JP6463372B2 - Dnaメチル化阻害剤に対する腫瘍の反応を予測する方法、および抵抗性を克服するための代替的な治療投与計画 - Google Patents
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Description
DNAメチル化阻害剤に対する腫瘍の反応(すなわち感受性または抵抗性)を予測するための方法に関し、抵抗性を克服するための代替的な治療投与計画を提供する。
化学療法処置に対する抵抗性は、奏効するがん治療を妨げる主要な妨害の1つである(Gottesman M.M. et al., Nature Reviews Cancer 2002; 2, 48-58)。研究は、化学療法に対する抵抗性の主な分子的な特徴(薬剤の細胞内不活性化(Garattini S. et al., European Journal of Cancer 2007; 43, 271-82)、DNAのミスマッチ修復における異常(Fink D. et al., Clinical Cancer Research 1998; 4, 1-6)、アポトーシスの回避(Hanahan D. et al., Cell 2000; 100, 57-70)、および膜輸送体(Huang Y. et al., Cancer Research 2004; 64, 4294-301)などの多数が挙げられる)を明らかにしているが、がんの化学療法の失敗は、しばしば未解決のままである。さらに、細胞培養系および動物モデルにおいて明らかにされている特定の薬剤抵抗性の機序は、臨床における個々の分子病態と必ずしも相関しない(Cimoli G. et al., Biochimica et Biophysica Acta 2004; 1705, 103-20)。これは、特定の薬剤に抵抗性のがん患を感作するため、および個々の患者にとっての代替的な治療投与計画を準備するための、さらなる標的を調査することに対する最大の重要性を強調している。現在、エピジェネティックスは、腫瘍学の境界を広げる最も有望な分野の1つとして明らかになっており、異常なDNAメチル化は、すべての種類のがんにおける頻度高い関与のために、一貫性のある顕著な特徴であり続けている(Rodriguez-Paredes M. et al., Nature Medicine 2011; 17, 330-39)。シトシン類似物5−アザシチジン(AZA)および2’−デオキシ−5−アザシチジン(DAC)は、現在、最も有効なエピジェネティック薬剤の1つであり(Stresemann C. et al., International Journal of Cancer 2008; 123, 8-13)、新規のDNAメチルトランスフェラーゼの発現を阻害することによって機能し、異常なDNAメチル化によって抑制されている腫瘍サプレッサ遺伝子を再活性化させることにおいて実質的な有効性を示している(Karahoca M. et al., Clinical Epigenetics 2013; 5, 3)。代表的なDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤AZAおよびDACは、骨髄異形成症候群(MDS)および急性骨髄白血病(AML)にかかっている患者が反応する数少ない薬剤の1つであり、アメリカ食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって、MDSの処置用に認可されている(Saba H.I. et al., Therapeutics and Clinical Risk Management 2007; 3, 807-17)。骨髄の悪性腫瘍にとっての確立されている治療法であることの他に、それらは、初期の臨床試験の間に、固形腫瘍を根絶することにおいて有望と思われた(Cowan L.A. et al., Epigenomics 2010; 2, 71-86)。しかし、他の抗がん剤と同様に、これらの低メチル化剤に対する抵抗性が、有効なエピジェネティック療法を無効にする主要な障壁である。患者の大部分は、治療に反応せず、原発性の抵抗性に直面する一方で、初期において反応している患者は、続発性の抵抗性を獲得し、継続的な治療にもかかわらず、上記疾患のために死亡する(Prebet T. et al., Journal of Clinical Oncology 2011; 29, 3322-7)。これらの薬剤に対するインビトロにおける抵抗性の原因を説明する分子機序は、多種態様(膜輸送体による薬剤の不十分な流入、薬剤の活性化に必要とされる酵素デオキシシチジンキナーゼの欠損、または促進された薬剤代謝に導くシチジンデアミナーゼによる脱アミノ化が挙げられる)であるが、それらは、患者において獲得された抵抗性を説明できない。加えて、DACに対する続発性の抵抗性が、DNAメチル化と独立しているらしいこと、および抵抗性が、持続する脱メチル化にも関わらず進行することは、また確立されている(Qin T. et al., PLOS ONE 2011; 6, e23372)。また、エピジェネティック抑制されている腫瘍サプレッサ遺伝子の、DAC処理に続く再発現が、一過性であることは、否定できない事実である(Kagey J.D. et al., Molecular Cancer Research 2010; 8, 1048-59)。DACの使用中止は、抵抗性に導く、遺伝子の再度のサイレンシングを最終的に生じる一方で、持続される遺伝子の再発現は、臨床反応と一致しており、薬剤抵抗性の形成における遺伝子の再度のサイレンシングの役割を支持している(Hesson L.B. et al., PLOS Genetics 2013; 9, e1003636)。抵抗性の必須条件として遺伝子の再度のサイレンシングに着目すると、それは、遺伝子の複数のサイレンシング機序(過剰なDNAメチル化、クロマチン再構成複合体における変異、および翻訳後の多数のヒストン修飾)が、互いに隔てられておらず、相関されていることを明確に述べているエピジェネティックスのセントラルドグマを強調している(Grant S. et al., Clinical Cancer Research 2009; 15, 7111-3)。これに関連して、ε−N−アセチルリシンモチーフを認識し、かつこれに結合する、ブロモドメイン(BRDs)、クロマチンエフェクタモジュールは、がんにおける臨床上の進歩のための探索において、興味深い新たな標的として急速に明らかになっている(Muller S. et al., Expert Reviews in Molecular Medicine)。ヘテロクロマチンのサイレンシングの拡大を制限することにおける複数のブロモドメイン遺伝子の役割は、過去に検討されている(Jambunathan N. et al., Genetics 2005; 171, 913-22)。加えて、ブロモドメインタンパク質は、転写に必須な因子の補強による遺伝子活性化に重要な役割を果たしている(Josling G.A. et al., Genes 2012; 3, 320-43)。
本発明は、DNAメチル化阻害剤に対する患者の反応(すなわち、感受性または抵抗性)を決定するための方法を提供し、当該抵抗性を解消させる代替的な治療投与計画も提供する。
本発明の第1の実施形態は、がん疾患にかかっている患者の、DNAメチル化阻害療法に対する感受性を予測するための方法である。当該方法は、以下の(1)および/または(2)および/または(3)および/または(4)および/または(5)および/または(6)および/または(7)および/または(8)を、上記患者から取られたがん細胞において、インビトロにおいて決定すること、および細胞の親種について値と比較すること、ならびに以上においてもたらされる情報に基づいて上記処置に対する上記患者の抵抗性または感受性を続いて決定することを包含している。
(1)BRD4の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に
(2)OAS1の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に
(3)タンパク質、ブロモドメイン含有 2の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に
(4)アミノ酸配列における非同義変化をともなう、KATA2の変異、
(5)アミノ酸配列の非同義変化をともなう、BRCA1の変異、
(6)アミノ酸配列の非同義変化をともなう、OAS1の変異、
(7)
エピジェネティックなライターの阻害剤(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(AZA、ゼブラリン)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤(アナカルジン酸、C646)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[BIX−01294、3−デアザネプラノシンA塩酸塩(DZNep)])、およびエピジェネティックなイレーサの阻害剤(例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(レミデプシン、ボリノスタット)、およびヒストンデメチラーゼ阻害剤(GSK J4、IOX1))の半数阻害濃度(IC50)、ここで、IC50の上昇が交差抵抗性を表す
(8)エピジェネティックなリーダ(主に、選択的なBETブロモドメイン阻害剤[(+)−JQ1およびI−BET 151塩酸塩(I−BET 151)])ここで、IC50の低下が感受性を表す。
図1:DACおよび(+)−JQ1の抗腫瘍活性。DACについての効果倍率および有意ではないT/C比の低下は、親のHCT116(効果倍率2.9、p<0.05)との比較において、HCT116‐RDAC(効果倍率1.3、p<0.05)の抵抗性を明らかに示しており、これに対して、(+)−JQ1についての効果倍率の上昇は、親のHCT116(効果倍率1.6、p<0.05)との比較において、HCT116‐RDAC(倍率効果1.7、p<0.001)のより高い感受性を示している。
(細胞培養)
DNAメチル化阻害剤である2’‐デオキシ‐5‐アザシチジンに対する耐性のメカニズムを研究するため、我々は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(バージニア州マナサス)から入手したヒト結腸直腸がん細胞株(HCT116)、ヒト前骨髄球性白血病細胞(HL‐60)、およびヒト乳腺がん(MCF‐7)を用いた。ウシ胎仔血清(FBS,PAN-Biotech GmbH,アイデンバッハ,ドイツ)、100U/mLのペニシリン(Biotika,Slovenska Lupca,スロバキア共和国)および50μg/mLのストレプトマイシン(シグマアルドリッチ)を補った完全培地(シグマアルドリッチ,ミズーリ州セントルイス)中で上記細胞株を培養し、当該培養物を、加湿したインキュベータ中、37℃、5%CO2のもとで維持した。細胞株HCT116は、10%のFBSおよび3mMのL‐グルタミン(シグマアルドリッチ)を補ったMcCoy's 5A 培地中で増殖させた。HL‐60は、20%のFBSを補ったIscove's Modified Dulbecco's 培地中で増殖させた。MCF‐7は、10%のFBSを補ったRPMI-1640培地中で増殖させた。
DAC耐性HCT116細胞株を、2つの方法を用いて開発した。順応法:細胞を、まず、1×IC50の濃度の薬剤で処理した(0.28μM;5日間のMTT試験)。薬剤の濃度は、その後の継代培養において、耐性の順応とともに徐々に上げていき、10×IC50の濃度にまで到達させた。急速選択法:細胞を直接、5×IC50の濃度の薬剤に曝し、それをさらに二倍して10×IC50の濃度にした。上記細胞を長期間、細胞傷害性の量の上記薬剤に曝した後、大部分の集団は耐性であると判断された。耐性細胞集団のクローニングの結果、6つの耐性細胞株:R1.1、R1.2、R1.3、R1.4(順応法によって単離)およびR2.1、R.2.2(急速選択法によって単離)が得られた。
高処理能力のシークエンシングプラットフォームを用いるRNAシークエンシング(RNA-Seq)は、転写および遺伝子発現の比較的不偏な測定を容易にすることによって、トランスクリプトームを発見し、プロファイルし、定量する強力な方法として現れてきた。エクソンおよびアレル特有の発現を測定する能力があり、また、アノテーション付けされていないエクソンの転写を検知する能力があり、珍しい転写物および新規な転写物の同定をもたらす(Pickrell J.K. et al., Nature 2010; 464, 768-72)。
HCT116親細胞株および6つの耐性細胞株それぞれを、ペトリ皿中で、80%を超えて覆う状態に増殖させた。細胞は、単層培養物10cm2につき1mLのTRI(トリゾール)試薬を用いてホモジナイズし、室温で5分間インキュベートして、核タンパク質複合体を完全に解離させた。ホモジェネートを1.5mLのマイクロ遠心チューブに移し、製造者のプロトコル(Ambion RiboPure Kit,ライフテクノロジーズ,カリフォルニア州カールスバッド)に従った有機抽出法によって全RNAを抽出した。得られたRNAサンプルの完全性を、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて分析した(Agilent RNA 6000 Nano Kit,アジレント・テクノロジー,カリフォルニア州サンタクララ)。全RNAのうち0.1〜4μgを用いて、製造者のプロトコル(TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit,イルミナ社,カリフォルニア州サンディエゴ)に従ってcDNAライブラリーを構築した。簡単に言うと、ポリA含有mRNA分子に対して、ポリTオリゴ付着磁性ビーズを用いて、RNA断片化とランダムな六量体によるプライミングとを含む二段階の精製を行った。切断されたRNA断片を第一ストランドcDNAへ逆転写し(RevertAid H Minus Reverse Transcriptase,サーモ・サイエンティフィック,マサチューセッツ州ウォルサム)、続いて第二ストランドcDNAの合成を行った。cDNAの合成は、−20℃において「End Repair」制御を用いて行った。平滑断片の3’末端に1つの「A」ヌクレオチドを付加し、続いて複数のインデキシングアダプタをライゲーションした。両端にアダプタ分子を有するDNA断片を、PCRによって選択的に濃縮して増幅させた。このように調製されたcDNAライブラリーを、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて確認し、定量した(Agilent High Sensitivity DNA Kit,アジレント・テクノロジー)。最後に、異なるインデックスを有するサンプルを、シークエンシングのためにプールした。
イルミナ社の超高処理能力シークエンシングシステムHiSeq 2500を用いて、トランスクリプトームを超並列特徴シークエンシング(MPSS)によって配列決定した。RNA Seq実験からの読み取りを、Tophat 2(Trapnell C. et al., Bioinformatics 2009; 25, 1105-11)を用いて、アノテーション付けしたヒト基準ゲノム(HG19)に対してアラインメントし、エクソン、遺伝子およびスプライス部位とアラインメントするものを数えた。アラインメントの間、最大で2つのミスマッチを許容するようにし、複数のゲノム位置にアラインメントする読み取りは数えなかった。アラインメント後、変異体(cSNPs、インデルおよびスプライス部位)をSAMtools(Li H. et al., Bioinformatics 2009; 25, 2078-79)によってコールし、ANNOVAR(Wang K. et al., Nucleic Acids Research 2010; 38, e164)によってアノテーションした。遺伝子および転写レベルの発現の定量化のために、HTSeq package(Python)を用いた。DESeq package(R library)を用いたデータ正準化および統計的評価ののち、差異的な発現が報告された。二項検定によって統計的有意性を判定し、有意性の閾値を0.01とした。
トランスクリプトミクス研究はRNAの役割および遺伝子発現への洞察を与えてくれるが、生物学的機能に影響するのは、最終的にはタンパク質発現のレベルにおける変化である。質量分析と組み合わせた細胞培養におけるアミノ酸の安定同位体ラベリング(SILAC)は、正常状態および病態生理学的状態における異なるタンパク質レベルの定量を容易にすることによって、新規なバイオマーカーの同定および開発において、非常に有益なツールとして発展してきた(Mann M., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2006; 7, 952-58)。
親細胞株HCT116を、重いリジン-13C6およびアルギニン-13C6で置換したSILAC培地(サーモ・サイエンティフィック)中で培養し、FBS(シグマアルドリッチ)を約8倍まで透析して、完全にラベリングを行った。次いで、ラベルされた親細胞株を、ラベルされていない耐性細胞株それぞれと、1:1の割合で混合した。このようにして調製した細胞混合物を、阻害剤(ホスファターゼ阻害剤(5mMピロリン酸ナトリウム、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、5mMフッ化ナトリウム)、プロテアーゼ阻害剤(1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物、プロテアーゼ阻害剤カクテル;シグマアルドリッチ))を含む氷冷した1×PBSで2回洗浄し、続いて、阻害剤を含まない1×PBSで1回洗浄し、その後、2×107個の細胞あたり200μLの氷冷SILAC溶解緩衝液(20 mM Tris-HCl、7 M 尿素、10 mM DTT、1% Triton X-100、0.5% SDS)を用いて細胞を溶解させた。次いで、溶解液を、Branson Digital Sonifierを用いてソニケーションし、14,000rpmにおける遠心分離を10分間行うことによって透明にし、澄んだ上清を−80℃で保存した。
細胞溶解液(100μL)を、12%LDS-トリス-グリシンゲル上で分子量によって分画した。当該分画は、円筒型ゲルマトリックスを通して、3〜4時間、1Wの定電力における連続溶出ゲル電気泳動(Mini Prep Cell, バイオ・ラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア)によって行った。電気泳動後、ゲルをチューブから取り出して固定し(10%酢酸、35%エタノール)、続いてミリQ水でリンスした。清潔な外科用メスを用いて、90mmのゲル片を20スライス(それぞれ4.5mm以下)に切り、それをさらに小片(1mm3以下)に賽の目切りにし、1.5mLマイクロ遠心チューブに移した。ゲル片を、ACN(アセトニトリル)を用いて5分間ソニケーションすることによって脱水し、続いて50mMのトリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィンを用いて90℃で10分間還元した。還元したゲルを再び脱水し、続いて、新しく調製した50mMのIAA(ヨードアセトアミド)を用いて、暗下で60分間アルキル化した。アルキル化の後、ACNおよびH2Oを交互に用いて2回脱水し(IAAを完全に取り除くため)、続いて、最後に50%ACNで脱水した。最後に、ゲルを、製造者のプロトコルに従って調製したトリプシン緩衝液(Trypsin Gold,プロメガ,ウィスコンシン州マディソン)で一晩37℃においてインキュベートすることによって、酵素学的に消化した。タンパク質のゲル内消化の後、ゲルを脱水(0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)、80%ACN)することによってペプチド混合物を抽出し、続いて再水和(0.1%TFA)し、最後に50%ACNによる脱水を行った。抽出緩衝液を濃縮して完全に蒸発させ、ペプチド混合物を再懸濁し(5μLの80%ACN、0.1%TFA)、希釈した(145μLの0.1%TFA)。ペプチドサンプル150μLをカラム(MacroTrap,MICHROM Bioresources Inc.,カリフォルニア州オーバーン)にロードし、脱塩し(0.1%TFA)、続いて溶出した(0.1%TFA、80%ACN)。精製後、溶出緩衝液を完全に蒸発させ、精製したペプチドを、LC−MS分析のために移動相A(5%ACN、0.1%FA(ギ酸))に再懸濁した。
移動相A中のペプチドサンプル20μLを、UltiMate 3000 RSLCnano システム(サーモ・サイエンティフィック)におけるトラップカラム(Acclaim PepMap100 C18, 3 μm, 100 Å, 75 μm i.d. × 2 cm, nanoViper, サーモ・サイエンティフィック)にロードして、5μL/分の流速において前濃縮(pre-concentration)および脱塩を行った。今度はトラップカラムをEASY-Spray(サーモ・サイエンティフィック)における分離カラム(PepMap C18, 3 μm, 100Å, 75 μm i.d. × 15 cm, サーモ・サイエンティフィック)と直接接続し、逆相クロマトグラフィーによって分離されたペプチドを、流速300nL/分、カラム温度35℃において、100分間で5%から35%まで直線的勾配を付けた移動相Bを用いて溶出した。勾配による溶出の後、カラムを移動相Bで洗浄し、移動相Aで再平衡化した。マススペクトルを得るため、高速液体クロマトグラフィーをOrbitrap Elite Mass Spectrometer(サーモ・サイエンティフィック)に接続し、トップ20法(top 20 method)を用いて、MSスキャンとMS/MSスキャンとを自動的に切り替えてデータ依存的にスペクトルを得た。MSスペクトルはOrbitrap analyzerを用いて300〜1700Daの質量範囲および106イオンのターゲット値で得られたのに対し、MS/MSスペクトルはイオントラップアナライザを用いて104イオンのターゲット値で得られた。ペプチド断片化はCID法を用いて行い、イオン選択閾値は1000カウントとした。
生のMSファイルをMaxQuant version 1.4.1.3(Cox J. et al., Nature Biotechnology 2008; 26, 1367-72)によって解析し、MS/MSスペクトルをAndromedaサーチエンジン(Cox J. et al., Journal of Proteome Research 2011; 10, 1794-1805)を用いて、順向き配列および逆向き配列を含むUniprotKB / Swiss-Prot-human database (generated from version 2013_09)内で検索した。248個の共通のコンタミナントの追加データベースが、検索の際に加えられた(Geiger T. et al., Molecular & Cellular Proteomics 2012; 11, M111.014050)。前駆体の質量許容度20ppmでの最初の検索の結果を用いて質量較正を行った。しかし、メインのAndromedaサーチでは、前駆体の質量および断片の質量はそれぞれ、7ppmおよび20ppmの許容度に設定されていた。カルバミドメチルシステインの固定化された修飾ならびにメチオニン酸化およびN端末アセチル化の可変的な修飾を、データベース検索のために含めた。SILACデータの解析のために、SILACラベル、R6およびK6を用いた。当該検索はTrypsin/Pの酵素学的な切断ルールに基づいており、誤切断は最大で2つまで許容した。最小ペプチド長をアミノ酸6個に設定し、少なくとも1つの特異的なペプチドがタンパク質同定に必要とした。ペプチドおよびタンパク質の同定の偽発見率(FDR)は0.01に設定した。
DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびヒストンデメチラーゼの阻害剤に対するDAC耐性細胞株の交差耐性を判定する場合でも、選択的BETブロモドメイン阻害剤に対するDAC耐性細胞株の感受性を判定する場合でも、MTTベースの細胞生存アッセイを行った。
DACに対するHCT116耐性およびDAC耐性腫瘍の(+)-JQ1処理に対する感受性をインビボで確認するため、HCT116親細胞クローンと耐性細胞クローンR.14(HCT116_RDAC)とを対比してそれぞれにおけるDACおよび(+)-JQ1の抗腫瘍活性を調べた。11〜12週齢の雌のSCIDマウスに異種移植を行い、胸部の両側に5×106個の細胞を皮下接種した。2週間後、腫瘍は触知可能となり(腫瘍の平均体積は20mm3)、マウスを4つの群(8匹/群)に分けた。群I:DAC(10:90、DMSO:PBS)についてのビヒクル対照群。群II:2.5mg/kgのDACを、1日1回14日間(5日間投与、2日間休み)、合計で10投与量、腹腔内注射した群。群III:(+)-JQ1(5:95、DMSO:10%2‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン)についてのビヒクル対照群。群IV:50mg/kgの(+)-JQ1を1日1回28日間(5日間投与、2日間休み)、合計で20投与量、腹腔内注射した群。動物の体重を毎日測定し、腫瘍体積データを週2回集めた。体重が当初の体重から20%を超えて減少したときに、マウスを死なせた。動物に関するすべての作業は、承認されたIACUCのプロトコルに従って行われた。
遺伝子発現およびタンパク質発現の試験を、RNAレベルおよびタンパク質レベルのそれぞれにおいて行った。遺伝子発現試験のために、大規模並行シグニチャー配列決定(massively parallel signature sequencing)(MPSS)を使用し、かつRNA-Seq実験から生成された配列を、アノテーションの付されているヒト基準ゲノム(HG19)上にマッピングし、続いて遺伝子発現および転写物発現を定量化した。一方で、タンパク質発現試験のために、細胞培養物におけるアミノ酸の安定な同位体標識化(SILAC)を使用し、タンパク質発現を質量分析を用いて定量化した。
本発明に開示されているブロモドメイン含有遺伝子および/またはブロモドメイン含有タンパク質は、異常なDNAメチル化を標的にしているエピジェネティック療法に対する臨床反応を予測するためのバイオマーカーとして用いられ得る。上記遺伝子および/またはタンパク質の発現の変化するレベル、ならびにアミノ酸配列の非同義変化をともなう変異は、反応者および非反応者を区別するための基礎として使用され得る。これは、上記療法の予測および独自化の方法の到達性をもたらす。
Claims (4)
- DNAメチル化阻害剤療法に対する、がん疾患にかかっている患者の感受性を予測するための方法であって、
BRD4の発現のレベルを、上記患者から取られたがん細胞において、インビトロにおいて決定すること、およびBRD4の発現の当該レベルを、当該がん細胞にとっての親細胞種の細胞についてのBRD4の発現のレベルと比較することを包含しており、
上記がん細胞にとっての親細胞種の上記細胞と比べたときの、上記がん細胞におけるBRD4の発現の上記レベルの低下は、DNAメチル化阻害剤療法に対する抵抗性を上記患者が有していることを決定する、方法。 - 少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つもしくは10の、請求項2に記載のブロモドメイン含有遺伝子との、BRD4の組合せの発現のレベルが決定される、請求項2に記載の方法。
- 上記がん細胞が、がん腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病から選択されるがんから得られている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
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