JP6422889B2 - Cell peeling method, cell supporting substrate, and cell culturing method - Google Patents

Cell peeling method, cell supporting substrate, and cell culturing method Download PDF

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Description

本発明は、細胞の剥離方法、細胞支持用基材、並びに、細胞の培養方法に関する。本発明は、ｉＰＳ細胞等の培養、回収、選別、分析などに有用なものである。   The present invention relates to a cell detachment method, a cell support substrate, and a cell culture method. The present invention is useful for culturing, collecting, selecting, analyzing and the like of iPS cells and the like.

従来より、支持体上で増殖させた接着性細胞を剥離する場合に、トリプシン処理がよく行われている。すなわち、支持体に接着した細胞をトリプシン溶液に晒して細胞表面を処理し、細胞を剥離する。トリプシン処理により、細胞が支持体から剥離するとともに、細胞同士の接着も壊され、基本的に個々の細胞が独立して懸濁した状態（single cell suspension）となる。   Conventionally, trypsin treatment is often performed when the adherent cells grown on a support are peeled off. That is, the cells adhered to the support are exposed to a trypsin solution to treat the cell surface, and the cells are detached. By trypsin treatment, the cells are detached from the support, and the adhesion between the cells is broken, so that the individual cells are basically in a single cell suspension.

一方、トリプシン処理によって細胞に与えられる損傷が問題視されている。例えば、細胞がトリプシンに晒されることにより、細胞表面の受容体が損傷を受けることがある。そのため、細胞の生存率が下がってしまう。したがって、基材に接着した細胞を回収する場合において、細胞表面にできるだけ損傷を受けていない細胞を回収したいという要望がある。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を継代等する場合には、シングルセルではなく、コロニーの状態で行うことが好ましいとされている。そのため、細胞間結合がある程度保持されるような穏やかな条件で、細胞の剥離を行いたいという要望がある。   On the other hand, damage given to cells by trypsin treatment is regarded as a problem. For example, exposure of cells to trypsin can damage cell surface receptors. As a result, the cell viability decreases. Therefore, when collecting the cells adhered to the substrate, there is a desire to collect cells that are not damaged as much as possible on the cell surface. Further, when iPS cells or ES cells are passaged, it is preferable to carry out in a colony state instead of a single cell. For this reason, there is a demand for detachment of cells under mild conditions that maintain a certain degree of cell-cell bonding.

トリプシンを用いずに支持体から細胞を剥離する技術として、例えば、特許文献１に記載の技術がある。特許文献１には、光ファイバに付着させた細胞に紫外線等の光を当てて、光ファイバから細胞を取り除く技術が開示されている。しかし、この技術は不要な細胞を除去するためのものであり、剥離した細胞の損傷については考慮されていない。   As a technique for peeling cells from a support without using trypsin, for example, there is a technique described in Patent Document 1. Patent Document 1 discloses a technique for removing cells from an optical fiber by applying light such as ultraviolet rays to cells attached to the optical fiber. However, this technique is for removing unnecessary cells and does not consider damage to detached cells.

また、細胞の集団から特定の細胞を効率的に選別したいという要望がある。例えば、細胞の集団を分画した後、所望の細胞が含まれる分画を特定し、当該分画から細胞を回収したい場合がある。この場合には、細胞の集団全体ではなく、特定の細胞（群）のみを支持体から剥離することが好ましい。特許文献１に記載の技術では、光ファイバごとに細胞の剥離が可能な構成とされている。   There is also a desire to efficiently select specific cells from a population of cells. For example, after fractionating a population of cells, it may be desired to identify a fraction containing the desired cells and collect the cells from the fraction. In this case, it is preferable to detach only specific cells (group) from the support, not the entire cell population. The technique described in Patent Document 1 is configured such that cells can be detached for each optical fiber.

国際公開第２００８／１１４８２８号International Publication No. 2008/114828

しかし、特許文献１に記載の技術は複数の光ファイバを必要とし、構成が複雑である。そこで本発明は、より簡単な構成をもって、穏やかな条件で支持体から細胞を剥離する技術を提供することを目的とする。   However, the technique described in Patent Document 1 requires a plurality of optical fibers and is complicated in configuration. Therefore, an object of the present invention is to provide a technique for detaching cells from a support under a mild condition with a simpler configuration.

本発明の１つの様相は、支持体たる基材の表面に接着した細胞を前記基材から剥離する細胞の剥離方法であって、前記基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離することを特徴とする細胞の剥離方法である。   One aspect of the present invention is a cell detachment method for detaching cells adhered to the surface of a base material as a support from the base material, wherein the base material emits light when irradiated with light. A cell comprising a responsive gas generating agent, wherein the cell is detached from the substrate by contacting the cell with gas bubbles generated by irradiating the substrate with light. This is a peeling method.

本様相の細胞の剥離方法では、支持体たる基材が光応答性ガス発生剤を含んでいる。そのため、基材に光を照射することにより、基材からガスを発生させることができる。そして本様相では、前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離する。本様相では、ガスの気泡を利用して細胞を剥離するので、剥離が穏やかに行われ、細胞表面に与える負担が小さい。そのため、トリプシン処理のような細胞表面に過度の負担を与えることがなく、例えば、細胞表面の受容体等を損傷することがない。さらに、剥離の条件が穏やかであるゆえ、細胞間結合がある程度保持されるから、コロニーの状態で細胞を剥離及び回収することが容易である。一方、シングルセルの回収に際しても、細胞表面に大きな負担を受けていない細胞を回収することができる。   In the cell peeling method of this aspect, the base material as a support contains a photoresponsive gas generating agent. Therefore, gas can be generated from the substrate by irradiating the substrate with light. In this aspect, the cells are detached from the substrate by bringing gas bubbles generated by irradiating the substrate with light into contact with the cells. In this aspect, since the cells are detached using gas bubbles, the separation is performed gently and the burden on the cell surface is small. Therefore, an excessive load is not given to the cell surface like trypsin treatment, and for example, a receptor on the cell surface is not damaged. Furthermore, since the detachment conditions are gentle, cell-cell bonds are maintained to some extent, and it is easy to detach and collect cells in a colony state. On the other hand, when collecting a single cell, it is possible to collect cells that are not subjected to a large burden on the cell surface.

好ましくは、前記基材は、アミン化合物をさらに含む。Preferably, the substrate further includes an amine compound.

好ましくは、前記基材の一部であって、剥離対象となる細胞が接着している部位に対して選択的に光を照射する。   Preferably, light is selectively irradiated to a part of the base material where a cell to be peeled adheres.

この好ましい様相によれば、所望の細胞のみを効率的に剥離させることができる。例えば、同一平面上に一様に接着している複数の細胞のうち、特定の細胞（群）のみを狙って剥離することができる。   According to this preferable aspect, only desired cells can be efficiently detached. For example, it is possible to peel only a specific cell (group) among a plurality of cells that are uniformly adhered on the same plane.

好ましくは、光を集光させるレンズを用いて前記部位に対して選択的に光を照射する。   Preferably, the portion is irradiated with light selectively using a lens that collects light.

好ましくは、前記基材は複数の区画を有し、剥離対象の細胞が含まれる区画のみに光を照射する。   Preferably, the base material has a plurality of sections, and the light is irradiated only to the sections including cells to be detached.

この好ましい様相によれば、特定の区画内に存在する細胞のみを効率的に剥離させることができる。   According to this preferable aspect, only cells existing in a specific compartment can be efficiently detached.

好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。   Preferably, the gas generating agent is contained in an adhesive binder resin.

本発明の他の様相は、表面に細胞を接着させて支持するための細胞支持用基材であって、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、前記光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を前記細胞に接触させることが可能であることを特徴とする細胞支持用基材である。   Another aspect of the present invention is a cell support base material for supporting cells by adhering to the surface, and includes a photoresponsive gas generating agent that generates gas when irradiated with light, A cell-supporting base material capable of bringing gas bubbles generated from the photoresponsive gas generating agent into contact with the cells.

本様相の細胞支持用基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含んでいる。そのため、基材に光を照射することによりガスを発生させることができる。さらに、本様相では、光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を細胞に接触させることが可能である。そのため、基材表面に接着した細胞を穏やかに剥離することができる。   The cell support base material of this aspect includes a photoresponsive gas generating agent that generates gas when irradiated with light. Therefore, gas can be generated by irradiating the substrate with light. Further, in this aspect, it is possible to bring gas bubbles generated from the photoresponsive gas generating agent into contact with cells. Therefore, the cells adhered to the substrate surface can be gently peeled off.

好ましくは、前記基材は、アミン化合物をさらに含む。Preferably, the substrate further includes an amine compound.

好ましくは、複数の区画を有し、各々の区画内で細胞を支持可能である。   Preferably, it has several divisions and can support a cell in each division.

好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。   Preferably, the gas generating agent is contained in an adhesive binder resin.

好ましくは、前記ガス発生剤は、アゾ化合物又はアジド化合物からなる。   Preferably, the gas generating agent comprises an azo compound or an azide compound.

本発明の他の様相は、上記の細胞支持用基材に細胞を接着させて、前記細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法である。   Another aspect of the present invention is a method for culturing cells, characterized in that the cells are cultured by adhering the cells to the cell support substrate.

本様相によれば、培養された細胞を穏やかな条件で剥離及び回収することができる。   According to this aspect, cultured cells can be detached and collected under mild conditions.

本発明によれば、細胞表面に大きな負担を与えることなく細胞を剥離及び回収することができる。さらに、コロニーの状態で細胞を回収することが容易であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の回収に有用である。   According to the present invention, cells can be detached and collected without imposing a large burden on the cell surface. Furthermore, it is easy to collect cells in a colony state, which is useful for collecting iPS cells and ES cells.

本発明の一実施形態に係る細胞の剥離方法を模式的に表す説明図であり、（ａ）は光照射前の状態、（ｂ）は光照射後の状態を表す。It is explanatory drawing which represents typically the peeling method of the cell which concerns on one Embodiment of this invention, (a) represents the state before light irradiation, (b) represents the state after light irradiation. 本発明の他の実施形態に係る細胞の剥離方法を模式的に表す説明図である。It is explanatory drawing which represents typically the peeling method of the cell which concerns on other embodiment of this invention. 実施例で行った実験結果を表す顕微鏡写真であり、（ａ）は光照射前の細胞の様子、（ｂ）は光照射後の細胞の様子を表す。It is a microscope picture showing the experimental result performed in the Example, (a) represents the state of the cell before light irradiation, (b) represents the state of the cell after light irradiation.

以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の細胞の剥離方法は、光応答性ガス発生剤を含む基材の表面に接着した細胞を、該光応答性ガス発生剤から発生させたガスの気泡を利用して剥離するものである。まず、図１に示す本発明の実施形態を参照しつつ、本発明の基本概念を説明する。図１は本発明の一実施形態を模式的に表したものである。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The cell peeling method of the present invention is a method for peeling cells adhered to the surface of a substrate containing a photoresponsive gas generating agent by utilizing gas bubbles generated from the photoresponsive gas generating agent. . First, the basic concept of the present invention will be described with reference to the embodiment of the present invention shown in FIG. FIG. 1 schematically shows an embodiment of the present invention.

図１（ａ）は細胞を剥離する前（光を照射する前）の基材（細胞支持用基材）１と細胞２の状態を表している。剥離前において、基材１の表面には複数の細胞２が一様に接着している。細胞２は培地等の液体８に浸っている。
基材１は光応答性ガス発生剤を含むものである。本実施形態では、基材１は、光応答性ガス発生剤を含むガス発生フィルム３と、光透過性のガスバリア層５とが積層された構造を有する。そして、ガス発生フィルム３が上側、ガスバリア層５が下側となる姿勢で使用され、細胞２はガス発生フィルム３の表面に接着している。光応答性ガス発生剤の詳細については後述する。
ガスバリア層５の裏側には、光非透過性のフォトマスク６が設けられている。そして、フォトマスク６により、ガスバリア層５の一部が覆われている。逆に言えば、ガスバリア層５の裏側は、フォトマスク６に覆われていない部分のみが露出している。 FIG. 1A shows the state of the base material (cell support base material) 1 and the cell 2 before the cells are detached (before light irradiation). Before peeling, a plurality of cells 2 are uniformly adhered to the surface of the substrate 1. The cell 2 is immersed in a liquid 8 such as a medium.
The substrate 1 contains a photoresponsive gas generating agent. In the present embodiment, the substrate 1 has a structure in which a gas generating film 3 containing a photoresponsive gas generating agent and a light transmissive gas barrier layer 5 are laminated. The gas generating film 3 is used in an attitude in which the gas generating layer 3 is on the upper side and the gas barrier layer 5 is on the lower side, and the cells 2 are adhered to the surface of the gas generating film 3. Details of the photoresponsive gas generating agent will be described later.
A light-impermeable photomask 6 is provided on the back side of the gas barrier layer 5. A part of the gas barrier layer 5 is covered with the photomask 6. In other words, only the portion not covered with the photomask 6 is exposed on the back side of the gas barrier layer 5.

図１（ａ）に示す状態から細胞２を剥離する場合には、基材１の裏側、すなわちガスバリア層５側から光を照射する。このとき、基材１におけるフォトマスク６で覆われていない部分のみに選択的に光が照射される（矢印参照）。照射された光はガスバリア層５を通過して、ガス発生フィルム３に到達する。
ガス発生フィルム３において光が照射された領域で、ガスが発生する。発生したガスは気泡７となり、主に細胞２における基材１との接着面に供給され、細胞２に当たる（接触する）。これにより、図１（ｂ）に示すように、細胞２が基材１から浮き上がり、基材１から剥離する。
ここで、本実施形態ではガスの発生が光照射された領域に限られるので、光を照射した領域に位置する細胞２のみが剥離する。逆に言えば、フォトマスク６で覆われた領域にはガスは発生せず、同領域に位置する細胞２は剥離しない。 When the cells 2 are peeled from the state shown in FIG. 1A, light is irradiated from the back side of the substrate 1, that is, the gas barrier layer 5 side. At this time, light is selectively irradiated only to a portion of the substrate 1 that is not covered with the photomask 6 (see arrows). The irradiated light passes through the gas barrier layer 5 and reaches the gas generating film 3.
Gas is generated in a region where light is irradiated in the gas generating film 3. The generated gas becomes bubbles 7 and is mainly supplied to the adhesive surface of the cell 2 with the base material 1 and strikes (contacts) the cell 2. Thereby, as shown in FIG.1 (b), the cell 2 floats from the base material 1, and peels from the base material 1. FIG.
Here, in this embodiment, since the generation of gas is limited to the region irradiated with light, only the cells 2 located in the region irradiated with light are detached. In other words, no gas is generated in the region covered with the photomask 6 and the cells 2 located in the region are not separated.

本実施形態によれば、ガスの気泡を細胞に接触させることによって細胞を剥離するので、細胞表面に与える負担が小さい。そのため、細胞表面の受容体等を破壊するおそれがなく、無傷により近い細胞を回収することができる。また、トリプシン処理等と比べて剥離条件が穏やかであるので、細胞間結合がある程度保持され、細胞をコロニーの状態で容易に回収できる。
また本実施形態では、光の照射域を限定することにより、特定の領域のみにガスを発生させている。そのため、同一平面上に接着している複数の細胞（群）のうち、所望の細胞（群）のみを効率的に剥離することができる。 According to this embodiment, since the cells are detached by bringing gas bubbles into contact with the cells, the burden on the cell surface is small. Therefore, there is no possibility of destroying receptors on the cell surface, and cells closer to the intact can be collected. In addition, since the detachment conditions are gentle compared to trypsin treatment or the like, the intercellular bond is maintained to some extent, and the cells can be easily recovered in a colony state.
In this embodiment, the gas is generated only in a specific region by limiting the light irradiation region. Therefore, only a desired cell (group) among a plurality of cells (group) adhered on the same plane can be efficiently detached.

上記した実施形態では、フォトマスク６を用いて所望部位に対して光を選択的に照射している。しかし、所望部位に対して光を選択的に照射する方策はこれに限定されない。例えば、図２に示す実施形態では、レンズ１０を用いて所望部位に対して光を集中させ、選択的に照射している。レンズ１０は凸レンズであり、入射した光を集光させるものである。本実施形態によれば、フォトマスク６を必要としないので、より簡単な構成をもって細胞剥離を行うことができる。本実施形態においては、レンズ１０を１個のみ用いてもよいし、複数個用いてもよい。   In the above-described embodiment, light is selectively irradiated to a desired portion using the photomask 6. However, the method of selectively irradiating light to a desired site is not limited to this. For example, in the embodiment shown in FIG. 2, the lens 10 is used to concentrate and selectively irradiate light on a desired part. The lens 10 is a convex lens and collects incident light. According to the present embodiment, since the photomask 6 is not required, cell detachment can be performed with a simpler configuration. In the present embodiment, only one lens 10 or a plurality of lenses 10 may be used.

ガスバリア層５を構成する材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ガラス、石英ガラス及びパイレックスガラス等が挙げられる。   Examples of the material constituting the gas barrier layer 5 include polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polybutylene terephthalate, glass, quartz glass, and Pyrex glass.

基材に光を照射する際に用いる光源としては、細胞に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定はないが、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることができる。その他の光源としては、レーザー、エレクトロルミネッセンス素子（ＥＬ素子）、プラズマ発光素子、外部電極形蛍光ランプ（ＥＥＦＬ）、マイクロハロゲンランプ、光ファイバ、並びに光セレクタの組み合わせにより取り出すことができる光源、などが挙げられる。   The light source used when irradiating the substrate with light is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cells. For example, a light emitting diode (LED) can be used. Other light sources include lasers, electroluminescent elements (EL elements), plasma light emitting elements, external electrode fluorescent lamps (EEFL), micro halogen lamps, optical fibers, and light sources that can be taken out by a combination of optical selectors, etc. Can be mentioned.

上記した実施形態では、ガス発生フィルムを用いて「光応答性ガス発生剤を含む基材」を構成しているが、光応答性ガス発生剤を含有させる態様はこれに限定されない。例えば、光応答性ガス発生剤を含有させた樹脂成型物で基材の一部又は全部を構成してもよい。   In the above-described embodiment, the “substrate including the photoresponsive gas generating agent” is configured using the gas generating film, but the mode of including the photoresponsive gas generating agent is not limited thereto. For example, you may comprise a part or all of a base material with the resin molding containing the photoresponsive gas generating agent.

細胞が接着する基材表面を区画しておくことにより、一部の細胞のみを剥離したい場合に、光照射すべき領域を容易に特定することができる。区画の態様としては、例えば、同一平面上に複数の細胞を接着させた場合、視認可能な格子状の目印を該平面に付与することが挙げられる。この場合には、格子の繰り返し単位である正方形又は長方形の領域が、区画となる。   By partitioning the substrate surface to which the cells adhere, it is possible to easily identify the region to be irradiated with light when only a part of the cells is to be peeled off. As an aspect of the partition, for example, when a plurality of cells are adhered on the same plane, a visually recognizable grid-like mark is given to the plane. In this case, a square or rectangular area which is a repeating unit of the lattice is a partition.

平板上に設けられた複数の凹部（窪み、ウェル）によって前記区画を構成することもできる。この場合には、各区画（凹部）は各々独立しているから、特定の区画に対する光照射及び剥離した細胞の回収が特に容易である。例えば、公知の細胞培養用マイクロタイタープレートのように、円筒形の複数のウェルを有する板体を、前記基材として用いることができる。この場合には、ウェルの底面を光応答性ガス発生剤を含む材料で構成すればよい。当該ウェルのサイズとしては、例えば、直径２〜３５ｍｍ程度、深さ１０〜１２ｍｍ程度、底面積０．１〜５ｃｍ2程度とすることができる。 The compartment can also be constituted by a plurality of recesses (dents, wells) provided on a flat plate. In this case, since each compartment (concave portion) is independent, it is particularly easy to irradiate a specific compartment with light and collect detached cells. For example, a plate having a plurality of cylindrical wells, such as a known cell culture microtiter plate, can be used as the substrate. In this case, the bottom surface of the well may be made of a material containing a photoresponsive gas generating agent. As the size of the well, for example, a diameter of about 2 to 35 mm, a depth of about 10 to 12 mm, and a bottom area of about 0.1 to 5 cm 2 can be used.

さらに、マイクロアレイチップをもって前記基材を構成することもできる。例えば、１又は複数の細胞を収容可能なマイクロチャンバーを複数備えたマイクロアレイチップを、光応答性ガス発生剤を含む材料で作製することにより、複数の区画を備えた前記基材を構成することができる。この態様によれば、蛍光分析等によってマイクロアレイチップ上で所望の細胞を容易に特定することができる。そしてその後、所望の細胞が収容されたマイクロチャンバーにのみ光を照射して、所望の細胞又は所望の細胞が含まれる細胞群を剥離し、回収することができる。本発明をマイクロアレイチップに適用することにより、ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）検査等の細胞解析が容易となる。
前記マイクロチャンバーのサイズや形状としては、例えば、直径２０〜１０００μｍ程度、深さ７〜２０００μｍ程度の円筒形とすることができる。 Furthermore, the base material can be configured with a microarray chip. For example, the substrate having a plurality of compartments can be configured by producing a microarray chip having a plurality of microchambers capable of accommodating one or a plurality of cells with a material containing a photoresponsive gas generating agent. it can. According to this aspect, desired cells can be easily identified on the microarray chip by fluorescence analysis or the like. And after that, only the micro chamber in which the desired cell is accommodated can be irradiated with light, and the desired cell or the cell group containing the desired cell can be detached and collected. Application of the present invention to a microarray chip facilitates cell analysis such as CTC (Circulating Tumor Cell) inspection.
As the size and shape of the microchamber, for example, a cylindrical shape having a diameter of about 20 to 1000 μm and a depth of about 7 to 2000 μm can be used.

本発明の細胞支持用基材は、光応答性ガス発生剤を含むものであり、光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を、支持している細胞に接触させることが可能なものである。   The substrate for cell support of the present invention contains a photoresponsive gas generating agent, and is capable of bringing gas bubbles generated from the photoresponsive gas generating agent into contact with supporting cells. is there.

本発明の細胞支持用基材としては、例えば、上記した実施形態に係る基材をそのまま採用することができる。すなわち、図１に示すように、ガス発生フィルム３を用いて細胞支持用基材を構成することができる。さらに、複数の区画を設け、特定の細胞（群）のみを容易に剥離できる構成としてもよい。複数の凹部（窪み、ウェル）を平板上に設けてもよい。上記したマイクロアレイチップも本発明の細胞支持用基材となり得る。   As the cell support substrate of the present invention, for example, the substrate according to the above-described embodiment can be employed as it is. That is, as shown in FIG. 1, a cell-supporting substrate can be configured using the gas generating film 3. Furthermore, it is good also as a structure which can provide several division and can peel only a specific cell (group) easily. You may provide a some recessed part (dent, well) on a flat plate. The above-described microarray chip can also serve as the cell support substrate of the present invention.

本発明の細胞支持用基材を、細胞培養用基材として用いることができる。例えば、接着性細胞の培養に通常用いられているプレート、シャーレ、フラスコ等の細胞接着面を、光応答性ガス発生剤を含む材料で構成することにより、前記細胞培養用基材とすることができる。具体的には、上記した構成のガス発生フィルムをシャーレやフラスコの底面に設置することにより、前記細胞培養用基材とすることができる。   The cell support substrate of the present invention can be used as a cell culture substrate. For example, the cell culture substrate can be used as the substrate for cell culture by configuring a cell adhesion surface such as a plate, petri dish, flask, etc., which is usually used for culturing adhesive cells, with a material containing a photoresponsive gas generating agent. it can. Specifically, the cell culture substrate can be obtained by installing the gas generating film having the above-described configuration on the bottom of a petri dish or flask.

本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材に細胞を接着させて、当該細胞を培養する細胞の培養方法を包含する。また本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材に細胞を接着させて、当該細胞を支持する細胞の支持方法を包含する。   The present invention includes a cell culturing method in which cells are adhered to a substrate containing a photoresponsive gas generating agent, and the cells are cultured. In addition, the present invention includes a cell supporting method in which cells are adhered to a substrate containing a photoresponsive gas generating agent to support the cells.

本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材の、細胞支持用基材のための使用を包含する。また本発明は、光応答性ガス発生剤を含む基材の、細胞培養用基材のための使用を包含する。   The present invention encompasses the use of a substrate comprising a photoresponsive gas generating agent for a cell support substrate. The present invention also includes the use of a substrate containing a photoresponsive gas generating agent for a cell culture substrate.

本発明の対象となる細胞としては特に限定はなく、接着性細胞であれば全てが対象となり得る。一例として、上述したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が挙げられる。これらの細胞はコロニーの状態で継代することが好ましいので、本発明の細胞の剥離方法が特に好適に用いられる。その他の細胞としては、ヒト子宮頸がん由来のＨｅｌａ；ヒト乳腺癌由来のMCF-7；胎児細胞由来の有核赤血球や胎児白血球；Ｔ細胞白血病由来のJurkat、HD-Mar2、SKW-3；Ｂ細胞白血病由来のNALM-6；白血病由来のHL-60；ラット副腎髄質由来ＰＣ１２；アフリカミドリザル腎臓由来COS-1やCOS-7；チャイニーズハムスター卵巣由来CHO/HGPRT、などの細胞が挙げられる。   There is no limitation in particular as a cell used as the object of this invention, and if it is an adhesive cell, all can become object. As an example, the above-described iPS cells and ES cells can be mentioned. Since these cells are preferably subcultured in a colony state, the cell peeling method of the present invention is particularly preferably used. Examples of other cells include Hela derived from human cervical cancer; MCF-7 derived from human breast cancer; Nucleated red blood cells and leukocytes derived from fetal cells; Jurkat, HD-Mar2, and SKW-3 derived from T cell leukemia; Examples include cells such as NALM-6 derived from B cell leukemia; HL-60 derived from leukemia; PC12 derived from rat adrenal medulla; COS-1 and COS-7 derived from African green monkey kidney; CHO / HGPRT derived from Chinese hamster ovary.

続いて、本発明で用いられる光応答性ガス発生剤について説明する。該光応答性ガス発生剤を構成する化合物としては、アゾ化合物、アジド化合物、ポリオキシアルキレン化合物等が挙げられる。このうちアゾ化合物又はアジド化合物が、ガス発生効率が高いため好適に用いられる。   Then, the photoresponsive gas generating agent used by this invention is demonstrated. Examples of the compound constituting the photoresponsive gas generating agent include azo compounds, azide compounds, polyoxyalkylene compounds and the like. Of these, azo compounds or azide compounds are preferably used because of their high gas generation efficiency.

該アゾ化合物としては、２，２’−アゾビス−（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）、等が挙げられる。また該アジド化合物としては、３−アジドメチル−３−メチルオキセタン、グリシジルアジドポリマー、等が挙げられる。これらのアゾ化合物やアジド化合物については、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。   Examples of the azo compound include 2,2′-azobis- (N-butyl-2-methylpropionamide), 2,2′-azobis (N-butyl-2-methylpropionamide), 2,2′-azobis ( N-cyclohexyl-2-methylpropionamide) and the like. Examples of the azide compound include 3-azidomethyl-3-methyloxetane, glycidyl azide polymer, and the like. About these azo compounds and azide compounds, only 1 type may be used and 2 or more types may be used together.

上記光応答性ガス発生剤は、バインダー樹脂に含まれていてもよい。該バインダー樹脂は、光応答性ガス発生剤を固定したり、光応答性ガス発生剤を含む材料に粘着性を持たせたり、種々の機能を付加する役割を果たす。例えば、光応答性ガス発生剤をバインダー樹脂に分散させたり、バインダー樹脂に相溶させたりすることができる。バインダー樹脂の使用により、ガス発生剤を含む材料を所望の形状に加工することが容易である。例えば、フィルム状などの形状に、容易に成形することができる。   The photoresponsive gas generating agent may be contained in a binder resin. The binder resin plays a role of fixing a photoresponsive gas generating agent, imparting adhesiveness to a material containing the photoresponsive gas generating agent, and adding various functions. For example, the photoresponsive gas generating agent can be dispersed in the binder resin or can be dissolved in the binder resin. By using the binder resin, it is easy to process a material containing a gas generating agent into a desired shape. For example, it can be easily formed into a film shape or the like.

該バインダー樹脂の好ましい例としては、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また該バインダー樹脂自体が、光の照射によりガスを発生する性質を有していてもよい。該バインダー樹脂は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。   Preferable examples of the binder resin include acrylic resins and epoxy resins, but are not limited thereto. Further, the binder resin itself may have a property of generating a gas upon irradiation with light. As for this binder resin, only 1 type may be used and 2 or more types may be used together.

さらに該バインダー樹脂は粘着性を有するものであってもよく、例えば、粘接着剤樹脂を含んでいてもよい。かかる構成により、例えば、フィルム状等の形状（ガス発生フィルム等）として用いる際に、取扱いが容易となる。なお、粘接着剤樹脂は、光の照射により粘着性が低下しない性質を有することが好ましい。この場合には、ガス発生剤に対して光照射が開始された後でも、高い粘接着性を維持可能である。また、粘接着剤樹脂は、例えば、光照射により架橋しない性質を有することが好ましい。   Further, the binder resin may have adhesiveness, and for example, may contain an adhesive resin. With such a configuration, for example, when used as a film-like shape (gas generating film or the like), handling becomes easy. In addition, it is preferable that adhesive agent resin has the property that adhesiveness does not fall by irradiation of light. In this case, high adhesiveness can be maintained even after light irradiation is started on the gas generating agent. Moreover, it is preferable that adhesive agent resin has a property which is not bridge | crosslinked by light irradiation, for example.

上記粘接着剤樹脂としては、例えば、ゴム系粘接着剤樹脂、（メタ）アクリル系粘接着剤樹脂、シリコーン系粘接着剤樹脂、ウレタン系粘接着剤樹脂、スチレン−イソプレン−スチレン共重合体系粘接着剤樹脂、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体粘接着剤樹脂、エポキシ系粘接着剤樹脂及びイソシアネート系粘接着剤樹脂、等が挙げられる。   Examples of the adhesive resin include a rubber-based adhesive resin, a (meth) acrylic adhesive resin, a silicone-based adhesive resin, a urethane-based adhesive resin, and styrene-isoprene- Examples thereof include styrene copolymer-based adhesive resins, styrene-butadiene-styrene copolymer adhesive resins, epoxy-based adhesive resins, and isocyanate-based adhesive resins.

光応答性ガス発生剤を含む基材には、さらにアミン化合物を含めてもよい。かかる構成により、基材表面の正電荷が増強され、細胞の接着がより確実となる。該アミン化合物としては特に限定はなく、１級、２級、又は３級の各種アミン化合物を用いることができる。   The substrate containing the photoresponsive gas generating agent may further contain an amine compound. With this configuration, the positive charge on the surface of the base material is enhanced, and cell adhesion is further ensured. The amine compound is not particularly limited, and various primary, secondary, or tertiary amine compounds can be used.

光応答性ガス発生剤を含む基材には、さらに光増感剤を含めてもよい。該光増感剤としては、チオキサントン、ベンゾフェノン、アセトフェノン類及びポルフィリン等が挙げられる。   The substrate containing the photoresponsive gas generating agent may further contain a photosensitizer. Examples of the photosensitizer include thioxanthone, benzophenone, acetophenones, and porphyrin.

光応答性ガス発生剤を含む基材には、必要に応じて、種々の添加剤をさらに含めてもよい。該添加剤としては、カップリング剤、可塑剤、界面活性剤、粘着付与剤、架橋剤、安定剤、等が挙げられる。他の添加剤としては、多孔質体、フィラー、金属箔、マイクロカプセル等の粒子が挙げられる。ガス発生剤を含む基材にこれらの粒子が分散されていると、ガスの拡散がより一層早くなる。   The base material containing the photoresponsive gas generating agent may further contain various additives as required. Examples of the additive include a coupling agent, a plasticizer, a surfactant, a tackifier, a crosslinking agent, and a stabilizer. Examples of the other additive include particles such as a porous body, a filler, a metal foil, and a microcapsule. When these particles are dispersed in the base material containing the gas generating agent, gas diffusion is further accelerated.

以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to an Example.

図１で模式的に示した細胞の剥離方法について、細胞と光応答性ガス発生フィルムを用いて実際に実験を行った。   The cell peeling method schematically shown in FIG. 1 was actually tested using cells and a photoresponsive gas generating film.

アクリル基板（５０ｍｍ×１００ｍｍ×２ｍｍ）に直径７ｍｍの３６個のウェル（貫通穴）作製し、底面にガス発生フィルムを貼り付けて、細胞支持用基材を作製した。ガス発生フィルムは、グリシジルアジドポリマーとアクリルポリマーとチオキサントンを含むものをＰＥＴフィルム（厚み５０μｍ）上にキャストし、乾燥後の厚みが５０μｍとなるようにして作製した。   36 wells (through holes) having a diameter of 7 mm were prepared on an acrylic substrate (50 mm × 100 mm × 2 mm), and a gas generating film was attached to the bottom surface to prepare a cell support substrate. The gas generating film was prepared by casting a film containing a glycidyl azide polymer, an acrylic polymer, and thioxanthone on a PET film (thickness 50 μm) so that the thickness after drying was 50 μm.

各ウェルに乳ガン細胞（１×１０6個／ｍＬ）を含む培地４０μＬを加え、ＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）に２０分間静置し、フィルム表面に細胞を接着させた。図３（ａ）は、この時点におけるフィルム上の細胞を表す顕微鏡写真である。
次に、ガス発生フィルムの裏側の一部をフォトマスクで覆った後、ＬＥＤを用いて光を１０秒間照射し、ガスを発生させた。ガスの発生量は約２μＬであった。ガス発生後の細胞の様子を図３（ｂ）に示す。すなわち、光照射前にはガス発生フィルムに一様に接着していた細胞が、光照射により、ガス発生フィルムから剥離した。また、フォトマスクで覆った部分の細胞はガス発生フィルムに接着したままであり、光を照射した部分の細胞のみが剥離された。 40 μL of medium containing breast cancer cells (1 × 10 6 cells / mL) was added to each well, and the plate was allowed to stand in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 20 minutes to adhere the cells to the film surface. FIG. 3 (a) is a photomicrograph representing the cells on the film at this point.
Next, after covering part of the back side of the gas generating film with a photomask, light was irradiated for 10 seconds using an LED to generate gas. The amount of gas generated was about 2 μL. The state of the cell after gas generation is shown in FIG. That is, the cells that were uniformly adhered to the gas generating film before the light irradiation were detached from the gas generating film by the light irradiation. Moreover, the cell of the part covered with the photomask remained adhered to the gas generating film, and only the cell of the part irradiated with light was peeled off.

以上より、光ガス応答性ガス発生剤を含む基材に光を照射してガスを発生させることにより、基材表面の細胞を剥離することができた。また、光の照射範囲を限定することにより、所望の領域に位置する細胞のみを剥離することができた。   From the above, the cells on the surface of the substrate could be peeled off by generating light by irradiating the substrate containing the photogas-responsive gas generating agent with light. Further, by limiting the light irradiation range, only cells located in a desired region could be detached.

１ 基材（細胞支持用基材）
２ 細胞
３ ガス発生フィルム
７ 気泡
１０ レンズ 1 Substrate (Substrate for cell support)
2 Cell 3 Gas generating film 7 Bubble 10 Lens

Claims (11)

支持体たる基材の表面に接着した細胞を前記基材から剥離する細胞の剥離方法であって、
前記基材は、光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、
前記基材に光を照射して発生させたガスの気泡を前記細胞に接触させることにより、前記細胞を前記基材から剥離することを特徴とする細胞の剥離方法。 A cell peeling method for peeling cells adhered to the surface of a base material as a support from the base material,
The base material includes a photoresponsive gas generating agent that generates gas when irradiated with light,
A method for detaching cells, wherein the cells are detached from the substrate by bringing gas bubbles generated by irradiating the substrate with light into contact with the cells. 前記基材は、アミン化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞の剥離方法。The method according to claim 1, wherein the base material further contains an amine compound. 前記基材の一部であって、剥離対象となる細胞が接着している部位に対して選択的に光を照射することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞の剥離方法。 3. The cell peeling method according to claim 1, wherein light is selectively irradiated to a part of the base material where a cell to be peeled adheres. 光を集光させるレンズを用いて前記部位に対して選択的に光を照射することを特徴とする請求項３に記載の細胞の剥離方法。 The method for detaching cells according to claim 3 , wherein light is selectively irradiated to the part using a lens that collects light. 前記基材は複数の区画を有し、剥離対象の細胞が含まれる区画のみに光を照射することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞の剥離方法。 Said substrate has a plurality of compartments, peeling method of cell according to any one of claims 1 to 4, wherein the irradiating light only to the partition that contains the peeling target cells. 前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞の剥離方法。 The method for detaching cells according to any one of claims 1 to 5 , wherein the gas generating agent is contained in an adhesive binder resin. 表面に細胞を接着させて支持するための細胞支持用基材であって、
光を照射することによりガスを発生する光応答性ガス発生剤を含むものであり、
前記光応答性ガス発生剤から発生したガスの気泡を前記細胞に接触させることが可能であることを特徴とする細胞支持用基材。 A cell supporting substrate for supporting cells by adhering to the surface,
It contains a photoresponsive gas generating agent that generates gas when irradiated with light,
A cell-supporting base material, wherein gas bubbles generated from the photoresponsive gas generating agent can be brought into contact with the cells. 前記基材は、アミン化合物をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の細胞支持用基材。The cell support substrate according to claim 7, wherein the substrate further contains an amine compound. 複数の区画を有し、各々の区画内で細胞を支持可能であることを特徴とする請求項７又は８に記載の細胞支持用基材。 The cell support substrate according to claim 7 or 8 , wherein the cell support base material has a plurality of compartments and can support cells in each compartment. 前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の細胞支持用基材。 The cell support substrate according to any one of claims 7 to 9, wherein the gas generating agent is contained in an adhesive binder resin. 請求項７〜１０のいずれかに記載の細胞支持用基材に細胞を接着させて、前記細胞を培養することを特徴とする細胞の培養方法。 A method for culturing cells, comprising culturing the cells by adhering the cells to the cell support substrate according to any one of claims 7 to 10 .
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