JP2017512474A

JP2017512474A - Ｄｎａメチル化阻害剤に対する腫瘍の反応を予測する方法、および抵抗性を克服するための代替的な治療投与計画

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Publication number: JP2017512474A
Application number: JP2016559355A
Authority: JP
Inventors: アグラワール，クシュブー; ジュバク，ペトル; フリドリヒ，イヴォ; ハイドゥッフ，マリアン
Original assignee: パラッキユニバーシティ，オロモウツ
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2017-05-25
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: ES2638400T3; EP2924125A1; JP6463372B2; US20180251847A1; EP3042650A1; EP3122902A1; EP3042650B1; WO2015144102A1; EP3122902B1; ES2681490T3; EP2924125B1

Abstract

本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤療法に対する、がん疾患にかかっている患者の感受性を予測するための方法を提供する。当該方法は、（１）ブロモドメイン含有遺伝子の発現のレベル、および／または（２）明細書に挙げられている他の遺伝子の発現のレベル、および／または（３）ブロモドメイン含有タンパク質の発現のレベル、ブロモドメイン含有遺伝子の、アミノ酸配列における非同義変化をともなう変異、および／または（４）明細書に挙げられている他の遺伝子の発現の、アミノ酸配列における非同義変化をともなう変異、および／または（５）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、および／またはヒストンデメチラーゼの阻害剤の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、上記患者から取られたがん細胞において、インビトロにおいて決定すること、および細胞の親種について値と比較することを包含している。ここで、上記（ＩＣ５０）の上昇は、交差抵抗性、および／または選択的なＢＥＴブロモドメイン阻害剤の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を表し、上記（ＩＣ５０）の低下は、感受性を表す。本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤との組合せにおいてブロモドメイン阻害剤を用いた、がんにとっての組合せ療法をさらに提供する。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
ＤＮＡメチル化阻害剤に対する腫瘍の反応（すなわち感受性または抵抗性）を予測するための方法に関し、抵抗性を克服するための代替的な治療投与計画を提供する。

〔背景技術〕
化学療法処置に対する抵抗性は、奏効するがん治療を妨げる主要な妨害の１つである（Gottesman M.M. et al., Nature Reviews Cancer 2002; 2, 48-58）。研究は、化学療法に対する抵抗性の主な分子的な特徴（薬剤の細胞内不活性化（Garattini S. et al., European Journal of Cancer 2007; 43, 271-82）、ＤＮＡのミスマッチ修復における異常（Fink D. et al., Clinical Cancer Research 1998; 4, 1-6）、アポトーシスの回避（Hanahan D. et al., Cell 2000; 100, 57-70）、および膜輸送体（Huang Y. et al., Cancer Research 2004; 64, 4294-301）などの多数が挙げられる）を明らかにしているが、がんの化学療法の失敗は、しばしば未解決のままである。さらに、細胞培養系および動物モデルにおいて明らかにされている特定の薬剤抵抗性の機序は、臨床における個々の分子病態と必ずしも相関しない（Cimoli G. et al., Biochimica et Biophysica Acta 2004; 1705, 103-20）。これは、特定の薬剤に抵抗性のがん患を感作するため、および個々の患者にとっての代替的な治療投与計画を準備するための、さらなる標的を調査することに対する最大の重要性を強調している。現在、エピジェネティックスは、腫瘍学の境界を広げる最も有望な分野の１つとして明らかになっており、異常なＤＮＡメチル化は、すべての種類のがんにおける頻度高い関与のために、一貫性のある顕著な特徴であり続けている（Rodriguez-Paredes M. et al., Nature Medicine 2011; 17, 330-39）。シトシン類似物５−アザシチジン（ＡＺＡ）および２’−デオキシ−５−アザシチジン（ＤＡＣ）は、現在、最も有効なエピジェネティック薬剤の１つであり（Stresemann C. et al., International Journal of Cancer 2008; 123, 8-13）、新規のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を阻害することによって機能し、異常なＤＮＡメチル化によって抑制されている腫瘍サプレッサ遺伝子を再活性化させることにおいて実質的な有効性を示している（Karahoca M. et al., Clinical Epigenetics 2013; 5, 3）。代表的なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＡＺＡおよびＤＡＣは、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄白血病（ＡＭＬ）にかかっている患者が反応する数少ない薬剤の１つであり、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって、ＭＤＳの処置用に認可されている（Saba H.I. et al., Therapeutics and Clinical Risk Management 2007; 3, 807-17）。骨髄の悪性腫瘍にとっての確立されている治療法であることの他に、それらは、初期の臨床試験の間に、固形腫瘍を根絶することにおいて有望と思われた（Cowan L.A. et al., Epigenomics 2010; 2, 71-86）。しかし、他の抗がん剤と同様に、これらの低メチル化剤に対する抵抗性が、有効なエピジェネティック療法を無効にする主要な障壁である。患者の大部分は、治療に反応せず、原発性の抵抗性に直面する一方で、初期において反応している患者は、続発性の抵抗性を獲得し、継続的な治療にもかかわらず、上記疾患のために死亡する（Prebet T. et al., Journal of Clinical Oncology 2011; 29, 3322-7）。これらの薬剤に対するインビトロにおける抵抗性の原因を説明する分子機序は、多種態様（膜輸送体による薬剤の不十分な流入、薬剤の活性化に必要とされる酵素デオキシシチジンキナーゼの欠損、または促進された薬剤代謝に導くシチジンデアミナーゼによる脱アミノ化が挙げられる）であるが、それらは、患者において獲得された抵抗性を説明できない。加えて、ＤＡＣに対する続発性の抵抗性が、ＤＮＡメチル化と独立しているらしいこと、および抵抗性が、持続する脱メチル化にも関わらず進行することは、また確立されている（Qin T. et al., PLOS ONE 2011; 6, e23372）。また、エピジェネティック抑制されている腫瘍サプレッサ遺伝子の、ＤＡＣ処理に続く再発現が、一過性であることは、否定できない事実である（Kagey J.D. et al., Molecular Cancer Research 2010; 8, 1048-59）。ＤＡＣの使用中止は、抵抗性に導く、遺伝子の再度のサイレンシングを最終的に生じる一方で、持続される遺伝子の再発現は、臨床反応と一致しており、薬剤抵抗性の形成における遺伝子の再度のサイレンシングの役割を支持している（Hesson L.B. et al., PLOS Genetics 2013; 9, e1003636）。抵抗性の必須条件として遺伝子の再度のサイレンシングに着目すると、それは、遺伝子の複数のサイレンシング機序（過剰なＤＮＡメチル化、クロマチン再構成複合体における変異、および翻訳後の多数のヒストン修飾）が、互いに隔てられておらず、相関されていることを明確に述べているエピジェネティックスのセントラルドグマを強調している（Grant S. et al., Clinical Cancer Research 2009; 15, 7111-3）。これに関連して、ε−Ｎ−アセチルリシンモチーフを認識し、かつこれに結合する、ブロモドメイン（ＢＲＤｓ）、クロマチンエフェクタモジュールは、がんにおける臨床上の進歩のための探索において、興味深い新たな標的として急速に明らかになっている（Muller S. et al., Expert Reviews in Molecular Medicine）。ヘテロクロマチンのサイレンシングの拡大を制限することにおける複数のブロモドメイン遺伝子の役割は、過去に検討されている（Jambunathan N. et al., Genetics 2005; 171, 913-22）。加えて、ブロモドメインタンパク質は、転写に必須な因子の補強による遺伝子活性化に重要な役割を果たしている（Josling G.A. et al., Genes 2012; 3, 320-43）。

本発明は、そのようなブロモドメイン含有遺伝子および／または当該遺伝子によってコードされているタンパク質を公開しており、当該遺伝子および／またはタンパク質の発現は、抵抗性の形成の間に特異的に制御されており、当該遺伝子および／またはタンパク質の標的化は、ＤＮＡメチル化阻害剤に対する抵抗性に苦しんでいる患者を感作し得る。したがって、
本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤に対する患者の反応（すなわち、感受性または抵抗性）を決定するための方法を提供し、当該抵抗性を解消させる代替的な治療投与計画も提供する。

〔発明の開示〕
本発明の第１の実施形態は、がん疾患にかかっている患者の、ＤＮＡメチル化阻害療法に対する感受性を予測するための方法である。当該方法は、以下の（１）および／または（２）および／または（３）および／または（４）および／または（５）および／または（６）および／または（７）および／または（８）を、上記患者から取られたがん細胞において、インビトロにおいて決定すること、および細胞の親種について値と比較すること、ならびに以上においてもたらされる情報に基づいて上記処置に対する上記患者の抵抗性または感受性を続いて決定することを包含している。
（１）ＢＲＤ４の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定する
（２）ＯＡＳ１の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定する
（３）タンパク質、ブロモドメイン含有２の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなるタンパク質の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定する
（４）アミノ酸配列における非同義変化をともなう、ＫＡＴＡ２の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて
（５）アミノ酸配列の非同義変化をともなう、ＢＲＣＡ１の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて
（６）アミノ酸配列の非同義変化をともなう、ＯＡＳ１の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて
（７）
エピジェネティックなライターの阻害剤（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＡＺＡ、ゼブラリン）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤（アナカルジン酸、Ｃ６４６）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［ＢＩＸ−０１２９４、３−デアザネプラノシンＡ塩酸塩（ＤＺＮｅｐ）］）、およびエピジェネティックなイレーサの阻害剤（例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（レミデプシン、ボリノスタット）、およびヒストンデメチラーゼ阻害剤（ＧＳＫＪ４、ＩＯＸ１））の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）、ここで、ＩＣ_５０の上昇が交差抵抗性を表す
（８）エピジェネティックなリーダ（主に、選択的なＢＥＴブロモドメイン阻害剤［（＋）−ＪＱ１およびＩ−ＢＥＴ１５１塩酸塩（Ｉ−ＢＥＴ１５１）］）ここで、ＩＣ_５０の低下が感受性を表す。

関連する表に挙げられている上記遺伝子および／または当該遺伝子によってコードされているタンパク質の発現のレベルの変化（上方制御または下方制御）は、遺伝的に同一な薬剤感受性の対照物との比較において、種々の薬剤抵抗性細胞株において繰り返し観察された。したがって、当該変化は、ＤＮＡメチル化阻害剤、２’−デオキシ−５−アザシチジン（ＤＡＣ）に対する抵抗性の指標である。

好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のブロモドメイン含有遺伝子との、ＢＲＤ４の組合せの発現のレベル、および／または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のブロモドメイン含有タンパク質との、タンパク質ブロモドメイン含有２の組合せの発現のレベルが、決定される。最も好ましくは、本明細書に挙げられているすべてのブロモドメイン含有遺伝子の発現のレベル、および／または本明細書に挙げられているすべてのブロモドメイン含有タンパク質の発現のレベルが、決定される。

好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の本明細書に挙げられている遺伝子との、ＯＡＳ１の組合せの発現が、決定される。最も好ましくは、本明細書に挙げられているすべての遺伝子の発現のレベルが、決定される。

ブロモドメイン含有遺伝子の、所定の基準位置における変異が、薬剤抵抗性細胞株およびそれらの遺伝的に同一な薬剤感受性の対照物の間において、ヒトの基準ゲノムとの比較において、繰り返し観察された。したがって、当該変異は、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＤＡＣに対する抵抗性の指標である。

好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のコード配列との、ＫＡＴ２Ａの組合せにおける所定の基準位置における変異が、決定される。最も好ましくは、本明細書に挙げられているすべてのブロモドメイン含有遺伝子における変異が、決定される。

好ましくは、少なくとも２、３または４の本明細書に挙げられているコード配列との、ＢＲＣＡ１の組合せにおける所定の基準位置における変異が、決定される。最も好ましくは、本明細書に挙げられているすべての部分におけるい変異が、決定される。

好ましくは、少なくとも２、３または４の本明細書に挙げられているコード配列との、ＯＡＳ１の組合せにおける所定の基準位置における変異が、決定される。最も好ましくは、本明細書に挙げられているすべての部分における変異が、決定される。

試験されたエピジェネティックな阻害剤のＩＣ_５０値の上昇が、それらの遺伝的に同一な薬剤感受性の対照物との比較において、種々の薬剤抵抗性細胞株に繰り返し観察された。当該上昇は、他のエピジェネティックな阻害剤に対する、ＤＡＣ抵抗性細胞の交差抵抗性のための指標である。

したがって、本発明において述べられている遺伝子およびタンパク質の発現データはまた、他のエピジェネティックな薬剤に対する感受性および／または抵抗性を予測するために適用され得る。

試験されたＢＥＴブロモドメイン阻害剤のＩＣ_５０値の低下が、それらの遺伝的に同一な薬剤感受性の対照物との比較において、種々の薬剤抵抗性細胞株に繰り返し観察された。当該低下は、ＢＥＴブロモドメイン阻害剤に対する、ＤＡＣ抵抗性細胞の感受性のための指標である。

したがって、ブロモドメイン阻害剤は、ＤＮＡメチル化阻害剤に対して抵抗性の患者を再感作するために、ＤＮＡメチル化阻害剤との組合せにおいて使用され得る。

抵抗性の決定の方法および組合せ療法は、がん腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病から選択されるがんにおいて特に有用である。

〔図面の簡単な説明〕
図１：ＤＡＣおよび（＋）−ＪＱ１の抗腫瘍活性。ＤＡＣについての効果倍率および有意ではないＴ／Ｃ比の低下は、親のＨＣＴ１１６（効果倍率２．９、ｐ＜０．０５）との比較において、ＨＣＴ１１６‐Ｒ_ＤＡＣ（効果倍率１．３、ｐ＜０．０５）の抵抗性を明らかに示しており、これに対して、（＋）−ＪＱ１についての効果倍率の上昇は、親のＨＣＴ１１６（効果倍率１．６、ｐ＜０．０５）との比較において、ＨＣＴ１１６‐Ｒ_ＤＡＣ（倍率効果１．７、ｐ＜０．００１）のより高い感受性を示している。

〔発明を実施する例〕
（細胞培養）
ＤＮＡメチル化阻害剤である２’‐デオキシ‐５‐アザシチジンに対する耐性のメカニズムを研究するため、我々は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）から入手したヒト結腸直腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６）、ヒト前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ‐６０）、およびヒト乳腺がん（ＭＣＦ‐７）を用いた。ウシ胎仔血清（FBS，PAN-Biotech GmbH，アイデンバッハ，ドイツ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Biotika，Slovenska Lupca，スロバキア共和国）および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（シグマアルドリッチ）を補った完全培地（シグマアルドリッチ，ミズーリ州セントルイス）中で上記細胞株を培養し、当該培養物を、加湿したインキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ_２のもとで維持した。細胞株ＨＣＴ１１６は、１０％のＦＢＳおよび３ｍＭのＬ‐グルタミン（シグマアルドリッチ）を補ったMcCoy's 5A 培地中で増殖させた。ＨＬ‐６０は、２０％のＦＢＳを補ったIscove's Modified Dulbecco's 培地中で増殖させた。ＭＣＦ‐７は、１０％のＦＢＳを補ったRPMI-1640培地中で増殖させた。

（耐性細胞株の開発）
ＤＡＣ耐性ＨＣＴ１１６細胞株を、２つの方法を用いて開発した。順応法：細胞を、まず、１×ＩＣ_５０の濃度の薬剤で処理した（０．２８μＭ；５日間のＭＴＴ試験）。薬剤の濃度は、その後の継代培養において、耐性の順応とともに徐々に上げていき、１０×ＩＣ_５０の濃度にまで到達させた。急速選択法：細胞を直接、５×ＩＣ_５０の濃度の薬剤に曝し、それをさらに二倍して１０×ＩＣ_５０の濃度にした。上記細胞を長期間、細胞傷害性の量の上記薬剤に曝した後、大部分の集団は耐性であると判断された。耐性細胞集団のクローニングの結果、６つの耐性細胞株：Ｒ１．１、Ｒ１．２、Ｒ１．３、Ｒ１．４（順応法によって単離）およびＲ２．１、Ｒ．２．２（急速選択法によって単離）が得られた。

ＨＣＴ１１６親細胞とＨＣＴ１１６耐性細胞との比較研究から得られたデータのクロス確認をするため、さらに、ＤＡＣ耐性ＭＣＦ‐７細胞株およびＤＡＣ耐性ＨＬ‐６０細胞株を開発した。耐性ＭＣＦ‐７細胞は順応法を用いて開発した（ここでは、細胞を０．５μＭのＤＡＣで処理し、それを耐性の順応とともに徐々に上げて最後には５μＭにした）。しかし、ＤＡＣ耐性ＨＬ‐６０細胞は、著者（Qin T. et al., Blood 2009; 113, 659-67）からの寄贈として取得し、さらに、我々の研究室において、５μＭのＤＡＣで処理することによって選択した。

ＤＡＣへの耐性は、ＭＴＴベースの細胞生存アッセイで確認し、耐性指標を、未処理の対照群と比較しての耐性細胞株のＩＣ_５０の倍率増加（fold increase）として計算した。耐性細胞株はすべて、１００μＭを超えるＤＡＣに対して耐性を示した。

（ＲＮＡシークエンシング（RNA-Seq）に基づくトランスクリプトミクス）
高処理能力のシークエンシングプラットフォームを用いるＲＮＡシークエンシング（RNA-Seq）は、転写および遺伝子発現の比較的不偏な測定を容易にすることによって、トランスクリプトームを発見し、プロファイルし、定量する強力な方法として現れてきた。エクソンおよびアレル特有の発現を測定する能力があり、また、アノテーション付けされていないエクソンの転写を検知する能力があり、珍しい転写物および新規な転写物の同定をもたらす（Pickrell J.K. et al., Nature 2010; 464, 768-72）。

（サンプルの調製／ｃＤＮＡライブラリーの構築）
ＨＣＴ１１６親細胞株および６つの耐性細胞株それぞれを、ペトリ皿中で、８０％を超えて覆う状態に増殖させた。細胞は、単層培養物１０ｃｍ^２につき１ｍＬのＴＲＩ（トリゾール）試薬を用いてホモジナイズし、室温で５分間インキュベートして、核タンパク質複合体を完全に解離させた。ホモジェネートを１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、製造者のプロトコル（Ambion RiboPure Kit，ライフテクノロジーズ，カリフォルニア州カールスバッド）に従った有機抽出法によって全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡサンプルの完全性を、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて分析した（Agilent RNA 6000 Nano Kit，アジレント・テクノロジー，カリフォルニア州サンタクララ）。全ＲＮＡのうち０．１〜４μｇを用いて、製造者のプロトコル（TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit，イルミナ社，カリフォルニア州サンディエゴ）に従ってｃＤＮＡライブラリーを構築した。簡単に言うと、ポリＡ含有ｍＲＮＡ分子に対して、ポリＴオリゴ付着磁性ビーズを用いて、ＲＮＡ断片化とランダムな六量体によるプライミングとを含む二段階の精製を行った。切断されたＲＮＡ断片を第一ストランドｃＤＮＡへ逆転写し（RevertAid H Minus Reverse Transcriptase，サーモ・サイエンティフィック，マサチューセッツ州ウォルサム）、続いて第二ストランドｃＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡの合成は、−２０℃において「End Repair」制御を用いて行った。平滑断片の３’末端に１つの「Ａ」ヌクレオチドを付加し、続いて複数のインデキシングアダプタをライゲーションした。両端にアダプタ分子を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって選択的に濃縮して増幅させた。このように調製されたｃＤＮＡライブラリーを、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて確認し、定量した（Agilent High Sensitivity DNA Kit，アジレント・テクノロジー）。最後に、異なるインデックスを有するサンプルを、シークエンシングのためにプールした。

（ＲＮＡシークエンシング、アラインメント、およびバリアントコーリング）
イルミナ社の超高処理能力シークエンシングシステムHiSeq 2500を用いて、トランスクリプトームを超並列特徴シークエンシング（ＭＰＳＳ）によって配列決定した。RNA Seq実験からの読み取りを、Tophat 2（Trapnell C. et al., Bioinformatics 2009; 25, 1105-11）を用いて、アノテーション付けしたヒト基準ゲノム（ＨＧ_１９）に対してアラインメントし、エクソン、遺伝子およびスプライス部位とアラインメントするものを数えた。アラインメントの間、最大で２つのミスマッチを許容するようにし、複数のゲノム位置にアラインメントする読み取りは数えなかった。アラインメント後、変異体（cSNPs、インデルおよびスプライス部位）をSAMtools（Li H. et al., Bioinformatics 2009; 25, 2078-79）によってコールし、ANNOVAR（Wang K. et al., Nucleic Acids Research 2010; 38, e164）によってアノテーションした。遺伝子および転写レベルの発現の定量化のために、HTSeq package（Python）を用いた。DESeq package（R library）を用いたデータ正準化および統計的評価ののち、差異的な発現が報告された。二項検定によって統計的有意性を判定し、有意性の閾値を０．０１とした。

（質量分析法に基づくプロテオミクス）
トランスクリプトミクス研究はＲＮＡの役割および遺伝子発現への洞察を与えてくれるが、生物学的機能に影響するのは、最終的にはタンパク質発現のレベルにおける変化である。質量分析と組み合わせた細胞培養におけるアミノ酸の安定同位体ラベリング（ＳＩＬＡＣ）は、正常状態および病態生理学的状態における異なるタンパク質レベルの定量を容易にすることによって、新規なバイオマーカーの同定および開発において、非常に有益なツールとして発展してきた（Mann M., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2006; 7, 952-58）。

（ＳＩＬＡＣ／溶解物の調製）
親細胞株ＨＣＴ１１６を、重いリジン-^１３Ｃ_６およびアルギニン-^１３Ｃ_６で置換したＳＩＬＡＣ培地（サーモ・サイエンティフィック）中で培養し、ＦＢＳ（シグマアルドリッチ）を約８倍まで透析して、完全にラベリングを行った。次いで、ラベルされた親細胞株を、ラベルされていない耐性細胞株それぞれと、１：１の割合で混合した。このようにして調製した細胞混合物を、阻害剤（ホスファターゼ阻害剤（５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭフッ化ナトリウム）、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、プロテアーゼ阻害剤カクテル；シグマアルドリッチ））を含む氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、阻害剤を含まない１×ＰＢＳで１回洗浄し、その後、２×１０^７個の細胞あたり２００μＬの氷冷SILAC溶解緩衝液（20 mM Tris-HCl、7 M 尿素、10 mM DTT、1% Triton X-100、0.5% SDS）を用いて細胞を溶解させた。次いで、溶解液を、Branson Digital Sonifierを用いてソニケーションし、１４，０００ｒｐｍにおける遠心分離を１０分間行うことによって透明にし、澄んだ上清を−８０℃で保存した。

（分画／酵素ゲル内消化）
細胞溶解液（１００μＬ）を、１２％ＬＤＳ-トリス-グリシンゲル上で分子量によって分画した。当該分画は、円筒型ゲルマトリックスを通して、３〜４時間、１Ｗの定電力における連続溶出ゲル電気泳動（Mini Prep Cell, バイオ・ラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア）によって行った。電気泳動後、ゲルをチューブから取り出して固定し（１０％酢酸、３５％エタノール）、続いてミリＱ水でリンスした。清潔な外科用メスを用いて、９０ｍｍのゲル片を２０スライス（それぞれ４．５ｍｍ以下）に切り、それをさらに小片（１ｍｍ^３以下）に賽の目切りにし、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。ゲル片を、ＡＣＮ（アセトニトリル）を用いて５分間ソニケーションすることによって脱水し、続いて５０ｍＭのトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィンを用いて９０℃で１０分間還元した。還元したゲルを再び脱水し、続いて、新しく調製した５０ｍＭのＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を用いて、暗下で６０分間アルキル化した。アルキル化の後、ＡＣＮおよびＨ_２Ｏを交互に用いて２回脱水し（ＩＡＡを完全に取り除くため）、続いて、最後に５０％ＡＣＮで脱水した。最後に、ゲルを、製造者のプロトコルに従って調製したトリプシン緩衝液（Trypsin Gold，プロメガ，ウィスコンシン州マディソン）で一晩３７℃においてインキュベートすることによって、酵素学的に消化した。タンパク質のゲル内消化の後、ゲルを脱水（０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、８０％ＡＣＮ）することによってペプチド混合物を抽出し、続いて再水和（０．１％ＴＦＡ）し、最後に５０％ＡＣＮによる脱水を行った。抽出緩衝液を濃縮して完全に蒸発させ、ペプチド混合物を再懸濁し（５μＬの８０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ）、希釈した（１４５μＬの０．１％ＴＦＡ）。ペプチドサンプル１５０μＬをカラム（MacroTrap，MICHROM Bioresources Inc.，カリフォルニア州オーバーン）にロードし、脱塩し（０．１％ＴＦＡ）、続いて溶出した（０．１％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮ）。精製後、溶出緩衝液を完全に蒸発させ、精製したペプチドを、ＬＣ−ＭＳ分析のために移動相Ａ（５％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ（ギ酸））に再懸濁した。

（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
移動相Ａ中のペプチドサンプル２０μＬを、UltiMate 3000 RSLCnano システム（サーモ・サイエンティフィック）におけるトラップカラム（Acclaim PepMap100 C18, 3 μm, 100 Å, 75 μm i.d. × 2 cm, nanoViper, サーモ・サイエンティフィック）にロードして、５μＬ／分の流速において前濃縮（pre-concentration）および脱塩を行った。今度はトラップカラムをEASY-Spray（サーモ・サイエンティフィック）における分離カラム（PepMap C18, 3 μm, 100Å, 75 μm i.d. × 15 cm, サーモ・サイエンティフィック）と直接接続し、逆相クロマトグラフィーによって分離されたペプチドを、流速３００ｎＬ／分、カラム温度３５℃において、１００分間で５％から３５％まで直線的勾配を付けた移動相Ｂを用いて溶出した。勾配による溶出の後、カラムを移動相Ｂで洗浄し、移動相Ａで再平衡化した。マススペクトルを得るため、高速液体クロマトグラフィーをOrbitrap Elite Mass Spectrometer（サーモ・サイエンティフィック）に接続し、トップ２０法（top 20 method）を用いて、ＭＳスキャンとＭＳ／ＭＳスキャンとを自動的に切り替えてデータ依存的にスペクトルを得た。ＭＳスペクトルはOrbitrap analyzerを用いて３００〜１７００Ｄａの質量範囲および１０^６イオンのターゲット値で得られたのに対し、ＭＳ／ＭＳスペクトルはイオントラップアナライザを用いて１０^４イオンのターゲット値で得られた。ペプチド断片化はＣＩＤ法を用いて行い、イオン選択閾値は１０００カウントとした。

（データ解析）
生のＭＳファイルをMaxQuant version 1.4.1.3（Cox J. et al., Nature Biotechnology 2008; 26, 1367-72）によって解析し、ＭＳ／ＭＳスペクトルをAndromedaサーチエンジン（Cox J. et al., Journal of Proteome Research 2011; 10, 1794-1805）を用いて、順向き配列および逆向き配列を含むUniprotKB / Swiss-Prot-human database (generated from version 2013_09)内で検索した。２４８個の共通のコンタミナントの追加データベースが、検索の際に加えられた（Geiger T. et al., Molecular & Cellular Proteomics 2012; 11, M111.014050）。前駆体の質量許容度２０ｐｐｍでの最初の検索の結果を用いて質量較正を行った。しかし、メインのAndromedaサーチでは、前駆体の質量および断片の質量はそれぞれ、７ｐｐｍおよび２０ｐｐｍの許容度に設定されていた。カルバミドメチルシステインの固定化された修飾ならびにメチオニン酸化およびＮ端末アセチル化の可変的な修飾を、データベース検索のために含めた。ＳＩＬＡＣデータの解析のために、ＳＩＬＡＣラベル、Ｒ６およびＫ６を用いた。当該検索はTrypsin/Pの酵素学的な切断ルールに基づいており、誤切断は最大で２つまで許容した。最小ペプチド長をアミノ酸６個に設定し、少なくとも１つの特異的なペプチドがタンパク質同定に必要とした。ペプチドおよびタンパク質の同定の偽発見率（ＦＤＲ）は０．０１に設定した。

Perseus version 1.4.1.3を用いて生物情報学的な解析を行った。フィルタリングを行って、逆向き配列および共通コンタミナントのデータベースから上記同定を取り除き、有効値が３未満のタンパク質を除外した（３回の測定において定量化されたペプチドだけを考慮した）。カテゴリーに関するアノテーションは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）の生物学的プロセス、分子機能および細胞の構成要素の形式で与えた。差異的な発現を定量化するために、データをlog 2に変換し、各列から中央値を引いて正規化した。倍率変化は、３つの値の平均として計算し、有意性は、ＦＤＲ閾値０．０５に基づいたBenjamini-Hochberg multiple hypothesis testing correctionを用いてｐ値を計算することで判定した。

（交差耐性／感受性の判定）
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびヒストンデメチラーゼの阻害剤に対するＤＡＣ耐性細胞株の交差耐性を判定する場合でも、選択的ＢＥＴブロモドメイン阻害剤に対するＤＡＣ耐性細胞株の感受性を判定する場合でも、ＭＴＴベースの細胞生存アッセイを行った。

当該方法は主として、黄色のテトラゾリウム塩である臭化３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２、５‐ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）を、生存細胞のミトコンドリア中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存オキシドレダクターゼ酵素によって、不溶性の紫色のホルマザン結晶へと還元することに基づいている。ホルマザン結晶の可溶化の際に作られる紫色の濃さが、生存細胞数に直接比例している（Meerloo J.V. et al., Methods in Molecular Biology 2011; 731, 237-45）。

エピジェネティック薬（Tocris Bioscience，英国ブリストル）のＩＣ_５０を測定するために、９６ウェルプレートの３つ１組のウェルを用いて、４回の独立した実験を行った。８０μＬの培地中の細胞を実験用ウェルおよびコントロール用ウェルそれぞれに播き、続いて、実験用ウェルに５倍の薬剤濃度の２０μＬの培地を加えた。培地のみのウェルも、吸収度の読み取りのためにブランクとして含めた。７２時間の薬剤処理のあと、１×ＰＢＳ（５ｍｇ／ｍＬ）中に調製した１０μＬのＭＴＴ（シグマアルドリッチ）をブランクおよびコントロールを含むすべてのウェルに加え、紫色のホルマザン結晶が見えるまでインキュベートし、その後、１００μＬの界面活性剤（１０％ＳＤＳ、ｐＨ５．５）を加え、プレートを一晩インキュベートして、ホルマザンおよび細胞性物質を溶解させた。Labsystems iEMS Reader MFを用いて５４０ｎＭにおいてＭＴＴの吸収度を読み取り、Chemorezistソフトウェア（IMTM，パラツキー大学，チェコ共和国オロモウツ）を用いてＩＣ_５０値を決定した。

交差耐性は、耐性細胞株についての薬剤のＩＣ_５０をそれらと遺伝的に同一の薬剤感受性細胞株についての薬剤のＩＣ_５０と比較した際の倍率増加で判定し、一方、感受性は、当該比較の際の倍率減少で判定した。

（ＤＡＣおよび（＋）-ＪＱ１の抗腫瘍活性）
ＤＡＣに対するＨＣＴ１１６耐性およびＤＡＣ耐性腫瘍の（＋）-ＪＱ１処理に対する感受性をインビボで確認するため、ＨＣＴ１１６親細胞クローンと耐性細胞クローンＲ．１４（ＨＣＴ１１６＿Ｒ_ＤＡＣ）とを対比してそれぞれにおけるＤＡＣおよび（＋）-ＪＱ１の抗腫瘍活性を調べた。１１〜１２週齢の雌のＳＣＩＤマウスに異種移植を行い、胸部の両側に５×１０^６個の細胞を皮下接種した。２週間後、腫瘍は触知可能となり（腫瘍の平均体積は２０ｍｍ^３）、マウスを４つの群（８匹／群）に分けた。群Ｉ：ＤＡＣ（１０：９０、ＤＭＳＯ：ＰＢＳ）についてのビヒクル対照群。群ＩＩ：２．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＣを、１日１回１４日間（５日間投与、２日間休み）、合計で１０投与量、腹腔内注射した群。群ＩＩＩ：（＋）-ＪＱ１（５：９５、ＤＭＳＯ：１０％２‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン）についてのビヒクル対照群。群ＩＶ：５０ｍｇ／ｋｇの（＋）-ＪＱ１を１日１回２８日間（５日間投与、２日間休み）、合計で２０投与量、腹腔内注射した群。動物の体重を毎日測定し、腫瘍体積データを週２回集めた。体重が当初の体重から２０％を超えて減少したときに、マウスを死なせた。動物に関するすべての作業は、承認されたＩＡＣＵＣのプロトコルに従って行われた。

薬剤ＤＡＣおよび（＋）-ＪＱ１の抗腫瘍活性を判定するために、各群の腫瘍体積データを相対腫瘍体積に変換し、続いて、各時点における処置群対対照群の比率（Ｔ／Ｃ比）を計算した。０日目から２１日目までのＴ／Ｃ比をさらに、各薬剤のａＡＵＣを計算するのに用いた（Jianrong Wu. Et al., Pharmaceutical statistics 2010; 9, 46-54）。このようにして得られたａＡＵＣ値を用いて、ＨＣＴ１１６＿Ｒ_ＤＡＣの（ＤＡＣに対する）耐性と（（＋）-ＪＱ１に対する）感受性指標とを、ＨＣＴ１１６親細胞株と比較して定めた。当該データの統計的有意性を、ブートストラップｐ値、ｎ＝１００００、片側検定（H0：Ｔ／Ｃ比＝１、H1：Ｔ／Ｃ比＜１）を計算することによって判定した（Jianrong Wu. Et al., Pharmaceutical statistics 2010; 9, 46-54）。２１日目以降は、対照群における動物の生存率が低下したため、統計的有意性を正確に測定することができない。

（結果）
遺伝子発現およびタンパク質発現の試験を、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルのそれぞれにおいて行った。遺伝子発現試験のために、大規模並行シグニチャー配列決定（massively parallel signature sequencing）（ＭＰＳＳ）を使用し、かつRNA-Seq実験から生成された配列を、アノテーションの付されているヒト基準ゲノム（ＨＧ_１９）上にマッピングし、続いて遺伝子発現および転写物発現を定量化した。一方で、タンパク質発現試験のために、細胞培養物におけるアミノ酸の安定な同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）を使用し、タンパク質発現を質量分析を用いて定量化した。

特異な発現を記録するために、薬剤抵抗性の細胞株ＨＣＴ１１６‐Ｒ_ＤＡＣ（Ｒ１．１、Ｒ１．２、Ｒ１．３、Ｒ１．４、およびＲ２．１、Ｒ２．２）のそれぞれを、それらの遺伝的に同一な薬剤感受性の対照物、または親細胞株ＨＣＴ１１６と比較した。値は変化の倍率として表されている。正の値は上方制御を、負の数値は下方制御を示す。データは、３つの独立した実験から生成されており、統計的に有意（ｐ値＜０．０５）である。

アミノ酸配列の非同義変化をともなう変異を、整列ステップの後におけるＲＮＡ配列決定実験から生成されたデータを用いて決定した。表に表されている変異の妥当性を、高いqualityおよびcoverageの複数のリード（＞１００）によって決定した。さらに、これらの変異を、少なくとも３回の独立した配列決定実験において同定した。

試験されたエピジェネティック阻害剤に対する交差抵抗性を、ＭＴＴに基づく細胞生存アッセイを用いて決定し、抵抗性指数を、それらの遺伝的に同一な薬剤抵抗性の対照物に対する、抵抗性細胞株のＩＣ_５０値の比として算出した。

表における値は、独立した４回の実験から算出されたμＭにおけるＩＣ_５０の平均値を表しており、当該実験のそれぞれを３つ１組において実施し（Ｓ．Ｄ、±０ − ±９．７４）、括弧内の値は変化の倍率を表す。実験の有意性を、Bonferroniの多重比較検定をともなった一元配置分散分析を用いて決定した（*p<0.05、**p<0.005、***p<0.0005）。

ブロモドメイン阻害剤に対する感受性を、ＭＴＴに基づく細胞生存アッセイを用いて決定し、感受性指数を、それらの遺伝的に同一な薬剤抵抗性対照物または抵抗性細胞株に対する、親細胞株のＩＣ_５０値の比として算出した。

表における値は、独立した４回の実験から算出されたμＭにおけるＩＣ_５０の平均値を表しており、当該実験のそれぞれを３つ１組において実施し（Ｓ．Ｄ、±０．８８ − ±１．０９）、括弧内の値は変化の倍率を表す。実験の有意性を、Bonferroniの多重比較検定をともなった一元配置分散分析を用いて決定した（*p<0.05、**p<0.005、***p<0.0005）。

ブロモドメイン阻害によるＤＡＣ抵抗性のがん細胞の感作を、ＭＣＦ−７細胞株およびＨＬ−６０細胞株の、親対ＤＡＣ抵抗性（Ｒ_ＤＡＣ）において確認した。（＋）−ＪＱ１に対する、ＭＣＦ−７＿Ｒ_ＤＡＣ対ＭＣＦ−７、およびＨＬ−６０＿Ｒ_ＤＡＣ対ＨＬ−６０の感受性は、統計的に有意ではないが、結果は、（＋）−ＪＱ１処理が、高いＤＡＣ抵抗性を克服し得ることを明らかに示している。

ＤＡＣおよび（＋）−ＪＱ１の抗腫瘍活性を、大腸がん（ＨＣＴ１１６の親対薬剤抵抗性の対照物のＣＴ１１６＿Ｒ_ＤＡＣ）の異種移植されたマウスモデルにおいて試験した。図１Ａは、ＤＡＣおよび（＋）−ＪＱ１の抗腫瘍活性についての、ＨＣＴ１１６およびＨＣＴ１１６＿Ｒ_ＤＡＣにおける、薬剤にとってのビヒクルコントロールと比べた、時間測定プロットを示している。データは、相対的な腫瘍体積±標準誤差である。図１Ｂは、親のＨＣＴ１１６対ＨＣＴ１１６＿Ｒ_ＤＡＣを比較しているするａＡＵＣ（Ｔ／Ｃ比）を示している。

〔産業上の利用可能性〕
本発明に開示されているブロモドメイン含有遺伝子および／またはブロモドメイン含有タンパク質は、異常なＤＮＡメチル化を標的にしているエピジェネティック療法に対する臨床反応を予測するためのバイオマーカーとして用いられ得る。上記遺伝子および／またはタンパク質の発現の変化するレベル、ならびにアミノ酸配列の非同義変化をともなう変異は、反応者および非反応者を区別するための基礎として使用され得る。これは、上記療法の予測および独自化の方法の到達性をもたらす。

ＤＮＡメチル化阻害剤に反応せず、原発性の抵抗性に苦しんでいる患者は、無効な処置から直ちに除外され得る。これは、薬剤と関連し得る副作用、治療の余剰の費用からの回避によってそのような患者に利益をもたらし、かつ見込みのある処置手順を適時に提案する。ＤＮＡメチル化阻害剤に対して初期には反応するが、長期の処置の間に、続発性の抵抗性を獲得することによって疾患の進行の徴候を生じている患者は、ＤＮＡメチル化阻害剤との組合せにおけるボロもドメイン阻害剤の使用によって、再感作され得る。これは、抵抗性を克服するための代替的な治療投与計画を提供し、特定のＤＮＡメチル化阻害剤に対する抵抗性を形成することの出現率を低下させ得る。

ＤＡＣおよび（＋）−ＪＱ１の抗腫瘍活性を示す図である。

Claims

ＤＮＡメチル化阻害剤療法に対する、がん疾患にかかっている患者の感受性を予測するための方法であって、
（１）ＢＲＤ４の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定し、および／または
（２）ＯＡＳ１の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定し、および／または
（３）タンパク質、ブロモドメイン含有２の発現のレベル、ここで、発現の低下が、任意に

を含んでいる群から選択されるさらなるタンパク質の１つ以上またはすべての組合せにおいて、抵抗性を決定し、および／または
（４）アミノ酸配列における非同義変化をともなう、ＫＡＴ２の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、および／または
（５）アミノ酸配列の非同義変化をともなう、ＢＲＣＡ１の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、および／または
（６）アミノ酸配列の非同義変化をともなう、ＯＡＳ１の変異、

任意に

を含んでいる群から選択されるさらなる遺伝子の１つ以上またはすべての組合せにおいて、および／または
（７）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼおよび／またはヒストンデメチラーゼの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）、ここで、ＩＣ_５０の上昇が交差抵抗性を表し、および／または
（８）選択的なＢＥＴブロモドメイン阻害剤の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）、ここで、ＩＣ_５０の低下が感受性を表し、
を、上記患者から取られたがん細胞において、インビトロにおいて決定すること、および細胞の親種について値と比較することを包含している、方法。
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の以上に挙げられているブロモドメイン含有遺伝子との、ＢＲＤ４の組合せの発現のレベル、および／または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の以上に挙げられている遺伝子との、ＯＡＳ１の組合せの発現のレベル、および／または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の以上に挙げられているブロモドメイン含有タンパク質との、タンパク質ブロモドメイン含有２の組合せの発現のレベルが決定される、請求項１に記載の方法。
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の以上に挙げられているブロモドメイン含有遺伝子との、ＫＡＴ２Ａの組合せにおいて、所定の基準位置における変異が決定される、請求項１に記載の方法。
少なくとも２、３または４の以上に挙げられている遺伝子との、ＢＲＣＡ１の組合せにおいて、所定の基準位置における変異が決定される、請求項１に記載の方法。
少なくとも２、３または４の以上に挙げられている遺伝子との、ＯＡＳ１の組合せにおいて、所定の基準位置における変異が決定される、請求項１に記載の方法。
上記がん細胞が、がん種、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病から選択されるがんから得られている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
がん種、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病から好ましく選択される、がんのＤＮＡメチル化阻害剤療法における使用のための、ＤＮＡメチル化阻害剤との組合せにおけるブロモドメイン阻害剤。