。流体入口（４１）は出口の役目も果たすことができる。チャンバー（４０）は高さを調節可能なカバー（４６）を含む。その入口（４１）はこの高さを調節可能なカバー（４６）中に形成されている。挿入部（４８）はそのカバー（４６）上に取り付けられている。その挿入部（４８）はカバーシール（４７）を含み、均一な流動分布のための流路（４２）がその挿入部（４８）の下部中に形成されている。組み立てられた際、その挿入部（４８）は主な流路の壁を形成する台（４５）の中にはめ込まれる。主要チャンバー（４３）の下壁（示していない）はそのベースプレート（４４）により形成される。その組立品は台座（４９）の上に取り付けられる。

細胞（１）のベースプレート（４４）上での固定の後、そのチャンバー（４０）を取り外すことができ、固定された細胞を本明細書で記述されるような選択的な物理的パルスまたは他の適切な方法により個々に解放することができる。

遠心分離を用いてそのチャンバーを充填することができる。それはリンカー化学を用いた、または用いない細胞の表面への結合を促進して沈降時間を高速化するために用いることもでき、選択されて脱離した細胞の解放および輸送を促進するために用いることができる。本明細書で記述される方法の１態様において、前記の生物学的単位のサブグループを含む前記の生物学的単位の群の前記の実体へのリンカーを介した結合は遠心分離により促進される。１つの特定の態様において、遠心分離は本明細書で記述されたようなチャンバー中で実施される。１態様において、脱離した生物学的単位（単数または複数）の回収は本明細書で記述されたようなチャンバー中での遠心分離により促進される。

実施例１：熱的に切断可能な分子
本実験例は、熱的に切断可能な分子を用いる方法の実現可能性を示す。実現可能性を容易に分析するため、用いられるリンカー分子には色素が含まれる。その色素はその方法に必須ではない。

この実施例における解離は、そのリンカー中に含まれる２つのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの変性に基づいている。その変性温度はそのオリゴヌクレオチドの設計に依存し、安定な結合を確実にするために周囲温度より上であり、細胞が損傷し得る、または粒子が解離し得る温度より下であるべきである。１つの特定の態様において、そのリンカーのオリゴヌクレオチドの変性温度は３５℃〜５０℃である。一部の適用に関して、そのオリゴヌクレオチドが自己ハイブリダイズしていないのであれば好都合である可能性がある。

熱パルスを生成するために赤外線源を用いる場合、その波長は高い吸光係数によりその液体を加熱するのに適しているべきである。水溶液の場合、８００ｎｍより上の光源を用いるべきである。１つの特定の態様において、その波長は局所吸収極大（例えば１４７０ｎｍ、１５５０ｎｍ、１９００ｎｍ、２８７０ｎｍ）に近い。

この実施例において用いられるリンカー分子は、互いにハイブリダイズすることができる２種類のオリゴヌクレオチドである。分子Ｓ１１は緑色蛍光色素で標識されており、配列５’（ＣＹ３）−ＴＴＴ−ＧＣＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’−（ＴＥＧ−ビオチン）を有する。分子Ｓ１２は赤色蛍光色素で標識されており、配列５’（ＡＴＴＯ６４７Ｎ）−ＴＴＴ−ＣＧＣＴＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（ＴＥＧ−ビオチン）を有する。実体はアビジンでコートされたスライドガラス（ＡｒｒａｙＩｔ Ｃｏｒｐ，米国サニーベール）である。フローチャンバーが機能化および保温のためにスライドガラス上に取り付けられている。蛍光走査装置がスライドの画像化のために用いられる。

実施例１ａ）：分子および実体の間の結合の安定性
分子Ｓ１１およびアビジンでコートされたスライドガラス、ならびに分子Ｓ１２およびアビジンでコートされたスライドガラスの間に形成される結合の安定性を試験した。

分子Ｓ１２を、アビジンでコートされたスライドガラス上で１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において６０分間保温した。結合した分子Ｓ１２を有するアビジンでコートされたスライドガラスを、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュする（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）ことにより洗浄した。赤色蛍光を測定した。その結合の安定性を試験するため、結合した分子Ｓ１２を有するアビジンでコートされたスライドガラスを５５℃の温度のＰＢＳで洗浄することにより温め、続いて赤色蛍光色素の検出を行った。蛍光の低減は決定されず、これは温めたことおよび洗浄したことは、リンカーおよびアビジンでコートされたガラス表面の間の安定な結合のためそのリンカーを除去しなかったことを示している。

分子Ｓ１１を、アビジンでコートされたスライドガラス上で１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において６０分間保温した。結合した分子Ｓ１１を有するアビジンでコートされたスライドガラスを、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュすることにより洗浄した。緑色蛍光を測定した。その結合の安定性を試験するため、結合した分子Ｓ１１を有するアビジンでコートされたスライドガラスを５５℃の温度のＰＢＳで洗浄することにより温め、続いて緑色蛍光色素の検出を行った。蛍光の低減は決定されず、これは温めたことおよび洗浄したことは、リンカーおよびアビジンでコートされたガラス表面の間の安定な結合のためそのリンカーを除去しなかったことを示している。

実施例１ｂ）：分子の熱的除去
分子Ｓ１２をアビジンでコートされたスライドガラス上で１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において６０分間保温した。結合した分子Ｓ１２を有するアビジンでコートされたスライドガラスを、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュすることにより洗浄した。

分子Ｓ１１を、結合した分子Ｓ１２を有するアビジンでコートされたスライドガラスと共に１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において６０分間保温した。ハイブリダイズした分子Ｓ１２およびＳ１１を有するアビジンでコートされたガラス表面を、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュすることにより洗浄した。この時点で赤色および緑色蛍光の両方を測定した。次いで分子Ｓ１１の脱離の除去を、そのリンカーを有するスライドガラスをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュすることにより温めることにより試験した。赤色および緑色蛍光を再度測定した。分子Ｓ１１の６５％〜７０％がそのスライドガラスから除去され、一方で分子Ｓ１２の除去は検出できなかった。

実施例２：空間的分解（ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）なしでの蛍光ビーズの除去
リンカーおよび実体は実施例１で記述された通りであった。蛍光ビーズはＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，米国レイクフォレスト（ＴＦＰ ７０５２−５）から得た。それらは７〜８マイクロメートルの直径を有し、ビオチンおよび蛍光黄色色素でコートされていた。図９において示したようなフローチャンバーを、光学式蛍光顕微鏡および均一にスライドガラスを加熱する抵抗加熱と一緒に用いた（すなわち、スライド全体が均一に加熱された）。

分子Ｓ１２を実施例１で記述したようにスライドガラス上に固定した。１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において６０分間保温することによって、アビジンでコートされたスライドガラス上の結合部位を飽和させるために、ビオチンを添加し、続いてＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュした。分子Ｓ１１を、結合した分子Ｓ１２を有するアビジンでコートされたスライドガラスと共に１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１Ｍ ＮａＣｌ中で４２℃において３０分間保温した。これに続いて室温で３０分間保温し、続いてＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュした。１０μＭ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で室温において３０分間保温することによって、分子Ｓ１１に連結されたビオチンに、アビジンを結合させ、続いてＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュした。次いで、そのビオチンでコートされた蛍光ビーズを、０．１ｗ／ｖ％の無希釈のアビジンに、室温において暗所で３０分間保温することにより結合させ、続いてＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてフラッシュした。

５０ｍｍ／ｓおよび加熱なしでのフラッシュの前後に画像化を実施した。除去は検出できなかった。そのスライドガラス上に結合したビーズの数は一定のままであった（＋／−６％）。

チャンバー中の液体を６０℃および７０℃まで加熱しながらのフラッシュの前後にも画像化を実施した。蛍光ビーズの除去率は４０〜６０％であり、残りのビーズは均一に分布していた。連結分子なしでガラス表面に直接結合したビーズは、１００ｍｍ／ｓのフラッシュ速度および６０℃より高い温度までの加熱においてもその表面上に残っていた。

その加熱温度は熱源の近くでの温度である。その生物学的単位の近くでの温度はより低いことが予想される。
実施例３：空間的分解での蛍光ビーズの除去
リンカー分子Ｓ１１およびＳ１２、実体は実施例１で記述した通りであった。蛍光ビーズは実施例２で記述した通りであった。その設定は、実施例２におけるようなフローチャンバーおよび光学式蛍光顕微鏡を含んでいた。しかし、図２で示したような局所的な抵抗加熱素子を、そのスライド上に適用される局所的な熱パルスのためにフローチャンバー中に配置した。この実験において、我々は加熱素子のアレイの代わりに単一の加熱接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）を用いた。

コーティングおよびハイブリダイズおよび結合のプロセスは実施例２で記述した通りであった。
５０ｍｍ／ｓおよび加熱なしでのフラッシュの前後に画像化を実施した。除去は検出できなかった。そのスライドガラス上に結合したビーズの数は一定のままであった（＋／−６％）。

１００ｍｍ／ｓでのフラッシュおよび１．５Ｗで３０秒間までの局所的加熱パルスの前後に画像化を実施した。熱源の近くのビーズは完全に流されて除かれ、一方で熱源からさらに離れた位置にあったビーズは結合したままであった。その熱源の周囲内の全てのビーズが除去された。連結分子なしでガラス表面に直接結合したビーズは、１００ｍｍ／ｓのフラッシュ速度および１．５Ｗで６０秒間までの加熱においてもその表面上に残っていた。

実施例４：光子切断可能なリンカー分子
熱パルスにより解離させることができる部分ａおよび部分ｂを有するリンカーを用いる代わりに、部分ａおよび部分ｂは光子により切断することができる分子であってよい。そのようなリンカーを切断するための適切な光源はそのリンカーの設計に依存する。解離波長は４５０ｎｍより下の可視から２００ｎｍより下の紫外までに及ぶ。具体的な範囲は２８０〜３５０ｎｍおよび／または３６０〜４５０ｎｍである。実体にリンカーを介して結合している生物学的単位の取り外しは、リンカー分子を取り除く光パルスにより誘発される。そのような光切断可能なリンカーの一例がBioconjugate Chem., Vol 15, No. 5, 2004, page 1033, Scheme 2: Photolysis of SSTNにおいて示されている。この例では、２９７ｎｍにおける紫外光パルスが分子ＳＳＴＮを切断する。光切断可能である適切な分子の他の例が国際公開第２０１１／０５８７２１号において開示されている。

実施例５：電荷依存性の固定ならびに光パルスおよび試薬を用いた組み合わせた解放
この態様において、脱離プロセスはまず試薬により可能にされなければならず、続いて光パルスにより誘発される。そのプロセスは、第１工程において、細胞を陽イオン性リンカー分子と共に保温して細胞表面に電荷を提供することを含む。次いで、その細胞を荷電した表面（ガラスまたは修飾されたガラスの表面）上に固定する。続いて、細胞の分析、処理および選択が行われる。

個々の細胞の取り外しのため、まず光酸発生剤を可能にする試薬（ｅｎａｂｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）として添加する。次いで、光パルス（紫外線）を選択された細胞に適用する。これにより、その光酸発生剤が電荷を生成し、それが表面電荷を相殺し、従って結合力を低減する。局所的な光パルスが細胞の選択的解放を可能にするイオン濃度で局所的な電荷を生成する。光切断可能な部分の活性化のための光源の波長は、約４６０ｎｍより下の可視から２００ｎｍより下の紫外までに及び；特定の範囲は２３０〜４６０ｎｍである。

Claims (10)

1. 生物学的単位の不均質な群中に含まれる生物学的単位のサブグループの１個以上のメンバーを実体から個々に解放する方法であって、以下：
   −前記の生物学的単位のサブグループを含む前記の生物学的単位の群を前記の実体にリンカーを介して結合させ、
   ここで前記リンカーは部分ａおよび部分ｂを含み、該部分ａは生物学的単位の群が実体に結合している間は該部分ｂに結合する、ここで、該部分ａは第１のオリゴヌクレオチドであり、該部分ｂは部分的に第１のオリゴヌクレオチドの配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチドであり、
   −前記の実体上の前記の１個以上のメンバーの位置を決定し、
   −局所的な物理的パルスを前記の１個以上のメンバーに適用し、ここで前記の局所的な物理的パルスは、前記のリンカーを解離させることにより、前記の実体から前記の１個以上のメンバーを個々に解放する、
   ここで、前記の局所的な物理的パルスは熱パルスであり、該局所的な熱パルスが適用された場合、前記の部分ａが前記の部分ｂから解離する、該部分ａは該物理的パルスにより生成される熱により該部分ｂから解離する；
   を含む、前記方法。
2. 前記の決定が顕微鏡、走査型顕微鏡または光学式走査装置を用いた観察により実施される、請求項１に記載の方法。
3. 前記結合したメンバーの位置の温度が５０℃になるまでに、部分ａが部分ｂから解離する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記の１個以上のメンバーが解放後に回収される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記の１個以上のメンバーが回収された後、さらに１個以上のメンバーが前記の実体から解放される、請求項４に記載の方法。
6. 前記の生物学的単位の群が細胞のサブグループを含む細胞の不均質な群である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記の細胞のサブグループが１個以上のメンバーを含み、前記の１個以上のメンバーが稀な細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 細胞のサブグループが
   −疾患を示す、または
   −１タイプの細胞からなる；
   請求項６または７に記載の方法。
9. リンカーの部分ｂがタグを含み、前記の実体が前記のタグに関する結合パートナーでコートされている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記の生物学的単位のサブグループを含む前記の生物学的単位の群の前記の実体へのリンカーを介した前記の結合が遠心分離により促進される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

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