JP6480258B2 - COX-1 inhibitor - Google Patents
COX-1 inhibitor Download PDFInfo
- Publication number
- JP6480258B2 JP6480258B2 JP2015101996A JP2015101996A JP6480258B2 JP 6480258 B2 JP6480258 B2 JP 6480258B2 JP 2015101996 A JP2015101996 A JP 2015101996A JP 2015101996 A JP2015101996 A JP 2015101996A JP 6480258 B2 JP6480258 B2 JP 6480258B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- minutes
- compound
- formula
- solution
- alliinase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003260 cyclooxygenase 1 inhibitor Substances 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 185
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 108010092760 Alliin lyase Proteins 0.000 claims description 52
- OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N S-1-propenyl-L-cysteine sulfoxide zwitterion Chemical compound C\C=C\S(=O)C[C@H](N)C(O)=O OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N 0.000 claims description 47
- 102000010906 Cyclooxygenase 1 Human genes 0.000 claims description 39
- 108010037464 Cyclooxygenase 1 Proteins 0.000 claims description 39
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 101000783577 Dendroaspis angusticeps Thrombostatin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000783578 Dendroaspis jamesoni kaimosae Dendroaspin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 55
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 51
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 51
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 34
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 15
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 13
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 12
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- 229930189654 Zwiebelane Natural products 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 7
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- YIBNHAJFJUQSRA-YNNPMVKQSA-N prostaglandin H2 Chemical compound C1[C@@H]2OO[C@H]1[C@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H]2C\C=C/CCCC(O)=O YIBNHAJFJUQSRA-YNNPMVKQSA-N 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- MJPOWQTYEJVYKF-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxysulfanylprop-1-ene Chemical compound CC=CSO MJPOWQTYEJVYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 description 5
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 5
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- HKQYGTCOTHHOMP-UHFFFAOYSA-N formononetin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC=C2C1=O HKQYGTCOTHHOMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 4
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 4
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JTWUZULPZAALRN-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridine-4-carbaldehyde;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O JTWUZULPZAALRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 3
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 3
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 101000957724 Catostomus commersonii Corticoliberin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- RIKPNWPEMPODJD-UHFFFAOYSA-N formononetin Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=COC2=CC=CC=C2C1=O RIKPNWPEMPODJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 2
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008111 thiosulfinates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- MJPOWQTYEJVYKF-NSCUHMNNSA-N (E)-prop-1-en-1-SO-peroxol Chemical compound C\C=C\SO MJPOWQTYEJVYKF-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 0 *C(C1*)C(*)SC1O Chemical compound *C(C1*)C(*)SC1O 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220433 Albizia Species 0.000 description 1
- XUHLIQGRKRUKPH-GCXOYZPQSA-N Alliin Natural products N[C@H](C[S@@](=O)CC=C)C(O)=O XUHLIQGRKRUKPH-GCXOYZPQSA-N 0.000 description 1
- 229940077274 Alpha glucosidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical compound NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- XUHLIQGRKRUKPH-UHFFFAOYSA-N S-allyl-L-cysteine sulfoxide Natural products OC(=O)C(N)CS(=O)CC=C XUHLIQGRKRUKPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHLMCOCHAVMHLD-REOHCLBHSA-N S-oxy-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CS=O BHLMCOCHAVMHLD-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- XUHLIQGRKRUKPH-DYEAUMGKSA-N alliin Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C[S@@](=O)CC=C XUHLIQGRKRUKPH-DYEAUMGKSA-N 0.000 description 1
- 235000015295 alliin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003888 alpha glucosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 108010076637 carbon-sulfur lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000028406 carbon-sulfur lyase Human genes 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- AZWGLUKZZIPCEG-XVSDJDOKSA-N ethanol;(5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoic acid Chemical compound CCO.CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O AZWGLUKZZIPCEG-XVSDJDOKSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000021398 garlic paste Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 1
- RCCPEORTSYDPMB-UHFFFAOYSA-N hydroxy benzenecarboximidothioate Chemical compound OSC(=N)C1=CC=CC=C1 RCCPEORTSYDPMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 229940072113 onion extract Drugs 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- OTYNBGDFCPCPOU-UHFFFAOYSA-N phosphane sulfane Chemical compound S.P[H] OTYNBGDFCPCPOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- RVEZZJVBDQCTEF-UHFFFAOYSA-N sulfenic acid Chemical compound SO RVEZZJVBDQCTEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
本発明は、COX-1阻害活性を有する新規化合物及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a novel compound having COX-1 inhibitory activity and a method for producing the same.
タマネギは古くから世界中で広く食されている野菜の一つであり、人に対して有効な生理作用を示すことに関しては多くの報告がある（非特許文献１）。さらに、2002年に催涙成分生成酵素（LFS）が発見され、タマネギの催涙成分(LF)であるpropanthial S-oxideが、前駆物質であるPRENCSOに酵素アリイナーゼが作用して1-プロペニルスルフェン酸（E-1-propenylsulfenic acid）となり、1-プロペニルスルフェン酸がLFSにより異性化されて生じる機構が明らかとなった。このため、LFSの発現を抑制できれば、タマネギ中の有用成分の量が増加し、有用な生理作用の効果も強くなるのではないかと期待されていた（非特許文献２）。 Onion has long been one of the vegetables widely consumed all over the world, and there are many reports on showing effective physiological action to humans (Non-patent Document 1). Furthermore, a tear component producing enzyme (LFS) was discovered in 2002, and propantial S-oxide, a tear component (LF) of onion, acted on the precursor PRENCSO by the enzyme alliinase to produce 1-propenylsulfenic acid ( It became E-1-propenylsulfenic acid), and the mechanism resulting from 1-propenylsulfenic acid being isomerized by LFS was clarified. For this reason, if it was possible to suppress the expression of LFS, it was expected that the amount of useful components in the onion would increase and the effect of useful physiological actions would also become stronger (Non-patent Document 2).
過去に行われた研究で、PRENCSOのアリイナーゼ分解物は、1-プロペニルスルフェン酸であることや、この1-プロペニルスルフェン酸から誘導されるチオスルフィネートは不安定なため、短時間でZwiebelanesと呼ばれる化合物に変化することが報告されていた（非特許文献３）。さらに、RNAi技術を用いて作出したLFS抑制タマネギについての成分分析の結果から、LFS抑制タマネギでは、通常のタマネギに比べてチオスルフィネート量が増加していることや、Zwiebelane isomerと呼ばれる成分が増加していることが確認されていた。Zwiebelane isomerの１つの光学異性体については、ネギ香を有するタマネギ由来成分としての報告がある（特許文献１）。また、本発明者らはこれまでに、Zwiebelane isomerと呼ばれる化合物がシクロオキシゲナーゼ-1(COX-1)阻害剤やα-グルコシダーゼ阻害剤として有用なものであることを見出し報告している（特許文献２）。 In studies conducted in the past, it was found that the alliinase degradation product of PRENCSO is 1-propenyl sulfenic acid and the thiosulfinate derived from this 1-propenyl sulfenic acid is unstable, so in a short time It has been reported that the compound turns into a compound called Zwiebelanes (Non-patent Document 3). Furthermore, based on the results of component analysis of LFS-suppressed onions produced using RNAi technology, LFS-suppressed onions have an increased amount of thiosulfinate compared to normal onions, and a component called Zwiebelane isomer is It has been confirmed that it is increasing. One optical isomer of Zwiebelane isomer has been reported as an onion-derived component having a green onion (Patent Document 1). The present inventors have also found and reported that a compound called Zwiebelane isomer is useful as a cyclooxygenase-1 (COX-1) inhibitor or an α-glucosidase inhibitor (Patent Document 2) ).
しかしながら、Zwiebelane isomerは水溶液中で不安定であることから、製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合に分解しやすいといった問題があった。 However, since Zwiebelane isomer is unstable in aqueous solution, there is a problem that it is easily decomposed in the manufacturing process or when it is contained in a medicine or food and drink.
そこで、本発明は製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合においても安定な、COX-1を阻害活性を有する化合物、またその製造方法を提供する事を目的とする。 Therefore, the object of the present invention is to provide a compound having a COX-1 inhibitory activity and a method for producing the same, which are stable in the production process and also when contained in pharmaceuticals and foods and beverages.
本発明者らは低LFSタマネギの抽出液中の成分、及び、LFS非存在下でのPRENCSOのアリイナーゼ分解反応の反応液中の成分について鋭意研究を積み重ねた結果、これらの抽出液及び反応液中に前記Zwiebelane isomerとは異なるCOX-1阻害活性を有する新規化合物が存在し、当該化合物がZwiebelane isomerと比べて高い安定性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have intensively studied about the components in the extract of low LFS onion and the components in the reaction of the alliinase degradation reaction of PRENCSO in the absence of LFS, and as a result, these extracts and the reaction liquid The inventors of the present invention have found that there are novel compounds having a COX-1 inhibitory activity different from Zwiebelane isomer, and found that the compounds have high stability as compared to Zwiebelane isomer, thereby completing the present invention.
本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 式Ｉ：
R1は水素又は低級アルキル基であり、
R2及びR3は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R4は
R5及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R7は水素又は低級アルキル基であり、
ｎは3〜6の整数である。）
で表される、化合物又はその塩。
［２］ 式１：
［３］ 式２(a)：
［４］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ−１（COX-1）阻害剤。
［５］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を有効成分として含有する、血小板凝集抑制剤。
［６］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩を含有する組成物。
［７］［１］〜［３］の化合物及び／又はその塩より選択される一又は複数の化合物及び／又はその塩、あるいは［６］の組成物を含む、飲食品。
［８］［１］〜［３］のいずれかの化合物又はその塩、あるいはそれらを含む組成物の製造方法であって、
催涙成分生成酵素（ＬＦＳ）の活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより処理し、該化合物又はその塩を生成する工程
を含む、上記方法。
The present invention includes the following inventions.
[1] Formula I:
R 1 is hydrogen or a lower alkyl group,
R 2 and R 3 are the same or different and are lower alkyl groups,
R 4 is
R 5 and R 6 are the same or different and are lower alkyl groups,
R 7 is hydrogen or a lower alkyl group,
n is an integer of 3 to 6; )
Or a compound thereof or a salt thereof.
[2] Equation 1:
[3] Equation 2 (a):
[4] A cyclooxygenase-1 (COX-1) inhibitor comprising, as an active ingredient, one or more compounds selected from the compounds of [1] to [3] and / or salts thereof and / or salts thereof.
[5] A platelet aggregation inhibitor comprising one or more compounds selected from the compounds of [1] to [3] and / or salts thereof and / or salts thereof as an active ingredient.
[6] A composition comprising one or more compounds selected from the compounds of [1] to [3] and / or salts thereof and / or salts thereof.
[7] A food or drink comprising one or more compounds selected from the compounds of [1] to [3] and / or salts thereof and / or salts thereof, or the composition of [6].
[8] A method for producing the compound of any one of [1] to [3] or a salt thereof, or a composition containing them,
Treating the PRENCSO with alliinase under conditions where the activity of the lacrimal component producing enzyme (LFS) is reduced or eliminated, to produce the compound or a salt thereof.
本発明によれば、シクロオキシゲナーゼ-1(COX-1)を阻害する活性を有し、製造過程において、また医薬品や飲食品中に含めた場合においても安定な新規化合物、およびその製造方法が提供される。 According to the present invention, there are provided novel compounds which have the activity of inhibiting cyclooxygenase-1 (COX-1) and which are stable in the production process, and also when contained in medicines and foods, and a method for producing the same. Ru.
Ｉ．化合物
本発明の化合物は式Ｉ：
R1は水素又は低級アルキル基であり、
R2及びR3は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R4は
R5及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
R7は水素又は低級アルキル基であり、
nは3〜6の整数である。）
で表される平面構造を有する。
I. Compounds The compounds of the invention have the formula I
R 1 is hydrogen or a lower alkyl group,
R 2 and R 3 are the same or different and are lower alkyl groups,
R 4 is
R 5 and R 6 are the same or different and are lower alkyl groups,
R 7 is hydrogen or a lower alkyl group,
n is an integer of 3 to 6; )
It has a planar structure represented by
本明細書において、「低級アルキル基」とは、炭素原子数が１〜６個の直鎖又は分枝のアルキル基が好ましく、炭素原子数が１〜４個の直鎖又は分枝のアルキル基がより好ましい。例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル基等が挙げられる。 In the present specification, the "lower alkyl group" is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. Is more preferred. For example, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and the like can be mentioned.
式Ｉで表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式Ｉで表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。 A plurality of optical isomers exist in a compound having a planar structure represented by Formula I. The compound of the present invention may be a compound having a planar structure represented by Formula I, and the structure of the optical isomer is not particularly limited.
本発明において「式Ｉで表される化合物」とは、式Ｉで表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。 In the present invention, “the compound represented by the formula I” means a mixture of a plurality of optical isomers of a compound having a planar structure represented by the formula I and an isolated or enriched individual optical isomer Encompass both.
本発明において塩とは、医薬、飲食品等の用途に許容される慣用的なものを意味し、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩、有機アミン塩、有機酸塩、無機酸塩、スルホン酸塩等が挙げられる。 In the present invention, a salt means a conventional one acceptable for uses such as medicine, food and drink etc. For example, alkali metal salt (sodium salt, potassium salt etc.), alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt) Etc., ammonium salts, organic amine salts, organic acid salts, inorganic acid salts, sulfonates and the like.
一実施形態において、本発明の化合物は式1：
本発明において「式1で表される化合物」とは、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
In the present invention, “the compound represented by
式1で表される化合物は、構造式に基づいて化学的に合成しても良いし、あるいは後述する化合物の製造方法に基づいて調製することができる。すなわち、LFSの活性が低減された又は消失した条件下でのPRENCSOのアリイナーゼによる分解反応の反応物や、低LFSタマネギの粉砕物より、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物を得ることができる。
The compound represented by
具体的には、当該反応物及び粉砕物には、以下の条件：
カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)、65分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて65分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650 nm、
の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラムにおいて、保持時間約13分〜約17分の間に主要な4つのピーク（Peak1〜Peak4）として現れる（図１）、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体化合物が含まれる。これらの光学異性体化合物は相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい。
Specifically, the following conditions are applied to the reaction product and the pulverized product:
Column: Thermo Fisher
In the chromatogram obtained by high performance liquid chromatography (HPLC), a retention time of about 13 minutes to about 17 minutes appears as four main peaks (Peak1 to Peak4) (FIG. 1). And a plurality of optical isomer compounds of the compound having These optical isomer compounds may be obtained separately from one another or may be obtained as a mixture of a plurality of optical isomers.
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約13分〜約17分の間に現れる主要な4つのピークのうち、保持時間が3番目に長いPeak3（実施例1-3.では27.5分から28.5分）に対応する画分中の式1で表される化合物は、下記実施例1-3.に示す物理化学的特徴を有する。
Among chromatograms by HPLC under the above conditions, among the four main peaks appearing between retention time of about 13 minutes and about 17 minutes,
式1で表される化合物は単離精製された形態の化合物で提供されてもよいし、式1で表される化合物を含む組成物として提供されてもよい。式1で表される化合物を含む組成物としては、組成物の固形分に対して当該化合物を0.001質量％以上、0.01質量％以上、0.1質量％以上、1質量％以上、10質量％以上、30質量％以上、50質量％以上、70質量％以上、又は90質量％以上の量で含む組成物が挙げられる。このような組成物は、後述する化合物の製造方法において調製することができる。
The compound represented by
式1で表される化合物は、水との水和物や、低級アルコール等との溶媒和物の形態で存在していてもよい。水和物又は溶媒和物は医薬、飲食品等の用途に許容される水和物又は溶媒和物であれば特に限定されない。すなわち、本発明における「式1で表される化合物」には、それらの水和物又は溶媒和物の形態も下位概念として包含される。
The compound represented by
また、一実施形態において、本発明の化合物は式2：
R1及びR7は同一又は異なって水素又は低級アルキル基であり、
R2, R3, R5 及びR6は同一又は異なって低級アルキル基であり、
ｎは3〜6の整数である。）
で表される平面構造を有する。式2で表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式2で表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
Also, in one embodiment, the compounds of the invention have the formula 2:
R 1 and R 7 are the same or different and are hydrogen or a lower alkyl group,
R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are the same or different and are lower alkyl groups,
n is an integer of 3 to 6; )
It has a planar structure represented by The compound having a planar structure represented by
本発明において「式2で表される化合物」とは、式2で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
In the present invention, “the compound represented by
好ましくは、式2で表される化合物は式２(a)：
本発明において「式２(a)で表される化合物」とは、式２(a)で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。また、本発明において「式２(b)で表される化合物」とは、式２(b)で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。 In the present invention, the “compound represented by Formula 2 (a)” is a mixture of a plurality of optical isomers of a compound having a planar structure represented by Formula 2 (a), and is isolated or enriched. It includes both individual optical isomers. In the present invention, “the compound represented by Formula 2 (b)” means a mixture of a plurality of optical isomers of a compound having a planar structure represented by Formula 2 (b), and isolation or concentration enhancement And both of the individual optical isomers.
式2で表される化合物は、構造式に基づいて化学的に合成しても良いし、あるいは後述する化合物の製造方法において調製することができる。LFSの活性が低減された又は消失した条件下でのPRENCSOのアリイナーゼによる分解反応の反応物、及び低LFSタマネギの粉砕物において、式2で表される平面構造を有する化合物の混合物が含まれる。
The compound represented by
具体的には、当該反応物及び粉砕物には、以下の条件：
カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，65分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて65分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650 nm、
の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に主要な6つのピークが現れ（Peak A, Peak B, Peak C1, C2, Peak D1, D2）、そのうち保持時間が最も短いピーク及び保持時間が次に短いピークに式2で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体化合物が含まれる（図1）。これらの光学異性体化合物は相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい。
Specifically, the following conditions are applied to the reaction product and the pulverized product:
Column: Thermo Fisher
In the chromatogram obtained by high performance liquid chromatography (HPLC), six major peaks appear during a retention time of about 35 minutes to about 46 minutes (Peak A, Peak B, Peak C1, C2, Peak D1, D2), Among them, a peak having the shortest retention time and a peak having the second shortest retention time include a plurality of optical isomer compounds of the compound having a planar structure represented by Formula 2 (FIG. 1). These optical isomer compounds may be obtained separately from one another or may be obtained as a mixture of a plurality of optical isomers.
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に現れる主要な6つのピークのうち、保持時間が最も短いPeak A（実施例3.では23分から26分）に対応する画分中には式2(a)で表される化合物が含まれる。 Among the six major peaks appearing between retention time of about 35 minutes to about 46 minutes in the chromatogram by HPLC under the above conditions, Peak A (23 minutes to 26 minutes in Example 3) having the shortest retention time The corresponding fractions contain the compound represented by formula 2 (a).
また、上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約35分〜約46分の間に主要な6つのピークのうち、保持時間が次に短いPeak B（実施例3.では28.5分から31分）に対応する画分中の式2(b)で表される化合物が含まれる。 Further, in the chromatogram by HPLC under the above conditions, Peak B (the second retention time is 28.5 minutes to 31 minutes in the third example) among the six major peaks having a retention time of about 35 minutes to about 46 minutes. And the compound represented by Formula 2 (b) in the fraction corresponding to
式2(a)で表される化合物及び式2(b)で表される化合物は、下記実施例3.に示す物理化学的特徴をそれぞれ有する。 The compound represented by Formula 2 (a) and the compound represented by Formula 2 (b) respectively have the physicochemical characteristics shown in Example 3 below.
式2で表される化合物は単離精製された形態の化合物で提供されてもよいし、式2で表される化合物を含む組成物として提供されてもよい。式2で表される化合物を含む組成物としては、組成物の固形分に対して当該化合物を0.001質量％以上、0.01質量％以上、0. 1質量％以上、1質量％以上、10質量％以上、30質量％以上、50質量％以上、70質量％以上、又は90質量％以上の量で含む組成物が挙げられる。このような組成物は、後述する化合物の製造方法において調製することができる。
The compound represented by
式2で表される化合物は、アルコール、エーテル、アセトン、ヘキサン、クロロホルム等の有機溶媒との溶媒和物の形態で存在していてもよい。溶媒和物は医薬、飲食品等の用途に許容される溶媒和物であれば特に限定されない。すなわち、本発明における「式2で表される化合物」には、それらの溶媒和物の形態も下位概念として包含される。
The compound represented by
ＩＩ．化合物の製造方法
本発明の化合物の製造は特に限定されず、構造式に基づいて化学的に合成しても良いが、好ましくは、PRENCSOをアリイナーゼにより処理する分解反応を含む方法により行うことができる。タマネギを粉砕することによりこの分解反応は進行するが、通常のタマネギ粉砕物中にはLFSが含まれるため、PRENCSOのアリイナーゼによる分解物（1-プロペニルスルフェン酸）はLFSによるLF(催涙成分)の合成に用いられて速やかに消費されるため、本発明の化合物は蓄積され難い。
II. Method for Producing the Compound Production of the compound of the present invention is not particularly limited, and may be chemically synthesized based on the structural formula, but can preferably be carried out by a method including a decomposition reaction of treating PRENCSO with alliinase . Although this degradation reaction proceeds by grinding the onion, since LFS is contained in the normal onion grind, the degradation product of PRENCSO by alliinase (1-propenylsulfenic acid) is LF by LFS (tearing component) The compounds of the present invention are difficult to accumulate because they are used for the synthesis of and rapidly consumed.
そこで本明細書では、本発明の化合物を以下の2つの手法を含む方法により製造することを開示するが、該化合物を工業的に製造するには、LFSの活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む、下記第二の製造方法が好適である。 Thus, the present specification discloses that the compound of the present invention is produced by a method including the following two methods, in order to industrially produce the compound, conditions under which the activity of LFS is reduced or eliminated Below, the following 2nd manufacturing method including the process of decomposing PRENCSO by alliinase is suitable.
本発明の化合物又は該化合物を含む組成物の第一の製造方法は、LFSの活性が低減された低LFSタマネギを粉砕する工程を含む。第二の製造方法は、LFSの活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む。 The first method of producing the compound of the present invention or a composition containing the compound comprises the step of grinding a low LFS onion with reduced LFS activity. The second production method comprises the step of degrading PRENCSO with alliinase under conditions where the activity of LFS is reduced or eliminated.
上記第一の製造方法について詳述する。 The first manufacturing method will be described in detail.
低LFSタマネギは通常のタマネギと比較してLFSの活性が低減したタマネギであり、遺伝子組み換えや突然変異処理により得ることができる。好ましい低LFSタマネギは、親株（通常のタマネギ）のLFS活性の20分の1以下、好ましくは40分の1以下、より好ましくは160分の1以下、特に好ましくは400分の1以下のLFS活性を有する。LFS活性は以下の方法により測定することができる。 The low LFS onion is an onion with reduced LFS activity as compared to normal onions, and can be obtained by genetic modification or mutation treatment. Preferred low LFS onions have a LFS activity which is at most 1/20, preferably at most 1/40, more preferably at most 1/160, particularly preferably at least 1/400 that of the parent strain (normal onion). Have. LFS activity can be measured by the following method.
＜LFS活性測定方法＞
LFS活性は、酵素反応で発生した催涙成分（LF）のピーク面積に基づいて定量する。測定試料（タマネギ抽出液）10μlに対し、250 U/mlの精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/mlの精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させる。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、LF発生量を測定する。
<Method for measuring LFS activity>
LFS activity is quantified based on the peak area of tear component (LF) generated in the enzyme reaction. 40 μl of 250 U / ml purified alliinase solution is added to 10 μl of the measurement sample (onion extract), and 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution is further added to start the enzyme substrate reaction. After 3 minutes, 1 μl of the reaction solution is injected into HPLC to measure the amount of LF generation.
ここで用いるHPLC条件としては以下の条件を適用することができる：
カラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm（センシュウ科学）,移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの, 温度：35℃, 検出波長：254nm, 流速：0.6ml/min。この条件を用いると、LFのピークは、保持時間9.6分に検出される。
The following conditions can be applied as HPLC conditions used here:
Column: Pegasil ODS 4.6 mmΦ × 25 cm (Censhu Science), mobile phase: 7 to 3 mixture of acidic water pH 3.3 and methanol, temperature: 35 ° C., detection wavelength: 254 nm, flow rate: 0.6 ml / min. Using this condition, the LF peak is detected at a retention time of 9.6 minutes.
移動相として用いた酸性水pH3.3としてはTFA溶液を使用することができる。作製方法は以下である。蒸留水2リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気する。脱気した蒸留水2リットルにTFA（アミノ酸配列分析用特製試薬 ナカライテスク 34902-11 1ｍｌアンプル×5本入り）1mlを加え、ストック溶液（TFA溶液（×10））とする。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で10倍に希釈して、酸性水 pH3.3を作製することができる。精製アリイナーゼ溶液及び精製PRENCSO溶液としては、下記実施例1-1.及び1-2.に記載の方法で作製したものを用いることができる。 A TFA solution can be used as the acidic water pH 3.3 used as the mobile phase. The production method is as follows. Pour 2 liters of distilled water into a sealable container and degas using an aspirator. To 2 liters of degassed distilled water, add 1 ml of TFA (special reagent for amino acid sequence analysis Nacalai Tesque 34902-11 1 ml ampoule × 5 bottles) to make a stock solution (TFA solution (× 10)). The stock solution can be diluted 10-fold with degassed distilled water to make acidic water pH 3.3. As the purified alliinase solution and the purified PRENCSO solution, those prepared by the methods described in the following Examples 1-1 and 1-2 can be used.
本発明では低LFSタマネギとして該タマネギの鱗茎（一般に、「バルブ」または「球」と呼ばれる部分）、或いは鱗茎から伸びる鞘葉の部分を用いることができる。 In the present invention, as the low LFS onion, the bulb (generally referred to as "bulb" or "ball") of the onion, or a portion of sheath leaf extending from the bulb can be used.
低LFSタマネギの粉砕はホモジナイザー、ミキサー等の通常の粉砕装置により行うことができる。このようにして得られた低LFSタマネギの粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。 The grinding of the low LFS onion can be carried out by a conventional grinding apparatus such as a homogenizer, a mixer or the like. The ground product of the low LFS onion thus obtained or the solution obtained by removing solids from the ground product can be used as a composition containing the compound of the present invention.
上記第一の製造方法は更に、低LFSタマネギの粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液から本発明の化合物を抽出する工程を含んでもよい。本発明の化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち徐々に生成されてくることから、粉砕後は速やかに抽出を行っても目的の化合物を十分に得ることはできない。そこで、低LFSタマネギ粉砕物から、粉砕後1〜120分、好ましくは3〜90分経過した後に、当該化合物を抽出することが好ましい。 The first production method may further include the step of extracting the compound of the present invention from the ground product of the low LFS onion, or a solution obtained by removing solids from the ground product. Since the compound of the present invention is gradually produced after treating PRENCSO with alliinase, the target compound can not be sufficiently obtained even after extraction after pulverization. Then, it is preferable to extract the said compound, after 1 to 120 minutes, preferably 3 to 90 minutes, have passed after grinding from a low LFS onion ground material.
低LFSタマネギ粉砕物からの本発明の化合物の抽出は、低LFSタマネギ粉砕物又は粉砕物から固形物を取り除いた溶液を水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどより適宜選択される一又は複数の抽出溶媒を用いて抽出する方法と、低LFSタマネギの粉砕物から固形物を取り除いた溶液を合成吸着剤により処理して前記化合物を合成吸着剤に吸着させ、次いでメタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水可溶な有機溶媒を含む溶液により、吸着された前記化合物を溶出させる方法等が挙げられる。特に、式１の化合物は水溶性の性質を示すため、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等を用いて抽出及び溶出することができる。また、式2の化合物は、例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム等を用いて抽出及び溶出することができる。合成吸着剤としては、ダイアイオンHP-20（三菱化学株式会社）やアンバーライトXAD-2（オルガノ株式会社）など各種吸着剤が使用できる。このようにして得られた抽出物は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。
Extraction of the compound of the present invention from low LFS onion grinds water, methanol, ethanol, acetonitrile, acetone, ether, ethyl acetate, hexane, dichloromethane, a solution obtained by removing solids from the low LFS onion grinds or grinds A method of extraction using one or more extraction solvents appropriately selected from chloroform and the like, and a solution obtained by removing solid matter from a ground product of low LFS onion is treated with a synthetic adsorbent to adsorb the compound onto the synthetic adsorbent And then the adsorbed compound is eluted with a solution containing a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, propanol, acetonitrile, acetone or the like. In particular, since the compound of the
上記第一の製造方法は更に、得られた抽出物より式１及び／又は式２で表される化合物を精製する工程を含んでもよい。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の手段により行うことができる。
The first production method may further include the step of purifying the compound represented by
次に、上記第二の製造方法について詳述する。 Next, the second manufacturing method will be described in detail.
原料として用いられるS-1-プロペニル-システインスルフォキシド(PRENCSO)は、天然由来の場合、以下の構造：
原料として用いるPRENCSOは合成されたものであってもよいし、タマネギ等に由来するものであってもよい。更に、PRENCSOを含む組成物を、PRENCSO原料として使用することもできる。例えば、タマネギを加熱処理して酵素を失活又は酵素活性を低減させる。加熱処理による酵素活性の低減又は失活は、少なくともLFSの活性が、未加熱のタマネギにおけるLFSの活性と比べて、20分の1以下、40分の1以下、160分の1以下、400分の1以下、800分の1以下、又はそれ以下であるか、あるいは消失していればよい。次いで加熱処理したタマネギを粉砕して調製されたジュースやペースト（加熱タマネギジュース、加熱タマネギペースト）はPRENCSOを含む組成物であり、PRENCSO原料としてアリイナーゼ処理に供することができる。 PRENCSO used as a raw material may be synthesized or may be derived from onion or the like. Furthermore, a composition comprising PRENCSO can also be used as a PRENCSO feed. For example, heat treating the onion to inactivate the enzyme or reduce the enzyme activity. The reduction or inactivation of the enzyme activity by heat treatment is at least 20 times lower, 1/40 lower than 1 / 160th lower, 400 minutes at least the activity of LFS compared to the activity of LFS in unheated onion Or less, or less than or equal to 1/800, or less or less or less. Next, a juice or paste (heated onion juice, heated onion paste) prepared by crushing heat-treated onion is a composition containing PRENCSO, and can be subjected to alliinase treatment as a PRENCSO raw material.
アリイナーゼ(E.C.4.4.1.4, S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide lyase)はアルキル（アルケニル）システインスルフォキシドをデヒドロアラニンとスルフェン酸に分解する酵素であり、アリインを分解する事からその名がつけられた。現在ではC-Sリアーゼとも呼ばれている（出典：香辛料成分の食品機能 岩井和夫、中谷延二 編集、(株)光生館 P174-175 (1989)）。上記第二の製造方法に用いることができるアリイナーゼの起源は特に限定されず、タマネギ、ニンニク、ネギ、ニラ、ラッキョなどのネギ属の他、アブラナ科のブロッコリーやカリフラワー、マメ科の灌木Albizzia lophantha (出典は上記と同じ)等に由来するものを使用することができる。 Alliinase (EC 4.4.1.4, S-alk (en) yl-L-cysteine sulfoxide lyase) is an enzyme that breaks down alkyl (alkenyl) cysteine sulphoxide into dehydroalanine and sulfenic acid, and because it degrades alliin It was given a name. At present, it is also called C-S lyase (Source: Food function of spice ingredients Kazuo Iwai, Edited by Nakatani ed., Koseikan Co., Ltd. P174-175 (1989)). The origin of alliinase which can be used for the second production method is not particularly limited, and broccoli and cauliflower of the Brassicaceae family and shrubs of the leguminous family Albizzia lophantha in addition to the leek genus such as onion, garlic, leek, leek and lachyo Sources derived from the same as above can be used.
PRENCSOをアリイナーゼで処理する条件は特に限定されない。しかし、アリイナーゼの特性は由来によって異なるため、反応条件を使用する個々のアリイナーゼの特性に合わせるとPRENCSOの分解を効率化できる。例えば、アリイナーゼがニンニク由来の場合は、至適pHの範囲は広いのでpHは5〜8の範囲でよく、温度は37℃が最適である。一方、タマネギ由来のアリイナーゼを使う場合は、pHを7.5〜8.6にすると酵素活性が最適化され、Welsh onionの葉由来のアリイナーゼを用いる場合は、pHを7.0にすると最適化される（出典：香辛料成分の食品機能 岩井和夫、中谷延二 編集、(株)光生館 P174-175 (1989)）。なお、アリイナーゼは、ピリドキサールリン酸を補酵素とするため、実施例1-2.の様に、ピリドキサールリン酸を添加したバッファーを使う事も、アリイナーゼの活性を最適化するのに役立つ。 The conditions for treating PRENCSO with alliinase are not particularly limited. However, since the characteristics of alliinase differ depending on the origin, the decomposition of PRENCSO can be streamlined by combining the reaction conditions with the characteristics of the individual alliinase used. For example, when alliinase is derived from garlic, the optimum pH range is wide, so the pH may be in the range of 5 to 8, and the temperature is optimally 37 ° C. On the other hand, when using onion-derived alliinase, the enzyme activity is optimized when the pH is 7.5 to 8.6, and when using the alliinase derived from the leaves of Welshionion, it is optimized when the pH is 7.0 (source: spices) Food Function of the Ingredient Kazuo Iwai, Yuji Nakatani Edit, Inc. Koseikan P174-175 (1989)). Since alliinase uses pyridoxal phosphate as a coenzyme, using a buffer to which pyridoxal phosphate is added as in Example 1-2 also helps to optimize the activity of alliinase.
このようにして得られた、PRENCSOをアリイナーゼで分解処理して得られた反応液は、本発明の化合物を含む組成物として利用することができる。 The reaction solution obtained by degrading PRENCSO with alliinase thus obtained can be used as a composition containing the compound of the present invention.
上記第二の製造方法は更に、PRENCSOをアリイナーゼで分解処理して得られた反応液から本発明の化合物を抽出する工程を含んでもよい。本発明の化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち徐々に生成されてくることから、処理後は速やかに抽出を行っても目的の化合物を十分に得ることはできない。そこで、処理後少なくとも1〜120分、好ましくは3〜90分経過した後に、当該化合物を抽出することが好ましい。抽出に際しては、反応物を遠心分離して、上清と沈殿物に分けて、それぞれより、目的の化合物を抽出することができる。すなわち、上清からは上記式1で表される化合物を抽出することができ、沈殿物からは上記式2で表される化合物を抽出することができる。上清からの上記式1で表される化合物の抽出は、例えば水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の抽出溶媒を用いて行うことができる。また、沈殿物からの上記式2で表される化合物の抽出は、例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム等の抽出溶媒を用いて行うことができる。得られた抽出物は、各式で表される化合物を含む組成物として利用することができる。
The second production method may further include the step of extracting the compound of the present invention from the reaction solution obtained by degrading PRENCSO with alliinase. Since the compound of the present invention is gradually produced after treating PRENCSO with alliinase, the target compound can not be sufficiently obtained even if extraction is performed immediately after treatment. Therefore, it is preferable to extract the compound after at least 1 to 120 minutes, preferably 3 to 90 minutes after the treatment. At the time of extraction, the reaction product can be centrifuged to be separated into a supernatant and a precipitate, from which the desired compound can be extracted. That is, the compound represented by
上記第二の製造方法は更に、抽出物から各式で表される化合物を精製する工程を含んでもよい。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の手段により行うことができる。 The second production method may further include the step of purifying the compound represented by each formula from the extract. Purification can be performed by means of silica gel column chromatography, HPLC or the like.
得られた式2で表される化合物又は式2で表される化合物を含む組成物は、凍結乾燥することにより、式2で表される化合物の活性（すなわち、COX-1阻害活性）を維持しながら、安定して保存することができる。
The obtained compound represented by the
ＩＩＩ．用途
本発明の化合物は、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) 阻害剤の有効成分として有用である。本発明の化合物はCOX-1阻害作用を有しているため、血小板内のアラキドン酸からプロスタグランジンH2への酵素反応を阻害し、血小板の凝集を抑制することによる血栓形成の予防等に有用である。
III. Uses The compounds of the present invention are useful as active ingredients for cyclooxygenase-1 (COX-1) inhibitors. Since the compound of the present invention has a COX-1 inhibitory action, it is useful for the prevention of thrombus formation by inhibiting the enzymatic reaction of arachidonic acid in platelets to prostaglandin H2 and suppressing platelet aggregation. It is.
本発明の化合物は、飲食品や医薬品などの最終的な形態において許容される成分であって、経口摂取可能な成分と共に組成物の形態とすることができる。 The compound of the present invention is an acceptable ingredient in the final form of food and drink, medicine and the like, and can be in the form of a composition together with an orally ingestible ingredient.
本発明の化合物を含む組成物は、飲食品組成物または医薬品組成物（医薬部外品組成物を含む。以下同じ）等の任意の形態であってよい。 The composition containing the compound of the present invention may be in any form such as a food and drink composition or a pharmaceutical composition (including quasi-drug composition, hereinafter the same).
飲食品組成物の形態としては、飲料、固形食品、半固形食品等が挙げられる。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態が挙げられる。半固形食品としては、例えばジャムのようなペーストの形態、チューイングガムのようなガムの形態が挙げられる。これらの飲食品組成物には本発明の化合物のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、飲食品原料として通常用いられる種々の成分を配合することができる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。 As a form of a food-drinks composition, a drink, solid food, semi-solid food etc. are mentioned. Specific examples of the beverage include fruit juice beverages, soft drinks, alcoholic beverages and the like. As solid food, for example, tablets (tablets) including sugar cane, troche and the like, sugar coated tablets, granules, powder drinks, powder soup such as powder soup, block confections such as biscuits, capsules, jelly and the like There are various forms such as the form of Semi-solid foods include, for example, the form of paste such as jam, and the form of gum such as chewing gum. In addition to the compounds of the present invention, various components that are usually used as food and beverage ingredients can be blended into these food and beverage compositions as long as the desired effects of the present invention are not impaired. These components may be used alone or in combination.
医薬品組成物としては種々の投与形態用に製剤化されたものを使用することができる。医薬品組成物の製剤形態は特に制限はなく、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒、散剤、チュアブル剤等の経口剤、注射剤等の非経口剤等の通常の製剤形態が挙げられる。上記製剤は本発明の化合物と、賦形剤等の製薬上許容される他の成分とを使用して常法により調製することができる。 As the pharmaceutical composition, those formulated for various administration forms can be used. The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and examples thereof include conventional dosage forms such as liquids, tablets, granules, fine particles, powders, oral agents such as chewable agents, parenteral agents such as injections, and the like. The above formulations can be prepared in a conventional manner using the compound of the present invention and other pharmaceutically acceptable ingredients such as excipients.
本発明の化合物を含む飲食品組成物や医薬品組成物を摂取又は投与することにより、有効成分として含有する本発明の化合物のCOX-1阻害作用により、COX-1を阻害することにより改善される疾患又は症状を予防又は治療する等することができる。 It is improved by inhibiting COX-1 by the COX-1 inhibitory action of the compound of the present invention contained as an active ingredient by ingesting or administering a food or drink composition or a pharmaceutical composition containing the compound of the present invention Diseases or symptoms can be prevented or treated.
あるいは、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む組成物は、in vitroにおいてCOX-1を阻害するための試薬として用いられてもよい。 Alternatively, a compound of the invention or a composition comprising a compound of the invention may be used as a reagent for inhibiting COX-1 in vitro.
実施例1. 式1の化合物の単離精製
実施例1-1. 精製PRENCSO溶液の調製
（１）加熱タマネギからPRENCSOの抽出
生タマネギ3玉（約1000g）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで12分間加熱した。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えてから粗砕し、粗砕液を8000rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、陽イオン交換樹脂IR120B（Hタイプ）を加えて攪拌したのち、吸引濾過により、樹脂を回収した。回収した樹脂に蒸留水1Lを加え、これに濃アンモニア水を加えてpH8.5に調整した。吸引濾過により、上清を回収し、残った樹脂に再度pH8.5のアンモニア水を加えた。再度、吸引濾過により、上清を回収した。得られた溶液に1N塩酸を加えてpH7.0に中和した。エバポレーターを用いて溶液を濃縮乾固した。
EXAMPLE 1 Isolation and Purification of the Compound of
（２）PRENCSOの精製
残留物に蒸留水50mlを加えて溶解させた。得られた粗PRENCSO溶液を中圧逆相クロマトグラフィーによって精製した。必要に応じて、さらにHPLC（カラム：ODS，移動相：酸性水pH3.3，温度：35℃，UV：230nm）によって精製した。カラムから得られた溶出液をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて乾固し、精製PRENCSO粉末（約100mg）を得た。
(2) Purification of PRENCSO The residue was dissolved in 50 ml of distilled water. The resulting crude PRENCSO solution was purified by medium pressure reverse phase chromatography. As necessary, the product was further purified by HPLC (column: ODS, mobile phase: acidic water pH 3.3, temperature: 35 ° C., UV: 230 nm). The eluate obtained from the column was dried using an evaporator and a lyophilizer to obtain purified PRENCSO powder (about 100 mg).
実施例1-2. 精製アリイナーゼ溶液の調製
（１）ニンニクを粉砕・酸沈
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やしておいた。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を4℃にセットして冷却しておいた。ニンニク片（100g）に等量のバッファー A（後述）を加えて、ミキサーで粉砕した。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめ、粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾した。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞った。得られたろ液を4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、上清を回収した。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、pHをモニターしながら、酢酸を加えていき、pHを4.0に調整した。pHが4.0になったら、そのまま5分間静置した。沈殿の出てきたサンプルを4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、遠心ペレットを回収した（バッファー Aを使用した）。
Example 1-2. Preparation of purified alliinase solution (1) Pulverizing garlic and acid precipitation First, the mug of the mixer was put in a refrigerator and cooled. In addition, the rotor was set in a low temperature centrifuge, and the temperature was set to 4 ° C. and cooled. An equal volume of buffer A (described later) was added to garlic pieces (100 g) and ground with a mixer. A double-gauze gauze was fastened with a rubber band to the mouth of a jug placed on ice, and the crushed material was poured onto the gauze and filtered. After the filtrate was obtained to some extent, the crushed material on the gauze was wrapped with gauze and squeezed. The obtained filtrate was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered. Acetic acid was added while monitoring the pH while stirring the collected supernatant of the supernatant on ice, and the pH was adjusted to 4.0. When pH reached 4.0, it was left to stand for 5 minutes. The sedimented sample was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the centrifugation pellet was collected (buffer A was used).
回収したペレットを50ml〜100mlにして（バッファー A）、そのまま、5℃で30分間静置した。回収したペレットの懸濁液を4℃、12000rpmで10分間遠心分離した。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のpHを6.5に調整した。これをアリイナーゼ粗抽出液とした。 The collected pellet was made 50 ml to 100 ml (buffer A), and left as it is at 5 ° C. for 30 minutes. The collected pellet suspension was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The pH of the collected supernatant was adjusted to 6.5 using a 1 N aqueous solution of sodium hydroxide. This was used as a crude extract of alliinase.
（２）ハイドロキシアパタイトカラム処理
上記アリイナーゼ粗抽出液（遠心上清）をバッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにアプライした。アリイナーゼは、ハイドロキシアパタイトカラムに黄色のバンドとなって吸着された。サンプルをアプライしたハイドロキシアパタイトカラムを300mlのバッファー Aで洗浄した。洗浄の終了したハイドロキシアパタイトカラムに300mlのバッファー C（後述）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って10mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
(2) Hydroxyapatite Column Treatment The above crude alliinase extract (centrifugal supernatant) was applied to a hydroxyapatite column equilibrated with buffer A. Alliinase was adsorbed as a yellow band on the hydroxyapatite column. The hydroxyapatite column to which the sample was applied was washed with 300 ml of buffer A. The washed hydroxyapatite column was flushed with 300 ml of buffer C (described later) for elution. The eluate was fractionated in 10 ml portions using a fraction collector, and the fraction from which the yellow eluate was fractionated was collected.
（３）ConAカラムによるアリイナーゼの精製
集めたフラクション（20ml）の1/20倍volの20mM塩化カルシウム及び塩化マグネシウム溶液を加えて、サンプル溶液のカルシウムイオン及びマグネシウムイオン濃度を上げた。そうした上で、再生し、startingバッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）で平衡化したConAカラムにアプライした。サンプルをアプライした後のConAカラムを50mlのstartingバッファーで洗浄した。洗浄の終了したConAカラムに50mlのConA溶出バッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って2mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
(3) Purification of alliinase with Con A
（４）精製したアリイナーゼの濃縮方法
ConAカラム精製によって得られた黄色い溶出液（アリイナーゼ溶液）10mlをCENTRIPLUS CONCENTRATORS(up to 15ml,No.4421)（ミリポア社製）に入れた。CENTRIPLUS CONCENTRATORSを、4℃に冷却した遠心機にセットし、3000rpmで30分遠心した。中身を一度確認した後、もう一度、3000rpmで30分間遠心した。濃縮したアリイナーゼは250または500U/mlになるように適宜バッファー Dで希釈し、使用時まで-80℃で保存した。
(4) Method of concentrating purified alliinase
10 ml of a yellow eluate (aliinase solution) obtained by Con A column purification was placed in CENTRIPLUS CONCENTRATORS (up to 15 ml, No. 4421) (manufactured by Millipore). CENTRIPLUS CONCENTRATORS was set in a centrifuge cooled to 4 ° C., and centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. After checking the contents once, it was centrifuged again at 3000 rpm for 30 minutes. The concentrated alliinase was appropriately diluted with buffer D to 250 or 500 U / ml and stored at -80.degree. C. until use.
［バッファー A］
上記バッファー A(pH7.0)（アリイナーゼ精製用50mMバッファーA）は次のように調製した。50mMリン酸水素二カリウム溶液（5.22gを600mlに溶解）と50mMリン酸二水素カリウム溶液（3.4gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
[Buffer A]
The above buffer A (pH 7.0) (50 mM buffer A for alliinase purification) was prepared as follows. A 50 mM dipotassium hydrogen phosphate solution (5.22 g dissolved in 600 ml) and a 50 mM potassium dihydrogen phosphate solution (3.4 g dissolved in 500 ml) were prepared. The pH was adjusted to 7.0 by mixing the two while monitoring the pH. One volume of glycerol was added to 9 volumes of the completed buffer and mixed well. 5.3 mg of pyridoxal phosphoric acid was added to 1 L of the glycerol-containing buffer solution and mixed. The finished buffer was stored at 10 ° C.
［バッファー C］
上記バッファー C(pH 7.0)（アリイナーゼ精製用500mMバッファー C）は、次のように調製した。500mMリン酸水素二カリウム溶液（43.6gを500mlに溶解）と500mMリン酸二水素カリウム溶液（34.0gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
[Buffer C]
The above buffer C (pH 7.0) (500 mM buffer C for alliinase purification) was prepared as follows. A 500 mM dipotassium hydrogen phosphate solution (43.6 g dissolved in 500 ml) and a 500 mM potassium dihydrogen phosphate solution (34.0 g dissolved in 500 ml) were prepared. The pH was adjusted to 7.0 by mixing the two while monitoring the pH. One volume of glycerol was added to 9 volumes of the completed buffer and mixed well. 5.3 mg of pyridoxal phosphoric acid was added to 1 L of the glycerol-containing buffer solution and mixed. The finished buffer was stored at 10 ° C.
［バッファー D］
上記バッファー D(pH6.5)（アリイナーゼ希釈用100mMバッファー D）は、次のように調製した。100mMリン酸水素二カリウム溶液（10.44gを600mlに溶解）と100mMリン酸二水素カリウム溶液（6.8gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを6.5に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
[Buffer D]
The above buffer D (pH 6.5) (100 mM buffer D for alliinase dilution) was prepared as follows. A 100 mM dipotassium hydrogen phosphate solution (10.44 g dissolved in 600 ml) and a 100 mM potassium dihydrogen phosphate solution (6.8 g dissolved in 500 ml) were prepared. The pH was adjusted to 6.5 by mixing the two while monitoring the pH. One volume of glycerol was added to 9 volumes of the completed buffer and mixed well. 5.3 mg of pyridoxal phosphoric acid was added to 1 L of the glycerol-containing buffer solution and mixed. The finished buffer was stored at 10 ° C.
実施例1-3. 式1の化合物の誘導と単離精製
2mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液1200μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液800μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後にチューブを15000rpmで5分間遠心し、上清と沈殿物を回収した。
Example 1-3. Derivation, isolation and purification of the compound of
In a 2 ml microtube, 1200 μl of 250 U / ml alliinase solution was taken. The enzyme reaction was started by adding 800 μl of a 20 mg / ml aqueous solution of PRENCSO to this. After 90 minutes from the start of the reaction, the tube was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes to recover the supernatant and the precipitate.
得られた上清について、島津製作所社の大量分取HPLCシステムを用いて、反応後期生成物-SUPを単離精製した。HPLC条件は、検出波長：210nm、カラム：GL Sciences Inertsil ODS-3 250 mm X 20 mm, 5μm、移動相（CH3CN/H2O）：0分（16%/84%），16分（16%/84%），35分（35%/65%），36分（90%/10%），41分（90%/10%），42分（16%/84%），65分（16%/84%）、流速：15ml/分とした。 The reaction supernatant product-SUP was isolated and purified from the resulting supernatant using Shimadzu Corporation's large-scale preparative HPLC system. HPLC conditions are: detection wavelength: 210 nm, column: GL Sciences Inertsil ODS-3 250 mm × 20 mm, 5 μm, mobile phase (CH3CN / H2O): 0 minutes (16% / 84%), 16 minutes (16% / 84) %), 35 minutes (35% / 65%), 36 minutes (90% / 10%), 41 minutes (90% / 10%), 42 minutes (16% / 84%), 65 minutes (16% / 84) %, Flow rate: 15 ml / min.
HPLC保持時間20分から32分までの画分3（Fr-3）の内、Peak3（HPLC保持時間27.5分から28.5分）について分取した（図2）。分取したPeak3を含む画分について、エバポレーターを用いて濃縮乾固後、NMRとHPLC-Orbitrapを用いて解析した結果、式1の平面構造を有することが特定できた。
Among fractions 3 (Fr-3) with an HPLC retention time of 20 minutes to 32 minutes, separation was performed for Peak 3 (HPLC retention time 27.5 minutes to 28.5 minutes) (FIG. 2). The fraction containing the separated
また、画分3の内、Peak1, Peak2及びPeak4については、HPLC-Orbitrapを用いたMSスペクトル解析の結果、Peak3と同様のスペクトルを示したことから、Peak3の異性体画分であることが確認できた（図3-1,3-2）。
In addition, among
Peak3として現れる式1の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色粉末
（２）HR MS [M+H]+：m/z 221.0661 (221.0664 calcd. for C9H17O2S2)
（３）分子式：C9H16O2S2
（４）溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 230 (in 43% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 6.53, 6.45, 5.19, 4.08, 2.31, 2.03, 1.93, 1.24, 1.05
（７）13C NMRスペクトル：δ 139.10, 131.66, 84.39, 73.70, 53.52, 42.59, 17.51, 16.64, 12.43
（８）HPLC保持時間：15.5〜15.9分 (ピークトップの検出時間:15.67分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ポジティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：3.5 kV、Capillary温度：300℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
The compound having a planar structure of
(1) Appearance: colorless powder (2) HR MS [M + H] + : m / z 221.0661 (221.0664 calcd. For C 9 H 17 O 2 S 2 )
(3) Molecular formula: C 9 H 16 O 2 S 2
(4) Solubility: water, methanol, ethanol, acetonitrile (5) UV absorption spectrum: λ max nm 230 (in 43% CH 3 CN)
(6) 1 H NMR spectrum: δ 6.53, 6.45, 5.19, 4.08, 2.31, 2.03, 1.93, 1.24, 1.05
(7) 13 C NMR spectrum: δ 139.10, 131.66, 84.39, 73.70, 53.52, 42.59, 17.51, 16.64, 12.43
(8) HPLC retention time: 15.5 to 15.9 minutes (peak top detection time: 15.67 minutes)
(HPLC conditions) HPLC: Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000, column: Thermo Fisher
(Orbitrap conditions) Ionaization mode: Positive, Heater temperature: 200 ° C, Spray voltage: 3.5 kV, Capillary temperature: 300 ° C, Sheath gas: 50, Auxiliary gas: 15, Collision energy: 35
実施例2. 式1の化合物の誘導
（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から
1.5mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液30μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液20μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から3分または90分後に10μg/mlホルモノネチン含有メタノール150μlを添加し、30秒間混合した。チューブを15000rpmで3分間遠心し、得られた上清について、Thermo Fisher Scientific社のHPLC-Orbitrapを用いて下記の条件にて分析を行った。
Example 2 Derivation of the Compound of Formula 1 (1) From a Mixture of Alliinase and PRENCSO
30 μl of 250 U / ml alliinase solution was collected in a 1.5 ml microtube. An enzyme reaction was initiated by adding 20 μl of a 20 mg / ml aqueous solution of PRENCSO thereto. Three minutes or 90 minutes after the start of the reaction, 150 μl of methanol containing 10 μg / ml formononetin was added and mixed for 30 seconds. The tube was centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes, and the obtained supernatant was analyzed using HPLC-Orbitrap of Thermo Fisher Scientific under the following conditions.
[HPLC条件]
HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250 mm X 4.6 mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10 mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
[HPLC conditions]
HPLC: Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000, column: Thermo Fisher
[Orbitrap条件]
Ionaizationモード：ポジティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：3.5 kV、Capillary温度：300℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
[Orbitrap Condition]
Ionaization mode: Positive, Heater temperature: 200 ° C, Spray voltage: 3.5 kV, Capillary temperature: 300 ° C, Sheath gas: 50, Auxiliary gas: 15, Collision energy: 35
結果を図4に示す。HPLC保持時間13〜17分にピークが観察され、式1の化合物が誘導されたことが確認された。また、式1の化合物は反応開始から90分後においても十分に存在していたのに対して、Zwiebelane isomerは、反応開始から90分後には顕著に減少していることが確認できた。これは式1の化合物が、Zwiebelane isomerと比べて、水溶液中にてより安定な化合物であることを示す。
The results are shown in FIG. A peak was observed at an HPLC retention time of 13-17 minutes, confirming that the compound of
（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から
ニンニクジュースはニンニクの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を粉砕して調製した。また、加熱タマネギジュースはタマネギの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を加熱処理した後、粉砕して調製した。
(2) From a liquid mixture of garlic juice and heated onion juice Garlic juice was prepared by crushing the cocoons extending from garlic bulbs and bulbs. In addition, the heated onion juice was prepared by heat-treating the bulbs of onions and the sheath leaves extending from the bulbs, followed by crushing.
1.5mlマイクロチューブにニンニクジュース30μlを採った。ここに加熱タマネギジュース300μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後に10 μg/mlホルモノネチン含有メタノールを990μl添加した後、チューブを15000rpmで5分間遠心し、得られた上清について、上記「（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から」に記載のHPLC-Orbitrap条件にて分析を行った。但し、検出は式1の化合物のプロダクトイオンであるm/z 203でイオンクロマトグラム抽出を行った。
30 μl of garlic juice was collected in a 1.5 ml microtube. To this was added 300 μl of heated onion juice to initiate the enzyme reaction. After 990 μl of 10 μg / ml formononetin-containing methanol was added 90 minutes after the start of the reaction, the tube was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the obtained supernatant was described in the above “(1) from a mixed solution of alliinase and PRENCSO” The analysis was performed under the HPLC-Orbitrap conditions of However, for detection, ion chromatogram extraction was performed at m / z 203 which is a product ion of the compound of
結果を図5に示す。HPLC保持時間13〜17分にピークが観察され、式1の化合物が誘導されたことが確認された。
The results are shown in FIG. A peak was observed at an HPLC retention time of 13-17 minutes, confirming that the compound of
実施例3. 式2の化合物の単離精製
実施例1-3で回収された沈殿物を1mlのメタノールに溶解し、島津製作所社の大量分取HPLCシステムを用いて、反応後期生成物-PPTを単離精製した。HPLC条件は、検出波長：210 nm、カラム：GL Sciences Inertsil ODS-3 250 mm X 20 mm, 5μm、移動相（CH3CN/H2O）：0分（50%/50%），40分（90%/10%），45分（90%/10%），46分（50%/50%），70分（50%/50%）、流速：10ml/分とした。
Example 3 Isolation and Purification of the Compound of
HPLC保持時間23分から26分までのPeak Aと、28.5分から31分までのPeak Bについて分取した（図6）。分取したPeak A及びPeak Bを含む各画分について、エバポレーターを用いて濃縮乾固後、NMRとHPLC-Orbitrapを用いて解析した結果、Peak Aは式2(a)の平面構造を有するトリスルフィドタイプの構造を有すること、Peak Bは式2(b)の平面構造を有するテトラスルフィドタイプの構造を有することが特定できた。 The HPLC retention time was separated for Peak A from 23 to 26 minutes and Peak B from 28.5 to 31 minutes (FIG. 6). Each fraction containing the separated Peak A and Peak B was concentrated to dryness using an evaporator and then analyzed using NMR and HPLC-Orbitrap. As a result, Peak A has a planar structure of formula 2 (a). It could be specified that having a structure of sulfide type, Peak B has a structure of tetrasulfide type having a planar structure of Formula 2 (b).
Peak Aとして現れる式2(a)の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色油状
（２）HR MS [M＋HCOO]-：m/z 403.0205 (403.0205 calcd. for C13H23O4S5)
（３）分子式：C12H22O2S5
（４）溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 280 (in 74.8% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 5.18, 5.14, 4.49, 4.34, 2.12, 1.85, 1.84, 1.73, 1.18, 1.16, 1.10, 1.04
（７）13C NMRスペクトル：δ 86.57, 83.41, 65.99, 64.19, 52.81, 51.20, 49.08, 47.25, 15.15, 14.79, 14.76, 12.68
（８）HPLC保持時間：35〜36分 (ピークトップの検出時間:35.65分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
The compound having a planar structure of Formula 2 (a) appearing as Peak A has the following physicochemical properties.
(1) Appearance: colorless oil (2) HR MS [M + HCOO] - : m / z 403.0205 (403.0205 calcd. For C 13 H 23 O 4 S 5 )
(3) Molecular formula: C 12 H 22 O 2 S 5
(4) Solubility: methanol, ethanol, acetonitrile, acetone, ether, ethyl acetate, hexane, chloroform (5) UV absorption spectrum: λ max nm 280 (in 74.8% CH 3 CN)
(6) 1 H NMR spectrum: δ 5.18, 5.14, 4.49, 4.34, 2.12, 1.85, 1.84, 1.73, 1.18, 1.16, 1.10, 1.04
(7) 13 C NMR spectrum: δ 86.57, 83.41, 65.99, 64.19, 52.81, 51.20, 49.08, 47.25, 15.15, 14.79, 14.76, 12.68
(8) HPLC retention time: 35 to 36 minutes (peak top detection time: 35.65 minutes)
(HPLC conditions) HPLC: Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000, column: Thermo Fisher
(Orbitrap conditions) Ionaization mode: Negative, Heater temperature: 200 ° C, Spray voltage: 2.5 kV, Capillary temperature: 275 ° C, Sheath gas: 50, Auxiliary gas: 15, Collision energy: 35
また、Peak Bとして現れる式2(b)の平面構造を有する化合物は以下の物理化学的性状を有する。
（１）外観：無色油状
（２）HR MS [M-H]-：m/z 388.9871 (388.9871 calcd. for C12H21O2S6)
（３）分子式：C12H22O2S6
（４）溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム
（５）紫外吸収スペクトル：λmax nm 300 (in 80.4% CH3CN)
（６）1H NMRスペクトル：δ 5.19, 5.17, 4.52, 4.39, 2.15, 1.89, 1.86, 1.74, 1.20, 1.16, 1.11, 1.05
（７）13C NMRスペクトル：δ 86.63, 83.55, 66.14, 64.13, 52.74, 51.28, 49.34, 47.54, 15.09, 14.92, 14.69, 12.69
（８）HPLC保持時間：38.5〜39.5分 (ピークトップの検出時間:38.96分)
（HPLC条件）HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出190〜650nm
（Orbitrap条件）Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
Moreover, the compound which has a planar structure of Formula 2 (b) which appears as Peak B has the following physicochemical properties.
(1) Appearance: colorless oil (2) HR MS [MH] - : m / z 388.9871 (388.9871 calcd. For C 12 H 21 O 2 S 6 )
(3) Molecular formula: C 12 H 22 O 2 S 6
(4) Solubility: Methanol, ethanol, acetonitrile, acetone, ether, ethyl acetate, hexane, chloroform (5) UV absorption spectrum: λmax nm 300 (in 80.4% CH 3 CN)
(6) 1 H NMR spectrum: δ 5.19, 5.17, 4.52, 4.39, 2.15, 1.89, 1.86, 1.74, 1.20, 1.16, 1.11, 1.05
(7) 13 C NMR spectrum: δ 86.63, 83.55, 66.14, 64.13, 52.74, 51.28, 49.34, 47.54, 15.09, 14.92, 14.69, 12.69
(8) HPLC retention time: 38.5 to 39.5 minutes (peak top detection time: 38.96 minutes)
(HPLC conditions) HPLC: Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000, column: Thermo Fisher
(Orbitrap conditions) Ionaization mode: Negative, Heater temperature: 200 ° C, Spray voltage: 2.5 kV, Capillary temperature: 275 ° C, Sheath gas: 50, Auxiliary gas: 15, Collision energy: 35
実施例4. 式2の化合物の誘導
（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から
実施例2の「（１）アリイナーゼとPRENCSOの混合液から」にて得られた上清について、Thermo Fisher Scientific社のHPLC-Orbitrapを用いて同様の条件にて分析を行った。
Example 4 Derivation of the Compound of Formula 2 (1) From a Mixture of Alliinase and PRENCSO The supernatant obtained from “a mixture of alliinase and PRENCSO” of Example 2 was obtained from Thermo Fisher Scientific Inc. The analysis was performed using HPLC-Orbitrap under the same conditions.
[HPLC条件]
HPLC：Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000、カラム：Thermo Fisher Scientific ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5 μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/10mM HCOONH4 H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 51分(18%/82%)，60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後51分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5ml/分、検出190〜650nm
[HPLC conditions]
HPLC: Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000, column: Thermo Fisher
[Orbitrap条件]
Ionaizationモード：ネガティブ、Heater温度：200℃、Spray電圧：2.5 kV、Capillary温度：275℃、Sheathガス：50、Auxiliaryガス：15、Collisionエネルギー：35
[Orbitrap Condition]
Ionaization mode: Negative, Heater temperature: 200 ° C, Spray voltage: 2.5 kV, Capillary temperature: 275 ° C, Sheath gas: 50, Auxiliary gas: 15, Collision energy: 35
結果を図4に示す。HPLC保持時間35〜46分にピークが観察され、式2の化合物が誘導されたことが確認された。また、式1の化合物と同じく、式2の化合物は反応開始から90分後においても十分に存在していることが確認できた。これは式2の化合物が、Zwiebelane isomerと比べて、水溶液中にてより安定な化合物であることを示す。また、HPLC-Orbitrapの分析で検出されたPeak C1, C2, Peak D1, D2は、精密質量から算出される組成式とMSスペクトル解析の結果、ペンタスルフィドタイプ、ヘキサスルフィドタイプの構造を有することが確認できた（図7-1, 7-2, 7-3）。
The results are shown in FIG. A peak was observed at
（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から
実施例2の「（２）ニンニクジュースと加熱タマネギジュースの混合液から」にて得られた上清について、上記「アリイナーゼとPRENCSOの混合液」と同様の条件にてHPLC-Orbitrap分析を行った。但し、式2の化合物のプロダクトイオンであるm/z 227および259でイオンクロマトグラム抽出を行った。
(2) From the liquid mixture of garlic juice and heated onion juice For the supernatant obtained in "(2) From the liquid mixture of garlic juice and heated onion juice" in Example 2, the above "mixed liquid of alliinase and PRENCSO" HPLC-Orbitrap analysis was performed under the same conditions as in. However, ion chromatogram extraction was performed at m / z 227 and 259 which are product ions of the compound of
結果を図８に示す。HPLC保持時間35〜40分にピークが観察され、式2(a)の化合物及び式2(b)の化合物が誘導されたことが確認された。 The results are shown in FIG. A peak was observed at an HPLC retention time of 35 to 40 minutes, confirming that the compound of formula 2 (a) and the compound of formula 2 (b) were derived.
実施例5. COX-1阻害活性
＜使用試薬＞
20または25 U/μlのCOX-1（Cayman Chemical：76011）を100mM Tris-HCl（pH 8.0）で2.5 U/μlに希釈した。COX-1の補酵素として、ヘム（Cayman Chemical：760116）を100mM Tris-HCl（pH 8.0）で22.7倍希釈した。基質として、22mMのアラキドン酸エタノール溶液（Cayman Chemical）を0.5mM KOH溶液で110μMに希釈した。ポジティブコントロールとして、濃度の異なるアスピリン（Cayman Chemical：70260 / 179.2mM、44.8mM、11.2mM、2.8mM）のエタノール溶液を調製した。
Example 5. COX-1 inhibitory activity <reagent used>
20 or 25 U / μl of COX-1 (Cayman Chemical: 76011) was diluted to 2.5 U / μl with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0). Heme (Cayman Chemical: 760116) was diluted 22.7 times with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) as a coenzyme of COX-1. As a substrate, 22 mM arachidonic acid ethanol solution (Cayman Chemical) was diluted to 110 μM with 0.5 mM KOH solution. As a positive control, ethanol solutions of aspirin (Cayman Chemical: 70260 / 179.2 mM, 44.8 mM, 11.2 mM, 2.8 mM) at different concentrations were prepared.
阻害活性試験用試料として、実施例1-3で分取した式1の化合物を含む画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、ならびに実施例3で単離精製した式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物（10μg, 20μg, 40μg, 80μg, 120μg, 160μg）及び実施例3で単離精製した式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物（11μg, 22μg, 44μg, 87μg, 131μg, 175μg）をそれぞれ含むメタノール溶液、を調製した。
As a sample for inhibitory activity test, a three-step diluted aqueous solution of the concentrated solution of
＜実験方法＞
1.5 mlのマイクロチューブに200mM Tris-HCl（pH 8.0）Buffer、蒸留水、ヘム、COX-1を下表に従って添加した。次に、テスト区では各種濃度のアスピリン、あるいは式1の化合物を含む画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、あるいは各種濃度の式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物を含むメタノール溶液、または式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物を含むメタノール溶液を添加して24℃の恒温槽で5分加温した。その後、アラキドン酸溶液を加えて24℃の恒温槽で更に1分加温した後、800μlのエタノールを添加して酵素反応を止めた。一方、Blank区ではアスピリン、画分3の濃縮液の3段階希釈水溶液、各種濃度の式2(a)又は式2(b)の化合物を含むメタノール溶液の代わりに、エタノール、蒸留水、メタノールをそれぞれ添加して上記と同様の操作を行った。各反応液をUPLC-MS/MSで分析を行い、アラキドン酸のCOX-1による反応産物であるプロスタグランジンH2（PGH2）を検出した。試料の酵素阻害率は、以下の式で求めた。
<Experimental method>
In a 1.5 ml microtube, 200 mM Tris-HCl (pH 8.0) Buffer, distilled water, heme, COX-1 were added according to the table below. Next, in the test area, aspirin in various concentrations, or a three-step diluted aqueous solution of a concentrate of
酵素阻害率（%）＝｛（ブランク区のPGH2のピーク面積−テスト区のPGH2のピーク面積）／ブランク区のPGH2のピーク面積）｝＊100 Enzyme inhibition rate (%) = {(peak area of PGH2 in blank area-peak area of PGH2 in test area) / peak area of PGH2 in blank area) * 100
［UPLC-MS/MS条件］
UPLC：Waters Acquity、カラム：Waters Acquity UPLC BEH C18 100mm X 2.1mm, 1.7μm、カラムオーブン：40℃、移動相（1mM トリエチルアミン（TEA）in CH3CN/1mM TEA in H2O）：0分(5%/95%), 10分(60%/40%), 10.5分(80%/20%), 15.5分(80%/20%), 15.51分(5%/95%), 40分(5%/95%)、流速：0.3 ml/分、サンプルトレイ：5℃
検出器：Micromass Quattro Premier XE、Ionizationモード：ネガティブ、Capillary電圧：3 kV、Cone電圧：15 V、Source温度：120℃、Desolvation温度：350℃、Coneガス流速：50 L/hr、Desolvationガス流速：600 L/hr、Collisionエネルギー：16 eV、MRM条件：Parent m/z=351, Daughter m/z=271
[UPLC-MS / MS conditions]
UPLC: Waters Acquity, Column: Waters Acquity
Detector: Micromass Quattro Premier XE, Ionization mode: negative, Capillary voltage: 3 kV, Cone voltage: 15 V, Source temperature: 120 ° C., Desolvation temperature: 350 ° C., Cone gas flow rate: 50 L / hr, Desolvation gas flow rate: 600 L / hr, Collision energy: 16 eV, MRM conditions: Parent m / z = 351, Daughter m / z = 271
＜結果＞
その結果、アスピリン、式1の化合物を含む画分3、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物には、それぞれCOX-1阻害活性があることを確認した（図９）。
<Result>
As a result, aspirin,
COX-1阻害に要するIC50値で比較すると、下記表２に示すとおり、本評価系でのアスピリンのIC50（酵素反応液200μl中での濃度）はおよそ3.3mMであったのに対して、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物のIC50は720μM、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物のIC50は464μMであった。すなわち、式2(a)のトリスルフィドタイプの化合物はアスピリンの約5倍、式2(b)のテトラスルフィドタイプの化合物はアスピリンの約7倍、COX-1阻害活性が高いことがわかった。 In comparison with the IC 50 values required for COX-1 inhibition, as shown in Table 2 below, the IC 50 (concentration in 200 μl of enzyme reaction solution) of aspirin in this evaluation system was approximately 3.3 mM. , IC 50 of the trisulfide compounds of the type formula. 2 (a) 720μM, IC 50 of the tetrasulfide compounds of the type formula. 2 (b) was 464MyuM. That is, it has been found that the trisulfide type compound of the formula 2 (a) is about 5 times that of aspirin, and the tetrasulfide type compound of the formula 2 (b) is about 7 times that of aspirin and the COX-1 inhibitory activity is high.
実施例6. 安定性
（１）凍結乾燥した式1の化合物
1.5mlマイクロチューブに250U/mlのアリイナーゼ溶液10μlを採った。ここに20mg/mlのPRENCSO水溶液20μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から90分後にチューブを15000rpmで5分間遠心し、上清及び沈殿物を回収した。
Example 6 Stability (1) Lyophilized Compound of
10 μl of 250 U / ml alliinase solution was collected in a 1.5 ml microtube. An enzyme reaction was initiated by adding 20 μl of a 20 mg / ml aqueous solution of PRENCSO thereto. After 90 minutes from the start of the reaction, the tube was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes to collect the supernatant and the precipitate.
次に上清を凍結乾燥し40℃または50℃で保存した。40℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28, 56, 84日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。50℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。酵素反応終了直後のサンプルについては、反応終了後に20μlの蒸留水を添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。凍結乾燥直後及び保存開始後のサンプルについては、50μlの蒸留水を添加混合した後、10μlを検液として同様にCOX-1阻害活性試験に供した。 The supernatant was then lyophilized and stored at 40 ° C or 50 ° C. For samples stored at 40 ° C., the stability was confirmed using COX-1 inhibitory activity as an index immediately after completion of the enzyme reaction, immediately after lyophilization, and after 8, 14, 28, 56, 84 days after the start of storage. For samples stored at 50 ° C., stability was confirmed using COX-1 inhibitory activity as an index immediately after completion of the enzyme reaction, immediately after lyophilization, and after 8, 14, 28 days after the start of storage. For the sample immediately after completion of the enzyme reaction, 20 μl of distilled water was added and mixed after completion of the reaction, and then 10 μl was subjected to the COX-1 inhibitory activity test shown in Example 5 as a test solution. Immediately after lyophilization and after the start of storage, 50 μl of distilled water was added and mixed, and 10 μl was similarly subjected to a COX-1 inhibitory activity test as a test solution.
その結果、両保存温度においても保存経過時間と共に、COX-1阻害活性は減衰することが確認された（図１０）。すなわち、凍結乾燥した式1の化合物は不安定であることを確認した。
As a result, it was confirmed that the COX-1 inhibitory activity was attenuated with the storage elapsed time also at both storage temperatures (FIG. 10). That is, it was confirmed that the freeze-dried compound of
（２）凍結乾燥した式2の化合物
上記「（１）凍結乾燥した式1の化合物」にて回収した沈殿物に150μlの蒸留水を添加混合し、15000rpmで5分間遠心し、沈殿を回収した。次に沈殿を凍結乾燥し40℃または50℃で保存した。40℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28, 56, 84日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。50℃保存のサンプルについては、酵素反応終了直後、凍結乾燥直後、保存開始後8, 14, 28日間経過後にCOX-1阻害活性を指標として安定性を確認した。酵素反応終了直後のサンプルについては、回収した沈殿に50μlのメタノールを添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。一方、凍結乾燥直後及び保存開始後のサンプルについては、50μlのメタノールを添加混合した後、10μlを検液として実施例5に示したCOX-1阻害活性試験に供した。
(2) Lyophilized Compound of
その結果、両保存温度においても保存経過時間と共に、COX-1阻害活性は減衰しないことが確認された（図１１）。すなわち、凍結乾燥した式2の化合物は安定であることを確認した。
As a result, it was confirmed that the COX-1 inhibitory activity was not attenuated with the storage elapsed time even at both storage temperatures (FIG. 11). That is, it was confirmed that the lyophilized compound of
実施例7． ラット血小板凝集抑制効果（短期投与）
血小板凝集抑制効果についてSDラット（雄）を用いて評価を行った。即ち、1群7匹の10週齢Slc:SD(SPF)雄（日本エスエルシー株式会社）を市販固型飼料CRF-1（オリエンタル酵母工業株式会社）、および水を自由摂取させて6日間飼育した。その後、コンピュータを用いた層別無作為化割付により、体重が各群で均一になるようコントロール群、被験物質投与群、アスピリン投与群の3群に分けた。コントロール群には、蒸留水で2倍希釈したバッファーD、被験物質投与群には、実施例1-1，1-2で作製した40mg/ml精製PRENCSOと500U/ml精製アリイナーゼを1:1の割合で混合し室温で90分反応させた後、凍結乾燥後にPRENCSOの最終濃度が2mg/mlとなるように2倍希釈バッファーDで溶解または縣濁させたもの、アスピリン投与群には、3mg/mlとなるようにアスピリンを注射用水で溶解または縣濁させたものを、それぞれ10ml/kg（ラット体重）になるようにフレキシブル胃ゾンデおよび注射筒を用いて強制経口投与した。また投与は午前11時から12時の間に行い、投与期間は4日間とした。
Example 7 Rat platelet aggregation inhibitory effect (short-term administration)
Evaluation was carried out using a SD rat (male) for the platelet aggregation inhibitory effect. That is, a group of 7 10-week-old Slc: SD (SPF) males (Nippon SLC Co., Ltd.) are reared for 6 days with free intake of commercial solid feed CRF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and water. did. After that, by stratified randomization assignment using a computer, it was divided into three groups, a control group, a test substance administration group, and an aspirin administration group, so that the weight was uniform in each group. In the control group, buffer D diluted 2-fold with distilled water, and in the test substance administration group, the 40 mg / ml purified PRENCSO prepared in Examples 1-1 and 1-2 and the 500 U / ml purified alliinase were 1: 1. The mixture was mixed in proportions and reacted at room temperature for 90 minutes, and after lyophilization it was dissolved or suspended in 2-fold dilution buffer D so that the final concentration of PRENCSO would be 2 mg / ml. A solution of aspirin dissolved or suspended in water for injection to give ml was orally administered orally using a flexible gastroscope and syringe to give 10 ml / kg (body weight of the rat). The administration was performed between 11:00 am and 12:00, and the administration period was 4 days.
投与期間中は、全例について1日1回の頻度で一般状態の観察、投与開始日および血小板凝集能測定日に体重測定を実施した。また最終投与日前日（投与3日目）の17時から絶食を行い、翌日（投与4日目）の経口投与の3時間後に35mg/kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与の麻酔下にて、腹部大動脈に注射針を挿入して、5mlシリンジ（3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液を0.5ml充填）で5mlの採血（3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液1容に対して血液が9容）を行った。 During the administration period, body weight measurement was performed on observation of general condition, administration start date and platelet aggregation ability measurement day on a frequency of once a day for all cases. In addition, fasting is performed from 17:00 on the day before the final administration day (the third day of administration), and 3 days after oral administration on the next day (the fourth day of administration), the abdomen is under anesthesia with intraperitoneal administration of 35 mg / kg pentobarbital sodium With a needle inserted into the aorta, draw 5 ml of blood using a 5 ml syringe (filled with 0.5 ml of 3.8 w / v% trisodium citrate solution) and 9 blood per 1 volume of 3.8 w / v% trisodium citrate solution. I did).
採取した血液を25℃、220 X gで10分間遠心分離したのち、上層の多血小板血漿（Platelet-Rich Plasma:PRP）を採取した。下層を25℃、2,300 X gで15分間遠心分離し、上層（Platelet-Poor Plasma:PPP）を採取した。PRPおよびPPP画分の血小板数をそれぞれ自動血球計数装置（Sysmex F-820、シスメックス株式会社）により測定し、血小板数を5.0 X 105 cells/μlに調整した。 The collected blood was centrifuged at 220 × g for 10 minutes at 25 ° C., and then the upper platelet-rich plasma (Platelet-Rich Plasma: PRP) was collected. The lower layer was centrifuged at 2,300 × g at 25 ° C. for 15 minutes, and the upper layer (Platelet-Poor Plasma: PPP) was collected. The platelet counts of PRP and PPP fractions were respectively measured by an automatic blood cell counter (Sysmex F-820, Sysmex Corporation), and the platelet count was adjusted to 5.0 × 10 5 cells / μl.
調整したPRPを専用キュベットに240μl入れ、37℃で90秒間保温した後、62.5μg/mlコラーゲン溶液を10μl添加し、血小板凝集能測定装置（MCMヘマトレーサー313M）を用いて血小板凝集能を測定した。測定時間はコラーゲン添加後10分間とし、得られた最大凝集率（%）を採用した。 240 μl of the prepared PRP was put in a dedicated cuvette, kept at 37 ° C. for 90 seconds, 10 μl of 62.5 μg / ml collagen solution was added, and platelet aggregation was measured using a platelet aggregation measurement device (MCM hematracer 313 M) . The measurement time was 10 minutes after collagen addition, and the maximum aggregation rate (%) obtained was adopted.
結果を図12に示す。尚、各群の代表値は平均値±標準誤差で表した。統計解析はコントロール群と被験物質投与群、アスピリン投与群の間で、ダネットの多重比較検定を行った。有意水準は5%（*）及び1%（**）で表示した。被験物質投与群では、血小板最大凝集率がコントロールと比較して有意に減少していることが確認できた（図12）。 The results are shown in FIG. In addition, the representative value of each group was represented by average value +/- standard error. Statistical analysis performed Dunnett's multiple comparison test between the control group, the test substance administration group, and the aspirin administration group. The significance level is indicated by 5% (*) and 1% (**). In the test substance administration group, it was confirmed that the platelet maximum aggregation rate was significantly reduced as compared to the control (FIG. 12).
実施例8． ラット血小板凝集抑制効果（長期投与）
（１）被験物質の調製
タマネギの鱗茎や鱗茎から伸びる鞘葉を加熱処理した後、粉砕して調製した加熱タマネギジュースに、その1/200当量のすりおろしニンニクペーストを混合させたのち、室温で60分間反応させたものを、凍結乾燥して得られた粉末（式１及び式２の化合物を含む）を、式２の化合物が所定の濃度にて含まれるように、蒸留水、又はクエン酸緩衝液で再懸濁させたものを、被験物質として以下の実験に利用した。
Example 8 Rat platelet aggregation inhibitory effect (long-term administration)
(1) Preparation of test substance Heat treated the bulbs of onion, and the sheath leaf extending from the bulbs, and
（２）ラット血小板凝集効果確認試験
被験物質をSDラット（雄）に6週間投与したときの、血小板凝集抑制効果について評価を行った。即ち、1群7匹の5週齢Slc:SD(SPF)雄(日本エスエルシー株式会社) を市販固型飼料CRF‐1(オリエンタル酵母工業株式会社)、及び水を自由摂取させて6日間飼育した。その後、コンピュータを用いた層別無作為化割付により、体重が各群で均一になるように、表３に示す群構成で5群に分けた。
(2) Rat platelet aggregation effect confirmation test The test substance was evaluated about the platelet aggregation inhibitory effect at the time of administering for 6 weeks to SD rat (male). That is, a group of 7 5-week-old Slc: SD (SPF) males (Japan SLC Co., Ltd.) are reared for 6 days with free access to the commercial solid feed CRF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and water. did. After that, by stratified randomization assignment using a computer, it was divided into five groups in the group configuration shown in Table 3 so that the weight was uniform among each group.
このうち1群には、正常食（MF粉末飼料）を自由摂取させ、クエン酸緩衝液を注射筒を用いて強制経ロ投与した（コントロール1）。残りの4群には、高脂肪食（配合を表４に示す）を自由摂取させ、表３に示す通りに、クエン酸緩衝液、被験物質、又はアスピリンをそれぞれフレキシブル胃ゾンデおよび注射筒を用いて強制経ロ投与した。また投与は午前11時から12時の間に行った。 One of the groups was given a normal diet (MF powder feed) freely, and citrated buffer solution was forcibly injected via a syringe (Control 1). The remaining 4 groups have a high fat diet (formulations are shown in Table 4), and as shown in Table 3, use citrate buffer, test substance, or aspirin with flexible gastric tube and syringe, respectively. It was administered by gavage. The administration was performed between 11 am and 12 o'clock.
投与期間中は、全例について1日1回の頻度で一般状態の観察、投与開始日および血小板凝集能測定日に体重測定を実施した。また最終投与日前日(投与41日目)の17時から絶食を行い、翌日(投与42日目)の経ロ投与の3時間後に35mg/kgペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与の麻酔下にて、腹部大動脈に注射針を挿入して、5mlシリンジ(3.8w/v%クエン酸三ナトリウム溶液を0.5ml充填)で5mlの採血(3〜8 w/v%クエン酸三ナトリウム溶液1容に対して血液を9容)を行った。
During the administration period, body weight measurement was performed on observation of general condition, administration start date and platelet aggregation ability measurement day on a frequency of once a day for all cases. In addition, fasting is performed from 17:00 on the day before the last administration day (day 41 of administration), and under the anesthesia of intraperitoneal administration of 35 mg /
採取した血液を25℃、220 X gで10分間遠心分離したのち、上層の多血小板血葉(Platelet‐Rich Plasma：PRP)を採取した。下層を25℃、2,300 X gで15分間遠心分離し、上層(Platelet‐Poor Plasma：PPP)を採取した。PRPおよびPPP画分の血小板数をそれぞれ自動血球計数装置(Sysmex F‐820、シスメックス株式会社)により測定し、血小板数を5.0 X 105 cells/μlに調整した。 The collected blood was centrifuged at 220 × g for 10 minutes at 25 ° C., and then the upper platelet-rich blood lobe (Platelet-Rich Plasma: PRP) was collected. The lower layer was centrifuged at 2,300 × g at 25 ° C. for 15 minutes, and the upper layer (Platelet-Poor Plasma: PPP) was collected. The platelet counts of PRP and PPP fractions were respectively measured by an automatic blood cell counter (Sysmex F-820, Sysmex Corporation), and the platelet count was adjusted to 5.0 × 10 5 cells / μl.
調整したPRPを専用キュベットに240 μl入れ、37℃で90秒間保温した後、62.5μg/mlコラーゲン溶液を10μl添加し、血小板凝集能測定装置(MCMヘマトレーサー313M)を用いて血小板凝集能を測定した。測定時間はコラーゲン添加後10分間とし、得られた最大凝集率(%)を採用した。 After adding 240 μl of the prepared PRP to a dedicated cuvette and incubating at 37 ° C. for 90 seconds, add 10 μl of 62.5 μg / ml collagen solution and measure platelet aggregation using a platelet aggregation measurement device (MCM hema tracer 313 M) did. The measurement time was 10 minutes after collagen addition, and the maximum aggregation rate (%) obtained was adopted.
結果を図13に示す。尚、各群の代表値は平均値±標準誤差で表した。統計解析はコントロール群と各被験物質投与群の間で、ダネットの多重比較検定を行った。有意水準は5%(＊)及び1%(♯♯)で表示した。被験物質投与群では、血小板最大凝集率がコントロールと比較して有意に減少していることが確認できた(図13)。 The results are shown in FIG. In addition, the representative value of each group was represented by average value +/- standard error. Statistical analysis performed Dunnett's multiple comparison test between the control group and each test substance administration group. The significance level is indicated by 5% (*) and 1% (##). In the test substance administration group, it was confirmed that the platelet maximum aggregation rate was significantly reduced as compared to the control (FIG. 13).
Claims (7)
催涙成分生成酵素（ＬＦＳ）の活性が低減された又は消失した条件下で、PRENCSOをアリイナーゼにより処理し、該化合物又はその塩を生成する工程
を含む、上記方法。 A method for producing a compound according to claim 1 or 2 or a salt thereof, or a composition containing them,
Treating the PRENCSO with alliinase under conditions where the activity of the lacrimal component producing enzyme (LFS) is reduced or eliminated, to produce the compound or a salt thereof.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015101996A JP6480258B2 (en) | 2014-05-19 | 2015-05-19 | COX-1 inhibitor |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014103821 | 2014-05-19 | ||
| JP2014103821 | 2014-05-19 | ||
| JP2015101996A JP6480258B2 (en) | 2014-05-19 | 2015-05-19 | COX-1 inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016000726A JP2016000726A (en) | 2016-01-07 |
| JP6480258B2 true JP6480258B2 (en) | 2019-03-06 |
Family
ID=55076526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015101996A Active JP6480258B2 (en) | 2014-05-19 | 2015-05-19 | COX-1 inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6480258B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105664681A (en) * | 2016-03-02 | 2016-06-15 | 许五妮 | High-efficiency extraction process of onion extract liquid |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5452017B2 (en) * | 2008-12-19 | 2014-03-26 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Novel thiolane compounds and uses thereof |
| JP5701117B2 (en) * | 2010-11-01 | 2015-04-15 | ハウス食品グループ本社株式会社 | COX-1 inhibitor and α-glucosidase inhibitor |
| JP5932328B2 (en) * | 2011-12-27 | 2016-06-08 | ハウス食品グループ本社株式会社 | Method for determining onion with suppressed LFS activity |
-
2015
- 2015-05-19 JP JP2015101996A patent/JP6480258B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016000726A (en) | 2016-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10532992B2 (en) | Prodrugs of urolithins and uses thereof | |
| JP2010525051A (en) | Guava extract | |
| WO2006084033A1 (en) | Compositions and methods for enhancing cognitive function | |
| AU2016275642B2 (en) | Antihypertensive agent | |
| JP6192167B2 (en) | Fermented food extract composition | |
| WO2011108059A1 (en) | Xanthine oxidase inhibitor | |
| AU2013210416B2 (en) | Desrhamnosyl acteoside-containing olive extract | |
| WO2006137139A1 (en) | Method of isolating mangosteen and drug and health food containing the same | |
| JP6480258B2 (en) | COX-1 inhibitor | |
| KR20160115889A (en) | Composition for prevention, improvement or treatment of osteoporosis comprising extract of Sigesbeckia spp. | |
| WO2008023283A2 (en) | Stabilized esters of lutein | |
| JP5701117B2 (en) | COX-1 inhibitor and α-glucosidase inhibitor | |
| JP6628204B2 (en) | Xanthine oxidase inhibitor and method for producing the same | |
| JP6679280B2 (en) | Composition for improving lipid metabolism | |
| KR101760433B1 (en) | Composition for preventing and treatment of osteoporosis | |
| JP2008231101A (en) | Anti-diabetic agent | |
| EP1219615B1 (en) | Method for extracting flavon mixtures and use of mixtures so obtained in dermocosmetic, food and pharmacy | |
| TWI541016B (en) | The use of polyoxymethyl flavonoids | |
| JP2011037829A (en) | Smooth muscle relaxant | |
| JP2019163234A (en) | Xanthine oxidase inhibitor and method for producing the same | |
| JP4840845B2 (en) | Novel ellagic acid derivatives and xanthine oxidase inhibitors | |
| JP2015097511A (en) | Production method of polyphenol derivative, and food and medicinal composition containing polyphenol derivative | |
| US20070082077A1 (en) | Inhibitor of glucose absorption and method for producing the same | |
| JP5951512B2 (en) | Composition for improving lipid metabolism comprising cepatiolanes as active ingredient, and food additive | |
| JP2010180133A (en) | alpha-GLUCOSIDASE INHIBITOR |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180221 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180927 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181023 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181225 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190122 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190207 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6480258 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |