JP6462632B2 - Antibody to mutant α-actinin-4 - Google Patents
Antibody to mutant α-actinin-4 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6462632B2 JP6462632B2 JP2016109825A JP2016109825A JP6462632B2 JP 6462632 B2 JP6462632 B2 JP 6462632B2 JP 2016109825 A JP2016109825 A JP 2016109825A JP 2016109825 A JP2016109825 A JP 2016109825A JP 6462632 B2 JP6462632 B2 JP 6462632B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- actn4
- amino acid
- cancer
- actinin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102100032959 Alpha-actinin-4 Human genes 0.000 title claims description 64
- 101710115256 Alpha-actinin-4 Proteins 0.000 title claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 105
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 76
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 25
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 206010052399 Neuroendocrine tumour Diseases 0.000 claims description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 98
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 67
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 54
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 51
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 51
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 34
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 34
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 30
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 101000797282 Homo sapiens Alpha-actinin-4 Proteins 0.000 description 26
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 11
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 10
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 10
- 102100037412 Germinal-center associated nuclear protein Human genes 0.000 description 9
- 101710194542 Germinal-center associated nuclear protein Proteins 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 3
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- -1 t-butyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 101150101620 Actn4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 1
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000016675 EF-hand domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006297 EF-hand domains Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000984622 Leucodon Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 102000011830 Neural cell adhesion Human genes 0.000 description 1
- 108050002172 Neural cell adhesion Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000041060 alpha-actinin family Human genes 0.000 description 1
- 108091060828 alpha-actinin family Proteins 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003849 large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 210000005015 mediastinal lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、変異型α-アクチニン-4に対する抗体であり、特に、α-アクチニン-4タンパク質の新規スプライスバリアントに対するモノクローナル抗体に関する。 The present invention is an antibody against mutant α-actinin-4, and particularly relates to a monoclonal antibody against a novel splice variant of α-actinin-4 protein.
α-アクチニン-4 (以下ACTN4ともいう)は,α-アクチニンのひとつであり、N 末端には球状のアクチン結合ドメイン、C 末端にはカルシウムが結合するモチーフ(EF ハンドドメインという)を有している。また、ACTN4は、その中央部にあるロッドドメインを使って二量体を形成してダンベル状になり、また両端のアクチン結合ドメインを使ってアクチンを架橋し束状にする(非特許文献1)。 α-actinin-4 (hereinafter also referred to as ACTN4) is one of α-actinin and has a globular actin-binding domain at the N-terminus and a calcium-binding motif (referred to as the EF hand domain) at the C-terminus. Yes. ACTN4 forms a dimer using a rod domain in the center to form a dumbbell, and actin is cross-linked and bundled using actin-binding domains at both ends (Non-Patent Document 1). .
哺乳類のα-アクチニンはアクチニン-1〜4の4種類が同定されており、アクチニン-1、-4が非筋肉型、そしてアクチニン-2と-3が筋肉型である(非特許文献1、2、3、4)。 Four types of mammalian α-actinins, actinin-1 to 4 have been identified, actinin-1 and -4 are non-muscular, and actinin-2 and -3 are muscular (Non-Patent Documents 1 and 2) , 3, 4).
ACTN4は、アクチン束状化に関与し、細胞運動性を促すアクチン結合タンパク質であり、細胞運動が亢進していると考えられる細胞突起に濃縮していることが確認されている。さらに、がん浸潤に対して何らかの積極的な貢献をしている可能性が示唆されている(非特許文献2)。 ACTN4 is an actin-binding protein that is involved in actin bundling and promotes cell motility, and it has been confirmed that it is concentrated in cell processes thought to have increased cell motility. Furthermore, there is a possibility that some positive contribution to cancer invasion has been suggested (Non-patent Document 2).
また、家族性糸球体巣状硬化症の家系に遺伝子変異がみられるエキソン8をスキップし,いままでに知られていない新規エキソン8’を挿入するタイプの選択的スプライスバリアントは、小細胞肺癌に特異的に発現しており、正常組織からは精巣にしか発現が確認できないことからがん精巣抗原である可能性が示唆されている(非特許文献5)。 In addition, an alternative splice variant that skips exon 8 in which a gene mutation is found in a familial glomerular sclerosis family and inserts a new exon 8 ′ that has not been known so far is used in small cell lung cancer. Since it is expressed specifically and can only be confirmed in the testis from normal tissues, it is suggested that it may be a cancer testis antigen (Non-patent Document 5).
一方、肺がんは、その組織所見により小細胞肺癌(SCLCという)と、非小細胞肺癌(非SCLCという)の2つに分類される。SCLCは、原発性肺癌の20%を占め、発育スピードが速いために多臓器転移を伴う進展型で発見されるケースが多く、"高い悪性度"と"予後不良"で知られている(非特許文献5)。 On the other hand, lung cancer is classified into two types, small cell lung cancer (referred to as SCLC) and non-small cell lung cancer (referred to as non-SCLC), based on the histological findings. SCLC accounts for 20% of primary lung cancers, and because of its rapid growth rate, it is often found in progressive forms with multiple organ metastases, and is known for "high grade" and "poor prognosis" (non-prognosis) Patent Document 5).
治療においては、腺癌と扁平上皮癌がその大半を占める非SCLCとSCLCでは、その治療法が異なる。少しでも病期の進んだSCLCでは外科療法が適用できない点、非SCLCでは化学療法の効果が低い点など特徴がある。そのため、早い病期で両者を鑑別することが、的確な治療を行うために重要であると考えられてきた。 In terms of treatment, non-SCLC and SCLC, where adenocarcinoma and squamous cell carcinoma are the majority, are treated differently. It is characterized by the fact that surgical treatment cannot be applied to SCLC that has progressed as much as possible, and that chemotherapy is less effective for non-SCLC. Therefore, it has been considered that it is important to distinguish the two at an early stage in order to perform an accurate treatment.
また、非SCLCに含まれる大細胞癌の亜型、大細胞神経内分泌癌(LCNECという)は、原発性肺がんの3%を占め、SCLCと同様に"予後不良"である。共にその他の肺がんと異なり、高い神経内分泌性格を持つ(非特許文献6)。 In addition, a large cell carcinoma subtype included in non-SCLC, large cell neuroendocrine cancer (referred to as LCNEC), accounts for 3% of primary lung cancer, and has a “poor prognosis” like SCLC. Both have a high neuroendocrine character unlike other lung cancers (Non-Patent Document 6).
従来、SCLCとLCNECは肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍(high-grade nuroendocrine tumor, HGNT)と呼ばれ、診断法の一つとして、切除標本に対する神経内分泌マーカー(Chromogranin, Synaptophysin, neural-cell-adhesion-molecule (NCAM))の免疫染色が行われてきた(非特許文献7)。 Traditionally, SCLC and LCNEC are called primary high-grade neuroendocrine tumors (HGNT), and as one of the diagnostic methods, neuroendocrine markers (Chromogranin, Synaptophysin, neural-cell-adhesion) -molecule (NCAM)) has been performed (Non-patent Document 7).
しかし、それら3マーカーの陽性率は決して高いものではなく、偽陽性率の高さが問題視されてきた。よって、小細胞肺癌と大細胞神経内分泌癌に高い特異性を持ち、早期検出が可能な新たな腫瘍マーカーの開発が望まれている。 However, the positive rate of these three markers is never high, and the high false positive rate has been regarded as a problem. Therefore, development of a new tumor marker having high specificity for small cell lung cancer and large cell neuroendocrine cancer and capable of early detection is desired.
本発明は、ACTN4の新規スプライスバリアントタンパク質などの変異型ACTN4(以下ACTN4-Vaという)に反応し、恒常的に発現するACTN4(以下ACTN4-Ubという)に反応しない、ACTN4-Va特異的モノクローナル抗体、および当該抗体を産生する細胞株を提供することを目的とする。また本発明は、前記ACTN4-Vaの検出方法、および検出用試薬などを提供することを目的とする。 The present invention is an ACTN4-Va-specific monoclonal antibody that reacts with a mutant ACTN4 (hereinafter referred to as ACTN4-Va) such as a novel splice variant protein of ACTN4 but does not react with constitutively expressed ACTN4 (hereinafter referred to as ACTN4-Ub) And a cell line producing the antibody. Another object of the present invention is to provide a method for detecting the ACTN4-Va, a detection reagent, and the like.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そしてACTN4-Vaまたはポリペプチドを抗原として用い、さらに、ACTN4-Ubまたはポリペプチドをスクリーニングに用い、そして、抗原を抗親和性抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより、ACTN4-Vaと反応し、ACTN4-Ubとは反応しない抗体、すなわち、ACTN4-VaとACTN4-Ubとの識別が可能なモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. ACTN4-Va or polypeptide is used as an antigen, ACTN4-Ub or polypeptide is used for screening, and the antigen is immunized to an anti-affinity antibody-producing transgenic non-human mammal to produce ACTN4-Va and The present inventors have succeeded in obtaining an antibody that reacts and does not react with ACTN4-Ub, that is, a monoclonal antibody capable of distinguishing between ACTN4-Va and ACTN4-Ub, and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α-アクチニン-4に対する抗体であって、当該領域における置換アミノ酸残基の全部又は一部を認識する、前記抗体。
(2)変異型α-アクチニン-4が、α-アクチニン-4をコードするDNAのエキソン8’に由来するスプライスバリアントである(1)に記載の抗体。
(3)置換アミノ酸残基が、α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第248番目のグリシン、第250番目のロイシン及び第263番目のシステインからなる群から選ばれる少なくとも1つである(1)に記載の抗体。
(4)置換アミノ酸残基を含むアミノ酸配列がDIVGTLRPDEKAIMTYVSC(配列番号4)で示される、(1)に記載の抗体。
(5)抗体がモノクローナル抗体である(1)に記載の抗体。
(6)受領番号がNITE ABP-1140であるハイブリドーマにより産生される、(5)に記載の抗体。
(7)上記(5)又は(6)に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体。
(8)抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、(5)又は(6)に記載の抗体。
(9)上記(1)〜(8)のいずれか1項に記載の抗体の断片。
(10)上記(5)又は(6)に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
(11)受領番号がNITE ABP-1140であるハイブリドーマ。
(12)変異型α-アクチニン-4に対する抗体の製造方法であって、
(a) α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
(b) 当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
(13)変異型α-アクチニン-4に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、
(a) α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであって当該領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
(b) 前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
(c) 工程(b)で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
(d) 工程(c)で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
(14)非ヒト哺乳動物が、GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物である(12)又は(13)に記載の方法。
(15)上記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の抗体又はその断片と生体試料とを反応させて、変異型α-アクチニン-4を検出することを特徴とする、変異型α-アクチニン-4の検出方法。
(16)α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む変異型α-アクチニン-4をコードする遺伝子を検出する方法であって、当該置換アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーと生体試料とを反応させて前記遺伝子を検出する、前記方法。
(17)変異型α-アクチニン-4をコードする遺伝子が、α-アクチニン-4をコードするDNAのエキソン8’に由来するスプライスバリアントのmRNAである(16)に記載の方法。
(18)上記(15)〜(17)のいずれか1項に記載の方法により得られた検出結果を用いて腫瘍を検出する方法。
(19)上記(15)〜(18)のいずれか1項に記載の方法により検出された結果を指標として腫瘍の状態又は予後の状態を評価する方法。
(20)上記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
(21)α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーを含む、腫瘍の検出又は診断用試薬。
(22)腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である(18)又は(19)に記載の方法。
(23)腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である(20)又は(21)に記載の試薬。
(24)α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α-アクチニン-4の機能を阻害する物質を含む、抗腫瘍用医薬組成物。
(25)変異型α-アクチニン-4の機能を阻害する物質が、(1)〜(9)のいずれか1項に記載の抗体若しくはその断片、又は変異型α-アクチニン-4をコードする遺伝子の阻害性核酸である、(24)に記載の医薬組成物。
(26)腫瘍が肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍である請求項24又は25に記載の医薬組成物。
That is, the present invention is as follows.
(1) against mutant α-actinin-4 having an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of α-actinin-4 is substituted with another amino acid residue An antibody that recognizes all or part of the substituted amino acid residues in the region.
(2) The antibody according to (1), wherein the mutant α-actinin-4 is a splice variant derived from exon 8 ′ of DNA encoding α-actinin-4.
(3) The substituted amino acid residue is at least one selected from the group consisting of the 248th glycine, the 250th leucine and the 263rd cysteine of the amino acid sequence of α-actinin-4 (1) The antibody described.
(4) The antibody according to (1), wherein the amino acid sequence containing the substituted amino acid residue is represented by DIVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 4).
(5) The antibody according to (1), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(6) The antibody according to (5), which is produced by a hybridoma whose receipt number is NITE ABP-1140.
(7) An antibody that binds to an antigenic determinant to which the antibody according to (5) or (6) binds.
(8) The antibody according to (5) or (6), wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a humanized antibody.
(9) The antibody fragment according to any one of (1) to (8) above.
(10) A hybridoma that produces the antibody according to (5) or (6) above.
(11) A hybridoma whose receipt number is NITE ABP-1140.
(12) A method for producing an antibody against mutant α-actinin-4,
(a) a partial peptide comprising the amino acid sequence of the 245th to 263th region of the amino acid sequence of α-actinin-4, wherein at least one of the amino acid residues in the region is substituted with another amino acid residue Immunizing a non-human mammal with a partial peptide having an amino acid sequence; and
(b) The method comprising collecting an antibody from the non-human mammal.
(13) A method for producing a monoclonal antibody against mutant α-actinin-4,
(a) a partial peptide comprising the amino acid sequence of the 245th to 263th region of the amino acid sequence of α-actinin-4, wherein at least one of the amino acid residues in the region is substituted with another amino acid residue Immunizing a non-human mammal with a partial peptide having an amino acid sequence;
(b) collecting antibody-producing cells from the immunized non-human mammal;
(c) fusing the antibody-producing cells obtained in step (b) with myeloma cells, and
(d) The said method including the process of extract | collecting an antibody from the fusion cell obtained at the process (c).
(14) The method according to (12) or (13), wherein the non-human mammal is a GANP transgenic non-human mammal.
(15) A mutant type characterized in that the mutant α-actinin-4 is detected by reacting the antibody or fragment thereof according to any one of (1) to (9) above with a biological sample. Detection method of α-actinin-4.
(16) A mutant α-actinin-4 comprising an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of α-actinin-4 is substituted with another amino acid residue, A method for detecting a gene to be encoded, wherein the gene is detected by reacting a probe for a polynucleotide encoding the substitution amino acid sequence or a primer for amplification of the polynucleotide with a biological sample.
(17) The method according to (16), wherein the gene encoding mutant α-actinin-4 is a splice variant mRNA derived from exon 8 ′ of DNA encoding α-actinin-4.
(18) A method for detecting a tumor using the detection result obtained by the method according to any one of (15) to (17).
(19) A method for evaluating the state of a tumor or the state of prognosis using the result detected by the method according to any one of (15) to (18) as an index.
(20) A reagent for detecting or diagnosing a tumor comprising the antibody or fragment thereof according to any one of (1) to (9) above.
(21) a probe for a polynucleotide encoding an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of α-actinin-4 is substituted with another amino acid residue, or the poly A reagent for detecting or diagnosing a tumor, comprising a primer for nucleotide amplification.
(22) The method according to (18) or (19), wherein the tumor is a lung primary high-grade neuroendocrine tumor.
(23) The reagent according to (20) or (21), wherein the tumor is a lung primary high-grade neuroendocrine tumor.
(24) The mutant α-actinin-4 having an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of α-actinin-4 is substituted with another amino acid residue An antitumor pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits function.
(25) The substance that inhibits the function of mutant α-actinin-4 is the antibody or fragment thereof according to any one of (1) to (9), or a gene encoding mutant α-actinin-4 The pharmaceutical composition according to (24), which is an inhibitory nucleic acid.
(26) The pharmaceutical composition according to claim 24 or 25, wherein the tumor is a lung primary high-grade neuroendocrine tumor.
本発明により、変異型ACTN4に対する抗体、より具体的には、ACTN4-Vaに対する特異的な抗体、および当該抗体を産生する細胞株が提供される。また、本発明により、上記抗体と生体試料とを反応させることを特徴とするACTN4-Vaを検出する方法およびACTN4-Vaを検出するための試薬が提供される。 The present invention provides an antibody against mutant ACTN4, more specifically, an antibody specific to ACTN4-Va, and a cell line producing the antibody. The present invention also provides a method for detecting ACTN4-Va and a reagent for detecting ACTN4-Va, characterized by reacting the antibody with a biological sample.
本発明のACTN4-Vaと反応するモノクローナル抗体は、組織、細胞、および血液等の検体中のACTN4-Vaを高感度かつ特異的に検出でき、腫瘍、好ましくは癌の診断に有用である。 The monoclonal antibody that reacts with ACTN4-Va of the present invention can detect ACTN4-Va in tissues, cells, blood, and other specimens with high sensitivity and specificity, and is useful for diagnosis of tumors, preferably cancer.
本発明は、α-アクチニン-4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型α-アクチニン-4に対する抗体であり、本発明の抗体は、上記第245番目から第263番目の領域において置換されたアミノ酸残基(置換アミノ酸残基)の全部又は一部を認識するものである。本発明の一態様において、本発明の抗体が認識する変異型α-アクチニン-4は、α-アクチニン-4をコードするDNAのエキソン8’に由来するスプライスバリアントである。 The present invention relates to a mutant α-actinin-4 having an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of α-actinin-4 is substituted with another amino acid residue. The antibody of the present invention recognizes all or part of amino acid residues (substituted amino acid residues) substituted in the 245th to 263rd regions. In one embodiment of the present invention, mutant α-actinin-4 recognized by the antibody of the present invention is a splice variant derived from exon 8 'of DNA encoding α-actinin-4.
さらに、本発明は、ACTN4-Vaに反応し、ACTN4-Ubに反応しない、ACTN4-Vaを識別して結合する抗体に関するものである。 Furthermore, the present invention relates to an antibody that recognizes and binds ACTN4-Va, which reacts with ACTN4-Va but does not react with ACTN4-Ub.
1.本発明の抗体
本発明の抗体は、ACTN4分子中のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む変異型ACTN4(タンパク質またはポリペプチド)に対する抗体である。
1. Antibody of the Present Invention The antibody of the present invention is an antibody against mutant ACTN4 (protein or polypeptide) comprising an amino acid sequence in which amino acid residues in the ACTN4 molecule are substituted.
ここで、本明細書において、「α-アクチニン-4」、「ACTN4」、「変異型アクチニン-4」、「ACTN4-Va」、「スプライスバリアント」、「ACTN4-Ub」などの用語は、特に言及しない限り全長タンパク質、部分ポリペプチド及び部分ペプチドのいずれをも包含するものである。従って、例えば「本発明の抗体がACTN4-Vaを認識する」と表現した場合は、本発明の抗体はACTN4-Va(例えばACTN4のスプライスバリアント)の全長タンパク質を認識すること、あるいはACTN4-Vaの部分ポリペプチド(例えばACTN4のエキソン8’に由来するスプライスバリアントのアミノ酸置換が生じた領域を含む部分ポリペプチド)を認識することのいずれも意味するものである。 Here, in this specification, terms such as “α-actinin-4”, “ACTN4”, “mutant actinin-4”, “ACTN4-Va”, “splice variant”, “ACTN4-Ub” Unless otherwise stated, all of full-length proteins, partial polypeptides and partial peptides are included. Therefore, for example, when the expression “the antibody of the present invention recognizes ACTN4-Va” is expressed, the antibody of the present invention recognizes the full-length protein of ACTN4-Va (for example, a splice variant of ACTN4), or ACTN4-Va It means to recognize a partial polypeptide (for example, a partial polypeptide containing a region in which an amino acid substitution of a splice variant derived from exon 8 ′ of ACTN4 has occurred).
本発明の好ましい態様においては、本発明の抗体は、以下の(i)〜(iii)から選択される少なくとも1つの性質を有するものである。
(i) ACTN4-Vaに対する抗体であって、新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換の全部あるいは何れかを認識する条件を満たす。
(ii) 上記アミノ酸置換がアミノ酸配列の248番目のグリシン(G:glycine)、250番目のロイシン(L:leucine)、あるいは263番目のシステイン(C:cysteine)である。
(iii) 抗原のアミノ酸配列がDIVGTLRPDEKAIMTYVSC(配列番号1)で示される。
In a preferred embodiment of the present invention, the antibody of the present invention has at least one property selected from the following (i) to (iii).
(i) An antibody against ACTN4-Va, which satisfies the conditions for recognizing all or any of the newly inserted exon 8′-derived amino acid sequence substitutions.
(ii) The amino acid substitution is the 248th glycine (G), 250th leucine (L), or 263th cysteine (C: cysteine) in the amino acid sequence.
(iii) The amino acid sequence of the antigen is represented by DIVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 1).
アミノ酸残基の置換部位及び置換後のアミノ酸残基は、第245番目のアスパラギン酸から第263番目のセリンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも1つのアミノ酸残基である。好ましくは、ACTN4のアミノ酸配列の第248番目のグリシン、第250番目のロイシン及び第263番目のシステインであり、これらの1つ又は2つ以上の組み合わせの置換アミノ酸残基を有する。 The substitution site of the amino acid residue and the substituted amino acid residue are at least one amino acid residue in the amino acid sequence from the 245th aspartic acid to the 263th serine. Preferably, the amino acid sequence of ACTN4 is the 248th glycine, the 250th leucine and the 263rd cysteine, and has a substituted amino acid residue of one or a combination of two or more thereof.
ここで、ACTN4のアミノ酸配列は配列番号2に示される。配列番号2において、エキソン8に由来するアミノ酸配列は第245番目のアスパラギン酸から第263番目のセリンまでのアミノ酸配列(DIVNTARPDEKAIMTYVSS(配列番号3))である。 Here, the amino acid sequence of ACTN4 is shown in SEQ ID NO: 2. In SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence derived from exon 8 is the amino acid sequence from the 245th aspartic acid to the 263th serine (DIVNTARPDEKAIMTYVSS (SEQ ID NO: 3)).
従って、本発明において、変異型ACTN4は、第245番目のアスパラギン酸から第263番目のセリンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したものである。好ましくは、野生型ACTN4のアミノ酸配列の第248番目のバリンがグリシンに、第250番目のアラニンがロイシンに、及び第263番目のセリンがシステインに変異しているか、あるいはこれらのいずれか1つ又は2つが変異したものをいう。この変異はエキソン8の代わりにエキソン8’が挿入することにより生じた変異、すなわちスプライスバリアント(非特許文献5)が含まれる。このような変異となるアミノ酸の置換を、本明細書では「ACTN4-Va特異的なアミノ酸配列置換」ともいう。 Therefore, in the present invention, the mutant ACTN4 is one in which at least one amino acid residue in the amino acid sequence from the 245th aspartic acid to the 263th serine is substituted with another amino acid residue. Preferably, the 248th valine of the amino acid sequence of wild type ACTN4 is mutated to glycine, the 250th alanine is mutated to leucine, and the 263rd serine is mutated to cysteine, or one of these or Two are mutated. This mutation includes a mutation caused by insertion of exon 8 'instead of exon 8, that is, a splice variant (Non-patent Document 5). In this specification, substitution of an amino acid that causes such mutation is also referred to as “ACTN4-Va-specific amino acid sequence substitution”.
従って、本発明のより好ましい態様において、本発明の抗体は、ACTN4-Vaのアミノ酸配列のうち、新たに挿入されたエキソン8’由来の新規スプライスバリアント部分のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含む部分断片または全長に対し特異的に結合する高特異性抗体である。以下、本明細書においては、変異型ACTN4に対する抗体(スプライスバリアントに対する抗体を含む)を、「抗ACTN4-Va抗体」ともいう。 Therefore, in a more preferred embodiment of the present invention, the antibody of the present invention comprises an amino acid sequence in which the amino acid residue of the newly inserted exon 8′-derived splice variant portion of the amino acid sequence of ACTN4-Va is substituted. It is a highly specific antibody that specifically binds to a partial fragment or full length. Hereinafter, in the present specification, an antibody against mutant ACTN4 (including an antibody against splice variant) is also referred to as “anti-ACTN4-Va antibody”.
本発明において、「特異的に結合する」又は「認識する」とは、変異型ACTN4(ACTN4-Va)、例えば置換されたアミノ酸残基の全部又は1つ(少なくとも1つ)には結合する(反応する)が、変異がないACTN4-Ubには結合しない(反応しない)ことを意味する。本発明の抗体が結合又は認識する領域は、置換されたアミノ酸残基のみというわけではなく、置換されたアミノ酸残基を含む限り他の領域も含まれる。すなわち、本発明の抗体が結合又は認識する領域は、置換されていないアミノ酸配列の領域が排除されるものではない。 In the present invention, “specifically binds” or “recognizes” binds to mutant ACTN4 (ACTN4-Va), for example, all or one (at least one) of substituted amino acid residues ( Reacts) but does not bind (does not react) to ACTN4-Ub without mutation. The region to which the antibody of the present invention binds or recognizes is not limited to a substituted amino acid residue, but includes other regions as long as it includes a substituted amino acid residue. That is, the region where the antibody of the present invention binds or recognizes does not exclude the region of the amino acid sequence that is not substituted.
結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手法、例えばELISA法、ウエスタンブロット法、又は免疫組織学的染色等によって確認することができる。 Confirmation of whether the binding is specific or not can be confirmed by immunological techniques such as ELISA, Western blotting, or immunohistological staining.
2.抗体の製造
次に、本発明の抗体の製造方法について説明する。
2. Next, a method for producing the antibody of the present invention will be described.
2−1.抗原の調製
ACTN4-Vaは小細胞肺癌患者組織、小細胞肺癌由来の細胞株、あるいは正常組織の精巣にしか発現しない。また、目的の抗原部位は新規スプライスバリアントに存在するアミノ酸配列置換に由来する上記3種類のアミノ酸のいずれかである。このため、目的の抗体を得るための免疫抗原を調製する場合、全長配列を含む組織又は細胞由来の抗原たんぱく質は免疫抗原として適当でない。そこで、アミノ酸置換がされた配列を含む免疫抗原を合成する必要がある。
2-1. Antigen preparation
ACTN4-Va is expressed only in tissues of patients with small cell lung cancer, cell lines derived from small cell lung cancer, or normal testis. The target antigenic site is any one of the above three types of amino acids derived from amino acid sequence substitution present in the novel splice variant. For this reason, when preparing an immune antigen for obtaining the target antibody, a tissue or cell-derived antigen protein containing a full-length sequence is not suitable as an immune antigen. Therefore, it is necessary to synthesize an immune antigen containing a sequence with amino acid substitution.
本発明においては、ACTN4-Vaの部分ペプチドを合成し免疫抗原として用いるが、合成ペプチドは低分子であり、そのままの状態でマウスに免疫しても抗体を得ることは困難である。そこで、合成ペプチドとキャリア蛋白質とをMBS法によりジスルフィド結合させ、免疫抗原を作製する。 In the present invention, a partial peptide of ACTN4-Va is synthesized and used as an immunizing antigen. However, the synthetic peptide is a low molecular weight, and it is difficult to obtain an antibody even if a mouse is immunized as it is. Therefore, the synthetic peptide and carrier protein are disulfide bonded by the MBS method to produce an immunizing antigen.
本発明において免疫抗原は、公知の方法に準じて作製することができる(Fmoc法、Kunio Fujiwara. et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217-226(1983))。 In the present invention, an immunizing antigen can be prepared according to a known method (Fmoc method, Kunio Fujiwara. Et al., Journal of Immunological Methods, 61, 217-226 (1983)).
ペプチドの化学合成は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の、当業者に公知の方法によって行うことができる。 Chemical synthesis of peptides can be performed by methods known to those skilled in the art, such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
キャリア蛋白質は、BSA(Bovin serum albumin)の他、例えば、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)、OVA(Ovalbumin)等を使用することができる。当業者であれば、免疫抗原を公知の方法によって作製することができる。 As the carrier protein, in addition to BSA (Bovin serum albumin), for example, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), OVA (Ovalbumin) and the like can be used. Those skilled in the art can prepare immunizing antigens by known methods.
抗原ペプチドを合成する基本となるアミノ酸配列はACTN4-Va中の部分配列であり、そのアミノ酸配列の中から任意に連続する10〜50個、好ましくは10〜30個、さらに好ましくは15〜20個の長さのアミノ酸配列を選択する。選択基準は、アミノ酸配列中に少なくとも1個のACTN4-Va特異的なアミノ酸配列置換が含まれていることが必要である。これらのアミノ酸残基を用いてペプチドを合成する。 The basic amino acid sequence for synthesizing the antigen peptide is a partial sequence in ACTN4-Va, and 10 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 15 to 20 consecutively from the amino acid sequence. The amino acid sequence of the length is selected. The selection criterion requires that the amino acid sequence contains at least one ACTN4-Va specific amino acid sequence substitution. A peptide is synthesized using these amino acid residues.
抗原として使用できるペプチドは、好ましくは配列番号2に示すアミノ酸配列の第245番目〜263番の領域のペプチドであり、ACTN4-Va特異的なアミノ酸配列置換を含むペプチドとして、上記領域のペプチドのアミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたペプチドを用いることができる。好ましくは、上記領域の第248番目のバリン、第250番目のアラニン、及び第263番目のセリンのうち少なくとも1つが他のアミノ酸に置換されたペプチドを用いる。さらに、エキソン8’の挿入に基づく置換変異、すなわち、配列番号2に示すアミノ酸配列の第248番目のアスパラギンがグリシンに(N248G)、第250番目のアラニンがロイシンに(A250L)、そして第263番目のセリンがシステインに(S263C)変異したアミノ酸残基を含む、ACTN4-Vaの部分ペプチド(例えばDIVGTLRPDEKAIMTYVSC(配列番号4))を用いることが好ましい。 The peptide that can be used as an antigen is preferably a peptide in the region from the 245th to the 263th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the peptide containing the amino acid sequence substitution specific for ACTN4-Va is used as the amino acid of the peptide in the above region Peptides in which at least one amino acid residue in the sequence is substituted with another amino acid residue can be used. Preferably, a peptide in which at least one of 248th valine, 250th alanine, and 263rd serine in the above region is substituted with another amino acid is used. Furthermore, a substitution mutation based on the insertion of exon 8 ′, that is, the 248th asparagine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is glycine (N248G), the 250th alanine is leucine (A250L), and the 263rd It is preferable to use a partial peptide of ACTN4-Va (for example, DIVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 4)) containing an amino acid residue in which the serine of cysteine is mutated to cysteine (S263C).
但し、ACTN4-Va特異的なアミノ酸配列置換は、上記N248G、A250L及びS263Cに限定されるものではなく、置換後のアミノ酸残基が、第248番目ではN及びGを除く他の18種類のアミノ酸残基(A、R、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y又はV)、第250番目ではA及びLを除く他の18種類のアミノ酸残基(R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y又はV)、そして第263番目ではS及びCを除く他の18種類のアミノ酸残基(A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y又はV)であってもよい。 However, ACTN4-Va specific amino acid sequence substitution is not limited to the above N248G, A250L and S263C, and the amino acid residue after substitution is 18th amino acid other than N and G at the 248th place. Residue (A, R, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y or V), except for A and L at the 250th position 18 types of amino acid residues (R, N, D, C, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y or V), and in the 263rd 18 other amino acid residues except S and C (A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y or V) It may be.
2−2.ポリクローナル抗体の製造
前記のようにして作製した部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫し、抗体価を測定する。
2-2. Production of polyclonal antibody Immunization is carried out by administering the partial peptide prepared as described above to a non-human mammal with itself or together with a carrier and a diluent, and the antibody titer is measured.
免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。 The type of non-human mammal to be immunized is not particularly limited, and examples include mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, goats, etc., with mice being preferred.
本発明の好ましい態様において、本発明の抗体を作製するために、免疫する動物として、高特異性抗体産生能を有する「GANP(登録商標)」と呼ばれるトランスジェニック非ヒト哺乳動物(WO2004/040971)を用いることもできる。 In a preferred embodiment of the present invention, in order to produce the antibody of the present invention, a transgenic non-human mammal called “GANP (registered trademark)” having a high-specificity antibody-producing ability as an animal to be immunized (WO2004 / 040971) Can also be used.
GANP(登録商標)トランスジェニック非ヒト哺乳動物とは、胚中心結合核タンパク質(Germinal center-associated nuclear protein)をコードする遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物であり、当該動物を所定の抗原で免疫することにより、当該抗原に対して高親和性あるいは高特異性抗体を産生することができる動物である(WO00/50611号公報、Sakaguchi N. et al., J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4485-94.)。 A GANP (registered trademark) transgenic non-human mammal is a non-human mammal into which a gene encoding a germinal center-associated nuclear protein has been introduced, and the animal is immunized with a predetermined antigen. By doing so, it is an animal that can produce a high-affinity or high-specificity antibody against the antigen (WO00 / 50611, Sakaguchi N. et al., J Immunol. 2005 Apr 15; 174 (8 ): 4485-94.).
例えばGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物(例えばマウス)は、上記公報又はSakaguchiらの文献に記載の方法により作製することが可能であり、あるいは、市販品のGANP(登録商標)マウス(株式会社トランスジェニック)として得ることができる。 For example, a GANP transgenic non-human mammal (for example, mouse) can be prepared by the method described in the above publication or Sakaguchi et al., Or a commercially available GANP (registered trademark) mouse (Transgenic Inc.). ) Can be obtained.
抗原の動物1匹あたりの投与量は、全体で10〜2000μgである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜3週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。 The total dose of the antigen per animal is 10 to 2000 μg. When immunizing an antigen, an adjuvant and an antigen solution are generally mixed. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously into the footpad, or the like. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times, at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 3 weeks.
免疫により抗体価が吸光度レベルで2以上上昇したのち、抗体価が吸光度レベルで0.05〜1、好ましくは0.05〜0.5、より好ましくは0.05まで低下するまで、2〜6ヶ月間、好ましくは4〜6ヶ月間、より好ましくは6ヶ月間動物を放置する。なお、上記吸光度レベルを示す血清の希釈率は、例えば27,000倍である。 After the antibody titer has increased by 2 or more at the absorbance level due to immunization, the antibody titer is decreased to 0.05 to 1, preferably 0.05 to 0.5, more preferably 0.05 to the absorbance level, for 2 to 6 months, preferably 4 to 6 Leave the animal for months, more preferably 6 months. In addition, the dilution rate of the serum which shows the said light absorbency level is 27,000 times, for example.
GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する場合は、吸光度レベルが低下するまで放置する必要がなく、一般的なモノクローナル抗体作製法の免疫間隔に従って、最終免疫まで行えばよい。 When immunizing a GANP transgenic non-human mammal, it is not necessary to leave it until the absorbance level is lowered, and it is sufficient to perform the final immunization according to the immunization interval of a general monoclonal antibody production method.
抗体価は、免疫した動物から採取した血液を用いて調べることができる。採取した血液は、採血後低温下で保管せずに、速やかに遠心し血清を分離することが好ましい。得られた血清を段階希釈し、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)又はEIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA(radioimmuno assay))等で抗体価を測定することができる。ELISA又はEIAで抗体価を測定する場合、吸光度は、分光光度計で測定することができる。 The antibody titer can be examined using blood collected from the immunized animal. The collected blood is preferably centrifuged at a low temperature after blood collection, and quickly centrifuged to separate serum. The obtained serum can be serially diluted, and the antibody titer can be measured by enzyme immunoassay (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA (radioimmuno assay)), etc. it can. When the antibody titer is measured by ELISA or EIA, the absorbance can be measured with a spectrophotometer.
測定の結果、ACTN4-Vaに対する抗体価の高い動物に最終免疫を施す。但し、抗原の免疫と抗体価の測定に関しては上記測定法に限定するものではない。 As a result of the measurement, an animal having a high antibody titer against ACTN4-Va is subjected to final immunization. However, the immunity of the antigen and the measurement of the antibody titer are not limited to the above measurement methods.
その後、最終免疫日から数日後に、好ましくは3〜5日後に免疫担当細胞(脾臓細胞等)を摘出する。また、動物の足蹠皮下に抗原を注入した場合には、最終免疫の回数は1回で、免疫から7〜13日後に、好ましくは8〜10日後に脾臓細胞などの免疫担当細胞又は所属リンパ節を摘出する。採血の間隔は、免疫して1〜4週間後、好ましくは1〜2週間後に行う。 Thereafter, immunocompetent cells (such as spleen cells) are removed several days after the final immunization day, preferably 3 to 5 days later. In addition, when an antigen is injected subcutaneously into the footpad of an animal, the number of final immunization is one, 7-13 days after immunization, preferably 8-10 days later, immunocompetent cells such as spleen cells or regional lymph Remove the knot. The interval between blood collections is 1 to 4 weeks, preferably 1 to 2 weeks after immunization.
本発明において、ポリクローナル抗体を取得する場合は、上記所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得る。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。 In the present invention, when obtaining a polyclonal antibody, blood is collected on the day when the desired antibody titer is shown to obtain an antiserum. When antibody purification is required, purify by selecting a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, or a combination thereof. Can do. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by ELISA or the like.
2−3.ACTN4-Vaに対するモノクローナル抗体の作製
以下に、ACTN4-Vaに対するモノクローナル抗体の作製方法について説明するが、これに限定するものではない。
2-3. Production of Monoclonal Antibody Against ACTN4-Va Hereinafter, a method for producing a monoclonal antibody against ACTN4-Va will be described, but it is not limited thereto.
本発明のモノクローナル抗体(「抗ACTN4-Va抗体」)を得る方法としては、まず、新規スプライスバリアントのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列ペプチドをGANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物などの動物に免疫し、免疫動物から抗体産生細胞(例えばB細胞)を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ(融合細胞株)を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。 As a method for obtaining the monoclonal antibody of the present invention (“anti-ACTN4-Va antibody”), first, an animal such as a GANP transgenic non-human mammal is immunized with an amino acid sequence peptide in which amino acid residues of a novel splice variant are substituted. Then, antibody-producing cells (eg, B cells) are collected from the immunized animal, and the antibody-producing cells and myeloma cells are fused to produce a hybridoma (fusion cell line). And the target monoclonal antibody can be obtained by extract | collecting the antibody produced from this hybridoma.
抗ACTN4-Va抗体は、いわゆるハプテン抗体と呼ばれるものであるが、そのようなハプテン抗体を作製する場合、ハプテン-キャリア複合体の分子構造デザインは、特異抗体の性能に対して非常に大きな影響を与える。 Anti-ACTN4-Va antibodies are so-called hapten antibodies, but when making such hapten antibodies, the molecular structure design of the hapten-carrier complex has a huge impact on the performance of specific antibodies. give.
(1)抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物等の動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。GANPトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた場合でも、上記と同様に脾臓細胞やリンパ節から抗体産生細胞を採取することができる。
(1) Preparation of antibody-producing cells Antibody-producing cells are prepared from spleen cells or the like of immunized animals such as non-human mammals or regional lymph nodes. Even when a GANP transgenic non-human mammal is used, antibody-producing cells can be collected from spleen cells and lymph nodes in the same manner as described above.
リンパ節は、例えば鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節などがあげられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが望ましい。また、抗体産生細胞を調製する際には、組織の残骸や赤血球をできる限り除いておくことが好ましい。赤血球除去の方法は、一般的に市販されている赤血球除去液を使用するか、塩化アンモニウムとトリスで調製した中性の緩衝液を作製して使用する方法が好ましく採用される。調製した抗体産生細胞は、調製後直ちに次の作業に取りかからないと細胞の状態が悪化する場合があるので、調製後次の作業までに時間がかかる場合は、氷上に静置させておくことが好ましい。 Examples of lymph nodes include inguinal lymph nodes and mediastinal lymph nodes. Although it is not necessary to separate the antibody-producing cells from the collected cell population, it is desirable to separate only antibody-producing cells from the cell population. In preparing antibody-producing cells, it is preferable to remove tissue debris and erythrocytes as much as possible. As a method of removing erythrocytes, a method of using a commercially available erythrocyte removal solution or a method of preparing and using a neutral buffer prepared with ammonium chloride and Tris is preferably employed. The prepared antibody-producing cells may deteriorate if the next operation is not started immediately after preparation, so if it takes time until the next operation after preparation, it should be left on ice. preferable.
(2)細胞融合
細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞(ハイブリドーマ)を作製するために行う作業である。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、HAT選択培地(ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3X63-Ag.8.U1(P3U1)やP3/NS I/1-Ag4-1(NS I)等が挙げられる。
(2) Cell fusion Cell fusion is an operation performed to fuse the antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) to produce cells (hybridomas) that continue to grow semipermanently while producing antibodies. . As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line to be used is preferably one that has the property that it cannot survive in a HAT selective medium (medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin) and can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Examples of myeloma cells include P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) and P3 / NS I / 1-Ag4-1 (NS I).
細胞融合は、ウシ胎児血清(FCS)等を含まないDMEMやRPMI1640培地などの一般に市販されている培地で、1×106〜1×107個/mLの脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞と1×105〜1×106個/mLのミエローマ細胞とを混合し(脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比は5:1が好ましい)、細胞融合促進剤存在下で融合を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量200〜20000ダルトンのポリエチレングリコールを使用することができる。 Cell fusion is a commercially available medium such as DMEM or RPMI1640 medium that does not contain fetal calf serum (FCS), etc., and 1 × 10 6 to 1 × 10 7 cells / mL of spleen cells and / or lymph node cells 1 × 10 5 to 1 × 10 6 cells / mL myeloma cells are mixed (the ratio of spleen cells and / or lymph node cells to myeloma cells is preferably 5: 1) in the presence of a cell fusion promoter. Perform fusion. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 200 to 20,000 daltons can be used.
また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて、融合させることもできる。さらに、センダイウイルスを用いて細胞を融合させることもできる。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることができる。 Moreover, it can also fuse | melt using the commercially available cell fusion apparatus using electrical stimulation (for example, electroporation). Furthermore, cells can be fused using Sendai virus. A person skilled in the art can fuse the antibody-producing cells and myeloma cells using a known cell fusion method.
融合後、例えば10〜20%(好ましくは20%)FCS含有RPMI1640培地などで作製したHAT培地で細胞を希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.5〜3×105個ずつ細胞を播き込み、CO2インキュベーターで培養する。 After the fusion, for example, dilute the cells with HAT medium made with 10-20% (preferably 20%) FCS-containing RPMI1640 medium, and then inoculate 0.5- 3 x 10 5 cells into each well of a 96-well culture plate. Incubate in a CO 2 incubator.
(3)ハイブリドーマの樹立
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から10〜14日後に、前記したようにHAT培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性96穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、ACTN4-Vaに対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法(ELISA)や放射性免疫測定法(RIA)等で行う。このとき、細胞から産生される抗体にはキャリア蛋白質であるKLHやBSAに対する抗体も含まれるので、KLH等に対する抗体価を測定することで、KLH等に対する抗体価の高いKLH抗体陽性ウェルを除くことができる。ACTN4-Vaに対する抗体産生陽性ウェルを確認できた後は、24穴や12穴培養プレートに細胞を移す。
(3) Establishment of hybridoma Next, a hybridoma producing the target antibody is selected from the cells after cell fusion treatment. Ten to 14 days after cell fusion, cells selected in HAT medium as described above form colonies. The culture supernatant of each well of the colony positive 96-well culture plate is collected and the antibody titer against ACTN4-Va is confirmed. As a confirmation method, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or the like is performed. At this time, antibodies produced from cells include antibodies against KLH and BSA, which are carrier proteins. Therefore, by measuring the antibody titer against KLH, etc., remove KLH antibody positive wells with high antibody titer against KLH etc. Can do. After confirming positive wells for antibody production against ACTN4-Va, transfer the cells to 24-well or 12-well culture plates.
ここで、培地はアミノプテリンを除いたHT培地(ヒポキサンチン、チミジン含有培地)に置き換えることが好ましい。HT培地は、細胞内に残留したアミノプテリンの影響がある間、サルベージ経路にプリンおよびピリミジンの前駆体を供給し続けるハイブリドーマの回復用培地として用いる。HT培地中でしばらく培養後、再度培養上清中の抗体価を確認する。ハイブリドーマは融合細胞であるために不安定であり、すぐに抗体産生能が消失する可能性が高いため、2度目の抗体価の確認を行っておくことが好ましい。前記したように、本発明においてはACTN4-Ubとは交差反応せず、ACTN4-Vaに対して高い特異性を有するハイブリドーマを取得することが必要であるため、ここで重要なことは、培養上清レベルで他のACTN4-Ubとの交差反応性をELISAやRIA等で確認することである。 Here, the medium is preferably replaced with an HT medium (a medium containing hypoxanthine and thymidine) excluding aminopterin. HT medium is used as a recovery medium for hybridomas that continue to supply purine and pyrimidine precursors to the salvage pathway during the influence of aminopterin remaining in the cells. After culturing in HT medium for a while, the antibody titer in the culture supernatant is confirmed again. The hybridoma is unstable because it is a fused cell, and it is highly possible that the antibody-producing ability is immediately lost. Therefore, it is preferable to confirm the antibody titer for the second time. As described above, in the present invention, it is necessary to obtain a hybridoma that does not cross-react with ACTN4-Ub and has high specificity for ACTN4-Va. Cross-reactivity with other ACTN4-Ub at the clearing level is confirmed by ELISA or RIA.
最終的に選択されたウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を10〜20%のFCS含有(好ましくは20%)RPMI1640培地などで適当に希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.3〜2個入るように細胞を播き込む。96穴培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、1つのウェルに入る細胞が1個である確率が高くなるようにするため、好ましくは各ウェルに1個入るように細胞を播く。細胞播き込み後、7〜10日後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。このとき、3〜5日後にシングルコロニーであることを確認することが好ましい。回収した培養上清は、抗体価を確認する。ここでもACTN4-Vaに対して高い特異性を有し、かつACTN4-Ubに対する交差反応性が低いクローンを選択する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。 The cells in the final selected well are cloned to make a single cell. For cloning, for example, after appropriately diluting the cell suspension with RPMI1640 medium containing 10 to 20% FCS (preferably 20%), seed the cells so that 0.3 to 2 cells are added to each well of a 96-well culture plate. . In order to increase the probability that the number of cells in each well of the 96-well culture plate is one cell, it is preferable to seed one cell in each well. After cell seeding, the culture supernatant of the colony-positive well is collected 7 to 10 days later. At this time, it is preferable to confirm that it is a single colony after 3-5 days. The collected culture supernatant is checked for antibody titer. Again, clones are selected that have high specificity for ACTN4-Va and low cross-reactivity for ACTN4-Ub. Further, the number of cells in the selected well is increased to some extent to establish a hybridoma strain. Cloning may be performed several times as necessary.
(4)モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマ株から以下の方法でACTN4-Va特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を0.1〜4×105個/mLで調製し、1〜2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを0.1〜1×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。
(4) Preparation of monoclonal antibody ACTN4-Va specific monoclonal antibody is purified and collected from the established hybridoma strain by the following method. That is, a method of preparing an antibody from a culture supernatant cultured in a medium with reduced serum concentration, a method of preparing an antibody from a culture supernatant cultured in a commercially available serum-free medium, or injecting a hybridoma into the abdominal cavity of an animal. There is a method of collecting ascites and preparing antibodies from the ascites. The culture supernatant is collected from cells prepared at 0.1-4 × 10 5 cells / mL and cultured for 1-2 weeks. In the case of ascites, 0.1 to 1 × 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and the same type of animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. And ascitic fluid is collected after 1-2 weeks.
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。抗体の精製方法は、プロテインGアフィニティカラム又はプロテインAアフィニティカラムで精製する方法、ACTN4-Vaアフィニティカラムで精製する方法、硫安塩析分画からゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法等があり、これら公知の方法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。なお、プロテインAアフィニティカラムを用いてマウスのIgG1を精製する場合は、結合条件を至適化したバッファーなどを用いることが有効であり、当業者であれば至適条件を適宜選択して、精製することができる。 Examples of the culture method include a method using a culture flask, a method using a spinner flask, a method using a shaker flask, and a method using a bioreactor. Antibody purification methods include protein G affinity column or protein A affinity column purification method, ACTN4-Va affinity column purification method, ammonium sulfate salting-out fraction purification method using gel filtration chromatography, and ion exchange chromatography. There are methods for purification, etc., and these known methods can be appropriately selected, or can be purified by combining them. When purifying mouse IgG 1 using a protein A affinity column, it is effective to use a buffer or the like in which binding conditions are optimized, and those skilled in the art appropriately select the optimal conditions, Can be purified.
(5)微生物の寄託
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株(ハイブリドーマ)は、「Anti ACTN4-Va MAb (Clone No.15H2)」と称し、2011年8月31日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒 292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 NITEバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター)に国際寄託した。その受付番号を示す受領番号(受領書に記載)は、NITE ABP-1140である。NITE ABP-1140は、実施例1で「15H2」として樹立したクローンである。
(5) Deposit of microorganisms The cell line (hybridoma) producing the monoclonal antibody of the present invention is called “Anti ACTN4-Va MAb (Clone No. 15H2)” and was evaluated by an independent administrative agency product as of August 31, 2011. Deposited internationally at the Technology Microorganisms Patent Microorganisms Deposit Center (Nara Biotechnology Headquarters, Patent Microorganisms Deposit Center 2-5-8 Kazusa Kamashitsu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). The receipt number (indicated on the receipt) indicating the receipt number is NITE ABP-1140. NITE ABP-1140 is a clone established as “15H2” in Example 1.
(6)モノクローナル抗体の性質
本発明のモノクローナル抗体は、ACTN4-Vaに対して特異的に結合し、高特異性を示すものである。その特異性は、ウェスタンブロッティングにおけるACTN4-Vaと抗体との反応系において、ACTN4-Vaが特異的に発現したヒト小細胞肺癌由来癌細胞株H69の細胞抽出液を用いた際の抗原抗体反応系が、非発現株のヒト膵臓腺癌由来細胞株BxPC-3、ヒト乳癌由来細胞株MCF7の細胞抽出液を用いた際の抗原抗体反応系と比較して、目的の分子量の位置にACTN4-Vaのバンドを検出することによって、特異性を示すことができる条件を満たすものである。
(6) Properties of monoclonal antibody The monoclonal antibody of the present invention specifically binds to ACTN4-Va and exhibits high specificity. The specificity of the antigen-antibody reaction system using the cell extract of human small cell lung cancer-derived cancer cell line H69 that specifically expressed ACTN4-Va in the reaction system between ACTN4-Va and antibody in Western blotting However, compared to the antigen-antibody reaction system when using cell extracts of the non-expressing human pancreatic adenocarcinoma cell line BxPC-3 and the human breast cancer cell line MCF7, ACTN4-Va By detecting this band, the condition that can show the specificity is satisfied.
例えば、
(i)まず、新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換が存在するACTN4-Vaを含む、ヒト小細胞肺癌由来癌細胞株H69の抽出液(これを「抗原1」という)をウェスタンブロッティングに供する。同様に、新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換が存在しないACTN4-Ubを含むヒト膵臓腺癌由来細胞株BxPC-3、ヒト乳癌由来細胞株MCF7の細胞抽出液(これらをそれぞれ「抗原2」および「抗原3」という)をウェスタンブロッティングに供する。
(ii) 次に、当該抗原に対する抗体をそれぞれの抗原に対して同一濃度で反応させる。
上記(i)の抗原抗体反応における抗原分子(抗原1)は、そのアミノ酸配列において新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換が存在し、本発明のモノクローナル抗体は新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換を含む固相化抗原1と特異的に結合する。そのため、ウェスタンブロットでは分子量約100KDaのたんぱく質バンドとして検出が出来る。
For example,
(i) First, an extract of a human small cell lung cancer-derived cancer cell line H69 containing ACTN4-Va containing a newly inserted exon 8′-derived amino acid sequence substitution (hereinafter referred to as “antigen 1”) Use for blotting. Similarly, cell extracts of human pancreatic adenocarcinoma-derived cell line BxPC-3 and human breast cancer-derived cell line MCF7 containing ACTN4-Ub without amino acid sequence substitution derived from newly inserted exon 8 ' Antigen 2 ”and“ Antigen 3 ”) are subjected to Western blotting.
(ii) Next, an antibody against the antigen is reacted with each antigen at the same concentration.
The antigen molecule (antigen 1) in the antigen-antibody reaction of (i) above has an amino acid sequence substitution derived from the newly inserted exon 8 ′ in its amino acid sequence, and the monoclonal antibody of the present invention has a newly inserted exon. It specifically binds to immobilized antigen 1 containing an 8'-derived amino acid sequence substitution. Therefore, it can be detected as a protein band with a molecular weight of about 100 KDa by Western blot.
また、上記反応系において、固相化抗原が抗原2および抗原3の場合は新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換を有しないため、この固相化抗原2および3と、本発明のモノクローナル抗体とは特異的に結合できない。そのため、ウェスタンブロットでは分子量約100KDaのたんぱく質バンドとして検出が出来ない。 Further, in the above reaction system, when the immobilized antigen is antigen 2 and antigen 3, since the newly inserted exon 8′-derived amino acid sequence substitution is not present, the immobilized antigens 2 and 3 and the present invention It cannot bind specifically to the monoclonal antibody. Therefore, it cannot be detected as a protein band with a molecular weight of about 100 KDa by Western blot.
本発明の抗体は、上記抗原抗体反応試験を行なったときに、抗原1、2および3の泳動量が10μg/laneの場合、抗ACTN4-Va抗体の検出濃度が少なくとも10μg/ml以下、好ましくは5μg/ml以下、より好ましくは2.5μg/ml以下、特に好ましくは1μg/ml以下となる検出条件を満たすものであり、抗原1に対して極めて高い特異性を有する。 The antibody of the present invention has a detection concentration of anti-ACTN4-Va antibody of at least 10 μg / ml, preferably when the migration amount of antigens 1, 2 and 3 is 10 μg / lane when the antigen-antibody reaction test is performed. It satisfies the detection condition of 5 μg / ml or less, more preferably 2.5 μg / ml or less, particularly preferably 1 μg / ml or less, and has extremely high specificity for antigen 1.
あるいは、ACTN4-Vaを遺伝子導入した発現細胞由来抗原を用いたウェスタンブロッティングにより、本モノクローナル抗体の特異性を示してもよい。 Alternatively, the specificity of this monoclonal antibody may be shown by Western blotting using an expression cell-derived antigen into which ACTN4-Va has been introduced.
その特異性は、以下のようにして検出することができる。 Its specificity can be detected as follows.
ウェスタンブロッティングにおけるACTN4-Vaと抗体との反応系において、ACTN4-Va のN末端にGFP(green fluorescent protein)を付加したプラスミドベクターを作製し、ヒト腎上皮細胞株HEK293(HEK293という)に遺伝子導入した発現細胞由来の抽出液を用いた際の抗原抗体反応系を実施する(反応系1という)。一方、ACTN4-Ub のN末端にGFP(green fluorescent protein)を付加したプラスミドベクターを作製し、HEK293に遺伝子導入した発現細胞由来の抽出液を用いた際の抗原抗体反応系を実施する(反応系2という)。 In the reaction system of ACTN4-Va and antibody in Western blotting, a plasmid vector in which GFP (green fluorescent protein) was added to the N-terminus of ACTN4-Va was prepared and introduced into the human renal epithelial cell line HEK293 (referred to as HEK293) An antigen-antibody reaction system when an extract derived from an expressed cell is used (referred to as reaction system 1). On the other hand, a plasmid vector in which GFP (green fluorescent protein) is added to the N-terminus of ACTN4-Ub is prepared, and an antigen-antibody reaction system is performed using an extract derived from an expression cell that has been transfected into HEK293 (reaction system). 2).
次に、反応系1と反応系2とを比較して、反応系1において目的の分子量の位置にACTN4-Vaのバンドが現れるかを検出する。 Next, the reaction system 1 and the reaction system 2 are compared to detect whether or not an ACTN4-Va band appears at the position of the target molecular weight in the reaction system 1.
(7)抗体断片
上記抗体の断片も、本発明の抗体に含まれる。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗体と同様に、ACTN4-Vaに対する抗体であって、新たに挿入されたエキソン8’由来のアミノ酸配列置換の全部あるいは何れかを認識する上記性質を有するものである。
(7) Antibody fragment The above antibody fragment is also included in the antibody of the present invention. Here, the antibody fragment of the present invention is an antibody against ACTN4-Va, similar to the antibody of the present invention, which recognizes all or any of the newly inserted exon 8′-derived amino acid sequence substitutions. It is what has.
抗体の断片としては、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab(antigen - binding fragment)、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody(dibodies)、dsFv、線状抗体、scFv(single chain Fv)、相補性決定領域(complementarity determining region:CDR)を少なくとも一部に含むペプチド等などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。 The antibody fragment means a partial region of the antibody of the present invention. For example, Fab (antigen-binding fragment), Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, diabody (dibodies), dsFv, linear antibody , ScFv (single chain Fv), peptides containing at least part of a complementarity determining region (CDR), and the like. The antibody fragment can be obtained by cleaving the antibody of the present invention with various proteolytic enzymes according to the purpose.
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。 For example, Fab can be obtained by treating antibody molecules with papain, and F (ab ′) 2 can be obtained by treating antibody molecules with pepsin. Fab ′ can be obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
scFvの場合は、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。 In the case of scFv, cDNA encoding VH and VL of the antibody is obtained, and DNA encoding scFv is constructed. By inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression, scFv can be produced.
diabodyの場合は、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。 In the case of a diabody, cDNA encoding the antibody VH and VL is obtained, and a DNA encoding scFv is constructed so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less. A diabody can be produced by inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression.
dsFvの場合は、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。 In the case of dsFv, cDNAs encoding antibody VH and VL are obtained, and DNAs encoding dsFv are constructed. By inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression, dsFv can be produced.
CDRを含むペプチドの場合は、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、CDRを含むペプチドを製造することができる。CDRを含むペプチドは、Fmoc法及びtBoc法等の化学合成法によって製造することもできる。 In the case of a peptide containing CDR, DNA encoding the CDR of antibody VH and VL is constructed. By inserting this DNA into an expression vector and introducing the expression vector into a host organism for expression, a peptide containing CDR can be produced. Peptides containing CDR can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method and tBoc method.
抗体のアミノ酸配列が改変されたとしても、上記変異型ACTN4と特異的に結合することができる限り、そのような抗体は本発明の範囲内に含まれる。 Even if the amino acid sequence of the antibody is modified, such an antibody is included in the scope of the present invention as long as it can specifically bind to the mutant ACTN4.
(8)遺伝子組換え抗体
本発明のACTN4-Vaに対する抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
(8) Recombinant antibody As a preferred embodiment of the antibody against ACTN4-Va of the present invention, a recombinant antibody can be mentioned. Examples of the recombinant antibody include, but are not limited to, chimeric antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies.
キメラ抗体(すなわちヒト型キメラ抗体)は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結(接合)した抗体であり(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照)、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって構築できる。 A chimeric antibody (ie, a human chimeric antibody) is an antibody obtained by linking (joining) a variable region of a mouse-derived antibody to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984). ), Etc.), when producing a chimera, it can be constructed by genetic recombination techniques so as to obtain an antibody so linked.
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング(CDR移植)と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域(CDR)をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である(例えばNature, 321, 522-525(1986);J. Mol. Biol., 196, 901-917(1987)等を参照)。 When producing a humanized antibody, a so-called CDR grafting (CDR grafting) method can be employed. CDR grafting refers to transplanting the complementarity determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody into a human variable region, the framework region (FR) is derived from a human and the CDR is derived from a mouse. This is a method for producing a configured variable region. These humanized reshaped human variable regions are then linked to human constant regions. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (see, for example, Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)). .
ヒト化抗体(完全ヒト抗体)は、一般にV領域の抗原結合部位である超過変領域(Hyper Variable region)、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727等を参照)や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431等を参照)により取得することができる。 Humanized antibodies (fully human antibodies) generally have the same structure as the human antibody in the hypervariable region, which is the antigen binding site of the V region, the rest of the V region, and the constant region. It is. However, the hypervariable site may be derived from another animal. Techniques for producing humanized antibodies are also known, and methods for producing gene sequences common to humans by genetic engineering techniques have been established. The humanized antibody can be obtained, for example, by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the H chain and L chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133. -143; Kuroiwa, Y. et.al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727 etc.) and methods for obtaining human antibodies derived from phage display selected from human antibody libraries (Wormstone, IMet.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301 -8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 etc.).
また、本発明においては、本発明のハイブリドーマ(例えば受領番号NITE ABP-1140のハイブリドーマ)又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。 Further, in the present invention, a chimeric antibody or a humanized antibody according to the above-mentioned well-known method using the hybridoma of the present invention (for example, the hybridoma having the receipt number NITE ABP-1140) or DNA or RNA extracted from the hybridoma as a raw material. Antibodies and humanized antibodies can be prepared.
(9)本発明の抗体が結合する抗原決定基に結合する抗体
さらに、本発明の抗ACTN4-Va抗体としては、例えば、受領番号がNITE ABP-1140であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合(認識)する部位(例えばエピトープ)に結合する抗体も好ましく挙げられる。エピトープとしては、以下に例示するものが挙げられる。
(9) An antibody that binds to an antigenic determinant to which the antibody of the present invention binds. Further, as an anti-ACTN4-Va antibody of the present invention, for example, a monoclonal antibody produced by a hybridoma whose receipt number is NITE ABP-1140 binds An antibody that binds to (recognizes) a site (for example, an epitope) is also preferred. Examples of the epitope include those exemplified below.
本発明の抗ACTN4-Va抗体のエピトープ(抗原決定基)は、抗原であるACTN4-Vaの少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、ACTN4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目のアミノ酸配列を含む領域であり、第248番目、第250番目及び第263番目が他のアミノ酸残基、好ましくはそれぞれグリシン、ロイシン、システインに置換されたアミノ酸配列を含むものである。このようなエピトープのアミノ酸配列は、D IVGTLRPDEKAIMTYVSC(配列番号4)で示されるものである。 The epitope (antigenic determinant) of the anti-ACTN4-Va antibody of the present invention is not limited as long as it is at least a part of the antigen ACTN4-Va. For example, the amino acid sequence of 245 to 263 of ACTN4 is used. Wherein the 248th, 250th and 263rd amino acid sequences are substituted with other amino acid residues, preferably glycine, leucine and cysteine, respectively. The amino acid sequence of such an epitope is represented by D IVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 4).
3.検出方法
ACTN4-Vaは、癌の臨床マーカー(腫瘍マーカー)として利用することができるため、本発明の抗体を生体試料と反応させ、生体試料中のACTN4-Vaを測定することにより、その測定結果を指標として腫瘍を検出または診断することができる。
3. Detection method
Since ACTN4-Va can be used as a clinical marker (tumor marker) for cancer, the antibody of the present invention is reacted with a biological sample, and ACTN4-Va in the biological sample is measured to indicate the measurement result as an index. As a tumor can be detected or diagnosed.
従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片と生体試料とを反応させて、変異型α-アクチニン-4を検出することを特徴とする、変異型α-アクチニン-4の検出方法を提供する。 Therefore, the present invention provides a method for detecting mutant α-actinin-4, which comprises reacting the antibody of the present invention or a fragment thereof with a biological sample to detect mutant α-actinin-4. To do.
また、本発明は、本発明の抗体と生体試料とを反応させて、ACTN4-Vaに反応し、ACTN4-Ubに反応しない、ACTN4-Vaを検出することを特徴とする、癌の検出または診断方法を提供する。検出の対象となるタンパク質としては、例えばACTN4-Vaが挙げられ、検出の対象は、ACTN4-Vaの全長タンパク質、あるいはACTN4-Vaの部分ポリペプチド(例えば下記のアミノ酸配列を含むポリペプチド)が挙げられる。
DIVGTLRPDEKAIMTYVSC(配列番号4)
ACTN4-Vaの測定は、一般に行われる免疫組織染色(IHC:Immunohistochemical stainingという)、あるいはハプテン免疫測定法として知られている方法のいずれの方法(例えば、ELISA、EIA)等によっても行うことができ、特に限定されない。
The present invention also provides a detection or diagnosis of cancer, characterized by reacting the antibody of the present invention with a biological sample to detect ACTN4-Va that reacts with ACTN4-Va but does not react with ACTN4-Ub. Provide a method. Examples of the protein to be detected include ACTN4-Va, and examples of the detection target include the full-length protein of ACTN4-Va or a partial polypeptide of ACTN4-Va (for example, a polypeptide containing the following amino acid sequence). It is done.
DIVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 4)
Measurement of ACTN4-Va generally immunohistochemical staining carried out: either method of (IHC I mmuno h isto c hemical called staining), or a method known as hapten immunoassay (e.g., ELISA, EIA) such as by There is no particular limitation.
癌としては、特に限定されるものではなく、例えば脳腫瘍、唾液腺がん、食道癌、咽頭癌、口腔がん、肺癌、胃癌、小腸又は十二指腸癌、大腸癌、尿路悪性腫瘍(例えば前立腺癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍)、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆道癌、膵がん、神経内分泌腫瘍、肉腫(例えば骨肉種、筋肉種など)及びメラノーマからなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられるが、好ましくは、肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍(HGNT)である。HGNTには、小細胞肺癌(SCLC)及び大細胞神経内分泌癌(LCNEC)が含まれ、これらの中から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。検出対象となる癌の種類は、1種類でもよく2種類以上が併発したものでもよい。癌の状態は、癌の有無、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無からなる群から選ばれる少なくとも1つである。 The cancer is not particularly limited, and for example, brain tumor, salivary gland cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, lung cancer, stomach cancer, small intestine or duodenal cancer, colon cancer, urinary tract malignant tumor (for example, prostate cancer, Kidney cancer, bladder cancer, testicular tumor), liver cancer, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, neuroendocrine tumor, sarcoma (eg, osteosarcoma, muscle species, etc.) ) And at least one selected from the group consisting of melanomas, preferably a primary lung high-grade neuroendocrine tumor (HGNT). HGNT includes small cell lung cancer (SCLC) and large cell neuroendocrine cancer (LCNEC), and includes at least one selected from these. The type of cancer to be detected may be one, or two or more types may be combined. The state of cancer is at least one selected from the group consisting of the presence or absence of cancer, the malignancy of cancer, the presence or absence of cancer metastasis, and the presence or absence of cancer recurrence.
特に、HGNT患者由来のACTN4-Vaには、上記配列番号4に示すペプチド(アミノ酸が置換されているペプチド)のアミノ酸配列が含まれているため、このアミノ酸配列に特異的に結合する本発明の抗体は、前述の癌を検出するのに特に好ましい。 In particular, ACTN4-Va derived from an HGNT patient contains the amino acid sequence of the peptide shown in SEQ ID NO: 4 (a peptide in which an amino acid is substituted). Therefore, the present invention specifically binds to this amino acid sequence. Antibodies are particularly preferred for detecting the aforementioned cancers.
癌患者、癌が疑われる患者、あるいは健康診断受診者等の被験者から生体試料を採取し、ACTN4-Va測定試料を調製する。生体試料としては、組織、細胞等が挙げられる。組織は、採取した後に組織切片として調製したものを用いることが好ましい。 A biological sample is collected from a subject such as a cancer patient, a patient suspected of cancer, or a health checkup examinee, and an ACTN4-Va measurement sample is prepared. Examples of biological samples include tissues and cells. It is preferable to use a tissue prepared as a tissue section after being collected.
次いで、前記測定試料と本発明の抗体とを反応させる。ACTN4-Vaの検出は、一般に行われるIHCにより行うことができる。ここでは、説明の便宜上、本発明の抗体にはマウス由来の抗体を用いる。 Next, the measurement sample is reacted with the antibody of the present invention. The detection of ACTN4-Va can be performed by a commonly performed IHC. Here, for convenience of explanation, a mouse-derived antibody is used as the antibody of the present invention.
IHCでの測定には、切片上のパラフィンを除去したのち、内因性のペルオキシダーゼ活性の阻止を行い、熱処理にて抗原を賦活させる。2%の豚血清で非特異的なタンパク質結合のブロッキングを行い、1次抗体(抗ACTN4-Va抗体)を4度、16時間以上でハイブリダイゼーションを行う。1次抗体を洗浄し、2次抗体としてビオチン化抗マウスIgGで室温1時間でハイブリダイゼーションをおこない、さらに洗浄後アビジンペルオキダーゼ標識3次抗体で反応させ、DAB(3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochlorideという)を基質として発色を行う。 For measurement with IHC, after removing paraffin on the section, endogenous peroxidase activity is blocked and the antigen is activated by heat treatment. Block nonspecific protein binding with 2% porcine serum and hybridize with primary antibody (anti-ACTN4-Va antibody) 4 times for 16 hours or more. The primary antibody was washed, hybridized with a biotinylated anti-mouse IgG as a secondary antibody at room temperature for 1 hour, further washed and reacted with an avidin peroxidase-labeled tertiary antibody, and DAB (3,3'-Diaminobenzidine, Color is developed using tetrahydrochloride as a substrate.
また、本発明の別の態様においては、ACTN4-VaのmRNA量を検出し、その検出結果から腫瘍を検出することができる。 In another embodiment of the present invention, the amount of ACTN4-Va mRNA can be detected, and a tumor can be detected from the detection result.
従って、本発明は、ACTN4のアミノ酸配列の第245番目から第263番目の領域のアミノ酸残基の少なくとも1つが他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む変異型ACTN4をコードする遺伝子を検出する方法を提供する。その方法は、上記置換アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対するプローブ又は該ポリヌクレオチドの増幅用プライマーと生体試料とを反応させて前記遺伝子を検出するというものである。検出の遺伝子としては、ACTN4をコードするDNAのエキソン8’に由来するスプライスバリアントのmRNA であることが好ましい。 Therefore, the present invention detects a gene encoding a mutant ACTN4 comprising an amino acid sequence in which at least one of the amino acid residues in the 245th to 263th regions of the amino acid sequence of ACTN4 is substituted with another amino acid residue Provide a way to do it. The method detects the gene by reacting a probe for a polynucleotide encoding the substituted amino acid sequence or a primer for amplification of the polynucleotide with a biological sample. The detection gene is preferably a splice variant mRNA derived from exon 8 'of DNA encoding ACTN4.
mRNAの測定は、例えばノーザンブロッティング、RT-PCR、Real-time PCR、マイクロアレイ等により行なうことができる。 Measurement of mRNA can be performed, for example, by Northern blotting, RT-PCR, Real-time PCR, microarray, or the like.
ACTN4-Vaをコードする遺伝子は、前記N248G、A250L若しくはS263C、又はこれらの組み合わせの置換変異を有するように配列番号1に示される塩基配列が置換されている。すなわち、V248Gでは配列番号1に示す塩基配列の第861〜863番の「aac」(Asnのコドン)が「ggc」(Glyのコドン)に、A250Lでは配列番号1に示す塩基配列の第867〜869番の「gcc」(Alaのコドン)が「cug」(Leuのコドン)に、そしてS263Cでは配列番号1に示す塩基配列の第906〜908番の「agc」(Serのコドン)が「ugc」(Cysのコドン)に置換されている。 In the gene encoding ACTN4-Va, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted so as to have a substitution mutation of N248G, A250L or S263C, or a combination thereof. That is, in V248G, “aac” (Asn codon) of 861-863 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is “ggc” (Gly codon), and in A250L, 867-863 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. 869 “gcc” (Ala codon) is “cug” (Leu codon), and in S263C, nucleotide sequences 906 to 908 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 are “agc” (Ser codon) “ugc "(Cys codon).
従って、ノーザンブロッティングを行う場合は、ACTN4-Vaをコードする遺伝子のうち、上記変異部位を含むヌクレオチド(エキソン8’に由来するヌクレオチド)にハイブリダイズするプローブを設計し、合成する。 Therefore, when Northern blotting is performed, a probe that hybridizes to the nucleotide containing the mutation site (nucleotide derived from exon 8 ') of the gene encoding ACTN4-Va is designed and synthesized.
また、RT-PCRやReal-time PCRを行う場合は、上記変異部位を含むヌクレオチド(エキソン8’に由来するヌクレオチド)が増幅されるようにプライマーを設計する。 In addition, when performing RT-PCR or Real-time PCR, the primer is designed so that nucleotides containing the above mutation sites (nucleotides derived from exon 8 ') are amplified.
mRNAの解析では、例えば、アクセッション番号NM_00004924.4に示すACTN4遺伝子(配列番号1)に対応したスプライスバリアント、すなわちエキソン8’の挿入に基づく塩基の置換を網羅的に検出することができる。 In the analysis of mRNA, for example, substitution of bases based on insertion of a splice variant corresponding to the ACTN4 gene (SEQ ID NO: 1) shown in the accession number NM_00004924.4, that is, exon 8 'can be comprehensively detected.
そしてACTN4が変異型であることの判断、あるいは腫瘍であるかどうかの判断は、プローブによるハイブリダイゼーション、PCRによる増幅反応又はシークエンシングの結果、目的のバンドが検出された場合、あるいは変異型の塩基配列が得られた場合は、ACTN4が変異型であると判断することができる。 Judgment that ACTN4 is a mutant type or whether it is a tumor is based on the detection of the target band as a result of hybridization with the probe, amplification reaction or sequencing by PCR, or the base of the mutant type. If the sequence is obtained, it can be determined that ACTN4 is mutant.
その際、健常者由来のmRNA発現量と比較することが好ましい。例えば、被験者由来の試料中のmRNA発現量(試験値)と、健常人由来の被検試料中におけるmRNAの発現量(対照値)との比を比較し、基準値以上であれば癌であると判定する。 In that case, it is preferable to compare with the mRNA expression level derived from a healthy person. For example, the ratio of the mRNA expression level (test value) in a subject-derived sample to the mRNA expression level (control value) in a test sample derived from a healthy subject is compared. Is determined.
ところで、本発明の方法では、複数の被験者由来の生体試料を用いてACTN4-Va又はそのmRNAのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験者(1次母集団)において上記ACTN4-Va又はそのmRNA量を測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる個々の被験者由来の生体試料由来のACTN4-Va又はそのmRNA量とを比較することができる。 By the way, in the method of the present invention, the level of ACTN4-Va or its mRNA may be measured using biological samples derived from a plurality of subjects. Therefore, the ACTN4-Va or its mRNA amount is measured in a predetermined number of subjects (primary population), and the obtained measurement values are used as basic data, and the basic data and individual detection targets. The amount of ACTN4-Va derived from a biological sample derived from a subject or its mRNA can be compared.
さらに、上記測定された被験者のデータが所定値以上のときは前記母集団の値に組み込んでACTN4-Va又はそのmRNA量のレベルを再度データ処理し(平均値化等)、対象となる被験者(母集団)の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ACTN4-Va又はそのmRNA量の臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、癌の検出又は診断精度を高めることができる。 Furthermore, when the measured data of the test subject is equal to or greater than a predetermined value, it is incorporated into the population value, and the data level of ACTN4-Va or its mRNA amount is processed again (averaging, etc.) You can also increase the number of cases in the population). By increasing the number of cases, the accuracy of the critical value of ACTN4-Va or its mRNA amount can be increased, and in some cases, the critical value can be appropriately corrected to improve the accuracy of cancer detection or diagnosis.
さらに、患者又は健康診断受診者等の被験者から個別に採取した生体試料に対し、本発明の方法を用いて、実際に治療を開始する前などに当該被験者の癌の検出を行うことができる。即ち、当該生体試料からmRNAを採取してそのレベル又は塩基配列を検査し、その検査結果が陽性である場合又は目的の塩基配列が解析された場合には、当該被験者が癌である確率(リスク)が高いものと判断することができる。 Furthermore, cancer of the subject can be detected using a method of the present invention on a biological sample individually collected from a subject such as a patient or a health checkup examinee before actually starting treatment. That is, if mRNA is collected from the biological sample and its level or base sequence is examined, and the test result is positive or the target base sequence is analyzed, the probability that the subject has cancer (risk ) Is high.
上記検出結果は、例えば癌の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。より詳細には癌の検査又は確定診断を行う場合には、上記検出結果に加えて、その他の検査結果、例えば生検、他の癌マーカーのレベルから選択される少なくとも1つと組み合わせて、総合的に判断すればよい。 The detection result can be, for example, main data or auxiliary data when performing a definitive diagnosis of cancer. More specifically, in the case of performing a cancer test or a definitive diagnosis, in addition to the above detection results, in combination with at least one selected from other test results, for example, biopsy, the level of other cancer markers, Judgment should be made.
4.癌の評価方法
本発明においては、前記3に示す検出方法により得られた検出結果を指標として癌の状態を評価することができる。検出結果が所定の基準値を超えるものをACTN4-Va陽性、所定の基準値以下のものをACTN4-Va陰性とし、陽性の場合には、癌を発症している可能性があると判断し、癌の状態を評価することができる。所定の基準値は、癌の種類によって適宜設定される。
4). Cancer Evaluation Method In the present invention, the state of cancer can be evaluated using the detection result obtained by the detection method shown in 3 above as an index. If the detection result exceeds the predetermined reference value ACTN4-Va positive, the one below the predetermined reference value ACTN4-Va negative, if positive, it is determined that there is a possibility of developing cancer, Cancer status can be assessed. The predetermined reference value is appropriately set depending on the type of cancer.
癌の状態とは、癌または腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、癌発症の有無、癌の悪性度、癌の転移の有無及び癌の再発の有無等が挙げられる。上記評価に際し、これらの癌の状態は1つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。癌の有無を評価するには、癌に罹患しているか否かを判断する。癌の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、病期(Stage)を分類して評価を行ったり、いわゆる早期癌、進行癌を分類して評価することも可能である。癌の転移は、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。再発は、間欠期又は寛解の後に再び癌が現れたか否かにより評価する。 The state of cancer means the presence or absence or progression of cancer or tumor, and includes the presence or absence of onset of cancer, the malignancy of cancer, the presence or absence of cancer metastasis, and the presence or absence of cancer recurrence. In the above evaluation, one of these cancer states may be selected, or a plurality may be selected in appropriate combination. To evaluate the presence or absence of cancer, it is determined whether or not the patient is afflicted with cancer. Cancer malignancy is an indicator of how far the cancer has progressed, and it is evaluated by classifying the stage (Stage), or by classifying so-called early cancer and advanced cancer It is also possible. Cancer metastasis is evaluated by whether or not a neoplasm has appeared at a site distant from the location of the primary lesion. Recurrence is assessed by whether the cancer reappears after an intermittent period or remission.
5.本発明の抗体を含むキット、試薬
本発明においては、ACTN4-Vaに対する抗体をACTN4-Vaの検出用試薬又はキットとして使用することができる。本発明の試薬又はキットは、上記腫瘍の検出等に使用することができる。
5. Kits and Reagents Containing the Antibody of the Present Invention In the present invention, an antibody against ACTN4-Va can be used as a reagent or kit for detecting ACTN4-Va. The reagent or kit of the present invention can be used for the detection of the tumor.
本発明の抗体(例えばモノクローナル抗体)を癌の検出又は診断薬として用いる場合には、このモノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、モノクローナル抗体を酵素標識し、使用することができる。標識酵素として、HRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。 When the antibody of the present invention (for example, a monoclonal antibody) is used as a cancer detection or diagnostic agent, the monoclonal antibody can be combined with another solvent or solute to form a composition. For example, distilled water, pH buffer reagent, salt, protein, surfactant and the like can be combined. Monoclonal antibodies can be used after enzyme labeling. As a labeling enzyme, in addition to HRP (horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, malate dehydrase, α-glucosidase, α-galactosidase, colloidal gold, and the like can be used.
本発明をキットに用いる場合には、本発明の抗体の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、抗原固相化マイクロプレート、抗体希釈溶液、OPD(オルトフェニレンジアミン)錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液、使用説明書などを含めることができる。また、反応の至適条件を与える緩衝液、反応生成物質の安定化に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などの反応媒体も本発明のキットに含まれ得る。 When using the present invention in a kit, in addition to the antibody of the present invention, the above solvent, solute, enzyme labeling reagent, antigen-immobilized microplate, antibody dilution solution, OPD (orthophenylenediamine) tablet, substrate solution, A reaction stop solution, a concentrated washing solution, instructions for use, and the like can be included. In addition, a reaction medium such as a buffer solution that gives optimum conditions for the reaction, a buffer solution that is useful for stabilizing the reaction product, and a stabilizer for the reaction material may be included in the kit of the present invention.
本発明において、ACTN4-VaのmRNAを検出するためのプローブ及びプライマーは、本発明の試薬又はキットに含めることができる。プローブ又はプライマーの設計の基礎とする領域はエキソン8’を検出し得る限り、特に限定されるものではない。 In the present invention, probes and primers for detecting ACTN4-Va mRNA can be included in the reagent or kit of the present invention. The region on which the probe or primer design is based is not particularly limited as long as exon 8 'can be detected.
シーケンスプライマーの長さは、18〜24塩基、好ましくは20〜22塩基である。シーケンスプライマーの塩基配列としては以下のものを例示することができる。
CCGTATAAGAACGTCAATGTGC(配列番号5)
CTGGCCAGCTTCTCGTAGTC(配列番号6)
The length of the sequence primer is 18 to 24 bases, preferably 20 to 22 bases. Examples of the base sequence of the sequence primer include the following.
CCGTATAAGAACGTCAATGTGC (SEQ ID NO: 5)
CTGGCCAGCTTCTCGTAGTC (SEQ ID NO: 6)
また、RT-PCRやリアルタイムPCRを行ってACTN4-VaのmRNAを増幅するためのプライマーとしては、エキソン8’を増幅する限り特に限定されるものではなく、エキソン8’の上流領域及び下流領域から15〜24塩基、好ましくは16〜22塩基の長さのヌクレオチドを設計及び合成し、これをプライマーとして使用することができる。 In addition, the primer for amplifying ACTN4-Va mRNA by RT-PCR or real-time PCR is not particularly limited as long as exon 8 ′ is amplified. From the upstream region and downstream region of exon 8 ′ A nucleotide having a length of 15 to 24 bases, preferably 16 to 22 bases can be designed and synthesized and used as a primer.
例えば、プライマーの塩基配列としては以下のものを例示することができる。
フォワード:TGGGCACTCTGAGGCCA(配列番号7)
リバース:CTTCTGAGCCCCCGAGAAA(配列番号8)
For example, the following can be illustrated as a base sequence of a primer.
Forward: TGGGCACTCTGAGGCCA (SEQ ID NO: 7)
Reverse: CTTCTGAGCCCCCGAGAAA (SEQ ID NO: 8)
また、ハイブリダイゼーションを行うプローブ(TaqMan プローブ)としては、以下のものを例示することができる。
TGAGAAGGCCATCATG(配列番号9)
ハイブリダイゼーションやPCRに使用される試薬や反応条件は、当業者に周知である。
Moreover, the following can be illustrated as a probe (TaqMan probe) which hybridizes.
TGAGAAGGCCATCATG (SEQ ID NO: 9)
Reagents and reaction conditions used for hybridization and PCR are well known to those skilled in the art.
6.医薬組成物
本発明の医薬組成物は、変異型α-アクチニン-4(ACTN4-Va)の機能を阻害する物質、好ましくは本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、腫瘍の予防、治療に有効である。
6). Pharmaceutical Composition The pharmaceutical composition of the present invention comprises a substance that inhibits the function of mutant α-actinin-4 (ACTN4-Va), preferably the antibody of the present invention as an active ingredient, It is effective for treatment.
従って、本発明は、変異型α-アクチニン-4の機能を阻害する物質を患者に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法を提供する。 Therefore, the present invention provides a method for treating a tumor, which comprises administering to a patient a substance that inhibits the function of mutant α-actinin-4.
「変異型α-アクチニン-4の機能を阻害する物質」とは、低分子化合物若しくは機能阻害性抗体であることを意味し、好ましくは本発明のACTN4-Vaに対する抗体、及びACTN4-Vaをコードする遺伝子の阻害性核酸である。 The “substance that inhibits the function of mutant α-actinin-4” means a low molecular compound or a function-inhibiting antibody, and preferably encodes an antibody against ACTN4-Va of the present invention and ACTN4-Va. It is an inhibitory nucleic acid of a gene.
ACTN4-Vaをコードする遺伝子(ACTN4-Va遺伝子ともいう)の阻害性核酸は、その遺伝子機能又は遺伝子発現を抑制する核酸を意味し、例えば、アンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA又はsiRNAなどが挙げられる。これらの阻害性核酸は、上記遺伝子の発現を抑制することが可能であり、腫瘍の遺伝子治療用医薬組成物として使用することができる。 An inhibitory nucleic acid of a gene encoding ACTN4-Va (also referred to as an ACTN4-Va gene) means a nucleic acid that suppresses its gene function or gene expression. For example, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, microRNA, shRNA or siRNA Etc. These inhibitory nucleic acids can suppress the expression of the above gene and can be used as a pharmaceutical composition for tumor gene therapy.
<アンチセンス核酸>
アンチセンス核酸は、ACTN4-Va遺伝子(標的遺伝子)のmRNA(センス)又はDNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも14ヌクレオチドであり、好ましくは14〜100ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、転写又は翻訳を抑制する。
<Antisense nucleic acid>
An antisense nucleic acid is a single-stranded nucleic acid sequence (either RNA or DNA) that can bind to the mRNA (sense) or DNA (antisense) sequence of the ACTN4-Va gene (target gene). The length of the antisense nucleic acid sequence is at least 14 nucleotides, preferably 14-100 nucleotides. Antisense nucleic acid binds to the gene sequence to form a double strand and suppresses transcription or translation.
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。アンチセンス核酸は、例えば、各種DNAトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法により、あるいはウイルスベクターを用いることにより、細胞に導入される。 Antisense nucleic acids can be produced using chemical synthesis methods or biochemical synthesis methods known in the art. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used. Antisense nucleic acids are introduced into cells by, for example, various gene transfection methods such as DNA transfection or electroporation, or by using viral vectors.
<デコイ核酸>
本発明において、デコイ核酸は、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味し、ACTN4-Va遺伝子の転写因子に結合し、プロモーター活性を抑制することができる。この核酸を細胞内に導入し、転写因子がこの核酸に結合することにより、転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、その転写因子の発現が抑制される。具体的には、デコイ核酸は、標的結合配列に結合しうる核酸又はその類似体である。本発明のデコイ核酸は、上記遺伝子のプロモーター配列をもとに、1本鎖、又はその相補鎖を含む2本鎖として設計することができる。長さは特に限定されるものではなく、15〜60塩基、好ましくは20〜30塩基である。
<Decoy nucleic acid>
In the present invention, decoy nucleic acid means a short decoy nucleic acid containing a transcription factor binding site, and can bind to a transcription factor of ACTN4-Va gene and suppress promoter activity. When this nucleic acid is introduced into cells and the transcription factor binds to this nucleic acid, the binding of the transcription factor to the original genome binding site is competitively inhibited, and as a result, the expression of the transcription factor is suppressed. . Specifically, a decoy nucleic acid is a nucleic acid that can bind to a target binding sequence or an analog thereof. The decoy nucleic acid of the present invention can be designed as a single strand or a double strand including a complementary strand based on the promoter sequence of the above gene. The length is not particularly limited, and is 15 to 60 bases, preferably 20 to 30 bases.
核酸は、DNAでもRNAでもよく、あるいは、その核酸内に修飾された核酸及び/又は擬核酸を含んでいてもよい。またこれらの核酸は1本鎖又は2本鎖であってもよく、また環状でも線状でもよい。 The nucleic acid may be DNA or RNA, or may contain a modified nucleic acid and / or pseudo-nucleic acid within the nucleic acid. These nucleic acids may be single-stranded or double-stranded, and may be circular or linear.
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術として一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、DNAリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよい。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。 The decoy nucleic acid used in the present invention can be produced using a chemical synthesis method or a biochemical synthesis method known in the art. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used. In addition, after isolating or synthesizing a base sequence serving as a template, a PCR method or a gene amplification method using a cloning vector can also be used. Furthermore, the desired nucleic acid may be produced by cleaving the nucleic acid obtained by these methods using a restriction enzyme or the like and binding using a DNA ligase. Furthermore, in order to obtain a more stable decoy nucleic acid in a cell, chemical modification such as alkylation or acylation can be added to a base or the like.
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロッティング法、FACS解析法、RT-PCR等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている(例えばpromega dual luciferase assay kit)。 For analysis of the transcriptional activity of the promoter when decoy nucleic acid is used, a commonly performed luciferase assay, gel shift assay, Western blotting method, FACS analysis method, RT-PCR, etc. can be employed. Kits for performing these assays are also commercially available (eg, promega dual luciferase assay kit).
<RNA干渉>
本発明においては、細胞においてRNA干渉(RNAi)により遺伝子発現を調節しうる合成小核酸分子、例えばsiRNA、マイクロRNA(miRNA)及びshRNA分子を使用することができる。
<RNA interference>
In the present invention, synthetic small nucleic acid molecules that can regulate gene expression by RNA interference (RNAi) in cells, such as siRNA, microRNA (miRNA), and shRNA molecules can be used.
siRNA(small interfering RNA)分子を用いる場合は、ACTN4-Va遺伝子に対応する種々のRNAを標的とすることができる。そのようなRNAとしては、mRNA、ACTN4-Va遺伝子の転写後修飾RNA等が挙げられる。本発明において標的とする遺伝子は、選択的スプライシングによって生じたスプライスバリアントであるため、siRNA分子を用いてエキソン部分(エキソン8’)の発現を阻害することができる。 When siRNA (small interfering RNA) molecules are used, various RNAs corresponding to the ACTN4-Va gene can be targeted. Such RNA includes mRNA, post-transcriptionally modified RNA of ACTN4-Va gene, and the like. Since the gene targeted in the present invention is a splice variant generated by alternative splicing, siRNA molecules can be used to inhibit the expression of the exon part (exon 8 ').
siRNA分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA(最も好ましい)、TA、GA又はCAで始まる連続する15〜30塩基、好ましくは19〜25塩基のセグメントを選択することができる。siRNA分子のGC比は、30〜70%、好ましくは35〜55%である。 siRNA molecules can be designed based on criteria well known in the art. For example, as the target segment of the target mRNA, a continuous 15-30 base, preferably 19-25 base segment, preferably starting with AA (most preferred), TA, GA or CA can be selected. The GC ratio of siRNA molecules is 30-70%, preferably 35-55%.
siRNAは、二本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンRNA分子として生成することができる。siRNA分子は、通常の化学合成により得ることができる。
本発明において使用される好ましいsiRNAの塩基配列は、例えば以下の通りである。
CCAUCAUGACUUACGUGUC (配列番号10)
UUACGUGUCCUGCUUCUAC (配列番号11)
AGAUGAGAAGGCCAUCAUG (配列番号12)
siRNAs can be generated as single stranded hairpin RNA molecules that fold on their nucleic acid to generate a double stranded portion. siRNA molecules can be obtained by conventional chemical synthesis.
Preferred base sequences of siRNA used in the present invention are as follows, for example.
CCAUCAUGACUUACGUGUC (SEQ ID NO: 10)
UUACGUGUCCUGCUUCUAC (SEQ ID NO: 11)
AGAUGAGAAGGCCAUCAUG (SEQ ID NO: 12)
本発明においては、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNA とは、ショートヘアピンRNAと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。 In the present invention, shRNA can also be used to bring about the RNAi effect. shRNA is called short hairpin RNA, and is an RNA molecule having a stem-loop structure so that a partial region of a single strand forms a complementary strand with another region.
shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Aとし、配列Aに対する相補鎖を配列Bとすると、配列A、スペーサー、配列Bの順でこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するように連結し、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計する。配列Aは、標的となる遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。 shRNA can be designed so that a part thereof forms a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is set as sequence A and the complementary strand to sequence A is set as sequence B, these sequences are linked in the order of sequence A, spacer, and sequence B so that they are present in one RNA strand. Design to be 45-60 bases in length. The sequence A is a sequence of a partial region of the target gene, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate. The length of the sequence A is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
さらに、本発明は、マイクロRNAを用いて上記遺伝子の発現を抑制することができる。マイクロRNA(miRNA)とは、細胞内に存在する長さ20〜25塩基ほどの1本鎖RNAであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているncRNA(non coding RNA)の一種である。miRNAは、RNAに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。 Furthermore, this invention can suppress the expression of the said gene using microRNA. MicroRNA (miRNA) is a single-stranded RNA with a length of about 20-25 bases that exists in cells, and is considered to have a function to regulate the expression of other genes (non-coding RNA) It is a kind of. miRNAs are produced as a nucleic acid that forms a hairpin structure that is produced by being processed when transcribed into RNA and suppresses the expression of a target sequence.
miRNAも、RNAiに基づく阻害性核酸であるため、shRNA又はsiRNAに準じて設計し合成することができる。 Since miRNA is also an inhibitory nucleic acid based on RNAi, it can be designed and synthesized according to shRNA or siRNA.
本発明において治療の対象となる疾患は癌患者であり、癌の種類は前記した通りであるが、中でも神経内分泌腫瘍、好ましくは肺原発高悪性度神経内分泌腫瘍(小細胞肺癌又は大細胞神経内分泌)である。 The disease to be treated in the present invention is a cancer patient, and the type of cancer is as described above. Among them, neuroendocrine tumors, preferably high-grade neuroendocrine tumors of primary lung (small cell lung cancer or large cell neuroendocrine) ).
本発明の抗体又はACTN4-Va遺伝子の阻害性核酸は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共に医薬組成物として投与することができ、またその投与は1回または数回に分けて行うことができる。 The antibody of the present invention or the inhibitory nucleic acid of ACTN4-Va gene can be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, etc., and can be administered once or several times. Can be divided into two.
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口又は非経口的に投与することができる。 As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners. , Flavoring agents, solubilizers or other additives. By using one or more of such carriers, pharmaceuticals in the form of tablets, pills, powders, granules, injections, solutions, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups, etc. A composition can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。 In the case of oral administration, various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate and glycine can be used together with a disintegrant, a binder and the like. Examples of the disintegrant include starch, alginic acid, and certain types of silicate double salts. Examples of the binder include polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, and gum arabic. Further, lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are very effective for tablet formation. When an aqueous suspension or elixir is used for oral administration, an emulsifier and a suspending agent may be used in combination, if necessary, and used with water, ethanol, propylene glycol, glycerin, etc., and diluents that combine them. .
非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。 Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods.
注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に5mg/ml〜500mg/mlの抗体濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、1回の投与において体表面積あたり、250mg/m2〜375mg/m2の割合で、好ましくは250mg/m2〜400mg/m2の割合で、1週間あたり1回として、数回投与することができる。 In the case of injections, for example, by dissolving or suspending in an pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection to an antibody concentration of 5 mg / ml to 500 mg / ml. Can be manufactured. Injection prepared in this way, a human patient in need of treatment, per body surface area in a single dose at a rate of 250mg / m 2 ~375mg / m 2 , preferably 250 mg / m 2 ~ It can be administered several times, once a week at a rate of 400 mg / m 2 .
但し、投与量はこの範囲に限定されるものではなく、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。 However, the dosage is not limited to this range, and may vary depending on the weight and symptoms of the patient and individual administration routes. The dose may vary depending on the sensitivity of the patient to be treated, the way the drug is prescribed, the period of administration, and the interval between doses. In some cases, a dose lower than the lower limit of the above range may be appropriate. .
投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤(例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など)、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体又は粉末組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。 Examples of the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, and the like, preferably intravenous injection. In addition, injections can be prepared as non-aqueous diluents (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, or emulsions. Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation. The injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid or powder composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvent before use.
siRNA、shRNA又はmiRNAを投与する場合は、その有効量は、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、患者に投与すべき有効量を、身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの処方を考慮して決定することができる。例えば、siRNA、shRNA又はmiRNAは、非経口投与(例えば静注)の場合約1pM〜約20pM、好ましくは5pM〜10pMの細胞内濃度である。 When siRNA, shRNA or miRNA is administered, the effective amount is not particularly limited as long as it is sufficient to cause RNAi-mediated degradation of the target mRNA. One skilled in the art can determine the effective amount to be administered to a patient in view of prescription such as height and weight, age, sex, route of administration, or local or systemic administration. For example, the siRNA, shRNA or miRNA has an intracellular concentration of about 1 pM to about 20 pM, preferably 5 pM to 10 pM, for parenteral administration (eg, intravenous injection).
以下、実施例および実験例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例および実験例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and experimental examples. However, the present invention is not limited to these examples and experimental examples.
〔実施例1〕ACTN4-Vaに特異的なモノクローナル抗体の作製
(1)抗原の作製
ACTN4-Vaは小細胞肺癌患者組織又は小細胞肺癌由来の細胞株、あるいは正常組織の精巣にしか発現しない。また、それらより免疫抗原を調製しようとしても、目的の抗原部位は新規スプライスバリアントに存在するアミノ酸配列置換に由来するアミノ酸3種類のいずれかである。よって、目的の抗体を得るための抗原として、全長配列を含む組織あるいは細胞由来の抗原たんぱく質は免疫抗原として適当でない。そこで、アミノ酸置換された配列を含む免疫抗原(配列番号4)を部分ペプチドとして化学合成した。
次に、合成されたACTN4-Va部分ペプチドを免疫抗原として用いた。
合成ペプチドとキャリア蛋白質であるKLHとをMBS法によりジスルフィド結合させ、免疫抗原を作製した。
[Example 1] Production of monoclonal antibody specific for ACTN4-Va (1) Production of antigen
ACTN4-Va is expressed only in small cell lung cancer patient tissues, cell lines derived from small cell lung cancer, or normal tissue testis. Moreover, even if an immune antigen is prepared from them, the target antigen site is any one of the three amino acids derived from the amino acid sequence substitution present in the novel splice variant. Therefore, a tissue or cell-derived antigenic protein containing a full-length sequence is not suitable as an immunizing antigen as an antigen for obtaining the target antibody. Therefore, an immune antigen (SEQ ID NO: 4) containing an amino acid-substituted sequence was chemically synthesized as a partial peptide.
Next, the synthesized ACTN4-Va partial peptide was used as an immunizing antigen.
Synthetic peptides and carrier protein KLH were disulfide bonded by MBS method to prepare immune antigens.
(2)マウスへの免疫
免疫方法の概略を図1に示す。免疫は以下の方法で行った。1.25mg/mLに調製した免疫抗原をFCAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを160μLずつマウスの背部皮下に投与し、その後2週間間隔で1.25mg/mLの免疫抗原とFIAと等量混合し、エマルジョンを形成させたものを80μLずつマウスの背部皮下に投与した。最終的に合計5回抗原を投与し、ELISAにより抗体価を確認し、抗体価の高かったものに対して、1.25mg/mLの免疫抗原40μLと生理食塩水460μLを混合したものをマウスの腹腔内に最終投与し、その3日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
(2) Immunization to mice An outline of the immunization method is shown in FIG. Immunization was performed by the following method. An equal amount of 1.25 mg / mL of immunizing antigen mixed with FCA and an emulsion formed is administered subcutaneously to the back of the mouse by 160 μL, and then 1.25 mg / mL of immunizing antigen and FIA etc. at 2-week intervals 80 μL of the mixture that was mixed and formed into an emulsion was subcutaneously administered to the back of the mouse. Finally, the antigen was administered a total of 5 times, and the antibody titer was confirmed by ELISA. In contrast to the antibody with a high antibody titer, a mixture of 40 μL of 1.25 mg / mL immune antigen and 460 μL of physiological saline was used. The spleen was removed for cell fusion 3 days later.
(3)脾臓細胞の調製と細胞融合
摘出した脾臓をすりつぶし、ACTN4-Va抗体産生細胞を含む脾臓細胞を調製したところ、1匹あたり約1×108個の脾臓細胞を調製できた。一方で、ミエローマ細胞であるP3U1を培養し、細胞融合当日に生細胞率が95%以上のP3U1を調製した。これら脾臓細胞とP3U1を5:1で混ぜ、50%濃度の分子量1,450のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、培地で洗浄し、HAT培地に懸濁したものを、96穴培養プレートの各ウェルに1×105個/ウェルとなるように細胞を播きこんだ。
(3) Preparation of spleen cells and cell fusion When the extracted spleen was ground and spleen cells containing ACTN4-Va antibody-producing cells were prepared, about 1 × 10 8 spleen cells per mouse could be prepared. On the other hand, P3U1, which is a myeloma cell, was cultured, and P3U1 having a viable cell ratio of 95% or more was prepared on the day of cell fusion. These spleen cells and P3U1 were mixed at 5: 1, and cell fusion was performed with polyethylene glycol having a molecular weight of 1,450 at a concentration of 50%. After the fusion, the cells were washed with a medium and suspended in HAT medium, and cells were seeded at 1 × 10 5 cells / well in each well of a 96-well culture plate.
(4)抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、10日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを後述の実験例1の方法で行った。1264ウェル中31ウェルでACTN4-Va陽性、ACTN4-Ub陰性であった。これらの選択したウェルの培養上清で、再度実験例2の方法でスクリーニングを行ったところ、最終的に、17ウェル分がACTN4-Va陽性であった。
(4) Screening of antibody production positive wells After cell fusion, the culture supernatant on the 10th day was collected, and antibody production positive wells were screened by the method of Experimental Example 1 described later. 31 out of 1264 wells were ACTN4-Va positive and ACTN4-Ub negative. When the culture supernatants of these selected wells were screened again by the method of Experimental Example 2, 17 wells were finally positive for ACTN4-Va.
(5)クローニング
ACTN4-Vaに対する特異性の高かった17ウェル分を限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を10%のFCSを含むRPMI培地で5個/mLに調製し、96穴培養プレート2枚分の各ウェルに200μLずつ添加した。10日後、後述の実験例1および2の方法で培養上清中のACTN4-Vaに対する抗体価および特異性を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを5クローン得た。それぞれの樹立クローンを「13G9」、「11H2」、「9B3」、「15H2」、「10E10」とした。
(5) Cloning
Seventeen wells with high specificity for ACTN4-Va were cloned by limiting dilution. That is, cells were prepared at 5 cells / mL in RPMI medium containing 10% FCS, and 200 μL was added to each well of two 96-well culture plates. Ten days later, the antibody titer and specificity for ACTN4-Va in the culture supernatant were measured by the method of Experimental Examples 1 and 2 described below, and confirmed to be positive, and 5 clones derived from each well were obtained. It was. The respective established clones were designated as “13G9”, “11H2”, “9B3”, “15H2”, and “10E10”.
<実験例1>
抗体のスクリーニング法
96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、固相化抗原としてPBS(pH7.0)で1μg/mLに調製したACTN4-Vaペプチドを50μLずつ添加し、25℃で1時間放置した。また、同時に特異性確認のためACTN4-UbペプチドDIVNTARPDEKAIMTYVSS(配列番号3)を同様に50μLずつ添加し、25℃で1時間放置した。次に、0.05% Tween20を含むPBS(pH7.0)(PBST)で3回洗浄後、0.5%ゼラチンを含むPBST(ブロッキング液)を各ウェルに200μLずつ添加し、25℃で1時間静置した。洗浄後、培養上清を原液のまま各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で1時間静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに2500倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(KPL社)を50μLずつ添加し、25℃で1時間静置した。次に、PBSTで3回洗浄後、各ウェルに0.02%の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸リン酸緩衝液(pH5.0)で0.5mg/mLに調製したo-フェニレンジアミン溶液100μLを添加し、25℃で10分間静置した後に、1M硫酸溶液100μLを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後490nmの吸光度をELISAリーダーによって測定した。
<Experimental example 1>
Antibody screening methods
50 μL of ACTN4-Va peptide prepared at 1 μg / mL with PBS (pH 7.0) as a solid phase antigen was added to each well of a 96-well microtiter plate and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. At the same time, 50 μL of ACTN4-Ub peptide DIVNTARPDEKAIMTYVSS (SEQ ID NO: 3) was added in the same manner for specificity confirmation, and left at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBS (pH 7.0) (PBST) containing 0.05% Tween20, 200 μL of PBST (blocking solution) containing 0.5% gelatin was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. . After washing, 50 μL of the culture supernatant was added to each well as the stock solution and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBST, 50 μL each of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (KPL) diluted 2500-fold was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBST, 100 μL of o-phenylenediamine solution prepared to 0.5 mg / mL with 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) containing 0.02% hydrogen peroxide is added to each well. After standing at 25 ° C. for 10 minutes, 100 μL of 1M sulfuric acid solution was added to each well to stop the color reaction. The absorbance at 490 nm was then measured with an ELISA reader.
<実験例2>
ウェスタンブロッティングによるスクリーニング法および特異性確認法
以下の方法で、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGEという)を行った後、セミドライブロッティングによる、ウェスタンブロッティング(WBという)を行い、特異性確認試験を行った。
<Experimental example 2>
Screening method and specificity confirmation method by Western blotting After performing SDS-polyacrylamide electrophoresis (referred to as SDS-PAGE) by the following method, Western blotting (referred to as WB) by semi-dry blotting is performed, and a specificity confirmation test is performed. went.
特異性評価用のサンプルは癌細胞株由来の抽出液を用いる場合は、ACTN4-Vaが特異的に発現しているヒト小細胞肺癌由来癌細胞株H69および非発現株のヒト膵臓腺癌由来細胞株BxPC-3、ヒト乳癌由来細胞株MCF7の計3種類の細胞抽出液を用いた。発現細胞由来の抽出液を用いる場合はACTN4-Vaを遺伝子導入したHEK293 GFP-ACTN4-VaおよびACTN4-Ub を遺伝子導入したHEK293 GFP-ACTN4-Ubの2種類と、HEK293 およびHEK293 GFPの計4種類を用いた。 When using a sample derived from a cancer cell line as a sample for specificity evaluation, human small cell lung cancer-derived cancer cell line H69 that specifically expresses ACTN4-Va and human pancreatic adenocarcinoma-derived cells that do not express it A total of three cell extracts were used: strain BxPC-3 and human breast cancer-derived cell line MCF7. When using extracts derived from expression cells, HEK293 GFP-ACTN4-Va with ACTN4-Va gene introduced and HEK293 GFP-ACTN4-Ub with ACTN4-Ub gene, HEK293 and HEK293 GFP, 4 types in total Was used.
また、培養上清でのスクリーニングの際は、H69抽出液のみを用いて評価を行い、精製抗体での確認試験には癌細胞由来あるいは発現細胞由来の抽出液を用いて評価した。 Further, when screening with the culture supernatant, the evaluation was performed using only the H69 extract, and the confirmation test using the purified antibody was performed using an extract derived from cancer cells or expression cells.
調製にはそれぞれ、1×107cell以上の細胞を用意し、T-PER抽出液(Thermo社)に100倍希釈でプロテインインヒビター(ナカライテスク社)を加えた抽出液500ul以下で混和し、取扱説明書に従って抽出を行いサンプルとした。また、各サンプルはBCA法(Thermo社)により濃度を測定した。 For each preparation, prepare cells of 1 x 10 7 cells or more, mix with T-PER extract (Thermo) at a dilution of 100-fold and add protein inhibitor (Nacalai Tesque) in 500ul or less. Extraction was performed in accordance with the instructions to obtain a sample. The concentration of each sample was measured by the BCA method (Thermo).
SDS-PAGEは10%単一濃度のポリアクリルアミドゲル(ATTO社)を使用し、1×SDS-PAGE用Running Bufferを用いて電気泳動を行った。また、サンプルは9.3% DTT(dithiothreitol)を含む6×Sample Bufferで希釈し、95℃、5分の熱反応処理を行った後、10ug/laneで電気泳動に供した。その際の泳動条件は20mA、定電流であり、泳動はゲルの下端まで可視化用に添加された、サンプル中のブロモフェノールブルーのラインが移動した時点で終了した。 SDS-PAGE was performed using a 10% single concentration polyacrylamide gel (ATTO) and electrophoresis using 1 × SDS-PAGE Running Buffer. Further, the sample was diluted with 6 × Sample Buffer containing 9.3% DTT (dithiothreitol), subjected to thermal reaction treatment at 95 ° C. for 5 minutes, and then subjected to electrophoresis at 10 ug / lane. The electrophoresis conditions at that time were 20 mA and a constant current, and the migration was completed when the bromophenol blue line in the sample, which was added for visualization to the bottom of the gel, moved.
次にWBを行った。前処理として、泳動が終了するまでに9×8.5cmのPVDFメンブレン(メンブレンという)(ミリポア社)をメタノールで1分処理した後、20%メタノールを含むBlotting bufferへ再度浸透させた。同様にメンブレンと同サイズにカットしたろ紙6枚をBlotting bufferへ浸透させた。 Next, WB was performed. As a pretreatment, a 9 × 8.5 cm PVDF membrane (referred to as a membrane) (Millipore) was treated with methanol for 1 minute before the electrophoresis was completed, and then permeated again into a blotting buffer containing 20% methanol. Similarly, 6 filter papers cut to the same size as the membrane were permeated into the blotting buffer.
次にメンブレンへのブロッティングを行った。セミドライブロッティングシステム(GE社:旧Amersham社)にろ紙3枚、PVDFメンブレン、サンプルの泳動が終了したSDS-PAGEゲル、ろ紙3枚の順に重ね、1cm2/2mAでメンブレンに終圧15V〜30Vがかかるように定電流で50分泳動した。 Next, blotting to the membrane was performed. Semi-dry blotting system: three filter paper (GE company formerly Amersham Corporation), PVDF membrane, SDS-PAGE gel sample of the migration has been completed, one on top of the three filter paper, is Tsui圧15V~30V to the membrane in a 1cm 2 / 2mA Thus, electrophoresis was performed at a constant current for 50 minutes.
次にBlokingを行った。サンプルがH69の場合は1laneごとに、BxPC-3、MCF7を含む3種類の場合は3種類を1組としてメンブレンを切断した後、ミリQ水で3倍希釈したN101Blocking buffer(日油社)を用いて25℃で1時間の振とう反応を行った。 Next we performed a Bloking. When the sample is H69, cut the membrane for every 1 lane, and for 3 types including BxPC-3 and MCF7, set 3 types as a set, and then use N101 Blocking buffer (NOF Corporation) diluted 3-fold with milli-Q water. The mixture was shaken at 25 ° C. for 1 hour.
次に、1次反応を行った。培養上清を用いるスクリーニングの場合は、培養上清をPBSTで10倍希釈したブロッキング液(抗体希釈液という)を用いて3倍に希釈してメンブレンと反応させた。精製抗体を用いて特異性を確認する場合は、同様に抗体希釈液を用いて1μg/mlに調製し、メンブレンと反応させた。それぞれ25℃で1時間の振とう反応を行った。 Next, a primary reaction was performed. In the case of screening using the culture supernatant, the culture supernatant was diluted 3 times with a blocking solution (referred to as antibody dilution solution) diluted 10-fold with PBST and allowed to react with the membrane. In the case of confirming the specificity using the purified antibody, the antibody dilution was similarly prepared to 1 μg / ml and reacted with the membrane. Each was shaken at 25 ° C. for 1 hour.
次に2次反応を行った。PBSTでメンブレンを3回洗浄後、抗体希釈液を用いて20000倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(KPL社)を調製し、25℃で1時間の振とうによりメンブレンと反応させた。 Next, a secondary reaction was performed. After washing the membrane 3 times with PBST, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (KPL) diluted 20,000 times with an antibody diluent was prepared and reacted with the membrane by shaking at 25 ° C. for 1 hour.
次に発色反応を行った。PBSTでメンブレンを3回洗浄後、ケミルミワン(ナカライ社)を用いて発色反応を行った。方法は取扱説明書に従った。発色反応の後、LAS-3000を(GE社)を用いて、Chemiluminescence(化学発光)を検出した。 Next, a color reaction was performed. After the membrane was washed 3 times with PBST, a color reaction was performed using Chemil Miwan (Nacalai). The method followed the instruction manual. After the color reaction, Chemiluminescence was detected using LAS-3000 (GE).
(6)抗体の精製
上記(5)で樹立した5つのクローンから目的のモノクローナル抗体を以下の方法で精製した。まず、樹立クローンを市販の無血清培地(Hybridoma SFM:Invitrogen社)に懸濁し、4×105個/mLになるように調製した。T225フラスコにその細胞懸濁液を50mL入れ、37℃、5.0% CO2環境下で約1週間培養した。培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清をプロテインGカラムにアプライし、グリシンバッファー(pH3.0)で溶出し、モノクローナル抗体を精製した。
(6) Purification of antibody The target monoclonal antibody was purified from the 5 clones established in (5) above by the following method. First, established clones were suspended in a commercially available serum-free medium (Hybridoma SFM: Invitrogen) and prepared to 4 × 10 5 cells / mL. 50 mL of the cell suspension was placed in a T225 flask and cultured in a 37 ° C., 5.0% CO 2 environment for about one week. After culturing, the culture supernatant was collected. The collected culture supernatant was applied to a protein G column and eluted with glycine buffer (pH 3.0) to purify the monoclonal antibody.
その後、精製抗体を用いて、再度実験例1および2の方法でACTN4-Vaに対する特異性確認試験を行った。 Thereafter, using the purified antibody, the specificity confirmation test for ACTN4-Va was performed again by the methods of Experimental Examples 1 and 2.
その結果、5クローンで培養上清の場合と同様な結果が得られた(図2、図3および図4)。 As a result, the same results as in the case of the culture supernatant in 5 clones were obtained (FIGS. 2, 3 and 4).
(7)樹立クローンの免疫組織染色による診断適応試験
上記の5クローンに関して、生体組織中のACTN4-Vaを認識する抗体の免疫組織染色による診断適応試験を下記実験例3の方法で行った。診断には肺原発HGNTおよびAd、Sqの切除病理検体(n=557)を用いた。その結果、癌組織における免疫染色がACTN4-Vaに対する特異的モノクローナル抗体「15H2」を用いて可能であった(図5)。
(7) Diagnosis adaptation test by immunohistochemical staining of established clones With respect to the above 5 clones, a diagnostic adaptation test by immunohistochemical staining of an antibody recognizing ACTN4-Va in living tissue was performed by the method of Experimental Example 3 below. Diagnosis was performed using pulmonary primary HGNT, Ad, and Sq excised pathological specimens (n = 557). As a result, immunostaining in cancer tissues was possible using the specific monoclonal antibody “15H2” against ACTN4-Va (FIG. 5).
また、ACTN4-Va陽性率は実験例3の評価法を基に診断を行った。その結果、LCNECで47.5%(58/122)、SCLCで60.0%(42/70)となり擬陽性率はAd (0/158), Sq(0/158)ともに0%であった。肺原発低悪性度神経内分泌腫瘍であるカルチノイド(carcinoid)の陽性率は9.8%(5/51)となり高悪性度神経内分泌腫瘍に比べて陽性率が低かった(表1)。
The ACTN4-Va positive rate was diagnosed based on the evaluation method of Experimental Example 3. As a result, LCNEC was 47.5% (58/122) and SCLC was 60.0% (42/70). The false positive rate was 0% for both Ad (0/158) and Sq (0/158). The positive rate of carcinoid, a low-grade neuroendocrine tumor of the lung, was 9.8% (5/51), which was lower than that of high-grade neuroendocrine tumors (Table 1).
表1は、クローン「15H2」由来のモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による各癌の陽性率診断結果を示す表である。 Table 1 is a table showing the positive rate diagnosis result of each cancer by immunohistochemical staining using a monoclonal antibody derived from clone “15H2”.
<実験例3>
免疫組織染色による診断適応試験
以下の方法で免疫染色を行い、診断適応を確認した。
サンプルには、国立がん研究センター中央病院で切除されホルマリン固定パラフィンブロックとして保存されていた症例から作製された組織マイクロアレイ(tissue microarray, TMAという)を使用した。
<Experimental example 3>
Diagnosis indication test by immunohistological staining Immunostaining was performed by the following method to confirm the indication of diagnosis.
The sample used was a tissue microarray (Tissue microarray, TMA) prepared from a case excised at the National Cancer Center Central Hospital and stored as a formalin-fixed paraffin block.
TMAの切片厚は4μmで作製した。ベンタナディスカバリー(ロッシュ社)を用いて自動免疫染色をした。TMAはベンタナディスカバリー内のプログラムに従い脱パラフィンを行った後、熱処理にて抗原賦活をし、その後に内因性のペルオキシダーゼ活性阻害を行った。 The TMA slice thickness was 4 μm. Automatic immunostaining was performed using Ventana Discovery (Roche). TMA was deparaffinized according to the program in Ventana Discovery, then antigen-activated by heat treatment, and then endogenous peroxidase activity was inhibited.
次いて2%の豚血清(ベクター社)でブロッキングを行った。
1次反応は抗ACTN4-Va抗体を5 μg/mlに調製し37℃、60分でハイブリダイゼーションを行った。
Next, blocking was performed with 2% porcine serum (Vector).
In the primary reaction, anti-ACTN4-Va antibody was prepared at 5 μg / ml and hybridization was performed at 37 ° C. for 60 minutes.
2次抗体としてビオチン化抗マウスIgG(ベクター社)を100倍に調製し37度30分でハイブリダイゼーションをおこなった。
発色はTMAをベンタナディスカバリーDABキットプロトコールに従い染色した。
Biotinylated anti-mouse IgG (Vector) was prepared 100 times as a secondary antibody and hybridized at 37 ° C for 30 minutes.
For color development, TMA was stained according to the Ventana Discovery DAB kit protocol.
その後免疫組織化学染色の評価は、二人の観察者が別々に評価し、細胞膜全周性に強発現する症例を(3+)、細胞質内に顆粒状に強発現する症例を(2+)、細胞質に弱く染色性を有する症例を(1+)、全く染色されないものを(0)と定義し、このうち(3+)と(2+)の症例を陽性、(1+)と(0)の症例を陰性とそれぞれ定義した。 Subsequently, immunohistochemical staining was evaluated separately by two observers. Cases that were strongly expressed in the periplasm of the cell membrane (3+) and those that were strongly expressed in the cytoplasm (2+) (1+) and (0+) are defined as (0+), and (3+) and (2+) cases are positive, (1+) and (0). ) Cases were defined as negative.
(8)免疫組織診断結果を用いた全生存率解析
(7)の結果を用いてHGNTとそのサブクラス解析としてSCLCとLCNECのそれぞれ腫瘍で、ACTN4-Vaの発現と予後の関連について、カプランマイヤー法とCox比例ハザード法を用いて検討した。全生存期間をカプランマイヤー法で解析したところHGNT、SCLC、LCNECともにACTN4-Va陽性患者が陰性患者に比べて、陽性患者の生存期間が有意に短かった(図6)。Cox比例ハザード法を用いて死亡に関する危険率を評価したところ、HGNT、SCLC、LCNECのそれぞれでACTN4-Vaの発現は予後を予測する独立因子になり得ることが示された(表2)
(8) Overall survival analysis using immunohistochemical results As a subclass analysis of HGNT and its subclass analysis using the results of (7), regarding the relationship between ACTN4-Va expression and prognosis, Kaplan-Meier method And examined using Cox proportional hazards method. When the overall survival was analyzed by Kaplan-Meier method, the survival of positive patients was significantly shorter in ACTN4-Va positive patients than in negative patients for HGNT, SCLC, and LCNEC (Fig. 6). The Cox proportional hazards assessment of mortality risk showed that ACTN4-Va expression could be an independent factor predicting prognosis in each of HGNT, SCLC, and LCNEC (Table 2).
表2は、Cox比例ハザード法を用いてACTN4-Vaの発現におけるHGNT、SCLC、LCNEC患者の死亡に関する危険率を評価した結果を示す表である。表2において、ACTN4-Vaのタンパク質発現が多変量解析で有意性を持つことから、HGNT、SCLC、LCNECに対する独立した予後因子であると言える。 Table 2 is a table showing the results of evaluating the risk factors for death of HGNT, SCLC, and LCNEC patients in the expression of ACTN4-Va using the Cox proportional hazards method. In Table 2, since the protein expression of ACTN4-Va has significance in multivariate analysis, it can be said that it is an independent prognostic factor for HGNT, SCLC, and LCNEC.
〔実施例2〕siRNAによるACTN4-Vaの発現阻害
(1)siRNAの作製
本発明において使用される好ましいsiRNA(配列番号10、11、12)を化学合成により生成した。陰性対照には、Silencer(登録商標) Negative Control #1 siRNAおよびSilencer(登録商標) Negative Control #2 siRNA (Ambion社)を用いた。
[Example 2] Inhibition of ACTN4-Va expression by siRNA (1) Preparation of siRNA Preferred siRNAs (SEQ ID NOs: 10, 11, and 12) used in the present invention were generated by chemical synthesis. Silencer (registered trademark) Negative Control # 1 siRNA and Silencer (registered trademark) Negative Control # 2 siRNA (Ambion) were used as negative controls.
(2)細胞への導入
ACTN4-Vaを発現するヒト肺小細胞癌細胞株SBC-3に対して、遺伝子導入用カチオン性脂質を用いたsiRNAの導入を行った。
(2) Introduction into cells
SiRNA using a cationic lipid for gene transfer was introduced into human small cell lung cancer cell line SBC-3 expressing ACTN4-Va.
SBC-3は、6穴培養プレートの1ウェルに対して3x105個/2mlで播き、24時間CO2インキュベーターで培養した。 SBC-3 was seeded at 3 × 10 5 cells / 2 ml per well of a 6-well culture plate and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
siRNAの導入に用いる複合体は、2種類の混合液を反応させることで調製した。第1の混合液は、10μMの各siRNA 1μl (10pmol)とOpti-MEM I (Invitrogen社) 250μlを混合して作製した。第2の混合液は、Lipofectamine2000 (Invitrogen社) 5μlとOpti-MEM I 250μlを混合して作製した。これら2種類の混合液を室温で20分間静置した。また、陰性対照の混合液作製では、10μMの陰性対照siRNA 0.5μl (20pmol)を用いた。 A complex used for introduction of siRNA was prepared by reacting two kinds of mixed solutions. The first mixed solution was prepared by mixing 1 μl (10 pmol) of each 10 μM siRNA and 250 μl of Opti-MEM I (Invitrogen). The second mixed solution was prepared by mixing 5 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 250 μl of Opti-MEM I. These two kinds of mixed solutions were allowed to stand at room temperature for 20 minutes. In preparation of the negative control mixture, 0.5 μl (20 pmol) of 10 μM negative control siRNA was used.
次に、複合体 500μlをSBC-3培養ウェルへ添加し、37℃で72時間CO2インキュベーターで培養した。 Next, 500 μl of the complex was added to the SBC-3 culture well and cultured at 37 ° C. for 72 hours in a CO 2 incubator.
(3)ウェスタンブロッティング
導入反応後のSBC-3の抽出液を用いてウェスタンブロッティングを行い、精製抗体15H2によるACTN4-Vaの検出を行った。
(3) Western blotting Western blotting was performed using the SBC-3 extract after the introduction reaction, and ACTN4-Va was detected with the purified antibody 15H2.
(4)結果
結果を図7に示す。図7において、各レーンは以下のsiRNA又は対照を使用したときのバンドを表す。
lane 1: CCAUCAUGACUUACGUGUC (配列番号10)
lane 2: UUACGUGUCCUGCUUCUAC(配列番号11)
lane 3: AGAUGAGAAGGCCAUCAUG(配列番号12)
lane 4: 陰性対照 (Silencer(R) Negative Control #1 siRNA)
lane 5: 陰性対照 (Silencer(R) Negative Control #2 siRNA)
(4) Results The results are shown in FIG. In FIG. 7, each lane represents a band when the following siRNA or control is used.
lane 1: CCAUCAUGACUUACGUGUC (SEQ ID NO: 10)
lane 2: UUACGUGUCCUGCUUCUAC (SEQ ID NO: 11)
lane 3: AGAUGAGAAGGCCAUCAUG (SEQ ID NO: 12)
lane 4: Negative control (Silencer (R) Negative Control # 1 siRNA)
lane 5: Negative control (Silencer (R) Negative Control # 2 siRNA)
レーン1〜3ではACTN4-Vaのバンドが消失していることから、本発明のsiRNAを用いることによりACTN4-Vaの発現を抑制できることが示された。従って、本発明のsiRNAは腫瘍、特に神経内分泌腫瘍の治療に有用である。 In Lanes 1 to 3, since the ACTN4-Va band disappeared, it was shown that the expression of ACTN4-Va can be suppressed by using the siRNA of the present invention. Therefore, the siRNA of the present invention is useful for the treatment of tumors, particularly neuroendocrine tumors.
本発明の抗体は、組織、細胞、および血液等の検体中のACTN4-Vaを高感度かつ特異的に検出でき、腫瘍、好ましくは癌の検出及び診断に、また抗腫瘍用医薬組成物として有用である。 The antibody of the present invention can detect ACTN4-Va in samples such as tissues, cells, and blood with high sensitivity and specificity, and is useful for detection and diagnosis of tumors, preferably cancer, and as an antitumor pharmaceutical composition. It is.
配列番号5:合成DNA
配列番号6:合成DNA
配列番号7:合成DNA
配列番号8:合成DNA
配列番号9:合成DNA
配列番号10:合成RNA
配列番号11:合成RNA
配列番号12:合成RNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 6: Synthetic DNA
Sequence number 7: Synthetic DNA
Sequence number 8: Synthetic DNA
Sequence number 9: Synthetic DNA
Sequence number 10: Synthetic RNA
Sequence number 11: Synthetic RNA
Sequence number 12: Synthetic RNA
Claims (11)
α-アクチニン-4のアミノ酸配列のうち、第248番目のアスパラギンがグリシンに、第250番目のアラニンがロイシン、及び第263番目のセリンがシステインにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する変異型α-アクチニン-4の、前記置換されたアミノ酸残基の全部又は一部を認識し、
受託番号がNITE BP-1140であるハイブリドーマにより産生される、前記抗体。 A monoclonal antibody against a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by DIVGTLRPDEKAIMTYVSC (SEQ ID NO: 4),
Among the amino acid sequences of α-actinin-4, a mutant α-actinin having an amino acid sequence in which the 248th asparagine is replaced by glycine, the 250th alanine is replaced by leucine, and the 263rd serine is replaced by cysteine -4, recognizing all or part of the substituted amino acid residues,
The antibody produced by a hybridoma whose accession number is NITE BP-1140.
受託番号がNITE BP-1140であるハイブリドーマから抗体を採取する工程
を含む、前記方法。 A method for producing a monoclonal antibody against mutant α-actinin-4 , comprising:
Comprising the step of entrusted number is collected hybridomas or et antibody is NITE BP-1140, said methods.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016109825A JP6462632B2 (en) | 2016-06-01 | 2016-06-01 | Antibody to mutant α-actinin-4 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016109825A JP6462632B2 (en) | 2016-06-01 | 2016-06-01 | Antibody to mutant α-actinin-4 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013532385A Division JPWO2013035208A1 (en) | 2011-09-09 | 2011-09-09 | Antibody to mutant α-actinin-4 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016199554A JP2016199554A (en) | 2016-12-01 |
JP6462632B2 true JP6462632B2 (en) | 2019-01-30 |
Family
ID=57423894
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016109825A Active JP6462632B2 (en) | 2016-06-01 | 2016-06-01 | Antibody to mutant α-actinin-4 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6462632B2 (en) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004040969A1 (en) * | 2002-11-07 | 2004-05-21 | Kumamoto Technology & Industry Foundation | Transgenic mammal carrying ganp and utilization thereof |
US7521195B1 (en) * | 2005-07-21 | 2009-04-21 | Celera Corporation | Lung disease targets and uses thereof |
JP5028020B2 (en) * | 2005-09-30 | 2012-09-19 | 株式会社トランスジェニック | Highly specific monoclonal antibody against N1, N8-diacetylspermidine |
JP5716257B2 (en) * | 2009-02-06 | 2015-05-13 | 国立大学法人 熊本大学 | Monoclonal antibody recognizing cholangiocarcinoma specific carbohydrate epitope |
CN103958679A (en) * | 2011-09-09 | 2014-07-30 | 转基因股份有限公司 | Antibody against mutant alpha-actinin-4 |
-
2016
- 2016-06-01 JP JP2016109825A patent/JP6462632B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016199554A (en) | 2016-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8153122B2 (en) | Pharmaceutical composition for treating cholangiocarcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of cholangiocarcinoma and a method for treating cholangiocarcinoma | |
US20210253718A1 (en) | Frizzled5 protein-binding agents | |
WO2008007648A1 (en) | Method of classifying antigen, method of identifying antigen, method of obtaining antibody or antibody set, method of constructing antibody panel and antibody or antibody set and use of the same | |
AU2003253046A1 (en) | TFC/beta-catenin regulated genes for treating cancer | |
JP2017516463A (en) | FGFR fusion | |
JP6667967B2 (en) | Novel biomarkers for predicting susceptibility to MET inhibitors and uses thereof | |
TW200813231A (en) | Methods of treating, diagnosing or detecting cancer | |
US20230391886A1 (en) | Compositions and methods for muc18 targeting | |
JP2011521619A (en) | Novel antibodies against cancer targets that interfere with tumor growth, angiogenesis and metastasis | |
JP2020537490A (en) | Monoclonal antibody anti-FGFR4 | |
US20160075752A1 (en) | B-type plexin antagonists and uses thereof | |
JP6462632B2 (en) | Antibody to mutant α-actinin-4 | |
WO2013035208A1 (en) | ANTIBODY AGAINST MUTANT α-ACTININ-4 | |
KR20230156936A (en) | How to Treat Disease Using Gremlin1 Antagonists | |
TWI782000B (en) | Anti gpr20 antibodies, preparation method and application thereof | |
WO2019146759A1 (en) | Therapeutic agent targeted to receptor protein, test agent, antibody that binds to receptor protein, and screening method for molecularly targeted drugs | |
JP6057408B2 (en) | Cancer preventive and / or therapeutic agent | |
WO2021030450A1 (en) | Novel lox-1 antibody compositions, lox1 neutralization assay and methods of treatment using same | |
JP4705469B2 (en) | Anti-BAMBI antibody and diagnostic or therapeutic agent for colorectal cancer and liver cancer containing the same | |
JPWO2013035208A1 (en) | Antibody to mutant α-actinin-4 | |
EP3212804B1 (en) | Improved treatments of cancer resistant to taxoids | |
WO2017082254A1 (en) | Anti-phosphorylated-bach2 antibody and method for screening antitumor immunoactivators | |
US20200355686A1 (en) | Monoclonal antibody for predicting tamoxifen response in breast cancer patients | |
Atukorala | Investigating the Roles of CDH17 and FAT1 in Colorectal Cancer Progression | |
US20130212721A1 (en) | Reagent for tumor testing and pharmaceutical composition for tumor prevention |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170404 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170602 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170731 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180403 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180413 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20180521 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180710 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180903 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181016 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181203 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181218 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6462632 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |