JP6522585B2 - Monoclonal antibody against CXCR5 - Google Patents

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Description

本発明は、CXCR5に特異性を有する抗体に関する。より詳細には、本発明はモノクローナル抗体に関し、より詳細には、ヒトCXCR5に対して高親和性にて特異的に結合し、中和する、完全ヒトモノクローナル抗体に関する。本発明は、該抗体をコードする核酸、これらの核酸を発現するためのベクター、及び該抗体を産生するための宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、自己免疫若しくは炎症性疾患及びがんの診断並びに/又は治療における前記抗体の使用に関する。   The present invention relates to an antibody having specificity for CXCR5. More particularly, the invention relates to monoclonal antibodies, and more particularly to fully human monoclonal antibodies that specifically bind and neutralize with high affinity to human CXCR5. The invention also relates to nucleic acids encoding said antibodies, vectors for expressing these nucleic acids and host cells for producing said antibodies. Furthermore, the invention relates to the use of said antibody in the diagnosis and / or treatment of autoimmune or inflammatory diseases and cancer.

B細胞受容体(BCR)上の抗原(Ag)に結合するナイーブB細胞は、CCR7をアップレギュレートし、T細胞ヘルプを誘発するために外側のT細胞領域へと遊走し、T細胞依存又は非依存的様式で分化を導く。B細胞の活性化に非依存的なT細胞は、短期生存のIgM抗体分泌プラズマ細胞を誘導する。しかし、活性化T細胞との同族相互作用は、さらに、B細胞の機能を強化し、濾胞分化を促進することができる。T細胞領域を通過するTヘルパー細胞の集合は、樹状細胞等の抗原提示細胞(APC)上のMHCクラスII(MHCII)複合体上の同一抗原に暴露される。抗原−MHCII複合体の提示は、関連する抗原受容体を有するT細胞の活性化や増殖を導くことができる。活性化T細胞は、B細胞領域へと遊走し、同様の特異性を備えたB細胞上のMHCII結合抗原に結合し、免疫シナプスの形成を導く。この様式で活性化されたB細胞は濾胞を播き、激しい増殖を起こし、高親和性メモリーB細胞又は長期生存プラズマ細胞へと分化する。BCRの体細胞超突然変異を介した高親和性抗原結合B細胞を産生するための基準は、専門の間葉系細胞及びT細胞集団によって制御される。濾胞樹状細胞(FDCs)上に提示された抗原に結合し、処理することができる高親和性抗原結合B細胞は、さらに、濾胞BヘルパーT(TFH)細胞と相互作用することによって分化するために選択される。TFH細胞との相互作用は、高親和性バインダー(binder)の選択を促進し、同様に、プラズマ細胞及び長期生存プラズマ細胞へ分化するためのシグナル伝達を促進する。B細胞及びTFH細胞上のCXCR5の発現は、胚中心(germinal centre)内のこれらの相互作用を最適化する鍵となる役割を果たすことが知られている。T細胞及びB細胞相互作用を促進する専門的な微小環境は、CXCR5を発現する専門的なリンパ球サブセットの局在と維持を促進する、CXCL13を恒常的に発現するFDCによって創られる。   Naive B cells that bind antigen (Ag) on the B cell receptor (BCR) upregulate CCR7 and migrate to the outer T cell area to trigger T cell help, T cell dependent or Guide differentiation in an independent manner. T cells, which are independent of B cell activation, induce short-lived IgM antibody-secreting plasma cells. However, cognate interactions with activated T cells can further enhance B cell function and promote follicular differentiation. A population of T helper cells that cross the T cell area is exposed to the same antigen on MHC class II (MHC II) complexes on antigen presenting cells (APCs) such as dendritic cells. Presentation of antigen-MHC II complexes can lead to the activation and proliferation of T cells bearing the relevant antigen receptor. Activated T cells migrate to the B cell area, bind to MHC II-bound antigens on B cells with similar specificity, leading to the formation of immune synapses. B cells activated in this manner are seeded with follicles, undergo vigorous proliferation and differentiate into high affinity memory B cells or long-lived plasma cells. The criteria for producing high affinity antigen-binding B cells via somatic hypermutation of BCR are controlled by specialized mesenchymal cell and T cell populations. High affinity antigen-binding B cells capable of binding and processing antigens presented on follicular dendritic cells (FDCs) are further differentiated by interacting with follicular B helper T (TFH) cells Is selected. Interaction with TFH cells promotes the selection of high affinity binders, as well as signaling for differentiation into plasma cells and long-lived plasma cells. Expression of CXCR5 on B cells and TFH cells is known to play a key role in optimizing these interactions within the germinal center. A specialized microenvironment that promotes T cell and B cell interactions is created by FDCs that constitutively express CXCL13, which promote the localization and maintenance of specialized lymphocyte subsets that express CXCR5.

胚中心において、CXCR5陽性TFH細胞との相互作用が、高親和性抗体反応の誘導のためには必要とされる。B細胞は、ミエリン破壊の原因となる特異的な(自己)抗体の産生を介して多発性硬化症(MS)の病因における役割を果たすことが、文献に蓄積した証拠にある。加えて、B細胞は、MS疾患プロセスの、開始(抗原捕捉)から炎症及び組織損傷までの全ての段階において関与し、これらに限定されないが、抗原提示やサイトカイン産生を含む、MSでのさらなる役割を果たし得る。既存のMS療法において、モノクローナル抗体(mAb)リツキシマブ(抗−CD20)を使用したパイロット研究を用いた最近まで、B細胞は標的にされていない。しかし、MSに対する、多くの現在の療法(インターフェロンベータ、グリココルチコイド、ミトキサントロン(mitoxantrone,)、ナタリズマブ、フィンゴリモド(fingolimod))及び次に来る療法は、B細胞の振る舞いに影響を与えるための潜在能力を有している。B細胞への効果は、それらの治療効果に寄与しうる可能性がある。   In germinal centers, interaction with CXCR5 positive TFH cells is required for induction of high affinity antibody responses. There is evidence in the literature that B cells play a role in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS) through the production of specific (auto) antibodies responsible for myelin destruction. In addition, B cells are involved in all stages of the MS disease process from initiation (antigen capture) to inflammation and tissue damage, including but not limited to additional roles in MS including antigen presentation and cytokine production Can play Until now, B cells have not been targeted with pilot studies using monoclonal antibody (mAb) rituximab (anti-CD20) in existing MS therapies. However, many current therapies for MS (interferon beta, glycocorticoids, mitoxantrone, natalizumab, fingolimod) and upcoming therapies have the potential to influence B cell behavior. Have the ability. The effects on B cells may be able to contribute to their therapeutic effect.

CXCR5(バーキットリンパ球受容体としてしられている、すなわち、BLR−1及びCD185)は、Gタンパク結合7回膜貫通ドメイン受容体(GPCR 7TM受容体)であって、B細胞及びCD4T細胞の亜集団上に高発現している。CXCR5に対する唯一知られたリガンドが、CXCケモカインCXCL13(BLC又はBCA−1としても知られる)である。CXCR5の標的の欠損は、この受容体がリンパ節におけるB細胞の遊走やB細胞の局在に関与していることを示した。CXCR5の非存在下では脾臓のT細胞リッチ領域からB細胞濾胞へと遊走することに失敗し、その結果、機能的な胚中心が形成されない。CXCL13及びCXCR5ノックダウンマウスは同様の表現型を有し、しかし興味深いことに、野生型よりもはるかに低いにもかかわらず、重要な抗原特定的な反応を載せる能力を未だに有している。   CXCR5 (which has been identified as Burkitt lymphocyte receptor, ie, BLR-1 and CD185) is a G protein-coupled seven transmembrane domain receptor (GPCR 7TM receptor), and it is suitable for B cells and CD4 T cells. It is highly expressed on subpopulations. The only known ligand for CXCR5 is the CXC chemokine CXCL13 (also known as BLC or BCA-1). Deficiencies in the CXCR5 target indicated that this receptor is involved in B cell migration and B cell localization in the lymph nodes. In the absence of CXCR5, it fails to migrate from the T cell rich area of the spleen to B cell follicles, resulting in the formation of functional germinal centers. CXCL13 and CXCR5 knockdown mice have similar phenotypes, but it is interesting that, despite being much lower than wild-type, they still have the ability to mount important antigen-specific responses.

CXCL13は、炎症を有する中枢神経系(CNS)において高発現しているが、通常のCNSにおいては実質的に検出不可能である。CXCL13の髄腔内の産生は、脳脊髄液(CSF)へCSCR5陽性B細胞及びT細胞を動員することに関与すると考えられており、MS患者のCSFにおける大部分のB細胞はCXCR5陽性である。CXCL13発現もまた、二次進行型MSの患者の脳髄膜中のリンパ濾胞様構造中で観察されるFDCにおいて検出される。MSにおいて認められる病原性B細胞反応は、B細胞機能を調整することが示されている異所性リンパ系構造におけるリンパ球の蓄積の直接的な産生物であり得る。さらに、活動的脱髄病変の近接は、持続性自己免疫反応を引き起こす自己抗原を産生することによって、慢性的な疾患を誘導する上で主要な寄与的な役割を果たし得る。CXCL13及びB細胞活性化因子(BAFF;B細胞生存の重要な調節因子)は、寛解が再発した、又は慢性的再発性の実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EA)を有するマウスのCNSにおいて、両者顕著に及び持続的にアップレギュレートされており、これは、B細胞機能もまた、動物モデルにおいて慢性CNS炎症において役割を果たしていることを示唆している。この知見は、野生型と比較して、炎症症状の迅速な解決で制御するEAEの緩やかな形態を示し、病態から完全に回復を示す、CXCL13ノックアウトマウスの表現型と一致する。これらの研究は、B細胞遊走、分化、及び増殖反応において、CXCL13及びCXCR5が重要な役割を果たしていることを示している。血管系において、B細胞は比較的少ない数が存在し、それゆえ、専門化されたリンパ系微小環境内に配置することは、B細胞エフェクター機能に命令する他のリンパ球亜集団と相互作用させることに重要な意味を持つ。CXCR5の発現は、この過程において中心的な役割を果たし、それゆえ、CXCR5拮抗作用は、B及びT細胞のCNSへの動員を減少することによって、B細胞のプラズマ細胞若しくはセントロサイト(centrocyte)への成熟を阻害することによって、及び、TFH細胞との相互作用を阻害することによって、MS疾患を潜在的に阻害し、自己抗体産生を阻害しうる。おそらく、著しく、CXCR5の遮断は、これらの無菌の環境内における自己抗原提示を減衰させることによって、異所性のリンパ濾胞の発生を妨害し、炎症プロセスの解決を促進しうる。   CXCL13 is highly expressed in the central nervous system (CNS) with inflammation but is virtually undetectable in the normal CNS. Intrathecal production of CXCL13 is thought to be involved in mobilizing CSCR5 positive B cells and T cells to cerebrospinal fluid (CSF), and most B cells in CSF of MS patients are CXCR5 positive . CXCL13 expression is also detected in FDCs observed in lymphoid-like structures in the cerebral meninges of patients with secondary progressive MS. The pathogenic B cell response observed in MS may be a direct product of lymphocyte accumulation in ectopic lymphoid structures that have been shown to modulate B cell function. In addition, the proximity of active demyelinating lesions may play a major contributing role in inducing chronic disease by producing autoantigens that trigger a persistent autoimmune response. CXCL13 and B cell activator (BAFF; a key regulator of B cell survival) have relapsed relapses or in the CNS of mice with chronic relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EA) Both are significantly and persistently upregulated, suggesting that B cell function also plays a role in chronic CNS inflammation in animal models. This finding is consistent with the phenotype of CXCL13 knock-out mice, which show a modest form of EAE that controls with rapid resolution of inflammatory conditions compared to wild-type, and completely recovers from the pathology. These studies indicate that CXCL13 and CXCR5 play an important role in B cell migration, differentiation, and proliferative responses. In the vasculature, there is a relatively small number of B cells, so placing in a specialized lymphoid microenvironment interacts with other lymphocyte subpopulations that direct B cell effector function It has an important meaning in particular. The expression of CXCR5 plays a central role in this process, and therefore, CXCR5 antagonism reduces plasma B and T cell recruitment to the CNS, leading to plasma cells or centrocytes of B cells. It may potentially inhibit MS disease and inhibit autoantibody production, by inhibiting the maturation of S. and by interacting with TFH cells. Most likely, blockade of CXCR5 could prevent ectopic lymphoid follicle development and attenuate resolution of the inflammatory process by attenuating autoantigen presentation in these sterile environments.

CXCR13の発現及びCXCR5を有する細胞との相互作用を介した、異所性のリンパ型構造の生成は、リウマチ性関節炎(RA)及びシェーングレン症候群のような他の慢性炎症疾患として同定されており、より最近、CXCR5の発現もまた、多くの膵がんにおいて示されている。このように、CXCR5に対する抗体の使用を介した、CXCR5の拮抗作用は、これらの疾患において、有用な治療アプローチとなり得る。上述のように、これは、EAEを有するマウスのCNSにおいて、CXCL13(CXCR5のリガンド)とBAFFの間の発現の類似性の観点から信頼性があるものであり、なぜなら、抗−BAFF療法は、炎症性/自己免疫疾患の治療のために十分に確立されているからである。実際には、異なる抗−BAFF抗体が市販されているか、又は、炎症性/自己免疫疾患の治療のために開発されている:例えば、既に全身性エリテマトーデス(SLE)のために承認された、ベリムマブ(belimumab)が、MS、RA及びシェーングレン症候群のような疾患に対して評価されており、また、タバルマブ(tabalumab)が現在、SLE及びMSのために臨床試験中である。   The generation of ectopic lymphoid structures through the expression of CXCR13 and interaction with cells with CXCR5 has been identified as other chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and Schoenren's syndrome More recently, expression of CXCR5 has also been shown in many pancreatic cancers. Thus, antagonism of CXCR5, through the use of antibodies to CXCR5, can be a useful therapeutic approach in these diseases. As mentioned above, this is reliable in terms of the similarity of expression between CXCL13 (ligand for CXCR5) and BAFF in the CNS of mice with EAE, because anti-BAFF therapy is It is well established for the treatment of inflammatory / autoimmune diseases. In fact, different anti-BAFF antibodies are commercially available or are being developed for the treatment of inflammatory / autoimmune diseases: eg belimumab, already approved for systemic lupus erythematosus (SLE) (Belimumab) has been evaluated for diseases such as MS, RA and Schoengren's syndrome, and tabalumab (tabalumab) is currently in clinical trials for SLE and MS.

上述のように、CXCL13/CXCR5経路は、B細胞機能において、重要な役割を果たす。Burkleら(2007)が、例えば、B細胞慢性リンパ性白血病(B−CLL)等の、がんにおいて、この経路が関与していることも示している。CLL患者は、健常な患者よりCXCL13の血清レベルが有意に高いことが特に示されている。著者らは、抗−CXCR5抗体がCXCL13に対する走化性を阻害することを示すことができており、CXCR5はCLLを有する患者に対する新たな治療標的であることを示唆している。   As mentioned above, the CXCL13 / CXCR5 pathway plays an important role in B cell function. Burkle et al. (2007) also show that this pathway is involved in cancer, such as, for example, B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). It has been particularly shown that CLL patients have significantly higher serum levels of CXCL13 than healthy patients. The authors have shown that anti-CXCR5 antibodies inhibit chemotaxis to CXCL13, suggesting that CXCR5 is a new therapeutic target for patients with CLL.

WO2009032661は、ヒトCXCR5の細胞外ドメインに特異的に結合するヒト化抗体ペプチドを記述する。該患者に対して、CXCR5に結合するCXCR5アンタゴニストを投与することを含む、CXCR5陽性細胞に関与する疾患を有する患者を治療するための方法もまた記載する。   WO2009032661 describes a humanized antibody peptide that specifically binds to the extracellular domain of human CXCR5. Also described is a method for treating a patient having a disorder involving CXCR5 positive cells, comprising administering to said patient a CXCR5 antagonist that binds CXCR5.

公衆衛生における、炎症性及び/又は自己免疫疾患、並びにがんの主要な影響を考慮すると、CXCR5/CXCL13経路が関与する、多発性硬化症、リウマチ性関節炎若しくはシェーングレン症候群等の炎症性及び/又は自己免疫疾患、並びに、膵がん、B−CLL若しくはがん/リンパ腫等のがんを治療するための、とりわけ薬剤として有用であり得る新規分子に対する必要性が存在する。   In view of the major effects of inflammatory and / or autoimmune diseases and cancer in public health, inflammatory and / or inflammatory diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or Schönren syndrome involving the CXCR5 / CXCL13 pathway There is also a need for new molecules which may be useful, inter alia, as medicaments for treating autoimmune diseases as well as cancers such as pancreatic cancer, B-CLL or cancer / lymphoma.

本発明は、CXCR5に特異的に結合する新規のモノクローナル抗体、特に、完全ヒト抗体を提供する。これらのCXCR5抗体は、結合するだけでなく、CXCR5を中和することも可能である。それらは、特に、B細胞等のCXCR5+細胞に結合することができる。 The present invention provides novel monoclonal antibodies, in particular fully human antibodies, which bind specifically to CXCR5. These CXCR5 antibodies can not only bind but also neutralize CXCR5. They can in particular bind to CXCR5 + cells, such as B cells.

第一の実施形態において、本発明は、それらの相補性決定領域(CDR)配列を介して、CXCR5に結合する、抗体又はその一部を記述する。該CDRを含む抗体は、CDRが得られた親分子のCXCR5結合特異性を維持する。   In a first embodiment, the invention describes antibodies or parts thereof that bind to CXCR5 through their complementarity determining region (CDR) sequences. An antibody containing the CDRs maintains the CXCR5 binding specificity of the parent molecule from which the CDRs were obtained.

さらなる実施形態において、前記抗体のフレームワーク領域(FR)が記述される。該FRは、本発明のCDRと結合されることになる。   In a further embodiment, the framework regions (FR) of the antibody are described. The FRs will be linked to the CDRs of the invention.

他の実施形態において、対象の抗体の可変重鎖及び軽鎖、並びに、好ましい結合することができる定常領域のアミノ酸配列も開示される。   In other embodiments, the variable heavy and light chains of the antibody of interest as well as the amino acid sequences of the preferred binding constant regions that can be linked are also disclosed.

また、本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含むベクター及び株化細胞を構成する。   In addition, another embodiment of the present invention constitutes a polynucleotide sequence encoding the antibody of the present invention, a vector comprising the polynucleotide sequence, and a cell line.

また、本発明に沿った、抗体を産生するための方法を開示する。   Also disclosed are methods for producing antibodies in accordance with the present invention.

本発明の他の実施形態は、一又は少なくとも一つの目的の抗体を含む、医薬組成物である。   Another embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition comprising one or at least one antibody of interest.

最後の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、薬剤として使用するためのものである。特に、それらは、CXCR5又はCXCR5経路に関連する障害の治療のために使用することができ、このような、自己免疫又は炎症性疾患の治療のために使用されることができる。特に、このような障害又は疾患は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎又はシェーングレン症候群から選択される。それらは、膵がん、B−CLL若しくはCXCR5/CXCL13経路に関連する他のタイプのがん等のがんの治療のために使用され得る。   In a final embodiment, the monoclonal antibodies of the invention are for use as a medicament. In particular, they can be used for the treatment of disorders associated with the CXCR5 or CXCR5 pathway, and can be used for the treatment of such autoimmune or inflammatory diseases. In particular, such a disorder or disease is selected from multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or Schoengren's syndrome. They can be used for the treatment of cancers such as pancreatic cancer, B-CLL or other types of cancer associated with the CXCR5 / CXCL13 pathway.

<定義>
用語「免疫グロブリン」(Ig)は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1又は数個のポリペプチドからなるタンパク質を示す。免疫グロブリンの一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の2つの同一の対から構成され、それぞれの対は、一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する。軽鎖は2つの部位:可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)、を有しており、軽鎖の文脈において、同様に定常領域と呼ぶことができる。重鎖も同様に、2つの部位:可変ドメイン(VH)及び定常領域(CH)を有する。それぞれの対において、軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ともに抗原への結合に関与しており、定常領域は、抗体エフェクター機能に関連している。全長免疫グロブリン「軽鎖」(通常、約25kDa)は、N末端の可変ドメイン遺伝子(通常、約110アミノ酸)、及び、C末端のκ又はλ定常ドメイン(それぞれCκ及びCλ)遺伝子によってコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」(通常、約50kDa)は、同様に、可変ドメイン遺伝子(通常、約116アミノ酸)、及び、本明細書中で後述する他の定常領域遺伝子の一つ(通常、約330アミノ酸)によってコードされている。ギリシャ文字:[アルファ]、[デルタ]、[イプシロン]、[ガンマ]、および[ミュー]で表される、哺乳動物の重鎖の5つのタイプが存在する。重鎖のタイプはそれぞれ、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのような抗体のアイソタイプを定義する。定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖[ガンマ]、[アルファ]及び[デルタ]は、3つのIg定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)からなる定常領域、及び柔軟性のためのヒンジ領域を有し、重鎖[ミュー]及び[イプシロン]は、4つのIg定常ドメイン(CH1、CH2,CH3及びCH4)及びヒンジ領域からなる定常領域を有している。
<Definition>
The term "immunoglobulin" (Ig) denotes a protein consisting of one or several polypeptides substantially encoded by immunoglobulin genes. One form of immunoglobulin constitutes the basic structural unit of an antibody. This form is tetrameric and consists of two identical pairs of immunoglobulin chains, each pair having one light chain and one heavy chain. The light chain has two sites: the variable domain (VL) and the constant domain (CL), which in the context of the light chain can also be called constant region. The heavy chain likewise has two sites: variable domain (VH) and constant domain (CH). In each pair, the light and heavy chain variable domains are both involved in binding to antigen, and the constant regions are associated with antibody effector function. The full-length immunoglobulin "light chain" (usually about 25 kDa) is encoded by the N-terminal variable domain gene (usually about 110 amino acids) and the C-terminal kappa or lambda constant domain (C kappa and C lambda respectively) genes There is. The full-length immunoglobulin "heavy chain" (usually about 50 kDa) likewise is a variable domain gene (usually about 116 amino acids), and one of the other constant region genes described hereinafter (usually about). Encoded by 330 amino acids). Greek Letters: There are five types of mammalian heavy chains, represented by [alpha], [delta], [epsilon], [gamma] and [mu]. The heavy chain types define the isotypes of antibodies such as IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively. The constant regions are identical in all antibodies of the same isotype but differ in antibodies of different isotypes. Heavy chains [gamma], [alpha] and [delta] have constant regions consisting of three Ig constant domains (CH1, CH2 and CH3), and a hinge region for flexibility, and heavy chains [mu] and [Epsilon] has a constant region consisting of four Ig constant domains (CH1, CH2, CH3 and CH4) and a hinge region.

免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変ドメインは、3つの超可変領域が割り込まれた「フレームワーク」から構成される。このように、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、軽鎖可変ドメイン中の「相補性決定領域」若しくは「CDR」、すなわち、L−CDR1、L−CDR2及びL−CDR3由来のアミノ酸残基、と、重鎖可変ドメイン中のH−CDR1、H−CDR2及びH−CDR−3(Kabatら。1991)、並びに/又は、「超可変ループ」由来のこれらの残基(Chothia及びLesk、1987)を含む。「フレームワーク領域」又は「FR」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。異なる軽鎖(すなわち、L−FR1、L−FR2、L−FR3及びL−FR4)又は重鎖(すなわち、H−FR1、H−FR2、H−FR3及びH−FR4)のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。このように、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的同一(約85%以上、通常は90〜95%以上)であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち定常軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の組み合わせフレームワーク領域は、CDRを位置決めし、整列させる働きをする。CDRは抗原のエピトープに結合する主要な役割を担う。   An immunoglobulin light or heavy chain variable domain is comprised of a "framework" interrupted by three hypervariable regions. Thus, the term "hypervariable region" refers to the amino acid residues of an antibody responsible for antigen binding. The hypervariable region is “complementarity determining region” or “CDR” in the light chain variable domain, ie, amino acid residues derived from L-CDR1, L-CDR2 and L-CDR3, and H in the heavy chain variable domain. -CDR1, H-CDR2 and H-CDR-3 (Kabat et al., 1991) and / or these residues (Chothia and Lesk, 1987) from the "hypervariable loop". "Framework Region" or "FR" residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues as herein defined. Sequence regions of framework regions of different light chains (i.e. L-FR1, L-FR2, L-FR3 and L-FR4) or heavy chains (i.e. H-FR1, H-FR2, H-FR3 and H-FR4) Are relatively conserved within the species. Thus, a "human framework region" is a framework region that is substantially identical (about 85% or more, usually 90-95% or more) to the framework region of naturally occurring human immunoglobulin. The framework regions of the antibody framework, ie, the framework regions of the constant light and heavy chain framework regions, serve to position and align the CDRs. CDRs play a major role in binding to an epitope of an antigen.

−本明細書中で使用される用語「抗体」及びその複数形「抗体(antibodies)」は、特に、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びに、F(ab′)2、Fabタンパク分解フラグメント及び一本鎖可変領域フラグメント(scFvs)等の抗原結合抗体、を含む。キメラ抗体、scFv及びFabフラグメント等の遺伝子操作されたインタクトの抗体又はフラグメント、並びに、合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた含まれる。   The term “antibody” and its plural forms “antibodies” as used herein refer in particular to polyclonal antibodies, affinity purified polyclonal antibodies, monoclonal antibodies as well as F (ab ′) 2, Fab proteolysis And antigen binding antibodies such as single chain variable region fragments (scFvs). Also included are chimeric antibodies, genetically engineered intact antibodies or fragments such as scFv and Fab fragments, as well as synthetic antigen binding peptides and polypeptides.

−用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワークと、非ヒト(通常、マウス又はラット)免疫グロブリン由来の1又は数個のCDRを含む免疫グロブリンを指す。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる(ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒトCDRを移植することによってヒト化すること、又は、ヒト定常領域上に全長非ヒト可変ドメインを組み込むこと(キメラ化))。定常領域は存在する必要はないが、それらがある場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約85〜90%、好ましくは約95%以上同一でなければならない。それゆえ、エフェクター機能の調整が必要とされる場合、可能性のあるCDR及び重鎖定常領域中のいくつかの残基を除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖可変ドメイン及びヒト化重鎖可変ドメインを含む抗体である。いくつかの例において、ヒト化抗体は、適切な結合特性を増強するためにヒトフレームワーク領域内に非ヒト残基を保持してもよく、並びに/あるいは、結合親和性を向上するために、及び/又は、抗原性を減少するため、及び/又は、ヒト化の程度を増加させるため、及び/又は、抗体の生化学的/生物物理学的特性を向上させるために、いくつかのアミノ酸変異がCDR内に導入されてもよい。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期を増加される可能性があり、ヒトへの投与の際に有害な免疫反応の可能性が減少する。   -The term "humanized" immunoglobulin refers to an immunoglobulin comprising a human framework and one or several CDRs from a non-human (usually mouse or rat) immunoglobulin. Non-human immunoglobulins that provide CDRs are referred to as "donors" and human immunoglobulins that provide frameworks are referred to as "acceptors" (humanized by grafting non-human CDRs onto human frameworks and constant regions Or integrating a full-length non-human variable domain onto a human constant region (chimerization). The constant regions need not be present, but if they are present, they should be substantially identical to the human immunoglobulin constant region, ie at least about 85 to 90%, preferably about 95% or more. Therefore, with the exception of some residues in potential CDRs and heavy chain constant regions, all portions of humanized immunoglobulins are naturally occurring human immunoglobulins, when modulation of effector function is required. It is substantially identical to the corresponding part of the sequence. A "humanized antibody" is an antibody that comprises a humanized light chain variable domain and a humanized heavy chain variable domain. In some instances, humanized antibodies may retain non-human residues within human framework regions to enhance proper binding properties, and / or to improve binding affinity. And / or some amino acid mutations to reduce antigenicity and / or to increase the degree of humanization and / or to improve the biochemical / biophysical properties of the antibody May be introduced into the CDRs. Through humanized antibodies, biological half-life can be increased and the potential for adverse immune reactions is reduced upon administration to humans.

−用語「完全ヒト」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域とヒトCDRの両方を含む、免疫グロブリンを指す。定常領域が存在することは必要ないが、もしそれらがある場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質同一、すなわち、少なくとも約85%〜90%、好ましくは約95%以上同一、でなければならない。それゆえ、エフェクター機能又は薬物動態の調整が必要な場合、重鎖定常領域中の可能性のあるいくつかの残基を除いて、完全ヒト免疫グロブリンの全ての部分が、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「完全ヒト抗体」又は「完全ヒトモノクローナル抗体」は、完全ヒト軽鎖可変ドメイン及び完全ヒト重鎖可変ドメインを含む抗体である。いくつかの例において、抗体の結合親和性を向上するため、及び/又は、免疫原性を低減するため、及び/又は、生化学的/生物物理学的特性を向上するために、CDR、フレームワーク領域、あるいは定常領域内に、アミノ酸変異が導入されても良い。   -The term "fully human" immunoglobulin refers to an immunoglobulin comprising both human framework regions and human CDRs. The presence of constant regions is not required, but if they are present they must be substantially identical to human immunoglobulin constant regions, ie at least about 85% to 90%, preferably at least about 95% identical. . Thus, except where some of the possible residues in the heavy chain constant region are required to modulate effector function or pharmacokinetics, all parts of a fully human immunoglobulin are of the native human immunoglobulin sequence. It is substantially identical to the corresponding part. A "fully human antibody" or a "fully human monoclonal antibody" is an antibody comprising a fully human light chain variable domain and a fully human heavy chain variable domain. In some instances, CDRs, frames may be used to improve the binding affinity of the antibody and / or to reduce the immunogenicity and / or to improve the biochemical / biophysical properties. Amino acid mutations may be introduced into the work region or constant region.

−用語「組換え抗体」は、アミノ酸配列が、天然抗体の配列から変化された抗体を意味する。抗体の産生における組換えDNA技術の関連性のため、天然の抗体で見出されるアミノ酸配列に限定される必要はなく、抗体は所望の性質を得るために再設計することが可能である。可能なバリエーションは多く、ちょうど1つ又は数個のアミノ酸の変化から、例えば、可変ドメイン又は定常領域の完全な再設計までの範囲である。一般的には、補体結合(例えば、補体依存性細胞傷害、CDC)、Fc受容体との相互作用、及び他のエフェクター機能(例えば、抗体依存性細胞傷害、ADCC)、薬物動態学的特性(例えば、新生児Fc受容体への結合、FcRn)等の性質を改善、減少、変化させるために、定常領域の変化が行われる。可変ドメインの変更は、抗原結合性質を向上させるために行われる。抗体に加え、免疫グロブリンは、例えば、一本鎖若しくはFv、Fab及び(Fab’)2、並びにダイアボディ、リニア抗体、多価若しくは多特異的ハイブリッド抗体を含む、バラエティに富む他の形態で存在しうる。   The term "recombinant antibody" means an antibody in which the amino acid sequence has been changed from the sequence of a naturally occurring antibody. Because of the relevance of recombinant DNA technology in the production of antibodies, it is not necessary to be limited to the amino acid sequences found in naturally occurring antibodies, and antibodies can be redesigned to obtain desired properties. There are many possible variations, ranging from just one or a few amino acid changes, to a complete redesign of the variable domain or constant region, for example. Generally, complement binding (eg, complement dependent cytotoxicity, CDC), interaction with Fc receptors, and other effector functions (eg, antibody dependent cytotoxicity, ADCC), pharmacokinetics Changes in the constant region are made to improve, decrease, change properties such as properties (eg, binding to neonatal Fc receptor, FcRn). Alterations of variable domains are made to improve antigen binding properties. In addition to antibodies, immunoglobulins exist in a variety of other forms including, for example, single chain or Fv, Fab and (Fab ′) 2 and diabodies, linear antibodies, multivalent or multispecific hybrid antibodies. It can.

−本明細書で使用する用語「抗体部分」とは、インタクト(intact)のフラグメント、又は、全長鎖若しくは抗体を指し、通常、結合若しくは可変領域である。該一部若しくはフラグメントは、インタクトの鎖/抗体の少なくとも一つの活性を維持しなければならない、つまり、それらは、「機能的な部分」又は「機能的なフラグメント」である。それらは、少なくとも一つの活性を維持しなければならず、それらは好ましくは、標的結合能を維持する。抗体部分(又は、抗体フラグメント)の例としては限定されないが、「一本鎖Fv」、「一本鎖抗体」、「Fv」又は「scFv」を含む。これらの用語は、全ての単一ポリペプチド鎖内における、重鎖及び軽鎖の両方由来の可変領域を含み、しかし、定常領域は欠損している抗体フラグメントを指す。一般的に、一本鎖抗体は、VHドメインとVLドメインの間に、抗体結合を許容する所望の構造を形成することを可能とする、ポリペプチドリンカーをさらに含む。特定の実施形態では、一本鎖抗体は、二重特異性及び/又はヒト化することが可能である。   -The term "antibody moiety" as used herein refers to an intact fragment, or a full length chain or antibody, usually a binding or variable region. The parts or fragments must maintain at least one activity of the intact chain / antibody, ie, they are "functional parts" or "functional fragments". They must maintain at least one activity, they preferably maintain their target binding ability. Examples of antibody moieties (or antibody fragments) include, but are not limited to, "single-chain Fv", "single-chain antibody", "Fv" or "scFv". These terms refer to antibody fragments that contain variable regions from both heavy and light chains within all single polypeptide chains, but constant regions are deleted. In general, single chain antibodies further comprise a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the formation of the desired structure allowing antibody binding. In certain embodiments, single chain antibodies can be bispecific and / or humanized.

−「Fabフラグメント」は、一つの軽鎖、及び、一つの重鎖の可変ドメインとCH1ドメインから構成される。Fab分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖の間に形成されることができるように、一つの軽鎖と一つの重鎖を含み、CH1とCH2ドメインの間に、定常領域をより含む「Fab’フラグメント」は、F(ab′)2分子と呼ばれる。「F(ab′)2」は、鎖間ジスルフィド結合が2つの重鎖の間に形成されるように、CH1とCH2ドメインの間に定常領域の部分を含んだ、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む。いくつかの重要な用語が定義されているので、本発明の特定の実施形態に注意を集中することが可能となる。   -"Fab fragment" is composed of one light chain and one heavy chain variable domain and CH1 domain. The heavy chain of the Fab molecule can not form a disulfide bond with other heavy chain molecules. A “Fab” comprising one light chain and one heavy chain, and one or more constant regions between CH1 and CH2 domains, so that an interchain disulfide bond can be formed between the two heavy chains. Fragments are called F (ab ') 2 molecules. "F (ab ') 2" includes two light chains and two light chains, including part of the constant region between the CH1 and CH2 domains, such that an interchain disulfide bond is formed between the two heavy chains. Contains heavy chains. Having defined several key terms, it is possible to focus attention on particular embodiments of the present invention.

−本発明の文脈中における用語「治療」は、疾患の発症後、病理学的な発達の減衰(attenuation)、縮小(reduction)、及び減少(decrease)若しくは減少(diminishing)を含む、疾患の進行上の任意の有益な効果を指す。   -The term "treatment" in the context of the present invention refers to the progression of the disease after onset of the disease, including attenuation, reduction and decline or diminishing of the pathological development. Refers to any beneficial effect above.

−用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性でない、任意の担体(carrier)を包含することを意味している。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質(単数又は複数)は、限定されないが、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液等の溶媒中において、注射用の単位剤形で製剤化されてもよい。   -The term "pharmaceutically acceptable" includes any carrier which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient and which is not toxic to the host to which it is administered. I mean. For example, for parenteral administration, the active protein (s) may be formulated in unit dosage forms for injection in solvents such as, but not limited to, saline, dextrose solution, serum albumin and Ringer's solution May be

−ヒトの免疫系は、無数のウイルス、微生物及びその他の脅威に対抗するために進化してきた。液性の構成要素−抗体反応−は、免疫系の武器庫の重要な構成要素である。抗体は、外来の侵入物を覆い、阻害し、処理することが可能であり、重要なことに、オフェンダーを圧迫するための一連の広範な防御をもたらす免疫エフェクター細胞を動員することができる。ヒト免疫系において、複数の抗体のクラス及びアイソタイプが存在し、おそらく侵入する病原体の性質に合わせた、エフェクター機能のパレットをそれぞれ賦与する。組換え治療用抗体は、ヒト配列から構築され、ほとんどの場合、IgGクラス由来である。現在まで、多くの治療用抗体は、IgG1アイソタイプ由来であり、2番目はIgG2及びIgG4由来である。IgG1アイソタイプは、免疫エフェクター細胞及び補体に結合する組み込まれた能力を有するために、広い有用性を有している。抗体により仲介されるエフェクター機能及びエフェクター細胞は、主に細胞溶解(ADCC=抗体依存性細胞媒介性細胞傷害)、食作用(ADCP=抗体依存性細胞媒介食作用)、及び補体依存性細胞傷害(CDC)を含む。これらのエフェクター機能の発明者らの理解の多くは、抗体が媒介する殺傷性のin vitroでの解析から来るものである。例えば、標的細胞(典型的には、腫瘍細胞株)と標的特異的抗体と共にヒトPBMC(末梢血単核細胞)のインキュベーションは、何時間もの期間にわたって標的細胞の溶解をもたらす。全ての場合ではないが、ADCCのほとんどは、ナチュラルキラー(NK)細胞によって行われる。古典的なIgGエフェクター機能は、適切な名称のFcγレセプターを通して媒介されることが決定されている(Nimmerjahn及びRavetch、2011)。ヒトにおいて、FcγRは、3つの活性化受容体、FcγRI、FcγRIIa及びFcγRIIIaを含み、それらは、白血球上で変化するレベルで、独占的に発現している。ITAM細胞内ドメインを介した全てのシグナルは、シグナルカスケードを導き、それぞれのFcγRを発現する細胞の同族のエフェクター機能を引き起こす。NK細胞は、常に排他的にFcγRIIIaを発現しており、この受容体は、in vitroのADCCを仲介する明確な責任がある。補体タンパク質C1qと共に抗体Fcの関与によって引き起こされる古典的な(抗体依存)補体経路は、非細胞性及び細胞性メカニズム、並びに、補体とFcγR経路との間の相乗効果を含む。   The human immune system has evolved to combat the myriad viruses, microbes and other threats. Humoral components-antibody responses-are important components of the arsenal of the immune system. Antibodies can cover, inhibit and treat foreign invaders, and importantly, can mobilize immune effector cells that provide a range of broad protection against oppressors. In the human immune system, multiple antibody classes and isotypes exist, each conferring a palette of effector functions, possibly tailored to the nature of the invading pathogen. Recombinant therapeutic antibodies are constructed from human sequences, most often from the IgG class. To date, many therapeutic antibodies are from the IgG1 isotype, the second from IgG2 and IgG4. The IgG1 isotype has broad utility because it has an integrated ability to bind to immune effector cells and complement. Antibody-mediated effector function and effector cells are mainly cytolytic (ADCC = antibody dependent cell mediated cytotoxicity), phagocytosis (ADCP = antibody dependent cell mediated phagocytosis), and complement dependent cytotoxicity (CDC) is included. Much of our understanding of these effector functions comes from the in vitro analysis of antibody-mediated killing. For example, incubation of human PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with target cells (typically tumor cell lines) and target specific antibodies results in lysis of the target cells over a period of hours. Most, if not all, ADCC is performed by natural killer (NK) cells. Classical IgG effector functions have been determined to be mediated through the appropriately named Fcγ receptor (Nimmerjahn and Ravetch, 2011). In humans, FcγR contains three activating receptors, FcγRI, FcγRIIa and FcγRIIIa, which are exclusively expressed at varying levels on leukocytes. All signals through the ITAM intracellular domain direct the signal cascade and trigger cognate effector functions of cells expressing the respective FcγR. NK cells always exclusively express FcγRIIIa, and this receptor is clearly responsible for mediating ADCC in vitro. The classical (antibody dependent) complement pathway triggered by the participation of antibody Fc in combination with complement protein C1q includes noncellular and cellular mechanisms as well as a synergistic effect between the complement and FcγR pathways.

<発明の詳細な説明>
本発明は、CXCR5に特異的な新規モノクローナル抗体、より具体的には、完全ヒトモノクローナル抗体の発見に基づいている。特に、それらは、CXCR5のヒト及びマカク(例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis))形態の両方に特異的である、すなわち、それらは交差反応性である。CXCR5のアンタゴニストとしてのこれらの抗体は、多発性硬化症(MS)、リウマチ性関節炎(RA)又はシェーグレン症候群等の炎症性及び/又は自己免疫障害若しくは疾患を治療するために有用であり得る。それらは、膵がん、B−CLL若しくはCXCR5/CXCL13経路に関与する他の種類のがんの治療に使用することができる。
<Detailed Description of the Invention>
The present invention is based on the discovery of novel monoclonal antibodies specific for CXCR5, more particularly fully human monoclonal antibodies. In particular, they are specific for both human and macaque (e.g. cynomolgus monkey (Macaca fascicularis)) forms of CXCR5, i.e. they are cross-reactive. These antibodies as antagonists of CXCR5 may be useful for treating inflammatory and / or autoimmune disorders or diseases such as multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis (RA) or Sjogren's syndrome. They can be used to treat pancreatic cancer, B-CLL or other types of cancer involved in the CXCR5 / CXCL13 pathway.

本発明は、CXCR5、好ましくはCXCR5のヒト及びマカク(例えば、カニクイザル)形態の両方、を認識し、結合し、調節し、及び/又は中和する、モノクローナル抗体の使用を提供する。特に、本発明は、CXCR5、好ましくはCXCR5のヒト及びマカク(例えば、カニクイザル)形態の両方、に結合し、調節し、及び/又は中和する、軽鎖及び重鎖可変ドメインの使用を提供する。加えて、本発明に関するモノクローナル抗体は、CXCR5を介したCXCL13のシグナル伝達を阻害する。それらは、CXCL13が誘導する細胞内カルシウム流入を阻害し、CXCL13が誘導する走行性及びCXCL13が誘導するERKリン酸化を阻害することが可能であることが示されている(実施例の節を参照のこと)。それらはまた、初代ヒトB細胞に対してADCCを仲介することが可能である。本発明による抗体は、好ましくは、除去した(depleting)抗体、すなわち、自己のT細胞及びB細胞の両方のみならず、関連する樹状細胞及びマクロファージを除去する事ができる利点を有している抗体である。それらの軽鎖及び重鎖可変ドメインは、カッパ若しくはラムダ定常ドメイン、及び、任意のアイソタイプ(IgA、IgD、IgE、IgGB及びIgM)から選択される重鎖の定常領域へそれぞれ融合することができ、様々な宿主細胞中で発現される。好ましくは、選択される定常領域はIgGであり、より好ましくは、IgG1、IgG2又はIgG4であり、さらに好ましくは、IgG1である。本発明の抗体又はその一部は、グリコシル化/非グリコシル化(aglycosylated)、及び/又は、フコシル化/アフコシル化(afucosylated)のいずれか可能である。本発明の好ましい抗体は、低フコース含有を有する、又は、アフコシル化されており、増強されたADCCを許容する。   The invention provides the use of a monoclonal antibody that recognizes, binds, modulates and / or neutralizes CXCR5, preferably both human and macaque (e.g. cynomolgus monkey) forms of CXCR5. In particular, the present invention provides the use of light and heavy chain variable domains that bind, modulate and / or neutralize both CXCR5, preferably both human and macaque (e.g. cynomolgus) forms of CXCR5. . In addition, the monoclonal antibodies according to the invention inhibit CXCL13 signaling via CXCR5. They have been shown to inhibit CXCL13-induced intracellular calcium influx and to be able to inhibit CXCL13-induced motility and CXCL13-induced ERK phosphorylation (see the Example section) ). They are also capable of mediating ADCC on primary human B cells. The antibodies according to the invention preferably have the advantage of being able to remove not only depleting antibodies, ie both autologous T cells and B cells, but also the relevant dendritic cells and macrophages. It is an antibody. Their light and heavy chain variable domains can be fused respectively to kappa or lambda constant domains and heavy chain constant regions selected from any isotype (IgA, IgD, IgE, IgGB and IgM), It is expressed in various host cells. Preferably, the constant region selected is an IgG, more preferably an IgG1, an IgG2 or an IgG4 and even more preferably an IgG1. The antibodies of the invention, or portions thereof, can be either glycosylated / aglycosylated and / or fucosylated / afucosylated. Preferred antibodies of the invention have low fucose content or are afucosylated and tolerate enhanced ADCC.

第一の実施形態によれば、CXCR5に結合する本発明のモノクローナル抗体のいずれか、又はその一部は、H−CDR1、H−CDR2及びH−CDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに、L−CDR1、L−CDR2及びL−CDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、1)重鎖可変ドメインは、H−CDR1、H−CDR2及びH−CDR3を含み、ここで、H−CDR1は、配列番号:8と9からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り; H−CDR2は、配列番号10と11からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、及び、H−CDR3は配列番号:12と13からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、並びに、2)軽鎖可変ドメインは、L−CDR1、L−CDR2及びL−CDR3を含み、ここで、L−CDR1は、配列番号:14と15からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り; L−CDR2は、配列番号:16と17からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、及び、L−CDR3は配列番号:18と19からなる群から選択されるアミノ酸配列から成る。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、1)アミノ酸配列番号:8、10及び12、2)アミノ酸配列番号:8、11及び12; 又は、3)アミノ酸配列番号:9、11及び13、を含む、あるいは、それぞれからなる、H−CDR1、H−CDR2及びH−CDR3のセットを有する。同様に、モノクローナル抗体は、1)アミノ酸配列番号:14、16及び18、2)アミノ酸配列番号:15、17及び18、又は、3)アミノ酸配列番号:15、17及び19、を含む、あるいは、それぞれからなる、好ましくは、L−CDR1、L−CDR2及びL−CDR3のセットを有する。   According to a first embodiment, any of the monoclonal antibodies of the invention that bind CXCR5, or a portion thereof, comprises a heavy chain variable domain comprising H-CDR1, H-CDR2 and H-CDR3, and L- It comprises a light chain variable domain comprising CDRl, L-CDR2 and L-CDR3. Preferably, 1) the heavy chain variable domain comprises H-CDR1, H-CDR2 and H-CDR3, wherein H-CDR1 consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8 and 9 H-CDR2 consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10 and 11, and H-CDR3 consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 and 13, and 2.) The light chain variable domain comprises L-CDR1, L-CDR2 and L-CDR3, wherein L-CDR1 consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14 and 15; L-CDR2 Is composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16 and 17, and L-CDR3 is an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18 and 19 It consists of an array. Even more preferably, the monoclonal antibodies according to the invention are 1) amino acid SEQ ID NO: 8, 10 and 12, 2) amino acid SEQ ID NO: 8, 11 and 12; or 3) amino acid SEQ ID NO: 9, 11 and 13, Or have a set of H-CDR1, H-CDR2 and H-CDR3. Similarly, the monoclonal antibody comprises 1) amino acid SEQ ID NO: 14, 16 and 18, 2) amino acid SEQ ID NO: 15, 17 and 18 or 3) amino acid SEQ ID NO: 15, 17 and 19, or Preferably, each has a set of L-CDR1, L-CDR2 and L-CDR3.

他の実施形態において、本発明は、本明細書中で記載されるように、モノクローナル抗体又はその一部を提供し、ここで、1)モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域(FR)H−FR1、H−FR2、H−FR3及びH−FR4を含み、ここで:H−FR1は、配列番号:20のアミノ酸配列から成り、H−FR2は、配列番号:21と22からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、H−FR3は、配列番号23と24から成る群から選択されるアミノ酸配列から成り、H−FR4は、配列番号:25のアミノ酸配列から成り;並びに、2)軽鎖可変ドメインは、L−FR1、L−FR2、L−FR3及びL−FR4を含み、ここで:L−FR1は、配列番号:26と27と28からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、L−FR2は、配列番号:29と30と31からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、L−FR3は、配列番号:32と33から成る群から選択されるアミノ酸配列から成り、L−FR4は、配列番号34のアミノ酸配列から成る。好ましくは、本明細書中に記載されるようなモノクローナル抗体は、1)アミノ酸配列番号:20、21、23及び25、若しくは、2)アミノ酸配列番号:20、22、24及び25、を含む、又は、からそれぞれなる、H−FR1、H−FR2、H−FR3及びH−FR4の重鎖可変ドメインセットを備え、並びに、1)アミノ酸配列番号:26、29、32及び34、若しくは、2)アミノ酸配列番号:27、30、33及び34、若しくは、3)アミノ酸配列番号:28、31、33及び34、を含む、又は、からそれぞれなる、L−FR1、L−FR2、L−FR3及びL−FR4の軽鎖可変ドメインセットを備える。好ましくは、本発明のH−FR及びL−FRは、上述されたH−CDR及びL−CDRに関連する。   In other embodiments, the invention provides a monoclonal antibody or portion thereof as described herein, wherein 1) the heavy chain variable domain of the monoclonal antibody comprises a framework region (FR) ) H-FR1, H-FR2, H-FR3 and H-FR4 where: H-FR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, H-FR2 consists of SEQ ID NO: 21 and 22 H-FR3 consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 and 24; H-FR4 consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; ) The light chain variable domain comprises L-FR1, L-FR2, L-FR3 and L-FR4, wherein: L-FR1 is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 26, 27 and 28 L-FR2 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31 and L-FR3 comprises an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32 and 33 L-FR4 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34. Preferably, the monoclonal antibodies as described herein comprise 1) amino acid SEQ ID NO: 20, 21, 23 and 25 or 2) amino acid SEQ ID NO: 20, 22, 24 and 25, Or H-FR1, H-FR2, H-FR3 and H-FR4 heavy chain variable domain set consisting of respectively, and 1) amino acid SEQ ID NO: 26, 29, 32 and 34, or 2) L-FR1, L-FR2, L-FR3 and L comprising or consisting of amino acids SEQ ID NO: 27, 30, 33 and 34 or 3) amino acid SEQ ID NO: 28, 31, 33 and 34 -Comprises the light chain variable domain set of FR4. Preferably, the H-FR and L-FR of the present invention relate to the above mentioned H-CDR and L-CDR.

さらに他の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体又はその一部を提供するものであって、好ましくは完全ヒトモノクローナル抗体であり、ここで、重鎖可変ドメインは、配列番号:1、3、4、51、53、55、57、59及び61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成り; 軽鎖可変ドメインは、配列番号:2、5、6、7、52、54、56、58、60、62及び65からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又は、から成る。好ましい実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体を提供するものであって、重鎖可変ドメインは、配列番号:1、3及び4からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成り、軽鎖可変ドメインは、配列番号:2、5、6及び7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成る。好ましくは、可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせは、1)配列番号:1及び2(40C01と呼ばれるmAb)、2)配列番号3及び7(40C01−VH1−Vk3と呼ばれるmAb)、並びに、3)配列番号:4及び7(40C01−VH2−Vk3と呼ばれるmAb)、からなる群から選択される。Fabの温度安定性の有意な増加は、親(parental)mAb 40C01(配列番号1及び2)と比較したとき、配列番号:3又は4に関するアミノ酸配列を有する可変重鎖と、配列番号:5、6又は7に関するアミノ酸配列を有する可変軽鎖とを用いることで得られる。最良の結果は、40C01−VH1−Vk3及び40C01−VH2−Vk3を用いた時に得られる。代替的な実施形態において、可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせもまた、配列番号:51及び52(最適化された42F03と呼ばれるmAb)、2)配列番号:53及び54(80A10と呼ばれるmAb)、3)配列番号:55及び56(80A11と呼ばれるmAb)、4)配列番号:57及び58(80B09と呼ばれるmAb)、5)配列番号:59及び60(80D11と呼ばれるmAb)、5)配列番号:61及び62(42F03と呼ばれるmAb)、並びに、6)配列番号:1及び65(12A01と呼ばれるmAb)からなる群から選択され得る。   In yet another embodiment, the present invention provides a monoclonal antibody or a portion thereof, preferably a fully human monoclonal antibody, wherein the heavy chain variable domain comprises SEQ ID NO: 1, 3, The light chain variable domain comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of 4, 51, 53, 55, 57, 59 and 61; the light chain variable domain comprises SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 52, 54 , 56, 58, 60, 62 and 65, comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of In a preferred embodiment, the present invention provides a monoclonal antibody, wherein the heavy chain variable domain comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 3 and 4. The light chain variable domain comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 5, 6 and 7. Preferably, the combination of variable heavy chain and variable light chain is: 1) SEQ ID NO: 1 and 2 (mAb called 40C01) 2) SEQ ID NO 3 and 7 (mAb called 40C01-VH1-Vk3), and 3 B) selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 and 7 (a mAb designated 40C01-VH2-Vk3). A significant increase in the thermal stability of the Fabs is shown in SEQ ID NO: 5, with a variable heavy chain having an amino acid sequence for SEQ ID NO: 3 or 4 when compared to parental mAb 40C01 (SEQ ID NOs: 1 and 2). It can be obtained by using a variable light chain having an amino acid sequence related to 6 or 7. The best results are obtained with 40C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3. In an alternative embodiment, the combination of variable heavy chain and variable light chain is also SEQ ID NO: 51 and 52 (mAb called 42F03 optimized), 2) SEQ ID NO: 53 and 54 (mAb called 80A10) 3) SEQ ID NO: 55 and 56 (mAb called 80A11), 4) SEQ ID NO: 57 and 58 (mAb called 80B09), 5) SEQ ID NO: 59 and 60 (mAb called 80D11), 5) SEQ ID NO: It may be selected from the group consisting of: 61 and 62 (mAb called 42F03), and 6) SEQ ID NO: 1 and 65 (mAb called 12A01).

本明細書において開示される重鎖可変領域配列と、少なくとも90%以上、少なくとも95%以上、又は、少なくとも99%以上配列同一性を有する追加的な重鎖可変領域アミノ酸配列もまた提供される。本明細書において開示される軽鎖可変領域配列と、少なくとも90%以上、少なくとも95%以上、又は、少なくとも99%以上配列同一性を有する追加的な軽鎖可変領域アミノ酸配列もまた提供される。   Also provided are additional heavy chain variable region amino acid sequences having at least 90% or more, at least 95% or more, or at least 99% or more sequence identity with the heavy chain variable region sequences disclosed herein. Also provided are additional light chain variable region amino acid sequences having at least 90% or more, at least 95% or more, or at least 99% or more sequence identity with the light chain variable region sequences disclosed herein.

本発明の、操作されたモノクローナル抗体、好ましくは、完全ヒト抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む任意のクラスの抗体、並びに、特にIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む任意のサブクラス(アイソタイプ)由来の、重鎖定常領域若しくはその一部の任意のタイプを含んでもよい。抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、重鎖定常ドメインは、通常、補体固定定常ドメイン(complement−fixing constant domain)であって、クラスは一般的にはIgG1クラスである。そのような細胞傷害活性が所望されない場合、定常ドメインは、IgG2又はIgG4クラスであってもよい。操作された抗体は、複数のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでもよい。本発明の文脈において、IgGのIgG1、IgG2又はIgG4クラスが使用されうる。例えば、重鎖定常領域の以下の配列が使用されうる:1)ヒトIgGの、Kabatらにより提唱されたEUインデックスで示される、CH1ドメイン中のポジション214におけるアルギニン、及び、ポジション356及び358のそれぞれグルタミン酸及びメチオニンを有する、アロタイプG1m(f)のIgG1(Press 及びHogg、 Biochem J. 1970)、2)配列番号:39に開示されるような配列を有する、IgG2アイソタイプ(WO2009010290に開示される、サブタイプHC2h)、あるいは、3)ヒトIgG4の、Kabatらにより提唱されたEUインデックスで示される、ポジション228のセリン及びポジション409のアルギニンが、それぞれプロリンとリジンに置換されている、配列番号:40に開示される配列を有する、Andalら、1993に記載される、IgG4アイソタイプ。上述の定常領域配列は、例えば、CH1、CH2、及び/又はCH3部分等、完全若しくはその一部分のみで使用されうる。可変ドメイン及び定常ドメインの両方を含む重鎖の非限定的な例は、配列番号:79及び80に開示されるアミノ酸配列である。本発明の操作されたモノクローナル抗体は、任意のタイプの軽鎖免疫グロブリン定常遺伝子、すなわち、カッパ特有定常遺伝子又はラムダ定常遺伝子1、2、3、6若しくは7、を含んでも良い。例えば、軽鎖定常領域に対する以下の配列が使用され得る:配列番号:63で記載されるもの等のラムダ定常遺伝子3、又は、配列番号:64で記載されるもの等のカッパ定常遺伝子。可変ドメイン及び定常ドメインの両方を含む軽鎖の非限定的な例は、配列番号:81にて開示されたアミノ酸配列である。   The engineered monoclonal antibodies, preferably fully human antibodies, of the invention are of any class of antibodies, including IgM, IgG, IgD, IgA and IgE, and any subclass including, in particular, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. It may comprise any type of heavy chain constant region or part thereof from (isotype). When it is desired that the antibody exhibit cytotoxic activity, the heavy chain constant domain is usually the complement-fixing constant domain and the class is generally of the IgG1 class. If such cytotoxic activity is not desired, the constant domain may be of the IgG2 or IgG4 class. Engineered antibodies may comprise sequences from more than one class or isotype. In the context of the present invention, the IgG1, IgG2 or IgG4 classes of IgG may be used. For example, the following sequences of heavy chain constant regions may be used: 1) arginine at position 214 in the CH1 domain, indicated by the EU index proposed by Kabat et al. Of human IgG, and positions 356 and 358 respectively Allotype G1 (f) of IgG1 (Press and Hogg, Biochem J. 1970) with glutamate and methionine, 2) IgG2 isotype (disclosed in WO2009010290, having a sequence as disclosed in SEQ ID NO: 39, The serine at position 228 and the arginine at position 409, as indicated by the EU index proposed by Kabat et al., Of type HC 2 h) or 3) human IgG4, are replaced by proline and lysine, respectively SEQ ID NO: having the sequence disclosed in 40, Andal et al described 1993, IgG4 isotype. The constant region sequences described above may be used, for example, entirely or only in part, such as CH1, CH2, and / or CH3 moieties. Non-limiting examples of heavy chains comprising both variable and constant domains are the amino acid sequences disclosed in SEQ ID NO: 79 and 80. The engineered monoclonal antibodies of the invention may comprise any type of light chain immunoglobulin constant gene, ie, kappa specific constant gene or lambda constant gene 1, 2, 3, 6 or 7. For example, the following sequences for the light chain constant region may be used: lambda constant gene 3 such as that set forth in SEQ ID NO: 63, or kappa constant gene such as that set forth in SEQ ID NO: 64. A non-limiting example of a light chain comprising both variable and constant domains is the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 81.

本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載される任意の抗体若しくはその一部をコードする単離した核酸分子、又は、ポリヌクレオチド、又は、その相補鎖若しくは縮重配列である。この点において、用語「核酸分子」、又は相互に変換可能な「ポリヌクレオチド」は、限定することなく、デオキシリボ核酸(例えば、DNA、cDNA、gDNA、合成DNA等)、リボ核酸(例えば、RNA)及び、ペプチド核酸(PNA)を含む、全ての異なるタイプの核酸を包含する。好ましい実施形態において、核酸分子は、二本差DNA分子若しくはcDNA分子等のDNA分子である。用語「単離した」とは、通常は、天然源に付随している、少なくとも一つの汚染核酸分子から同定及び分離された核酸分子を意味する。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は設定以外のものである。単離された核酸分子は、それゆえ、天然の細胞中に存在するような特定の核酸分子とは区別される。縮重配列は、参照ヌクレオチド配列と同様のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を指すが、遺伝的コードの縮重の結果として異なるヌクレオチド配列を含んでいる。   An additional embodiment of the present invention is an isolated nucleic acid molecule encoding any of the antibodies described herein or a portion thereof, or a polynucleotide, or a complementary strand or degenerate sequence thereof. In this respect, the terms "nucleic acid molecule" or "convertible polynucleotides" are, without limitation, deoxyribonucleic acid (eg DNA, cDNA, gDNA, synthetic DNA etc), ribonucleic acid (eg RNA) And all different types of nucleic acids, including peptide nucleic acids (PNAs). In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is a DNA molecule, such as a double stranded DNA molecule or a cDNA molecule. The term "isolated" usually refers to a nucleic acid molecule identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule that is associated with a natural source. An isolated nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Isolated nucleic acid molecules are thus distinguished from specific nucleic acid molecules as are present in naturally occurring cells. Degenerate sequences refer to any nucleic acid sequence that encodes an amino acid sequence similar to the reference nucleotide sequence, but includes different nucleotide sequences as a result of the degeneracy of the genetic code.

他の実施形態において、ポリヌクレオチドとも呼ばれる、核酸分子は、重鎖可変ドメイン等の、本発明のモノクローナル抗体の任意の一つの重鎖、又は、その一部をコードし、他のポリヌクレオチドは、軽鎖可変ドメイン等の、本発明の任意の一つの軽鎖、又は、その一部をコードしている。代替実施形態では、ユニークなポリヌクレオチドは、可変ドメイン若しくはFab領域等の、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖の両方、又はその一部をコードしている。   In another embodiment, the nucleic acid molecule, also referred to as a polynucleotide, encodes any one heavy chain of a monoclonal antibody of the invention, such as a heavy chain variable domain, or a portion thereof, and the other polynucleotide comprises It encodes any one light chain of the invention, or a portion thereof, such as a light chain variable domain. In an alternative embodiment, the unique polynucleotide encodes both one or both of the heavy and light chains of an antibody of the invention, or a portion thereof, such as a variable domain or a Fab region.

好ましい実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75若しくは77を含む、又は、からなる。好ましい実施形態において、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号:42、47、48、49、50、67、68、70、72、74、76若しくは78を含む、又は、からなる。代替実施形態においては、ユニークなポリヌクレオチドは、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方をコードするものであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75若しくは77を含む、又は、からなる重鎖可変ドメインをコードし、並びに、該ポリヌクレオチドは、配列番号:42、47、48、49、50、67、68、70、72、74、76若しくは78を含む、又は、からなる軽鎖可変ドメインをコードする。配列番号:43〜46の57最初のヌクレオチド、配列番号:41〜42、47〜50、66〜70、69〜75若しくは77〜78の60最初のヌクレオチド、並びに、配列番号:76の63最初のヌクレオチド、又は、配列番号:68の75最初のヌクレオチドは、リーダー配列をコードする。本発明の文脈において、これらのヌクレオチドは、除去されたり、リーダー配列をコードする任意の他のヌクレオチド配列で置き換えられることができることが理解される。それゆえ、他の実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号:41のヌクレオチド61〜429、配列番号:43のヌクレオチド58〜426、配列番号:44のヌクレオチド58〜426、配列番号:45のヌクレオチド58〜426、配列番号:46のヌクレオチド58〜426、配列番号:66のヌクレオチド61〜399、配列番号:69のヌクレオチド61〜438、配列番号:71のヌクレオチド61〜420、配列番号:73のヌクレオチド61〜414、配列番号:75のヌクレオチド61〜405、若しくは、配列番号:77のヌクレオチド61〜399、を含む、又は、からなる。同様に、好ましい実施形態において、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号:42のヌクレオチド61〜381、配列番号:47のヌクレオチド61〜381、配列番号:48のヌクレオチド61〜381、配列番号:49のヌクレオチド61〜381、配列番号:50のヌクレオチド61〜381、配列番号:67のヌクレオチド61〜378、配列番号:68のヌクレオチド76〜396、配列番号:70のヌクレオチド61〜384、配列番号:72のヌクレオチド61〜390、配列番号:74のヌクレオチド61〜390、配列番号:76のヌクレオチド64〜384、若しくは、配列番号:78のヌクレオチド61〜381、を含む、又は、からなる。代替実施形態においては、ユニークなポリヌクレオチドは、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方をコードするものであって、該重鎖可変ドメインをコードする該ポリヌクレオチドは、配列番号:41のヌクレオチド61〜429、配列番号:43のヌクレオチド58〜426、配列番号:44のヌクレオチド58〜426、配列番号:45のヌクレオチド58〜426、配列番号:46のヌクレオチド58〜426、配列番号:66のヌクレオチド61〜399、配列番号:69のヌクレオチド61〜438、配列番号:71のヌクレオチド61〜420、配列番号:73のヌクレオチド61〜414、配列番号:75のヌクレオチド61〜405、若しくは、配列番号:77のヌクレオチド61〜399、を含む、又は、からなり、並びに、該軽鎖可変ドメインをコードする該ポリヌクレオチドは、配列番号:42のヌクレオチド61〜381、配列番号:47のヌクレオチド61〜381、配列番号:48のヌクレオチド61〜381、配列番号:49のヌクレオチド61〜381、配列番号:50のヌクレオチド61〜381、配列番号:67のヌクレオチド61〜378、配列番号:68のヌクレオチド76〜396、配列番号:70のヌクレオチド61〜384、配列番号:72のヌクレオチド61〜390、配列番号:74のヌクレオチド61〜390、配列番号:76のヌクレオチド64〜384、若しくは、配列番号:78のヌクレオチド61〜381、を含む、又は、からなる。   In a preferred embodiment, the polynucleotide encoding the heavy chain variable domain of the antibody of the invention comprises SEQ ID NO: 41, 43, 44, 45, 46, 66, 69, 71, 73, 75 or 77, or It consists of In a preferred embodiment, the polynucleotide encoding the light chain variable domain of the antibody of the invention comprises SEQ ID NO: 42, 47, 48, 49, 50, 67, 68, 70, 72, 74, 76 or 78. Or consists of In an alternative embodiment, the unique polynucleotide encodes both any heavy and light chain variable domains of the antibody of the invention, wherein said polynucleotide is SEQ ID NO: 41. , 43, 44, 45, 46, 66, 69, 71, 73, 75 or 77 and encoding a heavy chain variable domain, as well as the polynucleotide of SEQ ID NO: 42, 47, 48 , 49, 50, 67, 68, 70, 72, 74, 76 or 78, encoding a light chain variable domain. 57 first nucleotides of SEQ ID NO: 43-46, 60 first nucleotides of SEQ ID NO: 41-42, 47-50, 66-70, 69-75 or 77-78, as well as 63 first of SEQ ID NO: 76 The nucleotide or the 75 first nucleotide of SEQ ID NO: 68 encodes a leader sequence. It is understood that, in the context of the present invention, these nucleotides can be removed or replaced with any other nucleotide sequence encoding a leader sequence. Thus, in another embodiment, the polynucleotide encoding the heavy chain variable domain of the antibody of the present invention is nucleotides 61-429 of SEQ ID NO: 41, nucleotides 58-426 of SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 Nucleotides 58 to 426, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 45, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 46, nucleotides 61 to 399 of SEQ ID NO: 66, nucleotides 61 to 438 of SEQ ID NO: 69, of SEQ ID NO: 71 It comprises or consists of nucleotides 61 to 420, nucleotides 61 to 414 of SEQ ID NO: 73, nucleotides 61 to 405 of SEQ ID NO: 75, or nucleotides 61 to 399 of SEQ ID NO: 77. Similarly, in a preferred embodiment, the polynucleotide encoding the light chain variable domain of the antibody of the present invention comprises nucleotides 61 to 381 of SEQ ID NO: 42, nucleotides 61 to 381, SEQ ID NO: 48 of SEQ ID NO: 47 61-381, nucleotide 61 to 381 of SEQ ID NO: 49, nucleotide 61 to 381 of SEQ ID NO: 50, nucleotide 61 to 378 of SEQ ID NO: 67, nucleotide 76 to 396 of SEQ ID NO: 68, nucleotide of SEQ ID NO: 70 61-384, nucleotides 61-390 of SEQ ID NO: 72, nucleotides 61-390 of SEQ ID NO: 74, nucleotides 64-384 of SEQ ID NO: 76, or nucleotides 61-381 of SEQ ID NO: 78, or It consists of In an alternative embodiment, the unique polynucleotide encodes both the heavy and light chain variable domains of any one of the antibodies of the invention, wherein the polynucleotide encoding the heavy chain variable domain is , Nucleotides 61 to 429 of SEQ ID NO: 41, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 43, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 44, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 45, nucleotides 58 to 426 of SEQ ID NO: 46 , Nucleotides 61 to 399 of SEQ ID NO: 66, nucleotides 61 to 438 of SEQ ID NO: 69, nucleotides 61 to 420 of SEQ ID NO: 71, nucleotides 61 to 414 of SEQ ID NO: 73, nucleotides 61 to 405 of SEQ ID NO: 75 Or nucleotides 61 to 399 of SEQ ID NO: 77 Or the polynucleotide encoding the light chain variable domain comprises nucleotides 61-381 of SEQ ID NO: 42, nucleotides 61-381 of SEQ ID NO: 47, nucleotides 61-381 of SEQ ID NO: 48, Nucleotide 61 to 381 of SEQ ID NO: 49, nucleotide 61 to 381 of SEQ ID NO: 50, nucleotide 61 to 378 of SEQ ID NO: 67, nucleotide 76 to 396 of SEQ ID NO: 68, nucleotide 61 to 384 of SEQ ID NO: 70 It comprises or consists of nucleotides 61-390 of SEQ ID NO: 72, nucleotides 61-390 of SEQ ID NO: 74, nucleotides 64-384 of SEQ ID NO: 76, or nucleotides 61-381 of SEQ ID NO: 78.

遺伝暗号の縮重のために、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、最適化されることができることが理解される。それゆえ、本明細書中で開示される重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも90%以上、少なくとも95%以上、若しくは、少なくとも99%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、上で挙げられた好ましいポリヌクレオチド配列等も提供される。同様に、本明細書中で開示される軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも90%以上、少なくとも95%以上、若しくは、少なくとも99%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、上で挙げられた好ましいポリヌクレオチド配列等も提供される。   It is understood that, due to the degeneracy of the genetic code, polynucleotides encoding the antibodies of the invention can be optimized. Thus, a polynucleotide sequence having at least 90% or more, at least 95% or more, or at least 99% or more sequence identity with a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region sequence disclosed herein, For example, preferred polynucleotide sequences listed above are also provided. Similarly, a polynucleotide sequence having at least 90% or more, at least 95% or more, or at least 99% or more sequence identity with a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region sequence disclosed herein, For example, preferred polynucleotide sequences listed above are also provided.

本発明のさらなる実施形態は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)又はFab領域等の、本明細書中に記載された任意の抗体、又は、その一部をコードするDNAを含むベクターである。ベクターは、任意の原核細胞若しくは真核細胞において、組み込み又は自立複製する、機能的な、任意のクローニングベクター、又は、発現ベクターであってよい。とりわけ、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、エピソーム、人工染色体等であってよい。ベクターは、重鎖及び軽鎖の両方に対してコードする配列の全体若しくは一部、又は、軽鎖及び重鎖をコードする配列のいずれか、若しくは、その一部、を含んでもよい。ベクターは、重鎖及び軽鎖の両方、及びその一部に対してコードする配列を含むべきであり、これらのコードする配列は、それぞれ、プロモーターに対して実施可能なように連結されてもよい。プロモーターは、重鎖及び掲載をコードする配列、又はその一部に対して、同じ、又は異なっても良い。重鎖及び軽鎖に対するコードする配列、又はその一部が、好ましくは、内部リボソーム侵入部位(IRES)によって分離されてもよい場合、重鎖及び軽鎖をコードする配列、又はその一部は、一つの単一プロモーターに実施可能なように連結されてもよい。真核生物の遺伝子発現に適したプロモーターは、例えば、当業者によく知られている、マウス若しくはヒトサイトメガロウイルス(CMV)、マウス双方向性(bi−directional)CMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、又は、ヒト伸長因子1アルファ(EF−1α)プロモーター等の、ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。ベクターは、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、複製起点、インシュレーター等のような、調節因子を含んでも良い。一般的に、DNAは、当該技術分野で公知の技術を用いて、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位(単数又は複数)に挿入される。これらの構成の1又は複数を含む最適なベクターの構築は、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を採用する。   A further embodiment of the invention is a vector comprising DNA encoding any of the antibodies described herein, or a portion thereof, such as variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions. is there. The vector may be any cloning vector or expression vector that is functional, integrating or autonomously replicating in any prokaryotic or eukaryotic cell. In particular, the vector may be a plasmid, cosmid, virus, phage, episome, artificial chromosome and the like. The vector may contain all or part of the sequences encoding for both heavy and light chains, or any of the sequences encoding light and heavy chains or parts thereof. The vector should contain sequences encoding for both heavy and light chains, and portions thereof, each of which encoding sequences may be operably linked to a promoter. . The promoter may be the same or different to the heavy chain and the sequence encoding the list, or a portion thereof. The sequences encoding the heavy and light chains, or portions thereof, where the sequences encoding the heavy and light chains, or portions thereof, may preferably be separated by an internal ribosome entry site (IRES) It may be operably linked to one single promoter. Suitable promoters for eukaryotic gene expression are, for example, mouse or human cytomegalovirus (CMV), mouse bi-directional CMV promoter, rous sarcoma virus (RSV), which are well known to the person skilled in the art. 2.) Promoters or promoters from viral genes, such as human elongation factor 1 alpha (EF-1α) promoter. The vector may contain regulatory elements such as promoter, terminator, enhancer, selectable marker, replication origin, insulator and the like. In general, DNA is inserted into the appropriate restriction endonuclease site (s) using techniques known in the art. Construction of optimal vectors containing one or more of these configurations employs standard ligation techniques which are known to the skilled artisan.

本発明のさらなる実施形態は、組換え宿主細胞であって、該細胞は、上記で定義された、1若しくは複数の核酸分子(単数又は複数)/ポリヌクレオチド(単数又は複数)、又は、1若しくは複数のベクター(単数又は複数)、を含む。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってよい。原核細胞の例は、大腸菌等の細菌を含む。真核生物の例は、任意の初代細胞培養(primary cell culture)、又は、確立された細胞株(例えば、3T3、Vero、HEK293、TN5、等)を含む、酵母細胞、植物細胞、哺乳類細胞、及び、昆虫細胞である。グリコシル化タンパク質の発現に最適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。好ましい有用な哺乳類宿主細胞株の例は、CHO、HEK293、NS0、SP2/0及びCOS細胞を含む。本発明の抗体は、組換え技術、化学的合成、クローニング、ライゲーション、又はその組み合わせ等の、当該技術で公知の技術によって製造されてもよい。低グリコシル化レベルを有する抗体、アグリコシル化抗体、又は、アグリコシル化Fc部分等の、アグリコシル化されたその一部を得るために必要とされるべき場合、酵母発現系若しくは工学的/糖鎖工学的、CHO細胞株が有利に使用することができる。同様に、低フコシル化レベルを有する抗体、アフコシル化抗体、又は、アフコシル化Fc部分等の、アフコシル化されたその一部、を得るために必要とされるべき場合、操作された/糖鎖操作された酵母発現系、又は、操作された/糖鎖操作されたCHO細胞株が、有利に使用されることができる。   A further embodiment of the invention is a recombinant host cell, wherein said cell is one or more nucleic acid molecule (s) / polynucleotide (s) or one or more as defined above. Contains multiple vector (s). Host cells may be prokaryotic or eukaryotic cells. Examples of prokaryotic cells include bacteria such as E. coli. Examples of eukaryotes are yeast cells, plant cells, mammalian cells, including any primary cell culture or established cell lines (eg, 3T3, Vero, HEK 293, TN5, etc.) And insect cells. Suitable host cells for the expression of glycosylated proteins are derived from multicellular organisms. Examples of preferred useful mammalian host cell lines include CHO, HEK293, NS0, SP2 / 0 and COS cells. The antibodies of the invention may be produced by techniques known in the art, such as recombinant techniques, chemical synthesis, cloning, ligation, or a combination thereof. Yeast expression systems or engineering / sugars, if it is necessary to obtain aglycosylated parts thereof, such as antibodies with reduced glycosylation levels, aglycosylated antibodies or aglycosylated Fc moieties Strand-engineered, CHO cell lines can be advantageously used. Similarly, if it is required to obtain an antibody with low fucosylation level, an afucosylated antibody, or an afucosylated portion thereof, such as an afucosylated Fc moiety, engineered / glycoengineered A yeast expression system or engineered / glycoengineered CHO cell line can advantageously be used.

本発明の他の実施形態は、それゆえ、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)又は、Fab領域等の本発明の抗体を製造する方法であって、該方法は、本明細書中に記載される任意の抗体又はその一部をコードする核酸分子(単数又は複数)の発現を許容する条件下において、本発明の組換え宿主細胞を培養し、及び、製造されたポリペプチド(単数又は複数)を回復し/単離すること、を含む。製造されるポリペプチド(単数又は複数)は、グリコシル化されている、若しくはされていなくてもよく、フコシル化されている、若しくはされていなくてもよく、又は、使用される宿主細胞に依存した他の翻訳後修飾を含んでいてもよい。本発明の抗体、若しくはその一部を製造する方法は、さらに、抗体若しくはその一部を精製する工程、及び/又は、該抗体若しくはその一部を、医薬組成物へと配合する工程、をさらに含んでも良い。   Another embodiment of the invention is, therefore, a method of producing an antibody of the invention, such as a variable domain (heavy and / or light variable domain) or a Fab region, which method is herein described. The recombinant host cell of the present invention is cultured under conditions permitting expression of the nucleic acid molecule (s) encoding any of the described antibodies or parts thereof, and the produced polypeptide (single or multiple). Recovery / isolation). The polypeptide (s) produced may be glycosylated or not, fucosylated or not, or dependent on the host cell used Other post-translational modifications may be included. The method of producing the antibody of the present invention, or a portion thereof further comprises the steps of purifying the antibody or a portion thereof, and / or combining the antibody or a portion thereof into a pharmaceutical composition. It may be included.

可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域等の、抗体の一部を含む、本明細書で記載される抗体をコードするポリヌクレオチド(DNA及びRNAを含む)を準備するための他の方法は、当該技術分野で周知である。総RNAは、グアニジンイソチオシアネート抽出物を使用して準備し、続いて、CsCl勾配中で遠心分離によって単離されることができる(Chirgwin JM ら1979)。ポリ(A)+RNAは、AvivとLeder(Aviv Hら、1972)の方法を使用して総RNAから準備される。相補性DNA(cDNA)は、公知の方法を使用して、ポリ(A)+RNAから準備される。あるいは、ゲノムDNAが単離されることができる。CXCR5抗体若しくはその部分をコードするポリヌクレオチドは、その時、例えば、ハイブリダイゼーションやPCRによって同定され、単離される。可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域等の、抗体の一部を含む、本明細書で記載される抗体は、組換え技術、化学的合成、クローニング、ライゲーション若しくはその組み合わせ等の、当該技術で公知の任意の技術によって製造されてもよい。多くの書籍や総説が、ベクター及び原核若しくは真核宿主細胞を用いて、組換えタンパク質をクローン化し、製造する方法の技術を提供する。   Other for preparing polynucleotides (including DNA and RNA) encoding the antibodies described herein, including portions of antibodies, such as variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions Methods are well known in the art. Total RNA can be prepared using guanidine isothiocyanate extract and subsequently isolated by centrifugation in a CsCl gradient (Chirgwin JM et al 1979). Poly (A) + RNA is prepared from total RNA using the method of Aviv and Leder (Aviv H et al., 1972). Complementary DNA (cDNA) is prepared from poly (A) + RNA using known methods. Alternatively, genomic DNA can be isolated. The polynucleotide encoding the CXCR5 antibody or portion thereof is then identified and isolated, for example, by hybridization or PCR. The antibodies described herein, including portions of antibodies, such as variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions can be recombinant technology, chemical synthesis, cloning, ligation or combinations thereof, etc. , May be manufactured by any technique known in the art. Many books and reviews provide techniques for methods of cloning and producing recombinant proteins using vectors and prokaryotic or eukaryotic host cells.

本発明のさらなる実施形態は、本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域等の抗体の一部を含む医薬組成物である。好ましくは、該医薬組成物は、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、溶媒(vehicles)等の、少なくとも一つの追加的な賦刑剤を、さらに含む。   A further embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition comprising a monoclonal antibody of the present invention or part of an antibody such as a variable domain (heavy and / or light variable domain) or Fab region. Preferably, the pharmaceutical composition further comprises at least one additional pendent, such as buffers, stabilizers, surfactants, carriers, diluents, vehicles and the like.

本発明の医薬組成物は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、若しくはシェーングレン症候群、並びに、膵がん、B−CLL若しくはCXCR5/CXCL13経路が関与する他の形態のがんのような、炎症性若しくは自己免疫疾患/障害の診断、予防及び/又は治療(局所又は全身的)において有用である。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに投与されてもよい。   The pharmaceutical composition of the present invention is an inflammation such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or Schönren's syndrome, as well as other forms of cancer involving pancreatic cancer, B-CLL or CXCR5 / CXCL13 pathway. It is useful in the diagnosis, prevention and / or treatment (local or systemic) of sexual or autoimmune diseases / disorders. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier.

他の局面において、本発明は、薬剤として使用するための、本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域等の、その一部を提供する。特に、それらは、炎症性又は自己免疫疾患/障害の治療のために使用される。好ましくは、該障害/疾患は、MS、RA又はシェーングレン症候群から選択される。他の局面において、本発明は、患者における疾患を治療するための方法を提供するものであって、本発明の医薬組成物、又は、任意の一つの抗体若しくはその一部を患者に投与すること、を含んでいる。好ましくは、MS、RA又はシェーングレン症候群等の、炎症性若しくは自己免疫疾患/障害である。さらなる局面において、本発明は、がんを治療する方法に関するものであって、本発明の医薬組成物、又は、任意の一つの抗体若しくはその一部を患者に投与すること、を含んでいる。好ましくは、がんは、膵がん、B−CLL又はCXCR5/CXCL13経路が関与する任意のタイプのがんである。   In another aspect, the present invention provides the monoclonal antibody of the present invention, or a portion thereof such as a variable domain (heavy and / or light variable domain) or a Fab region, for use as a drug. In particular, they are used for the treatment of inflammatory or autoimmune diseases / disorders. Preferably, the disorder / disease is selected from MS, RA or Schoengren's syndrome. In another aspect, the invention provides a method for treating a disease in a patient, comprising administering to the patient a pharmaceutical composition of the invention, or any one antibody or portion thereof. Contains. Preferably, it is an inflammatory or autoimmune disease / disorder such as MS, RA or Schönren syndrome. In a further aspect, the invention relates to a method of treating cancer, comprising administering to a patient a pharmaceutical composition of the invention, or any one antibody or portion thereof. Preferably, the cancer is pancreatic cancer, B-CLL or any type of cancer involving the CXCR5 / CXCL13 pathway.

他の局面において、本発明は、炎症性若しくは自己免疫疾患/障害、並びに、がんの治療のための薬剤を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。好ましくは、該炎症性又は自己免疫障害/疾患は、MS、RA又はシェーングレン症候群から選択される。好ましくは、該がんは、膵がん、B−CLL又はCXCR5/CXCL13経路を含む任意のタイプのがんである。   In another aspect, the invention provides the use of the antibody of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory or autoimmune diseases / disorders, as well as cancer. Preferably, the inflammatory or autoimmune disorder / disease is selected from MS, RA or Sjogren's syndrome. Preferably, the cancer is any type of cancer including pancreatic cancer, B-CLL or CXCR5 / CXCL13 pathway.

本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等の、任意の適切な方法によって投与することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any suitable method, such as intravenous, intramuscular, subcutaneous or intradermal.

非経口(例えば、静脈内、皮下、筋肉内、皮内)投与のために、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容しうる非経口溶媒(vehicle)(例えば、水、整理食塩水、デキストロース溶液)、及び、等張性を維持する添加剤(例えば、マンニトール)若しくは化学的安定性を維持する添加剤(例えば、例えば、防腐剤及び緩衝液)と関連して、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。固定に投与される用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴(特に、性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、症状の程度、併用療法、治療の頻度、及び、所望の効果に依存して変わる。本発明の抗体、又は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域等の、抗体の一部は、製造され、製剤化され、投与され、あるいは、使用及び/又は製造する所望の方法を実施されうる他の代替する形態で使用され得る。有用な結合又は複合体は、薬物運搬の有効性の点において薬剤を改善するために生成される。この目的のために、本明細書中に記載される抗体は、ポリエチレングリコール及び他の天然若しくは合成ポリマー等の分子との活性化結合体(conjugates)又は複合体の形態であり得る(Harris JMら、2003)。この点において、本発明は、抗体がポリマーと結合されている、化学的に修飾された抗体を企図する。典型的には、ポリマーは、生理的環境等の水性環境中で、結合体(conjugate)が沈殿しないように水溶性である。さらに、ポリマーの混合物は、結合体(conjugate)を製造するために使用されうる。治療に使用される結合体(conjugatese)は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含み得る。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ−PEG、ビス−サクシニミジルカーボネーPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド/エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロール、又は、他の炭水化物ベースのポリマーである。適切なPEGは、約600〜約60,000の分子量、例えば、5,000、12,000、20,000及び25,000を含む分子量を含んでも良い。結合物(conjugate)は、このような水溶性ポリマーの混合物も含み得る。結合物の例としては、ここで開示される任意の抗体、及び、N末端に結合したポリアルキルオキサイド部分を含む。PEGは、一つの適切なポリアルキルオキシドである。例示として、本明細書で開示される任意の抗体は、「PEG化(PEGlation)」として知られる工程、PEGを用いて修飾することができる。PEG化は、当該技術分野で公知の任意のPEG化反応によって実施されうる(Francis GEら、1998)。例えば、PEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いて、アシル化反応、又はアルキル化反応によって実施される。好ましくは、これらの修飾は、ヒト又はマカク(例えば、カニクイザル等)CXCR5に結合する抗体の能力に重大な影響を与えない。   For parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intradermal) administration, the pharmaceutical compositions of the present invention can be used in a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle (eg, water, saline, Dextrose solution), and additives (eg, mannitol) that maintain isotonicity or additives (eg, preservatives and buffers) that maintain chemical stability, solutions, suspensions It can be formulated as an emulsion or a lyophilised powder. The formulation is sterilized by commonly used techniques. The doses administered for fixation may include pharmacokinetic properties, route of administration, patient status and characteristics (especially gender, age, weight, health status, size), degree of symptoms, combination therapy, frequency of treatment, and desired It changes depending on the effect. A portion of an antibody, such as an antibody of the invention, or variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions, is produced, formulated, administered, or desirably used and / or produced. It can be used in other alternative forms in which the method can be implemented. Useful bonds or complexes are generated to improve the drug in terms of drug delivery effectiveness. For this purpose, the antibodies described herein may be in the form of activated conjugates or complexes with molecules such as polyethylene glycol and other natural or synthetic polymers (Harris JM et al. , 2003). In this regard, the present invention contemplates chemically modified antibodies, wherein the antibody is conjugated to a polymer. Typically, the polymer is water soluble so that the conjugate does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. Additionally, mixtures of polymers can be used to make conjugates. The conjugates used for treatment may comprise a pharmaceutically acceptable water soluble polymer moiety. Suitable water-soluble polymers include polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-PEG, bis-succinimidyl carbonate PEG, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol (eg glycerol), Polyvinyl alcohol, dextran, cellulose or other carbohydrate based polymers. Suitable PEGs may include molecular weights of about 600 to about 60,000, including 5,000, 12,000, 20,000 and 25,000. Conjugates may also include mixtures of such water soluble polymers. Examples of conjugates include any of the antibodies disclosed herein and a polyalkyl oxide moiety attached at the N-terminus. PEG is one suitable polyalkyl oxide. As an illustration, any of the antibodies disclosed herein can be modified using PEG, a process known as "PEGylation". PEGylation can be performed by any PEGylation reaction known in the art (Francis GE et al., 1998). For example, PEGylation is carried out by means of an acylation reaction or an alkylation reaction using reactive polyethylene glycol molecules. Preferably, these modifications do not significantly affect the ability of the antibody to bind to human or macaque (e.g. cynomolgus monkey etc) CXCR5.

本発明もまた、上述のものと機能的に同等であるヒト及び/又はマカク(カニクイザル等)CXCR5に対する組換え抗体、又は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域などの抗体の一部を含む。向上された安定性及び/又は治療効果が改善する修飾された抗体、又はその一部もまた含まれる。修飾された抗体、又はその一部の例としては、著しく有害な抗原結合特性を変化させない、保存的アミノ酸残基の置換、及び、アミノ酸の1又は数個の欠損若しくは付加するものが含まれる。置換は、治療特性が維持されている限り、領域の再設計を完了するために1又は数個のアミノ酸残基を変化する、又は修飾する範囲にありうる。本発明の抗体、又はその一部は、翻訳後修飾され得る(例えば、アセチル化、酸化、脱アミノ化、ラセミ化及びリン酸化)、又は、合成的に修飾され得る(例えば、標識基の付加)。本発明の方法によって設計された、抗体、又はその一部は、実質的に抗原結合、又は他の免疫グロブリン機能に影響がない、追加的な保存的アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。   The present invention also relates to recombinant antibodies against human and / or macaque (Cynomolgus monkey etc) CXCR5 functionally equivalent to those described above, or antibodies such as variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions Including some. Also included are modified antibodies, or portions thereof, that improve the stability and / or the therapeutic effect. Examples of modified antibodies, or portions thereof, include conservative amino acid residue substitutions, and one or more amino acid deletions or additions that do not significantly alter the deleterious antigen binding properties. Substitutions can range from changing or modifying one or several amino acid residues to complete redesign of the region as long as the therapeutic properties are maintained. The antibodies of the invention, or parts thereof, may be post-translationally modified (eg acetylation, oxidation, deamination, racemization and phosphorylation), or may be synthetically modified (eg addition of labeling groups) ). It is understood that the antibodies, or parts thereof, designed by the methods of the present invention may have additional conservative amino acid substitutions which have substantially no effect on antigen binding or other immunoglobulin functions. Be done.

本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン(重及び/又は軽可変ドメイン)若しくはFab領域のような、抗体の一部は、誘導体を含み得る。例えば、しかし限定はしないが、誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/阻害基、タンパク分解切断、細胞性リガンド又は他のタンパクへの連結等による誘導体化によって、修飾された抗体、を含む。付加的に、誘導体は、一又は数個の非古典的及び/又は非天然アミノ酸を含んでもよい。本発明のモノクローナル抗体のin vivo半減期は、Fc領域とFcRn受容体の間の相互作用に関連することが同定されるアミノ酸残基の修飾(例えば、代替、欠損、又は付加)によって増大させることができる。   Some of the antibodies, such as the monoclonal antibodies of the invention, or variable domains (heavy and / or light variable domains) or Fab regions, may comprise derivatives. For example, but not limited to, derivatives are, for example, glycosylations, acetylations, pegylations, phosphorylations, amidations, known protecting / inhibiting groups, proteolytic cleavage, linking to cellular ligands or other proteins, etc. And antibodies modified by derivatization with Additionally, the derivative may comprise one or several non-classical and / or non-naturally occurring amino acids. In vivo half-life of the monoclonal antibody of the present invention is increased by modification (for example, substitution, deletion, or addition) of an amino acid residue identified to be associated with the interaction between Fc region and FcRn receptor Can.

学術論文又は要約、特許出願又は他の参考文献を含む、本明細書中で引用される全ての参考文献は、引用される参考文献中に提示される全てのデータ、表、図及びテキストを含む、本明細書中で参照として、全て援用される。追加的に、本明細書中で引用される参考文献中で引用される参考文献の全ての内容も、参照によって全て援用される。   All references cited herein, including scientific articles or abstracts, patent applications or other references, include all data, tables, figures and text presented in the cited references , All incorporated herein by reference. Additionally, the entire contents of all references cited in the references cited herein are also entirely incorporated by reference.

特定の実施形態の前述の説明は、他の者が、当該技術分野の技術内の知識(本明細書中で引用される参考文献の文脈を含む)を適用することによって、過度の実験をすること無く、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、容易に修正及び/又は適合することができる、本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。それゆえ、このような適用及び修正は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づき、開示された実施形態の均等の範囲内であることが意図される。本明細書の用語(phraseology)又は用語法(terminology)は、説明の目的であり、限定するものではないことが理解されるべきである。   The foregoing description of specific embodiments allows others to experiment excessively by applying knowledge within the skill of the art, including the context of the references cited herein. Without departing from the general concept of the invention, the general nature of the invention can be fully elucidated, which can be easily modified and / or adapted. Therefore, such applications and modifications are intended to be within the equivalent of the disclosed embodiments, based on the teachings and guidance provided herein. It is to be understood that the terms phraseology or terminology herein are for the purpose of description and not limitation.

図1は、可変重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示し、2つのバリアントの間のフレームワーク領域及びCDRのアミノ酸配列と、ヒト生殖系列免疫グロブリン重可変3−23(IGHV3−23*01)及びヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖結合グループ4(IGHJ4*02)との違いを示す。FIG. 1 shows the alignment of the amino acid sequences of the variable regions of the variable heavy chain, the amino acid sequences of the framework regions and CDRs between the two variants, and human germline immunoglobulin heavy variable 3-23 (IGHV 3-23 * 01 And human germline immunoglobulin heavy chain binding group 4 (IGHJ4 * 02). 図2は、可変軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示し、3つのバリアントの間のフレームワーク領域及びCDRのアミノ酸配列と、ヒト生殖系列免疫グロブリン軽可変1−27(IGKV1−27*01)及びヒト生殖系列免疫グロブリンカッパ結合グループ5(IGKJ5*01)の違いを示す。FIG. 2 shows an alignment of the amino acid sequences of the variable regions of the variable light chain, the amino acid sequences of the framework regions and CDRs between the three variants, and human germline immunoglobulin light variable 1-27 (IGKV1-27 * 01 And human germline immunoglobulin kappa binding group 5 (IGKJ5 * 01). 40C01mAbの3形態(40C01VH−VL、40C01VH1−Vk1及び40C01VH1−Vk2)に対するDSC解析結果。4つの完全ヒトIgG1抗体、抗−CXCR5 40C01親分子(40C01 VH−VL)、軽鎖変異体1(VH1−Vk1)と対になった抗CXCR−5 40C01重鎖変異体1、軽鎖変異体2と対になった抗−CXCR5 40C01重鎖変異体1、及びアイソタイプコントロールの熱アンフォールディング曲線。Fabアンフォールディング遷移が高度に可変である一方、4つのIgG1構築物の全てについてのCH2及びCH3ドメインのアンフォールディング遷移は、同一である。DSC analysis results for three forms of 40C01 mAb (40C01VH-VL, 40C01VH1-Vk1 and 40C01VH1-Vk2). Four fully human IgG1 antibodies, anti-CXCR540C01 parent molecule (40C01 VH-VL), anti-CXCR-5 40C01 heavy chain variant 1 paired with light chain variant 1 (VH1-Vk1), light chain variant Thermal unfolding curves of anti-CXCR5 40C01 heavy chain variant 1 paired with 2 and isotype control. While the Fab unfolding transition is highly variable, the unfolding transition of the CH2 and CH3 domains for all four IgG1 constructs is identical. 40C01 VH1−Vk3及び40C01VH2−Vk3変異体について得られたサーモプロファイル。3つの完全ヒトIgG1抗体、軽鎖変異体3(VH1−Vk3)と対をなした抗−CXCR5 40C01重鎖変異体1、軽鎖変異体3(VH−Vk3)と対をなした抗−CXCR5 40C01重鎖変異体2及びアイソタイプコントロールの熱アンフォールディング曲線。抗−CXCR5 40C01変異体の両者に対するFabアンフォールディング遷移が、アイソタイプコントロールに対するものよりも、高い(80℃以上)一方、4つのIgG1構築物の全てについてのCH2及びCH3ドメインのアンフォールディング遷移は、同一である。Thermo profiles obtained for 40C01 VH1-Vk3 and 40C01VH2-Vk3 variants. Three fully human IgG1 antibodies, anti-CXCR5 40C01 paired with light chain variant 3 (VH1-Vk3), anti-CXCR5 paired with light chain variant 3 (VH-Vk3) Thermal unfolding curves of 40C01 heavy chain variant 2 and isotype control. While Fab unfolding transitions for both anti-CXCR5 40C01 variants are higher (over 80 ° C.) than for isotype controls, the unfolding transitions of the CH2 and CH3 domains for all four IgG1 constructs are identical is there. IgG1、IgG2及びIgG4の軽視での全抗体を発現する抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3及び40C01−VH2−Vk3変異体による、ヒト(パネルA〜F)及びカニクイザル(G〜H)CXCR5発現L1.2細胞のCXCL13が刺激する走行性の阻害。結果は、基礎活性(培地のみ)及び、10nM CXCL13で得られる最大反応(100%)で正規化された。表示されるデータは、3回の独立した実験の代表である。全ての点において、3連で行った(エラーバーは、+/−S.E.Mを示す)。Human (panels A to F) and cynomolgus monkey (G to H) CXCR5 expressing L1. Anti-CXCR5 40 C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 variants expressing whole antibodies with slight vision of IgG1, IgG2 and IgG4 Inhibition of motility stimulated by two cells of CXCL13. Results were normalized with basal activity (medium only) and maximal response (100%) obtained with 10 nM CXCL13. Data displayed are representative of three independent experiments. In all points, triplicates were performed (error bars indicate +/- S.E.M.). IgG1、IgG2及びIgG4の軽視での全抗体を発現する抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3及び40C01−VH2−Vk3変異体による、ヒト(パネルA〜F)及びカニクイザル(G〜H)CXCR5発現L1.2細胞のCXCL13が刺激する走行性の阻害。結果は、基礎活性(培地のみ)及び、10nM CXCL13で得られる最大反応(100%)で正規化された。表示されるデータは、3回の独立した実験の代表である。全ての点において、3連で行った(エラーバーは、+/−S.E.Mを示す)。Human (panels A to F) and cynomolgus monkey (G to H) CXCR5 expressing L1. Anti-CXCR5 40 C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 variants expressing whole antibodies with slight vision of IgG1, IgG2 and IgG4 Inhibition of motility stimulated by two cells of CXCL13. Results were normalized with basal activity (medium only) and maximal response (100%) obtained with 10 nM CXCL13. Data displayed are representative of three independent experiments. In all points, triplicates were performed (error bars indicate +/- S.E.M.). 図6は、IgG1のような全体の抗体形式で発現された抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3(パネルA)及び40C01−VH2−Vk3(パネルB)変異体により引き起こされる、ヒトCXCL13で刺激された初代ヒトB細胞の走行性の阻害の代表的な例を示す。結果は、IC50(半最大阻害濃度)として示される。値は、それぞれ、8回(40C01−VH1−Vk3)及び5回(40C01−VH2−Vk3)の独立した実験の平均+/−S.E.Mである。FIG. 6 shows human CXCL13 stimulated by anti-CXCR540C01-VH1-Vk3 (panel A) and 40C01-VH2-Vk3 (panel B) variants expressed in whole antibody format such as IgG1 Representative examples of motility inhibition of primary human B cells are shown. The results are presented as IC 50 (half maximal inhibitory concentration). Values are means +/- SD of 8 (40C01-VH1-Vk3) and 5 (40C01-VH2-Vk3) independent experiments, respectively. E. It is M. ヒトCXCR5を安定的にトランスフェクトされたHEK−293Tに対するAlexa−Fluror647標識抗−CXCR5 40C01変異体の結合Binding of Alexa-Fluror 647 labeled anti-CXCR5 40C01 mutant to HEK-293T stably transfected with human CXCR5 全血中のヒトB細胞に対するAlexa−Fluror647標識抗−CXCR5Alexa-Fluror 647 labeled anti-CXCR5 against human B cells in whole blood 全血中のカニクイザルB細胞に対する抗−CXCR5 40C01変異体の結合Binding of anti-CXCR5 40C01 variants to cynomolgus monkey B cells in whole blood 抗−CXCR5mAbによるヒト全血中のB細胞のCXCL13が刺激するERKリン酸化の阻害Inhibition of CXCL13-stimulated ERK phosphorylation of B cells in human whole blood by anti-CXCR5 mAb 抗−CXCR5mAbによるカニクイザル全血中のB細胞のCXCL13が刺激するERKリン酸化の阻害Inhibition of CXCL13-stimulated ERK phosphorylation of B cells in cynomolgus monkey whole blood by anti-CXCR5 mAb KinExA方法論を用いた、CXCR5発現細胞膜に対する、抗CXCR5mAb 40C01−VH1−Vk3変異体のKDの決定。CXCR5−HEK−293細胞(5×106/mL)は連続的に希釈され、0.02%NaN3の存在下において、抗CXCR5mAb 40C01−VH1−Vk3の活性化結合サイト濃度、30pM(黒菱形)又は300pM(白丸)と共にインキュベートされ、平衡化させた。上清中に残存したフリーのmAbを測定した。(A)抗原濃度に対するフリーmAbの%がプロットされている(10-9M抗原と等しくなるように任意に各100万細胞を採取)。未知の抗原を使用した複数の曲線分析(「n−曲線解析」)が、KD及び抗原乗数(antigen multiplier)に対する最適な値を決定するために実施された(それぞれ、B及びC)。95%信頼区間は、最適な値における他のパラメータは維持する一方、KD又は抗原乗数(antigen multiplier)に対する最適な値の反復した変化によって決定された。Using KinExA methodology for CXCR5 expression cell membrane, determining a K D of anti CXCR5mAb 40C01-VH1-Vk3 mutants. CXCR5-HEK-293 cells (5 × 10 6 / mL) were serially diluted, and in the presence of 0.02% NaN 3 , the activation binding site concentration of anti-CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3, 30 pM (black diamond Or equilibrated with 300 pM (open circles). The free mAb remaining in the supernatant was measured. (A) The% of free mAb against the antigen concentration is plotted (any one million cells are randomly picked to be equal to 10 -9 M antigen). A plurality of curve analysis using an unknown antigen ( "n- curve analysis") were conducted to determine the optimum values for K D and antigen multiplier (Antigen multiplier) (respectively, B and C). The 95% confidence intervals were determined by repeated changes of the optimal value to the K D or antigen multiplier while maintaining other parameters at the optimal value. KinExA方法論を用いた、CXCR5発現細胞膜に対する、抗−CXCR5mAb 40C01−VH2−Vk3変異体のKDの決定。CXCR5−HEK−293細胞(5×106/mL)は連続して希釈され、0.02%NaN3の存在下で、抗CXCR5mAb 40C01−VH1−Vk3の活性化結合サイト濃度、100pM(黒菱形)又は1nM(白丸)と共にインキュベートされ、平衡化させた。上清中に残存したフリーのmAbを測定した。(A)抗原濃度に対するフリーmAbの%がプロットされている(10-9M抗原と等しくなるように任意に各100万細胞を採取)。未知の抗原を使用した複数の曲線分析(「n−曲線解析」)が、KD及び抗原乗数(antigen multiplier)に対する最適な値を決定するために実施された(それぞれ、B及びC)。95%信頼区間は、最適な値における他のパラメータは維持する一方、KD又は抗原乗数(antigen multiplier)に対する最適な値の反復した変化によって決定された。Using KinExA methodology for CXCR5 expression cell membrane, determining a K D of anti -CXCR5mAb 40C01-VH2-Vk3 mutants. CXCR5-HEK-293 cells (5 × 10 6 / mL) were serially diluted, and in the presence of 0.02% NaN 3 , the activation binding site concentration of anti-CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3, 100 pM (black diamond Or equilibrated with 1 nM (open circles). The free mAb remaining in the supernatant was measured. (A) The% of free mAb against the antigen concentration is plotted (any one million cells are randomly picked to be equal to 10 -9 M antigen). A plurality of curve analysis using an unknown antigen ( "n- curve analysis") were conducted to determine the optimum values for K D and antigen multiplier (Antigen multiplier) (respectively, B and C). The 95% confidence intervals were determined by repeated changes of the optimal value to the K D or antigen multiplier while maintaining other parameters at the optimal value. 51Cr標識ヒトB細胞を標的とする末梢血単核球(PBMC)から精製したヒトNK細胞の抗−CXCR5媒介抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)。Anti-CXCR5 mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of human NK cells purified from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) targeting 51Cr labeled human B cells. ヒト(パネルA)又はカニクイザル(パネルB)CXCR5のいずれかを発現する51CR標識L1.2細胞を標的とするヒトPBMCの抗CXCR5媒介ADCC。同様のエフェクター/標的細胞の混合物は、同じアッセイ条件の下、標準のグリコシル化コンテント(40C01−VH1−Vk3−IgG1)若しくは、アフコシル化抗体(40DC01−VH1−Vk3−IgG1低フコース)のいずれかとして準備された抗−CXCR5mAbとインキュベートされた。Anti-CXCR5 mediated ADCC of human PBMC targeting 51CR labeled L1.2 cells expressing either human (panel A) or cynomolgus monkey (panel B) CXCR5. A mixture of similar effector / target cells either as standard glycosylation content (40C01-VH1-Vk3-IgG1) or as an afucosylated antibody (40DC01-VH1-Vk3-IgG1 low fucose) under the same assay conditions Incubated with prepared anti-CXCR5 mAb. 抗−CXCR5抗体によってインキュベートされたヒトB細胞の除去。ヒトPBMC(5×106/mL)は、示された抗体の濃度の範囲の存在にて、一晩培養された。リンパ球ゲートにおけるCD19+の割合は、5人のドナーからフローサイトメトリーを用いて評価された。データは、アイソタイプコントロールに対するドナーごとに正規化され、5人のドナーを統合した(POC=percent of control)。平均±SEMが示されている。Removal of human B cells incubated with anti-CXCR5 antibody. Human PBMC (5 × 10 6 / mL) were cultured overnight in the presence of the indicated concentration range of antibody. The percentage of CD19 + in lymphocyte gates was assessed using flow cytometry from 5 donors. Data were normalized for each donor to isotype control and integrated 5 donors (POC = percent of control). Mean ± SEM is shown.

<配列の説明>
配列番号:1:mAb 40C01及び12A01に対する可変重鎖(アミノ酸配列)
配列番号:2:mAb 40C01に対する可変軽鎖(アミノ酸配列)
配列番号:3:mAb 40C01−VH1に対する可変重鎖(アミノ酸配列)
配列番号:4:mAb 40C01−VH2に対する可変重鎖(アミノ酸配列)
配列番号:5:mAb 40C01−Vk1に対する可変軽鎖(アミノ酸配列)
配列番号:6:mAb 40C01−Vk2に対する可変軽鎖(アミノ酸配列)
配列番号:7:mAb 40C01−Vk3に対する可変軽鎖(アミノ酸配列)
配列番号:8〜19:mAb 40C01シリーズのCDR配列(アミノ酸配列)
配列番号:20〜34:mAb 40C01シリーズのFR配列(アミノ酸配列)
配列番号:35:ヒトCXCR5(アミノ酸配列)
配列番号:36:カニクイザルCXCR5(アミノ酸配列)
配列番号:37:アカゲザルCXCR5(アミノ酸配列)
配列番号:38:重鎖定常領域−ヒトIgG1、アロタイプG1m(f)(アミノ酸配列)
配列番号:39:重鎖定常領域−ヒトIgG2 DI−NQ−HC2hサブタイプ(アミノ酸配列)
配列番号:40:重鎖定常領域−ヒトIgG4 S228P−R409Kサブタイプ(アミノ酸配列)
配列番号:41:mAb 40C01に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:42:mAb 40C01に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:43:mAb 40C01−VH1に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜57は、リーダー配列をコードする。
配列番号:44:mAb 40C01−VH1に対する可変重鎖(コドン最適化核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜57は、リーダー配列をコードする。
配列番号:45:mAb 40C01−VH2に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜57は、リーダー配列をコードする。
配列番号:46:mAb 40C01−VH2に対する可変重鎖(コドン最適化核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜57は、リーダー配列をコードする。
配列番号:47:mAb 40C01−Vk1に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:48:mAb40C01−Vk2に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:49:mAb40C01−Vk3に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:50:mAb40C01−Vk3に対する可変軽鎖(コドン最適化核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:51:mAb最適化42F03に対する可変重鎖。
配列番号:52:mAb最適化42F03に対する可変軽鎖。
配列番号:53:mAb 80A10に対する可変重鎖。
配列番号:54:mAb 80A10に対する可変軽鎖。
配列番号:55:mAb 80A11に対する可変重鎖。
配列番号:56:mAb 80A11に対する可変軽鎖。
配列番号:57:mAb 80B09に対する可変重鎖。
配列番号:58:mAb 80B09に対する可変軽鎖。
配列番号:59:mAb 80D11に対する可変重鎖。
配列番号:60:mAb 80D11に対する可変軽鎖。
配列番号:61:mAb 42F03に対する可変重鎖。
配列番号:62:mAb 42F03に対する可変軽鎖。
配列番号:63:軽鎖定常領域−ラムダ定常遺伝子3(アミノ酸配列)。
配列番号:64:軽鎖定常領域−カッパユニーク定常遺伝子(アミノ酸配列)。
配列番号:65:mAb 12A01に対する可変軽鎖。
配列番号:66:mAb最適化42F03に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:67:mAb最適化42F03に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:68:mAb 80A10に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜75は、リーダー配列をコードする。
配列番号:69:mAb 80A10に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:70:mAb 80A11に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:71:mAb 80A11に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:72:mAb 80B09に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:73:mAb 80B09に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:74:mAb 80D11に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜75は、リーダー配列をコードする。
配列番号:75:mAb 80D11に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:76:mAb 42F03に対する可変軽鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜63は、リーダー配列をコードする。
配列番号:77:mAb 42F03に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:78:mAb 12A01に対する可変重鎖(核酸配列)。この配列のヌクレオチド1〜60は、リーダー配列をコードする。
配列番号:79:mAb 40C01−VH1−IgG1に対する可変重鎖(アミノ酸配列)
配列番号:80:mAb 40C01−VH1−IgG2_DI−NQ−HC2h−サブタイプに対する重鎖(アミノ酸配列)
配列番号:81:mAb 40C01−Vk3−c−カッパに対する軽鎖(アミノ酸配列)
<Description of array>
SEQ ID NO: 1: Variable heavy chain (amino acid sequence) to mAbs 40C01 and 12A01
SEQ ID NO: 2: variable light chain (amino acid sequence) for mAb 40C01
SEQ ID NO: 3: Variable heavy chain (amino acid sequence) to mAb 40C01-VH1
SEQ ID NO: 4: Variable heavy chain (amino acid sequence) to mAb 40C01-VH2
SEQ ID NO: 5: Variable light chain (amino acid sequence) for mAb 40C01-Vk1
SEQ ID NO: 6: Variable light chain (amino acid sequence) to mAb 40C01-Vk2
SEQ ID NO: 7: Variable light chain (amino acid sequence) for mAb 40C01-Vk3
SEQ ID NOs: 8-19: CDR sequences (amino acid sequences) of mAb 40C01 series
SEQ ID NOs: 20-34: FR sequences (amino acid sequences) of mAb 40C01 series
SEQ ID NO: 35: human CXCR5 (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 36: cynomolgus monkey CXCR5 (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 37: Rhesus monkey CXCR5 (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 38: heavy chain constant region-human IgG1, allotype G1 m (f) (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 39: heavy chain constant region-human IgG2 DI-NQ-HC2h subtype (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 40: heavy chain constant region-human IgG4 S228P-R409K subtype (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 41: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 42: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 43: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01-VH1. Nucleotides 1-57 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 44: Variable heavy chain (codon optimized nucleic acid sequence) to mAb 40C01-VH1. Nucleotides 1-57 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 45: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01-VH2. Nucleotides 1-57 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 46: Variable heavy chain (codon optimized nucleic acid sequence) to mAb 40C01-VH2. Nucleotides 1-57 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 47: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01-Vk1. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 48: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01-Vk2. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 49: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 40C01-Vk3. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 50: Variable light chain (codon optimized nucleic acid sequence) to mAb 40 C 01-Vk3. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 51: Variable heavy chain to mAb optimized 42F03.
SEQ ID NO: 52: Variable light chain to mAb optimized 42F03.
SEQ ID NO: 53: Variable heavy chain to mAb 80A10.
SEQ ID NO: 54: Variable light chain for mAb 80A10.
SEQ ID NO: 55: Variable heavy chain to mAb 80A11.
SEQ ID NO: 56: Variable light chain to mAb 80A11.
SEQ ID NO: 57: Variable heavy chain to mAb 80B09.
SEQ ID NO: 58: Variable light chain to mAb 80B09.
SEQ ID NO: 59: Variable heavy chain for mAb 80D11.
SEQ ID NO: 60: Variable light chain to mAb 80D11.
SEQ ID NO: 61: Variable heavy chain to mAb 42F03.
SEQ ID NO: 62: Variable light chain to mAb 42F03.
SEQ ID NO: 63: light chain constant region-lambda constant gene 3 (amino acid sequence).
SEQ ID NO: 64: light chain constant region-kappa unique constant gene (amino acid sequence).
SEQ ID NO: 65: Variable light chain to mAb 12A01.
SEQ ID NO: 66: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb optimized 42F03. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 67: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb optimized 42F03. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 68: Variable light chain for mAb 80A10 (nucleic acid sequence). Nucleotides 1 to 75 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 69: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 80A10. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 70: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 80A11. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 71: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 80A11. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 72: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 80B09. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 73: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 80B09. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 74: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 80D11. Nucleotides 1 to 75 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 75: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 80D11. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 76: Variable light chain (nucleic acid sequence) to mAb 42F03. Nucleotides 1-63 of this sequence encode a leader sequence.
SEQ ID NO: 77: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 42F03. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 78: Variable heavy chain (nucleic acid sequence) to mAb 12A01. Nucleotides 1 to 60 of this sequence encode the leader sequence.
SEQ ID NO: 79: Variable heavy chain (amino acid sequence) to mAb 40C01-VH1-IgG1
SEQ ID NO: 80: heavy chain for the mAb 40C01-VH1-IgG2_DI-NQ-HC2h-subtype (amino acid sequence)
SEQ ID NO: 81: light chain (amino acid sequence) for mAb 40C01-Vk3-c-kappa

<実施例1−発見>
1.1.ヒト及びマカクCXCR5発現安定細胞株の製造
ヒトCXCR5をコードするコドン最適化DNA(NCBI参考文献 NM_001716.3、配列番号:35のアミノ酸配列をコードする)、及び、カニクイザル(Macaca fascicularis)CXCR5(配列番号:36参照)は、C末端タグ有り又は無しで遺伝子合成によって製造された。カニクイザルCXCR5に対する配列は、公的データベースでは入手できなかった。cDNA配列は、それゆえ、ヒトCXCR5及びアカゲザル(Macaca mulatta)(NCBI参照 XM_001100017.2、配列番号:37のアミノ酸配列をコードする)を基にした縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRにより、カニクイザル脾臓DNA(Biochain社より購入した)からクローン化した。全長DNAは、哺乳類細胞発現ベクターpcDNA4(Invitrogen社)へサブクローニングされた。コドン最適化hCXCR5を過剰発現する安定な細胞株:チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−hCXCR5;イヌ胸腺細胞株Cf2Th−hCXCR5;ハムスター線維芽細胞株R1610−hCXCR5;ヒト胎児腎臓細胞株HEK293−hCXCR5、及び、コドン最適化カニクイザルCXCR5:チャイニーズハムスター卵巣細胞cCXCR5−CHOは、ジーンポーター(Genlantis社)等の市販のトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションすることによって得られた。トランスフェクトされたCXCR5遺伝子が発現する細胞は、ネオマイシン(G418)で選択された。ネオマイシン耐性で、細胞表面上に高レベルのCXCR5を発現する安定なクローンは、市販の抗−CXCR5mAb(mAb 190、R&D systems社)を使用したFACS解析によって同定された。
Example 1 Discovery
1.1. Production of human and macaque CXCR5 expressing stable cell lines Codon-optimized DNA encoding human CXCR5 (NCBI reference NM_001716.3, encoding amino acid sequence of SEQ ID NO: 35), and cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) CXCR5 (SEQ ID NO: 36) were produced by gene synthesis with or without C-terminal tag. Sequences for cynomolgus monkey CXCR5 were not available in public databases. The cDNA sequence is thus RT-derived using degenerate oligonucleotide primers based on human CXCR5 and Rhesus monkey (Macaca mulatta) (NCBI reference XM_001100017.2, encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37). It was cloned from cynomolgus monkey spleen DNA (purchased from Biochain) by PCR. The full-length DNA was subcloned into mammalian cell expression vector pcDNA4 (Invitrogen). Stable cell line overexpressing codon optimized hCXCR5: Chinese hamster ovary cell CHO-hCXCR5; canine thymocyte cell line Cf2Th-hCXCR5; hamster fibroblast cell line R1610-hCXCR5; human fetal kidney cell line HEK293-hCXCR5, and codon Optimized cynomolgus monkey CXCR5: Chinese hamster ovary cells cCXCR5-CHO were obtained by transfection using a commercially available transfection reagent such as Gene Porter (Genlantis). Cells expressing the transfected CXCR5 gene were selected with neomycin (G418). Stable clones that are neomycin resistant and express high levels of CXCR5 on the cell surface were identified by FACS analysis using commercially available anti-CXCR5 mAb (mAb 190, R & D systems).

1.2.CXCR5を発現する常磁性プロテオリポソーム(PMPLs)の調整
ヒト又はカニクイザルCXCR5を含む常磁性プロテオリポソーム(Paramagnetic Proteoliposomes、PMPLs)は、Mirzabekovら(2000)に記載された方法に基づいたMSMが所有する技術を使用したMSMタンパク技術によって調整された。簡潔には、CXCR5を過剰発現した細胞を集め、細胞の膜を界面活性剤の独自の混合物中で溶解した。非多孔性の常磁性ビーズの表面に、ストラプトアビジンとCXCR5条のC末端タグを認識知る抗体とを共有結合させた。結合させたビーズは、可溶化した細胞溶解物からC末端にタグ化されたCXCR5を捕捉するために使用された。汚染物質を除去するために、徹底的に洗浄した後、ビーズは、0.1〜1%のビオチン化DOPEを含有する界面活性剤で可溶化した脂質と混合した。ビーズの周りに脂質二重膜が自己集合し、CXCR5が天然の環境へと戻る間に、界面活性剤は透析によって除去される。市販の抗−CXCR5−PE結合抗体(R&D systems社)は、Guava(登録商標)easyCyteフローサイトメトリー(ミリポア社)によって、正しい配置においてCXCR5が含まれたビーズであるか(すなわち、ビーズの表面において露出された細胞外部分)を証明するために使用された。hCXCR5−PMPLを製造するために使用された条件は、カニクイザルCXCR5に対するPMPLsを製造するためにも使用された。
1.2. Preparation of Paramagnetic Proteoliposomes (PMPLs) Expressing CXCR5 Paramagnetic Proteoliposomes (PMPLs), including human or cynomolgus CXCR5, possess MSM-owned techniques based on the method described by Mirzabekov et al. (2000) Adjusted by the MSM protein technology used. Briefly, cells overexpressing CXCR5 were collected and the cell membranes were lysed in a unique mixture of detergents. Streptavidin was covalently attached to the surface of nonporous paramagnetic beads with an antibody that recognizes the C-terminal tag of CXCR5 strip. Bound beads were used to capture C-terminally tagged CXCR5 from solubilized cell lysates. After extensive washing to remove contaminants, the beads were mixed with detergent solubilized lipid containing 0.1-1% biotinylated DOPE. The surfactant is removed by dialysis while the lipid bilayer membrane self assembles around the beads and CXCR5 returns to its natural environment. Is the commercially available anti-CXCR5-PE conjugated antibody (R & D systems) a bead containing CXCR5 in the correct configuration by Guava® easyCyte flow cytometry (Millipore) (ie on the surface of the bead Was used to demonstrate the exposed extracellular portion). The conditions used to produce hCXCR5-PMPL were also used to produce PMPLs to cynomolgus monkey CXCR5.

1.3.ファージディスプレイ技術を使用した抗−CXCR5抗体の製造
ファージディスプレイ技術は、標的とするCXCR5を生じるPMPLを用いて、DYAX社のヒトFab−ファージ410抗体ライブラリーから、CXCR5に対する中和抗体を同定するために使用された。ヒト及びカニクイザルCXCR5に対する選択の変更するラウンドを採用し、特異的にヒトCXCR5に結合するFab(4〜5ラウンドの選択)若しくはヒト及びカニクイザルCXCR5に結合する交差反応性Fabを選択するために、いくつかの異なる選択目的が採られた。
1.3. Production of Anti-CXCR5 Antibodies Using Phage Display Technology Phage display technology is used to identify neutralizing antibodies against CXCR5 from the human Fab-phage 410 antibody library from DYAX using PMPL to generate targeted CXCR5 Used for Adopting changing rounds of selection against human and cynomolgus monkey CXCR5, how many Fabs to select specifically for human CXCR5 binding (4-5 rounds of selection) or cross reactive Fabs binding to human and cynomolgus CXCR5 Some different selection objectives were taken.

ラウンド3セレクションの結果から約9535クローン単離されたFabが、発現ベクターpXP1s−SacB(DYAX社)へ再フォーマットされ、本質的には、Hoetら(2005)が以前記載したように、大腸菌BL21Gold細胞にて、96又は24ウェルプレートにて、IPTG(100μM)を用いて18時間インキュベートして、発現させた。可溶の分泌されたFabを含む培養液は、ヒト又はカニクイザル過剰発現CXCR5細胞株と40分間室温にてインキュベートすることによってスクリーニングされた。結合していないFabは洗浄され、そして細胞は、抗−c−Mycマウスモノクローナル抗体(9E10)を用いて室温にて20分間インキュベートされた。非結合抗体は、洗い流され、細胞は、抗−マウスIgG−PE標識二次抗体で、20分間室温にてインキュベートされた。細胞は2度洗浄され、固定され、Guava(登録商標)FACSプレートリーダーを用いて解析された。   From the results of round 3 selection, the approximately 9535 cloned isolated Fabs were reformatted into the expression vector pXP1s-SacB (DYAX), essentially as described by Hoet et al. (2005), in E. coli BL21 Gold cells. At 96 or 24 well plates, expression was carried out by incubating for 18 hours with IPTG (100 μM). Media containing soluble secreted Fabs were screened by incubation with human or cynomolgus monkey overexpressing CXCR5 cell lines for 40 minutes at room temperature. Unbound Fab was washed and cells were incubated with anti-c-Myc mouse monoclonal antibody (9E10) for 20 minutes at room temperature. Unbound antibody was washed away and cells were incubated with anti-mouse IgG-PE labeled secondary antibody for 20 minutes at room temperature. Cells were washed twice, fixed and analyzed using a Guava® FACS plate reader.

ヒト−カニクイザルCXCR5と交差反応を示す973クローンが同定された。シークエンス解析上、168のユニークな配列が同定され、46はユニークな重鎖CDR3配列を有していた(データは示さず)。全ての対象のクローンは、哺乳類細胞発現ベクターpTT5(カナダ国立研究評議会(National Research Council of Canada)、出願US20110039339参照)に完全ヒトIgGとして再フォーマットされ、HEK293にて一時的に発現され、細胞ベースアッセイでテストするために精製された。   973 clones were identified that cross-react with human cynomolgus monkey CXCR5. Sequence analysis identified 168 unique sequences and 46 had unique heavy chain CDR3 sequences (data not shown). All target clones are reformatted as fully human IgG in mammalian cell expression vector pTT5 (see National Research Council of Canada, application US20110039339), transiently expressed in HEK 293, cell based Purified for testing in the assay.

1.4.抗体発現及び精製
抗体重鎖及び軽鎖は、別々にpTT5ベクターへとサブクローニングされ、ポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションした後、懸濁培養に適したHEK293T細胞中にて一時的に共発現させた。細胞は、5%CO2の加湿したインキュベータにて、37℃で振盪して3日間インキュベートされた。培養上清が回収され、細胞破片(deris)を除去するために遠心分離された。抗体は、通常の方法を使用して、プロテインAアフィニティ−クロマトグラフィーによって細胞上清から精製され、セファデックスG25で脱塩され、TBS中で調整されるFLIPRカルシウムアッセイを除き、全てのアッセイのために、抗体はPBS中で調整された。大量の抗体調整のために(>400mLの培養物)、凝集物を除くために、追加的なサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)工程がSuperdex−200樹脂上で実施された。以下のQC解析は、精製されたタンパク上で実施された:還元、非還元条件下でのSDS−PAGE:純度及び見せかけのMWの決定のためのSEC;濃度決定のためのUV分光。エンドトキシンの混入の測定は、Endosafe PTSアッセイを使用して実施された。1〜5mgの精製された抗体が、一般的には、50mL培養物より得られた。
1.4. Antibody Expression and Purification Antibody heavy and light chains are separately subcloned into pTT5 vector, transfected using polyethylenimine (PEI) transfection reagent and then transiently transfected into HEK293T cells suitable for suspension culture. Were coexpressed. The cells were incubated for 3 days with shaking at 37 ° C. in a 5% CO 2 humidified incubator. Culture supernatants were collected and centrifuged to remove cell debris (deris). Antibodies are purified from cell supernatants by protein A affinity chromatography using routine methods, desalted with Sephadex G25, and prepared in TBS for all assays except the FLIPR calcium assay The antibodies were adjusted in PBS. An additional size exclusion chromatography (SEC) step was performed on Superdex-200 resin to remove aggregates for bulk antibody preparation (> 400 mL culture). The following QC analysis was performed on the purified protein: SDS-PAGE under reducing, non-reducing conditions: SEC for determination of purity and sham MW; UV spectroscopy for concentration determination. Measurement of endotoxin contamination was performed using the Endosafe PTS assay. 1-5 mg of purified antibody was generally obtained from a 50 mL culture.

1.5.抗−CXCR5 Fabに対する細胞ベース結合アッセイ
ヒトCXCR5又は種オーソログを発現する細胞株及び初代細胞への抗−CXCR5抗体の結合は、FACSによって評価された。簡潔には、約1×105CXCR5発現細胞は、0〜100μg/mLの範囲で抗−CXCR5抗体の増加する濃度を含むFACSバッファー(1%FBS及び0.02%アジ化ナトリウム含有PBS)にて懸濁し、4℃で20分インキュベートした。細胞は、洗浄され、その後、PE標識したヤギ抗−ヒトIgG(Jackson labs社)を含むFACSバッファー中にて20分間4℃で再懸濁した。細胞はその後3回洗浄され、100μLのFACSバッファーに再懸濁され、FACScalibur装置(BD Sciences社)にて解析された。抗体濃度に対するMFIがプロットされ、EC50値を算出するためにグラフパッドプリズムソフトウエアが使用された。mAb 80A11、80A10、80B09は、ヒトCXCR5に対して高い特異性があった(データ示さず)。42F03、12A01、40C01及び80DNA11は、ヒト及びカニクイザルCXCR5の両方に結合しした(データ示さず)。実施例1.3にて同定された抗体は、ラット又はマウスCXCR5に交差反応しなかった。
1.5. Cell-Based Binding Assay to Anti-CXCR5 Fab The binding of anti-CXCR5 antibody to cell lines expressing primary CXCR5 or species orthologs and to primary cells was assessed by FACS. Briefly, approximately 1 × 10 5 CXCR5 expressing cells are in FACS buffer (PBS containing 1% FBS and 0.02% sodium azide) containing increasing concentrations of anti-CXCR5 antibody in the range of 0-100 μg / mL. Suspended and incubated at 4 ° C. for 20 minutes. The cells were washed and then resuspended at 4 ° C. for 20 minutes in FACS buffer containing PE-labeled goat anti-human IgG (Jackson labs). The cells were then washed 3 times, resuspended in 100 μL FACS buffer and analyzed on a FACScalibur instrument (BD Sciences). MFI was plotted against antibody concentration and GraphPad Prism software was used to calculate EC 50 values. mAbs 80A11, 80A10, 80B09 were highly specific for human CXCR5 (data not shown). 42F03, 12A01, 40C01 and 80 DNA11 bound to both human and cynomolgus monkey CXCR5 (data not shown). The antibodies identified in Example 1.3 did not cross react with rat or mouse CXCR5.

1.6.FLIPRカルシウム動員(mobilization)アッセイ
CXCR5発現細胞におけるCXCL13によって誘導される細胞内カルシウムの動員(カルシウム流入)を阻害するための抗−CXCR5の能力は、カルシウム5アッセイキット(Molecular Devices社)を使用したFLIPRアッセイで決定された。R1610−hCXCR5細胞は、96ウェル平底組織培養プレートにCHO−S−SFM II無血清培地(Gibco社)を用いてウェルあたり40,000〜60,000細胞を播種し、加湿された5%CO2インキュベータ中にて細胞がウェルの底へ接着して100%近くのコンフルエントの単層を形成するように37℃で一晩培養した。細胞は、キット製造業者のプロトコールに従って、色素を載せ、その後、濃度増加した抗−CXCR5抗体(1μMまで)と1時間37℃でプレインキュベートし、洗浄し、その後、130nMのCXCL13に暴露した。カルシウムの流入の変化は、Molecular Devices社のFLEXstation III 装置で測定した。実施例1.5で同定された全ての抗体は、CXCL13が誘導する細胞内カルシウム流入を阻害することができた(データ示さず)。
1.6. FLIPR Calcium Mobilization Assay The ability of anti-CXCR5 to inhibit CXCL13-induced intracellular calcium mobilization (calcium influx) in CXCR5 expressing cells was determined using the calcium 5 assay kit (Molecular Devices) FLIPR It was determined in the assay. R1610-hCXCR5 cells were seeded in 96-well flat bottom tissue culture plates using CHO-S-SFM II serum free medium (Gibco) at 40,000 to 60,000 cells per well and humidified 5% CO2 incubator The cells were cultured overnight at 37 ° C. so that the cells adhered to the bottom of the wells to form near 100% confluent monolayers. Cells were loaded with dye according to the kit manufacturer's protocol and then pre-incubated with increasing concentrations of anti-CXCR5 antibody (to 1 μM) for 1 hour at 37 ° C., washed and then exposed to 130 nM CXCL13. Changes in calcium flux were measured with a Molecular Devices FLEXstation III instrument. All antibodies identified in Example 1.5 were able to inhibit CXCL13 induced intracellular calcium influx (data not shown).

1.7.走行性アッセイ
CXCR5を過剰発現するL1.2細胞のCXCL13が誘導する遊走を阻害する抗−CXCR5抗体の能力は、走行性アッセイシステムにて決定した。ヒト又はカニクイザルCXCR5を安定的にトランスフェクトしたマウス プレB細胞株L1.2は、この目的のために作製された。5%の熱失活したFCS、2mMグルタミン、及び50μMメルカプトエタノールを含むRPMI培地中にて維持されたL1.2細胞は、哺乳類細胞発現ベクターpcDNA3.1hygro DEST(Invitrogens社)へクローン化されたヒト又はカニクイザルCXCR5cDNAをエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた。CXCR5発現細胞は、600μg/mLハイグロマイシンを含む培地中で選択され、12〜14日後、96ウェル組織培養プレート中で、0.3細胞/ウェルにて細胞を播種することでシングルセルクローニングされた。育ったクローンは、R&D systems社の抗−CXCR5抗体(mAb 190)を用いて、FACSでCXCR5発現をテストした。CXCR5を高レベル発現する一つのクローン(L1.2/CXCR5 clone 19)が、さらなる使用のために増幅された。
1.7. The ability of anti -CXCR5 antibody that inhibits the migration CXCL13 induced in L1.2 cells overexpressing runnability assay CXCR5 was determined by the running resistance assay system. A mouse pre-B cell line L1.2 stably transfected with human or cynomolgus monkey CXCR5 was generated for this purpose. L1.2 cells maintained in RPMI medium containing 5% heat-inactivated FCS, 2 mM glutamine, and 50 μM mercaptoethanol were cloned into the mammalian cell expression vector pcDNA3.1 hygro DEST (Invitrogens). Alternatively, cynomolgus monkey CXCR5 cDNA was transfected by electroporation. CXCR5 expressing cells were selected in medium containing 600 μg / mL hygromycin and after 12-14 days single cell cloned by seeding cells at 0.3 cells / well in 96 well tissue culture plates . The grown clones were tested for CXCR5 expression by FACS using anti-CXCR5 antibody (mAb 190) from R & D systems. One clone (L1.2 / CXCR5 clone 19) expressing high levels of CXCR5 was amplified for further use.

走行性アッセイのために、L1.2/CXCR5細胞は、0.7×106細胞/mLにて懸濁され、抗−CXCR5抗体(0〜1.0μM)の増加する濃度で37℃、30分間インキュベートされた。細胞は、8μmの孔径フィルターを有し、マイクロプレートチャンバーの底には10nMのCXCL13を含む、Neuroprobe ChemoTx96ウェル ケモタキシスシステムの上部チャンバーに加えられた。アッセンブリは蓋がかぶせられ、5時間、5%CO2でパルス加湿空気インキュベータ中にて、37℃でインキュベートされた。5時間後、フィルターを除去し、下部のチャンバー中に遊走した細胞は、製造業者インストラクションに従って96ウェル平底黒プレートへ移した。移動後、黒プレートはシールされ、細胞を凍結するために−80℃冷凍庫に1〜2時間、又は一晩静置した。細胞をその後、室温にて20分間融解し、CyQuant (Invitrogen社)にて染色した。蛍光は、SynergyTM H4 マイクロプレートリーダー(Bio Tek Instruments社)にて測定した。蛍光は、遊走した細胞の数の割合である。走行性インデックスはそれぞれのサンプルで計算され(CXCL13に反応した蛍光シグナル/ケモカイン非存在下の自発的な細胞遊走の蛍光シグナル)、抗CXCR5抗体の濃度の関数としてプロットした。IC50値は、GraphPad プリズムソフトウエアを用いて決定した。 For the motility assay, L1.2 / CXCR5 cells are suspended at 0.7 × 10 6 cells / mL and incubated at 37 ° C., 30 with increasing concentrations of anti-CXCR5 antibody (0-1.0 μM). It was incubated for a minute. Cells were added to the upper chamber of the Neuroprobe ChemoTx 96 well chemotaxis system with an 8 μm pore size filter and containing 10 nM CXCL13 at the bottom of the microplate chamber. The assembly was capped and incubated for 5 hours at 37 ° C in a 5% CO 2 pulsed humidified air incubator. After 5 hours, filters were removed and cells migrated into the lower chamber were transferred to 96 well flat bottom black plates according to the manufacturer's instructions. After transfer, the black plate was sealed and left in a -80 ° C freezer for 1 to 2 hours, or overnight to freeze the cells. The cells were then thawed for 20 minutes at room temperature and stained with CyQuant (Invitrogen). Fluorescence was measured at Synergy TM H4 microplate reader (Bio Tek Instruments, Inc.). Fluorescence is the percentage of the number of migrated cells. The motility index was calculated for each sample (fluorescent signal in response to CXCL13 / fluorescent signal of spontaneous cell migration in the absence of chemokine) and plotted as a function of anti-CXCR5 antibody concentration. IC 50 values were determined using GraphPad Prism software.

実施例1.3において同定されたユニークな重鎖CDR3を有する46のクローンのうち、42は、正常に再フォーマットされ、IgG1として発現した。少なくとも12のクローンは、IC50値が1〜2200nMの範囲で、CXCL13が誘導するL1.2/CXCR5細胞走行性を中和することができた(表1参照)。 Of the 46 clones with the unique heavy chain CDR3 identified in Example 1.3, 42 was successfully reformatted and expressed as an IgG1. At least 12 clones were able to neutralize CXCL13 induced L1.2 / CXCR5 cell motility with IC 50 values in the range of 1-2200 nM (see Table 1).

<実施例2−mAb40C01の最適化>
2.1.重鎖及び軽鎖変異体
40C01重鎖(配列番号:1;VH)及び軽鎖(配列番号:2;VL)は、重鎖及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域及びCDR配列の両方を変えることで、別々に修飾された。これらの配列の変更の目的は、そのポジションで見出される最も相同性のあるヒト生殖系列の残基へとフレームワークアミノ酸残基を変異させるため、関連する細胞性アッセイにおける力価を高めるため、アスパラギン(Asn)の異性化、Asnの脱アミド化及びメチオニン(Met)酸化を防止することにより分子の製造を改善するため、又は、in silicoで同定されたヒトT細胞エピトープの抗体を除き、それによってヒトにおける潜在的な免疫原性を減少若しくは無効化するための、いずれかである。
Example 2-Optimization of mAb 40C01
2.1. The heavy and light chain variant 40C01 heavy chain (SEQ ID NO: 1; VH) and light chain (SEQ ID NO: 2; VL) alter both the framework regions and CDR sequences of the heavy and light chain variable regions And were separately qualified. The purpose of these sequence changes is to mutate the framework amino acid residues to the most homologous human germline residues found at that position, thereby increasing the potency in the relevant cellular assays. To improve the production of molecules by preventing (Asn) isomerization, Asn deamidation and methionine (Met) oxidation, or except for the antibodies of the human T cell epitopes identified in silico, thereby Either to reduce or eliminate potential immunogenicity in humans.

2つの重鎖変異体(配列番号:3及び4)は、ヒトIgG1、IgG4(ヒンジドメインを安定化するS241Pアミノ酸変更(Angalら、1993)及び、ポジション409のLysを有するアロタイプを含む)、又は、修飾されたIgG2(WO2009010290で記述されるサブタイプHC2h)重鎖アイソタイプとして構築され、VH1(配列番号:3に相当)及びVH2(配列番号:4に相当)と表示される。VH1及びVH2は、以下の変異を含む(カバット番号付けに従う;下線が引かれている残基はCDRの一つに位置する):
VH1: D46E−D61A−M89V,
VH2: Y32S−D46E−D61A−M89V−M99K
Two heavy chain variants (SEQ ID NOs: 3 and 4) are human IgG1, IgG4 (including the S241 P amino acid change stabilizing the hinge domain (Angal et al., 1993) and the allotype with Lys at position 409), or , Modified as IgG2 (subtype HC2h described in WO2009010290) heavy chain isotype, designated VH1 (corresponding to SEQ ID NO: 3) and VH2 (corresponding to SEQ ID NO: 4). VH1 and VH2 contain the following mutations (following Kabat numbering; underlined residues are located in one of the CDRs):
VH1: D46E- D61A- M89V,
VH2: Y32S- D46E- D61A- M89V- M99K

3つの軽鎖変異体は、ヒト カッパ鎖のバックグラウンドで構築され、Vk1、Vk2及びVk3と表示される。Vk1、Vk2及びVk3は、以下の変異を含む(上述のように、カバット番号付けに従い、下線が引かれている残基はCDRの一つに位置する):
Vk1:K6Q−A7S−D9S−I31A−M48I−H49Y−A51T−R65S−N76S−A80P(配列番号:5も参照)、
Vk2:R6Q−A7S−D9S−I31A−A43V−M48I−H49Y−A51T−R65S−N76S−A80P(配列番号:6も参照)、
Vk3:R6Q−A7S−D9S−I31A−A43V−M48I−H49Y−A51T−R65S−N76S−A80P−S93A (配列番号:7も参照)
Three light chain variants were constructed in the background of human kappa chain and designated Vk1, Vk2 and Vk3. Vk1, Vk2 and Vk3 contain the following mutations (as described above, under Kabat numbering, the underlined residues are located in one of the CDRs):
Vk1: K6Q-A7S-D9S- I31A -M48I-H49Y- A51T -R65S-N76S-A80P ( SEQ ID NO: see also 5),
Vk2: R6Q-A7S-D9S- I31A -A43V-M48I-H49Y- A51T -R65S-N76S-A80P ( SEQ ID NO: 6 see also),
Vk3: R6Q-A7S-D9S- I31A -A43V-M48I-H49Y- A51T -R65S-N76S-A80P- S93A ( SEQ ID NO: 7 See also)

オリジナルの及び変異体の重鎖及び軽鎖は、多くの機能的に完全なヒト抗−CXCR5抗体を製造するために全ての可能なペアワイズ組み合わせで組み合わせられた。   The original and variant heavy and light chains were combined in all possible pairwise combinations to produce many functionally complete human anti-CXCR5 antibodies.

2.2.示差走査熱量測定(DSC)測定
モノクローナル抗体のようなマルチドメインタンパク質の安定性は、示差走査熱量測定(DSC、例を参照)を使用して一般的には調べられる。大きな利点の一つは、タンパク質の個別のドメインの間の相互作用の微調整として使用されることが可能であることである。DSCにより測定されるモノクローナル抗体の熱誘導アンフォールディングは、タンパク質構造を監視するために使用される不可欠なツールとなっている。その結果、観察される遷移の正しい解釈が不可欠である。
2.2. Differential Scanning Calorimetry (DSC) Measurement The stability of multidomain proteins, such as monoclonal antibodies, is generally investigated using differential scanning calorimetry (DSC, see example). One of the great advantages is that it can be used as a fine-tuning of the interactions between individual domains of proteins. Thermally induced unfolding of monoclonal antibodies measured by DSC has become an essential tool used to monitor protein structure. As a result, correct interpretation of the observed transitions is essential.

4つのIgGモノクローナル抗体の熱誘導アンフォールディングは、中性のpHにてDSCで監視された。得られたサーモグラムのプロファイルは、図3に示される。インタクトの抗体の4つ全てのサーモグラムは、2つのピークを示す。コントロ−ルIgGアイソタイプ及びオリジナルの40C01−VH−VLの両方に対し、アンフォールディングは、71℃及び83℃付近に融解温度(Tm)を有し、第二ピークの振幅よりも大きな第一ピークの振幅を有する2つの遷移を表す。インタクトのIgGとその単離されたFab及びFcフラグメントのDSCプロファイルを比較する研究の結果を基に(Ionescuら、2008)、第二の遷移が主にCH3ドメインのアンフォールディングを表す一方、これらのインタクトの2つの抗体でのアンフォールディング事象は、FcフラグメントのCHドメインの融解、及び、Fabフラグメントの融解と関連することが推測され得る。このアプローチは、Fabフラグメントが協調的な様式において展開(アンフォールド)する、つまり、唯一の遷移がFabフラグメントのサーモグラムにて観察されるという仮定に依存している。   The heat-induced unfolding of the four IgG monoclonal antibodies was monitored by DSC at neutral pH. The profile of the obtained thermogram is shown in FIG. All four thermograms of the intact antibody show two peaks. For both the control IgG isotype and the original 40C01-VH-VL, the unfolding has a melting temperature (Tm) near 71 ° C and 83 ° C, and the first peak is larger than the amplitude of the second peak. Represents two transitions having an amplitude. Based on the results of studies comparing DSC profiles of intact IgG and its isolated Fab and Fc fragments (Ionescu et al., 2008), while the second transition primarily represents unfolding of the CH3 domain, An unfolding event with two intact antibodies can be inferred to be associated with melting of the CH domain of the Fc fragment and melting of the Fab fragment. This approach relies on the assumption that the Fab fragments unfold (unfold) in a cooperative manner, ie, only one transition is observed in the thermogram of the Fab fragments.

40C01−VH1−Vk1変異体の場合、サーモグラムは、第一のピークに対して74.5℃付近により高いTmを有しているが、同一のプロファイルを有している。40C01VH−Vk2変異体の場合、DSCサーモグラムは、72℃付近のTmを有する第一のピークの振幅よりも大きい、83℃付近のTmを有する第二のピークの振幅を有する異なった融解プロファイルを有している。DSCサーモグラム中のピーク領域は、アンフォールディングの実験エンタルピーを表すので、本実施例において、第一ピークが主にCH2ドメインの展開(アンフォールド)を表す一方、第二ピークは、Fabフラグメント及びFcフラグメントのCH3ドメインアンフォールディングを表すことが推測され得る。   In the case of the 40C01-VH1-Vk1 variant, the thermogram has a higher Tm around 74.5 ° C. with respect to the first peak, but has the same profile. In the case of the 40C01 VH-Vk2 variant, the DSC thermogram has a different melting profile with an amplitude of the second peak with a Tm near 83 ° C. which is greater than the amplitude of the first peak with a Tm around 72 ° C. Have. Since the peak area in the DSC thermogram represents the experimental enthalpy of unfolding, in this example, the first peak mainly represents the unfolding of the CH2 domain, while the second peak represents the Fab fragment and the Fc. It can be inferred to represent CH3 domain unfolding of fragments.

図3において、DSC解析は、FabフラグメントのTmが、オリジナルの40C01抗体における71℃付近から、VH1−Vk2変異体においては74.5℃付近へ、VH1−Vk2においては83℃まで上昇することが示される。Fabフラグメントの低安定性又は不均一性は、長期間保存や生産の一貫性に対する問題を提供しうる。それゆえ、83℃付近のTm値を有するFabフラグメントを有することは、この治療用モノクローナル抗体の開発にとって有益であるとみなされ得る。FabフラグメントのTmにおけるこの変化は、その安定性が、可変重鎖及び軽鎖ドメインの配列によって有意に影響されることを証明する。それゆえ、重鎖に対して40C01 VHとVH1の間に起こり、軽鎖に対して40C01 VH、Vk1及びVk2変異体の間におこる、重鎖及び軽鎖フレームワーク並びにCDR残基の変化は、VH及びVLドメインの間の相互作用の微調整による、分子の全体的な熱安定性を上昇している。   In FIG. 3, DSC analysis indicates that the Tm of the Fab fragment increases from around 71 ° C. in the original 40C01 antibody to around 74.5 ° C. in the VH1-Vk2 mutant and to 83 ° C. in the VH1-Vk2 Indicated. The low stability or heterogeneity of the Fab fragments can provide problems for long term storage and production consistency. Therefore, having a Fab fragment with a Tm value around 83 ° C. can be considered beneficial for the development of this therapeutic monoclonal antibody. This change in Tm of the Fab fragment demonstrates that its stability is significantly influenced by the variable heavy and light chain domain sequences. Therefore, changes in heavy chain and light chain frameworks and CDR residues that occur between 40C01 VH and VH1 for the heavy chain and between 40C01 VH, Vk1 and Vk2 variants for the light chain are: Fine tuning of the interaction between the VH and VL domains has increased the overall thermal stability of the molecule.

40C01 VH1−Vk3及びVH2−Vk3変異体に対して得られたサーモグラムのプロファイルは、図4に示される。DSCサーモグラムは、第二ピークの振幅よりずっと小さい第一のピークの振幅を有する、40C01 VH1−Vk2変異体と同一の融解プロファイルを有する。第一のアンフォールディング事象は、FcフラグメントのCH2ドメインの融解と関連しており、第二のアンフォールディング事象は、FcフラグメントのFab及びCH3ドメインの融解と関連する。40C01 VH1−Vk3及びVk2−Vk3変異体の場合、第一及び第二ピークに相当するTmは、それぞれ、72℃付近と82℃付近、及び、72℃付近と81℃付近である。全長インタクトのIgG1分子を用いて得られるサーモグラムから計算されたFabフラグメントに対する上記81℃の推定された高いTm値は、哺乳類細胞発現システムで製造された、相当する組換えFabフラグメントに対して得られたTm値によって確認された。40C01−VH1−Vk3及び40C01−VH2−Vk3の組換えFabフラグメントに対してDSCによって得られたTmは、それぞれ85.5℃及び84.1℃であった(データは示さず)。   The profiles of the thermograms obtained for the 40C01 VH1-Vk3 and VH2-Vk3 variants are shown in FIG. The DSC thermogram has the same melting profile as the 40C01 VH1-Vk2 variant, with the amplitude of the first peak being much smaller than the amplitude of the second peak. The first unfolding event is associated with the melting of the CH2 domain of the Fc fragment, and the second unfolding event is associated with the melting of the Fab and CH3 domains of the Fc fragment. In the case of the 40C01 VH1-Vk3 and Vk2-Vk3 mutants, the Tm corresponding to the first and second peaks is around 72 ° C. and 82 ° C., and around 72 ° C. and 81 ° C., respectively. The estimated high Tm values of 81 ° C. above for Fab fragments calculated from thermograms obtained using full-length intact IgG1 molecules are obtained for the corresponding recombinant Fab fragments produced by the mammalian cell expression system. It was confirmed by the determined Tm value. The Tm obtained by DSC for the recombinant Fab fragments of 40C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 were 85.5 ° C. and 84.1 ° C., respectively (data not shown).

2.3.CXCL13が刺激するL1.2−CXCR5細胞走行性の阻害
実験1.7に開示されたものと同様のプロトコールに従った。
図5は、IgG1、IgG2及びIgG4としての全抗体フォーマットで発現された、抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3及び40C01−VH2−Vk3変異体によって、L1.2−ヒト及びカニクイザルCXCR5のCXCL13が刺激する走行性の阻害を示す。算出されたIC50(半最大阻害濃度)は、表2中で要約される。全てのテストを行ったmAbは、100%の効力で走行性を阻害した。ヒトCXCR5に対する異なるIgGアイソタイプ間で、効力の差異は認められなかった。ヒトCXCR5の場合、40C01−VH2−Vk3変異体は、40C01−VH1−Vk3変異体(一桁のナノモル範囲)よりも、10〜20倍高い効力を有し(ナノモル以下の範囲のIC50)、一方でカニクイザルCXCR5の場合は、該変異体は、等しい効力である(ナノモル以下の範囲)。
2.3. Inhibition of L1.2-CXCR5 Cell Stimulation Stimulated by CXCL13 A protocol similar to that disclosed in Experiment 1.7 was followed.
FIG. 5 shows that CXCL13 of L1.2-human and cynomolgus monkey CXCR5 is stimulated by anti-CXCR540C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 variants expressed in whole antibody format as IgG1, IgG2 and IgG4 It shows an obstacle to running. The calculated IC 50 (half maximal inhibitory concentration) is summarized in Table 2. All tested mAbs inhibited motility with 100% potency. No difference in potency was observed between different IgG isotypes for human CXCR5. In the case of human CXCR5, the 40C01-VH2-Vk3 variant is 10-20 times more potent than the 40C01-VH1-Vk3 variant (one-digit nanomolar range) (IC 50 in the subnanomolar range), In the case of cynomolgus monkey CXCR5, on the other hand, the variants are of equal potency (in the sub-nanomolar range).

二価IgG抗体上の単一の結合部位に対する一価抗原の結合強度は、親和性として定義される。溶液中において、一価抗原に対するIgG抗体のそれぞれの結合部位の結合は独立している。しかしながら、細胞膜上のように抗原の動きが部分的に制限される時、CXCR5のような抗原上のエピトープは、IgG結合部位の両方に対して空間的に近位になることがあり、一つの部位の結合が他の結合部位の結合強度を増強することがある。抗体と抗原との間の全ての結合部位の強さの合計は、アビディティ(avidity)と定義される。アビディティは、抗体の価数及び抗原の価数の両方によって影響される。アビディティは、それぞれの親和性の合計よりも大きくなり得る。   The binding strength of a monovalent antigen to a single binding site on a bivalent IgG antibody is defined as affinity. In solution, the binding of each binding site of an IgG antibody to a monovalent antigen is independent. However, when antigen movement is partially restricted, such as on cell membranes, epitopes on antigens such as CXCR5 may be spatially proximal to both of the IgG binding sites, Site binding may enhance the binding strength of other binding sites. The sum of the strengths of all binding sites between antibody and antigen is defined as avidity. Avidity is influenced by both antibody titer and antigen titer. The avidity can be greater than the sum of their respective affinities.

抗−CXCR5 40C01変異体のアビディティが、走行性の阻害の強さにおいて役割を果たしたかどうか試験するために、40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3変異体の組換えFabフラグメントをヒトCXCR5−L1.2細胞走行性の阻害のテストが行われた。発明者らは、40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3の組換えFabフラグメントが、それぞれ、288nM及び20.9nMのIC50を有していることを見出し、一方で、それらに相当する全長ヒトIgGは,それぞれ、0.38nM及び0.05nMのIC50であった。インタクトのIgGとFabフラグメントの間の走行性の阻害の効力におけるこれらの差異は、明らかに、IgGの二価性が重要な要素であることを示している(データは示さない)。 In order to test whether the avidity of anti-CXCR5 40C01 variants played a role in the strength of motility inhibition, recombinant Fab fragments of 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3 variants were used as human CXCR5-L1. A test of inhibition of two cell motility was performed. We find that the recombinant Fab fragments of 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3 have an IC 50 of 288 nM and 20.9 nM, respectively, while their corresponding full-length human IgGs Have an IC 50 of 0.38 nM and 0.05 nM, respectively. These differences in potency of inhibition of motility between intact IgG and Fab fragments clearly indicate that IgG bivalent is an important factor (data not shown).

2.4.ヒト血清中のCXCL13によって誘導されるヒト初代B細胞走行性の阻害
ヒトリンパ球は、Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences社、カタログ番号17−1440−03)を使用して、バフィーコートから単離された。B細胞は、MagCellect ヒトB細胞単離キット(R&D Systems社、カタログ番号MAGH103)を使用して、ネガティブセレクションによって精製した。精製したB細胞は、3×106細胞/mLにて、B細胞培地(2mM グルタミン、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウム、25mg/ml Pen−Strep、50μMβ−メルカプトエタノール及び10%熱不活性化FCSを含むRPMI1640)に再懸濁され、可能性のあるin vivo脱感作を克服するために4℃にて一晩保存され(Hausdorffら、1990; Tomhave ED 1994)、従って、遊走する細胞の数が増加する。B細胞は、100%の非熱不活性化ヒト血清(PAA Laboratories社、カタログ番号C11−020)中にて、100μg/mLにて開始し、0.38ng/mLまでの一連の4倍希釈の40C01変異体とともに37℃で20分間プレインキュベートした。300nMヒトCXCL13(内製)に対するヒトB細胞の遊走は、5μm孔径の96ウェル走行性プレート(ChemoTx#101−5、Neuro Probe社)を用いたChemoTx(登録商標)システムを使用して評価された。走行性は、加湿されたインキュベータ内で、5%CO2、2時間、37℃で行われて許容された。遊走した細胞は、その後、新しい96ウェルマイクロプレートに移され、数時間−80℃で保存され、解凍され、CyQuant(登録商標)(Life Technologies社、カタログ番号C7026)を用いて染色され、そしてカウントされた。阻害パーセントは、以下の式を使用して算出した:阻害パーセント=100×(1−Ab処理下の平均細胞数/処理なしの平均細胞数)
2.4. Human primary B cell motility inhibition induced by CXCL13 in human serum is isolated from buffy coat using Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Cat. No. 17-1440-03) It was done. B cells were purified by negative selection using the MagCellect human B cell isolation kit (R & D Systems, Cat. # MAGH103). Purified B cells at 3 × 10 6 cells / mL, B cell medium (2 mM glutamine, 1% nonessential amino acids, 1% sodium pyruvate, 25 mg / ml Pen-Strep, 50 μM β-mercaptoethanol and 10% heat) Resuspend in RPMI 1640) with inactivated FCS and store overnight at 4 ° C. to overcome possible in vivo desensitization (Hausdorff et al., 1990; Tomhave ED 1994), thus migrating Increase the number of cells. B cells are started at 100 μg / mL in 100% non-heat inactivated human serum (PAA Laboratories, Cat. # C11-020), and a series of 4-fold dilutions to 0.38 ng / mL Preincubated with the 40C01 mutant for 20 minutes at 37 ° C. Migration of human B cells to 300 nM human CXCL13 (in house) was evaluated using the ChemoTx® system using a 96 μm running plate (ChemoTx # 101-5, Neuro Probe) with a 5 μm pore size . Runnability was allowed to occur in a humidified incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 for 2 hours. Migrated cells are then transferred to a new 96-well microplate, stored at -80 ° C for several hours, thawed, stained with CyQuant® (Life Technologies, Cat. No. C7026), and counted It was done. The percent inhibition was calculated using the following formula: percent inhibition = 100 × (average cell number under 1-Ab treatment / average cell number without treatment)

結果は、以下の式を用いて、コントロール(すなわち、CXCL13誘導)遊走のパーセンテージとして表される:%M d=(Mab+CXCL13 − Mbuffer / Mcxcl13 − Mbuffer)×100; Mは遊走、Mab+cxcl13はantibody+cxcl13による遊走、Mbufferは、バッファーのみによる遊走を意味する、及び、Mcxcl13は、cxcl13単独による遊走を意味する。CXCL13の存在下での細胞の遊走の数が100%である。基礎の遊走は、最小であることに注意すべきである(CXCL13を用いて得られた最大反応の0.5%未満)。   The results are expressed as a percentage of control (ie CXCL13 induced) migration using the following formula:% M d = (Mab + CXCL13-Mbuffer / Mcxcl13-Mbuffer) x 100; Mbuffer means migration by buffer only, and Mcxcl13 means migration by cxcl13 alone. The number of cell migration in the presence of CXCL13 is 100%. It should be noted that basal migration is minimal (less than 0.5% of the maximal response obtained with CXCL13).

図6は、40C01−VH1−Vk3変異体の場合、平均IC50は1.89nMであって、0.29〜3.09nMの範囲であり、71〜88.5%の範囲の阻害パーセントを有することを示す。40C01−VH2−Vk3変異体の場合、平均IC50は0.34nMであって、0.082〜0.479nMの範囲であり、80.8〜90.5%の範囲の阻害パーセントである。 FIG. 6 shows that for the 40C01-VH1-Vk3 variant, the average IC 50 is 1.89 nM, in the range of 0.29-3.09 nM, with percent inhibition in the range of 71-88.5%. Indicates that. For the 40C01-VH2-Vk3 variant, the average IC 50 is 0.34 nM, in the range of 0.082 to 0.479 nM, with a percent inhibition in the range of 80.8 to 90.5%.

2.5.ヒトCXCR5安定的にトランスフェクトされたHEK−293細胞へのAlexa−Fluor 647標識mAbの結合
抗CXCR5 40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3変異体は、Invitrogen社のモノクローナル抗体標識キット(カタログ番号A20186)を使用して、Alexa Fluor 647色素で標識された。ヒトCXCR5を安定的にトランスフェクトされたHEK−293細胞への標識したmAbの結合は、直接免疫蛍光アッセイによって調べられた。合計1×105のヒトCXCR5を過剰発現する安定HEK−293細胞は、FACSバッファー(1%BSA及び0.1%NaN3を含むPBS)中で、60μg/mLから0.33ng/mLの範囲の3倍希釈系列のAlexa Fluor 647mAbとともに、1時間、氷上でインキュベートされた。細胞はFACSバッファーで2回洗浄され、FACSCalburフローサイトメーター(BD Biosciences社)にて解析された。EC50(半最大細胞結合(%)に達する各Abの濃度及び幾何学的平均蛍光強度(Geo mean))、及びEC80は、抗体濃度の関数として、FL4蛍光(Alexa Fluor 647の発光)をプロットすることで算出された。これらのEC50及びEC80あたりは、ヒトCXCR5陽性細胞に対する各変異体の相対的結合親和性の尺度として使用された。図7で示される結果から、発明者らは、40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3それぞれに対し、2.26nM及び4.6nMのEC50値を算出した。
2.5. Binding of Alexa-Fluor 647-labeled mAb to Human CXCR5 Stably Transfected HEK-293 Cells Anti-CXCR5 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3 Variants are Invitrogen's Monoclonal Antibody Labeling Kit (Catalog No. A20186) Labeled with Alexa Fluor 647 dye. Binding of labeled mAb to HEK-293 cells stably transfected with human CXCR5 was examined by direct immunofluorescence assay. Stable HEK-293 cells overexpressing a total of 1 × 10 5 human CXCR5 ranged from 60 μg / mL to 0.33 ng / mL in FACS buffer (PBS with 1% BSA and 0.1% NaN 3 ) Was incubated on ice for 1 hour with a 3-fold dilution series of Alexa Fluor 647 mAb. Cells were washed twice with FACS buffer and analyzed on a FACSCalbur flow cytometer (BD Biosciences). EC 50 (concentration of each Ab reaching half maximal cell binding (%) and geometric mean fluorescence intensity (Geo mean)), and EC 80 , as a function of antibody concentration, FL4 fluorescence (emission of Alexa Fluor 647) Calculated by plotting. These EC 50 and EC 80 were used as a measure of the relative binding affinity of each mutant to human CXCR5 positive cells. From the results shown in FIG. 7, the inventors calculated EC 50 values of 2.26 nM and 4.6 nM for 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3, respectively.

2.6.全血中のヒトB細胞に対するAlexa−Fluor 647標識mAbの結合
40C01−VH1−Vk3 及びVH2−Vk3変異体は、Invitrogen社のモノクローナル抗体標識キット(カタログ番号A20186)を使用して、Alexa Fluor 647色素で標識された。血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブ中に採取され、2時間室温に置いた。アジ化ナトリウム(NaN3)をその後、終濃度0.01%になるように全血に添加された。60μg/mLから3ng/mLの範囲の3倍希釈系列のAlexa Fluor 647標識mAbが全血サンプルへ添加され、室温で30分間インキュベートされた。フィコエリトリン(PE)標識抗−CD19(BD Pharmingen社、カタログ番号555413)及び、抗−ヒトCXCR2(R&D Systems社、カタログ番号FAB331P)mAb及びその各アイソタイプコントロールが、B細胞をゲーティングするため、及び、顆粒球上のCXCR2発現をモニタリングするために、それぞれ使用された。標識された赤血球は、その後、R&D Systems社のヒト赤血球溶解キット(カタログ番号WL1000)で溶解され、血液細胞は、FACSバッファー(PBS−1%BSA、0.1%NaN3)中に再懸濁され、FACS Calibur 3(BD Biosciences社)にてフローサイトメトリーによって解析された。EC50及びEC80あたりは、抗体濃度の関数として、FL4蛍光(Alexa Fluor 647色素の発光)をプロットすることによって算出された。図8に示された結果より、発明者らは、40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3に対してそれぞれ、EC50値が、1.92nM及び7.22nMと算出した。2つの40C01変異体の結合は、CXCR2を発現する顆粒球の集団(好中球)上では検出されなかった。
2.6. Binding of Alexa-Fluor 647-labeled mAb to human B cells in whole blood The 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3 mutants were prepared using the Invitrogen monoclonal antibody labeling kit (Catalog No. A20186) to generate Alexa Fluor 647 dye. It was labeled with. Blood was collected in sodium-heparin tubes and left at room temperature for 2 hours. Sodium azide (NaN 3 ) was then added to whole blood to a final concentration of 0.01%. A 3-fold dilution series of Alexa Fluor 647 labeled mAb ranging from 60 μg / mL to 3 ng / mL was added to whole blood samples and incubated for 30 minutes at room temperature. Phycoerythrin (PE) -labeled anti-CD19 (BD Pharmingen, Cat. No. 555413) and anti-human CXCR2 (R & D Systems, Cat. No. FAB331P) mAbs and their respective isotype controls for gating B cells, and Each was used to monitor CXCR2 expression on granulocytes. The labeled red blood cells are then lysed with the R & D Systems human red blood cell lysis kit (Catalog No. WL1000) and blood cells are resuspended in FACS buffer (PBS-1% BSA, 0.1% NaN 3 ) And analyzed by flow cytometry on FACS Calibur 3 (BD Biosciences). The EC 50 and EC 80 values were calculated by plotting FL4 fluorescence (emission of Alexa Fluor 647 dye) as a function of antibody concentration. From the results shown in FIG. 8, the inventors calculated EC 50 values of 1.92 nM and 7.22 nM for 40C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3, respectively. Binding of the two 40C01 variants was not detected on the population of CXCR2 expressing granulocytes (neutrophils).

2.7.全血中のカニクイザルB細胞への抗−CXCR5 40C01変異体の結合
カニクイザル(Macaca fascicularis)血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブ中で採取されて、室温で保存された。アジ化ナトリウム(NaN3)は、最終濃度が0.01%になるまで全血へ加えられた。500μg/mL及び50ng/mLの抗体の希釈5μLが、45μLの血液に対し、二重(duplicate)で添加され、室温で30分間インキュベートされた。赤血球は、その後、R&D Systems社のヒト赤血球溶解キット(カタログ番号WL1000)で溶解された。Fc受容体は、Innovex社のFc受容体ブロッカー(カタログ番号NB309)を使用してブロックされた。フィコエリトリン(PE)結合ヤギ抗−ヒトFcフラグメント(Jackson Immuno Research社、カタログ番号109−116−098)及びアロフィコシアニン(APC)結合マウスIgG2b抗−ヒトCD20(BD Biosciences社、カタログ番号559776)及びその各アイソタイプコントロールは、抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3及びVH2−Vk3変異体mAbの結合を検出するため、B細胞をゲーティングするためにそれぞれ使用された。氷上での30分間のインキュベート後、血液細胞は洗浄され、FACSバッファー(PBS−1%BSA、0.1%NaN3)中に再懸濁され、FACS Calibur 3(BD Biosciences社)にてフローサイトメトリーによって解析された。図9に示された結果は、50μg/mLにおいて、40C01変異体の両方は、B細胞上に発現したカニクイザルCXCR5に対して強力かつ特異的な結合を示すことを表す。
2.7. Binding of Anti-CXCR5 40C01 Mutants to Cynomolgus Monkey B Cells in Whole Blood Cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) blood was collected in sodium-heparin tubes and stored at room temperature. Sodium azide (NaN 3 ) was added to whole blood to a final concentration of 0.01%. A dilution of 500 μg / mL and 50 ng / mL of antibody, 5 μL, was added in duplicate to 45 μL of blood and incubated for 30 minutes at room temperature. Erythrocytes were then lysed with R & D Systems' human erythrocyte lysis kit (Catalog No. WL1000). The Fc receptor was blocked using Innovex's Fc receptor blocker (Catalog No. NB309). Phycoerythrin (PE) conjugated goat anti-human Fc fragment (Jackson Immuno Research, catalog no. 109-116-098) and allophycocyanin (APC) conjugated mouse IgG2b anti-human CD20 (BD Biosciences, catalog no. 559776) and the respective Isotype controls were used to gate B cells, respectively, to detect binding of anti-CXCR540C01-VH1-Vk3 and VH2-Vk3 mutant mAbs. After incubation for 30 minutes on ice, blood cells are washed and resuspended in FACS buffer (PBS-1% BSA, 0.1% NaN 3 ) and flow-sited on FACS Calibur 3 (BD Biosciences) It was analyzed by measurement. The results shown in FIG. 9 indicate that at 50 μg / mL, both of the 40C01 mutants show strong and specific binding to cynomolgus monkey CXCR5 expressed on B cells.

2.8.抗−CXCR5mAbによる、ヒト及びカニクイザル全血からのB細胞中において、CXCL13刺激によるERKのリン酸化の阻害
ケモカインレセプターCXCR5に対するCXCL13の結合は、様々な細胞内シグナル伝達イベント、特に、p44/42マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ(細胞外シグナル調節キナーゼ; ERK1/2)の一時的なリン酸化(活性化)の引き金となる。このアッセイは、フローサイトメトリーを使用して、抗−CXCR5 40C01変異体による全血中のB細胞中のCXCL13刺激によるERKリン酸化の阻害を測定する。
2.8. Inhibition of CXCL13-stimulated phosphorylation of ERK in B cells from human and cynomolgus monkey whole blood by anti-CXCR5 mAb Binding of CXCL13 to the chemokine receptor CXCR5 has a variety of intracellular signaling events, in particular p44 / 42 mitogenic activity Triggers transient phosphorylation (activation) of activated protein (MAP) kinase (extracellular signal-regulated kinase; ERK1 / 2). This assay uses flow cytometry to measure the inhibition of CXCL13-stimulated ERK phosphorylation in B cells in whole blood by anti-CXCR540C01 mutants.

血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブで採取され、室温にて2時間、静置される。抗体の一連の希釈を該血液に添加され、37℃にて30分間インキュベートされる。全血中のB細胞は、その後、500nMのヒト又は350nMのカニクイザルCXCL13を用いて、37℃にて活性化される。シグナル伝達活性化は、2分後に、室温にて8分間、4%ホルムアルデヒド中の細胞の固定によって止められる。固定後、トライトンX−100が、終濃度0.1%になるまで添加され、35分間37℃でインキュベートされた。細胞は、PBSで洗浄され、メタノールで固定され(50%終濃度)及び、少なくとも1時間、−20℃でインキュベートされる。細胞は、その後、室温まで温めるためにベンチ上に残され、洗浄され、FACS染色バッファー(4%FCS含有PBS)中の抗−リン酸−p44/42 MAPK(ERK1/2)ウサギ抗体(Cell Signaling Technology社、カタログ番号4370S)の1/50希釈を加え、さらに1時間室温にてインキュベートする。細胞は、その後、FACS染色バッファーで洗浄され、Alexa Fluor 647ロバ抗−ウサギIgG(Invitrogen社、カタログ番号A31573)の1/400希釈と抗−ヒトCD20−PE(BD Pharmingen、カタログ番号556633)抗体の1/2.5希釈との混合物を添加し、氷上にて1時間インキュベートされた。細胞は、その後、洗浄され、FACS染色バッファー中に再懸濁され、フローサイトメトリーで解析された。CD20+細胞でゲートされたリン酸−ERK蛍光ヒストグラムが表示される(FL4)(データは示さない)。各サンプルに対して、パーセント陽性細胞が報告される。陽性細胞のパーセンテージは、抗−CXCR5mAbの濃度の関数及び算出されたIC50として表される。図10で表される結果より、ヒト血液に対し、IgG1及びIgG2としての40C01−VH1−Vk3に対する算出されるIC50は、それぞれ、0.17nM(パネルD)及び0.736nM(パネルA);並びに、IgG1及びIgG2としての40C01−VH1−Vk3に対しては、それぞれ0.45nM(パネルC)及び0.88nM(パネルB)であった。カニクイザル血液に対する図11で得られた結果より、IgG1としての40C01−VH1−Vk3と40C01−VH2−Vk3の両者に対する算出されたIC50は、それぞれ、0.195nM及び1.57nMであった。得られた結果は、表3に要約される。 Blood is collected in sodium-heparin tubes and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Serial dilutions of antibody are added to the blood and incubated for 30 minutes at 37 ° C. B cells in whole blood are then activated at 37 ° C. with 500 nM human or 350 nM cynomolgus CXCL13. Signal transduction activation is stopped after 2 minutes by fixation of cells in 4% formaldehyde for 8 minutes at room temperature. After fixation, Triton X-100 was added to a final concentration of 0.1% and incubated for 35 minutes at 37 ° C. The cells are washed with PBS, fixed with methanol (50% final concentration) and incubated at -20 ° C for at least 1 hour. Cells are then left on the bench to warm to room temperature, washed and anti-phosphate-p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) rabbit antibody (Cell Signaling) in FACS staining buffer (PBS with 4% FCS) Add a 1/50 dilution of Technology, cat. No. The cells are then washed with FACS staining buffer and a 1/400 dilution of Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen, Cat. No. A31573) and anti-human CD20-PE (BD Pharmingen, Cat. No. 565633) antibody A mixture with a 1 / 2.5 dilution was added and incubated on ice for 1 hour. The cells were then washed, resuspended in FACS staining buffer and analyzed by flow cytometry. CD20 + cell gated phospho-ERK fluorescence histograms are displayed (FL4) (data not shown). Percent positive cells are reported for each sample. The percentage of positive cells are represented as IC 50 which functions and calculated concentrations of anti -CXCR5mAb. From the results shown in FIG. 10, the calculated IC 50 against 40C01-VH1-Vk3 as IgG1 and IgG2 for human blood is 0.17 nM (panel D) and 0.736 nM (panel A), respectively; And, for 40C01-VH1-Vk3 as IgG1 and IgG2, it was 0.45 nM (panel C) and 0.88 nM (panel B), respectively. From the results obtained in FIG. 11 on cynomolgus monkey blood, the calculated IC 50 for both 40C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 as IgG1 was 0.195 nM and 1.57 nM, respectively. The results obtained are summarized in Table 3.

2.9.CXCR5発現細胞膜に対する抗−CXCR5mAb変異体のK d の決定
速度論除外アッセイ(Kinetic Exclusion Assay (KinExA))は、完全ヒトIgG(サブタイプHC2h、WO2009010290に記載)抗−CXCR5 40C01抗体変異体と安定的にトランスフェクトされたHEK−293細胞上に発現したヒトCXCR5の間に平衡が確立された後に、溶液中に残存する遊離抗体の濃度を決定するために使用され、そこから、平衡解離定数(Kd)が決定された。この方法は、GPCRのような、完全な膜タンパク質に対する抗体の親和性/結合性(アビディティ)の真の測定を提供する。
2.9. CXCR5 determine kinetic exclusion assay a K d of anti -CXCR5mAb variants to express the cell membrane (Kinetic Exclusion Assay (KinExA)) is (according to subtype HC2h, WO2009010290) fully human IgG anti -CXCR5 40C01 antibody variant and stable After equilibrium is established between human CXCR5 expressed on transfected HEK-293 cells, it is used to determine the concentration of free antibody remaining in solution, from which the equilibrium dissociation constant (Kd ) Was decided. This method provides a true measure of the affinity / binding (avidity) of an antibody for a complete membrane protein, such as GPCR.

7つのトランスメンブレンドメインを有する完全膜タンパク質、ヒトCXCR5を安定的に発現する、HEK−293は、Accutase細胞剥離液を使用して回収され、2×106細胞/mLで再懸濁され、15個のファルコンチューブ中にKinExAバッファー(1mg/mL BSA及び0.02%NaN3含有PBS)を使用して2倍に段階希釈した。精製されたmAbの適切な一定濃度は、KinExAバッファー中で作成され、等量のmAbは段階希釈された細胞とともに混合された。標準Kd値を得るために、2つの異なる濃度のmAb、40C01−VH1−Vk3変異体に対しては30pM及び300pM、40C01−VH2−Vk3変異体に対しては100pM及び1M、が試験された。細胞は、少なくとも24時間室温にて、回転によってmAbと混合された。細胞は、その後、遠心分離され、上清中に存在する遊離のmAbは、KinExAバッファー中にて、1μg/mL使用されるヤギ抗−ヒトIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch社、カタログ番号109−005−003)及びDyLight 649結合抗−ヒト二次抗体(Jackson ImmunoResearch社、ヤギ抗−ヒトFc、カタログ番号109−495−098)でコートされたPMMAビーズ(Sapidyne Instruments社、カタログ番号440198)を使用し、KinExAniyotte測定された。標準のKdは、KinExAソフトウエアを使用することによって、及び、単一Kd値に対して同時に、40C01−VH1−Vk3に対しては30pM及び300pMにて、40’C01−VH2−Vk3に対しては100pM及び1nMにて得られる曲線にフィットする「n−カーブ解析」によって得られた。溶液中に残った遊離mAbのパーセンテージは、KinExAソフトウエアを使用することで、抗原の濃度に対してプロットされ(任意に100万細胞ごとに1nM抗原として定義される)、シグモイド曲線が作成された。 HEK-293, which stably expresses human CXCR5, a complete membrane protein with seven transmembrane domains, is recovered using Accutase cell detachment solution, resuspended at 2 × 10 6 cells / mL, 15 Two Falcon tubes were serially diluted 2-fold using KinExA buffer (PBS containing 1 mg / mL BSA and 0.02% NaN 3 ). Appropriate constant concentrations of purified mAb were made in KinExA buffer and equal amounts of mAb were mixed with serially diluted cells. Two different concentrations of mAb, 30 pM and 300 pM for the 40C01-VH1-Vk3 variants, and 100 pM and 1 M for the 40C01-VH2-Vk3 variants, were tested to obtain standard Kd values. The cells were mixed with the mAb by spinning at room temperature for at least 24 hours. The cells are then centrifuged and free mAb present in the supernatant is used Goat anti-human IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-005, used at 1 μg / mL in KinExA buffer) -003) and DyLight 649 conjugated anti-human secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, goat anti-human Fc, catalog no. 109-495-098) coated with PMMA beads (Sapidyne Instruments, catalog no. 440198) , KinExAniyotte was measured. The standard Kd is for 40'C01-VH2-Vk3 at 30 pM and 300 pM for 40C01-VH1-Vk3 simultaneously by using KinExA software and for single Kd values simultaneously. Was obtained by "n-curve analysis" fitting the curves obtained at 100 pM and 1 nM. The percentage of free mAb left in solution was plotted against the concentration of antigen (optionally defined as 1 nM antigen per 1 million cells) using the KinExA software, and a sigmoid curve was generated .

40C01−VH1−Vk3と40C01−VH2−Vk3に対するn−曲線解析を使用して、KinExAソフトウエアによって算出されたKdの代表的な実験が、それぞれ、図12及び図13で示される。ヒト抗−CXCR5 mAb 40C01−VH1−Vk3に対して算出されたKdは15.35pMであって、95%信頼区間においてKd高(high)で41.84pM及びKd低(low)で2.29pMであった。11.3の抗原乗数は、細胞あたり1.6×105CXCR5受容体に変換するこの方法によって算出された。ヒト抗−CXCR5 mAb 40C01−VH2−Vk3に対する算出されたKdは、47.04pMであって、95%信頼区間においてKd高(high)は92.41であり、Kd低(low)は20.44であった。22.94の抗原乗数は、細胞あたり2.8×106CXCR5受容体に変換するこの方法によって算出された。 Representative experiments of Kd calculated by KinExA software using n-curve analysis for 40C01-VH1-Vk3 and 40C01-VH2-Vk3 are shown in FIG. 12 and FIG. 13, respectively. The calculated Kd for human anti-CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3 is 15.35 pM, with 41.84 pM for Kd high and 2.29 pM for Kd low in the 95% confidence interval there were. The 11.3 antigen multiplier was calculated by this method to convert to 1.6 × 10 5 CXCR5 receptors per cell. The calculated Kd for human anti-CXCR5 mAb 40C01-VH2-Vk3 is 47.04 pM with a Kd high of 92.41 and a Kd low of 20.44 in the 95% confidence interval. Met. The antigen multiplier of 22.94 was calculated by this method to convert to 2.8 × 10 6 CXCR5 receptors per cell.

2.10.抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk2介在ADCC
クロム51標識細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)アッセイは、標的としてヒトB細胞及びエフェクター細胞としてヒトNK細胞を使用して実施された。B細胞とNK細胞は、Miltenyi Biotec社からの各々のMACS細胞単離キットを使用して、ヒトPBMCから精製された。単離したB細胞は、その後、51Crで標識された。細胞傷害性を測定するために、エフェクター(E)及び標的(T)細胞を10/1 E/T比率で、抗−CXCR5−40C01−VH1−Vk2 mAb、リツキシマブ(ポジティブコントロールIgGmAb)、抗−ニワトリ−卵−リソザイムmAb(ネガティブコントロールIgGmAb)又は培地のみを用いて、37℃4時間共培養した。細胞溶解のパーセンテージは、公式を使用して算出した:特異的溶解のパーセンテージ= ((毎分の実験カウント(c.p.m.)−自発性c.p.m.)/(最大c.p.m.−自発性c.p.m.))×100。図14にて示された結果は、抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk2 mAbが、初代ヒトB細胞に対するADCCを仲介する能力を有し、その効果は、よく記述されているFDAで承認された抗−CD20抗体、リツキシマブの効果と、勝るとはいわないまでも、同等であることを示す。
2.10. Anti-CXCR5 40C01-VH1-Vk2 mediated ADCC
Antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) assays against chromium 51 labeled cells were performed using human B cells as targets and human NK cells as effector cells. B cells and NK cells were purified from human PBMC using the respective MACS cell isolation kit from Miltenyi Biotec. The isolated B cells were then labeled with 51Cr. Anti-CXCR5-40C01-VH1-Vk2 mAb, rituximab (positive control IgG mAb), anti-chicken with 10/1 E / T ratio of effector (E) and target (T) cells to measure cytotoxicity -Egg-Coculture was performed at 37 ° C for 4 hours using lysozyme mAb (negative control IgG mAb) or medium alone. The percentage of cell lysis was calculated using the formula: Percentage of specific lysis = ((experimental counts per minute (cpm)-spontaneous cpm)) / (maximum c. p.m.-spontaneous cpm))) * 100. The results shown in FIG. 14 indicate that the anti-CXCR540C01-VH1-Vk2 mAb has the ability to mediate ADCC on primary human B cells, the effect of which is the well described FDA approved anti -Shows that the effect of the CD20 antibody, rituximab, is comparable if not better.

2.11.アフコシル化抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3−IG1仲介ADCC
クロム51標識標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)アッセイは、標的細胞としてヒト又はカニクイザル(Macaca fascicularis)いずれかのCXCR5を安定的に発現するL1.2細胞(上記例1.7を参照)と、エフェクター細胞としてのヒトPBMCを使用して、実施された。細胞傷害性を測定するために、エフェクター(E)と標的(T)細胞を100/1 E/T割合にて、抗−CXCR5−40C01−VH1−Vk3−IgG1 mAb、抗−CXCR5−40C01−VH1−Vk3−IgG1低フコースmAb若しくは培地のみとともに4時間37℃で共培養した。細胞溶解のパーセンテージは、式を使用して算出した:特異的な溶解のパーセンテージ= ((毎分の実験的カウント(c.p.m.)−自発性c.p.m.)/(最大c.p.m.−自発性c.p.m.))×100。図15に表された結果は、抗−CXCR5−40C01−VH1−Vk3−IgG mAbが、ヒト又はカニクイザルいずれかのCXCR5を発現するL1.2標的細胞に対してADCCを仲介するための能力を有していることを示す。さらに、同様のアッセイ条件下において、アフコシル化バージョンのこの抗体(抗−CXCR5−40C01−VH1−Vk3−IgG1_低フコース)は、ヒト若しくはカニクイザルCXCR5のいずれかを発現する標的細胞に対して増強されたADCC活性を示す。
2.11. Afucosylated anti-CXCR5 40C01-VH1-Vk3-IG1-mediated ADCC
The antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) assay against chromium 51-labeled target cells was performed using L1.2 cells stably expressing either human or cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) CXCR5 as target cells (Example 1.7 above). And human PBMC as effector cells were performed. Anti-CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1 mAb, anti-CXCR5-40C01-VH1 at a ratio of 100/1 E / T of effector (E) and target (T) cells to measure cytotoxicity -Co-cultured with Vk3-IgG1 low fucose mAb or medium alone for 4 hours at 37 ° C. The percentage of cell lysis was calculated using the formula: Percentage of specific lysis = ((experimental counts per minute (cpm)-spontaneous cpm) / (max) c.p.m.-spontaneous c.p.m.)) x 100. The results presented in FIG. 15 show that the anti-CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG mAb has the ability to mediate ADCC to L1.2 target cells expressing either human or cynomolgus monkey CXCR5. Show what you are doing. Furthermore, under similar assay conditions, the afucosylated version of this antibody (anti-CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1_low fucose) was enhanced against target cells expressing either human or cynomolgus CXCR5 Indicates ADCC activity.

2.12.抗−CXCR5 40C01−VH1−Vk3−IgG1はヒトB細胞の除去を誘導する
5名のドナー由来のヒトPBMCは、濃度範囲にわたって抗−CXCR5抗体又はIgG1アイソタイプコントロール抗体の存在下で培養された。一晩のインキュベーション後、リンパ球集団内のCD19+B細胞のパーセンテージがフローサイトメーターで評価された。データは、アイソタイプコントロールに対して正規化され、各ドナーから統合された。図16中に示されるように、発明者らは、40C01−VH1−Vk3−IgG2_DI−NQ−HC2hは、B細胞の除去の原因ではないことを観察した。しかしながら、40C01−VH1−Vk3−IgG1及び40C01−VH1−Vk3−IgG1低フコースバージョンの両者とも、B細胞の除去を引き起こした。発明者らは、40C01−VH1−Vk3−IgG1低フコースバージョンは、低濃度の該抗体がB細胞除去を誘導することに必要であり、より強力であることを見出した。このデータは、40C01−VH1−Vk3−IgG1及び40C01−VH1−Vk3−IgG1低フコースは、B細胞の除去を誘導することができ、40C01−VH1−Vk3−IgG1低フコースは増強された効力を有することを証明した。
2.12. Anti-CXCR5 40C01-VH1-Vk3-IgG1 Induces Human B Cell Depletion Human PBMC from five donors were cultured in the presence of anti-CXCR5 antibody or IgG1 isotype control antibody over a concentration range. After overnight incubation, the percentage of CD19 + B cells in the lymphocyte population was assessed by flow cytometer. Data were normalized to isotype controls and integrated from each donor. As shown in FIG. 16, the inventors observed that 40C01-VH1-Vk3-IgG2_DI-NQ-HC2h was not responsible for the elimination of B cells. However, both 40C01-VH1-Vk3-IgG1 and 40C01-VH1-Vk3-IgG1 low-fucose versions caused B cell elimination. We found that the 40C01-VH1-Vk3-IgG1 low fucose version is more potent, as low concentrations of the antibody are required to induce B cell elimination. This data indicates that 40C01-VH1-Vk3-IgG1 and 40C01-VH1-Vk3-IgG1 low fucose can induce B cell elimination and 40C01-VH1-Vk3-IgG1 low fucose has enhanced potency I proved that.

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Claims (14)

a.配列番号:3を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号:5を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号:3を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号:6を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号:3を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号:7を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、又は
d.配列番号:4を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号:7を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、又は
を含む、CXCR5に結合するモノクローナル抗体又はそのCXCR5結合フラグメント。
a. A heavy chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 5,
b. A heavy chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 6,
c. A heavy chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 7, or
d. A monoclonal antibody that binds to CXCR5 or a CXCR5 binding fragment thereof , comprising: a heavy chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 4 and a light chain variable domain comprising or consisting of SEQ ID NO: 7 .
前記モノクローナル抗体が重鎖定常領域を含み、前記定常領域が、タイプIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4から選択される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。 The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the monoclonal antibody comprises a heavy chain constant region, and the constant region is selected from type IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. 請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はそのCXCR5結合フラグメント、の重鎖をコードするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding a heavy chain of the monoclonal antibody according to claim 1 or 2 or a CXCR5 binding fragment thereof. 請求項1に記載のモノクローナル抗体又はそのCXCR5結合フラグメント、の軽鎖をコードするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding a light chain of the monoclonal antibody according to claim 1 or a CXCR5 binding fragment thereof. 請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はそのCXCR5結合フラグメント、の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding the heavy chain and the light chain of the monoclonal antibody or the CXCR5 binding fragment thereof according to claim 1 or 2 . 請求項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 An expression vector comprising the polynucleotide of claim 3 . 請求項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 An expression vector comprising the polynucleotide of claim 4 . a. 請求項のポリヌクレオチド及び請求項のポリヌクレオチド;又は
b. 請求項のポリヌクレオチド、
を含む発現ベクター。
a. The polynucleotide of claim 3 and the polynucleotide of claim 4 ; or
b. The polynucleotide of claim 5 ,
An expression vector comprising
a. 請求項の発現ベクター及び請求項の発現ベクター、又は、
b. 請求項の発現ベクター、
を用いて形質転換された宿主細胞。
a. The expression vector of claim 6 and the expression vector of claim 7 , or
b. The expression vector of claim 8 ,
A host cell transformed with
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項の宿主細胞。 10. The host cell of claim 9 , wherein said cell is a mammalian cell. a. 請求項又は請求項10の宿主細胞を培養する工程、及び
b. 該宿主細胞によって製造される前記抗体を単離する工程、
を含む、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を製造する方法。
a. culturing the host cell of claim 9 or claim 10 , and
b. isolating the antibody produced by the host cell;
A method for producing the monoclonal antibody according to claim 1 or 2, comprising
請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項11に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to claim 1 or 2 , or the monoclonal antibody produced by the method according to claim 11 . 薬剤として使用するための、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項11に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体。 A monoclonal antibody according to claim 1 or 2 or a monoclonal antibody produced by the method according to claim 11 for use as a medicament. 自己免疫若しくは炎症性疾患及びがんの治療に使用するための、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項11に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体。 A monoclonal antibody according to claim 1 or 2 or a monoclonal antibody produced by the method according to claim 11 for use in the treatment of autoimmune or inflammatory diseases and cancer.
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