JP6429143B2 - Plant growth enhancer and plant cultivation method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、宿主植物のクロロフィル量増加作用を有する水生植物根圏微生物を含む植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法に関する。 The present invention relates to a plant growth enhancer containing an aquatic plant rhizosphere microorganism having an action of increasing the amount of chlorophyll of a host plant, and a plant cultivation method using the same.
世界の食糧需要は、新興国の経済成長に伴う生活水準の向上や中長期的な人口増加により今後も上昇傾向が予測されている。一方、世界的な食糧難に対応するための耕作地の拡大は、大規模な環境破壊を伴うため、大気中の二酸化炭素量の削減を阻害し、温室ガス効果による地球温暖化を進行させる結果となっている。また、地球温暖化に起因する昨今の世界的な異常気象は、農業に深刻な損害を与えており、耕作地の拡大による食糧難の解決策が食糧難の到来を助長するというジレンマに陥っている。 Global food demand is expected to continue rising due to the improvement of living standards accompanying the economic growth of emerging countries and the mid- to long-term population growth. On the other hand, the expansion of cultivated land to cope with global food shortages is accompanied by a large-scale environmental destruction, which hinders the reduction of carbon dioxide in the atmosphere and promotes global warming due to the greenhouse gas effect. It has become. In addition, the recent global abnormal weather caused by global warming has caused serious damage to agriculture, and it has fallen into a dilemma that the solution to food difficulties by expanding cultivated land promotes the arrival of food difficulties.
上記問題の解決策として、近年植物工場が注目されている。「植物工場」とは、光、湿度、温度等の気象条件や培地の供給等が管理された人工環境下で植物を栽培する農作物生産工場である。植物工場は、工場化及び機械化による作業の省力化が可能であり、栽培時期や生産量を自由に制御できることから需要量に応じた生産量の調節ができる。それ故、広い貯蔵スペースや多大な貯蔵管理費を必要としない。また、工場形式であることから生産者は日本の農地法のような法的規制を受けることがなく、従来の二次元的な圃場栽培と異なり、都市部でもビル屋内等で三次元的に実施することが可能であるため、耕作地の拡大による環境破壊を伴うことがない。さらに、植物工場は、農耕作に不適な乾燥地や寒冷地などでも設置可能であり、天候の影響を受けないため年間を通じて農作物を安定供給することができる。また、植物の成育に必要な養分を人工的に調製した培地で栽培することから根部の環境を制御し易く、連作による障害もない。その上、害虫を完全に排除できるため無農薬栽培が可能であり、残留農薬の心配がない安全で新鮮な農作物を提供することができる(特許文献1、特許文献2、非特許文献1)。
In recent years, plant factories have attracted attention as a solution to the above problems. A “plant factory” is a crop production factory that grows plants in an artificial environment in which weather conditions such as light, humidity, and temperature, and supply of culture medium are controlled. The plant factory can be labor-saving by factory and mechanization, and can adjust the production amount according to the demand amount because it can freely control the cultivation time and the production amount. Therefore, a large storage space and a large storage management cost are not required. In addition, because it is a factory format, producers are not subject to legal regulations like Japanese agricultural land laws, and unlike conventional two-dimensional field cultivation, they are implemented three-dimensionally in urban areas such as in buildings. Therefore, there is no environmental damage caused by expansion of cultivated land. In addition, plant factories can be installed in dry and cold areas that are not suitable for farming, and are not affected by the weather, so they can stably supply crops throughout the year. In addition, since the nutrients necessary for plant growth are cultivated in an artificially prepared medium, the root environment is easily controlled, and there are no obstacles due to continuous cropping. In addition, since pests can be completely eliminated, pesticide-free cultivation is possible, and a safe and fresh crop without worrying about residual pesticides can be provided (
上記のように多くの利点を有する植物工場ではあるが、解決すべき課題も多い。最大の課題は、生産コストである。植物工場では、人工環境下で植物を栽培しなければならず、光照射や空調等の管理が重要となる。例えば、光照射は、工場内に設置された光源から光合成に必要な光を長時間にわたって植物に連続照射する必要があり、また光源等から発生する熱による過度な温度上昇を空調によって抑え、かつ適切な温度に調節しなければならない。それ故、植物工場では膨大な電力を消費する。特に外界から隔絶された閉鎖空間内で行われる完全制御型の植物工場ではその傾向が著しい。また、植物を正常、かつ効率的に生育させるためには、人工培地に必要十分量の肥料を施肥する必要があり、雑菌の繁殖防止のためには培地を定期的に交換しなければならず、多大な肥料費を要する。それ故、必然的に生産コストが高くなり、栽培作物を安価で提供できないという問題があった。 Although the plant factory has many advantages as described above, there are many problems to be solved. The biggest issue is the production cost. In a plant factory, plants must be cultivated in an artificial environment, and management such as light irradiation and air conditioning becomes important. For example, for light irradiation, it is necessary to continuously irradiate the plant with light necessary for photosynthesis from a light source installed in the factory for a long time, and an excessive temperature rise due to heat generated from the light source is suppressed by air conditioning, and It must be adjusted to an appropriate temperature. Therefore, the plant factory consumes a huge amount of power. This is especially true in fully controlled plant factories that are carried out in closed spaces isolated from the outside world. In addition, in order for plants to grow normally and efficiently, it is necessary to fertilize the artificial medium with a necessary and sufficient amount of fertilizer, and the medium must be periodically replaced to prevent the propagation of various bacteria. , It costs a lot of fertilizer. Therefore, there is a problem that production costs are inevitably high, and cultivated crops cannot be provided at low cost.
本発明は、植物工場における生産コストを低減する技術を開発し、それを提供する。 The present invention develops and provides technology for reducing production costs in plant factories.
植物では、周囲の環境に化学的又は物理的に影響を与える「根圏」と呼ばれる根を中心とした領域において、微生物と共生関係にある例が数多く知られている(Urbance J.W., et al., 2003, Nucleic Acids Res.31: 152-155)。例えば、マメ科(Fabaceae)植物と根粒菌の関係は、その代表的な例である(Tao C.,et al., 2009, Mol. Microbiol. 73(3): 507−517)。マメ科植物は、根粒菌に対して根粒という生息場所の提供と根から直接的な養分の供給を行う一方、根粒菌は、大気中の窒素を固定して植物が利用できる形に変換することで双方が利益を得ている。この他にも植物の根圏には多数の微生物が生息している。例えば、アオウキクサ(Lemna aoukikusa)の根圏に生息し、水中の有機汚染物質を分解する微生物(Yamaga F. et al., 2010, Environ. Sci. Technol. 44, 6470-6474)や、コウキクサの成長を促進する微生物等が単離されている(Underwood G.J.C. and Baker J.H., 1991, J. Appl. Bacteriol.)。このような植物の根圏に生息する微生物を一般に「根圏微生物」と総称する。根圏微生物の多くは、前述の根粒菌等のように、宿主植物の根から養分を得る一方で宿主植物に対して有用な活性や性質を付与する等、宿主植物と相利共生関係にある。 In plants, there are many known examples of symbiotic relationships with microorganisms in an area centered on the root called the “rhizosphere” that chemically or physically affects the surrounding environment (Urbance JW, et al. , 2003, Nucleic Acids Res. 31: 152-155). For example, the relationship between a Fabaceae plant and a rhizobia is a representative example (Tao C., et al., 2009, Mol. Microbiol. 73 (3): 507-517). Leguminous plants provide nodule habitats and supply nutrients directly from the roots, while rhizobia fix nitrogen in the atmosphere and convert it into a form that the plant can use. Both sides are profitable. In addition, many microorganisms inhabit the rhizosphere of plants. For example, microorganisms (Yamaga F. et al., 2010, Environ. Sci. Technol. 44, 6470-6474) that grow in the rhizosphere of Lemna aoukikusa and decompose organic pollutants in water, and the growth of duckweed Have been isolated (Underwood GJC and Baker JH, 1991, J. Appl. Bacteriol.). Such microorganisms inhabiting the rhizosphere of plants are generally collectively referred to as “rhizosphere microorganisms”. Many of the rhizosphere microorganisms have a symbiotic relationship with the host plant, such as the above-mentioned rhizobia, which obtains nutrients from the root of the host plant while imparting useful activities and properties to the host plant. .
上記本発明の課題に鑑み、本発明者らは、根圏微生物の中に本発明の課題を解決し得る性質を宿主植物に付与する種が存在すると仮定し、その探索と分離を試みた。植物工場では、管理及び衛生面から一般に水耕栽培が採用されており、栽培植物の根は液体培地に浸漬している。水耕栽培環境のように水中又は水底に根を張る自然界の植物には、水生植物が知られている。そこで、本発明者らは、水生植物の根圏微生物に着目し、様々な水生植物から根圏微生物を網羅的に分離、収集した。その後、個々の水生植物根圏微生物を培地に添加して宿主植物を培養し、未添加の個体との間で成長性等について比較検証を行った。その結果、特定の水生植物根圏微生物を培地に添加したときに宿主植物が低照度条件下や低濃度肥料培地でも高い成長率を維持できることを見出した。このような性質を宿主植物に付与し得る水生植物根圏微生物は、共通の性質として宿主植物の成長を促進する植物成長促進性根圏微生物(Plant Growth Promoting Rhizobacteria:本明細書では、しばしば「PGPR」と表記する。)で、かつ宿主植物のクロロフィル量を増加することのできる水生植物根圏微生物であることが明らかとなった。本発明は、上記知見に基づいてなされたものであって、以下を提供する。 In view of the above-described problems of the present invention, the present inventors have assumed that there are species in the rhizosphere microorganisms that impart to the host plant the property that can solve the problems of the present invention, and have attempted to search for and isolate them. In plant factories, hydroponics is generally adopted from the viewpoint of management and hygiene, and the roots of cultivated plants are immersed in a liquid medium. Aquatic plants are known as natural plants that have roots in water or in the bottom of the water, such as hydroponic cultivation environments. Accordingly, the present inventors focused on the rhizosphere microorganisms of aquatic plants and comprehensively separated and collected rhizosphere microorganisms from various aquatic plants. Thereafter, individual aquatic plant rhizosphere microorganisms were added to the culture medium, and the host plants were cultured. As a result, it was found that when a specific aquatic plant rhizosphere microorganism was added to the medium, the host plant could maintain a high growth rate even under low light conditions or in a low-concentration fertilizer medium. The aquatic plant rhizosphere microorganism capable of imparting such a property to a host plant is a plant growth promoting rhizobacteria that promotes the growth of the host plant as a common property (Plant Growth Promoting Rhizobacteria: often referred to herein as “PGPR”). It was revealed that this is an aquatic plant rhizosphere microorganism that can increase the amount of chlorophyll in the host plant. This invention is made | formed based on the said knowledge, Comprising: The following are provided.
(1)宿主植物のクロロフィル量を増加する作用を有する水生植物根圏微生物。
(2)ペロモナス属(Pelomonas)微生物、キサントモナス科(Xanthomonadaceae)微生物、ブラディリゾリウム属(Bradyrhizobium)微生物及びアシネトバクター属(Acinetobacter)微生物からなる群のいずれかの微生物属に属する、(1)に記載の水生植物根圏微生物。
(3)ペロモナス属微生物が受託番号NITE P-01645の微生物である、(2)に記載の水生植物根圏微生物。
(4)ペロモナス属微生物が受託番号NITE P-01647の微生物である、(2)に記載の水生植物根圏微生物。
(5)キサントモナス科微生物が受託番号NITE P-01646の微生物である、(2)に記載の水生植物根圏微生物。
(6)ブラディリゾリウム属微生物が受託番号NITE P-01648の微生物である、(2)に記載の水生植物根圏微生物。
(7)キトファギア綱(Cytophagia)微生物、ラキバクター属(Lacibacter)微生物、及びウンディバクテリウム属(Undibacterium)微生物からなる群のいずれかの微生物属に属する、(1)に記載の水生植物根圏微生物。
(8)キトファギア綱微生物が受託番号NITE P-01894の微生物である、(7)に記載の水生植物根圏微生物。
(9)ラキバクター属微生物が受託番号NITE P-01895の微生物である、(7)に記載の水生植物根圏微生物。
(10)ウンディバクテリウム属微生物が受託番号NITE P-01896の微生物である、(7)に記載の水生植物根圏微生物。
(11)(1)〜(10)に記載の水生植物根圏微生物を少なくとも1種含む植物成長強化剤。
(12)(2)に記載のアシネトバクター属微生物が受託番号NITE P-523の微生物である、(11)に記載の植物成長強化剤。
(13)植物が双子葉植物又は単子葉植物である、(11)又は(12)に記載の植物成長強化剤。
(14)(11)〜(13)のいずれかに記載の植物成長強化剤を栽培植物の根に施用して当該植物を栽培する植物栽培方法。
(15)前記栽培が水耕栽培である、(14)に記載の植物栽培方法。
(16)低濃度肥料培地で栽培する、(14)又は(15)に記載の植物栽培方法。
(17)低照度条件下で栽培する、(14)〜(16)のいずれかに記載の植物栽培方法。
(1) An aquatic plant rhizosphere microorganism having an action of increasing the amount of chlorophyll in a host plant.
(2) belonging to any microbial genus of the group consisting of Pelomonas microorganisms, Xanthomonadaceae microorganisms, Bradyrhizobium microorganisms and Acinetobacter microorganisms, Aquatic plant rhizosphere microorganisms.
(3) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (2), wherein the microorganism belonging to the genus Peromonas is the microorganism having the deposit number NITE P-01645.
(4) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (2), wherein the microorganism belonging to the genus Peromonas is the microorganism having the deposit number NITE P-01647.
(5) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (2), wherein the Xanthomonasaceae microorganism is a microorganism having the deposit number NITE P-01646.
(6) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (2), wherein the microorganism belonging to the genus Bradyrizolium is a microorganism having the deposit number NITE P-01648.
(7) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (1) belonging to any one of the group consisting of Cytophagia microorganisms, Lacibacter microorganisms, and Undibacterium microorganisms .
(8) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (7), wherein the chitophagia class microorganism is a microorganism having the deposit number NITE P-01894.
(9) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (7), wherein the microorganism belonging to the genus Rakibacter is a microorganism having the deposit number NITE P-01895.
(10) The aquatic plant rhizosphere microorganism according to (7), wherein the microorganism belonging to the genus Undibacterium is a microorganism having the deposit number NITE P-01896.
(11) A plant growth enhancer comprising at least one aquatic plant rhizosphere microorganism according to (1) to (10).
(12) The plant growth enhancer according to (11), wherein the Acinetobacter genus microorganism according to (2) is a microorganism with the deposit number NITE P-523.
(13) The plant growth enhancer according to (11) or (12), wherein the plant is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
(14) A plant cultivation method in which the plant growth enhancer according to any one of (11) to (13) is applied to the root of a cultivated plant to grow the plant.
(15) The plant cultivation method according to (14), wherein the cultivation is hydroponics.
(16) The plant cultivation method according to (14) or (15), which is cultivated in a low-concentration fertilizer medium.
(17) The plant cultivation method according to any one of (14) to (16), which is cultivated under low illumination conditions.
本発明の水生植物根圏微生物を宿主植物の根部に付着させることで当該宿主植物のクロロフィル量を増加させることができる。それにより、低照度条件下であっても宿主植物の成長率を維持することができる。 The amount of chlorophyll of the host plant can be increased by attaching the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the root of the host plant. Thereby, the growth rate of the host plant can be maintained even under low light conditions.
本発明の水生植物根圏微生物を宿主植物の根部に付着させることで当該宿主植物の栄養状態を強化することができる。それにより、培地の肥料濃度が通常の1/10以下であっても宿主植物の成長率を維持することができる。 By attaching the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the root of the host plant, the nutritional state of the host plant can be enhanced. Thereby, even if the fertilizer density | concentration of a culture medium is 1/10 or less of normal, the growth rate of a host plant can be maintained.
本発明の水生植物根圏微生物を宿主植物の根部に付着させることで当該宿主植物の成長を促進させることができる。 The growth of the host plant can be promoted by attaching the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the root of the host plant.
本発明の植物成長強化剤によれば、培地に施用することで、当該植物成長強化剤が包含する前記水生植物根圏微生物による前記効果により、植物の成長を促進し、また低濃度肥料培地で、かつ低照度条件下であっても植物の成長率を維持することができる。 According to the plant growth enhancer of the present invention, when applied to a culture medium, the effect of the aquatic plant rhizosphere microorganism included in the plant growth enhancer promotes the growth of the plant, and in a low-concentration fertilizer medium. And the growth rate of a plant can be maintained even under low light conditions.
本発明の植物栽培方法によれば、植物栽培における栽培コストを抑えることができる。特に水耕栽培のような人工培地栽培法において、電力コスト及び肥料コストを抑えることで、安価な栽培植物を提供することができる。 According to the plant cultivation method of the present invention, the cultivation cost in plant cultivation can be suppressed. In particular, in an artificial medium cultivation method such as hydroponics, an inexpensive cultivated plant can be provided by suppressing power costs and fertilizer costs.
1.植物成長強化剤
1-1.概要及び定義
本発明の第1の態様は、植物成長強化剤である。本態様の植物成長強化剤は、水生植物根圏微生物を有効成分として含む。本態様の植物成長強化剤を宿主植物に施用することで、宿主植物の成長を強化することができる。
1. Plant growth enhancer 1-1. Outline and Definition The first aspect of the present invention is a plant growth enhancer. The plant growth enhancer of this embodiment contains an aquatic plant rhizosphere microorganism as an active ingredient. By applying the plant growth enhancer of this embodiment to a host plant, the growth of the host plant can be enhanced.
本態様の植物成長強化剤は、植物成長強化作用を有する。本明細書において「植物成長強化作用」とは、至適栽培条件下のみならず、低照度条件下及び/又は低濃度肥料下であっても植物の成長率を維持及び/又は促進させる作用をいう。「植物の成長」とは、植物体の重量、好ましくは乾燥重量の増加をいい、植物体の伸長及び/又は拡大、葉数及び/又は茎数の増加、花芽形成、結実等を含む。「植物の成長率」とは、一定期間内で植物が成長した割合をいう。成長率が0の場合は、その植物が一定期間において全く成長しなかったことを示す。また、成長率がマイナスの場合は、その植物が衰弱、枯死、又は成長停止後、落葉した場合等を示す。したがって、本明細書において「植物の成長率を維持」するとは、植物の成長率がプラス状態を保持していることを意味し、必ずしも前記と同程度の成長率である必要はない。 The plant growth enhancing agent of this embodiment has a plant growth enhancing action. As used herein, the term “plant growth enhancing action” refers to the action of maintaining and / or promoting the growth rate of plants not only under optimal cultivation conditions but also under low light conditions and / or under low-concentration fertilizers. Say. “Plant growth” refers to an increase in the weight of a plant body, preferably a dry weight, and includes elongation and / or expansion of the plant body, an increase in the number of leaves and / or stems, flower bud formation, fruiting, and the like. “Plant growth rate” refers to the rate of plant growth within a certain period. A growth rate of 0 indicates that the plant did not grow at all for a certain period. In addition, when the growth rate is negative, it indicates a case where the plant has fallen after declining, withering, or stopping growth. Therefore, in this specification, “maintaining the growth rate of the plant” means that the growth rate of the plant is maintained in a positive state, and does not necessarily have to be the same growth rate as described above.
本明細書において「低照度条件」とは、通常の室内の明るさに相当する照度条件で、耐陰性のない一般的な植物にとっては成長に必要な光合成を行う上で不十分な明るさをいう。具体的には100〜15000ルクス(lux)、500〜10000ルクス、又は1000〜5000ルクスの範囲の照度である。 In the present specification, the “low illumination condition” is an illumination condition corresponding to normal room brightness, and for a general plant having no negative tolerance, the brightness is insufficient to perform photosynthesis necessary for growth. Say. Specifically, the illuminance is in the range of 100 to 15000 lux, 500 to 10,000 lux, or 1000 to 5000 lux.
本明細書において「低濃度肥料」とは、施肥される肥料の至適濃度の1/500〜1/2の濃度、1/300〜1/3の濃度、又は1/100〜1/5の濃度をいう。 In this specification, “low-concentration fertilizer” means 1/500 to 1/2 of the optimum concentration of fertilizer to be applied, 1/300 to 1/3, or 1/100 to 1/5. Refers to the concentration.
本明細書において「水生植物根圏微生物」とは、水生植物の根圏から単離された根圏微生物をいう。 As used herein, “aquatic plant rhizosphere microorganism” refers to a rhizosphere microorganism isolated from the rhizosphere of an aquatic plant.
本明細書において「水生植物」とは、通常の生活環において根が水中に浸漬している植物をいう。例えば、浮遊植物、浮葉植物、沈水植物、抽水植物、及び湿生植物が該当する。淡水性、汽水性、海水性を問わないが、淡水性が好ましい。「浮遊植物」とは、根を水底に張らずに水中に露出し、植物体全体を水面に浮かべた植物をいう。例えば、アオウキクサ(Lemna aoukikusa)やコウキクサ(Lemna minor)のようなウキクサ科(Lemnaceae)植物、ホテイアオイ(Eichhornia crassipes)のようなミズアオイ科(Pontederiaceae)植物が該当する。「浮葉植物」とは、水底に根を張り、葉を水面又は水面近くに浮かべる植物をいう。例えば、ヒツジグサ(Nymphaea tetragona)やジュンサイ(Brasenia schreberi)のようなスイレン科(Nymphaeaceae)植物、ヒシ(Trapa japonica)のようなヒシ科(Trapaceae)植物、及びアサザ(Nymphoides peltata)のようなミツガシワ科(Menyanthaceae)植物が該当する。「沈水植物」とは、水底に根を張り、植物体全体が水面下にある植物をいう。例えば、クロモ(Hydrilla verticillata)のようなトチカガミ科(Hydrocharitaceae)植物、エビモ(Potamogeton crispus)のようなヒルムシロ科(Potamogetonaceae)植物、及びシャジクモ(Chara braunii)のような車軸藻綱 (Charophyceae)藻類が該当する。「抽水植物」とは、水底に根を張り、葉や茎の植物体上部を水面上に伸ばした植物をいう。例えば、イネ(Oryza sativa)、マコモ(Zizania latifolia)及びヨシ(Phragmites australis)のようなイネ科(Poaceae)植物、ハス(Nelumbo nucifera)のようなハス科(Nelumbonaceae)植物、コウホネ(Nuphar japonicum)のようなスイレン科植物、及びガマ(Typha latifolia)のようなガマ科(Typhaceae)植物が該当する。「湿生植物」とは、湿地や、河川又は池沼の周辺等のように根が水に浸漬し得る場所に生息する植物で、根や地下茎を除く植物体の大部分は水に浸かることがないものをいう。例えば、ミソハギ(Lythrum anceps)のようなミソハギ科(Lythraceae)植物、サギソウ(Habenaria radiata)のようなラン科(Orchidaceae)植物、キショウブ(Iris pseudacorus)のようなアヤメ科(Iridaceae)植物が該当する。 As used herein, “aquatic plant” refers to a plant in which roots are immersed in water in a normal life cycle. For example, a floating plant, a floating leaf plant, a submerged plant, a water extraction plant, and a wet plant are applicable. Although fresh water, brackish water, and seawater are not ask | required, fresh water is preferable. “Floating plant” refers to a plant that is exposed in water without its roots stretched to the bottom of the water, and the whole plant floats on the surface of the water. Examples include Lemnaceae plants such as Lemna aoukikusa and Lemna minor, and Pontederiaceae plants such as Eichhornia crassipes. “Floating leaf plant” refers to a plant that has roots on the bottom of the water and leaves the leaves floating on or near the water surface. For example, Nymphaeaceae plants, such as Nymphaea tetragona and Brasnia schreberi, Trapaceae plants, such as Trapa japonica, and Thripaceae, such as Nymphoides peltata ( Menyanthaceae) plant. A “submerged plant” refers to a plant that has roots in the bottom of the water and the entire plant is below the surface of the water. For example, Hydrocharitaceae plants such as Hydrilla verticillata, Potamogetonaceae plants such as Potamogeton crispus, and Charophyceae algae such as Chara braunii To do. “Drawing plant” refers to a plant with roots on the bottom of the water and with the upper parts of the leaves and stems extending above the surface of the water. For example, Poaceae plants such as rice (Oryza sativa), Zizania latifolia and Phragmites australis, Nelumbonaceae plants such as Lotus (Nelumbo nucifera), Nuphar japonicum This includes the water lily family and the Typhaceae plant such as Typha latifolia. “Hygrophytes” are plants that inhabit wetlands and places where the roots can be immersed in water, such as in the vicinity of rivers or ponds and marshes. Say something that doesn't exist. For example, there are Lythraceae plants such as Lythrum anceps, Orchidaceae plants such as Habenaria radiata, and Iridaceae plants such as Iris pseudacorus.
本明細書において「根圏」とは、前述のように植物の根から化学的又は物理的影響を受ける領域をいう。 As used herein, “rhizosphere” refers to a region that is chemically or physically affected by the roots of a plant as described above.
本明細書において「根圏微生物」(Rhizobacteria)とは、根圏に生息する微生物をいう。ここでいう「微生物」とは、肉眼での認識が困難な微小生物で、細菌(バクテリア)、古細菌(アーキア)、真菌(酵母を含む)、糸状菌を含む。根圏では、植物の根から分泌される物質を餌として様々な根圏微生物が繁殖する一方で、根圏微生物は根圏環境を保護し、植物を土壌伝染性病害の感染から防護すると共に、植物成長因子の供給や代謝調節など植物にとって様々な利点を付与している。したがって、通常の根圏微生物は、根圏を提供する宿主植物と相利共生の関係にある。 As used herein, “Rhizobacteria” refers to microorganisms that inhabit the rhizosphere. The “microorganism” here is a micro organism that is difficult to recognize with the naked eye, and includes bacteria (bacteria), archaea (archia), fungi (including yeast), and filamentous fungi. In the rhizosphere, various rhizosphere microorganisms propagate by feeding on substances secreted from the roots of the plant, while the rhizosphere microorganisms protect the rhizosphere environment and protect the plant from infection with soil-borne diseases, It provides various benefits for plants such as the supply of plant growth factors and metabolic regulation. Therefore, normal rhizosphere microorganisms have a symbiotic relationship with the host plant that provides the rhizosphere.
本明細書において「宿主植物」とは、本態様の植物成長強化剤の施用対象植物をいう。宿主植物は、水生植物である必要はなく、その根圏に水生植物根圏微生物を生息させることのできる植物であれば特に制限はしない。例えば、コケ植物、シダ植物及び種子植物を含む。種子植物の場合、被子植物又は裸子植物を問わず、また被子植物は、単子葉植物又は双子葉植物のいずれであってもよい。さらに、草本植物及び木本植物も問わない。本態様の水生植物根圏微生物を適応する宿主植物の例として、農業的に重要な植物、例えば、穀類、花、野菜、果物等の作物植物が挙げられる。具体的には、単子葉植物では、イネ科に属する種(例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、コウリャン)が該当する。また、双子葉植物では、アブラナ科に属する種(例えば、キャベツ、ダイコン、ハクサイ、アブラナ)、キク科に属する種(例えば、レタス、ゴボウ、キク)、マメ科に属する種(例えば、ダイズ、落花生、エンドウ、インゲンマメ、アズキ、ソラマメ)、ナス科に属する種(例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ、ペチュニア)、バラ科に属する種(例えば、イチゴ、リンゴ、ナシ、モモ、ビワ、アーモンド、スモモ、バラ、ウメ、サクラ)、ウリ科に属する種(例えば、キュウリ、ウリ、カボチャ、メロン、スイカ)、ユリ科に属する種(例えば、ネギ、タマネギ、ユリ)、ミカン科(例えば、ミカン、グレープフルーツ、レモン、ユズ)、ブドウ科に属する種(例えば、ブドウ)が該当する。後述する水耕栽培に好適な植物は、特に好ましい。 As used herein, “host plant” refers to a plant to which the plant growth enhancer of this embodiment is applied. The host plant does not need to be an aquatic plant, and is not particularly limited as long as it is a plant that can inhabit aquatic plant rhizosphere microorganisms in its rhizosphere. For example, moss plants, fern plants and seed plants are included. In the case of a seed plant, regardless of angiosperm or gymnosperm, the angiosperm may be either a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant. Furthermore, a herbaceous plant and a woody plant are not ask | required. Examples of host plants to which the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment is adapted include agriculturally important plants such as crop plants such as cereals, flowers, vegetables and fruits. Specifically, in monocotyledonous plants, species belonging to the family Gramineae (for example, rice, wheat, barley, corn, sugarcane, sorghum, cucumber) correspond. In addition, in dicotyledonous plants, species belonging to the Brassicaceae family (for example, cabbage, radish, Chinese cabbage, Brassica), species belonging to the Asteraceae family (for example, lettuce, burdock, chrysanthemum), species belonging to the legume family (for example, soybean, peanuts). , Peas, kidney beans, azuki beans, broad beans), species belonging to the solanaceous family (eg tomato, eggplant, potato, tobacco, pepper, pepper, petunia), species belonging to the rose family (eg strawberry, apple, pear, peach, loquat) , Almond, plum, rose, ume, cherry), species belonging to the family Cucurbitaceae (for example, cucumber, cucumber, pumpkin, melon, watermelon), species belonging to the Lily family (for example, leeks, onions, lilies), citrus (for example, , Mandarin orange, grapefruit, lemon, yuzu), species belonging to the vine family (for example, grapes). Plants suitable for hydroponics described below are particularly preferred.
1−2.構成
1−2−1.含有成分
本態様の植物成長強化剤は、有効成分として水生植物根圏微生物を含む。
本態様の植物成長強化剤に含まれる水生植物根圏微生物(以下、しばしば「本態様の水生植物根圏微生物」、又は「第1態様の水生植物根圏微生物」若しくは「本発明の水生植物根圏微生物」と称する。)は、宿主植物の成長を促進させる作用(成長促進作用)を有する、いわゆる植物成長促進性根圏微生物(Plant Growth Promoting Rhizobacteria:PGPR)であることを特徴とする。ここでいう「成長促進作用」とは、水生植物根圏微生物を根圏に生息させることによって、生息させていない同種植物と比較して植物の成長を促進する作用をいう。また、本態様の水生植物根圏微生物は、前記成長促進作用に加えて、宿主植物のクロロフィル量を増加する作用(クロロフィル量増加作用)をさらに有することを特徴とする。「クロロフィル量増加作用」とは、水生植物根圏微生物を根圏に生息させることによって、生息させていない同種植物と比較して植物全体のクロロフィル量を増加する作用をいう。前述した本態様の植物成長強化剤が有する植物成長強化作用は、有効成分である水生植物根圏微生物に起因する作用である。つまり、本態様の水生植物根圏微生物が本発明の効果を奏する植物成長強化作用を有している。
1-2. Configuration 1-2-1. Ingredients The plant growth enhancer of this embodiment contains aquatic plant rhizosphere microorganisms as active ingredients.
The aquatic plant rhizosphere microorganism (hereinafter often referred to as “aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment”, or “aquatic plant rhizosphere microorganism of the first embodiment” or “aquatic plant root of the present invention” contained in the plant growth enhancer of this embodiment. Is referred to as a plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) having an action of promoting the growth of the host plant (growth promoting action). The “growth promoting action” as used herein refers to an action of promoting the growth of a plant by inhabiting the rhizosphere of aquatic plant rhizosphere microorganisms as compared to the same species not inhabiting. Further, the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment further has an action of increasing the amount of chlorophyll in the host plant (chlorophyll quantity increasing action) in addition to the growth promoting action. The “chlorophyll amount increasing action” refers to an action of increasing the chlorophyll amount of the whole plant by inhabiting the rhizosphere of aquatic plant rhizosphere microorganisms as compared to the same plant not inhabiting. The plant growth enhancing action of the plant growth enhancing agent of this embodiment described above is an action caused by the aquatic plant rhizosphere microorganism which is an active ingredient. That is, the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment has a plant growth enhancing action that exhibits the effects of the present invention.
本態様の植物成長強化剤に含まれる水生植物根圏微生物の例として、ペロモナス属(Pelomonas)微生物、ドクドネラ属(Dokdonella)微生物を含むキサントモナス科(Xanthomonadaceae)微生物、好ましくは下記MRB2株が属する属の微生物、ブラディリゾリウム属(Bradyrhizobium)微生物、アシネトバクター属(Acinetobacter)微生物、キトファギア綱(Cytophagia)微生物、好ましくは下記MRB5株が属する属の微生物、ラキバクター属(Lacibacter)微生物を含むキチノファガセアエ科(Chitinophagaceae)微生物、好ましくは下記MRB6株が属する属の微生物、及びウンディバクテリウム属(Undibacterium)微生物を含むオキサロバクテラセアエ科(Oxalobacteraceae)微生物、好ましくは下記MRB7株が属する属の微生物が挙げられる。中でも表1又は表2に示す水生植物根圏微生物は、本態様の植物成長強化剤の水生植物根圏微生物として特に好ましい。 Examples of aquatic plant rhizosphere microorganisms contained in the plant growth enhancer of this embodiment include Pelomonas microorganisms, Xanthomonadaceae microorganisms including Dokdonella microorganisms, preferably the following MRB2 strains belonging to the genus A family of chitinofagaceae including microorganisms, Bradyrhizobium microorganisms, Acinetobacter microorganisms, Cytophagia microorganisms, preferably those belonging to the following MRB5 strains, Lacibacter microorganisms (Chitinophagaceae) microorganisms, preferably microorganisms of the genus to which the following MRB6 strains belong, and Oxalobacteraceae microorganisms including the Undibacterium microorganisms, preferably microorganisms of the genus to which the following MRB7 strains belong It is done. Among these, the aquatic plant rhizosphere microorganisms shown in Table 1 or Table 2 are particularly preferable as the aquatic plant rhizosphere microorganisms of the plant growth enhancer of this embodiment.
表1において受託番号NITE P-01645〜NITE P-01648の水生植物根圏微生物は、2013年7月3日付で、また、受託番号NITE P-523の水生植物根圏微生物は、2008年3月12日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構(292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に寄託されている。Pelomonas sp. MRB1株(以下、本明細書では、しばしば「MRB1(株)」と略称する。)、Dokdonella sp. MRB2株(以下、本明細書では、しばしば「MRB2(株)」と略称する。なお、後述の表5に記載のように、本株は、既知株であるDokdonella sp. KIS28-6株と16S rRNAの相同性が93.6%しかなく、ドクドネラ属に近い新属の可能性もある。しかし、本明細書では便宜的にDokdonella属として記載する。)、Pelomonas sp. MRB3株(以下、本明細書では、しばしば「MRB3(株)」と略称する。)、及びBradyrhizobium sp. MRB4株(以下、本明細書では、しばしば「MRB4(株)」と略称する。)は、後述する実施例において新たに分離された新規水生植物根圏微生物である。また、Acinetobacter calcoaceticus P23株(以下、本明細書では、しばしば「P23(株)」と略称する。)は、フェノール等の多環式芳香族化合物に対して分解能を有する水生植物根圏微生物として分離されていた(特開2009-247279)が、今回、低照度条件下及び/又は低濃度肥料下で植物の成長率を維持及び/又は促進する植物成長強化剤としての新たな用途が見出された。 In Table 1, the aquatic plant rhizosphere microorganisms with accession numbers NITE P-01645 to NITE P-01648 are dated July 3, 2013, and the aquatic plant rhizosphere microorganisms with accession number NITE P-523 are March 2008. On December 12, it has been deposited with the National Institute of Technology and Evaluation (292-0818, Room 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818). Pelomonas sp. MRB1 strain (hereinafter often abbreviated as “MRB1 (strain)”), Dokdonella sp. MRB2 strain (hereinafter often abbreviated as “MRB2 (strain)” herein). As described in Table 5 below, this strain has only 93.6% homology between 16S rRNA and Dokdonella sp. KIS28-6, which is a known strain, and may be a new genus close to the genus Docdonella. However, in this specification, it is described as the genus Dokdonella for convenience.), Pelomonas sp. MRB3 strain (hereinafter, abbreviated as “MRB3 (strain)” in this specification), and Bradyrhizobium sp. MRB4 strain (Hereinafter, in this specification, it is often abbreviated as “MRB4 Co.”) is a novel aquatic plant rhizosphere microorganism newly isolated in Examples described later. In addition, Acinetobacter calcoaceticus P23 strain (hereinafter often abbreviated as “P23 strain” in the present specification) is isolated as an aquatic plant rhizosphere microorganism having a resolution with respect to polycyclic aromatic compounds such as phenol. (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-247279), however, has now found a new use as a plant growth enhancer that maintains and / or promotes the growth rate of plants under low light conditions and / or under low-concentration fertilizers. It was.
表2において受託番号NITE P-01894〜NITE P-01896の水生植物根圏微生物は、2014年7月10日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構(292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)で寄託されている。Cytophagia綱微生物 MRB5株(以下、本明細書では、しばしば「MRB5(株)」と略称する。)、Lacibacter sp. MRB6株(以下、本明細書では、しばしば「MRB6(株)」と略称する。)、及びUndibacterium sp. MRB7株(以下、本明細書では、しばしば「MRB7(株)」と略称する。)は、後述する実施例12において新たに分離された新規水生植物根圏微生物である。 In Table 2, the aquatic plant rhizosphere microorganisms with the accession numbers NITE P-01894 to NITE P-01896 are listed on July 10, 2014 by the National Institute of Technology and Evaluation (Kazusa Kamaji, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan, 292-0818). 2-5-8 Room 120). Cytophagia class microorganism MRB5 strain (hereinafter often abbreviated as “MRB5 strain”), Lacibacter sp. MRB6 strain (hereinafter often abbreviated as “MRB6 strain” herein). ) And Undibacterium sp. MRB7 strain (hereinafter abbreviated as “MRB7 (strain)” in the present specification) are novel aquatic plant rhizosphere microorganisms newly isolated in Example 12 described later.
本態様の植物成長強化剤において、水生植物根圏微生物は、原則として生存状態で含まれている。したがって、本態様の植物成長強化剤の有効成分として用いる場合、L培地等の適当な培地で培養した対数増殖期にある水生植物根圏微生物を用いることが好ましい。ただし、一部に死亡した水生植物根圏微生物が含まれていても構わない。なお、本態様の水生植物根圏微生物は、本態様の植物成長強化剤に包含する前は、個別に凍結保存しておくことができる。例えば、L培地等の培地で一晩培養した後、滅菌したグリセロールを終濃度20%となるように添加して、-80℃の超低温で保存すればよい。 In the plant growth enhancer of this embodiment, the aquatic plant rhizosphere microorganism is contained in a living state in principle. Therefore, when used as an active ingredient of the plant growth enhancer of this embodiment, it is preferable to use aquatic plant rhizosphere microorganisms in the logarithmic growth phase cultured in an appropriate medium such as L medium. However, some dead aquatic plant rhizosphere microorganisms may be included. In addition, the aquatic plant rhizosphere microorganism of this aspect can be cryopreserved separately before including in the plant growth enhancing agent of this aspect. For example, after culturing overnight in a medium such as L medium, sterilized glycerol may be added to a final concentration of 20% and stored at an ultralow temperature of -80 ° C.
本態様の植物成長強化剤は、植物成長強化作用を互いに阻害せず、また、宿主植物の根圏内で同所的又は異所的に共存し得る限りにおいて、異なる二種類以上の水生植物根圏微生物を含むことができる。 The plant growth enhancing agent of this embodiment does not inhibit the plant growth enhancing action to each other, and two or more different types of aquatic plant rhizospheres as long as they can coexist sympatrically or ectopically within the root zone of the host plant. Microorganisms can be included.
本態様の植物成長強化剤は、上記有効成分としての水生植物根圏微生物に加えて、その微生物の生存及び植物成長強化作用を阻害又は抑制しない範囲において農業上許容可能な溶媒又は担体を含むことができる。 In addition to the aquatic plant rhizosphere microorganism as the active ingredient, the plant growth enhancer of this embodiment contains an agriculturally acceptable solvent or carrier in a range not inhibiting or suppressing the survival of the microorganism and the plant growth enhancing action. Can do.
「農業上許容可能な溶媒又は担体」とは、植物成長強化剤の施用を容易にし、水生植物根圏微生物の生存及び/又は植物成長強化作用を維持し、農作物栽培への使用が法的に認められており、水質汚染等の環境に対する有害性がないか若しくは低く、及び/又は動物、特にヒトに対する有害性がないか若しくは少ない物質をいう。 “Agriculturally acceptable solvent or carrier” means that the application of a plant growth enhancer is facilitated, the survival and / or plant growth enhancing action of aquatic plant rhizosphere microorganisms is maintained, and its use in crop cultivation is legal. A substance that is recognized and has no or low environmental hazards, such as water pollution, and / or no or low toxicity to animals, particularly humans.
「農業上許容可能な溶媒」には、水、又はそれ以外の農業上許容し得る水溶液が含まれる。水溶液としては、例えば、リン酸塩緩衝液のような緩衝剤、液体培地が挙げられる。 “Agriculturally acceptable solvent” includes water or other agriculturally acceptable aqueous solutions. Examples of the aqueous solution include a buffer such as a phosphate buffer and a liquid medium.
「農業上許容可能な賦形剤」には、粉砕天然鉱物(例えば、カオリン、クレイ、タルク及びチョーク)、粉砕合成鉱物(例えば、高分散シリカ及びシリケート)、乳化剤(非イオン性乳化剤やアニオン性乳化剤)、分散剤(リグノ亜硫酸廃液及びメチルセルロース)及び界面活性剤等が含まれる。 “Agriculturally acceptable excipients” include ground natural minerals (eg kaolin, clay, talc and chalk), ground synthetic minerals (eg highly disperse silica and silicates), emulsifiers (non-ionic emulsifiers and anionics). Emulsifiers), dispersants (lignosulfite waste liquor and methylcellulose), surfactants and the like.
本態様の植物成長強化剤は、農業上許容可能な溶媒又は担体を1以上包含することできる。また、この他に、有効成分である水生植物根圏微生物の生存及び植物成長強化作用に影響しない範囲において、他の成長強化剤等や栄養素を包含することもできる。「栄養素」とは、その物質の欠乏により植物が成長上又は生殖上何らかの異常をきたし、その症状の回復が他の物質の供給では補償できない物質をいう。原則として植物の必須元素を意味する。一般的な植物の必須元素としては、16種の元素、すなわち、水素(H)、酸素(O)、炭素(C)、窒素(N)、リン(P)、カリウム(K)、マグネシウム(Mg)、カルシウム(Ca)、硫黄(S)、鉄(Fe)、マンガン(Mg)、亜鉛(Zn)、ホウ素(B)、モリブデン(Mo)、銅(Cu)及び塩素(Cl)が挙げられる。また、それらの元素を含む肥料(例えば、尿素、アンモニウム塩、(過)リン酸塩)もここでいう栄養素に含まれる。 The plant growth enhancer of this embodiment can include one or more agriculturally acceptable solvents or carriers. In addition, other growth enhancers and nutrients can be included as long as they do not affect the survival and plant growth enhancing action of aquatic plant rhizosphere microorganisms which are active ingredients. “Nutrient” refers to a substance in which a plant has some abnormality in growth or reproduction due to lack of the substance, and recovery of the symptom cannot be compensated by the supply of other substances. In principle, it means an essential element of plants. General plant essential elements include 16 elements: hydrogen (H), oxygen (O), carbon (C), nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), magnesium (Mg ), Calcium (Ca), sulfur (S), iron (Fe), manganese (Mg), zinc (Zn), boron (B), molybdenum (Mo), copper (Cu) and chlorine (Cl). Further, fertilizers containing these elements (for example, urea, ammonium salts, (per) phosphates) are also included in the nutrients herein.
1−2−2.剤形
本態様の植物成長強化剤は、有効成分である本態様の水生植物根圏微生物を生存状態で保持し得ることができれば、特に限定はしない。例えば、本態様の水生植物根圏微生物を適当な溶液に懸濁した液体状態、固体状態又はその組み合わせとすることができる。液体状態の場合、本態様の水生植物根圏微生物を適切な溶液に懸濁したものであればよい。適切な溶液としては、例えば、水(滅菌水、脱イオン水、超純水を含む)、生理食塩水、バッファー(リン酸緩衝液、炭酸緩衝液を含む)、その水生植物根圏微生物の培地が挙げられる。固体状態の場合、例えば、顆粒状態、粉末状態、ゲルのような半固体状態が挙げられる。これらの具体例として、液剤、粉剤、粒剤等の剤形が含まれる。
1-2-2. Dosage Form The plant growth enhancer of this embodiment is not particularly limited as long as it can retain the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment which is an active ingredient in a living state. For example, the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment can be in a liquid state, a solid state or a combination thereof suspended in an appropriate solution. In the liquid state, the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment may be suspended in an appropriate solution. Suitable solutions include, for example, water (including sterilized water, deionized water, and ultrapure water), physiological saline, buffer (including phosphate buffer and carbonate buffer), and the aquatic plant rhizosphere microorganism medium. Is mentioned. In the case of a solid state, for example, a granular state, a powder state, and a semi-solid state such as a gel can be mentioned. Specific examples of these include dosage forms such as liquids, powders and granules.
1−2−3.含有量
本態様の植物成長強化剤の所定量あたりにおける有効成分である本態様の水生植物根圏微生物の含有量は、含有する水生植物根圏微生物の種類、異なる複数種を含む場合には、その組み合わせ、宿主物の種類、剤形、及び施用方法等の諸条件によって異なるが、通常は、本態様の植物成長強化剤を施用後、本態様の水生植物根圏微生物が宿主植物に対して植物成長強化作用を発揮する上で十分な量を含んでいることが好ましい。この含有量は、当該分野の技術常識の範囲内で、施用後に所定量の培地あたりの水生植物根圏微生物が所望の存在量となるように勘案し、決定すればよい。一例として、本態様の植物成長強化剤における本態様の水生植物根圏微生物の含有量は、103〜1015cfu/mL、好ましくは104〜1010cfu/mLの範囲にあればよい。この場合、施用時に、必要に応じて水、生理食塩水、バッファー等で10〜1000倍に希釈することもできる。
1-2-3. Content The content of the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment, which is an active ingredient per predetermined amount of the plant growth enhancer of this embodiment, includes the types of aquatic plant rhizosphere microorganisms to be contained, and a plurality of different species. Usually, after application of the plant growth enhancing agent of this embodiment, the aquatic plant rhizosphere microorganisms of this embodiment are applied to the host plant, depending on the combination, the type of host product, the dosage form, and the application method. It is preferable to contain a sufficient amount for exhibiting the plant growth enhancing action. This content may be determined in consideration of the desired abundance of aquatic plant rhizosphere microorganisms per predetermined amount of the medium after application within the range of technical common sense in the field. As an example, the content of the aquatic plant rhizosphere microorganism of this embodiment in the plant growth enhancer of this embodiment may be in the range of 10 3 to 10 15 cfu / mL, preferably 10 4 to 10 10 cfu / mL. In this case, it can also be diluted 10 to 1000 times with water, physiological saline, buffer, or the like as needed during application.
2.植物栽培方法
2−1.概要
本発明の第2の態様は、植物栽培方法である。本態様の植物栽培方法は、前記第1態様の植物成長強化剤を栽培植物の根に施用して当該植物を栽培することを特徴とする。本態様の植物栽培方法により、低照度条件下及び/又は低濃度肥料下であっても栽培植物の成長率を維持及び/又は促進させることができる。
2. Plant cultivation method 2-1. Outline | summary The 2nd aspect of this invention is a plant cultivation method. The plant cultivation method of this aspect is characterized by cultivating the plant by applying the plant growth enhancing agent of the first aspect to the roots of the cultivated plant. By the plant cultivation method of this aspect, the growth rate of a cultivated plant can be maintained and / or promoted even under low illumination conditions and / or under a low concentration fertilizer.
2−2.栽培形態
本態様の植物栽培方法を適用する栽培形態は、特に制限はしない。しかし、本態様の植物栽培方法は、植物工場、特に完全制御型の植物工場で用いた場合にその効果を最も享受し得る。ここで「完全制御型の植物工場」とは、ビル屋内のような閉鎖空間内において、光、湿度、温度等の気象条件や培地の供給及び交換等が完全にシステム化され、コンピューター制御された人工環境下で植物の栽培を行う工場をいう。一般に、植物工場では、管理面、衛生面、労力面等から水耕栽培形態が採用されている。
2-2. Cultivation form The cultivation form to which the plant cultivation method of this embodiment is applied is not particularly limited. However, the plant cultivation method of this embodiment can enjoy the most effect when used in a plant factory, particularly a fully-controlled plant factory. Here, a “fully controlled plant factory” means that the weather conditions such as light, humidity, and temperature, and the supply and exchange of culture media are completely systematized and controlled by a computer in a closed space such as in a building. A factory that grows plants in an artificial environment. In general, hydroponics is adopted in plant factories in terms of management, hygiene, labor, and the like.
本明細書において「水耕栽培」とは、栽培植物の根の全部又は一部が水耕液に浸漬した状態で栽培を行う形態である。「水耕液」とは、水耕栽培に用いる液体培地又は液体肥料をいう。本態様の植物栽培方法で用いる水耕液は、当該分野で公知の水耕液でよい。水耕液の組成等については、例えば、社団法人 日本施設園芸協会編、培養液栽培新マニュアル、に記載の組成に基づいて調製することができる。また、水耕液は、園芸用品メーカーからも市販されており、それらを利用してもよい。 In this specification, “hydroponic cultivation” refers to a form in which cultivation is performed in a state where all or part of the roots of a cultivated plant is immersed in a hydroponic liquid. "Hydroculture liquid" refers to a liquid medium or liquid fertilizer used for hydroponics. The hydroponic liquid used in the plant cultivation method of this embodiment may be a hydroponic liquid known in the art. The composition of the hydroponic liquid can be prepared based on the composition described in, for example, the Japan Facility Horticultural Association edited by the new culture liquid cultivation manual. Hydroponic liquids are also commercially available from gardening equipment manufacturers and may be used.
本態様の植物栽培方法で施用する第1態様の水生植物根圏微生物は、元来、根が水中に浸漬している水生植物の根圏に生息していた根圏微生物であることから、水耕栽培は、本態様の植物栽培方法における栽培形態としても好適である。通常の水耕栽培では、水耕液のみで栽培されるが、本明細書における水耕栽培では、水耕液に植物の足場としての支持体を充填しても構わない。支持体には、例えば、ウレタン、ロックウール、砂、礫、バーミキュライト、パーライト等の無機材の他、おが屑、籾殻、やし殻、バークチップ等の未腐植セルロース、及び寒天等の天然有機材、又はそれらの組み合わせが使用される。栽培植物の回収及び再生が容易な支持体、すなわち掘り上げが容易で植物体残渣の残りにくい支持体が好ましい。 The aquatic plant rhizosphere microorganism of the first aspect applied by the plant cultivation method of this aspect is originally a rhizosphere microorganism that inhabited the rhizosphere of an aquatic plant whose roots are immersed in water. Tillage cultivation is also suitable as a cultivation form in the plant cultivation method of this embodiment. In normal hydroponics, it is cultivated only with hydroponic liquid. However, in hydroponic culture in this specification, the hydroponic liquid may be filled with a support as a plant scaffold. For the support, for example, in addition to inorganic materials such as urethane, rock wool, sand, gravel, vermiculite, pearlite, unhumid cellulose such as sawdust, rice husk, coconut shell, bark chip, and natural organic materials such as agar, Or a combination thereof is used. A support that allows easy collection and regeneration of cultivated plants, that is, a support that is easy to dig up and that does not easily leave plant residue is preferred.
水耕栽培の具体的な方法については、公知の水耕栽培法、例えば、非特許文献1に記載の平成17年度特許流通支援チャート 一般23「水耕栽培(植物工場)に記載の方法を参照すればよい。
For specific methods of hydroponic cultivation, see the known hydroponic cultivation method, for example, the method described in 2005 Patent Distribution Support Chart of
2−3.栽培方法
本態様の植物栽培方法では、必須の工程として施用工程及び栽培工程を含む。以下、それぞれの工程について説明する。
2-3. Cultivation method In the plant cultivation method of this aspect, an application process and a cultivation process are included as an essential process. Hereinafter, each process will be described.
(施用工程)
本明細書において「施用工程」は、前記第1態様の植物成長強化剤を栽培植物の根に施用する工程である。施用工程は、植物成長強化剤の有効成分である第1態様の水生植物根圏微生物を栽培植物の根圏に付与することを目的とする。
(Application process)
In the present specification, the “application step” is a step of applying the plant growth enhancing agent of the first aspect to the roots of cultivated plants. An application process aims at providing the aquatic plant rhizosphere microorganism of the 1st aspect which is an active ingredient of a plant growth enhancer to the rhizosphere of a cultivation plant.
「栽培植物」とは、本態様の植物栽培方法の栽培対象となる植物をいう。栽培植物は、前記宿主植物と同じであるため、ここでは具体的な説明を省略する。本工程で使用する栽培植物の成長段階については、制限はしないが、前記本工程の目的を鑑みれば、発根後の栽培植物を用いることが好ましい。 “Cultivation plant” refers to a plant to be cultivated in the plant cultivation method of this embodiment. Since the cultivated plant is the same as the host plant, a specific description is omitted here. Although there is no restriction | limiting about the growth stage of the cultivated plant used at this process, In view of the objective of the said this process, it is preferable to use the cultivated plant after rooting.
施用方法については、栽培植物の根に第1態様の植物成長強化剤を施用することができる方法であれば、当該分野で公知の方法を用いればよく、特に限定はされない。例えば、前述の水耕栽培であれば、第1態様の植物成長強化剤を水耕液中に添加すればよい。添加後、必要に応じて水耕液を撹拌する。第1態様の水生植物根圏微生物は、栽培植物の根圏に誘引されて移動し、栽培植物の根圏に到達後、定着する。この方法は、溶液を介して第1態様の水生植物根圏微生物が水耕液全体に行き渡る点で好ましい。あるいは、栽培植物の根に第1態様の植物成長強化剤を直接、塗布、噴霧、散布又は浸漬によって接触させる施用法であってもよい。水耕液中への添加方法が簡便で好適である。 About an application method, if it is a method which can apply the plant growth enhancer of a 1st aspect to the root of a cultivated plant, a well-known method may be used in the said field | area, and it will not specifically limit. For example, if it is the above-mentioned hydroponics, what is necessary is just to add the plant growth enhancer of a 1st aspect in hydroponics. After the addition, the hydroponic liquid is stirred as necessary. The aquatic plant rhizosphere microorganism of the first aspect is attracted to and moved to the rhizosphere of the cultivated plant and settles after reaching the rhizosphere of the cultivated plant. This method is preferable in that the aquatic plant rhizosphere microorganism of the first aspect is distributed throughout the hydroponic solution via the solution. Alternatively, it may be an application method in which the plant growth enhancing agent of the first aspect is directly contacted with the roots of the cultivated plant by application, spraying, spraying or dipping. The addition method to the hydroponic liquid is simple and suitable.
植物成長強化剤の施用量は、含有された水生植物根圏微生物の種類及び施用する栽培植物の種類、及び/又は施用方法に応じて適宜調整すればよい。しかし、本工程で第1態様の水生植物根圏微生物を一旦栽培植物の根圏に生息させることができれば、水生植物根圏微生物は根圏内で必要に応じて増殖可能である。したがって、植物成長強化剤の施用量は、少量であっても十分な作用効果を奏することができる。一例として、水耕液に植物成長強化剤を添加する場合であれば、第1態様の植物成長強化剤を施用後、水耕液中の水生植物根圏微生物の濃度が、103〜1015cfu/mL、好ましくは104〜1010cfu/mLとなるようにすればよい。 What is necessary is just to adjust the application rate of a plant growth enhancing agent suitably according to the kind of contained aquatic plant rhizosphere microorganisms, the kind of cultivated plant to apply, and / or the application method. However, once the aquatic plant rhizosphere microorganism of the first aspect can be inhabited in the rhizosphere of the cultivated plant in this step, the aquatic plant rhizosphere microorganism can proliferate as necessary in the rhizosphere. Therefore, even if the application amount of the plant growth enhancer is small, a sufficient effect can be obtained. As an example, if a plant growth enhancer is added to the hydroponic liquid, the concentration of aquatic plant rhizosphere microorganisms in the hydroponic liquid after application of the plant growth enhancer of the first aspect is 10 3 to 10 15. cfu / mL, preferably 10 4 to 10 10 cfu / mL.
(栽培工程)
本明細書において「栽培工程」は、前記施用工程後の栽培植物を所定の期間栽培する工程である。本工程は、栽培植物の根圏に第1態様の水生植物根圏微生物を定着させ、その後、栽培植物を所望の状態にまで生育させることを目的とする。
(Cultivation process)
In the present specification, the “cultivation step” is a step of cultivating the cultivated plant after the application step for a predetermined period. The purpose of this step is to fix the aquatic plant rhizosphere microorganism of the first aspect in the rhizosphere of the cultivated plant, and then grow the cultivated plant to a desired state.
前述のように本態様の植物栽培方法では、通常、水耕栽培形態が採用されることから、本工程では、公知の水耕栽培方法に基づいて栽培すればよい。水耕栽培の具体的な方法については、例えば、前述の社団法人 日本施設園芸協会編、培養液栽培新マニュアルに記載の方法を参照すればよい。明暗時間(光照射時間及び暗黒時間)、気温及び湿度等を含む気象条件、及び生育期間等の栽培条件は、栽培植物に関して当該分野で公知の条件を適用すればよい。完全制御型の植物工場において本態様の植物栽培方法を適用する場合、本工程において栽培植物の至適栽培条件に設定することは比較的容易である。 As described above, in the plant cultivation method of this aspect, a hydroponic cultivation form is usually employed. Therefore, in this step, cultivation may be performed based on a known hydroponic cultivation method. For a specific method of hydroponics, for example, the method described in the aforementioned Japan Facility Horticultural Association edited by a new culture broth cultivation manual may be referred to. Conditions known in the art with respect to the cultivated plant may be applied to weather conditions including light / dark time (light irradiation time and dark time), air temperature, humidity, and the like, and cultivation conditions such as a growth period. When applying the plant cultivation method of this aspect in a fully controlled plant factory, it is relatively easy to set the optimum cultivation conditions for the cultivated plant in this step.
2−4.効果
本態様の植物栽培方法は、低照度条件下及び/又は低濃度肥料下であっても栽培植物の成長率を維持及び/又は促進させることができることから、電力コスト及び肥料コストの低減が可能となり、従来の植物工場における最大の課題であった生産コストの低減を実現することができる。それによって、安価で、安全な栽培植物の安定的な供給が可能となる。
2-4. Effect The plant cultivation method of the present aspect can maintain and / or promote the growth rate of cultivated plants even under low illumination conditions and / or under low-concentration fertilizers, so that power costs and fertilizer costs can be reduced. Thus, it is possible to realize a reduction in production cost, which was the biggest problem in the conventional plant factory. This makes it possible to stably supply inexpensive and safe cultivated plants.
<実施例1:水生植物根圏微生物ライブラリーの作製>
(目的)
様々な水生植物から水生植物根圏微生物を分離し、水生植物根圏微生物ライブラリーを作製する。
<Example 1: Production of aquatic plant rhizosphere microbial library>
(the purpose)
Isolate aquatic plant rhizosphere microorganisms from various aquatic plants and create aquatic plant rhizosphere microorganism library.
(材料)
水生植物根圏微生物の分離源として、浮遊植物のアオウキクサ(Lemna aoukikusa)及びコウキクサ(Lemna minor)、抽水植物のヨシ(Phragmites australis)、及び湿生植物のミソハギ(Lythrum anceps)の4種の水生植物を使用した。
(material)
Four species of aquatic plants, Lemna aoukikusa and Lemna minor, Phragmites australis, a water extract, and Lythrum anceps, a source of aquatic plant rhizosphere microorganisms It was used.
(方法)
(1)分離培地
培地にはR2Aの成分を10倍希釈した1/10-R2A培地を使用した。培地の組成は、表3に示す通りである。
(Method)
(1)
(2)分離方法
各水生植物の根を滅菌Hoagland培地で2回軽く洗浄した後、10mLの滅菌Hoagland培地内でホモジナイザー(エースホモジナイザーAM5;日本精機製作所)を用いて15000rpmにて5分間ホモジナイズした。Hoagland培地組成は表4に示す。
(2) Separation method The roots of each aquatic plant were lightly washed twice with sterile Hoagland medium, and then homogenized for 5 minutes at 15000 rpm using a homogenizer (ACE homogenizer AM5; Nippon Seiki Seisakusho) in 10 mL of sterile Hoagland medium. The composition of Hoagland medium is shown in Table 4.
その後、滅菌Hoagland培地で10倍、100倍、及び1000倍に段階希釈したサンプル液を調製し、各サンプル液を50μLずつ1/10-R2Aの分離培地に塗布した。その後、プレートを25℃にて30日間インキュベートした。コロニー形成した水生植物根圏微生物を単離した。 Thereafter, sample solutions serially diluted 10-fold, 100-fold, and 1000-fold with a sterile Hoagland medium were prepared, and 50 μL of each sample liquid was applied to a 1 / 10-R2A separation medium. The plates were then incubated for 30 days at 25 ° C. Colonized aquatic plant rhizosphere microorganisms were isolated.
40属60種以上からなる125株の水性植物根圏微生物の単離に成功した。各水性植物根圏微生物はR2A培地で25℃にて2週間培養し、滅菌スワブで回収した後、20%滅菌グリセロール水溶液に懸濁して-80℃で保存した。これらの水性植物根圏微生物を水生植物根圏微生物ライブラリーとして登録した。 We succeeded in isolating 125 aquatic plant rhizosphere microorganisms consisting of more than 60 species in 40 genera. Each aqueous plant rhizosphere microorganism was cultured in an R2A medium at 25 ° C. for 2 weeks, recovered with a sterile swab, suspended in a 20% sterile glycerol aqueous solution, and stored at −80 ° C. These aqueous plant rhizosphere microorganisms were registered as an aquatic plant rhizosphere microorganism library.
<実施例2:植物成長促進根圏微生物の選抜(1)>
(目的)
実施例1で作製した水生植物根圏微生物ライブラリーから植物成長促進根圏微生物(PGPR)を選抜する。
<Example 2: Selection of plant growth promoting rhizosphere microorganisms (1)>
(the purpose)
A plant growth promoting rhizosphere microorganism (PGPR) is selected from the aquatic plant rhizosphere microorganism library prepared in Example 1.
(方法)
滅菌コウキクサを用いた無菌系で前記ライブラリー内の各水生植物根圏微生物について、コウキクサに対する成長促進効果を個別検証し、PGPRを選抜した。
(Method)
The growth promoting effect on duckweed was individually verified for each aquatic plant rhizosphere microorganism in the library in a sterile system using sterilized duckweed, and PGPR was selected.
前記ライブラリーから各水生植物根圏微生物をR2A培地に接種した。その後、25℃暗条件下で2週間培養した。 R2A medium was inoculated with each aquatic plant rhizosphere microorganism from the library. Then, it culture | cultivated on 25 degreeC dark conditions for 2 weeks.
植物培養用試験管(直径4cm、高さ13cm、専用キャップ使用; IWAKI社)に40mLのHoagland培地を入れて、121℃で20分間滅菌した。滅菌後のHoagland培地に、供試菌としての前記前培養液をOD600=0.3となるようにナイロンフロックスワブ(スギヤマゲン社)で接種した。続いて、無菌コウキクサ1株(葉状体2枚、根1本)をHoagland培地に移植し、25℃で16時間-Light(10000lux)/8時間-Darkで14日間栽培した。 40 mL of Hoagland medium was put in a plant culture test tube (diameter 4 cm, height 13 cm, using a special cap; IWAKI) and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. The sterilized Hoagland medium was inoculated with nylon floxwab (Sugia Magen) so that the preculture solution as a test bacterium had an OD 600 of 0.3. Subsequently, one sterile duckweed strain (2 fronds, 1 root) was transplanted to Hoagland medium and cultivated at 25 ° C. for 16 hours—Light (10000 lux) / 8 hours—Dark for 14 days.
なお、陰性対照として、水生植物根圏微生物の懸濁液を添加しない系を調製した。また、陽性対照として、PGPRであることが既に公知(Yamaga F. et al., 2010, Environ. Sci. Technol. 44, 6470-6474)の受託番号NITE P-523のAcinetobacter calcoaceticus P23株の懸濁液を添加した系を調製した。 As a negative control, a system in which no suspension of aquatic plant rhizosphere microorganisms was added was prepared. Moreover, as a positive control, suspension of Acinetobacter calcoaceticus P23 strain under the accession number NITE P-523 of PGPR already known (Yamaga F. et al., 2010, Environ. Sci. Technol. 44, 6470-6474) A system to which the liquid was added was prepared.
栽培開始後0日目、3日目、7日目、10日目、及び14日目の葉状体数をカウントした。コウキクサの成長促進効果の評価方法は、栽培14日目の陰性対照における葉状体数に対する、供試菌を添加した各系の葉状体数の比を算出し、既知のPGPRであるP23株と同等以上の値となる株を選抜した。
The number of fronds on
(結果)
結果を図1に示す。本選抜によってPGPRとして、新たに4種の菌株(MRB1株, MRB2株, MRB3株, MRB4株)が得られた。14日間栽培後の陰性対照(コントロール)に対するMRB1株、MRB2株、MRB3株、MRB4株及びP23株のコウキクサの成長促進効果は、それぞれ3.6倍、3.4倍、4.6倍、2.9倍、及び2.3倍であった。これら5株を本発明の水生植物根圏微生物候補とした。
(result)
The results are shown in FIG. As a result of this selection, four new strains (MRB1, MRB2, MRB3 and MRB4) were obtained as PGPR. The growth promotion effect of duckweed of MRB1, MRB2, MRB3, MRB4 and P23 strains against negative control after 14 days cultivation is 3.6 times, 3.4 times, 4.6 times, 2.9 times and 2.3 times respectively. there were. These five strains were designated as aquatic plant rhizosphere microorganism candidates of the present invention.
<実施例3:新たに単離したPGPRの分類(1)>
(目的)
実施例2で新たに得た4種のPGPR(MRB1株, MRB2株, MRB3株, MRB4株)の分類を行う。
<Example 3: Classification of newly isolated PGPR (1)>
(the purpose)
The four types of PGPR (MRB1, MRB2, MRB3, MRB4) newly obtained in Example 2 are classified.
(方法)
各PGPRの16S rRNA遺伝子の塩基配列を解析した。各PGPRの菌体を寒天培地上から滅菌ナイロンスワブで回収し、Fast DNA SPIN Kit for Soil(Q-biogene)を用いて、添付のプロトコルに従いDNAを抽出した。
(Method)
The base sequence of 16S rRNA gene of each PGPR was analyzed. The cells of each PGPR were recovered from the agar medium with a sterile nylon swab, and DNA was extracted using the Fast DNA SPIN Kit for Soil (Q-biogene) according to the attached protocol.
続いて、フォワードプライマーとしてBacteria 10f(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG:配列番号1)、リバースプライマーとしてUniversal 1492r-mix2(TACGGHTACCTTGTTACGACTT:配列番号2)を用いて95℃-2分で熱変性後、(95℃-30秒, 56℃-30秒,72℃1.5分)を35サイクルで反応を行い、各PGPRの16S rRNA領域を増幅した。 Subsequently, using Bacteria 10f (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG: SEQ ID NO: 1) as a forward primer and Universal 1492r-mix2 (TACGGHTACCTTGTTACGACTT: SEQ ID NO: 2) as a reverse primer, heat denaturation at 95 ° C.-2 minutes, (95 ° C.-30 seconds, The reaction was carried out in 35 cycles at 56 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1.5 minutes to amplify the 16S rRNA region of each PGPR.
AMPure(登録商標)(ベックマン)を用いて、添付のプロトコルに従い、PCR反応産物を精製した後、Big Dye Sequencing kit (life technologies)を用いて、添付のプロトコルに従い、シークエンス反応を行った。シークエンス反応プライマーには、Bacteria 10f(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG:配列番号3)、Universal 787f(ATTAGATACCCNGGTAG:配列番号4)、Universal 909f(ACTYAAAKGAATTGRCGGGGT:配列番号5)、Universal 907r(CCGYCAATTCMTTTRAGTTT:配列番号6)、及びUniversal 1492r(TACGGHTACCTTGTTACGACTT:配列番号7)を用いた。反応後の産物をClean Kit(登録商標)(ベックマン社)で精製後、シークセンサー(ABI 3130xl Genetic Analyzer;life technologies社)を用いてシークエンシングを行った。 The PCR reaction product was purified using AMPure (registered trademark) (Beckman) according to the attached protocol, and then sequence reaction was performed using Big Dye Sequencing kit (life technologies) according to the attached protocol. Sequence reaction primers include Bacteria 10f (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG: SEQ ID NO: 3), Universal 787f (ATTAGATACCCNGGTAG: SEQ ID NO: 4), Universal 909f (ACTYAAAKGAATTGRCGGGGT: SEQ ID NO: 5), Universal 907r (CCGYCAATTCMTTTRAGTTT: SEQ ID NO: 6), and Universal 1492 TACGGHTACCTTGTTACGACTT: SEQ ID NO: 7) was used. The product after the reaction was purified with Clean Kit (registered trademark) (Beckman) and then sequenced using a seek sensor (ABI 3130xl Genetic Analyzer; life technologies).
得られた塩基配列情報をATGCソフトウェア(ゼネティクス社)でトリミングならびにアセンブリし、BLAST検索により遺伝子配列の相同性解析を実施して各分離株の近縁種を調べた。 The obtained nucleotide sequence information was trimmed and assembled with ATGC software (Genetics), and homologous analysis of the gene sequence was performed by BLAST search to examine related species of each isolate.
(結果)
表5に結果を示す。MRB1株とMRB3株は、ペロモナス サッカロフィラ(Pelomonas saccharophila)に近縁であることが判明した。そこで、それぞれPelomonas sp. MRB1株、及びPelomonas sp. MRB3株と命名した。また、MRB2株はドクドネラ(Dokdonella)sp. KIS28-6に比較的近縁であることが判明した。ただし、93.6%の相同性は同属としては低い値であり、MRB2株は、ドクドネラ属を含むキサントモナス科(Xanthomonadaceae)に属する新属の微生物の可能性もある。しかし、詳細な分類分析前であることから本明細書では前述のようにMRB2株をドクドネラ属の1種としてDokdonella sp. MRB2株と命名した。ただし、この株名は、便宜的なものであって、今後の分類分析により新属に属する種であることが判明した場合、その新たな属名への変更を何ら妨げるものではない。さらに、MRB4株はブラディリゾリウム シチシ(Bradyrhizobium cytisi)に近縁であることが判明した。そこで、Bradyrhizobium sp. MRB4株と命名した。
(result)
Table 5 shows the results. MRB1 strain and MRB3 strain were found to be closely related to Pelomonas saccharophila. Therefore, they were named Pelomonas sp. MRB1 strain and Pelomonas sp. MRB3 strain, respectively. The MRB2 strain was also found to be relatively close to Dokdonella sp. KIS28-6. However, the homology of 93.6% is a low value for the same genus, and the MRB2 strain may be a new genus of microorganisms belonging to the family Xanthomonadaceae including the genus Dokudonella. However, since it was before detailed classification analysis, in this specification, MRB2 strain was named as Dokdonella sp. However, this strain name is convenient and does not prevent any change to the new genus name if it is found that it belongs to a new genus by future classification analysis. Furthermore, MRB4 strain was found to be closely related to Bradyrhizobium cytisi. Therefore, it was named Bradyrhizobium sp. MRB4 strain.
<実施例4:宿主植物体におけるクロロフィル量の検証>
(目的)
新規PGPR(MRB1株, MRB2株, MRB3株, MRB4株)及び既知PGPRのP23株を施用した宿主植物は、図1で示すように成長促進効果が認められたが、それ以外にも宿主植物の葉色が濃くなる現象が観察された(図示せず)。そこで、これらのPGPRによる宿主植物のクロロフィル量増加作用について検証した。
<Example 4: Verification of chlorophyll amount in host plant>
(the purpose)
The host plants to which the new PGPR (MRB1, MRB2, MRB3, MRB4) and the known PGPR P23 strain were applied showed growth promoting effects as shown in FIG. A phenomenon in which the leaf color deepened was observed (not shown). Therefore, the effect of increasing the amount of chlorophyll in host plants by these PGPR was examined.
(方法)
実施例2における栽培14日目の各コウキクサの葉状体と根を70℃で24時間乾燥させた後、N,N-ジメチルホルムアミド5 mLに浸漬し、4℃/暗条件下で24時間抽出した。得られた上清についてR. J. Porraらの方法(Porra R. J. et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 975: 384-394)に従って、649 nmと665 nmの吸光度を測定した。測定した吸光度の値から以下の式を用いて全クロロフィル量(a+b)を算出した。
クロロフィル a (μg/mL)=13.5275×A665-5.2007×A649
クロロフィル b (μg/mL)=-7.0741×A665+22.4327×A649
(Method)
Each duckweed frond and root on day 14 of cultivation in Example 2 was dried at 70 ° C. for 24 hours, then immersed in 5 mL of N, N-dimethylformamide, and extracted at 4 ° C./dark conditions for 24 hours. . The absorbance at 649 nm and 665 nm was measured for the obtained supernatant according to the method of RJ Porra et al. (Porra RJ et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 975: 384-394). The total amount of chlorophyll (a + b) was calculated from the measured absorbance value using the following formula.
Chlorophyll a (μg / mL) = 13.5275 × A665-5.2007 × A649
Chlorophyll b (μg / mL) =-7.0741 × A665 + 22.4327 × A649
(結果)
結果を図2に示す。MRB1株、MRB2株、MRB3株、MRB4株又はP23株を施用したコウキクサは、それらを施用していない陰性対照のコウキクサよりもクロロフィル量が4倍以上増加することが示された。すなわち、MRB1株、MRB2株、MRB3株、MRB4株及びP23株は、PGPRの性質に加えて、宿主植物に対するクロロフィル量増加作用を有することが明らかとなった。通常のPGPRでは、このような作用はこれまで知られていない。そこで、クロロフィル量増加作用を有する上記5株のPGPRを本発明の水生植物根圏微生物として、以下の実施例に用いた。
(result)
The results are shown in FIG. It was shown that the amount of chlorophyll in the duckweed applied with MRB1, MRB2, MRB3, MRB4 or P23 increased more than 4 times than the negative control duckweed not applied. That is, it became clear that MRB1, MRB2, MRB3, MRB4, and P23 have an effect of increasing the amount of chlorophyll on the host plant in addition to the properties of PGPR. In normal PGPR, this effect has not been known so far. Therefore, the above five strains of PGPR having an action of increasing the amount of chlorophyll were used in the following examples as the aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention.
<実施例5:本発明の水生植物根圏微生物による低肥料濃度培地での宿主植物の成長効果(1)>
(目的)
本発明の水生植物根圏微生物(MRB1株、MRB2株、MRB3株、MRB4株及びP23株)は、図1で示すように、いずれも顕著な成長促進作用を宿主植物に付与することができた。そこで、これらの水生植物根圏微生物が低肥料濃度培地においても宿主植物に成長効果を付与し得るか否かを検証する。
<Example 5: Growth effect of host plant on medium of low fertilizer concentration by aquatic rhizosphere microorganisms of the present invention (1)>
(the purpose)
The aquatic plant rhizosphere microorganisms (MRB1, MRB2, MRB3, MRB4 and P23 strains) of the present invention were able to impart a remarkable growth promoting action to the host plant as shown in FIG. . Therefore, it is verified whether or not these aquatic plant rhizosphere microorganisms can impart a growth effect to a host plant even in a low fertilizer concentration medium.
(方法)
基本的な方法は、実施例2の方法に準じた。ただし、本実施例では、Hoagland培地を原液(×1:至適濃度培地)と、原液の5倍希釈液(×1/5:低肥料濃度培地)をそれぞれに対して使用した。
(Method)
The basic method was in accordance with the method of Example 2. However, in this example, Hoagland medium was used as a stock solution (× 1: optimal concentration medium) and a 5-fold diluted solution of the stock solution (× 1/5: low fertilizer concentration medium).
(結果)
結果を図3に示す。この図は、栽培14日目における陰性対照のコウキクサの葉状体数に対する、本発明の水生植物根圏微生物を施用したコウキクサの葉状体数の比を示している。本発明の水生植物根圏微生物を施用した場合、陰性対照よりも低肥料濃度培地で高い成長性が観察された。この結果から、本発明の水生植物根圏微生物は、低肥料濃度培地であっても宿主植物に成長促進効果を付与できることが立証された。
(result)
The results are shown in FIG. This figure shows the ratio of the number of fronds of duckweed applied with the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the number of fronds of the negative control duckweed on the 14th day of cultivation. When the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention was applied, higher growth was observed in the low fertilizer concentration medium than in the negative control. From this result, it was proved that the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention can impart a growth promoting effect to a host plant even in a low fertilizer concentration medium.
<実施例6:本発明の水生植物根圏微生物による低照度条件下での宿主植物の成長効果(1)>
(目的)
本発明の水生植物根圏微生物(MRB1株、MRB2株、MRB3株、MRB4株及びP23株)は、図2で示すように、いずれも顕著なクロロフィル量の増加効果を宿主植物に付与した。そこで、これらの水生植物根圏が低照度条件下においても宿主植物に成長効果を付与し得るか否かを検証する。
<Example 6: Growth effect of host plant under low illuminance condition by aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention (1)>
(the purpose)
The aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention (MRB1, MRB2, MRB3, MRB4 and P23 strains) all imparted a significant chlorophyll increase effect to the host plant as shown in FIG. Therefore, it is verified whether or not these aquatic plant rhizospheres can impart a growth effect to the host plant even under low illumination conditions.
(方法)
基本的な方法は、実施例2の方法に準じた。ただし、本実施例では、無菌コウキクサの栽培を、25000luxの高照度条件下と10000luxの低照度条件下で行った。
(Method)
The basic method was in accordance with the method of Example 2. However, in this example, aseptic duckweed was cultivated under a high illuminance condition of 25000 lux and a low illuminance condition of 10000 lux.
(結果)
結果を図4に示す。この図は、栽培14日目における陰性対照のコウキクサの葉状体数に対する、本発明の水生植物根圏微生物を施用したコウキクサの葉状体数の比を示している。本発明の水生植物根圏微生物を施用した場合、低照度条件下栽培の方が高照度条件下栽培よりも、むしろ高い成長性が観察された。この結果から、本発明の水生植物根圏微生物は、低照度条件下であっても宿主植物に成長促進効果を付与できることが立証された。これは、これらの水生植物根圏微生物を根圏に有する宿主植物がそれを有さない同種植物よりも弱い光照射で効率的に成長できることを示している。
(result)
The results are shown in FIG. This figure shows the ratio of the number of fronds of duckweed applied with the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the number of fronds of the negative control duckweed on the 14th day of cultivation. When the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention was applied, higher growth was observed when cultivated under low illuminance conditions than when cultivated under high illuminance conditions. From this result, it was proved that the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention can impart a growth promoting effect to the host plant even under low illumination conditions. This indicates that host plants having rhizospheres of these aquatic plant rhizosphere microorganisms can grow more efficiently with weaker light irradiation than homologous plants without them.
<実施例7:双子葉植物における本発明の水生植物根圏微生物によるクロロフィル量増加効果>
(目的)
上記実施例では、いずれも宿主植物として単子葉植物であるコウキクサを使用した。そこで、本実施例では、本発明の水生植物根圏微生物が双子葉植物に対しても同様の効果を有することを確認するため、双子葉植物に本発明の水生植物根圏微生物を施用したときのクロロフィル量増加効果について検証した。
<Example 7: Effect of increasing the amount of chlorophyll by the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention in a dicotyledonous plant>
(the purpose)
In the above examples, duckweed, which is a monocotyledonous plant, was used as the host plant. Therefore, in this example, when the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention is applied to the dicotyledonous plant, the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention is applied to the dicotyledonous plant. The effect of increasing the amount of chlorophyll was verified.
(材料)
宿主植物として、双子葉植物であるキク科(Asteraceae )植物のレタス(Lactuca sativa L. cv. Great Lakes)(アタリヤ農園)を使用した。
(material)
As a host plant, Asteraceae plant lettuce (Lactuca sativa L. cv. Great Lakes) (Atalya plantation), which is a dicotyledonous plant, was used.
(方法)
(1)種子の表面殺菌
滅菌水に0.05% 次亜塩素酸ナトリウム、0.02% TritonX-100となるように加えて、殺菌溶液を調製した。この溶液にレタスの種子(アタリヤ農園)入れて、上下に激しく攪拌した後、3〜5分静置した。その後、上清を除去し、滅菌水を加えて静かに攪拌して洗浄後、再び静置した。滅菌水による同様の洗浄を5回繰り返し、種子の表面殺菌を行った。
(Method)
(1) Surface sterilization of seeds A sterilizing solution was prepared by adding 0.05% sodium hypochlorite and 0.02% TritonX-100 to sterilized water. Lettuce seeds (Atalya plantation) were put into this solution, stirred vigorously up and down, and allowed to stand for 3 to 5 minutes. Thereafter, the supernatant was removed, sterilized water was added, gently agitated and washed, and then allowed to stand again. The same washing with sterilized water was repeated 5 times to sterilize the seed surface.
(2)種子の発芽
10倍希釈のHoagland寒天培地200 mL(pH6.0)を入れたプラントボックス(72mm×72mm×100 mm)(インキティッシュ SPL-310072; バイオメディカルサイエンス社)に、表面殺菌後の種子を播種した。プラントボックスの蓋には直径10 mmの穴を開け、その穴にミリシール(FWMS01800; アズワン社)を貼付して、栽培に用いた。プラントボックスを人工気象器(LPH-240S日本医化器械製作所)内に入れて、25℃で、湿度70%、6000lux、16時間 Light / 8時間 Darkの栽培条件で7日間栽培した。
(2) Germination of seeds
The plant box (72 mm × 72 mm × 100 mm) (ink tissue SPL-310072; Biomedical Science Co., Ltd.) containing 200 mL of Hoagland agar medium diluted 10 times (pH 6.0) was sown with seeds after surface sterilization. A hole with a diameter of 10 mm was formed in the lid of the plant box, and a milliseal (FWMS01800; ASONE Co., Ltd.) was attached to the hole and used for cultivation. The plant box was placed in an artificial meteorograph (LPH-240S Nippon Medical Instrument Co., Ltd.) and cultivated for 7 days at 25 ° C, humidity 70%, 6000lux, 16 hours Light / 8 hours Dark.
(3)水耕栽培
3〜4葉の幼苗を水耕栽培に移植した。水耕栽培は、プラスチック製の角形容器(ハイパックS-38;エンテック社)に黒ビニールテープを巻いたものを用い、水耕液にはHoagland培地(pH 6.0)を10倍又は100倍希釈して1500 mL用いた。各培地には、P23株又は大腸菌(E. coli)を終濁度OD600=0.3 (108 cfu/mL)で接種したもの、又は菌を添加しないもの(菌非接種条件)をそれぞれ調製した。茎と根の境目をスポンジ(1.5 cm3)で挟み、容器の蓋に空けた直径10 mmの穴に差し込み、上記人工気象器を用いて同一栽培条件で7日間栽培した。栽培後、根を洗浄し、無菌Hoagland培地でさらに7日間栽培した。
(3) Hydroponics
3-4 leaf seedlings were transplanted to hydroponics. Hydroponics uses a plastic square container (Hipack S-38; Entec Co., Ltd.) wrapped with black vinyl tape. The hydroponics solution is diluted 10-fold or 100-fold with Hoagland medium (pH 6.0). 1500 mL was used. Each medium was prepared by inoculating the P23 strain or E. coli with a turbidity OD 600 = 0.3 (10 8 cfu / mL) or without adding bacteria (non-inoculation conditions). . The boundary between the stem and the root was sandwiched between sponges (1.5 cm 3 ), inserted into a hole with a diameter of 10 mm in the lid of the container, and cultivated for 7 days under the same cultivation conditions using the above artificial meteorograph. After cultivation, the roots were washed and cultivated in sterile Hoagland medium for an additional 7 days.
(4)クロロフィル量の測定
炭酸カルシウム0.2 gに4℃の99.5%エタノール50 mL加えた後、7500 rpm、4℃で10分間遠心分離し、不溶性画分を除去した溶液をクロロフィル抽出溶液として使用した。一穴パンチを用いてレタスの第8葉を直径5 mmの円状に切り取った後、クロロフィル抽出溶液を1 mL加えて、マルチビーズショッカー(MB755U(S);安井器械社)を用いて2500 rpm、60秒で粉砕した。得られた抽出液を12000 rpm、4℃で10分間遠心分離した後、上清を採取し、649 nmと665 nmの吸光度を測定した。測定した吸光度の値から以下の式用いてクロロフィル量(a+b)を算出した。
クロロフィル a (μg/mL)=13.5275×A665-5.2007×A649
クロロフィル b (μg/mL)=-7.0741×A665+22.4327×A649
測定した湿重量からmg/100 g(湿重量)の単位に換算し求めた。
(4) Measurement of the amount of chlorophyll After adding 50 mL of 99.5% ethanol at 4 ° C to 0.2 g of calcium carbonate, it was centrifuged at 7500 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the solution from which the insoluble fraction was removed was used as the chlorophyll extraction solution. . After cutting out the 8th leaf of lettuce into a 5 mm diameter circle using a single-hole punch, add 1 mL of chlorophyll extraction solution and use a multi-bead shocker (MB755U (S); Yasui Kikai Co., Ltd.) at 2500 rpm. Crushed in 60 seconds. The obtained extract was centrifuged at 12000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and then the supernatant was collected and the absorbance at 649 nm and 665 nm was measured. The amount of chlorophyll (a + b) was calculated from the measured absorbance using the following formula.
Chlorophyll a (μg / mL) = 13.5275 × A665-5.2007 × A649
Chlorophyll b (μg / mL) =-7.0741 × A665 + 22.4327 × A649
The measured wet weight was converted to a unit of mg / 100 g (wet weight).
(結果)
結果を図5に示す。菌非接種のコントロール及び大腸菌接種のレタスと比較してP23株接種のレタスではクロロフィル量が増加した。
(result)
The results are shown in FIG. The amount of chlorophyll was increased in lettuce inoculated with the P23 strain compared to the non-inoculated control and lettuce inoculated with E. coli.
この結果からP23株は、単子葉植物だけでなく双子葉植物に対してもクロロフィル量増加作用を有することが明らかとなった。一方、大腸菌接種のレタスではクロロフィル量が菌非接種のコントロールよりも逆に減少し、葉色が薄くなった(図示せず)。この結果から本発明の水生植物根圏微生物の施用とクロロフィル量の増加との間には相関があり、クロロフィル量の増加が不特定の微生物の施用による非特異的な効果ではないことが立証された。 From these results, it was revealed that the P23 strain has an effect of increasing the amount of chlorophyll not only on monocotyledons but also on dicotyledons. On the other hand, in lettuce inoculated with Escherichia coli, the amount of chlorophyll decreased in contrast to the non-inoculated control, and the leaf color became lighter (not shown). From this result, there is a correlation between the application of the aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention and the increase in the amount of chlorophyll, and it is proved that the increase in the amount of chlorophyll is not a non-specific effect due to the application of unspecified microorganisms. It was.
<実施例8:非水生植物の根圏における本発明の水生植物根圏微生物の生息状況>
(目的)
本発明の水生植物根圏微生物が非水生植物の根圏にも生息し得ることを実施例7で用いたレタスで確認する。
<Example 8: Inhabiting situation of aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention in the rhizosphere of non-aquatic plants>
(the purpose)
The lettuce used in Example 7 confirms that the aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention can also inhabit the rhizosphere of non-aquatic plants.
(方法)
実施例7で使用したレタスのうち、菌非接種のレタスとP23株接種のレタス主根を蛍光顕微鏡で観察した。レタス主根は、菌液に浸漬して7日間栽培した後、根を洗浄し、無菌培地でさらに7日間栽培したものを用いた。レタスの主根を軽く洗浄した後、生存バクテリアを緑色蛍光標識することのできるLIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (登録商標)(life technologies社)を用いて染色した。具体的な方法は、添付のプロトコルに従った。その後、蛍光顕微鏡BZ9000 (キーエンス社)で観察した。
(Method)
Among the lettuce used in Example 7, lettuce not inoculated with the fungus and main root of lettuce inoculated with the P23 strain were observed with a fluorescence microscope. The lettuce main roots were soaked in a bacterial solution and cultivated for 7 days, then the roots were washed and cultivated in a sterile medium for another 7 days. The main root of lettuce was lightly washed, and then the live bacteria were stained using a LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (registered trademark) (life technologies) capable of fluorescent labeling in green. The specific method followed the attached protocol. Then, it observed with the fluorescence microscope BZ9000 (Keyence Corporation).
(結果)
結果を図6に示す。Aは菌非接種のレタス主根の一部の、またBはP23株接種のレタス主根の一部の、蛍光画像である。A及びBにおいて根全体に散在し、図中、矢頭で示す小スポット(カラー図では赤色蛍光スポットに相当)は、自家蛍光しているクロロプラストを示す。また、Bにおいて、根表面で蛍光スポットが集積した部分(カラー図では緑色蛍光スポットに相当)は、根表面に付着した生存状態のP23株の集団(マイクロコロニー)を示す。Bから、非水生植物であっても水生植物根圏微生物は、その根圏に生息し得ることが立証された。
(result)
The results are shown in FIG. A is a fluorescence image of a part of a lettuce main root not inoculated with a fungus, and B is a part of a lettuce main root inoculated with a P23 strain. In A and B, the small spots (corresponding to red fluorescent spots in the color diagram) scattered throughout the roots and indicated by arrowheads in the figure indicate chloroplasts that are autofluorescent. Further, in B, the part where the fluorescent spots are accumulated on the root surface (corresponding to the green fluorescent spot in the color diagram) indicates a population (microcolony) of the P23 strain in a living state attached to the root surface. B proved that the rhizosphere microorganisms of aquatic plants can inhabit the rhizosphere even in non-aquatic plants.
また、菌非接種条件のAと比較してP23株接種のBでは、根全体に散在する小スポット数、すなわちクロロプラス数が多いことがわかる。これは、P23株を接種したレタスでクロロフィル量が増加した実施例7の結果とも矛盾しない。 Moreover, it can be seen that the number of small spots scattered throughout the root, that is, the number of chloropluses, is larger in B of the P23 strain inoculated than A in the non-inoculated condition. This is consistent with the result of Example 7 in which the amount of chlorophyll was increased in lettuce inoculated with the P23 strain.
<実施例9:イネ科植物における本発明の水生植物根圏微生物による成長促進効果及びクロロフィル量増加効果>
(目的)
本発明の水生植物根圏微生物が代表的な穀類でもあるイネ科植物のイネにおいても成長促進とクロロフィル量増加に関して、同じ単子葉植物のコウキクサと同様の効果が見られることを確認した。
<Example 9: Growth promotion effect and chlorophyll amount increase effect by aquatic plant rhizosphere microorganisms of the present invention in Gramineae>
(the purpose)
It was confirmed that the same effect as the duckweed of the same monocotyledonous plant was observed with respect to growth promotion and chlorophyll amount increase in rice of the grass family, which is also a representative cereal of the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention.
(材料)
宿主植物にはイネ(Oryza sativa)(農業生物資源ジーンバンクより入手)を使用した。
(material)
Rice (Oryza sativa) (obtained from Agrobiological Genebank) was used as the host plant.
(方法)
(1)種子の表面殺菌
滅菌水に0.05% 次亜塩素酸ナトリウム、0.02% TritonX-100となるように加えて、殺菌溶液を調製した。この溶液にイネの種子入れて、上下に激しく攪拌した後、3〜5分静置した。その後、上清を除去し、滅菌水を加えて静かに攪拌して洗浄後、再び静置した。滅菌水による同様の洗浄を5回繰り返し、種子の表面殺菌を行った。
(Method)
(1) Surface sterilization of seeds A sterilizing solution was prepared by adding 0.05% sodium hypochlorite and 0.02% TritonX-100 to sterilized water. Rice seeds were put into this solution and stirred vigorously up and down, and then allowed to stand for 3 to 5 minutes. Thereafter, the supernatant was removed, sterilized water was added, gently agitated and washed, and then allowed to stand again. The same washing with sterilized water was repeated 5 times to sterilize the seed surface.
(2)種子の発芽
表面殺菌後の種子を40〜50℃のインキュベーターで5日間乾燥させて休眠打破を行った。その後、種子を水に浸し、遮光下にて30℃で3〜5日間静置して、発根させた。発根した種子を25℃、70%の相対湿度下において0.5mM CaCl2溶液に7日間浸漬し、発芽させた。
(2) Seed germination The seed after surface sterilization was dried in an incubator at 40 to 50 ° C for 5 days to break the dormancy. Thereafter, the seeds were immersed in water and allowed to stand at 30 ° C. for 3 to 5 days under light shielding to root. The rooted seeds were immersed in a 0.5 mM CaCl 2 solution at 25 ° C. and 70% relative humidity for 7 days to germinate.
(3)水耕栽培
3〜4葉の幼苗を水耕培地に移植した。水耕液には水で10倍に希釈したKimura B培地(0.35 mM (NH4)2S04, 0.54 mM KNO3, 0.17 mM Na2HPO4, 0.18 mM Ca(NO3)2, 0.19 mM CaCl2, 0.47 mM MgSO4, 4.5×10-2 mM Fe-Citrate, 4.6×10-3 mM MnSO4, 18.8×10-3 mM H3BO4, 1.0×10-4 mM (Na2)6Mo04 , 1.5×10-4 mM ZnSO4, 1.6×10-4 mM CuSO4, 2 mM MES [pH5.7])を用いた。28℃、70%の相対湿度下において16時間-Light(20300lux)/8時間-Darkの条件下で7日間、前栽培した。
(3) Hydroponics
3-4 leaf seedlings were transplanted to hydroponic medium. Kimura B medium diluted 0.3 times with water (0.35 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.54 mM KNO 3 , 0.17 mM Na 2 HPO 4 , 0.18 mM Ca (NO 3 ) 2 , 0.19 mM CaCl 2 , 0.47 mM MgSO 4 , 4.5 × 10 -2 mM Fe-Citrate, 4.6 × 10 −3 mM MnSO 4 , 18.8 × 10 −3 mM H 3 BO 4 , 1.0 × 10 −4 mM (Na 2 ) 6 Mo0 4 1.5 × 10 −4 mM ZnSO 4 , 1.6 × 10 −4 mM CuSO 4 , 2 mM MES [pH5.7]). Pre-cultured under conditions of 28 hours at 70% relative humidity for 16 hours-Light (20300 lux) / 8 hours-Dark for 7 days.
続いて、苗根を細菌溶液に1日間浸漬し、細菌を接種した。細菌溶液には、水生植物根圏微生物であるP23株又は非水生植物根圏微生物(Acinetobacter sp. LB3)(本明細書ではしばしば「LB3(株)」と略称する)を終濁度OD600=0.3 (108 cfu/mL)となるように調製した懸濁液を使用した。菌を添加しない培地に1日間浸漬したサンプルも陰性対照として調製した。接種後、10倍希釈したKimura B培地で根部を2回洗浄し、前栽培と同様に、それぞれ1倍の、又は10倍希釈した、Kimura B培地で16時間-Light(20,300 lux)/8時間-Darkの条件下で15日間本栽培した。 Subsequently, the seedling roots were immersed in a bacterial solution for 1 day and inoculated with bacteria. In the bacterial solution, P23 strain which is an aquatic plant rhizosphere microorganism or non-aquatic plant rhizosphere microorganism (Acinetobacter sp. LB3) (often abbreviated as “LB3 (strain)” in the present specification) has a turbidity OD 600 = A suspension prepared to 0.3 (10 8 cfu / mL) was used. A sample immersed for 1 day in a medium to which no bacteria were added was also prepared as a negative control. After inoculation, the roots were washed twice with 10-fold diluted Kimura B medium, and 16-light-light (20,300 lux) / 8 hours with Kimura B medium diluted 1-fold or 10-fold, respectively, as in the previous cultivation -Main cultivation for 15 days under Dark conditions.
(4)地上部草丈及び葉数の測定
本栽培2日、3日、4日、6日、9日、11日、13日及び15日後に地上部の草丈を測定した。また、本栽培14日後の1株あたりの葉数を測定した。
(4) Measurement of the above-ground plant height and the number of leaves The plant height of the above-ground portion was measured after 2 days, 3 days, 4 days, 6 days, 9 days, 11 days, 13 days and 15 days of main cultivation. In addition, the number of leaves per strain 14 days after the main cultivation was measured.
(5)クロロフィル量の測定
葉のクロロフィル量の測定には、Chlorophyll monitor SPAD-502plus (KONICA)を用いた。測定場所は全ての葉の中央部であり、測定方法は所定の方法に従った。
(5) Measurement of chlorophyll amount Chlorophyll monitor SPAD-502plus (KONICA) was used to measure the chlorophyll amount of leaves. The measurement place was the central part of all leaves, and the measurement method followed a predetermined method.
(結果)
イネ地上部草丈の成長を図7に、1株当たりの葉数を図8に、そしてクロロフィル量を図9に示す。
(result)
Fig. 7 shows the growth of rice plant height, Fig. 8 shows the number of leaves per strain, and Fig. 9 shows the amount of chlorophyll.
図7で示すように、イネの栽培で通常使用する1×Kimura B培地を10倍に希釈した低濃度肥料培地を使用した場合、P23株を接種したイネでは、LB3株を接種したイネや菌非接種のイネと比較して有意に草丈が高かった。また、図8で示すように、1株当たりの葉数もP23株を接種したイネでは、LB3株を接種したイネや菌未接種のイネよりも有意に多かった。これらの結果から、本発明の水生植物根圏微生物を接種した場合には、単子葉植物はウキクサのみならず、イネ科植物であっても低濃度肥料培地で高い成長率を維持できることが立証された。 As shown in Fig. 7, when a low-concentration fertilizer medium diluted 10 times with 1x Kimura B medium normally used for rice cultivation is used, rice and fungi inoculated with LB3 strain are inoculated with rice P23. The plant height was significantly higher than that of non-inoculated rice. In addition, as shown in FIG. 8, the number of leaves per strain was significantly higher in rice inoculated with the P23 strain than in rice inoculated with the LB3 strain and in rice not inoculated with the fungus. From these results, when inoculating the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention, it is proved that the monocotyledonous plant can maintain a high growth rate in a low-concentration fertilizer medium even if it is a duckweed or a gramineous plant. It was.
さらに図9で示すように、LB3株を接種したイネや菌非接種のイネと比較してP23株接種のイネでは、クロロフィル量が有意に増加した。この結果からP23株は、ウキクサやレタスと同様に、イネにおいてもクロロフィル量増加作用を有することが明らかとなった。 Furthermore, as shown in FIG. 9, the amount of chlorophyll was significantly increased in the rice inoculated with the P23 strain compared to the rice inoculated with the LB3 strain and the rice not inoculated with the fungus. From these results, it was clarified that the P23 strain has an effect of increasing the amount of chlorophyll in rice as well as duckweed and lettuce.
<実施例10:本発明の水生植物根圏微生物による低肥料濃度培地での宿主植物の成長効果(2)>
(目的)
実施例5で検証した低肥料濃度培地における宿主植物の成長効果について、さらに肥料濃度が低い培地であっても本発明の水生植物根圏微生物が宿主植物に成長効果を付与し得るか否かを検証する。
<Example 10: Growth effect of host plant on medium of low fertilizer concentration by aquatic rhizosphere microorganisms of the present invention (2)>
(the purpose)
Regarding the growth effect of the host plant in the low fertilizer concentration medium verified in Example 5, whether or not the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention can impart the growth effect to the host plant even if the fertilizer concentration is low. Validate.
(方法)
基本的な方法は、実施例5の方法に準じた。ただし、本実施例では、Hoagland培地の50倍希釈液(×1/50)及び100倍希釈液(×1/100)を使用した。また水生植物根圏微生物にはMRB3株及びP23株を用いた。
(Method)
The basic method was in accordance with the method of Example 5. However, in this example, Hoagland medium 50-fold diluted solution (× 1/50) and 100-fold diluted solution (× 1/100) were used. MRB3 strain and P23 strain were used as aquatic plant rhizosphere microorganisms.
(結果)
結果を図10に示す。この図は、栽培14日目における陰性対照のコウキクサの葉状体数に対する、本発明の水生植物根圏微生物を施用したコウキクサの葉状体数の比を示している。本発明の水生植物根圏微生物を施用した場合には、Hoagland培地を50倍又は100倍に希釈した極めて低濃度の肥料培地であっても陰性対照と比較して高い成長性が確認された。この結果から、本発明の水生植物根圏微生物を接種した植物は、低肥料環境下であっても生育ができることが示唆された。これは、肥料コストの削減が可能であることを示唆している。
(result)
The results are shown in FIG. This figure shows the ratio of the number of fronds of duckweed applied with the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the number of fronds of the negative control duckweed on the 14th day of cultivation. When the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention was applied, even if it was a fertilizer medium having a very low concentration in which the Hoagland medium was diluted 50-fold or 100-fold, high growth was confirmed as compared with the negative control. From this result, it was suggested that the plant inoculated with the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention can grow even in a low fertilizer environment. This suggests that fertilizer costs can be reduced.
<実施例11:本発明の水生植物根圏微生物による低照度条件下での宿主植物の成長効果(2)>
(目的)
実施例6で検証した低照度条件下での宿主植物の成長効果について、さらに照度が低い条件下で成長効果を付与し得るか否かを検証する。
<Example 11: Growth effect of host plant under low illuminance conditions by the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention (2)>
(the purpose)
The growth effect of the host plant under the low illuminance conditions verified in Example 6 will be verified as to whether or not the growth effect can be imparted under conditions where the illuminance is low.
(方法)
基本的な方法は、実施例6の方法に準じた。ただし、本実施例では、無菌コウキクサの栽培を5000luxの低照度条件下で行った。また水生植物根圏微生物にはMRB3株及びP23株を用いた。
(Method)
The basic method was in accordance with the method of Example 6. However, in this example, cultivation of aseptic duckweed was performed under a low illuminance condition of 5000 lux. MRB3 strain and P23 strain were used as aquatic plant rhizosphere microorganisms.
(結果)
結果を図11に示す。この図は、栽培14日目における陰性対照のコウキクサの葉状体数に対する、本発明の水生植物根圏微生物を施用したコウキクサの葉状体数の比を示している。5000luxの低照度条件下であってもMRB3株又はP23株を接種したコウキクサでは、陰性対照と比較して高い成長性を維持していることが確認された。これは、植物工場において栽培する植物の成長を維持しながら、光源の消費電力を抑制できることを示唆している。
(result)
The results are shown in FIG. This figure shows the ratio of the number of fronds of duckweed applied with the aquatic plant rhizosphere microorganism of the present invention to the number of fronds of the negative control duckweed on the 14th day of cultivation. It was confirmed that the duckweed inoculated with MRB3 strain or P23 strain maintained high growth ability compared with the negative control even under low light conditions of 5000 lux. This has suggested that the power consumption of a light source can be suppressed, maintaining the growth of the plant cultivated in a plant factory.
<実施例12:植物成長促進根圏微生物の選抜(2)>
(目的)
実施例1に記載の方法に準じて新たに作製した水生植物根圏微生物ライブラリーから成長促進効果の高い植物成長促進根圏微生物(PGPR)を選抜する。
<Example 12: Selection of plant growth promoting rhizosphere microorganisms (2)>
(the purpose)
A plant growth promoting rhizosphere microorganism (PGPR) having a high growth promoting effect is selected from a newly prepared aquatic plant rhizosphere microorganism library according to the method described in Example 1.
(方法)
基本的な方法は、新たな水生植物根圏微生物ライブラリーの作製方法は実施例1に、また植物成長促進根圏微生物の選抜方法は実施例2に、準じた。滅菌コウキクサを用いた無菌系で前記ライブラリー内の各水生植物根圏微生物について、コウキクサに対する成長促進効果を個別検証し、P23株よりも高い成長促進効果を有する微生物を新たなPGPRとして選抜した。
(Method)
The basic method was the same as in Example 1 for preparing a new aquatic plant rhizosphere microorganism library, and Example 2 for the method of selecting plant growth promoting rhizosphere microorganisms. For each aquatic plant rhizosphere microorganism in the library in a sterile system using sterilized duckweed, the growth promoting effect on duckweed was individually verified, and a microorganism having a growth promoting effect higher than that of the P23 strain was selected as a new PGPR.
(結果)
結果を図12に示す。本選抜によってPGPRとして、新たに3種の菌株(MRB5株, MRB6株, MRB7株)が得られた。これらの菌株は、葉状体数に関してP23株の約1.5倍の成長促進効果がみられた。
(result)
The results are shown in FIG. As a result of this selection, three new strains (MRB5 strain, MRB6 strain, MRB7 strain) were obtained as PGPR. These strains showed a growth promoting effect about 1.5 times that of the P23 strain in terms of the number of fronds.
<実施例13:新たに単離したPGPRの分類(2)>
(目的)
実施例11で新たに得た3種のPGPR(MRB5株〜MRB7株)を16S rRNAの塩基配列に基づき分類を行う。
<Example 13: Classification of newly isolated PGPR (2)>
(the purpose)
The three types of PGPR (MRB5 strain to MRB7 strain) newly obtained in Example 11 are classified based on the base sequence of 16S rRNA.
(方法)
基本的な方法は、実施例3に準じた。
(Method)
The basic method was in accordance with Example 3.
(結果)
表6に結果を示す。MRB5株は、キトファギア綱(Cytophagia)のクリセオリネア セルペンス(Chryseolinea serpens)に最も近縁である。しかし、その相同性は90.1%に過ぎない。本発明者らの研究によりMRB5株はキトファギア綱に属する新属新種の微生物であることが確実視されているものの、目や科レベルの帰属については現在のところ不明である。そこで、本明細書では、便宜的にCytophagia微生物MRB5株と命名した。また、MRB6株はラキバクター カウエンシス(Lacibacter cauensis) NJ-8株に最も近縁であることが判明した。しかし、89.0%の相同性は、同属としては非常に低い値である。それ故、MRB6株はLacibacter cauensisと同じスフィンゴバクテリア綱(Sphingobacteria)スフィンゴバクテリアレス目(Sphingobacteriales)キチノファガセアエ科(Chitinophagaceae)に属する新属新種の微生物である可能性が極めて高い。しかし、詳細な分類分析前であるため本明細書では前述のようにMRB6株をラキバクター属の1種として取扱い、Lacibacter sp. MRB6株と命名した。ただし、この株名は、便宜的なものであって、今後の分類分析により新属に属する種であることが判明した場合、その新たな属名への変更を何ら妨げるものではない。さらに、MRB7株はウンディバクテリウム オリゴカルボニフィルム(Undibacterium oligocarboniphilum)EM1株に最も近縁であることが判明した。しかし、93.7%の相同性も同属としては低い値である。したがって、MRB7株もUndibacterium oligocarboniphilumと同じベータプロテオバクテリア綱(Betaproteobacteria)ブルクホルデリアレス目(Burkholderiales)オキサロバクテラセアエ科(Oxalobacteraceae)に属する新属新種の微生物の可能性が非常に高い。しかし、詳細な分類分析前であるため本明細書では前述のようにMRB7株をウンディバクテリウム属の1種として取扱い、Undibacterium sp. MRB7株と命名した。ただし、この株名は、便宜的なものであって、今後の分類分析により新属に属する種であることが判明した場合、その新たな属名への変更を何ら妨げるものではない。
(result)
Table 6 shows the results. The MRB5 strain is most closely related to the Cytophagia Chryseolinea serpens. However, its homology is only 90.1%. Although the research by the present inventors has confirmed that MRB5 strain is a microorganism of a new genus and new species belonging to the class of chitophagia, the attribution of the eyes and family level is currently unknown. Therefore, in this specification, the Cytophagia microorganism MRB5 strain was named for convenience. In addition, MRB6 strain was found to be most closely related to Lacibacter cauensis NJ-8 strain. However, the homology of 89.0% is very low for the genus. Therefore, the MRB6 strain is very likely to be a new genus and new species of microorganism belonging to the order of Sphingobacteriales, Sphingobacteriales and Chitinophagaceae as Lacibacter cauensis. However, since it was before detailed classification analysis, the MRB6 strain was treated as a member of the genus Rakibacter as described above and named Lacibacter sp. MRB6 strain in the present specification. However, this strain name is convenient and does not prevent any change to the new genus name if it is found that it belongs to a new genus by future classification analysis. Furthermore, the MRB7 strain was found to be most closely related to the Undibacterium oligocarboniphilum EM1 strain. However, the homology of 93.7% is also a low value for the same genera. Therefore, the MRB7 strain is also highly likely to be a new genus of new microorganisms belonging to the same Betaproteobacteria Burkholderiales family Oxalobacteraceae as Undibacterium oligocarboniphilum. However, since it was before detailed classification analysis, the MRB7 strain was treated as one of the genus Undibacterium as described above and named Undibacterium sp. MRB7 strain in this specification. However, this strain name is convenient and does not prevent any change to the new genus name if it is found that it belongs to a new genus by future classification analysis.
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